CN104558149A - 胸腺素α1的固相片段合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种胸腺素α1的合成工艺，根据胸腺素α1的困难合成序列设计困合成多个片段；在困难序列的区域采用固相片段缩合方法，提高合成质量和缩短合成时间；而在易合成序列区域采用常规的逐步缩合法；在Wang？Resin上得到全保护的胸腺素α1肽树脂；使用TFA/间甲酚或TFA/苯甲硫醚/EDT/苯甲醚作为裂解试剂，裂解肽树脂得到粗肽；将粗肽溶解、过滤，通过制备型反相HPLC纯化、脱盐、旋蒸及冻干得到纯度可达到99%以上的胸腺素α1成品。本发明方法合成的粗肽纯度可达到80%左右，易纯化，总收率可达到30%。本发明方法生产胸腺素α1的总收率和产品质量比文献报道的其它方法均有了较大幅度的提高，且生产周期能缩短40-50%，降低了生产成本，适合于规模化制备高纯度的胸腺素α1。
Description
技术领域
本发明涉及多肽药物化学合成领域，具体涉及一种胸腺素α1的固相片段合成方法。
背景技术
胸腺素a1是由胸腺分泌的一种重要的多肽类免疫调节因子，具有显著增强免疫功能的作用，被公认为特异性调节免疫失衡状态及增强免疫力最有效的药物。胸腺素a1最初是从小牛胸腺中提取出来的。胸腺素a1由28个氨基酸残基组成，分子量为3108，等电点为4.2, N端含有乙酰化结构。胸腺素a1通过刺激外周血液淋巴细胞丝裂原来促进T淋巴细胞的成熟，增加抗原或丝裂原激活后T细胞分泌的干扰素α、干扰素γ以及白介素2、白介素3等淋巴因子水平，同时增加T细胞表面淋巴因子受体水平。化学合成的胸腺素a1 (商品名为日达仙)已用于慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、恶性黑色素瘤、非小细胞性肺癌等疾病的治疗。
Ta1的一级结构图（Lys17至Glu24之间序列可以形成a~螺旋结构）
目前报道的胸腺素α1极其类似物的制备除了从动物胸腺中提取外，还可以采用基因工程的方法和化学合成的方法。从动物胸腺中提取的方法原料来源有限，胸腺素α1含量低，提取产品质量不高；基因工程法很难实现胸腺素α1结构中的乙酰化修饰，重组小肽的纯化工艺复杂；化学合成法是目前生产高品质胸腺素α1原料药的主要方法。
在标准的固相多肽合成法中，主要采用Boc/Bzl和Fmoc/tBu两种正交保护策略。用经典的Boc/Bzl策略合成胸腺素α1，以三氟乙酸（TFA）脱除Boc保护时可以避免困难序列的形成，合成粗肽的质量较好，但此工艺中要用到剧毒的氟化氢和昂贵的聚四氟乙烯装置，因此在胸腺素α1的规模化生产中，Boc/Bzl合成工艺逐渐被更加安全、经济、环保的Fmoc/tBu合成工艺替代。在标准的Fmoc/tBu合成工艺中，如克服因胸腺素α1困难序列的形成导致的某些氨基酸缩合困难及六氢吡啶脱除Fmoc困难是提高合成质量的关键。
在胸腺素α1的Fmoc/tBu固相合成工艺专利ZL200710024406.3中采用Fmoc-Asp-X(X=OtBu或 OAll)的侧链羧基与Rink Amide Resin或Rink Amide MBHA Resin的氨基相连，代替Fmoc-Asn(Trt)-OH与Wang Resin相连的常规方法，再按照逐步缩合的方法完成整个肽序的合成。此方法用Rink Resin替代Wang Resin，用Fmoc-Asp-X(X=OtBu或 OAll)代替Fmoc-Asn(Trt)-OH，更容易将第一个氨基酸连接到固相载体上，此方法具有一定的巧妙性，但本质上不会改善肽链中困难序列的合成效果，也就不会较大幅度的提高粗肽的纯度和收率等指标，Fmoc-Asp-X(X=OtBu或 OAll)和Rink Resin的价格也明显高于Fmoc-Asn(Trt)-OH和Wang Resin。
在胸腺素α1的Fmoc/tBu固相合成工艺专利ZL200780024724.8中, 以假脯氨酸二肽形式在序列中引入至少一个Thr或Ser, 克服困难序列的形成，改善缩合效果，最后用TFA裂解和脱侧链保护时，将假脯氨酸开环，得到胸腺素α1。胸腺素α1序列的1、8、9位含有3个Ser, 6、12、13位含有3个Thr, 和经典的Fmoc/tBu逐步缩合工艺比较，用此法可以在一定程度上提高胸腺素α1合成质量，但胸腺素α1最难合成的序列区间（Lys17至Glu24之间序列可以形成a~螺旋结构）不含Thr或Ser，且Thr或Ser的假脯氨酸二肽制备工艺复杂，价格昂贵。因此，难以用此工艺规模化制备有价格竞争力的高品质腺素α1原料药。
发明内容
本发明的目的是提供一种胸腺素α1的固相片段合成方法，该胸腺素α1的固相片段合成方法高收率、低成本、反应条件温和并易于操作、环境污染小、效率高有利于实现产业化。
为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种胸腺素α1的固相片段合成方法，包括以下步骤：
胸腺素α1为：
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH，所述胸腺素α1从C端到N端分为C末端片段A、片段B和N末端片段E；所述C末端片段A包括4~6个氨基酸，所述片段B包括8~10个氨基酸，所述N末端片段E包括2~4个氨基酸，所述C末端片段A和片段B在肽序上为连续片段；
所述C末端片段A通过以下工艺获得：
步骤一、将Fmoc-Asn(Trt)-OH、HOBt在溶剂中溶解后，再加入DIC活化形成氨基酸活化液；
步骤二、将所述氨基酸活化液、Wang Resin树脂混合并加入二甲氨基吡啶进行缩合反应获得 ，再去除Fmoc保护基；
步骤三、再根据肽序循环步骤一和步骤二，依次将Fmoc-Glu (OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-OH和Fmoc-Val-OH全部或部分缩合到树脂上，脱除Fmoc得到全保护C末端片段A的肽树脂；
所述片段B通过以下工艺获得：
步骤一、将Fmoc-Glu (OtBu)-OH或者Fmoc-Val-OH在溶剂中溶解后，再加入DIPEA活化形成氨基酸活化液；
步骤二、将所述氨基酸活化液、2-CTC Resin树脂混合并再次加入DIPEA进行缩合反应获得氨基酸-CTC Resin树脂，再去除Fmoc保护基获得脱保护氨基酸-CTC Resin树脂；
步骤三、将Fmoc-Val-OH或者Fmoc-Glu (OtBu)-OH与HOBt在溶剂中溶解后，再加入DIC活化形成氨基酸活化液；
步骤四、将步骤三所述氨基酸活化液、步骤二的脱保护氨基酸-CTC Resin树脂混合进行缩合反应获得中间氨基酸-CTC Resin树脂；
步骤五、再根据肽序循环步骤三和步骤四，按照肽序依次将若干个氨基酸直到Fmoc-Asp(OtBu)-OH逐步缩合到步骤四的树脂上，再将多肽与树脂分离从而获得全保护片段B；
将所述全保护片段B加入DCM/DMSO的混合溶剂，再依次加入HOBt、DIC活化后，再加入所述全保护C末端片段A的肽树脂，缩合反应合成全保护片段C；
按照肽序，在全保护片段C（AA15-AA28）的肽树脂依次将Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH和Fmoc-Ser(tBu)-OH中全部或部分偶联到全保护片段C上，脱除Fmoc保护基团后得到全保护片段D肽树脂；
所述N末端片段E为逐步缩合法依次完成Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH和Fmoc-Ser(tBu)-OH中全部或部分与2-CTC Resin树脂缩合，再将多肽与树脂分离从而获得片段E；
将片段E全溶解于DMF/DCM=2/1的混合溶剂中，加入HOBt搅拌至全溶，，再投入所述全保护片段D肽树脂，得到胸腺素α1肽树脂；
将胸腺素α1肽树脂加入裂解混合试剂，裂解2h，滤除树脂，得到滤液。将滤液缓缓加入至冰冷的无水乙醚中，静置，去除上清液，离心、洗涤、真空干燥得到粗肽胸腺素α1。
上述技术方案进一步改进的技术方案如下：
1. 上述方案中，合成片段A时，制备Fmoc-Asn(Trt)-Wang Resin时，各原料的摩尔比为WangResin/Fmoc-Asn(Trt)-OH/DIC/HOBt/DMAP = 1/2~4/2~4/2~4/0.2~0.4，反应温度为20~35℃，反应时间为1~2h。
2. 上述方案中，所述裂解混合试剂为为TFA/间甲酚=97.5/2.5(V/V)，或者TFA/苯甲硫醚/EDT/苯甲醚=90/5/3/2（V/V/V/V）。
3. 上述方案中，所述片段B工艺中多肽与树脂分离具体为：将全保护片段B肽树脂置于反应器中，加入25L的TFE/DCM溶液(V/V=1/4)，25℃搅拌反应2h。反应结束后，滤除树脂，收集滤液，通过旋转蒸发仪旋去有机溶剂，得到白色至浅黄色的胶状固体，放入真空干燥箱干燥至恒重，称重为1742.3g。
4. 上述方案中，还包括以下步骤将粗肽胸腺素α1进行纯化、脱盐及冻干，其中纯化方式具体为：使用制备流动相的组合为：一纯：A相为1‰TFA，B相为乙腈；二纯：A相为2‰磷酸，B相为乙腈；脱盐时A相为50-100mmol/L的醋酸铵水溶液+纯水，B相为乙腈。分析流动相采用：A相为1‰高氯酸（取1ml的高氯酸，称取2.36g甲烷磺酸钠加纯水定容至1L,用稀的氢氧化钠溶液调pH至2.3），B相为100%乙腈，C相为100%甲醇。
由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
1. 本发明胸腺素α1的固相片段合成方法，解决胸腺素α1化学合成方法中上述提到的缩合困难、效率不高且收率低下的问题。本发明人通过分析实验数据，发现在用标准的Fmoc~固相法生产胸腺素α1的过程中面临的主要困难有：（1）在C-端第9到14位的6个Fmoc~保护氨基酸的缩合很困难，是典型的多肽合成中的困难序列，缩合和Fmoc脱除都很困难，往往需要多次，不仅增加了物料消耗和生产时间，而且造成合成的粗肽纯度很低；（2）在靠近N端的几个Fmoc~保护氨基酸缩合不完全时，特别是25位和26位的Ala缺失时引入的杂质与目的产物性质很接近，在HPLC上很难分离，难以获得高品质的胸腺素α1原料药。
2. 本发明胸腺素α1的固相片段合成方法，本发明根据胸腺素α1的序列结构特点，在合成困难序列的区域采用片段缩合法巧妙地解决了逐步缩合法中困难序列的合成难题，在产生难分离杂质的区域用片段缩合方法解决了关键杂质的控制问题，而在合成难度不大的区域仍采用逐步缩合的策略，提供了一种高收率、低成本、操作简单、方便中控、效率高。此工艺中得到纯度约80%的粗肽，远优于现有文献报道的胸腺素α1的制备工艺，可以大规模地生产高纯度的胸腺素α1原料药；合成的粗肽纯度可达到80%左右，易纯化，总收率可达到30%。本发明方法生产胸腺素α1的总收率和产品质量比文献报道的其它方法均有了较大幅度的提高，且生产周期能缩短40-50%，降低了生产成本，适合于规模化制备高纯度的胸腺素α1。
附图说明
附图1为本发明实施例1中胸腺素α1粗肽的HPLC分析图谱；
附图2为本发明实施例1中纯化后的胸腺素α1的HPLC分析图谱；
附图3为本发明实施例1中纯化后的胸腺素α1的ESI-MS分析图谱；
附图4为本发明实施例2中胸腺素α1粗肽的HPLC分析图谱；
附图5为本发明实施例2中纯化后的胸腺素α1的HPLC分析图谱；
附图6为本发明实施例2中纯化后的胸腺素α1的ESI-MS的分析图谱；
附图7为本发明实施例3中胸腺素α1粗肽的HPLC分析图谱；
附图8为本发明实施例3中纯化后的胸腺素α1的HPLC分析图谱；
附图9为本发明实施例3中纯化后的胸腺素α1的ESI-MS的分析图谱。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
实施例1：
按“片段Ac(1-4)+逐步缩合5-14位氨基酸+Fmoc（15-22）+（23-28）-Wang Resin”合成策略合成所需的三个片段，工艺流程图如下：
Ⅰ、制备（23-28）-Wang Resin
Ⅱ、制备片段Fmoc(15~22)全保护粗肽
Ⅲ、片段Fmoc(15~22)全保护粗肽与（23~28）-Wang Resin的缩合，并逐步缩合至第5位氨基酸
Ⅳ、制备片段Ac(1~4)全保护粗肽
Ⅴ、片段Ac(1~4)全保护粗肽与（5~28）-Wang Resin的缩合，并裂解成粗肽
Ⅵ、粗肽的纯化、脱盐
（1）C-末端段片段A（AA23-AA28）的全保护肽树脂的合成H-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Wang Resin
称取1000.0gWang Resin（1.1mmol/g）于10L反应釜中，加入适量的DCM搅拌溶涨约30min，抽掉液体。称取1640.9gFmoc-Asn(Trt)-OH（2.75mol）、391.8gHOBt（2.9mol）于烧杯中，加入适量DMF溶解，冰浴约5min,加入511.1mLDIC（3.3mol）于烧杯中活化约15min。活化结束后，将氨基酸活化液倒入反应釜中，设定反应温度为30℃，同时开启氮气辅助搅拌，反应约5min后，加入事先溶解好的含33.6g二甲氨基吡啶（DMAP，275mmol）的DMF溶液，继续反应约1h，反应结束后，抽掉反应液，加入适量的DMF洗涤3次，再加入适量的Ac2O/NMM反应5h，以封闭Wang Resin上未反应的功能基团。封闭结束后，抽掉封闭液，加入适量DMF洗涤4次，抽掉，再加入适量的无水甲醇收缩2次，每次10min。结束后，将氨基酸树脂转移至真空干燥箱中干燥至恒重，称得氨基酸树脂重量为1210.0g,取样测Fmoc-Asn(Trt)-Wang Resin替代度为0.30mmol/g。称取1000.0g（300mmol）Fmoc-Asn(Trt)-Wang Resin于10L反应釜中，加入适量DCM溶涨约30min，溶涨结束后，抽掉DCM。加入DBLK脱保护两次，5+15min。脱完保护后，按如下顺序洗涤：DMF×1,无水甲醇×1,DCM×1, DMF×2，取少许树脂用Kaiser法检测，呈阳性。称取382.9g Fmoc-Glu (OtBu)-OH和145.8gHOBt于烧杯中，加入适量DMF溶解，冰浴约5min，再加入167.2mLDIC活化约15min。活化结束后，将活化液倒入反应釜中，设定反应温度为30℃，反应2h。截止2h时，抽掉反应液，加入DMF洗涤2遍。取少许树脂，用Kaiser法检测，呈阴性，表明偶联已完全，可以进入下一步偶联循环。根据肽序，依次将Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-OH和Fmoc-Val-OH缩合到树脂上，脱除Fmoc得到全保护片段A（AA23-AA28）的肽树脂。
（2）全保护片段B（Fmoc-AA15-A22）的合成
Fmoc-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-OH
称取1240.0g 2-CTC Resin（1.3mmol/g）于50L反应釜中，加入适量的DCM溶涨约30min，抽掉。称取1094.2gFmoc-Val-OH于烧杯中，加入适量DMF溶解，冰浴。再加入563.0mLDIPEA于该烧杯中，活化约10min。活化结束后将氨基酸活化液加入到反应釜中，设定反应温度为30℃，反应约10min后，再加入剩余的1126.0mLDIPEA，反应约2h。反应结束后，抽掉反应液，加入DMF洗涤3遍，再加入适量DCM/无水甲醇/DIPEA=17/2/1(V/V/V)的混合试剂封闭树脂上未反应的功能基团，封闭两次，每次约15min。封闭结束后，加入DMF洗涤3次，抽掉。再加入无水MeOH收缩两次，每次10min。结束后将氨基酸树脂转移至真空干燥箱中干燥至恒重，得到氨基酸重约1533.2g，取样测得Fmoc-Val-CTC Resin替代度为0.63mmol/g。称取1428.6g(900mmol)Fmoc-Val-CTC Resin于反应釜中,加入适量的DCM溶涨约30min,抽掉。加入DBLK脱保护两次，5+15min。脱完保护后，加入DMF洗涤5次，取少许树脂用Kaiser法检测，呈阳性。称取1148.8gFmoc-Glu(OtBu)-OH、437.4gHOBt于烧杯中，加入适量的DMF溶解，冰浴。再加入501.7mLDIC于烧杯中，活化约15min。活化结束后，将氨基酸活化液加入到反应釜中，设定反应温度为30℃，反应2h。截止2h后，抽掉反应液，加入DMF洗涤2遍。取少许树脂Kaiser法检测，结果呈阴性，表明偶联已完全，可进入下一步偶联循环。根据肽序，依次将Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc- Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc- Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH和Fmoc-Asp(OtBu)-OH缩合到树脂上，得到全保护片段全保护片段B（Fmoc-AA15~AA22)肽树脂。加入适量的无水甲醇收缩两次，每次10min，抽掉。将肽树脂转移至真空干燥箱中干燥至恒重，称重得到肽树脂重3100.0g。
将上述中所得的3100.0g 全保护片段B（Fmoc-AA15~AA22)肽树脂置于反应器中，加入25L的TFE/DCM溶液(V/V=1/4)，25℃搅拌反应2h。反应结束后，滤除树脂，收集滤液，通过旋转蒸发仪旋去有机溶剂，得到白色至浅黄色的胶状固体，放入真空干燥箱干燥至恒重，称重为1742.3g。
（3）片段C（AA15-AA28）的合成（A+B）
H-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-R
（R=Wang Resin 或2-Chlorotrityl Chloride Resin）
选取大小合适的烧杯，加入3L DCM/DMSO=3/1(V/V)的混合溶剂，在搅拌状态下逐步加入步骤（2）所得的全保护片段B（FmocAA15~AA22）1742.3g，溶解30min左右。再加入145.8gHOBt于烧杯中，继续搅拌直至全部溶解。使用冰水冷却5min后，量取167.2mLDIC于烧杯中，活化反应约15min。活化结束后，将全保护片段B活化液倒入步骤（1）所得的全保护片段A（AA23-AA28）的肽树脂中，维持30℃反应6h，取少许树脂用Kaiser法检测，结果为阴性，表明片段已缩合完全抽掉反应液，加入DMF洗涤2遍，得到全保护片段C（AA15-AA28）的肽树脂。
（4）片段D（AA5-AA28）肽树脂的合成：
H-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Wang Resin 或2-Chlorotrityl Chloride Resin）
向上述（3）所得的全保护片段C（AA15-AA28）的肽树脂中加入DBLK试剂，脱保护两次，分别为5min和15min,脱完保护后按如下顺序洗涤：DMF×1,无水甲醇×1,DCM×1, DMF×2，取少许树脂用Kaiser法检测，呈阳性,表明Fmoc已脱除。称取421.7g Fmoc-Lys(Boc)-OH、145.8gHOBt于烧杯中，加入适量DMF溶解，冰浴约5min，再加入167.2mLDIC活化约15min。活化结束后，将活化液加入反应釜中，30℃反应2h。抽掉反应液，加入DMF洗涤2遍。取少许树脂，用Kaiser法检测，呈阴性，表明偶联已完全，可以进入下一步偶联循环。根据肽序，依次将Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH和Fmoc-Val-OH缩合到树脂上，脱除Fmoc保护基团后得到全保护片段D（AA5-AA28）肽树脂。
（5）N-末端片段E（Ac-AA1-AA4）的合成
Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-OH
称取1120.0g 2-CTC Resin（1.3mmol/g）于50L反应釜中，加入适量的DCM溶涨约30min，抽掉。称取905.6g Fmoc-Ala-OH于烧杯中，加入适量DMF溶解，冰浴。再加入469mLDIPEA于该烧杯中，活化约10min。活化结束后将氨基酸活化液加入到反应釜中，设定反应温度为30℃，反应约10min后，再加入剩余的939mLDIPEA，维持反应约2h。反应结束后，抽掉反应液，加入DMF洗涤3遍，再加入适量体积之比为DCM、无水甲醇、DIPEA的混合试剂封闭树脂上未反应的功能基团，封闭两次，每次约15min。封闭结束后，加入DMF洗涤3次，抽掉。再加入无水甲醇收缩两次，每次10min。结束后将氨基酸树脂转移至真空干燥箱中干燥至恒重，得到氨基酸重约1452.0g，取样测得Fmoc-Ala-CTC Resin替代度为0.64mmol/g。称取1406.3g(900mmol)Fmoc-Ala-CTC Resin于反应釜中,加入适量的DCM溶涨约30min,抽掉。加入DBLK脱保护两次，5+15min。脱完保护后，加入DMF洗涤5次，取少许树脂用Kaiser法检测，呈阳性。称取840.0gFmoc-Ala-OH、437.4gHOBt于烧杯中，加入适量的DMF溶解，冰浴。再加入501.7mL DIC于烧杯中，活化约15min。活化结束后，将氨基酸活化液加入到反应釜中，设定反应温度为30℃，反应2h。截止2h后，抽掉反应液，加入DMF洗涤2遍。取少许树脂Kaiser法检测，结果呈阴性，表明偶联已完全，可进入下一步偶联循环。依次将Fmoc-Asp(OtBu)-OH和Fmoc-Ala-OH缩合得到树脂上。加入DBLK脱除Fmoc两次，5+15min，再用DMF洗涤4次，抽掉。加入适量的Ac2O/NMM封闭N端，反应约1h后取样用Kaiser法检测，结果显示阴性，表明乙酰化已完全。再加入DMF洗涤4次，无水甲醇收缩两遍，每遍约10min，抽掉。将肽树脂转移至真空干燥箱干燥至恒重，称重得到肽树脂重1890.2g。
将上述中所得的1890.2g 全保护片段E（Ac-AA1~AA4)肽树脂加入装有20L的TFE/DCM=1/4(V/V)混合试剂的反应器中，25℃搅拌反应2h。反应结束后，滤除树脂，收集滤液，通过旋转蒸发仪旋去有机溶剂，得到白色白色粉末状固体，放入真空干燥箱干燥至恒重，称重为492.4g。
（6）片段D和E的缩合（D+E）
Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-R
（R=Wang Resin 或2-Chlorotrityl Chloride Resin）
将上述步骤（5）所得的片段E全溶解于3L DMF/DCM=2/1的混合溶剂中，搅拌溶解约20min。再使用冰水浴冰浴5min,称取145.8gHOBt于该片段溶液中，搅拌至全溶，量取167.2mL于该烧杯中，活化约15min，再投入到上述（4）所得的全保护片段D（AA5-A28）-Wang Resin中，设定反应温度为30℃，反应6h。反应结束后抽掉反应液，按如下顺序洗涤：DMF×1,无水甲醇×1,DCM×1，取少许肽树脂用Kaiser法检测，结果显示为阴性，表明片段已缩合完全，得到胸腺素α1最终肽树脂，再加入适量无水甲醇收缩两次，每次10min,抽掉。将肽树脂转移至真空干燥箱中干燥约12h至恒重，称重为2102.8g。
（7）胸腺素α1粗肽的制备（Ac-AA1-AA28）
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH
配制TFA/间甲酚=97.5/2.5的混合试剂共计16.8L，冰冻约30min后，将所得肽树脂缓缓加入至该混合试剂中，25℃裂解2h，滤除树脂，得到滤液。将滤液缓缓加入至100L冰冷的无水乙醚中，静置约30min后，去除上清液，离心、洗涤、真空干燥得到粗肽973.2g，经HPLC分析粗肽纯度为80.8%。
（8）胸腺素α1粗肽的纯化、脱盐及冻干
将上述（7）所得的粗肽研磨，加水溶解至浓度为5mmol/L充分搅拌至完全溶解，在搅拌状态下向溶解胸腺素α1的容器中滴加10%的稀氨水，调节pH值至7.0，继续搅拌至颗粒充分溶解，溶液呈淡黄色，澄清，无颗粒，再用磷酸调pH至3~4。溶液经0.45μm的水系滤膜过滤，滤除不溶物，得滤液，滤液经直径15cm的硅胶反相高效液相制备柱（粒径10μm，孔径100A）纯化。纯化需分两步，第一步制备流动相为，A相：磷酸（2mL磷酸溶于1L水中，氨水调pH至6.5），B相：乙腈。制备流动相的检测波长为220nm，流速为400mL/min,洗脱梯度B为9%—13%，40分钟，上样量约为10g，收集并合并样品，然后根据HPLC分析检测并定量。
第二步，制备流动相为，A相：0.1%TFA，B相：乙腈，检测波长和流速同一纯，洗脱梯度B由17%—21%，40分钟，上样量约为10g，收集合并纯度大于98%的样品，单杂小于0.5%的样品，然后根据HPLC分析检测并定量，旋转蒸发仪减压（33℃）旋去大部分乙腈。最后再用醋酸铵和纯水脱盐、减压浓缩、冻干得到成品。
在上述纯化过程中，上样量是指所含目的肽的数量，973.2粗肽经过纯化、脱盐及冻干后得到最终成品283.4g（HPLC纯度为99.1%，水分为3.5%），总收率为30.4% 。
附图说明如下：
分析条件为：C8柱，4..6mm×25cm，孔径100A，流速为1ml/min，波长210nm。流动相为：A相位0.1%高氯酸（取1ml的高氯酸，称取2.36g甲烷磺酸钠加纯水定容至1L,用稀得氢氧化钠溶液调pH至2.3），B相为100%乙腈，C相为100%甲醇。检测该批粗肽时梯度为B相：4%，C相34%~38%，20min；检测该批成品时梯度为B相：4%，C相33%~37%，20min
将上述（7）所得的粗肽，加水溶解至浓度为14mmol/L充分搅拌至完全溶解，在搅拌状态下向溶解胸腺素α1的容器中滴加10%的稀氨水520mL左右，调节pH值至3～4，继续搅拌30分钟至颗粒充分溶解，溶液呈淡黄色，澄清，无颗粒。溶液经0.45μm的水系滤膜过滤，滤除不溶物，得滤液,滤液经直径15CM的硅胶反相高效液相制备柱（粒径10微米，孔径100埃）纯化。纯化需分两步，第一步制备流动相为, A相： 1‰TFA，B相：乙腈。制备流动相的检测波长为225nm,流速为400mL/min,洗脱梯度B由10～30%,40分钟，上样量约为15g，收集并合并纯度大于85%的样品，然后根据HPLC分析检测并定量，旋转蒸发仪减压（33℃）旋去大部分乙腈，准备进行二步纯化。
第二步制备流动相为，A相：2‰磷酸（2 mL磷酸溶于1L水中，调pH至6.5），B相：乙腈，检测波长和流速同一纯,洗脱梯度B由10~25%，40分钟，上样量约为18g，收集并合并纯度大于98%的样品，单杂小于0.5%的样品，然后根据HPLC分析检测并定量，旋转蒸发仪减压（33℃）旋去大部分乙腈。最后再用醋酸铵和纯水脱盐、减压浓缩、冻干得到成品。
在上述纯化过程中，上样量是指所含目的肽的数量，973.2g粗肽经纯化、脱盐及冻干后得到最终成品286.7g(HPLC纯度为99.1%，水分为3.5%),总收率为30.7%。
相关附图如下：
分析条件为：C8柱，4.6mm×25cm,孔径100埃，流速为1mL/min，波长215nm。流动相为：A相为1‰高氯酸（取1ml的高氯酸，称取2.36g甲烷磺酸钠加纯水定容至1L,用稀的氢氧化钠溶液调pH至2.3），B相为100%乙腈，C相为100%甲醇。检测该批粗肽时梯度为B相：4%，C相34~38%，20min；检测该批成品时梯度为：B相：4%，C相33~37%，20min。
实施例2
（1）按“片段Ac(1~2)+逐步缩合3~14位氨基酸+Fmoc（15~24）+（25~28）-Wang Resin”合成策略合成四个片段，工艺流程图如下：
Ⅰ、制备（25~28）-Wang Resin
Ⅱ、制备Fmoc(15~24)全保护粗肽
Ⅲ、片段Fmoc(15~24)全保护粗肽与（25~28）-Wang Resin的缩合，并逐步缩合至第3位氨基酸
Ⅳ、制备片段Ac(1~2)全保护粗肽
Ⅴ、片段Ac(1~2)全保护粗肽与（3~28）-Wang Resin的缩合，并裂解成粗肽
Ⅵ、粗肽的纯化、脱盐
具体操作如下：
a.合成片段（25~28）-Wang Resin：称取920.0gWang Resin（1.2mmol/g）于10L反应釜中，加入适量的DCM搅拌溶涨约30min，抽掉液体。称取1976.3gFmoc~Asn(Trt)~OH、536.5gHOBt于烧杯中，加入适量DMF溶解，冰浴约5min,加入615.4mLDIC于烧杯中活化约15min。活化结束后，将氨基酸活化液倒入反应釜中，设定反应温度为35℃，同时开启氮气辅助搅拌，反应约5min后，加入事先溶解好的含40.4gDMAP的DMF溶液，继续反应约1.5h，反应结束后，抽掉反应液，加入适量的DMF洗涤3次，再加入适量的Ac2O/NMM反应5h，以封闭Wang Resin上未反应的功能基团。封闭结束后，抽掉封闭液，加入适量DMF洗涤4次，抽掉，再加入适量的无水MeOH收缩2次，每次10min。结束后，将氨基酸树脂转移至真空干燥箱中干燥至恒重，称得氨基酸树脂重量为1179.4g,取样测得Fmoc~Asn
(Trt)-Wang Resin替代度为0.38mmol/g。称取789.5g（300mmol）Fmoc~Asn(Trt)-Wang Resin于10L反应釜中，加入适量DCM溶涨约30min，溶涨结束后，抽掉DCM。加入DBLK脱保护两次，5+15min。脱完保护后，按如下顺序洗涤：DMF×1,无水MeOH×1,DCM×1, DMF×2，取少许树脂用Kaiser法检测，呈阳性。称取319.1g Fmoc~Glu (OtBu)~OH和121.5gHOBt于烧杯中，加入适量DMF溶解，冰浴约5min，再加入139.4mLDIC活化约15min。活化结束后，将活化液倒入反应釜中，设定反应温度为35℃，反应2h。截止2h时，抽掉反应液，加入DMF洗涤2遍。取少许树脂，用Kaiser法检测，呈阴性，表明偶联已完全，可以进入下一步偶联循环。根据肽序和逐步缩合法（从C端至N端），合成至第25位氨基酸结束，并脱除Fmoc进入下一步片段缩合。
b．合成Fmoc(15~24)：称取1050.0g2~CTC Resin（1.1mmol/g）于50L反应釜中，加入适量的DCM溶涨约30min，抽掉。称取982.9gFmoc~Glu(OtBu)~OH于烧杯中，加入适量DMF溶解，冰浴。再加入504.0mLDIPEA于该烧杯中，活化约10min。活化结束后将氨基酸活化液加入到反应釜中，设定反应温度为35℃，反应约10min后，再加入剩余的1009.0mLDIPEA，反应约2h。反应结束后，抽掉反应液，加入DMF洗涤3遍，再加入适量DCM/无水MeOH/DIPEA=17/2/1(V/V/V)的混合试剂封闭树脂上未反应的功能基团，封闭两次，每次约15min。封闭结束后，加入DMF洗涤3次，抽掉。再加入无水MeOH收缩两次，每次10min。结束后将氨基酸树脂转移至真空干燥箱中干燥至恒重，得到氨基酸重约1345.2g，取样测得Fmoc~Glu(OtBu)~CTC Resin替代度为0.68mmol/g。称取1323.5g(900mmol)Fmoc~Glu(OtBu)
~CTC Resin于反应釜中,加入适量的DCM溶涨约30min,抽掉。加入DBLK脱保护两次，5+15min。脱完保护后，加入DMF洗涤5次，取少许树脂用Kaiser法检测，呈阳性。称取1148.9gFmoc~Glu(OtBu)~OH、364.5gHOBt于烧杯中，加入适量的DMF溶解，冰浴。再加入418.1mLDIC于烧杯中，活化约15min。活化结束后，将氨基酸活化液加入到反应釜中，设定反应温度为35℃，反应2h。截止2h后，抽掉反应液，加入DMF洗涤2遍。取少许树脂Kaiser法检测，结果呈阴性，表明偶联已完全，可进入下一步偶联循环。根据肽序和逐步缩合法(从C端至N端)合成至第15位氨基酸结束，保留Fmoc。加入适量的无水MeOH收缩两次，每次10min，抽掉。将肽树脂转移至真空干燥箱中干燥至恒重，称重得到肽树脂重2990.0g,待进入下一步操作。
c．合成片段Ac(1~2)：称取1250.0g2~CTC Resin（1.1mmol/g）于50L反应釜中，加入适量的DCM溶涨约30min，抽掉。称取1131.5gFmoc~Asp(OtBu)~OH于烧杯中，加入适量DMF溶解，冰浴。再加入480mLDIPEA于该烧杯中，活化约10min。活化结束后将氨基酸活化液加入到反应釜中，设定反应温度为30℃，反应约10min后，再加入剩余的961mLDIPEA，维持反应约2h。反应结束后，抽掉反应液，加入DMF洗涤3遍，再加入适量体积之比为DCM、无水MeOH、DIPEA的混合试剂封闭树脂上未反应的功能基团，封闭两次，每次约15min。封闭结束后，加入DMF洗涤3次，抽掉。再加入无水MeOH收缩两次，每次10min。结束后将氨基酸树脂转移至真空干燥箱中干燥至恒重，得到氨基酸重约1680.0g，取样测得Fmoc~Ala
~CTC Resin替代度为0.62mmol/g。称取1451.6g(900mmol)Fmoc~Asp(OtBu)~CTC Resin于反应釜中,加入适量的DCM溶涨约30min,抽掉。加入DBLK脱保护两次，5+15min。脱完保护后，加入DMF洗涤5次，取少许树脂用Kaiser法检测，呈阳性。称1035.2gFmoc~Ser(tBu)~OH、
364.5gHOBt于烧杯中，加入适量的DMF溶解，冰浴。再加入418.0mLDIC于烧杯中，活化约15min。活化结束后，将氨基酸活化液加入到反应釜中，设定反应温度为35℃，反应2h。截止2h后，抽掉反应液，加入DMF洗涤2遍。取少许树脂Kaiser法检测，结果呈阴性，表明偶联已完全，可进入下一步偶联循环。根据肽序和逐步缩合法，合成至第1位氨基酸后，加入DMF洗涤2遍，抽掉。加入DBLK脱除Fmoc两次，5+15min，再用DMF洗涤4次，抽掉。加入适量的Ac2O/NMM封闭N端，反应约1h后取样用Kaiser法检测，结果显示阴性，表明乙酰化已完全。再加入DMF洗涤4次，无水MeOH收缩两遍，每遍约10min，抽掉。将肽树脂转移至真空干燥箱干燥至恒重，称重得到肽树脂重1862.7g，待下步操作。
（2）裂解全保护肽
a. 将上述步骤（1）中所得的2990.0g片段Fmoc(15~24)肽树脂投入装有24L的TFE/DCM=1/4(V/V)混合试剂的容器中，30℃搅拌反应2h。反应结束后，滤除树脂，收集滤液，通过旋转蒸发仪旋去有机溶剂，得到白色至浅黄色的胶状固体，放入真空干燥箱干燥至恒重，称重为1814.1g,待下步操作。
b. 使用同样的操作方法将Ac(1~2)肽树脂裂解成全保护肽，抽干得到固体，重量分别为412.4g，待下步操作。
（3）将全保护肽片段Fmoc（15~24）和（25~28）-Wang Resin缩合，并逐步缩合至第3位氨基酸。选取大小合适的烧杯，加入3L DCM/DMSO=3/1(V/V)的混合溶剂，在搅拌状态下逐步加入步骤（2）所得的片段（7~14）全保护粗肽，溶解30min左右。再加入145.8gHOBt于烧杯中，继续搅拌直至全部溶解。使用冰水冰浴5min后，量取167.2mLDIC于烧杯中，活化反应约15min。活化结束后，将该活化液倒入步骤（1）所得的（25~28）-Wang Resin中反应。设定反应温度35℃，维持反应6h。反应6h后，抽掉反应液，加入DMF洗涤2遍，取少许树脂用Kaiser法检测，结果为阴性，表明片段已缩合完全，可进入下步操作。加入DBLK试剂，脱保护两次，分别为5min和15min,脱完保护后按如下顺序洗涤：DMF×1,无水MeOH×1,DCM×1, DMF×2，取少许树脂用Kaiser法检测，呈阳性,表明Fmoc已脱除。称取843.3g Fmoc~Lys(Boc)~OH、291.6gHOBt于烧杯中，加入适量DMF溶解，冰浴约5min，再加入334.5mLDIC活化约15min。活化结束后，将活化液倒入反应釜中，设定反应温度为35℃，反应2h。截止2h时，抽掉反应液，加入DMF洗涤2遍。取少许树脂，用Kaiser法检测，呈阴性，表明偶联已完全，可以进入下一步偶联循环。根据肽序和逐步缩合法，合成至第24位氨基酸结束，并脱除Fmoc,待进入下一步片段缩合。将上述步骤（2）所得的Ac(1~2)全保护肽粗肽溶解于3L DMF/DCM=2/1的混合溶剂中，搅拌溶解约20min。再使用冰水浴冰浴5min,称取291.6gHOBt于该片段溶液中，搅拌至全溶，量取167.2mL于该烧杯中，活化约15min，再投入到上步所得的片段（1~24）肽树脂中，设定反应温度为35℃，反应6h。反应结束后抽掉反应液，按如下顺序洗涤：DMF×1,无水MeOH×1,DCM×1，取少许肽树脂用Kaiser法检测，结果显示为阴性，表明片段已缩合完全，得到胸腺素α1最终肽树脂，再加入适量无水MeOH收缩两次，每次10min,抽掉。将肽树脂转移至真空干燥箱中干燥至恒重，称重为2084.6g。配制TFA/间甲酚=97.5/2.5的混合试剂共计16.8L，冰冻约30min后，将所得肽树脂缓缓加入至该混合试剂中，设定裂解温度为28℃，裂解时间为2h。裂解截止后，滤除树脂，得到滤液。将滤液缓缓加入至100L冰冻的无水乙醚中，静置约30min后，去除上清液，离心、洗涤、真空干燥得到粗肽946.0g,经检测粗肽纯度为81.6%。
（5）胸腺素α1粗肽的纯化、脱盐及冻干：将上述所得的粗肽，加水溶解至浓度为14mmol/L充分搅拌至完全溶解，在搅拌状态下向溶解胸腺素α1的容器中滴加10%的稀氨水512mL左右，调节pH值至3～4，继续搅拌30分钟至颗粒充分溶解，溶液呈淡黄色，澄清，无颗粒。溶液经0.45μm的水系滤膜过滤，滤除不溶物，得滤液,滤液经直径15CM的硅胶反相高效液相制备柱（粒径10微米，孔径100埃）纯化。纯化需分两步，第一步制备流动相为, A相： 1%CH3COOH，B相：乙腈。制备流动相的检测波长为225nm,流速为400mL/min,洗脱梯度B由15～36%,40分钟，上样量约为15g，收集并合并纯度大于85%的样品，然后根据HPLC分析检测并定量，旋转蒸发仪减压（33℃）旋去大部分乙腈，准备进行二步纯化。第二步制备流动相为，A相：PBS（1LH2O中加入35mLKH2PO4,用KOH调节pH至7）, B相：乙腈,检测波长和流速同一纯,洗脱梯度B由18~28%,40分钟，上样量约为18g，收集并合并纯度大于98%的样品，单杂小于0.5%的样品，然后根据HPLC分析检测并定量，旋转蒸发仪减压（33℃）旋去大部分乙腈。最后再用醋酸铵和纯水脱盐、减压浓缩、冻干得到成品。
在上述纯化过程中，上样量是指所含目的肽的数量，946.0g粗肽经纯化、脱盐及冻干后得到最终成品290.9g(HPLC纯度为99.3%，水分为2.5%),总收率为31.2%。
相关附图如下：
分析条件为：C8柱，4.6mm×25cm,孔径100埃，流速为1mL/min。流动相为：A相为1‰高氯酸（取1ml的高氯酸，称取2.36g甲烷磺酸钠加纯水定容至1L,用稀的氢氧化钠溶液调pH至2.3），B相为100%乙腈，C相为100%甲醇。检测该批粗肽时梯度为B相：4%，C相33~37%，20min；检测该批成品时梯度为：B相：4%，C相34~38%，20min
实施例3
（1）按“Ac+ Fmoc(1~4)+逐步缩合5~14位氨基酸+Fmoc（15~22）+（23~28）-Wang Resin”合成策略合成所需的三个片段，工艺流程图如下：
Ⅰ、制备（23~28）-Wang Resin
Ⅱ、制备片段Fmoc(15~22)全保护粗肽
Ⅲ、片段Fmoc(15~22)全保护粗肽与（23~28）-Wang Resin的缩合，并逐步缩合至第5位氨基酸
Ⅳ、制备片段Fmoc(1~4)全保护粗肽
Ⅴ、片段Fmoc(1~4)全保护粗肽与（5~28）-Wang Resin的缩合，乙酰化后裂解成粗肽
Ⅵ、粗肽的纯化、脱盐
具体操作如下：
a.合成（23~28）-Wang Resin：称取1100.0gWang Resin（1.0mmol/g）于10L反应釜中，加入适量的DCM搅拌溶涨约30min，抽掉液体。称取1312.7gFmoc-Asn(Trt)-OH、356.4
gHOBt于烧杯中，加入适量DMF溶解，冰浴约5min,加入408.8mLDIC于烧杯中活化约15min。活化结束后，将氨基酸活化液倒入反应釜中，设定反应温度为25℃，同时开启氮气辅助搅拌，反应约5min后，加入事先溶解好的含26.8gDMAP的DMF溶液，继续反应约1.5h，反应结束后，抽掉反应液，加入适量的DMF洗涤3次，再加入适量的Ac2O/NMM反应5h，以封闭Wang Resin上未反应的功能基团。封闭结束后，抽掉封闭液，加入适量DMF洗涤4次，抽掉，再加入适量的无水MeOH收缩2次，每次10min。结束后，将氨基酸树脂转移至真空干燥箱中干燥至恒重，称得氨基酸树脂重量为1312.7g,取样测得Fmoc~Asn(Trt)-Wang Resin替代度为0.28mmol/g。称取1071.4g（300mmol）Fmoc~Asn(Trt)-Wang Resin于10L反应釜中，加入适量DCM溶涨约30min，溶涨结束后，抽掉DCM。加入DBLK脱保护两次，5+15min。脱完保护后，按如下顺序洗涤：DMF×1,无水MeOH×1,DCM×1, DMF×2，取少许树脂用Kaiser法检测，呈阳性。称取255.3g Fmoc~Glu (OtBu)~OH、216.2gHBTU和81.0gHOBt于烧杯中，加入适量DMF溶解，冰浴约5min，再加入210.0mLDIPEA活化约15min。活化结束后，将活化液倒入反应釜中，设定反应温度为25℃，反应2h。截止2h时，抽掉反应液，加入DMF洗涤2遍。取少许树脂，用Kaiser法检测，呈阴性，表明偶联已完全，可以进入下一步偶联循环。根据肽序和逐步缩合法(从C端至N端合成)，合成至第6位氨基酸结束，并脱除Fmoc进入下一步片段缩合。
b．合成片段Fmoc-（15~22）：称取1300.0g2-CTC Resin（1.2mmol/g）于50L反应釜中，加入适量的DCM溶涨约30min，抽掉。称取1588.4gFmoc-Val-OH于烧杯中，加入适量DMF溶解，冰浴。再加入817.0mLDIPEA于该烧杯中，活化约10min。活化结束后将氨基酸活化液加入到反应釜中，设定反应温度为25℃，反应约10min后，再加入剩余的1635.0mLDIPEA，反应约2h。反应结束后，抽掉反应液，加入DMF洗涤3遍，再加入适量二氯甲烷/无水甲醇/DIPEA=17/2/1(V/V/V)的混合试剂封闭树脂上未反应的功能基团，封闭两次，每次约15min。封闭结束后，加入DMF洗涤3次，抽掉。再加入无水甲醇收缩两次，每次10min。结束后将氨基酸树脂转移至真空干燥箱中干燥至恒重，得到氨基酸重约1631.0g，取样测得Fmoc-Val-CTC Resin替代度为0.67mmol/g。称取1343.3g(900mmol)Fmoc-Val-CTC Resin于反应釜中,加入适量的DCM溶涨约30min,抽掉。加入DBLK脱保护两次，5+15min。脱完保护后，加入DMF洗涤5次，取少许树脂用Kaiser法检测，呈阳性。称取765.9gFmoc
-Glu(OtBu)-OH、648.6gHBTU、243.0gHOBt于烧杯中，加入适量的DMF溶解，冰浴。再加入628.8mLDIPEA于烧杯中，活化约15min。活化结束后，将氨基酸活化液加入到反应釜中，设定反应温度为25℃，反应2h。截止2h后，抽掉反应液，加入DMF洗涤2遍。取少许树脂Kaiser法检测，结果呈阴性，表明偶联已完全，可进入下一步偶联循环。根据肽序和逐步缩合法(从C端至N端)，合成至第22位氨基酸结束，保留Fmoc。加入适量的无水甲醇收缩两次，每次10min，抽掉。将肽树脂转移至真空干燥箱中干燥至恒重，称重得到肽树脂重3024.1g,待进入下一步操作。
C．合成片段Fmoc (1~4)：称取1200.0g2-CTC Resin（1.2mmol/g）于50L反应釜中，加入适量的DCM溶涨约30min，抽掉。称取1344.0gFmoc-Ala-OH于烧杯中，加入适量DMF溶解，冰浴。再加入754.0mLDIPEA于该烧杯中，活化约10min。活化结束后将氨基酸活化液加入到反应釜中，设定反应温度为25℃，反应约10min后，再加入剩余的1509.0mLDIPEA，维持反应约2h。反应结束后，抽掉反应液，加入DMF洗涤3遍，再加入适量体积之比为DCM、无水甲醇、DIPEA的混合试剂封闭树脂上未反应的功能基团，封闭两次，每次约15min。封闭结束后，加入DMF洗涤3次，抽掉。再加入无水甲醇收缩两次，每次10min。结束后将氨基酸树脂转移至真空干燥箱中干燥至恒重，得到氨基酸重约1460.0g，取样测得Fmoc-Ala-CTC Resin替代度为0.65mmol/g。称取1384.7g(900mmol)Fmoc-Ala-CTC Resin于反应釜中,加入适量的DCM溶涨约30min,抽掉。加入DBLK脱保护两次，5+15min。脱完保护后，加入DMF洗涤5次，取少许树脂用Kaiser法检测，呈阳性。称取560.0gFmoc~Ala~OH、648.6gHBTU、243.0gHOBt于烧杯中，加入适量的DMF溶解，冰浴。再加入628.7mLDIPEA于烧杯中，活化约15min。活化结束后，将氨基酸活化液加入到反应釜中，设定反应温度为25℃，反应2h。截止2h后，抽掉反应液，加入DMF洗涤2遍。取少许树脂Kaiser法检测，结果呈阴性，表明偶联已完全，可进入下一步偶联循环。根据肽序和逐步缩合法，合成至第4位氨基酸后，加入DMF洗涤4次，无水MeOH收缩两遍，每遍约10min，抽掉。将肽树脂转移至真空干燥箱干燥至恒重，称重得到肽树脂重1944.7g，待下步操作。
（2）裂解全保护肽
a. 将上述步骤（1）中所得的3024.1g片段Fmoc (15~22)肽树脂投入装有25L的TFE/DCM=1/4(V/V)混合试剂的容器中，30℃搅拌反应2h。反应结束后，滤除树脂，收集滤液，通过旋转蒸发仪旋去有机溶剂，得到白色至浅黄色的胶状固体，放入真空干燥箱干燥至恒重，称重为1735.0g,待下步操作。
b. 使用同样的操作方法将片段Fmoc(1~4)肽树脂裂解成全保护肽，抽干得到白色粉末状固体，称重为487.0g，待下步操作。
（3）将全保护肽片段Fmoc（15~22）和（23~28）-Wang Resin缩合，从C端至N端逐步缩合至第5位氨基酸。选取大小合适的烧杯，加入3L DCM/DMSO=3/1(V/V)的混合溶剂，在搅拌状态下逐步加入步骤（2）所得的片段Fmoc（15~22）全保护粗肽，溶解30min左右。再加入468.4gPyBOP、121.5gHOBt于烧杯中，继续搅拌直至全部溶解。使用冰水冰浴5min后，量取200.0mLNMM于烧杯中，活化反应约15min。活化结束后，将该活化液倒入步骤（1）所得的片段（23~28）-Wang Resin中反应。设定反应温度30℃，维持反应4h。反应4h后，抽掉反应液，加入DMF洗涤2遍，取少许树脂用Kaiser法检测，结果为阴性，表明片段已缩合完全，可进入下步操作。加入DBLK试剂，脱保护两次，分别为5min和15min,脱完保护后按如下顺序洗涤：DMF×1,无水MeOH×1,DCM×1, DMF×2，取少许树脂用Kaiser法检测，呈阳性,表明Fmoc已脱除。称取281.1g Fmoc~Lys(Boc)~OH、216.2gHBTU、81.0gHOBt于烧杯中，加入适量DMF溶解，冰浴约5min，再加入210.0mLDIPEA活化约15min。活化结束后，将活化液倒入反应釜中，设定反应温度为25℃，反应2h。截止2h时，抽掉反应液，加入DMF洗涤2遍。取少许树脂，用Kaiser法检测，呈阴性，表明偶联已完全，可以进入下一步偶联循环。根据肽序和逐步缩合法，合成至第24位氨基酸结束，并脱除Fmoc,待进入下一步片段缩合。将上述步骤（2）所得的Fmoc(1~4)全保护肽粗肽溶解于3L DMF/DCM=2/1的混合溶剂中，搅拌溶解约20min。再使用冰水浴冰浴5min,称取468.4gPyBOP、121.5gHOBt于该片段溶液中，搅拌至全溶，量取200.0mLNMM于该烧杯中，活化约15min，再投入到上步所得的片段（5~28）-Wang Resin中，设定反应温度为30℃，反应4h。反应结束后抽掉反应液，按如下顺序洗涤：DMF×1,无水MeOH×1,DCM×1，取少许肽树脂用Kaiser法检测，结果显示为阴性，表明片段已缩合完全。加入DBLK脱保护两次，分别为5+15min。脱完保护后，按如下顺序洗涤：DMF×1,无水MeOH×1,DCM×1, DMF×2，取少许树脂用Kaiser法检测，呈阳性。加入适量体积的Ac2O和NMM作为乙酰化试剂，反应约1h后抽掉。再依次加入DMF、无水MeoH和DCM各洗涤1遍。取少许树脂用Kaiser法检测，呈阴性，表明乙酰化已完全，得到胸腺素α1最终肽树脂。再加入适量无水MeOH收缩两次，每次10min,抽掉。将肽树脂转移至真空干燥箱中干燥至恒重，称重为2075.3g。配制TFA/间甲酚=97.5/2.5的混合试剂共计16.8L，冰冻约30min后，将所得肽树脂缓缓加入至该混合试剂中，设定裂解温度为25℃，裂解时间为2h。裂解截止后，滤除树脂，得到滤液。将滤液缓缓加入至100L冰冻的无水乙醚中，静置约30min后，去除上清液，离心、洗涤、真空干燥得到粗肽934.2g，经HPLC分析粗肽纯度为81.6%。
（5）胸腺素α1粗肽的纯化、脱盐及冻干：将上述所得的粗肽，加水溶解至浓度为14mmol/L充分搅拌至完全溶解，在搅拌状态下向溶解胸腺素α1的容器中滴加10%的稀氨水520mL左右，调节pH值至3～4，继续搅拌30分钟至颗粒充分溶解，溶液呈淡黄色，澄清，无颗粒。溶液经0.45μm的水系滤膜过滤，滤除不溶物，得滤液,滤液经直径15CM的硅胶反相高效液相制备柱（粒径10微米，孔径100埃）纯化。纯化需分两步，第一步制备流动相为, A相： 1‰TFA，B相：乙腈。制备流动相的检测波长为225nm,流速为400mL/min,洗脱梯度B由12～34%,40分钟，上样量约为15g，收集并合并纯度大于85%的样品，然后根据HPLC分析检测并定量，旋转蒸发仪减压（33℃）旋去大部分乙腈，准备进行二步纯化。第二步制备流动相为，A相：2‰磷酸（2 mL磷酸溶于1L水中，调pH至6.5）, B相：乙腈,检测波长和流速同一纯,洗脱梯度B由13~28%,40分钟，上样量约为18g，收集并合并纯度大于98%的样品，单杂小于0.5%的样品，然后根据HPLC分析检测并定量，旋转蒸发仪减压（33℃）旋去大部分乙腈。最后再用醋酸铵和纯水脱盐、减压浓缩、冻干得到成品。
在上述纯化过程中，上样量是指所含目的肽的数量，934.2g粗肽经纯化、脱盐及冻干后得到最终成品287.2g(HPLC纯度为99.2%，水分为3.0%),总收率为30.8%。
相关附图如下：
分析条件为：C8柱，4.6mm×25cm,孔径100埃，流速为1mL/min，波长215nm。流动相为：A相为1‰高氯酸（取1ml的高氯酸，称取2.36g甲烷磺酸钠加纯水定容至1L,用稀的氢氧化钠溶液调pH至2.3），B相为100%乙腈，C相为100%甲醇。检测该批粗肽时梯度为B相：4%，C相33~37%，20min；检测该批成品时梯度为：B相：4%，C相34~38%，20min
综上，本发明胸腺素α1的固相片段合成方法，其解决胸腺素α1化学合成方法中上述提到的缩合困难、效率不高且收率低下的问题。本发明人通过分析实验数据，发现在用标准的Fmoc~固相法生产胸腺素α1的过程中面临的主要困难有：（1）在C-端第9到14位的6个Fmoc~保护氨基酸的缩合很困难，是典型的多肽合成中的困难序列，缩合和Fmoc脱除都很困难，往往需要多次，不仅增加了物料消耗和生产时间，而且造成合成的粗肽纯度很低；（2）在靠近N端的几个Fmoc~保护氨基酸缩合不完全时，特别是25位和26位的Ala缺失时引入的杂质与目的产物性质很接近，在HPLC上很难分离，难以获得高品质的胸腺素α1原料药；再次，本发明根据胸腺素α1的序列结构特点，在合成困难序列的区域采用片段缩合法巧妙地解决了逐步缩合法中困难序列的合成难题，在产生难分离杂质的区域用片段缩合方法解决了关键杂质的控制问题，而在合成难度不大的区域仍采用逐步缩合的策略，提供了一种高收率、低成本、操作简单、方便中控、效率高。此工艺中得到纯度约80%的粗肽，远优于现有文献报道的胸腺素α1的制备工艺，可以大规模地生产高纯度的胸腺素α1原料药；合成的粗肽纯度可达到80%左右，易纯化，总收率可达到30%。本发明方法生产胸腺素α1的总收率和产品质量比文献报道的其它方法均有了较大幅度的提高，且生产周期能缩短40-50%，降低了生产成本，适合于规模化制备高纯度的胸腺素α1。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种胸腺素α1的固相片段合成方法，其特征在于：包括以下步骤：
胸腺素α1为：
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH，所述胸腺素α1从C端到N端分为C末端片段A、片段B和N末端片段E；所述C末端片段A包括4~6个氨基酸，所述片段B包括8~10个氨基酸，所述N末端片段E包括2~4个氨基酸，所述C末端片段A和片段B在肽序上为连续片段；
所述C末端片段A通过以下工艺获得：
步骤一、将Fmoc-Asn(Trt)-OH、HOBt在溶剂中溶解后，再加入DIC活化形成氨基酸活化液；
步骤二、将所述氨基酸活化液、Wang Resin树脂混合并加入二甲氨基吡啶进行缩合反应获得 ，再去除Fmoc保护基；
步骤三、再根据肽序循环步骤一和步骤二，依次将Fmoc-Glu (OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-OH和Fmoc-Val-OH全部或部分缩合到树脂上，脱除Fmoc得到全保护C末端片段A的肽树脂；
所述片段B通过以下工艺获得：
步骤一、将Fmoc-Glu (OtBu)-OH或者Fmoc-Val-OH在溶剂中溶解后，加入所需DIPEA总量的2/3，活化形成氨基酸活化液；
步骤二、将所述氨基酸活化液、2-CTC Resin树脂混合并加入剩余1/3DIPEA进行缩合反应获得氨基酸-CTC Resin树脂，再去除Fmoc保护基获得脱保护氨基酸-CTC Resin树脂；
步骤三、将Fmoc-Val-OH或者Fmoc-Glu (OtBu)-OH与HOBt在溶剂中溶解后，再加入DIC/HOBt活化形成氨基酸活化液；
步骤四、将步骤三所述氨基酸活化液、步骤二的脱保护氨基酸-CTC Resin树脂混合进行缩合反应获得中间氨基酸-CTC Resin树脂；
步骤五、再根据肽序循环步骤三和步骤四，按照肽序依次将若干个氨基酸直到Fmoc-Asp(OtBu)-OH逐步缩合到步骤四的树脂上，再通过TFE/DCM溶液(V/V=1/4)将多肽与树脂分离从而获得全保护片段B；
将所述全保护片段B加入DCM/DMSO的混合溶剂，再依次加入DIC /HOBt活化后，再加入所述全保护C末端片段A的肽树脂，缩合反应合成全保护片段C；
按照肽序，在全保护片段C的肽树脂依次将Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH和Fmoc-Ser(tBu)-OH中全部或部分偶联到全保护片段C上，脱除Fmoc保护基团后得到全保护片段D肽树脂；
所述N末端片段E为逐步缩合法依次完成Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH和Fmoc-Ser(tBu)-OH中全部或部分与2-CTC Resin树脂缩合，再将多肽与树脂分离从而获得片段E；
将片段E全溶解于DMF/DCM=2/1的混合溶剂中，加入HOBt搅拌至全溶，，再投入所述全保护片段D肽树脂，得到胸腺素α1肽树脂；
将胸腺素α1肽树脂加入裂解混合试剂，裂解2h，滤除树脂，得到滤液，将滤液缓缓加入至冰冷的无水乙醚中，静置，去除上清液，离心、洗涤、真空干燥得到粗肽胸腺素α1。
2.根据权利要求1所述的胸腺素α1的固相片段合成方法，其特征在于：合成片段A时，制备Fmoc-Asn(Trt)-Wang Resin时，各原料的摩尔比为WangResin/Fmoc-Asn(Trt)-OH/DIC/HOBt/DMAP = 1/2~4/2~4/2~4/0.2~0.4，反应温度为20~35℃，反应时间为1~2h。
3.根据权利要求1所述的胸腺素α1的固相片段合成方法，其特征在于：所述裂解混合试剂为为TFA/间甲酚=97.5/2.5(V/V)，或者TFA/苯甲硫醚/EDT/苯甲醚=90/5/3/2（V/V/V/V）。
4.根据权利要求1所述的胸腺素α1的固相片段合成方法，其特征在于：所述片段B工艺中多肽与树脂分离具体为：将全保护片段B肽树脂置于反应器中，加入25L的TFE/DCM溶液(V/V=1/4)，25℃搅拌反应2h，反应结束后，滤除树脂，收集滤液，通过旋转蒸发仪旋去有机溶剂，得到白色至浅黄色的胶状固体，放入真空干燥箱干燥至恒重。
5.根据权利要求1所述的胸腺素α1的固相片段合成方法，其特征在于：还包括以下步骤将粗肽胸腺素α1进行纯化、脱盐及冻干，其中纯化方式具体为：使用制备流动相的组合为：一纯：A相为1‰TFA，B相为乙腈；二纯：A相为2‰磷酸，B相为乙腈；脱盐时A相为50-100mmol/L的醋酸铵水溶液+纯水，B相为乙腈，分析流动相采用：A相为1‰高氯酸（取1ml的高氯酸，称取2.36g甲烷磺酸钠加纯水定容至1L,用稀的氢氧化钠溶液调pH至2.3），B相为100%乙腈，C相为100%甲醇。
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