CN112679600A - 固液相结合制备胸腺法新的方法 - Google Patents

固液相结合制备胸腺法新的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了固液相结合制备胸腺法新的方法，本发明所述方法包括如下步骤：以CTC Resin为固相载体合成胸腺法新1‑16个氨基酸的全保护肽作为第一片段，并且在N末端乙酰化氨基；合成第16‑28个氨基酸的全保护肽作为第二片段；在液相里将第一片段和第二片段偶联，得到胸腺法新全保护肽，经裂解、纯化、冻干得胸腺法新成品。该方法可以两片段同时固相合成，有效的缩短40％的合成周期、提高粗肽纯度，降低下游纯化制备难度，提高了总收率，适合于工业化生产。

Description

固液相结合制备胸腺法新的方法
技术领域
本发明涉及多肽药物固相合成领域，特别涉及固液相结合制备胸腺法新的方法。
背景技术
中文名称：胸腺法新
英文名称：Thymalfasin
肽序结构：
Ac-Ser1-Asp2-Ala3-Ala4-Val5-Asp6-Thr7-Ser8-Ser9-Glu10-Ile11-Thr12-Thr13-Lys14-Asp15-Leu16-Lys17-Glu18-Lys19-Lys20-Glu21-Val22-Val23-Glu24-Glu25-Ala26-Glu27-Asn28-OH
Cas号：69440-99-9
分子量：3108.3
分子式：C129H215N33O55
胸腺法新由美国赛生公司开发上市，剂型为冻干粉针注射剂，1995年前后进入中国。目前用于乙型和丙型肝炎的治疗及作为免疫增强剂供肿瘤病人使用，已获30多个国家批准胸腺法新。该品具有促进T细胞分化、成熟，提高NK细胞活性，促进T细胞分泌各类淋巴因子，提高IL-2受体对IL-2的亲合力等作用，可增强NK细胞的数量和活性，通过对辅助T细胞、细胞毒淋巴细胞及NK细胞等免疫细胞的增殖作用，间接地杀死受病毒感染的肝细胞及肿瘤细胞。
当前胸腺法新的制备方法主要为固相合成法，但胸腺法新分子结构中已经形成了大量的β折叠结构，如逐个氨基酸从C端到N端进行接肽，会出现偶联困难的现象，因此，降低了氨基酸的偶联效率，增加了分离纯化的难度。
CN104987382 A中介绍了一种采用液相方式合成连续氨基酸的二肽片段，以二肽片段投料固相合成胸腺法新的方法，该方法一定程度上缩短了固相合成周期，但有大量的二肽片段需要合成，实际上大大增加了整个合成周期，且工序繁琐；CN101484467报道了利用假脯氨酸二肽固相合成胸腺法新的工艺，该方法一定程度上降低了困难序列偶联的难度，但是不能有效避免缺失肽等杂质的生成；CN101104638A报道了胸腺法新的固相合成工艺，即以Fmoc-Rink Amide树脂或Fmoc-Rink Amide MBHA树脂为载体，将Fmoc-Asp-X的侧链羧基与树脂氨基相连，采用Fmoc策略依次固相合成序列剩余氨基酸的方法。该方法本质上还是逐个偶联的方法，对困难序列部分不能有效的降低难度。
发明内容
为解决胸腺法新合成中存在的以上缺陷，本发明提供了片段法固液相结合制备胸腺法新的新方法。
根据本发明技术的一方面提供了一种固液相结合制备胸腺法新的方法，该方法步骤如下：
(1)固相合成胸腺法新1-16个氨基酸，并乙酰化N端的氨基，裂解全保护肽作为第一片段；
(2)固相载体合成胸腺法新17-28个氨基酸，裂解全保护作为第二片段；
(3)第一片段与第二片段在液相里偶联，合成胸腺法新全保护肽；
(4)经裂解、纯化、冻干得胸腺法新成品。
根据本发明技术的一方面提供了一种固液相结合制备胸腺法新的方法，该方法步骤(1)与/或步骤(2)中所使用的树脂为2-C1-CTC Resin，取代度为0.6～1.2mmol/g。
根据本发明技术的一方面提供了一种固液相结合制备胸腺法新的方法，该方法步骤(1)中肽链完成合成时，使用AC2O在碱性条件下乙酰化肽链N末端的氨基。
根据本发明技术的一方面提供了一种固液相结合制备胸腺法新的方法，该方法步骤(1)中乙酰化第一片段N末端氨基时使用的碱为Py、NMM、DIEA、TEA、TMP中的任一种。
根据本发明技术的一方面提供了一种固液相结合制备胸腺法新的方法，该方法步骤(1)与/或步骤(2)中制备的氨基酸树脂的取代度为0.3-0.8mmol/g。
根据本发明技术的一方面提供了一种固液相结合制备胸腺法新的方法，该方法步骤(1)与/或步骤(2)中全保护片段的裂解试剂为15％～30％V/V TFE/DCM或0.5％～3％V/VTFA/DCM。
根据本发明技术的一方面提供了一种固液相结合制备胸腺法新的方法，该方法步骤(1)与/或步骤(2)中所使用的缩合剂为HoBt/DIC、HoAt/DIC、Cl-HOBt/DIC、HOOBt/DIC中的任一种，其中DIC可以替换为DCC、EDC.HCl中的任一种；或是HATU/HoBt/DIEA、HBTU/HoBt/DIEA、HCTU/HoBt/DIEA、TATU/HoBt/DIEA、TBTU/HoBt/DIEA、PyBOP/HoBt/DIEA或PyAOP/HoBt/DIEA中的任一种，其中DIEA可以替换为NMM、TMP或TEA中的任一种；所使用的反应溶剂为DMF、DCM、DMSO、DMA、NMP中的一种或几种组合；所使用脱Fmoc的试剂为15％～30％V/V的哌啶/DMF溶液或1％～5％V/V的DBU/DMF溶液，脱除两次，每次5min～20min。
根据本发明技术的一方面提供了一种固液相结合制备胸腺法新的方法，该方法步骤(3)中使用缩合剂组合为DCC/HOSu、EDC·HCl/HOSU中任一种。
根据本发明技术的一方面提供了一种固液相结合制备胸腺法新的方法，该方法步骤(4)中采用的裂解试剂为TFA∶间甲酚＝80～95∶5～20
根据本发明技术的一方面提供了一种固液相结合制备胸腺法新的方法，该方法步骤(4)中采用的裂解试剂优先选为TFA∶间甲酚＝90∶10
根据本发明技术的一方面提供了一种固液相结合制备胸腺法新的方法，本发明胸腺法新的合成方法中，其进一步优选的技术方案，其步骤具体如下：
(1)Fmoc-Leu-CTC Resin的制备
取2-CTC树脂加入到固相反应器中，加入DCM溶胀树脂；抽干溶剂，加入Fmoc-Gly-OH的DMF溶液，加入DIEA，搅拌反应，完成后，加入甲醇，封闭30min；甲醇洗涤；真空干燥后，得到Fmoc-Leu-CTC Resin；
(2)胸腺法新第一片段肽的制备：
a)取Fmoc-Leu-CTC Resin，加入到固相反应器中，加入DCM溶胀树脂，抽干溶剂，加入20％哌啶/DMF溶液反应两次；DMF洗涤；茚检结果呈阳性；b)取Fmoc-Asp(OtBu)-OH、HOBt溶解于DMF中，加入DIC，冰浴活化；加入到反应器中反应至茚检检测结果呈阴性后，抽干溶剂；加入DMF洗涤；c)重复以上步骤，按照氨基酸序列，依次加入Fmoc-Lys(BOC)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH进行偶联反应；d)偶联结束后，是用20eq的AC2O/NMM乙酰化N末端氨基；e)真空干燥，得AC-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(BOC)-Asp(OtBu)-Leu-CTC Resin；f)将肽树脂加入到20％TFE/DCM中反应，收集滤液，滤液进行真空旋干，得到AC-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(BOC)-Asp(OtBu)-Leu-OH即为胸腺法新第一片段；
(3)第一片段-琥珀酰亚胺酯的制备：
AC-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(BOC)-Asp(OtBu)-Leu-OH加入到DCM溶解，加入DCC，HOSU，冰浴条件下反应，TLC监测原料反应完全消失；使用5％NaCO3水溶液、5％柠檬酸水溶液交替洗涤后，再等体积使用饱和氯化钠溶液，纯水溶液洗涤，过滤除去不溶物，滤液加入无水硫酸钠干燥；所得滤液旋干即得第一片段-琥珀酰亚胺酯；
(4)Fmoc-Asn(trt)-CTC Resin的制备
取2-CTC树脂加入到固相反应器中，加入DCM溶胀树脂；抽干溶剂，加入Fmoc-Asn(trt)-OH的DMF溶液，加入DIEA，搅拌反应，完成后，加入甲醇，封闭30min；甲醇洗涤；真空干燥后，得到Fmoc-Asn(trt)-CTC Resin；
(5)胸腺法新第二片段肽的制备：
a)取Fmoc-Asn(trt)-CTC Resin，加入到固相反应器中，加入DCM溶胀树脂，抽干溶剂，加入20％哌啶/DMF溶液反应两次；DMF洗涤；茚检结果呈阳性；b)取Fmoc-Glu(OtBu)-OH、HOBt溶解于DMF中，加入DIC，冰浴活化；加入到反应器中反应至茚检检测结果呈阴性后，抽干溶剂；加入DMF洗涤；c)重复以上步骤，按照氨基酸序列，依次加入Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(BOC)-OH、Fmoc-Lys(BOC)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(BOC)-OH进行偶联反应；d)甲醇收缩，真空干燥，得NH2-Lys(BOC)-Glu(OtBu)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(trt)-CTC Resin；f)将肽树脂加入到20％TFE/DCM中反应，滤液旋干得NH2-Lys(BOC)-Glu(OtBu)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(trt)-OH，即为胸腺法新第二片段；
(6)胸腺法新全保护肽制备：
上述步骤(3)中制得第一片段-琥珀酰亚胺酯溶解于DCM溶液中，冰水浴缓慢加入NH2-Lys(BOC)-Glu(OtBu)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(trt)-OH的DCM溶液反应，反应结束后旋干溶剂，即得胸腺法新全保护肽；
(7)裂解
配制裂解试剂为TFA∶间甲酚＝95∶5，加入到全保护肽反应，结束后，加入无水乙醚沉降；离心、干燥后得胸腺法新成品
附图说明
图1：Scheme 1为本发明的一种合成路线图；
图2：本发明方法胸腺法新成品HPLC图谱。
具体实施方式
下述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。下面将结合附图对本发明作进一步的说明。
本发明所使用缩写的含义列于下表：
Figure BSA0000192704630000051
Figure BSA0000192704630000061
实施例1
胸腺法新第一片段全保护肽的制备：
1)树脂溶胀：称取40g替代度为1.0mmol/g的2-Cl-CTC Resin，加入400ml DCM溶胀树脂0.5h，抽干溶剂，加入200ml DMF洗涤树脂两次，抽干溶剂。
2)Fmoc-Leu-CTC Resin的制备：称取28.3g Fmoc-Leu-OH溶解于200ml DMF中，加入42ml DIEA，混合均匀后，将溶液加入反应柱反应2h，抽干溶剂；加入200ml DMF洗涤树脂三次，抽干洗涤溶剂；按照DCM、甲醇、DIEA体积比为17∶2∶1，配制400ml封闭液，封闭树脂两次，每次10min；加入200ml DMF洗涤树脂三次，抽干洗涤溶剂；甲醇洗涤三次，每次10min，抽干溶剂，真空干燥后，得到Fmoc-Leu-CTC Resin 52.8g，测得取代度0.68mmol/g。
3)胸腺法新第一片段制备：a)氨基酸树脂溶胀，称取44.1g Fmoc-Leu-CTC Resin，加入500ml DCM溶胀树脂0.5h，抽干溶剂，加入300ml DMF洗涤树脂两次，抽干溶剂；b)Fmoc保护基脱除，加入300ml 20％哌啶/DMF溶液到树脂中，脱保护两次，第一次脱保护时间为10min，第二次脱保护时间为15min，脱保护完成后，加入300ml DMF洗涤树脂5次，抽干溶剂，重复，茚检阳性；c)称取37.0g Fmoc-Asp(OtBu)-OH、14.6g HOB，并量取17ml DIC溶300mlDMF中，冰水浴活化5min后，将溶液加入反应柱30℃反应2h，茚检阴性，抽干溶剂，300ml DMF洗涤树脂3次，抽干溶剂；d)肽链延伸，按照树脂、氨基酸、HOBt、DIC摩尔质量比为1∶3∶3.6∶3.6，重复以上步骤，按照氨基酸序列，依次加入Fmoc-Lys(BOC)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH进行偶联反应，完成后，量取57ml AC2O、66mlNMM溶解于300mlDMF中，加入反应器中，反应0.5h，完成后，300ml DMF洗涤树脂五次，得胸腺法新第一片段肽树脂106.9g；e)配制20％TFE/DCM溶液800ml，加入胸腺法新第一片段肽树脂，反应2h，滤液旋干得胸腺法新肽第一片段69.1g。
实施例2
胸腺法新第一片段-琥珀酰亚胺酯的制备：
胸腺法新第一片段加入到200ml DCM溶解，加入6.8g DCC，3.4g HOSU，冰浴条件下反应，TLC监测原料反应完全消失；浓缩液体至100ml左右，使用等体积5％NaCO3水溶液、5％柠檬酸水溶液交替洗涤后，再等体积使用饱和氯化钠溶液，纯水溶液洗涤，过滤除去不溶物，滤液加入无水硫酸钠干燥；所得滤液旋干即得第一片段-琥珀酰亚胺酯70.8g。
实施例3
胸腺法新第二片段全保护肽的制备：
1)树脂溶胀：称取40g替代度为1.0mmol/g的CTC Resin，加入400ml DCM溶胀树脂0.5h，抽干溶剂，加入200ml DMF洗涤树脂两次，抽干溶剂。
2)Fmoc-Asn(trt)-CTC Resin的制备：称取47.7g Fmoc-Asn(trt)-OH溶解于200mlDMF中，加入42ml DIEA，混合均匀后，将溶液加入反应柱反应2h，抽干溶剂；加入200ml DMF洗涤树脂三次，抽干洗涤溶剂；按照DCM、甲醇、DIEA体积比为17∶2∶1，配制400ml封闭液，封闭树脂两次，每次10min；加入200ml DMF洗涤树脂三次，抽干洗涤溶剂；甲醇洗涤三次，每次10min，抽干溶剂，真空干燥后，得到Fmoc-Asn(trt)-CTC Resin56.2g，测得取代度0.59mmol/g。
3)胸腺法新第二片段制备：a)氨基酸树脂溶胀，称取50.8g Fmoc-Asn(trt)-CTCResin，加入500ml DCM溶胀树脂0.5h，抽干溶剂，加入300ml DMF洗涤树脂两次，抽干溶剂；b)Fmoc保护基脱除，加入300ml 20％哌啶/DMF溶液到树脂中，脱保护两次，第一次脱保护时间为10min，第二次脱保护时间为15min，脱保护完成后，加入300ml DMF洗涤树脂5次，抽干溶剂，重复，茚检阳性；c)称取38.3g Fmoc-Glu(OtBu)-OH、14.6g HOB，并量取17ml DIC溶300ml DMF中，冰水浴活化5min后，将溶液加入反应柱30℃反应2h，茚检阴性，抽干溶剂，300ml DMF洗涤树脂3次，抽干溶剂；d)肽链延伸，按照树脂、氨基酸、HOBt、DIC摩尔质量比为1∶3∶3.6∶3.6，重复以上步骤，按照氨基酸序列，依次加入Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(BOC)-OH、Fmoc-Lys(BOC)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(BOC)-OH进行偶联反应，一次偶联不能完全茚检无色，可重复2eq投料补投一次，完成后，300ml DMF洗涤树脂五次，得胸腺法新第二片段肽树脂108.0g；e)配制20％TFE/DCM溶液800ml，加入胸腺法新第二片段肽树脂，反应2h，滤液旋干得胸腺法新肽第二片段62.9g。
实施例4
胸腺法新去保护肽制备：
将胸腺法新第二片段、第一片段-琥珀酰亚胺酯各溶解于200ml DCM中，溶解完全后，在冰浴条件下，将第一片段-琥珀酰亚胺酯溶液缓慢加入到第二片段溶液中，反应4h，反应结束后，旋干反应液得胸腺法新全保护肽118.8g。
实施例5
裂解纯化：
按照裂解液TFA/间甲酚＝95/5，配制500ml裂解液，搅拌均匀后缓慢加入胸腺法新全保护肽，溶解后，30℃反应3h，完成后反应液加入到3600ml异丙醚中沉降，离心干燥得胸腺法新粗品，经C18制备柱纯化，流动相0.3％醋酸水溶液，流速60～100ml/min，检测波长220nm，用HPLC跟踪收集液，然后采用常规的方法冻干，获得胸腺法新精肽质量为36.3g，纯度为99.61％，总收率为39.0％。
本发明本发明的一种合成路线图如图1所示，本发明HPLC图谱如图2所示，纯度99.61％，最大单杂0.13％，总杂0.39％。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.固液相结合制备胸腺法新的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)固相合成胸腺法新1-16个氨基酸，并乙酰化N端的氨基，裂解全保护肽作为第一片段；
(2)固相载体合成胸腺法新17-28个氨基酸，裂解全保护作为第二片段；
(3)第一片段与第二片段在液相里偶联，合成胸腺法新全保护肽；
(4)经裂解、纯化、冻干得胸腺法新成品。
2.根据权利要求1所述的固液相结合制备胸腺法新的方法，其特征在于：步骤(1)与/或步骤(2)中所使用的树脂为2-Cl-CTC Resin，取代度为0.6～1.2mmol/g。
3.根据权利要求1所述的固液相结合制备胸腺法新的方法，其特征在于：步骤(1)中肽链完成合成时，使用AC2O在碱性条件下乙酰化肽链N末端的氨基。
4.根据权利要求3所述的固液相结合制备胸腺法新的方法，其特征在于：乙酰化第一片段N末端氨基时使用的碱为Py、NMM、DIEA、TEA、TMP中的任一种。
5.根据权利要求1所述的固液相结合制备胸腺法新的方法，其特征在于：步骤(1)与/或步骤(2)中制备的氨基酸树脂的取代度为0.3-0.8mmol/g。
6.根据权利要求1所述的固液相结合制备胸腺法新的方法，其特征在于：步骤(1)与/或步骤(2)中全保护片段的裂解试剂为15％～30％V/V TFE/DCM或0.5％～3％V/V TFA/DCM。
7.根据权利要求1所述的固液相结合制备胸腺法新的方法，其特征在于：步骤(3)中使用缩合剂组合为DCC/HOSu、EDC·HCl/HOSU中任一种。
8.根据权利要求1所述的固液相结合制备胸腺法新的方法，其特征在于：步骤(4)中采用的裂解试剂为TFA∶间甲酚＝80～95∶5～20。
9.根据权利要求8所述的固液相结合制备胸腺法新的方法，其特征在于：步骤(4)中采用的裂解试剂为TFA∶间甲酚＝90∶10。
10.根据权利要求1所述的固液相结合制备胸腺法新的方法，其特征在于，其步骤具体如下：
(1)Fmoc-Leu-CTC Resin的制备
取2-CTC树脂加入到固相反应器中，加入DCM溶胀树脂；抽干溶剂，加入Fmoc-Gly-OH的DMF溶液，加入DIEA，搅拌反应，完成后，加入甲醇，封闭30min；甲醇洗涤；真空干燥后，得到Fmoc-Leu-CTC Resin；
(2)胸腺法新第一片段肽的制备：
a)取Fmoc-Leu-CTC Resin，加入到固相反应器中，加入DCM溶胀树脂，抽干溶剂，加入20％哌啶/DMF溶液反应两次；DMF洗涤；茚检结果呈阳性；b)取Fmoc-Asp(OtBu)-OH、HOBt溶解于DMF中，加入DIC，冰浴活化；加入到反应器中反应至茚检检测结果呈阴性后，抽干溶剂；加入DMF洗涤；c)重复以上步骤，按照氨基酸序列，依次加入Fmoc-Lys(BOC)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH进行偶联反应；d)偶联结束后，是用20eq的AC2O/NMM乙酰化N末端氨基；e)真空干燥，得AC-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(BOC)-Asp(OtBu)-Leu-CTC Resin；f)将肽树脂加入到20％TFE/DCM中反应，收集滤液，滤液进行真空旋干，得到AC-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(BOC)-Asp(OtBu)-Leu-OH即为胸腺法新第一片段；
(3)第一片段-琥珀酰亚胺酯的制备：
AC-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(BOC)-Asp(OtBu)-Leu-OH加入到DCM溶解，加入DCC，HOSU，冰浴条件下反应，TLC监测原料反应完全消失；使用5％NaCO3水溶液、5％柠檬酸水溶液交替洗涤后，再等体积使用饱和氯化钠溶液，纯水溶液洗涤，过滤除去不溶物，滤液加入无水硫酸钠干燥；所得滤液旋干即得第一片段-琥珀酰亚胺酯；
(4)Fmoc-Asn(trt)-CTC Resin的制备
取2-CTC树脂加入到固相反应器中，加入DCM溶胀树脂；抽干溶剂，加入Fmoc-Asn(trt)-OH的DMF溶液，加入DIEA，搅拌反应，完成后，加入甲醇，封闭30min；甲醇洗涤；真空干燥后，得到Fmoc-Asn(trt)-CTC Resin；
(5)胸腺法新第二片段肽的制备：
a)取Fmoc-Asn(trt)-CTC Resin，加入到固相反应器中，加入DCM溶胀树脂，抽干溶剂，加入20％哌啶/DMF溶液反应两次；DMF洗涤；茚检结果呈阳性；b)取Fmoc-Glu(OtBu)-OH、HOBt溶解于DMF中，加入DIC，冰浴活化；加入到反应器中反应至茚检检测结果呈阴性后，抽干溶剂；加入DMF洗涤；c)重复以上步骤，按照氨基酸序列，依次加入Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(BOC)-OH、Fmoc-Lys(BOC)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(BOC)-OH进行偶联反应；d)甲醇收缩，真空干燥，得NH2-Lys(BOC)-Glu(OtBu)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(trt)-CTC Resin；f)将肽树脂加入到20％TFE/DCM中反应，滤液旋干得NH2-Lys(BOC)-Glu(OtBu)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(trt)-OH，即为胸腺法新第二片段；
(6)胸腺法新全保护肽制备：
上述步骤(3)中制得第一片段-琥珀酰亚胺酯溶解于DCM溶液中，冰水浴缓慢加入NH2-Lys(BOC)-Glu(OtBu)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(trt)-OH的DCM溶液反应，反应结束后旋干溶剂，即得胸腺法新全保护肽；
(7)裂解
配制裂解试剂为TFA∶间甲酚＝95∶5，加入到全保护肽反应，结束后，加入无水乙醚沉降；离心、干燥后得胸腺法新成品。
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