CN105348367A - 一种固液相结合法制备卡贝缩宫素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于多肽合成领域，特别涉及一种固液相结合法制备卡贝缩宫素的方法。本发明首先采用固相合成法制备得片段X-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-OH，再与以液相法制得的片段H-Pro-Leu-Gly-NH2进行偶联反应，得到卡贝缩宫素线性肽，然后在液相中进行线性肽的环化反应制得卡贝缩宫素。此法操作过程简便，生产成本低，并且能够避免甘氨酸缺失肽杂质的产生，有利于后续的纯化过程，适宜大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种固液相结合法制备卡贝缩宫素的方法。
背景技术
卡贝缩宫素，英文名称为Carbetocin，是由加拿大辉凌制药(FerringInc.)研发合成的具有激动剂性质的长效催产素九肽类似物，于2009年在中国上市。其结构如下：
卡贝缩宫素用于选择性硬模外或腰麻下剖腹产术后，以预防子宫收缩乏力和产后出血。像催产素一样，卡贝缩宫素与子宫平滑肌的催产素受体结合，引起子宫的节律性收缩，在原有的收缩基础上，增加其频率和增加子宫张力；在非妊娠状态下，子宫的催产素受体含量很低，在妊娠期间增加，分娩时达高峰；因此卡贝缩宫素对非妊娠的子宫没有作用，但是对妊娠的子宫和刚生产的子宫具有有效的子宫收缩作用。
目前，卡贝缩宫素的制备方法国内外已广为报道：西班牙专利ES2115543公开了一种卡贝缩宫素的制备方法：以Fmoc-Cys(Trt)-OH，氯丁酸为原料合成卡贝缩宫素线性肽树脂，裂解后得线性肽，然后将其溶解在溶液中，通过NaOH/LiOH/DIEA/DMAP/NaHCO3等碱性试剂环化得卡贝缩宫素；该方法采用纯固相合成卡贝缩宫素线性肽，成本较高，且粗肽样品纯度较低。
另外，捷克专利CS8605461公开了一种通过固相法合成Z-Ile-Gln-Asn-Cys(Bzl)-Pro-Leu-Gly-NH2线性肽，氢化得到Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2再与溴丁酸反应，进而环化得到卡贝缩宫素，此方法中的由于存在氢化操作，安全风险大，不适于工业化生产。
在国内，专利CN104262464A、CN102796178A、CN104086631A、CN101555272B与CN102260326A、CN103467573A分别公开了一种先以固相法合成卡贝缩宫素线性肽树脂，然后固相上进行环合反应，该类方法在固相合成过程中容易产生甘氨酸缺失肽杂质，且一般采用氨基树脂，生产成本高，不适宜大规模生产。
在中国专利CN103833831A一种片段法固相合成卡贝缩宫素的方法中，采用的方法是首先合成片段1肽树脂Br(CH2)3-CO-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Cys-Wangresin与片段2肽树脂H-Pro-Leu-Gly-Rinkamide-AMresin，然后片段1肽树脂经环化、裂解过程再连接到片段2上，再次裂解后可制得卡贝缩宫素，此方法需采用两种固相载体，并且经过两步裂解过程，生产成本高，不利于放大生产。
中国专利CN102477082A公开了一种纯液相法合成卡贝缩宫素的方法：在液相中先分别合成三个卡贝缩宫素中间体片段，然后再将三个片段连接形成卡贝缩宫素线性肽，再进行环化反应，制备卡贝缩宫素，该方法涉及多种中间体，步骤繁琐，操作不便，不利于放大生产。
综上所述，目前报道的卡贝缩宫素合成方法中单纯采用固相合成法容易产生甘氨酸缺失肽杂质，样品提纯困难，并且需要使用价格昂贵的氨基树脂作为原料进行肽链或片段的合成，生产成本较高，不适宜大规模生产；而在纯液相法合成卡贝缩宫素的方法中存在中间体过多，反应后处理工作繁琐，操作不放便的问题，也不利于进行放大生产问题。
发明内容
为解决卡贝缩宫素上述合成过程中存在的问题，本发明提供一种固液相结合法制备卡贝缩宫素的方法：首先采用固相合成法制备得片段X-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-OH，再与以液相法制得的片段H-Pro-Leu-Gly-NH2，随后进行偶联反应，得到卡贝缩宫素线性肽，最后在液相中进行环化制得卡贝缩宫素。此法操作过程简便，生产成本低，并且能够避免甘氨酸缺失肽杂质的产生，有利于后续的纯化过程，适宜大规模生产。
为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种固液相结合法制备卡贝缩宫素的方法，包括如下步骤：
(a)以Wangresin或CTCresin为固相载体，用Fmoc-Cys(Trt)-OH与之偶联反应制备Fmoc-Cys(Trt)-Wangresin或Fmoc-Cys(Trt)-CTCresin，再按序列依次偶联保护氨基酸Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(Me)-OH、X(CH2)3-COOH，得片段I肽树脂，经裂解反应，制得片段I，其结构如下：
X-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-OH
(b)以Boc-Pro-OH、H-Leu-OH、HOSu和DCC为原料，液相中反应制备Boc-Pro-Leu-OH。
(c)以Boc-Pro-Leu–OH、H-Gly-NH2·HCl、HOSu和DCC为原料，液相中反应制备Boc-Pro-Leu-Gly-NH2，脱除Boc后制得片段Ⅱ，其结构如下：
H-Pro-Leu-Gly-NH2
(d)片段I与片段Ⅱ进行偶联反应，制得卡贝缩宫素线性肽，其结构如下：
X-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2
(e)卡贝缩宫素线性肽经环化反应，制得卡贝缩宫素，其结构如下：
其中步骤(a)中：固相载体为替代度为0.6-1.2mmol/g的Wangresin或CTCresin；Fmoc-Cys(Trt)-Wangresin或Fmoc-Cys(Trt)-CTCresin脱除Fmoc保护后，以2-5倍的投料比加入相应的保护氨基酸进行偶联反应，每一个偶联反应均是在缩合剂的存在下进行的固相接肽反应，每一步偶联反应均以Kaiser试剂检测反应终点，反应完毕后用脱保护试剂脱除Fmoc，再与下一个保护氨基酸进行偶联反应；重复操作直至合成得到侧链全保护的片段I肽树脂。
优选的，步骤(a)中，裂解反应所用的裂解试剂为加入体积比1-5％清除剂的TFA溶液，清除剂为苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇、巯基乙醇、苯酚、水和TIS中的一种或几种；更为优选的裂解试剂配比为：TFA/EDT/苯甲硫醚/水/苯酚＝82.5/5/5/5/2.5；X(CH2)3-COOH中的X为Br或Cl；缩合剂为以下组合DIC/HOBt、DIC/HOAt、TBTU/HOBt/DIPEA、HBTU/HOBt/DIPEA、HATU/HOAt/DIPEA中的一种；脱保护试剂是20％哌啶/DMF。
其中，步骤(b)中，Boc-Pro-Leu–OH的制备过程为：将H-Leu-OH与碱A按照摩尔比1:1～2的比例溶解在水中，加入5～20％体积比的有机溶剂助溶。完全溶解后，冰水浴中，搅拌下将用有机溶剂溶解的Boc-Pro-OSu溶液滴加到H-Leu-OH的溶液中，其中H-Leu-OH的摩尔量为Boc-Pro-OSu的1.1～1.5倍。TLC监测反应终点。待反应结束后，减压浓缩除去有机溶剂，抽滤后，冰水浴下以10％的柠檬酸水溶液将反应液pH值调至2～3，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩至原液的1/2体积，加入等体积石油醚，析晶，抽滤，真空干燥，得Boc-Pro-Leu-OH。
Boc-Pro-OSu的制备过程为：Boc-Pro-OH和HOSu按照1:1.0-1.2的摩尔比溶于有机溶剂中，冰水浴下将1.0-1.2倍Boc-Pro-OH摩尔量的DCC/有机溶剂溶液滴加到Boc-Pro-OH/HOSu溶液中，1h内滴加完毕，撤冰水浴，25℃继续搅拌反应2h；反应完成后抽滤，滤液减压浓缩至总体积的1/3-2/5，抽滤，向滤液中加入其3-4倍体积的石油醚，析出白色固体，抽滤，滤饼以乙酸乙酯重新溶解至浓缩后体积，加入3-4倍体积石油醚，析晶，抽滤，真空干燥滤饼，得Boc-Pro-OSu。
其中，步骤(c)中，H-Pro-Leu-Gly-NH2的制备过程为：将H-Gly-NH2·HCl与碱A按照摩尔比1:1～2的比例溶解在水中，加入5～20％体积比的有机溶剂助溶。完全溶解后，冰水浴中，搅拌下将用有机溶剂溶解的Boc-Pro-Leu-OSu溶液滴加到H-Gly-NH2·HCl的溶液中，其中H-Gly-NH2·HCl的摩尔量为Boc-Pro-Leu-OSu的1.1～1.5倍，TLC监测反应终点。待反应结束后，减压浓缩除去有机溶剂，抽滤后，冰水浴下以10％的柠檬酸水溶液将反应液pH值调至2～3，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩至原液的1/2体积，加入等体积石油醚，析晶，抽滤，真空干燥得Boc-Pro-Leu-Gly-NH2；然后用50％的TFA/H2O溶液将其溶解，搅拌反应1h，甲叔醚沉降并洗涤2次，真空干燥，得H-Pro-Leu-Gly-NH2。
Boc-Pro-Leu-OSu的制备过程为：Boc-Pro-Leu-OH和HOSu按照1:1.0-1.2的摩尔比溶于有机溶剂中，冰水浴下将1.0-1.2倍Boc-Pro-Leu-OH摩尔量的DCC/有机溶剂溶液滴加到Boc-Pro-Leu-OH/HOSu溶液中，1h内滴加完毕，撤冰水浴，25℃继续搅拌反应2h；反应完成后抽滤，滤液减压浓缩至总体积的1/3-2/5，抽滤，向滤液中加入其3-4倍体积的石油醚，析出白色固体，抽滤，滤饼以乙酸乙酯重新溶解至浓缩后体积，加入3-4倍体积石油醚，析晶，抽滤，真空干燥滤饼，得Boc-Pro-Leu-OSu。
其中，步骤(d)中，片段I与片段Ⅱ偶联的具体过程为：H-Pro-Leu-Gly-NH2与碱A按照摩尔比1:1～2的比例溶解在水中，加入5～20％体积比的有机溶剂助溶。完全溶解后，冰水浴中，搅拌下将用有机溶剂溶解的X-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-OSu溶液滴加到H-Pro-Leu-Gly-NH2的溶液中，其中H-Pro-Leu-Gly-NH2的摩尔量为X-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-OSu的1.1～1.5倍。TLC监测反应终点。待反应结束后，减压浓缩除去有机溶剂，抽滤后，冰水浴下以10％的柠檬酸水溶液将反应液pH值调至2～3，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩至原液的1/2体积，加入等体积石油醚，析晶，抽滤，真空干燥，得X-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2。
X-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-OSu的制备过程为：X-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-OH和HOSu按照1:1.0-1.2的摩尔比溶于有机溶剂中，冰水浴下将1.0-1.2倍X-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-OH摩尔量的DCC/有机溶剂溶液滴加到X-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-OH/HOSu溶液中，1h内滴加完毕，撤冰水浴，25℃继续搅拌反应2h；反应完成后抽滤，滤液减压浓缩至总体积的1/3-2/5，抽滤，向滤液中加入其3-4倍体积的石油醚，析出白色固体，抽滤，滤饼以乙酸乙酯重新溶解至浓缩后体积，加入3-4倍体积石油醚，析晶，抽滤，真空干燥滤饼，得X-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-OSu。
优选的，碱A为碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钾、三乙胺、二乙胺、N-乙基二异丙基胺、N,N-二异丙基乙胺等中的一种。
优选的，有机溶剂为四氢呋喃、二氧六环、丙酮中一种或一种以上的混合液。
其中步骤(e)中，卡贝缩宫素线性肽的环化反应为：将卡贝缩宫素线性肽溶解在乙腈/水溶液中，DIEA调节溶液pH值至8～10，加入0.1～0.5倍当量的环化试剂DMAP，搅拌反应10～20h；
相对于现有技术，本发明的有益效果是：
1、选用羟基树脂进行肽链片段的合成，与昂贵的氨基树脂相比，大大降低了生产成本；
2、片段Ⅱ采用液相合成的方法，所采用的氨基酸原料价格远远低于固相合成中所用的Fmoc保护氨基酸的价格，进一步降低了生产成本；
3、片段Ⅱ采用液相合成的方法，避免了甘氨酸缺失肽杂质的产生，提高了粗肽产品的纯度，有利于提高纯化过程收率，工艺过程操作简便，适宜大规模生产。
具体实施方式
下面用具体实施例对本发明进行详细说明，但不限定本专利；根据本发明改变原料的投料比，或是反应溶剂或及缩合剂等，均在本发明的保护范围内。
说明书和权利要求书中所使用的缩写含义如下：
Fmoc9-芴甲氧羰基
CTCresin2-氯三苯甲基氯树脂
Wangresin王树脂
Trt三苯甲基
DCM二氯甲烷
DMFN,N-二甲基甲酰胺
DMAP4-二甲氨基吡啶
DIEAN,N-二异丙基乙胺
DICN,N-二异丙基碳二亚胺
HOBt1-羟基苯并三唑
TFA三氟乙酸
HOSuN-羟基琥珀酰亚胺
EDT1,2乙二硫醇
DCC二环己基碳二亚胺
BOC叔丁氧羰基
实施例1：Fmoc-Cys(Trt)-Wangresin的制备
将载体Wangresin550.0g(sub＝1.0mmol/g)置于合成柱中，用4LDMF洗涤两次，加入4LDCM溶胀30min；抽滤掉DCM后，加入Fmoc-Cys(Trt)-OH/DIC/HOBt的混合溶液[称取644g(1100mmol)Fmoc-Cys(Trt)-OH和164g(1210mmol)HOBt置于溶解瓶中，加入2L体积比例为1∶1的DMF和DCM混合溶液搅拌溶解，冰水浴下加入190ml(1210mmol)DIC，活化5min]，反应10min后加入6.7g(55mmol)DMAP；反应5h，抽掉反应液，用4LDMF洗涤3次，加入封端试剂4L(1L乙酸酐和0.85L吡啶溶解于2.15DMF中)反应1h，抽滤掉反应液，分别用DMF、DCM、甲醇洗涤3次，真空干燥后得Fmoc-Cys(Trt)-Wangresin856.0g；取样测定替代度为0.614mmol/g。经计算，总合成规模为520mmol。
实施例2：Fmoc-Cys(Trt)-CTCresin的制备
称取CTCresin63.0g(sub＝1.0mmol/g)置于合成柱中，用500mLDMF洗涤两次，加入500mLDCM溶胀30min；抽滤掉DCM后，加入溶有74g(126mmol)Fmoc-Cys(Trt)-OH的DCM/DMF(体积比3:1)溶液300mL，搅拌后加入DIEA40ml(250mmol)，反应5h，抽掉反应液，加入DCM/CH3OH/DIEA(体积比17：2：1)混合溶液400ml封端反应1h；然后用DMF、DCM、甲醇分别洗涤3次，真空干燥得Fmoc-Cys(Trt)-CTCresin100.0g。测替代度为0.632mmol/g。经计算，总合成规模为61mmol。
实施例3：片段I肽树脂：
Br-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Wangresin的制备
准确称取实施例1中替代度为0.614mmol/g的Fmoc-Cys(Trt)-Wangresin823g(合成规模500mmol)置于合成柱中，加入4LDCM溶胀30min；抽滤掉DCM后，800mlDMF洗涤2次，加入20％哌啶/DMF溶液4L脱保护2次，分别反应10min和10min；然后用DMF洗涤6次，每次4L；称取Fmoc-Asn(Trt)-OH600g(1000mmol)、HOBT150g(1100mmol)用2.5LDMF溶解，冰水浴中预冷15-20min，然后加入DIC170ml(1100mmol)活化5min，将溶液加入到树脂中，反应2h，反应终点以Kaiser试剂检测结果为准，反应达终点后，抽掉反应液，用DMF洗涤6次，每次4L；随后再脱保护。如此反复循环操作，依次连接保护氨基酸Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(Me)-OH、Br(CH2)3-COOH，得到侧链全保护的片段I肽树脂，肽树脂合成完后，用4LDMF、DCM和甲醇分别洗涤3次，真空干燥得肽树脂Br(CH2)3-CO-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Wangresin1430g。
实施例4：片段I肽树脂：
Cl-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Wangresin的制备
准确称取实施例2中替代度为0.632mmol/g的Fmoc-Cys(Trt)-CTCresin16.7g(合成规模10mmol)置于合成柱中，加入150mlDCM溶胀30min；抽滤掉DCM后，120mlDMF洗涤2次，加入20％哌啶/DMF溶液120ml脱保护2次，分别反应10min和10min；然后用DMF洗涤6次，每次120ml；称取Fmoc-Asn(Trt)-OH12g(20mmol)、HOBT3g(22mmol)用70mlDMF溶解，冰水浴中预冷15-20min，然后加入DIC3.4ml(22mmol)活化5min，将溶液加入到树脂中，反应2h，反应终点以Kaiser试剂检测结果为准，反应达终点后，抽掉反应液，用DMF洗涤6次，每次120ml；随后再脱保护。如此反复循环操作，依次连接保护氨基酸Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(Me)-OH、Cl(CH2)3-COOH，得到侧链全保护的片段I肽树脂，肽树脂合成完后，用120mlDMF、DCM和甲醇分别洗涤3次，真空干燥得肽树脂
Cl(CH2)3-CO-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Wangresin27.5g
实施例5：片段I：Br-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-OH的制备
将实施例3得到的1430g片段I肽树脂，加入到冷冻的12L裂解液(体积配比为TFA/EDT/苯甲硫醚/苯酚/H2O＝82.5/5/5/2.5/5)中，室温下搅拌反应3h；裂解反应结束，过滤树脂，500mlTFA洗涤树脂2次，合并滤液和洗液，旋蒸浓缩至5L，浓缩液倒入50L冷冻甲叔醚中，析出白色沉淀；静置1h后，过滤，甲叔醚洗涤6次，真空干燥得片段I：Br-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-OH425.5g，收率106.0％，纯度90.3％。
实施例6：Boc-Pro-OSu的制备
准确称取Boc-Pro-OH215g(1mol)和HOSu115g(1mol)溶于2L四氢呋喃中，冰水浴搅拌。准确称取DCC206g(1mol)，溶于1.2L四氢呋喃中，缓慢滴加到上述溶液中，冰水浴搅拌1h后，25℃水浴中继续反应2h。反应完成后抽滤，滤液旋蒸浓缩至1.2L。浓缩完成后抽滤，向滤液中加入4L石油醚，析出大量白色固体，溶液-20℃冰柜静置1h。静置后抽滤，滤饼以1L乙酸乙酯溶解，加入3L石油醚，溶液澄清。置于-20℃冰柜中，2h后析出大量白色固体，抽滤，滤饼干燥，称重，得Boc-Pro-OSu293g，纯度大于99％，收率93.8％。
实施例7：Boc-Pro-Leu-OH的制备
准确称取H-Leu-OH185g(1.4mol)和碳酸钠170g(1.6mol)溶于2L水中，冰水浴下缓慢加入实施例6中所得Boc-Pro-OSu(293g，0.94mol)的四氢呋喃溶液1.5L，搅拌反应，TLC监测反应终点。反应完全后，减压旋蒸除去四氢呋喃，剩余水溶液抽滤后冰水浴下加入10％的柠檬酸水溶液，调节溶液pH值至2～3，4L乙酸乙酯分三次萃取，合并有机相，以1.5L饱和食盐水分三次洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩至1.7L，向浓缩液中加入1.7L石油醚，置于-20℃冰柜中析晶，得Boc-Pro-Leu-OH270g，纯度大于99％，收率87.5％。
实施例8：Boc-Pro-Leu-OSu的制备
将实施例7中所得Boc-Pro-Leu-OH270g(0.82mol)和HOSu94g(0.82mol)溶于2L四氢呋喃中，冰水浴搅拌。准确称取DCC169g(0.82mol)，溶于1.2L四氢呋喃中，缓慢滴加到上述溶液中，冰水浴搅拌1h后，25℃水浴中继续反应2h。反应完成后抽滤，滤液旋蒸浓缩至1-1.2L。浓缩完成后抽滤，滤液加入4L石油醚，析出大量白色固体，溶液-20℃冰柜静置1h。静置后抽滤，滤饼以1L乙酸乙酯溶解，加入3L石油醚，溶液澄清。置于-20℃冰柜中，2h后析出大量白色固体，抽滤，滤饼干燥，称重，得Boc-Pro-Leu-Osu314g，收率90.0％。
实施例9：H-Pro-Leu-Gly-NH2的制备
准确称取H-Gly-NH2·HCl100g(0.9mmol)和碳酸钠114g(1.08mol)溶于1L水中，冰水浴下缓慢加入实施例8中所得Boc-Pro-Leu-OSu(314g，0.74mol)的四氢呋喃溶液1.5L，搅拌反应，TLC监测反应终点。反应完全后，减压旋蒸除去四氢呋喃，剩余水溶液抽滤后冰水浴下加入10％的柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，4L乙酸乙酯分三次萃取，合并有机相，以1.5L饱和食盐水分三次洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩至1.2L，向浓缩液中加入1.2L石油醚，置于-20℃冰柜中析晶，得Boc-Pro-Leu-Gly-NH2，然后再用50％TFA/H2O溶解，搅拌反应1h后，甲叔醚沉降并洗涤2次，真空干燥后得H-Pro-Leu-Gly-NH2176g，纯度大于99％，收率83.6％。
实施例10：Br-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-OSu的制备
将实施例5中所得Br-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-OH425.5g(0.5mol)和HOSu58g(0.5mol)溶于2L四氢呋喃中，冰水浴搅拌。准确称取DCC103g(0.5mol)，溶于1.2L四氢呋喃中，缓慢滴加到上述溶液中，冰水浴搅拌1h后，25℃水浴中继续反应2h。反应完成后抽滤，滤液旋蒸浓缩至1-1.2L。浓缩完成后抽滤，滤液加入4L石油醚，析出大量白色固体，溶液-20℃冰柜静置1h。静置后抽滤，滤饼以1L乙酸乙酯溶解，加入3L石油醚，溶液澄清。置于-20℃冰柜中，2h后析出大量白色固体，抽滤，滤饼干燥，称重，得Br-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-OSu364g，收率81.0％。
实施例11：卡贝缩宫素线性肽的制备
准确称取实施例9所得H-Pro-Leu-Gly-NH264g(0.22mol)和碳酸钠23.3g(0.22mol)溶于500ml水中，加入100ml四氢呋喃助溶，冰水浴下缓慢加入实施例10中所得Br-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-OSu(182g，0.2mol)的四氢呋喃溶液800ml，搅拌反应，TLC监测反应终点。反应完全后，减压旋蒸除去四氢呋喃，剩余水溶液抽滤后冰水浴下加入10％的柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，2L乙酸乙酯分三次萃取，合并有机相，以500ml饱和食盐水分三次洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩至650ml，向浓缩液中加入650ml石油醚，置于-20℃冰柜中析晶，得卡贝缩宫素线性肽Br-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2167g，纯度大于99％，收率78.1％。
实施例12：卡贝缩宫素线性肽的制备
准确称取实施例9所得H-Pro-Leu-Gly-NH264g(0.22mol)和碳酸钠46.6g(0.44mol)溶于500mL水中，加入100ml四氢呋喃助溶，冰水浴下缓慢加入实施例10中所得Br-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-OSu(182g，0.2mol)的四氢呋喃溶液800ml，搅拌反应，TLC监测反应终点。反应完全后，减压旋蒸除去四氢呋喃，剩余水溶液抽滤后冰水浴下加入10％的柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，2L乙酸乙酯分三次萃取，合并有机相，以500ml饱和食盐水分三次洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩至650ml，向浓缩液中加入650ml石油醚，置于-20℃冰柜中析晶，得卡贝缩宫素线性肽Br-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2159g，纯度大于99％，收率74.3％。
实施例13：卡贝缩宫素粗肽的制备
准确称取实施例11所得卡贝缩宫素线性肽107g(0.1mol)，用25L乙腈和25L水的混合溶液溶解，DIEA调节溶液pH至9-10，然后加入DMAP1.2g(0.01mol)，搅拌反应16h，Ellman反应监测反应进程。反应结束，冰乙酸调节溶液pH值至4-5，反应液用0.45μm滤膜过滤。
实施例14：卡贝缩宫素粗肽的制备
准确称取实施例12所得卡贝缩宫素线性肽107g(0.1mol)，用25L乙腈和25L水的混合溶液溶解，DIEA调节溶液pH至9-10，然后加入DMAP6.1g(0.05mol)，搅拌反应16h，Ellman反应监测反应进程。反应结束，冰乙酸调节溶液pH值至4-5，反应液用0.45μm滤膜过滤。实施例15：卡贝缩宫素粗肽纯化精制
取实施例13中的反应液，采用内径为100mm的C18制备柱，流动相A为0.1％TFA/水，流动相B为0.1％TFA/乙腈，上样量为10g/针，流速300ml/min，检测波长210nm，梯度洗脱，峰前和峰后循环进样，得到中控分析纯度为98.5％以上的精肽溶液；以醋酸/乙腈/水体系转盐后冻干得卡贝缩宫素精肽92.6g，纯度大于99.5％。
实施例16：卡贝缩宫素粗肽纯化精制
取实施例14中的反应液，采用内径为100mm的C18制备柱，流动相A为0.1％TFA/水，流动相B为0.1％TFA/乙腈，上样量为10g/针，流速300ml/min，检测波长210nm，梯度洗脱，峰前和峰后循环进样，得到中控分析纯度为98.5％以上的精肽溶液；以醋酸/乙腈/水体系转盐后冻干得卡贝缩宫素精肽87.5g，纯度大于99.5％。
Claims (10)
1.一种固液相结合法制备卡贝缩宫素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)以Wangresin或CTCresin为固相载体，用Fmoc-Cys(Trt)-OH与之偶联反应制备Fmoc-Cys(Trt)-Wangresin或Fmoc-Cys(Trt)-CTCresin，再按序列依次偶联保护氨基酸Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(Me)-OH、X(CH2)3-COOH，得片段I肽树脂，经裂解反应，制得片段I，其结构如下：X-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-OH；
(b)以Boc-Pro-OH、H-Leu-OH、HOSu和DCC为原料，液相中反应制备Boc-Pro-Leu–OH；
(c)以Boc-Pro-Leu–OH、H-Gly-NH2·HCl、HOSu和DCC为原料，液相中反应制备Boc-Pro-Leu-Gly-NH2，脱除Boc后制得片段Ⅱ，其结构如下：
H-Pro-Leu-Gly-NH2；
(d)片段I与片段Ⅱ进行偶联反应，制得卡贝缩宫素线性肽，其结构如下：
X-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2；
(e)卡贝缩宫素线性肽经环化反应，制得卡贝缩宫素。
2.根据权利要求1所述的一种固液相结合法制备卡贝缩宫素的方法，其特征在于，步骤(a)中：所述Wangresin或CTCresin的替代度为0.6-1.2mmol/g；所述Fmoc-Cys(Trt)-Wangresin或Fmoc-Cys(Trt)-CTCresin脱除Fmoc保护后，以2-5倍摩尔量的投料比加入相应的保护氨基酸进行偶联反应；所述的偶联反应均是在缩合剂的存在下进行的固相接肽反应，偶联反应均以Kaiser试剂检测反应终点，反应完毕后以20％哌啶/DMF作为脱保护试剂脱除Fmoc；重复操作直至合成得到侧链全保护的片段I肽树脂：X-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-resin；所述X(CH2)3-COOH中的X为Br或Cl，所述缩合剂为以下组合DIC/HOBt、DIC/HOAt、TBTU/HOBt/DIPEA、HBTU/HOBt/DIPEA、HATU/HOAt/DIPEA的一种。
3.根据权利要求1所述的一种固液相结合法制备卡贝缩宫素的方法，其特征在于，步骤(b)中，所述Boc-Pro-Leu–OH的制备过程为：将H-Leu-OH与碱A按摩尔比1:1～2的比例溶解在水中，加入5～20％体积比的有机溶剂助溶，完全溶解后，冰水浴中，搅拌下将用有机溶剂溶解的Boc-Pro-OSu溶液滴加到上述H-Leu-OH的溶液中，所述H-Leu-OH的摩尔量为Boc-Pro-OSu的1.1～1.5倍，TLC监测反应终点；待反应结束后，减压浓缩除去有机溶剂，抽滤后，冰水浴以10％的柠檬酸水溶液将反应液pH值调至2～3，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩至原液的1/2体积，加入等体积石油醚，析晶，抽滤，真空干燥，得Boc-Pro-Leu-OH。
4.根据权利要求3所述的一种固液相结合法制备卡贝缩宫素的方法，其特征在于，所述Boc-Pro-OSu溶液的制备过程为：Boc-Pro-OH和HOSu按照1:1.0-1.2的摩尔比溶于有机溶剂中，冰水浴下将1.0-1.2倍Boc-Pro-OH摩尔量的DCC/有机溶剂溶液滴加到上述Boc-Pro-OH/HOSu溶液中，1h内滴加完毕，撤冰水浴，25℃继续搅拌反应2h；反应完成后抽滤，滤液减压浓缩至总体积的1/3-2/5，抽滤，向滤液中加入其3-4倍体积的石油醚，析出白色固体，抽滤，滤饼以乙酸乙酯重新溶解至浓缩后体积，加入3-4倍体积石油醚，析晶，抽滤，真空干燥滤饼，得Boc-Pro-OSu。
5.根据权利要求1所述的一种固液相结合法制备卡贝缩宫素的方法，其特征在于，步骤(c)中，所述H-Pro-Leu-Gly-NH2的制备过程为：将H-Gly-NH2·HCl与碱A按照摩尔比1:1～2的比例溶解在水中，加入5～20％体积比的有机溶剂助溶，完全溶解后，冰水浴中，搅拌下将用有机溶剂溶解的Boc-Pro-Leu-OSu溶液滴加到H-Gly-NH2·HCl的溶液中，其中H-Gly-NH2·HCl的摩尔量为Boc-Pro-OSu的1.1～1.5倍，TLC监测反应终点；待反应结束后，减压浓缩除去有机溶剂，抽滤后，冰水浴以10％的柠檬酸水溶液将反应液pH值调至2～3，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩至原液的1/2体积，加入等体积石油醚，析晶，抽滤，真空干燥得Boc-Pro-Leu-Gly-NH2；然后用50％的TFA/H2O溶液将其溶解，搅拌反应1h，甲叔醚沉降并洗涤2次，真空干燥，得H-Pro-Leu-Gly-NH2。
6.根据权利要求5所述的一种固液相结合法制备卡贝缩宫素的方法，其特征在于，所述Boc-Pro-Leu-OSu的制备过程为：Boc-Pro-Leu-OH和HOSu按照1:1.0-1.2的摩尔比溶于有机溶剂中，冰水浴下将1.0-1.2倍Boc-Pro-Leu-OH摩尔量的DCC/有机溶剂溶液滴加到Boc-Pro-Leu-OH/HOSu溶液中，1h内滴加完毕，撤冰水浴，25℃继续搅拌反应2h；反应完成后抽滤，滤液减压浓缩至总体积的1/3-2/5，抽滤，向滤液中加入其3-4倍体积的石油醚，析出白色固体，抽滤，滤饼以乙酸乙酯重新溶解至浓缩后体积，加入3-4倍体积石油醚，析晶，抽滤，真空干燥滤饼，得Boc-Pro-Leu-OSu。
7.根据权利要求1所述的一种固液相结合法制备卡贝缩宫素的方法，其特征在于，步骤(d)中，所述片段I与片段Ⅱ偶联的具体过程为：H-Pro-Leu-Gly-NH2与碱A按照摩尔比1:1～2的比例溶解在水中，加入5～20％体积比的有机溶剂助溶，完全溶解后，冰水浴中，搅拌下将用有机溶剂溶解的X-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-OSu溶液滴加到H-Pro-Leu-Gly-NH2的溶液中，其中H-Pro-Leu-Gly-NH2的摩尔量为X-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-OSu的1.1～1.5倍，TLC监测反应终点；待反应结束后，减压浓缩除去有机溶剂，抽滤后，冰水浴以10％的柠檬酸水溶液将反应液pH值调至2～3，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩至原液的1/2体积，加入等体积石油醚，析晶，抽滤，真空干燥，得X-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2。
8.根据权利要求7所述的一种固液相结合法制备卡贝缩宫素的方法，其特征在于，所述X-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-OSu的其制备过程为：X-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-OH和HOSu按照1:1.0-1.2的摩尔比溶于有机溶剂中，冰水浴下将1.0-1.2倍X-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-OH摩尔量的DCC/有机溶剂溶液滴加到X-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-OH/HOSu溶液中，1h内滴加完毕，撤冰水浴，25℃继续搅拌反应2h；反应完成后抽滤，滤液减压浓缩至总体积的1/3-2/5，抽滤，向滤液中加入其3-4倍体积的石油醚，析出白色固体，抽滤，滤饼以乙酸乙酯重新溶解至浓缩后体积，加入3-4倍体积石油醚，析晶，抽滤，真空干燥滤饼，得X-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-OSu。
9.根据权利要求3～9任一项所述的一种固液相结合法制备卡贝缩宫素的方法，其特征在于，所述碱A为碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钾、三乙胺、二乙胺、N-乙基二异丙基胺、N,N-二异丙基乙胺等中的一种；所述有机溶剂为四氢呋喃、二氧六环、丙酮中一种或一种以上的混合液。
10.根据权利要求1所述的一种固液相结合法制备卡贝缩宫素的方法，其特征在于，步骤(e)中，所述卡贝缩宫素线性肽的环化反应为：将卡贝缩宫素线性肽溶解在乙腈/水溶液中，DIEA调节溶液pH值至8～10，加入0.1～0.5倍当量的环化试剂DMAP，搅拌反应10～20h。
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