CN105601718B - 一种布美诺肽的固相合成方法 - Google Patents

一种布美诺肽的固相合成方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于多肽合成领域，具体涉及以Rink Amide Resin为固相载体，以HO‑(CH2)n‑COOH作为连接固相载体与目标肽的Linker，其中，羧基端通过酰胺键与固相载体相连，羟基端通过酯键与目标肽相连。该技术方案与现有技术相比，通过在固相载体及布美诺肽之间引入长链脂肪酸，大大优化了目标肽固相成环的空间环境，避免了液相方式成环时所发生的分子间偶联，最终目标肽‑Linker纯度达到85％以上，纯化总收率达到50％以上，精肽纯度达到99％以上。

Description

一种布美诺肽的固相合成方法
技术领域
本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种以长链脂肪酸做Linker进行布美诺肽固相合成的方法。
背景技术
布美诺肽，英文名称为Bremelanotide，又称布雷默浪丹，PT141，由7个氨基酸组成，与α-促黑素细胞激素具有相同的核心序列，后者的受体在食欲及性欲唤起中起重要作用。其肽序为AC-Nle-[Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys]cycle-OH，结构式如下：
性功能障碍分为男性性功能障碍及女性性功能障碍，目前用于治疗男性性功能障碍的药物多数为磷酸二酯酶5(PDE-5)抑制剂，例如西替那非，他达拉非，伐地那非。此类药物的作用机制为维持或者升高体内环腺苷酸(cAMP)的浓度，增加动脉血液流入，降低静脉血液流出，从而导致阴茎血流增加，但此类药物对女性性功能障碍不具有显著疗效。
女性性反应周期是复杂的并且取决于生理，心理因素，用于女性性功能障碍的药物必须针对并且必须依赖中枢神经系统，而动物和人类的研究都已经表明布美诺肽具有明显的与局部生殖器血管充血无关的中枢神经系统效应。与其它多肽类药物相似，布美诺肽剂量少，疗效高，不会引发蓄积中毒，因此，在治疗女性性功能障碍上有广阔的市场前景。
目前，布美诺肽的合成方法主要为固相合成法。专利CN200610086841.4采用逐步合成的方法，肽树脂合成结束后，选择性脱除Asp及Lys的保护基，之后在树脂上成环，最后以HF裂解，因为HF的剧烈腐蚀性而导致该方法无法大规模使用，其实施例公布的精肽收率为30～35％；专利CN200710048824.6同样采用选择性脱保护的方法，但其所选择的的脱保护方法在脱除Asp及Lys侧链保护基的同时也会脱除His的保护基，其实施例公布的粗肽收率为80％；专利CN200910131598.7布雷默浪丹的固相合成方法中将对羟基苯甲酸连接在RinkAmide Resin之后，采用普通氨基酸原料逐步合成，合成结束后以TFA裂解，在液相条件下成环，但是该方法在进行液相成环时容易发生分子间偶联，产生二聚体，三聚体等多聚物，严重降低合成收率，此外，该专利在树脂与肽链间连接的对羟基苯甲酸分子较小，无法提供足够大的空间改善固相成环反应。
布美诺肽是由7个氨基酸组成的环肽，其合成的技术难点在于成环。目前布美诺肽的合成技术根据成环方法可分为两类，一类是液相中成环，一类是树脂上成环。在液相中成环容易产生大量分子间偶联产物，固相成环方法又因空间位阻太大而导致成环困难。
发明内容
为解决布美诺肽合成的技术难点，本发明提供一种以长链脂肪酸做Linker进行布美诺肽固相合成的方法。具体为以Rink Amide Resin为固相载体，以HO-(CH2)n-COOH作为连接固相载体与目标肽的Linker，其中，羧基端通过酰胺键与固相载体相连，羟基端通过酯键与目标肽相连。目标肽合成结束后，选择性脱除Asp及Lys的侧链保护基，在树脂上成环，环化结束后裂解，得布美诺肽-(CH2)n-NH2，碱性条件下断开酯键，得布美诺肽粗肽，经过纯化，冻干后得布美诺肽精肽。
本发明的技术方案如下：
布美诺肽的固相合成方法，包括如下步骤：
(a)：Rink Amide Resin与长链脂肪羟基酸HO-(CH2)n-COOH偶联合成HO-(CH2)n-CONH-Rink Amide Resin；
(b)：依照布美诺肽序列，在偶联剂存在条件下，依次偶联Fmoc-Lys(Mtt)-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-D-Phe-OH，Fmoc-His(Boc)-OH，Fmoc-Asp(O-2-Phipr)-OH，Fmoc-Nle-OH，Fmoc-Nle-OH，偶联完成后脱除Fmoc保护基，以乙酸酐/吡啶进行乙酰化，得AC-Nle-Asp(O-2-Phipr)-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(Mtt)-O-(CH2)n-CONH-Rink Amide Resin；
(c)：采用TFA/DCM溶液，选择性脱除Lys侧链保护基Mtt，Asp侧链保护基O-2-Phipr，得AC-Nle-Asp-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys-O-(CH2)n-CONH-RinkAmide Resin；
(d)：在偶联剂存在条件下进行树脂上环化，得：AC-Nle-[Asp-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys]cycle-O-(CH2)n-CONH-Rink Amide Resin；
(e)：在裂解剂存在条件下，将肽树脂裂解及侧链脱保护，得：AC-Nle-[Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys]cycle-O-(CH2)n-CONH2；
(f)：以乙腈/水将AC-Nle-[Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys]cycle-O-(CH2)n-CONH2溶解，在碱性条件下酯键水解，溶液调酸后得布美诺肽粗肽；
(g)：布美诺肽粗肽经过纯化，冻干，得布美诺肽精肽。
其中步骤(a)中，所述长链脂肪羟基酸HO-(CH2)n-COOH为8-羟基辛酸或16-羟基十六酸，n等于7或15；RinkAmide Resin的替代度为0.4～0.6mmol/g；
步骤(b)和步骤(d)中缩合剂组合为DMAP/DIC/HOBT，DMAP/DIC/HOAT，DIC/HOBT，DIC/HOAT，HBTU/HOBT/DIPEA，HATU/HOAT/DIPEA中的一种；
步骤(c)中TFA/DCM溶液中TFA所占体积比为3～5％；
步骤(e)中，裂解试剂为加入体积比1-5％清除剂的TFA溶液，清除剂为苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇、巯基乙醇、苯酚、水、三异丙基硅烷中的一种或几种；
步骤(f)中，乙腈/水体系中，乙腈所占的比例为5～15％，碱性条件中碱为氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化锂中的一种。
优选的，一种布美诺肽的固相合成方法包括如下步骤：
(a)以0.52mmol/g的Rink Amide Resin为固相载体，在DIC/HOBT存在下，与HO-(CH2)7-COOH偶联，合成HO-(CH2)7-CONH-RinkAmide Resin；
(b)：依照布美诺肽序列，在DMAP/DIC/HOBT存在条件下，偶联Fmoc-Lys(Mtt)-OH，在DIC/HOBT存在条件下，依次偶联Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-D-Phe-OH，Fmoc-His(Boc)-OH，Fmoc-Asp(O-2-Phipr)-OH，Fmoc-Nle-OH，Fmoc-Nle-OH，偶联完成后脱除Fmoc保护基，以乙酸酐/吡啶进行乙酰化，得AC-Nle-Asp(O-2-Phipr)-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(Mtt)-O-(CH2)7-CONH-Rink Amide Resin；
(c)：采用5％体积比的TFA/DCM溶液，选择性脱除Lys侧链保护基Mtt，Asp侧链保护基O-2-Phipr，得AC-Nle-Asp-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys-O-(CH2)7-CONH-Rink Amide Resin；
(d)：在HBTU/HOBT/DIEA存在条件下进行树脂上环化，得：AC-Nle-[Asp-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys]cycle-O-(CH2)7-CONH-Rink Amide Resin；
(e)：在体积比为TFA:TIS:H2O＝95:2.5:2.5的裂解剂条件下，将肽树脂裂解及侧链脱保护，得：AC-Nle-[Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys]cycle-O-(CH2)7-CONH2；
(f)：以体积比为5:95的乙腈/水将AC-Nle-[Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys]cycle-O-(CH2)7-CONH2溶解，以2mol/L的NaOH/水溶液调pH值到12，0～5℃反应0.5h，30℃继续反应1h，反应过程中维持溶液pH在12～14之间，1.5h后取样以HP-LC检测，酯键断裂完全，停止反应，离心除去所析出的白色物质，上清液以2mol/L的HCl水溶液调节pH至6～7，置于-20℃冰箱中保存；
(g)：将布美诺肽粗肽水溶液以反向制备色谱纯化，冻干，得布美诺肽精肽。
更优选的，一种布美诺肽的固相合成方法包括如下步骤：
(a)以0.52mmol/g的Rink Amide Resin为固相载体，在DIC/HOBT存在下，与HO-(CH2)15-COOH偶联，合成HO-(CH2)15-CONH-RinkAmide Resin，
(b)：依照布美诺肽序列，在DMAP/DIC/HOBT存在条件下，偶联Fmoc-Lys(Mtt)-OH，在DIC/HOBT存在条件下，依次偶联Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-D-Phe-OH，Fmoc-His(Boc)-OH，Fmoc-Asp(O-2-Phipr)-OH，Fmoc-Nle-OH，Fmoc-Nle-OH，偶联完成后脱除Fmoc保护基，以乙酸酐/吡啶进行乙酰化，得AC-Nle-Asp(O-2-Phipr)-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(Mtt)-O-(CH2)15-CONH-Rink Amide Resin；
(c)：采用3％体积比的TFA/DCM溶液，选择性脱除Lys侧链保护基Mtt，Asp侧链保护基O-2-Phipr，得AC-Nle-Asp-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys-O-(CH2)15-CONH-Rink Amide Resin；
(d)：在HATU/HOAT/DIEA存在条件下进行树脂上环化，得：AC-Nle-[Asp-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys]cycle-O-(CH2)15-CONH-Rink Amide Resin；
(e)：在体积比为TFA:TIS:H2O＝95:2.5:2.5的裂解剂条件下，将肽树脂裂解及侧链脱保护，得：AC-Nle-[Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys]cycle-O-(CH2)15-CONH2；
(f)：以体积比为15:85的乙腈/水将AC-Nle-[Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys]cycle-O-(CH2)15-CONH2溶解，以2mol/L的LiOH/水溶液调pH值到12，0～5℃反应0.5h，30℃继续反应1h，反应过程中维持溶液pH在12～14之间，1.5h后取样以HP-LC检测，酯键断裂完全，停止反应，离心除去所析出的白色物质，上清液以2mol/L的HCl水溶液调节pH至6～7，置于-20℃冰箱中保存；
(g)：将布美诺肽粗肽水溶液以反向制备色谱纯化，冻干，得布美诺肽精肽。
本发明的有益效果为：
为解释本发明的有益效果，采用化学式表示如下：
其中：N为一个树脂颗粒上所连接的肽链的数目；
n为Linker中CH2的数目，目前市售试剂为8-羟基辛酸及16-羟基十六酸，即n＝7及15；
当一个树脂颗粒上连接3个肽链，即N为3时，固相环化公式如下：
从上面公式可以看出，在树脂与肽链间连上一个长链脂肪酸，能大大改善固相成环的空间环境，提升环化反应效率。以本发明进行布美诺肽的合成，避免了液相环化时所生成的分子间偶联产物，降低了普通固相环化时的成环难度，精肽收率达到50％以上。
说明书和权利要求书中所使用的缩写含义如下：
RinkAmide Resin 酰胺树脂
O-2-Phipr 2-苯基异丙基
Mtt 4-甲基-三苯甲基
Fmoc 9-芴甲氧羰基
Boc 叔丁氧羰基
Pbf 2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基
Trt 三苯甲基
DCM 二氯甲烷
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DMAP 4-二甲氨基吡啶
DIEA N,N-二异丙基乙胺
DIC N,N-二异丙基碳二亚胺
HBTU 苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐
HATU 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
TBTU O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸
HOBT 1-羟基苯并三唑
HOAT 1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑
TFA 三氟乙酸
TIS 三异丙基硅烷
ACN 乙腈
具体实施方式
下面用具体实施例对本发明进行详细说明，但不限定本专利；根据本发明改变原料的投料比，或是反应溶剂或及缩合剂等，均在本发明的保护范围内。
实施例1：HO-(CH2)7-CONH-Rink Amide Resin的制备
准确称取替代度为0.52mmol/g的Rink Amide Resin100g置于固相合成釜中，以DMF洗涤两次，500ml/次，3min/次，洗涤完成后加入500ml DCM溶胀树脂30min。
以20％哌啶/DMF对Rink Amide Resin进行脱保护，400ml/次，第一次反应5min，第二次反应15min。两次脱保护后以DMF洗涤树脂六次，500ml/次，3min/次。取树脂小样以茚三酮试剂检测，树脂呈深蓝色。
称取HO-(CH2)7-COOH 24.9g(156mmol，3eq)，HOBt 23.2g(171.6mmol，3.3eq)置于溶解瓶中，以200ml DMF溶解，0～5℃预冷10min，加入DIC 27.5ml(171.6mmol，3.3eq)活化5min，活化完成后投入树脂，25℃搅拌反应2h。2h后取树脂以茚三酮试剂检测，树脂呈无色。
实施例2：HO-(CH2)15-CONH-RinkAmide Resin的制备
准确称取替代度为0.52mmol/g的Rink Amide Resin100g置于固相合成釜中，以DMF洗涤两次，500ml/次，3min/次，洗涤完成后加入500ml DCM溶胀树脂30min。
以20％哌啶/DMF对RinkAmide Resin进行脱保护，400ml/次，第一次反应5min，第二次反应15min。两次脱保护后以DMF洗涤树脂六次，500ml/次，3min/次。取树脂小样以茚三酮试剂检测，树脂呈深蓝色。
称取HO-(CH2)15-COOH 42.4g(156mmol，3eq)，HOBt 23.2g(171.6mmol，3.3eq)置于溶解瓶中，以200ml DMF溶解，0～5℃预冷10min，加入DIC 27.5ml(171.6mmol，3.3eq)活化5min，活化完成后投入树脂，25℃搅拌反应2h。2h后取树脂以茚三酮试剂检测，树脂呈无色。
实施例3：Fmoc-Lys(Mtt)-O-(CH2)7-CONH-RinkAmide Resin的制备
准确称取Fmoc-Lys(Mtt)-OH 97.344g(156mmol，3eq)，HOBt 23.2g(171.6mmol，3.3eq)置于溶解瓶中，以300ml DMF溶解，0～5℃预冷10min，加入DIC 27.5ml(171.6mmol，3.3eq)活化5min，活化完成后投入实施例1所合成的树脂HO-(CH2)7-CONH-RinkAmide Resin中，搅拌反应10min后加入DMAP 1.9g(15.6mmol，0.3eq)，25℃搅拌反应5h。5h后洗涤树脂，并置于真空干燥相中干燥(＜-0.1Mpa，8h)。取样品测定替代度，测定值为0.33mmol/g。
称取上述干燥树脂90g(替代度为0.33mmol/g，30mmol)置于固相合成釜中，以DMF洗涤两次，500ml/次，3min/次，洗涤完成后加入500ml DCM溶胀树脂30min。
量取乙酸酐45ml(450mmol，15eq)，吡啶38ml(450mmol，15eq)，两者以200ml DMF溶解，混匀后加入树脂中，25℃搅拌反应1.5h，洗涤树脂，得Fmoc-Lys(Mtt)-O-(CH2)7-CONH-RinkAmide Resin。
实施例4：Fmoc-Lys(Mtt)-O-(CH2)15-CONH-RinkAmide Resin的制备
准确称取Fmoc-Lys(Mtt)-OH 97.344g(156mmol，3eq)，HOBt 23.2g(171.6mmol，3.3eq)置于溶解瓶中，以300ml DMF溶解，0～5℃预冷10min，加入DIC 27.5ml(171.6mmol，3.3eq)活化5min，活化完成后投入实施例2所合成的树脂HO-(CH2)15-CONH-RinkAmideResin中，搅拌反应10min后加入DMAP 1.9g(15.6mmol，0.3eq)，25℃搅拌反应5h。5h后洗涤树脂，并置于真空干燥相中干燥(30℃，＜-0.1Mpa，8h)。取样品测定替代度，测定值为0.30mmol/g。
称取上述干燥树脂100g(替代度为0.30mmol/g，30mmol)置于固相合成釜中，以DMF洗涤两次，500ml/次，3min/次，洗涤完成后加入500ml DCM溶胀树脂30min。
量取乙酸酐45ml(450mmol，15eq)，吡啶38ml(450mmol，15eq)，两者以200ml DMF溶解，混匀后加入树脂中，25℃搅拌反应1.5h，洗涤树脂，得Fmoc-Lys(Mtt)-O-(CH2)15-CONH-RinkAmide Resin。
实施例5：AC-Nle-Asp(O-2-Phipr)-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(Mtt)-O-(CH2)7-CONH-Rink Amide Resin的制备
取实施例3中的Fmoc-Lys(Mtt)-O-(CH2)7-CONH-Rink Amide Resin，脱除Fmoc保护基，依次偶联Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-D-Phe-OH，Fmoc-His(Boc)-OH，Fmoc-Asp(O-2-Phipr)-OH，Fmoc-Nle-OH。Fmoc-Nle-OH偶联完成后脱除Fmoc保护基，以乙酸酐/吡啶进行乙酰化，得AC-Nle-Asp(O-2-Phipr)-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(Mtt)-O-(CH2)7-CONH-Rink Amide Resin。
实施例6：AC-Nle-Asp(O-2-Phipr)-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(Mtt)-O-(CH2)15-CONH-Rink Amide Resin的制备
取实施例4中的Fmoc-Lys(Mtt)-O-(CH2)15-CONH-Rink Amide Resin，脱除Fmoc保护基，依次偶联Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-D-Phe-OH，Fmoc-His(Boc)-OH，Fmoc-Asp(O-2-Phipr)-OH，Fmoc-Nle-OH。Fmoc-Nle-OH偶联完成后脱除Fmoc保护基，以乙酸酐/吡啶进行乙酰化，得AC-Nle-Asp(O-2-Phipr)-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(Mtt)-O-(CH2)15-CONH-Rink Amide Resin
实施例7：AC-Nle-Asp-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys-O-(CH2)7-CONH-Rink Amide Resin的制备
取实施例5中AC-Nle-Asp(O-2-Phipr)-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(Mtt)-O-(CH2)7-CONH-Rink Amide Resin，以300ml体积比为5％的TFA/DCM溶液处理树脂1h，取树脂小样以茚三酮试剂检测，树脂呈深蓝色，洗涤树脂，得AC-Nle-Asp-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys-O-(CH2)7-CONH-Rink Amide Resin
实施例8：AC-Nle-Asp-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys-O-(CH2)15-CONH-Rink Amide Resin的制备
取实施例6中AC-Nle-Asp(O-2-Phipr)-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(Mtt)-O-(CH2)15-CONH-Rink Amide Resin，以300ml体积比为3％的TFA/DCM溶液处理树脂1h，取树脂小样以茚三酮试剂检测，树脂呈深蓝色，洗涤树脂，得AC-Nle-Asp-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys-O-(CH2)15-CONH-Rink Amide Resin
实施例9：AC-Nle-[Asp-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys]cycle-O-(CH2)7-CONH-Rink Amide Resin的制备
称取HBTU 34.2g(90mmol，3eq)，HOBT 12.15g(90mmol，3eq)，以300ml DMF溶解，0～5℃预冷10min，预冷完成后加入到实施例7的AC-Nle-Asp-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys-O-(CH2)7-CONH-Rink Amide Resin中，搅拌条件下加入DIPEA 29.4ml(180mmol，6eq)，25℃搅拌反应2h，取树脂小样以茚三酮试剂检测，树脂颗粒无色，得AC-Nle-[Asp-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys]cycle-O-(CH2)7-CONH-Rink AmideResin。树脂以DMF洗涤6次，甲醇洗涤3次，500ml/次，3min/次，抽干后置于真空干燥箱中干燥(30℃，＜-0.1Mpa，8h)。肽树脂干燥后称重得142.3g。
实施例10：AC-Nle-[Asp-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys]cycle-O-(CH2)15-CONH-Rink Amide Resin的制备
称取HATU 34.2g(90mmol，3eq)，HOAT 12.15g(90mmol，3eq)，以300ml DMF溶解，0～5℃预冷10min，预冷完成后加入到实施例8的AC-Nle-Asp-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys-O-(CH2)15-CONH-Rink Amide Resin中，搅拌条件下加入DIPEA 29.4ml(180mmol，6eq)，25℃搅拌反应2h，取树脂小样以茚三酮试剂检测，树脂颗粒无色，得AC-Nle-[Asp-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys]cycle-O-(CH2)15-CONH-Rink AmideResin。树脂以DMF洗涤6次，甲醇洗涤3次，500ml/次，3min/次，抽干后置于真空干燥箱中干燥(30℃，＜-0.1Mpa，8h)。肽树脂干燥后称重得155.7g。
实施例11：AC-Nle-[Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys]cycle-O-(CH2)7-CONH2的制备
配制1423ml裂解试剂，其组成为TFA:TIS:H2O＝95:2.5:2.5，-20℃冰箱中预冷1h，遇冷完成后将裂解试剂转移至反应釜，搅拌条件下缓慢加入实施例9所得的AC-Nle-[Asp-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys]cycle-O-(CH2)7-CONH-Rink Amide Resin，0～5℃反应1h，升温至25℃反应2h。
反应3h后，滤除树脂，搅拌条件下将滤液加入14L预冻的甲叔醚中，析出大量白色物质，离心，收集离心所得固体，并以甲叔醚洗涤至溶剂pH呈中性，将所得固体置于真空干燥箱中干燥(30℃，＜-0.1Mpa，8h)。称重得AC-Nle-[Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys]cycle-O-(CH2)7-CONH235.4g，纯度为84.3％，收率103.3％。
实施例12：AC-Nle-[Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys]cycle-O-(CH2)15-CONH2的制备
配制1557ml裂解试剂，其组成为TFA:TIS:H2O＝95:2.5:2.5，-20℃冰箱中预冷1h，遇冷完成后将裂解试剂转移至反应釜，搅拌条件下缓慢加入实施例10所得的AC-Nle-[Asp-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys]cycle-O-(CH2)15-CONH-Rink Amide Resin，0～5℃反应1h，升温至25℃反应2h。
反应3h后，滤除树脂，搅拌条件下将滤液加入15L预冻的甲叔醚中，析出大量白色物质，离心，收集离心所得固体，并以甲叔醚洗涤至溶剂pH呈中性，将所得固体置于真空干燥箱中干燥(30℃，＜-0.1Mpa，8h)。称重得AC-Nle-[Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys]cycle-O-(CH2)15-CONH2,41.5g，纯度为88.3％，收率107.6％。
实施例13：AC-Nle-[Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys]cycle-OH的制备
称取实施例11所得的AC-Nle-[Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys]cycle-O-(CH2)7-CONH230g，加入900ml体积比为95:5的水/乙腈溶解，冰浴搅拌条件下缓慢滴加2mol/L的氢氧化钠水溶液，直至反应液pH达到12，0～5℃反应0.5h，30℃继续反应1h，反应过程中维持溶液pH在12～14之间，1.5h后取样以HP-LC检测，酯键断裂完全，停止反应，离心除去所析出的白色物质，上清液以2mol/L的HCl水溶液调节pH至6～7，置于-20℃冰箱中保存。
实施例14：AC-Nle-[Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys]cycle-OH的制备
称取实施例12所得的AC-Nle-[Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys]cycle-O-(CH2)15-CONH230g，加入900ml体积比为85:15的水/乙腈溶解，冰浴搅拌条件下缓慢滴加2mol/L的氢氧化锂水溶液，直至反应液pH达到12，0～5℃反应0.5h，30℃继续反应1h，反应过程中维持溶液pH在12～14之间，1.5h后取样以HP-LC检测，酯键断裂完全，停止反应，离心除去所析出的白色物质，上清液以2mol/L的HCl水溶液调节pH至6～7，置于-20℃冰箱中保存。
实施例15：布美诺肽精肽的制备
将实施例13所得的布美诺肽水溶液室温解冻后，以0.45μm滤膜过滤备用。
内径为100mm的C18制备柱，流动相A为0.1％TFA/水，流动相B为0.1％TFA/乙腈，上样量为500ml/针，流速300ml/min，检测波长210nm。梯度洗脱，峰前和峰后循环进样，得到中控分析纯度为98.2％的精肽溶液，以醋酸/乙腈/水体系转盐后冻干得布美诺肽精肽12.3g，纯度98.8％，总收率51.5％。
实施例16：布美诺肽精肽的制备
将实施例14所得的布美诺肽水溶液室温解冻后，以0.45μm滤膜过滤备用。
内径为100mm的C18制备柱，流动相A为0.1％TFA/水，流动相B为0.1％TFA/乙腈，上样量为500ml/针，流速300ml/min，检测波长210nm。梯度洗脱，峰前和峰后循环进样，得到中控分析纯度为98.5％的精肽溶液，以醋酸/乙腈/水体系转盐后冻干得布美诺肽精肽11.7g，纯度99.1％，总收率53.5％。

Claims (9)

1.一种布美诺肽的固相合成方法，包括如下步骤：
(a)：Rink Amide Resin与长链脂肪羟基酸HO-(CH2)n-COOH偶联合成HO-(CH2)n-CONH-Rink Amide Resin；
(b)：依照布美诺肽序列，在偶联剂存在条件下，依次偶联Fmoc-Lys(Mtt)-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-D-Phe-OH，Fmoc-His(Boc)-OH，Fmoc-Asp(O-2-Phipr)-OH，Fmoc-Nle-OH，Fmoc-Nle-OH偶联完成后脱除Fmoc保护基，以乙酸酐/吡啶进行乙酰化，得AC-Nle-Asp(O-2-Phipr)-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(Mtt)-O-(CH2)n-CONH-Rink Amide Resin；
(c)：采用TFA/DCM溶液，选择性脱除Lys侧链保护基Mtt，Asp侧链保护基O-2-Phipr，得AC-Nle-Asp-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys-O-(CH2)n-CONH-Rink AmideResin；
(d)：在偶联剂存在条件下进行树脂上环化，得：AC-Nle-[Asp-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys]cycle-O-(CH2)n-CONH-Rink Amide Resin；
(e)：在裂解剂存在条件下，将肽树脂裂解及侧链脱保护，得：AC-Nle-[Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys]cycle-O-(CH2)n-CONH2；
(f)：以乙腈/水将AC-Nle-[Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys]cycle-O-(CH2)n-CONH2溶解，在碱性条件下酯键水解，溶液调酸后得布美诺肽粗肽；
(g)：布美诺肽粗肽经过纯化，冻干，得布美诺肽精肽。
2.根据权利要求1所述的一种布美诺肽的固相合成方法，其特征在于，步骤(a)中，所述长链脂肪羟基酸HO-(CH2)n-COOH为8-羟基辛酸或16-羟基十六酸，n等于7或15。
3.根据权利要求1所述的一种布美诺肽的固相合成方法，其特征在于，步骤(a)中，所述Rink Amide Resin的替代度为0.4～0.6mmol/g。
4.根据权利要求1所述的一种布美诺肽的固相合成方法，其特征在于，所述步骤(b)和步骤(d)中偶联剂为DMAP/DIC/HOBT，DMAP/DIC/HOAT，DIC/HOBT，DIC/HOAT，HBTU/HOBT/DIPEA，HATU/HOAT/DIPEA中的一种。
5.根据权利要求1所述的一种布美诺肽的固相合成方法，其特征在于，步骤(c)中，所述TFA/DCM溶液，TFA所占体积比为3～5％。
6.根据权利要求1所述的一种布美诺肽的固相合成方法，其特征在于，步骤(e)中，所述裂解试剂为加入体积比1-5％清除剂的TFA溶液，所述清除剂为苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇、巯基乙醇、苯酚、水、三异丙基硅烷中的一种或几种。
7.根据权利要求1所述的一种布美诺肽的固相合成方法，其特征在于，步骤(f)中，所述乙腈/水体系中，乙腈所占的比例为5～15％，使用的碱为氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化锂中的一种。
8.根据权利要求1所述的一种布美诺肽的固相合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)：以0.52mmol/g的Rink Amide Resin为固相载体，在DIC/HOBT存在下，与HO-(CH2)7-COOH偶联，合成HO-(CH2)7-CONH-Rink Amide Resin；
(b)：依照布美诺肽序列，在DMAP/DIC/HOBT存在条件下，偶联Fmoc-Lys(Mtt)-OH，在DIC/HOBT存在条件下，依次偶联Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-D-Phe-OH，Fmoc-His(Boc)-OH，Fmoc-Asp(O-2-Phipr)-OH，Fmoc-Nle-OH，Fmoc-Nle-OH偶联完成后脱除Fmoc保护基，以乙酸酐/吡啶进行乙酰化，得AC-Nle-Asp(O-2-Phipr)-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(Mtt)-O-(CH2)7-CONH-Rink Amide Resin；
(c)：采用5％体积比的TFA/DCM溶液，选择性脱除Lys侧链保护基Mtt，Asp侧链保护基O-2-Phipr，得AC-Nle-Asp-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys-O-(CH2)7-CONH-RinkAmide Resin；
(d)：在HBTU/HOBT/DIEA存在条件下进行树脂上环化，得：AC-Nle-[Asp-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys]cycle-O-(CH2)7-CONH-Rink Amide Resin；
(e)：在体积比为TFA:TIS:H2O＝95:2.5:2.5的裂解剂条件下，将肽树脂裂解及侧链脱保护，得：AC-Nle-[Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys]cycle-O-(CH2)7-CONH2；
(f)：以体积比为5:95的乙腈/水将AC-Nle-[Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys]cycle-O-(CH2)7-CONH2溶解，以2mol/L的NaOH/水溶液调pH值到12，0～5℃反应0.5h，30℃继续反应1h，反应过程中维持溶液pH在12～14之间，1.5h后取样以HP-LC检测，酯键断裂完全，停止反应，离心除去所析出的白色物质，上清液以2mol/L的HCl水溶液调节pH至6～7，置于-20℃冰箱中保存；
(g)：将布美诺肽粗肽水溶液以反向制备色谱纯化，冻干，得布美诺肽精肽。
9.根据权利要求1所述的一种布美诺肽的固相合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)：以0.52mmol/g的Rink Amide Resin为固相载体，在DIC/HOBT存在下，与HO-(CH2)15-COOH偶联，合成HO-(CH2)15-CONH-Rink Amide Resin，
(b)：依照布美诺肽序列，在DMAP/DIC/HOBT存在条件下，偶联Fmoc-Lys(Mtt)-OH，在DIC/HOBT存在条件下，依次偶联Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-D-Phe-OH，Fmoc-His(Boc)-OH，Fmoc-Asp(O-2-Phipr)-OH，Fmoc-Nle-OH，Fmoc-Nle-OH偶联完成后脱除Fmoc保护基，以乙酸酐/吡啶进行乙酰化，得AC-Nle-Asp(O-2-Phipr)-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(Mtt)-O-(CH2)15-CONH-Rink Amide Resin；
(c)：采用3％体积比的TFA/DCM溶液，选择性脱除Lys侧链保护基Mtt，Asp侧链保护基O-2-Phipr，得AC-Nle-Asp-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys-O-(CH2)15-CONH-RinkAmide Resin；
(d)：在HATU/HOAT/DIEA存在条件下进行树脂上环化，得：AC-Nle-[Asp-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys]cycle-O-(CH2)15-CONH-Rink Amide Resin；
(e)：在体积比为TFA:TIS:H2O＝95:2.5:2.5的裂解剂条件下，将肽树脂裂解及侧链脱保护，得：AC-Nle-[Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys]cycle-O-(CH2)15-CONH2；
(f)：以体积比为15:85的乙腈/水将AC-Nle-[Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys]cycle-O-(CH2)15-CONH2溶解，以2mol/L的LiOH/水溶液调pH值到12，0～5℃反应0.5h，30℃继续反应1h，反应过程中维持溶液pH在12～14之间，1.5h后取样以HP-LC检测，酯键断裂完全，停止反应，离心除去所析出的白色物质，上清液以2mol/L的HCl水溶液调节pH至6～7，置于-20℃冰箱中保存；
(g)：将布美诺肽粗肽水溶液以反向制备色谱纯化，冻干，得布美诺肽精肽。
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