一种布雷默浪丹的合成方法
技术领域
本发明涉及一种多肽的制备方法,具体涉及一种布雷默浪丹的合成方法,属于药物合成领域。
背景技术
布雷默浪丹(Bremelanotide),又称普美拉肽、PT141,是一种α-促黑素细胞刺激激素(α-melanocyte stimulating hormone,αMSH)多肽α类似物,为环七肽结构。大量研究已证实它们的受体分子在性唤起、降低食欲以及催化黑色素的合成中起着重要的作用,由此可以治疗性功能障碍、肥胖以及刺激皮肤产生黑皮素抵抗紫外线灼伤等疾病。PT-141是美国Palatin公司开发的一种治疗性功能障碍的药物,目前已完成III期临床,对男女患者都有效,尤其是女性性冷淡患者唯一有效的候选药物。
现有的布雷默浪丹合成方法以固相合成为主,中国专利200710048824.6公开了一种采用Fmoc(芴甲氧羰基)保护的固相合成方法,首先固相合成带保护基的普美拉肽,其次在树脂上环化普美拉肽,然后从树脂上切割纯化,再转化为醋酸普美拉肽,收率为17%。中国专利200610086841.4公开了PT-141的固相合成方法,该发明通过选择性的保护了部分氨基酸,合成七肽后脱除部分侧链保护基,采用不同的环合顺序环化,裂解纯化后得到目的产物,收率为40%以下。上述为布雷默浪丹的合成主要方法,存在合成路线长,步骤多,合成路线单一,耗时长,成本高,收率不高等问题,而且合成过程中个别氨基酸的官能团保护基相互干扰,极大的增加了官能团保护基的反应选择性。
针对以前不足,本发明提供了一种分别合成布雷默浪丹片断,保护布雷默浪丹序列右侧即第一个氨基酸的羧基官能团,逆时针成环的合成方法。本发明合成路线短、收率高、原料廉价易得、合成难度低、成本低,适合工业化生产。
发明内容
本发明提供了一种新的布雷默浪丹合成方法。本发明使用的缩写具有如下含义:
Fmoc:芴甲氧羰基Otbu:叔丁氧基
HOBt:1-羟基苯骈三唑DIC:N,N-二异丙基碳二亚胺
DMF:N,N-二甲基甲酰胺TFA:三氟乙酸
PyBop:六氟磷酸苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基磷
Lys:赖氨酸Trp:色氨酸Arg:精氨酸
D-Phe:D-苯丙氨酸His:组氨酸
Asp:天冬氨酸Nle:新亮氨酸Boc:叔丁氧羰基
Pbf:2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰
DMF:N,N-二甲基甲酰胺Piperdine:六氢吡啶
Fmoc-Rink-AM Resin:芴甲氧羰基氨甲基树脂
TFA:三氟乙酸HAC:醋酸
PyBop:六氟磷酸苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基磷
Trt:2-氯三苯基DCM:二氯甲烷EDT:乙二硫醇
DIE(P)A:N,N-二异丙基乙胺HMBA Linker:对羟甲基苯甲酸
PAS:对羧基苯酚DBLK:六氢毗啶·峨匹
DMAP:4-二甲氨基吡啶
本发明采用如下技术方案:
一种布雷默浪丹的合成方法,将Lys的羧基用对羟甲基苯甲酸进行保护。可以是在载体树脂上连接对羟基苯甲酸基因,然后和Fmoc-Lys(IVDde)-OH发生酯化反应,再依次接入氨基酸,得到Boc-His(Trt)-D-Phe-Arg(pbf)-TrP(Boc)-Lys(IVDde)-HMBA-P,然后用裂解液脱掉Lys上的保护基IVDde,露出的氨基基团,将露出的氨基基团与Ac-Nle-Asp(COOH)-otBu中Asp的羧基发生缩合反应得缩合液,将缩合液裂解、过滤取滤液、沉降、离心取下层固体,真空干燥得粗肽,将粗肽环化得环化液,将环化液水解,再经过制备型高效液相色谱分离纯化后,冷冻干燥得布雷默浪丹纯品。将纯品进行检测,纯度为98%以上,回收率50%-60%。
本发明所用的原料廉价易得,树脂用Rink-Amide-AM-Resin、初始氨基酸为Fmoc-Lys(IVDde)-OH,采用哌啶试剂脱保护和三氟乙酸切割肽树脂,然后环化水解,避免使用昂贵的pd(PPh3)4/PhSiH3催化脱保护和强腐蚀性的HF切割肽树脂。本发明改变了环化方向,先分别合成Boc-His(Trt)-D-Phe-Arg(pbf)-TrP(Boc)-Lys(IVDde)-HMBA-P、Ac-Nle-Asp(COOH)-otBu,然后使Asp上的羧基与Lys上的氨基连接,最后完成成环,与传统的方法先合成七肽再成环相比极大的提高了收率。这可能是因为Ac-Nle-Asp(COOH)-otBu上Asp的侧链羧基与Lys上的氨基连接时位阻比七肽Ac-Nle-Asp(otbu)-His(Trt)-D-Phe-Arg(pbf)-TrP(Boc)-Lys(IVDde)-HMBA-P上Asp与Lys成环空间位阻更小。本发明Lys的羧基用对羟甲基苯甲酸进行保护,好处在于保护基常见,保护基容易脱除且脱除方便。
实施例一:
1.制备HMBA-Rink-Amide-AM-resin树脂
取出Rink-Amide-AM-resin树脂,放入玻璃多肽反应柱里面,用DMF洗涤一次,然后用DCM溶胀20分钟左右,抽去DCM;加入用DMF溶解好的4倍量的HMBA linker、HOBt、DIC,耦合反应2个小时,凯瑟试剂检测,若无色,表示反应完全,若还有颜色,则表示没有反应完全,重复耦合过程,直至反应完全为止。然后用DMF洗涤四次。
2.制备Fmoc-Lys(IVDde)-HMBA-Rink-Amide-AM-resin树脂
在步骤1的玻璃多肽反应柱里面加入用DMF混合好的Fmoc-Lys(IVDde)-OH、HOBt、DMAP、DIC,他们和树脂的摩尔比是(3/3/0.3/3.6):1,反应5个小时以上,然后用DMF洗四遍,加入20-30倍量的醋酸酐和吡啶混合液(比例为2:1),封闭过夜,或者封闭10个小时以上,用DMF,DCM交替洗涤6次,用甲醇收缩树脂,每次五分钟,真空抽干树脂。
3.Fmoc-Lys(IVDde)-HMBA-Rink-Amide-AM-resin替代度的测量
取5-10mg步骤2中得到的树脂,放入1.5mL的EP管中,加入1mL的DBLK,震荡20-30min。静置取上清液,准备2个10mL的小定量瓶,一个作为空白里面加入100ul的DBLK,另一个加入100ul的上清液,分别加入DMF定量到10mL,摇匀。用紫外分光光度计在波长为290nm处检测,读取数值。根据公式,算出替代度为0.3mmol/g。公式为:51*测出数值/(5.8*称取树脂量)。
4.Fmoc-Trp(boc)-Lys(IVDde)-HMBA-Rink-Amide-AM-resin的合成
根据要合成的规模,称取相应质量步骤2中制备好的树脂(合成的摩尔数=树脂的质量*树脂替代度)3.3g,即0.99mmol放入玻璃多肽反应柱里面,用DMF洗涤一次,然后用DCM溶胀20分钟左右,抽去DCM,加入DBLK,进行脱保护(脱去临时保护基Fmoc),分别用DBLK脱除两次,时间是10+15分钟,中间用DMF洗涤一次。第二次脱保护结束后,用DMF,DCM分别交替洗涤树脂五次,加入4倍量的Fmoc-Trp(boc)-OH、HOBt、DIC的混合DMF溶液,耦合反应2小时后,凯瑟试剂检测,若无色,表示反应完全,若还有颜色,则表示没有反应完全,应延长反应时间,或者重复上面的方法进行重复耦合,直至印鉴无色为止。然后用DMF洗涤三次。
5.Fmoc-Arg(pbf)-Trp(boc)-Lys(IVDde)-HMBA-Rink-Amide-AM-resin的合成
在步骤4后,入DBLK,进行脱保护(脱去临时保护基Fmoc),分别用DBLK脱除两次,时间是10+15分钟,中间用DMF洗涤一次。第二次脱保护结束后,用DMF,DCM分别交替洗涤树脂五次,加入4倍量的Fmoc-Arg(pbf)-OH,HOBt,DIC,的混合DMF溶液,反应2小时后,凯瑟试剂检测,诺无色,表示反应完全,若还有颜色,则表示没有反应完全,应延长反应时间,或者重复上面的方法进行重复耦合,直至印鉴无色为止。然后用DMF洗涤三次。
6.Fmoc-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(boc)-Lys(IVDde)-HMBA-Rink-Amide-AM-resin的合成
在步骤5后,入DBLK,进行脱保护(脱去临时保护基Fmoc),分别用DBLK脱除两次,时间是10+15分钟,中间用DMF洗涤一次。第二次脱保护结束后,用DMF,DCM分别交替洗涤树脂五次,加入4倍量的Fmoc-D-Phe-OH,HOBt,DIC的混合DMF溶液,反应2小时后,凯瑟试剂检测,诺无色,表示反应完全,若还有颜色,则表示没有反应完全,应延长反应时间,或者重复上面的方法进行重复耦合,直至印鉴无色为止。然后用DMF洗涤三次。
7.Boc-His(trt)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(boc)-Lys(IVDde)-HMBA-Rink-Amide-AM-resin的合成
在步骤6后,入DBLK,进行脱保护(脱去临时保护基Fmoc),分别用DBLK脱除两次,时间是10+15分钟,中间用DMF洗涤一次。第二次脱保护结束后,用DMF,DCM分别交替洗涤树脂五次,加入4倍量的Boc-His(trt)-OH,HOBt,DIC,的混合DMF溶液,反应2小时后,凯瑟试剂检测,诺无色,表示反应完全,若还有颜色,则表示没有反应完全,应延长反应时间,或者重复上面的方法进行重复耦合,直至印鉴无色为止。然后用DMF洗涤三次。
8.Boc-His(trt)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(boc)-Lys(IVDde)-HMBA-Rink-Amide-AM-resin树脂中侧链保护基IVDde的脱除
在步骤7后,用5%的水合肼,对树脂进行两次脱除,每次20分钟左右,然后用DMF,DCM分别交替洗涤树脂五次。
在步骤8后,加入4倍量的AC-Nle-Asp(COOH)-otbu,HOBT,DIC的混合DMF溶液,反应2小时后,凯瑟试剂检测,诺无色,表示反应完全,若还有颜色,则表示没有反应完全,应延长反应时间,或者重复上面的方法进行重复耦合,直至印鉴无色为止。然后DMF,DCM交替洗涤6次,然后用甲醇收缩树脂,每次五分钟,真空抽干树脂。
将树脂干燥后,称重,按1:10的树脂和裂解液的比例。裂解树脂,裂解液的配比为(TFA:苯甲硫醚:苯甲醚:EDT=90:5:2:3),裂解时间2个小时左右。裂解结束后,用砂芯漏斗过滤,留下滤液,将滤液在甲基叔丁醚中沉降,然后离心,真空干燥,得到粗肽
(0.99mmol量的树脂得到粗肽1.14g左右,收率在98%左右(1mmol的量,理论产量1.174g))
将粗肽溶解在DMF/DCM=2.5:1的混合溶剂中,按照6mmol/L的比例溶解,加入PyBop.HOBt.DIPEA.(和粗肽的摩尔比分别是:1:3:3:3),环化2-4个小时,过程中可以用HPLC检测,确认反应完全。便得到
旋蒸上述溶液,把里面的DCM蒸发掉,然后在加入剩余液体体积的三倍的超纯水,然后加入稀的NaOH溶液,调PH=10-11,搅拌半个小时,则完全水解掉HMBA。
13.加酸中和
14.布雷默浪丹的精品
15.高效液相制备方法
高效制备液相色谱仪使用前的准备:A相为上述制备水溶液,B相为上述制备乙腈溶液,选择C18直径50MM的DAC制备柱,流速为40ML/MIN。柱温为25度,波长220nm,将上述环化过滤后粗肽500ml泵入液相进行制备,制备梯度为时间0-7-50(MIN),浓度为5-29-39(B%),出峰时间为25-30MIN,出峰是B%浓度为35%时。收峰高为>150MV为布雷默郎丹纯品。最后得纯度99.2%以上的纯品0.587克左右,布雷默郎丹回收率57.3%。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想,对本说明书内容不应理解为对本发明的限制。