CN106589111B - 一种布雷默浪丹的合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多肽的制备方法，具体涉及一种布雷默浪丹的合成方法，属于药物合成领域。本发明通过先分别合成布雷默浪丹的两个片断，两个片断分别为2个氨基酸和5个氨基酸片断，同时用对羟甲基苯甲酸保护布雷默浪丹序列右侧即赖氨酸的羧基官能团，采用逆时针成环的合成方法得到终产物布雷默浪丹。本发明合成路线短、收率高、原料廉价易得、合成难度低、成本低，适合工业化生产。

Description

一种布雷默浪丹的合成方法
技术领域
本发明涉及一种多肽的制备方法，具体涉及一种布雷默浪丹的合成方法，属于药物合成领域。
背景技术
布雷默浪丹(Bremelanotide)，又称普美拉肽、PT141，是一种α-促黑素细胞刺激激素(α-melanocyte stimulating hormone，αMSH)多肽α类似物，为环七肽结构。大量研究已证实它们的受体分子在性唤起、降低食欲以及催化黑色素的合成中起着重要的作用，由此可以治疗性功能障碍、肥胖以及刺激皮肤产生黑皮素抵抗紫外线灼伤等疾病。PT-141是美国Palatin公司开发的一种治疗性功能障碍的药物，目前已完成III期临床，对男女患者都有效，尤其是女性性冷淡患者唯一有效的候选药物。
现有的布雷默浪丹合成方法以固相合成为主，中国专利200710048824.6公开了一种采用Fmoc(芴甲氧羰基)保护的固相合成方法，首先固相合成带保护基的普美拉肽，其次在树脂上环化普美拉肽，然后从树脂上切割纯化，再转化为醋酸普美拉肽，收率为17％。中国专利200610086841.4公开了PT-141的固相合成方法，该发明通过选择性的保护了部分氨基酸，合成七肽后脱除部分侧链保护基，采用不同的环合顺序环化，裂解纯化后得到目的产物，收率为40％以下。上述为布雷默浪丹的合成主要方法，存在合成路线长，步骤多，合成路线单一，耗时长，成本高，收率不高等问题，而且合成过程中个别氨基酸的官能团保护基相互干扰，极大的增加了官能团保护基的反应选择性。
针对以前不足，本发明提供了一种分别合成布雷默浪丹片断，保护布雷默浪丹序列右侧即第一个氨基酸的羧基官能团，逆时针成环的合成方法。本发明合成路线短、收率高、原料廉价易得、合成难度低、成本低，适合工业化生产。
发明内容
本发明提供了一种新的布雷默浪丹合成方法。本发明使用的缩写具有如下含义：
Fmoc：芴甲氧羰基Otbu：叔丁氧基
HOBt:1-羟基苯骈三唑DIC:N,N-二异丙基碳二亚胺
DMF:N,N-二甲基甲酰胺TFA:三氟乙酸
PyBop：六氟磷酸苯并三唑－1－基氧基三吡咯烷基磷
Lys：赖氨酸Trp：色氨酸Arg：精氨酸
D-Phe：D-苯丙氨酸His：组氨酸
Asp：天冬氨酸Nle：新亮氨酸Boc：叔丁氧羰基
Pbf：2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰
DMF：N，N-二甲基甲酰胺Piperdine：六氢吡啶
Fmoc-Rink-AM Resin：芴甲氧羰基氨甲基树脂
TFA：三氟乙酸HAC：醋酸
PyBop：六氟磷酸苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基磷
Trt：2-氯三苯基DCM:二氯甲烷EDT：乙二硫醇
DIE(P)A：N，N-二异丙基乙胺HMBA Linker:对羟甲基苯甲酸
PAS：对羧基苯酚DBLK:六氢毗啶·峨匹
DMAP：4-二甲氨基吡啶
本发明采用如下技术方案：
一种布雷默浪丹的合成方法，将Lys的羧基用对羟甲基苯甲酸进行保护。可以是在载体树脂上连接对羟基苯甲酸基因，然后和Fmoc-Lys(IVDde)-OH发生酯化反应，再依次接入氨基酸，得到Boc-His(Trt)-D-Phe-Arg(pbf)-TrP(Boc)-Lys(IVDde)-HMBA-P，然后用裂解液脱掉Lys上的保护基IVDde，露出的氨基基团，将露出的氨基基团与Ac-Nle-Asp(COOH)-otBu中Asp的羧基发生缩合反应得缩合液，将缩合液裂解、过滤取滤液、沉降、离心取下层固体，真空干燥得粗肽，将粗肽环化得环化液，将环化液水解，再经过制备型高效液相色谱分离纯化后，冷冻干燥得布雷默浪丹纯品。将纯品进行检测，纯度为98％以上，回收率50％-60％。
本发明所用的原料廉价易得，树脂用Rink-Amide-AM-Resin、初始氨基酸为Fmoc-Lys(IVDde)-OH，采用哌啶试剂脱保护和三氟乙酸切割肽树脂,然后环化水解，避免使用昂贵的pd(PPh3)4/PhSiH3催化脱保护和强腐蚀性的HF切割肽树脂。本发明改变了环化方向，先分别合成Boc-His(Trt)-D-Phe-Arg(pbf)-TrP(Boc)-Lys(IVDde)-HMBA-P、Ac-Nle-Asp(COOH)-otBu，然后使Asp上的羧基与Lys上的氨基连接，最后完成成环，与传统的方法先合成七肽再成环相比极大的提高了收率。这可能是因为Ac-Nle-Asp(COOH)-otBu上Asp的侧链羧基与Lys上的氨基连接时位阻比七肽Ac-Nle-Asp(otbu)-His(Trt)-D-Phe-Arg(pbf)-TrP(Boc)-Lys(IVDde)-HMBA-P上Asp与Lys成环空间位阻更小。本发明Lys的羧基用对羟甲基苯甲酸进行保护，好处在于保护基常见，保护基容易脱除且脱除方便。
实施例一：
1.制备HMBA-Rink-Amide-AM-resin树脂
取出Rink-Amide-AM-resin树脂，放入玻璃多肽反应柱里面，用DMF洗涤一次，然后用DCM溶胀20分钟左右，抽去DCM；加入用DMF溶解好的4倍量的HMBA linker、HOBt、DIC，耦合反应2个小时，凯瑟试剂检测，若无色，表示反应完全，若还有颜色，则表示没有反应完全，重复耦合过程，直至反应完全为止。然后用DMF洗涤四次。
2.制备Fmoc-Lys(IVDde)-HMBA-Rink-Amide-AM-resin树脂
在步骤1的玻璃多肽反应柱里面加入用DMF混合好的Fmoc-Lys(IVDde)-OH、HOBt、DMAP、DIC，他们和树脂的摩尔比是(3/3/0.3/3.6)：1，反应5个小时以上，然后用DMF洗四遍，加入20-30倍量的醋酸酐和吡啶混合液(比例为2:1)，封闭过夜，或者封闭10个小时以上，用DMF，DCM交替洗涤6次，用甲醇收缩树脂，每次五分钟，真空抽干树脂。
3.Fmoc-Lys(IVDde)-HMBA-Rink-Amide-AM-resin替代度的测量
取5-10mg步骤2中得到的树脂，放入1.5mL的EP管中，加入1mL的DBLK，震荡20-30min。静置取上清液，准备2个10mL的小定量瓶，一个作为空白里面加入100ul的DBLK，另一个加入100ul的上清液，分别加入DMF定量到10mL，摇匀。用紫外分光光度计在波长为290nm处检测，读取数值。根据公式，算出替代度为0.3mmol/g。公式为：51*测出数值/(5.8*称取树脂量)。
4.Fmoc-Trp(boc)-Lys(IVDde)-HMBA-Rink-Amide-AM-resin的合成
根据要合成的规模，称取相应质量步骤2中制备好的树脂(合成的摩尔数＝树脂的质量*树脂替代度)3.3g，即0.99mmol放入玻璃多肽反应柱里面，用DMF洗涤一次，然后用DCM溶胀20分钟左右，抽去DCM，加入DBLK，进行脱保护(脱去临时保护基Fmoc)，分别用DBLK脱除两次，时间是10+15分钟，中间用DMF洗涤一次。第二次脱保护结束后，用DMF，DCM分别交替洗涤树脂五次，加入4倍量的Fmoc-Trp(boc)-OH、HOBt、DIC的混合DMF溶液，耦合反应2小时后，凯瑟试剂检测，若无色，表示反应完全，若还有颜色，则表示没有反应完全，应延长反应时间，或者重复上面的方法进行重复耦合，直至印鉴无色为止。然后用DMF洗涤三次。
5.Fmoc-Arg(pbf)-Trp(boc)-Lys(IVDde)-HMBA-Rink-Amide-AM-resin的合成
在步骤4后，入DBLK，进行脱保护(脱去临时保护基Fmoc)，分别用DBLK脱除两次，时间是10+15分钟，中间用DMF洗涤一次。第二次脱保护结束后，用DMF，DCM分别交替洗涤树脂五次，加入4倍量的Fmoc-Arg(pbf)-OH，HOBt,DIC,的混合DMF溶液，反应2小时后，凯瑟试剂检测，诺无色，表示反应完全，若还有颜色，则表示没有反应完全，应延长反应时间，或者重复上面的方法进行重复耦合，直至印鉴无色为止。然后用DMF洗涤三次。
6.Fmoc-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(boc)-Lys(IVDde)-HMBA-Rink-Amide-AM-resin的合成
在步骤5后，入DBLK，进行脱保护(脱去临时保护基Fmoc)，分别用DBLK脱除两次，时间是10+15分钟，中间用DMF洗涤一次。第二次脱保护结束后，用DMF，DCM分别交替洗涤树脂五次，加入4倍量的Fmoc-D-Phe-OH,HOBt,DIC的混合DMF溶液，反应2小时后，凯瑟试剂检测，诺无色，表示反应完全，若还有颜色，则表示没有反应完全，应延长反应时间，或者重复上面的方法进行重复耦合，直至印鉴无色为止。然后用DMF洗涤三次。
7.Boc-His(trt)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(boc)-Lys(IVDde)-HMBA-Rink-Amide-AM-resin的合成
在步骤6后，入DBLK，进行脱保护(脱去临时保护基Fmoc)，分别用DBLK脱除两次，时间是10+15分钟，中间用DMF洗涤一次。第二次脱保护结束后，用DMF，DCM分别交替洗涤树脂五次，加入4倍量的Boc-His(trt)-OH,HOBt,DIC,的混合DMF溶液，反应2小时后，凯瑟试剂检测，诺无色，表示反应完全，若还有颜色，则表示没有反应完全，应延长反应时间，或者重复上面的方法进行重复耦合，直至印鉴无色为止。然后用DMF洗涤三次。
8.Boc-His(trt)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(boc)-Lys(IVDde)-HMBA-Rink-Amide-AM-resin树脂中侧链保护基IVDde的脱除
在步骤7后，用5％的水合肼，对树脂进行两次脱除，每次20分钟左右，然后用DMF，DCM分别交替洗涤树脂五次。
9.
Figure GDA0002747881070000041
的合成
在步骤8后，加入4倍量的AC-Nle-Asp(COOH)-otbu,HOBT,DIC的混合DMF溶液，反应2小时后，凯瑟试剂检测，诺无色，表示反应完全，若还有颜色，则表示没有反应完全，应延长反应时间，或者重复上面的方法进行重复耦合，直至印鉴无色为止。然后DMF，DCM交替洗涤6次，然后用甲醇收缩树脂，每次五分钟，真空抽干树脂。
10.裂解
Figure GDA0002747881070000042
将树脂干燥后，称重，按1:10的树脂和裂解液的比例。裂解树脂，裂解液的配比为(TFA：苯甲硫醚：苯甲醚：EDT＝90:5:2:3)，裂解时间2个小时左右。裂解结束后，用砂芯漏斗过滤，留下滤液，将滤液在甲基叔丁醚中沉降，然后离心，真空干燥，得到粗肽
Figure GDA0002747881070000051
(0.99mmol量的树脂得到粗肽1.14g左右，收率在98％左右(1mmol的量，理论产量1.174g))
11.氧化合成
Figure GDA0002747881070000052
将粗肽溶解在DMF/DCM＝2.5:1的混合溶剂中，按照6mmol/L的比例溶解，加入PyBop.HOBt.DIPEA.(和粗肽的摩尔比分别是：1:3:3:3)，环化2-4个小时，过程中可以用HPLC检测，确认反应完全。便得到
Figure GDA0002747881070000053
12.水解得到
Figure GDA0002747881070000054
旋蒸上述溶液，把里面的DCM蒸发掉，然后在加入剩余液体体积的三倍的超纯水，然后加入稀的NaOH溶液，调PH＝10-11，搅拌半个小时，则完全水解掉HMBA。
13.加酸中和
14.布雷默浪丹的精品
15.高效液相制备方法
高效制备液相色谱仪使用前的准备：A相为上述制备水溶液，B相为上述制备乙腈溶液，选择C18直径50MM的DAC制备柱，流速为40ML/MIN。柱温为25度,波长220nm，将上述环化过滤后粗肽500ml泵入液相进行制备，制备梯度为时间0-7-50(MIN)，浓度为5-29-39(B％),出峰时间为25-30MIN，出峰是B％浓度为35％时。收峰高为>150MV为布雷默郎丹纯品。最后得纯度99.2％以上的纯品0.587克左右，布雷默郎丹回收率57.3％。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想，对本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (1)

1.一种布雷默浪丹的合成方法，其特征在于,
将Lys的羧基用对羟甲基苯甲酸进行保护；
在Rink-Amide-AM-resin树脂上连接对羟甲基苯甲酸基团得到HMBA-Rink-Amide-AM-resin树脂，然后和Fmoc-Lys(IVDde)-OH发生酯化反应，得到Fmoc-Lys(IVDde)-HMBA-Rink-Amide-AM-resin树脂后；
分别合成Ac-Nle-Asp(COOH)-otBu和Boc-His(Trt)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(IVDde)-HMBA-Rink-Amide-AM-resin；
将Boc-His(Trt)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(IVDde)-HMBA-Rink-Amide-AM-resin中的Lys脱掉保护基IVDde露出的氨基基团与Ac-Nle-Asp(COOH)-otBu中Asp的羧基发生缩合反应得缩合液；
将缩合液依次经过如下步骤处理：加入裂解试剂裂解、过滤取滤液、沉降、离心取下层固体，真空干燥得粗肽，将粗肽环化得环化液，将环化液水解，再经过制备型高效液相色谱分离纯化后，冷冻干燥得布雷默浪丹纯品。
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