CN103833831A

CN103833831A - 一种卡贝缩宫素的制备方法

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Publication number: CN103833831A
Application number: CN201410076731.4A
Authority: CN
Inventors: 袁剑琳; 陈超; 张皓; 张巍; 张成广
Original assignee: HAINAN SHUANGCHENG PHARMACEUTICALS CO Ltd
Current assignee: HAINAN SHUANGCHENG PHARMACEUTICALS CO Ltd
Priority date: 2013-10-22
Filing date: 2014-03-04
Publication date: 2014-06-04
Anticipated expiration: 2034-03-04
Also published as: CN103833831B

Abstract

本发明公开了一种卡贝缩宫素的制备方法，所述的方法包括如下步骤：将Fmoc-Cys(Mmt)-OH与羟基官能团树脂偶联得到Fmoc-Cys(Mmt)-树脂。将Fmoc-Cys(Mmt)-树脂脱除Fmoc后得到H-Cys(Mmt)-树脂。将Fmoc-Asn(Trt)-OH与H-Cys(Mmt)-树脂偶联得到Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Mmt)-树脂。按照固相合成的方法重复脱Fmoc、缩合反应的步骤，得到如A结构的多肽树脂。A脱Fmoc后，与溴代丁酸琥珀酰亚胺酯反应得到B；B经过弱酸裂解得到C，然后经环化、裂解得到如式D的片段；D经过强酸体系裂解得到E。将Fmoc-Gly-OH和氨基树脂混合后经偶联反应，脱Fmoc后得到H-Gly-树脂。按照固相合成的方法重复上述步骤得到F。将片段E与F偶联得到如式G的多肽树脂。G经裂解后得到卡贝缩宫素H。本发明方法总收率高，杂质含量少，产物纯度高，具有较大的产业化前景。

Description

一种卡贝缩宫素的制备方法

技术领域

本发明属于多肽药物制备方法领域，具体涉及一种卡贝缩宫素的制备方法。

背景技术

卡贝缩宫素(Carbetocin)是一种化学合成的具有激动剂性质的长效催产素九肽类似物，其临床和药理特性与天然产生的催产素非常类似，卡贝缩宫素与子宫平滑肌的催产素受体结合，引起子宫的节律性收缩，在原有的收缩基础上，增加其频率和增加子宫张力。在非妊娠状态下，子宫的催产素受体含量很低，在妊娠期间增加，分娩时达高峰。因此卡贝缩宫素对非妊娠的子宫没有作用，但是对妊娠的子宫和刚生产的子宫具有有效的子宫收缩作用。目前国内只有原研厂家辉凌公司的进口药和辉凌中国的产品巧特欣，市场还处于保护期。

国外专利情况：

专利ES2115543，采用固液结合合成法：先通过常规的多肽固相合成法，采用HOBt/DIC偶联体系得到H-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂，该肽树脂和4-氯丁酸缩合生成4-Cl-Butyl-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂，经过酸裂解后得到线性肽4-Cl-Butyl-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH₂，线性肽在乙腈和水（V:V=1:1）中用1M NaOH调节pH=9，环化得到卡贝缩宫素，环化采用的碱包括LiOH、NaHCO₃、DIEA、DMAP；

国内专利情况：

深圳瀚宇药业有限公司2009年申请了专利“一种固相制备卡贝缩宫素的方法”，专利号为CN10555272A。采用了Alloc保护半胱氨酸的巯基(Fmoc-Cys(Alloc)-OH)，其它的氨基酸如下：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(OMe)-OH。以Rink Amide氨基树脂为固相合成的载体，经过依次偶联原料氨基酸得到H-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Alloc)-Pro-Leu-Gly-氨基树脂，接着与X(CH₂)₃COOH (X代表卤素，优选Br)反应得到Br-C(CH₂) ₂CONH-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Alloc)-Pro-Leu-Gly-氨基树脂，采用四三苯基膦钯/苯基硅烷/DCM脱除Alloc保护基得到Br-C(CH₂) ₂CONH-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys-Pro-Leu-Gly-氨基树脂，加入碱进行固相环化，得到卡贝缩宫素-氨基树脂，再经过裂解（裂解试剂是TFA/水/苯酚/乙二硫醇/苯甲硫醚）即可得到卡贝缩宫素粗肽，该粗肽通过离子交换柱的方法制备卡贝缩宫素衍生物（如卡贝缩宫素的醋酸盐、盐酸盐等）。

深圳键元医药科技有限公司在2010年申请了 “一种具有宫缩作用药物的生产工艺”的专利（CN102146122A）。在专利中采用保护的氨基酸Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(Me)-OH为原料，Rink Amide MBHA为载体，通过TBTU /HOBt/DIEA缩合得到Fmoc-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-氨基树脂，以1% TFA/DCM脱除半胱氨酸侧链保护，然后与4-溴丁酸在DIEA/DMF作用生成Fmoc-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys((CH₂)₃COOH)-Pro-Leu-Gly-氨基树脂。该肽树脂脱去Fmoc后，在TCTU/DIEA/DMF下环化生成卡贝缩宫素-氨基树脂，该片段经裂解（裂解试剂TFA：EDT：水=95:2.5:2.5）即可得到卡贝缩宫素粗肽。

发明内容

本发明提供了一种固相片段法合成卡贝缩宫素的方法，该方法的反应条件温和，收率高，单杂含量低，有利于实现规模化生产。

本发明的技术方案包括以下步骤：

1.一种卡贝缩宫素的制备方法，其特征主要包括以下步骤：

（1）以0.5-1.1 mmol/g王树脂为载体、Fmoc保护的氨基酸为单体，依次连接Fmoc氨基酸，以Fmoc-Tyr(OMe)-OH为终止氨基酸，得到Fmoc-Tyr(OMe)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Mmt)-树脂片段A。

（2）A经脱Fmoc后，与溴代丁酸琥珀酰亚胺酯反应得到B；B在1%-5%的TFA/DCM作用下得到C；然后C在树脂上环化得到D；D以TFA/TIS/EDT为切肽试剂、在乙醚中沉淀形成E；

（3）以Rink amide AM树脂为载体，Fmoc保护的氨基酸为单体，依次连接氨基酸，得到片段F；

（4）E与F偶联得到G，G经裂解得到卡贝缩宫素粗品H；

（5）将粗品溶于水，经过滤后通过制备HPLC进行分离纯化，得到卡贝缩宫素纯品。

2.根据本发明所述的方法，以Fmoc保护的氨基酸为单体，依次与王树脂相连得到如式A的多肽树脂；采用偶联至多肽树脂上的缩合剂为下述缩合剂的一种或多种组合：DIC、HATU、TBTU、HBTU、PyBop、HOBt、Cl-HOBt、DIPEA、NMM、DIEA。

3.根据本发明所述的方法，Cys 的侧链保护基为Mmt。

4.根据本发明所述的方法，脱除Mmt保护基试剂为1%-5%TFA的DCM溶液。

5.根据本发明所述的方法；H-Tyr(OMe)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Mmt)-树脂与溴代丁酸琥珀酰亚胺酯在选自由有机溶剂DCM，NMP和DMF组成的组中的至少一种溶剂中反应得到片段B。

6.根据本发明所述的方法，环化反应在树脂上进行，所用的试剂为：二异丙基乙基胺，三乙胺，LiOH等。

7.根据本发明所述的方法，采用E偶联至F肽树脂上的缩合剂为下述一种或多种组合：DIC、HATU、TBTU、HBTU、PyBop、HOBt、Cl-HOBt、DIPEA、NMM、DEPBT、DIEA。

8.根据本发明所述的方法，以TFA/TIS/HAc为切肽试剂，其比例为90.0:5.0:5.0，最后在乙醚沉淀得到卡贝缩宫素的粗品H。

9.根据本发明所述的方法，以C18柱为填料柱，通过制备HPLC进行分离纯化，流动相为硫酸铵的水溶液和乙腈的混合液，检测波长为280mm。

其中，化学物质A至H的化学结构如下所示：

Figure 2014100767314100002DEST_PATH_IMAGE002

Figure 2014100767314100002DEST_PATH_IMAGE003

该发明操作简单，产物的HPLC纯度大于99.0%，达到中国药典的要求。

与传统的工艺中使用昂贵的原料Fmoc-2-氨基-3-(3-叔丁氧基羰基-丙基磺胺酰基)-丙酸)（Fmoc-2-amino-3-(3-tert-butoxycarbonyl-propylsulfanyl)-propionic acid)）比较，该发明采用Fmoc-Cys(Mmt)-OH为原料，通过片段合成法，使用价格相对便宜的Fmoc-Cys(Mmt)-OH巧妙地避开了专利保护的路线，是一条具有工业化生产应用前景的路线。

附图说明

图1是本发明的卡贝缩宫素的LC-MS 图谱。

图2是本发明的卡贝缩宫素的HPLC 图谱。

具体实施方式

按照本发明相关步骤如下：

(1)片段D的合成

上述合成步骤中，“Fmoc- Asn(Trt)-OH/TBTU/DIEA/HOBt”的表述意指，Fmoc- Asn(Trt)-OH作为含肽原料是必须组分，“TBTU/DIEA/HOBt”的三者中选择其中至少一种。

本文中，除非特别注明，否则并列的多种缩合剂或切肽试剂等的试剂均为选择其中至少一种；而含肽原料是必须组分。

(2)片段E和H的合成

Figure 2014100767314100002DEST_PATH_IMAGE005

其中，化学物质A至H的化学结构如下所示：

Figure 2014100767314100002DEST_PATH_IMAGE006

实施例1

（1）Fmoc-Cys(Mmt)-树脂的制备

称取30g王树脂(0.50 mmol/g)置于固相反应器中，加入300 毫升的DMF溶胀约10分钟、抽干；加入18.5g (30 mmol) 的Fmoc-Cys(Mmt)-OH，4.05g (30 mmol)的HOBt，7.0 mL的DIC (45.0 mmol)，183.2 mg的DMAP (1.5 mmol)，混合物常温震荡2.5-3小时，抽干反应溶液，用200毫升的DMF 洗涤3遍，然后用200毫升吡啶/Ac₂O/DMF= 6:5:50 ( v/v/v)溶液反应2小时。反应完毕，抽滤掉DMF，用DMF（250 毫升）洗涤3次，抽干。

（2）Fmoc- Asn(Trt)-Cys(Mmt)- 树脂的制备

加入约200 mL的20%的PIP/DMF溶液，室温震荡约5分钟；再加入约200 mL的20%的PIP/DMF溶液，室温震荡约5分钟；抽干，用DMF洗涤3次，抽干，凯瑟测试(Kaiser test)为(+)，再用DCM 洗两遍，最后用DMF洗一遍。往合成管中加入200毫升的DMF。17.9 g的Fmoc-Asn(Trt)-OH（30 mmol），4.05g (30 mmol) 的HOBt，7.0 mL的DIC (45.0 mmol)和100 mL的DMF加入烧杯中，混合溶解后，转入合成管中，鼓氮气下常温震荡2.5-3小时；DMF洗涤3次，抽干。凯瑟测试分析为（-）。

（3）Fmoc- Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Mmt)- 树脂的制备

加入约200 mL的20%的PIP/DMF溶液，室温震荡约5分钟，抽干；再加入约200 mL的20%的PIP/DMF溶液，室温震荡约10分钟，抽干；分别用DMF洗涤5次、DCM 1次，DMF1次，抽干，凯瑟测试为(+)，然后加入 200毫升的DMF；

在烧杯中加入18.32g的Fmoc-Gln(Trt)-OH (30 mmol)，4.05g (30 mmol) 的HOBt，7.0 mL的DIC (45.0 mmol)和100 mL的DMF加入烧杯中，混合溶解后，转入合成管中，混合物常温震荡2.5-3小时；DMF洗涤3次，抽干，凯瑟测试分析为（-）。

（4）Fmoc- Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Mmt)- 树脂的制备

加入约300 mL的20%的PIP/DMF溶液，室温震荡约5分钟，抽干；再加入约300 mL的20%的PIP/DMF溶液，室温震荡约5分钟，抽干；分别用DMF洗涤5次、DCM 1次，DMF1次，抽干，凯瑟测试为(+)，然后加入 200毫升的DMF。

在烧杯中加入10.60 g的 Fmoc-Ile-OH (30 mmol)，4.05g (30 mmol) 的HOBt，7.0 mL的DIC (45.0 mmol)和100 mL的DMF加入烧杯中，混合溶解后，转入合成管中，混合物常温震荡2.5-3小时。DMF洗涤3次，抽干，凯瑟测试分析为（-）。

（5）Fmoc- Tyr(OMe)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Mmt)- 树脂的制备

加入约200 mL的20%的PIP/DMF溶液，室温震荡约5分钟，抽干；再加入约200 mL的20%的PIP/DMF溶液，室温震荡约10分钟，抽干；分别用DMF洗涤5次、DCM 1次，DMF1次，抽干，凯瑟测试为(+)，然后加入 200毫升的DMF。

在烧杯中加入12.52 g的 Fmoc-Tyr(OMe)-OH (30 mmol)，4.05g (30 mmol) 的HOBt，7.0 mL的DIC (45.0 mmol)和100 mL的DMF加入烧杯中，混合溶解后，转入合成管中，混合物常温震荡2.5-3小时。DMF洗涤3次，抽干，凯瑟测试分析为（-）。

（6）片段B的制备

加入约200 mL的20%的PIP/DMF溶液，室温震荡约5 分钟，抽干；再加入约200 mL的20%的PIP/DMF溶液，室温震荡约10分钟，抽干；分别用DMF洗涤5次、DCM 1次，DMF1次，抽干，凯瑟测试为(+)；加入 300毫升的DMF，然后加入4-溴代-丁酸2,5-二氧代-吡啶-1-基酯，反应结束后，抽干溶液，DMF洗5遍，DCM洗一遍。

（7）片段D和E的制备

加入约300毫升的1-5%的TFA/DMF溶液，室温震荡约3小时，脱去半胱氨酸上的Mmt保护基，DMF洗涤5次，抽干；然后加入300毫升DMF，用DIEA条件溶液的碱性在9左右，用埃尔曼(Ellman)反应检测SH反应的情况，直到反应结束。用DMF洗3遍，DCM洗2遍。再往体系中加入TFA/TIS/EDT=180ml/10ml/10ml的裂解液，室温反应约3小时，过滤，滤液缓慢加入到无水乙醚中，然后过滤收集沉淀物，减压干燥后得到的粗品6.5 g粗产品E。

（8）Fmoc-Gly-树脂的制备

称取20g Rink amide AM树脂(0.50mmol/g),置于固相反应器中，加入200 毫升的DMF溶胀约5 分钟、抽干；加入约200 毫升的20%的PIP/DMF溶液，室温震荡约10分钟，抽干；分别用DMF洗涤5次、DCM 洗涤1次，DMF1次，抽干；加入5.95g的Fmoc-Gly-OH （20 mmol）、4.05 g 的HOBt (30 mmol)、6.3 毫升的DIC (40 mmol) 和200毫升的DMF，混合物常温震荡2.5-3小时，DMF洗涤3次，抽干，凯瑟测试分析为（-）。

（9）Fmoc-Leu-Gly-树脂的制备

加入约200毫升的20%的PIP/DMF溶液，室温震荡约5 分钟，抽干；加入约200 毫升的20%的PIP/DMF溶液，室温震荡约10分钟，抽干；分别用DMF洗涤5次、DCM 洗涤1次，DMF1次，抽干；凯瑟测试为(+)。加入200毫升的DMF；加入10.06g的Fmoc-Leu-OH、(30 mmol)、6.3 毫升的DIC (40 mmol) 和50毫升的DMF，混合物常温震荡2.5-3小时，DMF洗涤3次，抽干，凯瑟测试分析为（-）。

（10）Fmoc-Pro-Leu-Gly-树脂的制备

加入约200毫升的20%的PIP/DMF溶液，室温震荡约5 分钟，抽干，分别用DMF洗涤5次、DCM 1次，DMF1次，抽干；凯瑟测试为(+)。加入

200毫升的DMF；10.1g的Fmoc-Pro-OH、6.3 毫升的DIC (40 mmol) 和50毫升的DMF混合后溶解，再转入合成管中，混合物常温震荡2.5-3小时，DMF洗涤3次，抽干，凯瑟测试分析为（-）。

（11）片段G的制备

加入约200 毫升的20%的PIP/DMF溶液，室温震荡约5min，抽干；再加入约200 毫升的20%的PIP/DMF溶液，室温震荡约10min，抽干；分别用DMF洗涤3次，DCM 1次，DMF1次，抽干；凯瑟测试为(+)。往合成管中加入DMF200毫升；往烧杯中加入4.58 g 的DEPBT (20 mmol), 50 ml DMF和3.4 ml的DIEA以及6.0克E, 然后转移到反应器中，混合物常温震荡2.5-3小时，DMF洗涤3次，抽干；

（12）片段H的制备

加入TFA/TIS/HAc=140ml/8ml/8ml的裂解液，室温反应约3小时，过滤，滤液缓慢加入到无水乙醚中，然后过滤收集沉淀物，减压干燥后得到5.8 g的卡贝缩宫素粗品。

（13）纯化

加入约10倍水溶解粗品，过滤后经制备HPLC纯化，填料为C18，流动相为0.1M(NH₂)₂SO₄:乙腈=4:1，流速为50ml/min,检测波长为280 nm，样品峰合并后，减压蒸馏溶剂、冻干得到3.3 g的成品。产物的总杂少于1.0%，单杂少于0.1%。

其中，制备条件为以下所示：柱子：Kromasil C18，10um，50*250mm 波长：214nm 流速：100mL/min 流动相： A: H₂O+0.1%TFA B：ACN+0.1TFA

梯度	A	B
			0 min	80%	20%
60 min	35%	65%
			60.1 min	5%	95%
80 min	5%	95%

以下是本发明涉及的化学品的全称及其来源：

Fmoc芴甲基氧基羰基

Wang resin王树脂

mmt4-甲氧基三苯甲基

Trt 三苯甲基

TFA CAS: 76-05-1 三氟乙酸

DCM CAS: 75-09-2 二氯甲烷

TIS CAS: 6485-79-6 三异丙基硅烷

HAc CAS: 64-19-7 乙酸

DMF CAS: 68-12-2 二甲基甲酰胺

DIC CAS: 693-13-0 N,N-二异丙基碳二亚胺

HOBt CAS: 2592-95-2 1-羟基-苯并三唑

DMAP CAS: 1122-58-3 4-(二甲基氨基)吡啶

TBTU CAS: 125700-67-6 O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸

HATU CAS: 148893-10-1 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯

HBTU CAS: 94790-37-1 苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐

PyBop CAS 128625-52-5 六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷

Cl-HOBt CAS 26198-19-6 6-氯-1-羟基苯并三氮唑

NMM CAS: 109-02-4 N-甲基吗啉

DIEA CAS: 7087-68-5 二异丙基乙胺

DIPEA CAS: 7087-68-5 二异丙基乙胺

PIP CAS: 110-89-4 哌啶

Ac₂O CAS: 108-24-7 乙酸酐

EDT CAS: 540-63-6 1,2-乙二硫醇

DEPBT CAS: 165534-43-0 3-(二乙氧基磷酰氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4-酮

Fmoc-Cys(Mmt)-OH CAS：177582-21-7 N-芴甲氧羰基-S-(4-甲氧基三苯甲基)-L-半胱氨酸

Fmoc-Asn(Trt)-OH CAS：132388-59-1 N-芴甲氧羰基-三苯甲基-L-天冬酰胺

Fmoc-Gly-OH CAS：29022-11-5 N-芴甲氧羰基-甘氨酸

Fmoc-Tyr(OMe)-OH CAS：77128-72-4 O-甲基-N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N-L-酪氨酸

Fmoc-Pro-OH CAS：71989-31-6 N-芴甲氧羰基-L-脯氨酸

Fmoc-Ile-OH CAS：71989-23-6 N-芴甲氧羰基-L-异亮氨酸

Fmoc-Cys(Trt)-OH CAS：103213-32-7 N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸

另外，有关凯瑟测试的文献：E. Kaiser, R. L. Colescott, C. D. Bossinger, P. I. Cook, Analytical Biochemistry 34 595 (1970).

有关埃尔曼反应的检测文献：Ellman GL (1959). "Tissue sulfhydryl groups". Arch. Biochem. Biophys. 82 (1): 70–7.

Wang resin 王树脂供应商：天津南开合成科技有限公司

Rink amide AM树脂供应商：天津南开合成科技有限公司。

Claims

1.一种卡贝缩宫素的制备方法，其特征主要包括以下步骤：

（1）以0.5-1.1mmol/g王树脂为载体、Fmoc保护的氨基酸为单体，依次连接Fmoc氨基酸，以Fmoc-Tyr(OMe)-OH为终止氨基酸，得到Fmoc-Tyr(OMe)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Mmt)-树脂片段A；

（4）E与F偶联得到G，G经裂解得到卡贝缩宫素粗品H；

（5）将粗品溶于水，经过滤后通过制备HPLC进行分离纯化，得到卡贝缩宫素纯品；

其中，化学物质A至H的化学结构如下所示：

。

2.根据权利要求1所述的方法，以Fmoc保护的氨基酸为单体，依次与王树脂相连得到如式A的多肽树脂；采用偶联至多肽树脂上的缩合剂为下述缩合剂的一种或多种组合：DIC、HATU、TBTU、HBTU、PyBop、HOBt、Cl-HOBt、DIPEA、NMM、DIEA。

3.根据权利要求1 所述的方法，Cys 的侧链保护基为Mmt。

4.根据权利要求1 所述的方法，脱除Mmt保护基试剂为1%-5%TFA的DCM溶液。

5.根据权利要求1 所述的方法；H-Tyr(OMe)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Mmt)-树脂与溴代丁酸琥珀酰亚胺酯在选自由有机溶剂DCM，NMP和DMF组成的组中的至少一种溶剂中反应得到片段B。

6.根据权利要求1 所述的方法，环化反应在树脂上进行，所用的试剂为：二异丙基乙基胺，三乙胺，LiOH等。

7.根据权利要求1 所述的方法，采用E偶联至F肽树脂上的缩合剂为下述一种或多种组合：DIC、HATU、TBTU、HBTU、PyBop、HOBt、Cl-HOBt、DIPEA、NMM、DEPBT、DIEA。

8.根据权利要求1 所述的方法，以TFA/TIS/EDT为切肽试剂，其比例为90.0:5.0:5.0，最后在乙醚中沉淀得到卡贝缩宫素的粗品H。

9.根据权利要求1 所述的方法，以C18柱为填料柱，通过制备HPLC进行分离纯化，流动相为硫酸铵的水溶液和乙腈的混合液，检测波长为280mm。