CN102286076A - 比伐卢定的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于多肽药物制备方法技术领域，特别涉及比伐卢定的制备方法。本发明比伐卢定的制备方法，包括固相多肽合成法制备比伐卢定树脂、比伐卢定树脂酸解得到比伐卢定粗品、比伐卢定粗品纯化得到比伐卢定纯品，其中固相多肽合成法制备比伐卢定树脂的方法为：在Fmoc-Leu-载体树脂上通过固相偶联合成法依次接入下列序列中相对应的Fmoc-保护氨基酸，得到比伐卢定树脂：R1-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-X-Asn(R2)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-树脂接入X片段时仅用1次固相偶联合成反应，对应的Fmoc-保护氨基酸为Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH。本发明产品纯度大于99.5％，单一杂质小于0.2％。

Description

比伐卢定的制备方法
技术领域
本发明属于多肽药物制备方法技术领域，特别涉及比伐卢定的制备方法。
背景技术
比伐卢定(Bivalirudin)属于直接凝血酶抑制剂(direct thrombin inhibitor，DTI)，由20个氨基酸残基组成。直接凝血酶抑制剂(DTI)是一组不需要辅助因子参与而直接抑制凝血酶活性的多肽，它不仅有抗凝血功能，还能抑制血小板的聚集。与其他抗凝药相比，其药理作用及药动学特点更优越，尤其在心血管疾病中有良好的用途。
比伐卢定为水蛭素衍生物(片段)，人工合成的包含20个氨基酸残基的多肽。它主要由两部分构成，一部分是氨基末端(N端)的短肽链，含有苯丙氨酸-脯氨酸-精氨酸-脯氨酸序列，能与凝血酶的活性部位发生特异性结合，另一部分是含羧基末端(C端)的12肽链，两部分靠四甘氨酸连接，它们与凝血酶的两个结合部位都有很高的亲和力。比伐卢定与凝血酶的结合是可逆的，结合后很容易在凝血酶的活性部位断开成两部分并分解出多肽链中的脯氨酸-精氨酸序列，使凝血酶的催化活性很快恢复，所以它的半衰期只有20～25min。半衰期短使它比水蛭素更安全。比伐卢定主要经肽酶降解后清除，少部分以原型经肾排泄，所以在肾功能不全时使用安全。
比伐卢定具有以下的结构：
D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-
Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH
有关比伐卢定的制备方法，国内外有大量的报道，世界专利WO98/50563，报道了一系列多肽的基因工程制备方法，其中包括比伐卢定。
中国专利200910028793报道了液相合成方法，首先逐步合成三个全保护的片段：N-端全保护的6肽、中段全保护的6肽、C-端全保护的8肽，然后将这三个片段依次缩合得到全保护的比伐卢定，最后脱除所有保护基团得到比伐卢定粗品，再经过高效液相色谱纯化，得到比伐卢定纯品。
Okayama et al.(1996，Chem.Pharm.Bull.44：1344-1350)和Steinmetzer et al.(1999，Eur.J.Biochem.265：598-605)报道了比伐卢定的Fmoc固相合成法，采用王树脂为开始的载体树脂，依次接入保护氨基酸，所得肽树脂采用三氟醋酸(TFA)酸解。
世界专利WO91/02750报道了比伐卢定的Boc固相合成法，采用Boc-Leu-Mrrifiled树脂为开始的载体树脂，依次接入保护氨基酸，所得肽树脂采用氟化氢(TFA)酸解。
US20070093423、US20100029916、US20100273982报道了一种高纯度比伐卢定制备方法，采用的方法为固相片段缩合，所得比伐卢定的纯度大于98.5％，总杂质小于1.5％，每个杂质小于1.0％，[Asp9-比伐卢定]小于0.5％。
US20100056755报道了一种商业化比伐卢定制备方法，采用的方法为固相片段缩合；US2008005155报道了一种制备比伐卢定的方法，采用的开始树脂为Trityl-Cl树脂，4-Methyltrityl-Cl树脂，4-Methoxytrityl-Cl树脂，或2-Cl Trity-Cl树脂，Fmoc-Leu-Wang树脂，用TFA酸解，C18液相色谱纯化；US 20090062511、US20100292436报道了一种改进的比伐卢定制备方法，与上述专利类似，为制备方法优化专利。
比伐卢定结构中含有一个Gly-Gly-Gly-Gly片段，在固相法依次接入Fmoc-Gly过程中，由于Gly自身的特性，使产品中产生以下杂质：[+1Gly]-比伐卢定，[+2Gly]-比伐卢定，[-1Gly]-比伐卢定，[-2Gly]-比伐卢定，而这些杂质与比伐卢定自身的极性相近，所以在纯化的时候很难完全纯化掉，产品总收率无法得到有效提高，产品纯度降低，影响用药的安全性。
以上专利均无法解决比伐卢定结构Gly增加和减少问题，为了解决上述问题，以色利NOVETIDE公司WO2010117725专利，在接肽过程中使用Fmoc-Gly-Gly-OH为原料接入Gly-Gly-Gly-Gly片段，但仅仅解决了[+1Gly]-比伐卢定和[-1Gly]-比伐卢定杂质的产生，而无法解决[+2Gly]-比伐卢定和[-2Gly]-比伐卢定的产生。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供比伐卢定的制备方法，该制备方法使用了保护氨基酸片段Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH，避免了[+1Gly]-比伐卢定、[-1Gly]-比伐卢定、[+2Gly]-比伐卢定、[-2Gly]-比伐卢定杂质的产生，提高了产品收率和纯度，反应效率高、有利于实现规模化的固相合成工艺。
本发明比伐卢定的制备方法，包括固相多肽合成法制备比伐卢定树脂、比伐卢定树脂酸解得到比伐卢定粗品、比伐卢定粗品纯化得到比伐卢定纯品，其中固相多肽合成法制备比伐卢定树脂的方法为：在Fmoc-Leu-载体树脂上通过固相偶联合成法依次接入下列序列中相对应的Fmoc-保护氨基酸，得到比伐卢定树脂：
R1-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-X-Asn(R2)-Gly-Asp(OtBu)-
Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-
Tyr(tBu)-Leu-树脂
其中，X为Gly-Gly-Gly-Gly，R1为R3或H，R2为Trt或H，R3为Fmoc或Boc。
接入X片段时仅用1次固相偶联合成反应，接入X时对应的Fmoc-保护氨基酸为Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH。
所述Fmoc-保护氨基酸种类分别为：R3-D-Phe-OH、Fmoc-X-OH、Fmoc-Asn(R2)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH。
其中，X为Gly-Gly-Gly-Gly，R2为Trt或H，R3为Fmoc或Boc。
Fmoc为9-芴甲氧羰基，tBu为叔丁基、Trt为三苯基甲烷、OtBu为叔丁氧基、Boc为叔丁氧羰酰基。
各个Fmoc-保护氨基酸用量为所投料树脂总摩尔数的1.2～6倍，优选3倍。
其中Fmoc-Gly-OH是应用于接入第11个Gly氨基酸的时侯，第13-17个Gly氨基酸接入时使用的是Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH。
Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH，结构为：
Figure BDA0000070579280000031
固相偶联合成法具体为：前一步反应得到的保护氨基酸-树脂脱去保护Fmoc后再与下一个保护氨基酸偶联反应。脱去Fmoc保护的试剂为10～30％(V/V)哌啶(PIP)/N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，优选的为20％。使用的去保护试剂用量为每克投料树脂5～15ml，优选为每克投料树脂10ml。去保护反应时间为10～60分钟，优选为15～25分钟。
偶联时需添加缩合试剂和活化试剂，缩合试剂选自N，N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)或O-苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)；优选的为N，N-二异丙基碳二亚胺。
缩合试剂的摩尔用量为氨基树脂中氨基总摩尔数的1.2～6倍，优选为2.5～3.5倍。
活化试剂选自1-羟基苯并三唑(HOBt)、N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(HOAt)，优选的为1-羟基苯并三唑。
活化试剂用量为氨基树脂中氨基总摩尔数的1.2～6倍，优选的为2.5～3.5倍。
偶联反应时间为60～300分钟，优选的为100～140分钟。
优选的，所述Fmoc-Leu-载体树脂的取代值为0.5～1.5mmol/g，优选的取代值为0.8～1.2mmol/g树脂时产率较高。
所述载体树脂为Trityl-Cl类型树脂或羟基类型树脂，其中Trityl-Cl类型树脂优选为Trityl-Cl树脂、4-Methyltrityl-Cl树脂、4-Methoxytrityl-Cl树脂或2-Cl Trity-Cl树脂；羟基类型树脂优选为Wang树脂或对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯(HMP)树脂。
当载体树脂为三苯甲基氯树脂时，Fmoc-Leu-OH与载体树脂的偶联方法为：Fmoc-Leu-OH的羧基与树脂中的Cl-代烷在碱作用下发生酯化反应而接入保护氨基酸。
所述的碱选自N.N-二异丙基乙基胺(DIEA)、三乙胺(TEA)、吡啶中的至少一种，优选为DIEA。碱的摩尔用量为保护氨基酸摩尔数的1.5～3倍。
酯化反应时间为1～6小时，优选为3小时。
当载体树脂为羟基类型树脂时，Fmoc-Leu-OH与载体树脂的偶联方法为：Fmoc-Leu-OH的羧基与树脂中的羟基在偶联剂、活化剂和碱催化剂的作用下发生酯化反应而接入保护氨基酸。
偶联剂选自N，N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、O-苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)中的至少一种，优选为DIC。偶联剂用量为所投料树脂总摩尔数的1.2～6倍，优选为3倍。
碱催化剂为4-N，N-二甲基吡啶(DMAP)，用量为为所投料树脂总摩尔数的0.1倍。
活化剂选自1-羟基苯并三唑(HOBt)、N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(HOAt)中的至少一种，优选为HOBt。活化剂用量为所投料树脂总摩尔数的1.2～6倍，优选的为3倍。
酯化反应时间为12～36小时，优选为18小时。
进一步的，比伐卢定树脂经酸解同时脱去树脂及侧链保护基得到比伐卢定粗品：
D-Phe-Pro-Arg-Pro-X-Asn-Gly-Asp-Phe-
Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH
其中，X为Gly-Gly-Gly-Gly
酸解剂为三氟醋酸(TFA)、1，2-乙二硫醇(EDT)和水混合溶剂，混合溶剂的配比为：TFA的比列为80-95％(V/V)，EDT的比例为1～10％(V/V)，余量为水。优选的配比为89-91％、EDT 4-6％、余量为水。最优的，配比为90％、EDT 5％、余量为水。
酸解剂用量为每克比伐卢定树脂需要4～15ml酸解剂，优选的，每克比伐卢定树脂需要9～11ml酸解剂。
使用酸解剂裂解的时间为室温条件下1～5小时，优选的为2小时。
进一步的，比伐卢定粗品经高效液相色谱纯化、冻干得到比伐卢定纯品。纯化方法具体为：
称取比伐卢定粗品粉末，加入至水中(约20ml水/g粗品)，搅拌下滴加稀氨水调pH＝4.5～5.5，溶液用0.45μm混合微孔滤膜过滤，备用。
高效液相色谱法进行纯化时色谱填料为10μm的反相C18，流动相为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90ml/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化。取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得比伐卢定纯化中间体浓缩液。
取比伐卢定纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用。采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为0.1％TFA/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90ml/min(可根据不同规格的色谱柱，调整相应的流速)。采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，在小于40℃水浴条件下减压浓缩，用旋转蒸发仪蒸去大部分乙腈，得到比伐卢定三氟醋酸盐水溶液，冷冻干燥得产品。
本发明方法直接使用保护氨基酸片段Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH制备比伐卢定，产品纯度大于99.5％，单一杂质小于0.2％。与已有技术相比，本发明工艺具有反应操作简单、反应条件温等特点，具有广泛的实用价值和应用前景。
具体实施方式
通过下述实施例将有助于理解本发明，但不能限制本发明的内容：
实施例1Fmoc-Leu-Wang树脂的制备
取wang树脂500g(取代值为1.0mmol/g)，用5L N，N-二甲基酰胺(DMF)溶涨30分钟，加入Fmoc-Leu-OH 353g(1.0mol)，搅拌30分钟后加入155ml DIC(1.0mol)、135gHOBt(1.0mol)、6.1g(0.05mol)DMAP，室温搅拌反应18小时，过滤后树脂分别用DMF、二氯甲烷(DCM)、甲醇洗涤3次，减压干燥，得Fmoc-Leu-Waug树脂651g，酯化收率95.6％。
实施例2Fmoc-Leu-Wang树脂脱Fmoc保护得到H-Leu-Wang树脂
取上述Fmoc-Leu-Wang树脂，用5L 20％哌啶(PIP)/NN-二甲基酰胺(DMF)溶液溶涨10分钟，过滤后再加入5L 20％PIP/DMF溶液，室温搅拌反应25分钟，过滤后树脂分别用DMF、DCM、甲醇洗涤3次，减压干燥即得H-Leu-Wang树脂的制备。
实施例3Fmoc-Leu-2-Cl-Trt树脂的制备
取2-Cl-Trt-Cl树脂500g(取代值为1.0mmol/g)，用5LN，N-二甲基酰胺(DMF)溶涨30分钟，加入Fmoc-Leu-OH 353g(1.0mol)，搅拌30分钟后加入260ml DIEA(1.5mol)，室温搅拌反应3小时，过滤后树脂分别用DMF、DCM、甲醇洗涤3次，减压干燥，得Fmoc-Leu-2-Cl-Trt树脂655g，酯化收率98.1％。
实施例4Fmoc-Leu-2-Cl-Trt树脂脱Fmoc保护得到H-Leu-2-Cl-Trt树脂
取上述Fmoc-Leu-2-Cl-Trt树脂，用5L 20％PIP/DMF溶液溶涨10分钟，过滤后再加入5L 20％PIP/DMF溶液，室温搅拌反应25分钟，过滤后树脂分别用DMF、DCM、甲醇洗涤3次，减压干燥即得H-Leu-2-Cl-Trt树脂的制备。
实施例5Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH的合成
取3.0mol Fmoc-Gly和3.0mol HOBt，用适量DMF溶解；另取3.0mol DIC，搅拌下慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的保护氨基酸溶液。
取Fmoc-Gly-2-Cl-Trt-树脂1Kg(取代值为1.0mmol/g)，采用5L 20％PIP/DMF溶液去Fmoc保护25分钟，过滤后树脂分别用MDF、DCM洗涤3次，加入上述保护氨基酸溶液，室温搅拌反应3小时，反应完成后，过滤后树脂分别用MDF、DCM洗涤3次。
重复上述两步反应，接入另外3个Gly，制得Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-2-Cl-Trt-树脂。
取Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-2-Cl-Trt-树脂，加入20L 30％六氟异丙醇/DCM溶液，搅拌反应2小时，过滤收集滤液，减压蒸干溶剂，减压干燥，得Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH457g，收率为97.2％，纯度为98.3％，MS m/z：469(M+1)
实施例6比伐卢定树脂的合成
比伐卢定树脂为：
H-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-X-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-
Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-
Tyr(tBu)-Leu-树脂
其中，X为Gly-Gly-Gly-Gly。
取Fmoc-Leu-Wang树脂，依次与表1所示的保护氨基酸偶联，制得比伐卢定树脂。本实施例使用的保护氨基酸从树脂起算第2至第17个氨基酸相对应的保护氨基酸如下所示：
表1
  接肽顺序n＝   保护氨基酸   分子量
  2   Fmoc-Tyr(tBu)-OH   460
  3   Fmoc-Glu(OtBu)-OH   426
  4   Fmoc-Glu(OtBu)-OH   426
  5   Fmoc-Pro-OH   337
  6   Fmoc-Ile-OH   353
  7   Fmoc-Glu(OtBu)-OH   426
  8   Fmoc-Glu(OtBu)-OH   426
  9   Fmoc-Phe-OH   387
  10   Fmoc-Asp(OtBu)-OH   412
  11   Fmoc-Gly-OH   297
  12   Fmoc-Asn(Trt)-OH   597
  13   Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH   468
  14   Fmoc-Pro-OH   337
  15   Fmoc-Arg(pbf)-OH   648
  16   Fmoc-Pro-OH   337
  17   Fmoc-D-Phe-OH   387
其中第13个为实施例5制得的Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH。
保护氨基酸的活化方法为：
取1.5mol保护氨基酸和1.5mol HOBt，用适量DMF溶解；另取1.5mol DIC，搅拌下慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的保护氨基酸溶液。
取Fmoc-Leu-Wang树脂(取代值为1.0mmol/g)0.5Kg，采用5L 20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，过滤得到去Fmoc的树脂备用。
去Fmoc的树脂加入活化后的第2个保护氨基酸溶液，偶联反应60～300分钟，过滤洗涤得2肽树脂。2肽树脂用5L20％PIP/DMF溶液去Fmoc保护25分钟，过滤洗涤后，与第3个活化后的保护氨基酸溶液偶联反应60～300分钟，过滤洗涤后得3肽树脂。
采用上述同样方法，依次接入第4至第17个氨基酸对应的Fmoc-保护氨基酸，即前一步得到的Fmoc-[1～(n-1)个]氨基酸-Wang树脂，脱Fmoc保护后与活化的Fmoc-保护氨基酸(第n个)偶联反应60～300分钟，n＝2～17。接完所有保护氨基酸后，再用5L 20％PIP/DMF溶液去Fmoc保护25分钟，过滤洗涤后，即得比伐卢定树脂。
实施例7比伐卢定树脂的酸解
取实施例6制得的比伐卢定树脂，加入裂解试剂[TFA/水/EDT＝95∶5∶5(V/V)(10ml/克树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得白色粉末即为比伐卢定粗品。
实施例8比伐卢定粗品的纯化
称取比伐卢定粗品粉末，将粗品加入至纯化水中(约20ml水/g粗品)，搅拌下滴加稀氨水调pH，将pH控制在～5.0，溶液用0.45μm混合微孔滤膜过滤，备纯化用。
采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90ml/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得比伐卢定纯化中间体浓缩液。
取比伐卢定纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用。采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为0.1％TFA/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90ml/min(可根据不同规格的色谱柱，调整相应的流速)。采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，在小于40℃水浴条件下减压浓缩，用旋转蒸发仪蒸去大部分乙腈，得到比伐卢定三氟醋酸水溶液，冷冻干燥，得产品608g，总收率为55.8％。
分子量：2181.2(100％M+H)；比旋度：-116.5°；
水分2.1％；三氟醋酸：9.5％；纯度：99.8％。

Claims (10)

1.比伐卢定的制备方法，包括固相多肽合成法制备比伐卢定树脂、比伐卢定树脂酸解得到比伐卢定粗品、比伐卢定粗品纯化得到比伐卢定纯品，其中固相多肽合成法制备比伐卢定树脂的方法为：在Fmoc-Leu-载体树脂上通过固相偶联合成法依次接入下列序列中相对应的Fmoc-保护氨基酸，得到比伐卢定树脂：
R1-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-X-Asn(R2)-Gly-Asp(OtBu)-
Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-
Tyr(tBu)-Leu-树脂
其中，X为Gly-Gly-Gly-Gly，R1为R3或H，R2为Trt或H，R3为Fmoc或Boc；接入X片段时仅用1次固相偶联合成反应。
2.根据权利要求1所述的比伐卢定的制备方法，其特征在于：所述载体树脂的取代值为0.5～1.5mmol/g，优选的为0.8～1.2mmol/g。
3.根据权利要求1所述的比伐卢定的制备方法，其特征在于：所述载体树脂为Trityl-Cl类型树脂或羟基类型树脂。
4.根据权利要求3所述的比伐卢定的制备方法，其特征在于：Trityl-Cl类型树脂为Trityl-Cl树脂、4-Methyltrityl-Cl树脂、4-Methoxytrityl-Cl树脂或2-Cl Trity-Cl树脂；羟基类型树脂为Wang树脂或对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯树脂。
5.根据权利要求3或4所述的比伐卢定的制备方法，其特征在于：当载体树脂为三苯甲基氯树脂时，Fmoc-Leu-OH与载体树脂的偶联方法为：Fmoc-Leu-OH的羧基与树脂中的Cl-代烷在碱作用下发生酯化反应而接入保护氨基酸。
6.根据权利要求5所述的比伐卢定的制备方法，其特征在于：所述的碱选自N.N-二异丙基乙基胺、三乙胺、吡啶中的至少一种。
7.根据权利要求3或4所述的比伐卢定的制备方法，其特征在于：当载体树脂为羟基类型树脂时，Fmoc-Leu-OH与载体树脂的偶联方法为：Fmoc-Leu-OH的羧基与树脂中的羟基在偶联剂、活化剂和碱催化剂的作用下发生酯化反应而接入保护氨基酸。
8.根据权利要求7所述的比伐卢定的制备方法，其特征在于：偶联剂选自N，N-二异丙基碳二亚胺、N，N-二环己基碳二亚胺、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐、O-苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸酯中的至少一种；
碱催化剂为4-N，N-二甲基吡啶；
活化剂选自1-羟基苯并三唑、N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑中的至少一种。
9.根据权利要求1～8任一项所述的比伐卢定的制备方法，其特征在于：所述Fmoc-保护氨基酸种类分别为：R3-D-Phe-OH、Fmoc-X-OH、Fmoc-Asn(R2)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH，其中，X为Gly-Gly-Gly-Gly，R2为Trt或H，R3为Fmoc或Boc。
10.根据权利要求1～8任一项所述的比伐卢定的制备方法，其特征在于：比伐卢定树脂经酸解同时脱去树脂及侧链保护基得到比伐卢定粗品：
D-Phe-Pro-Arg-Pro-Y-Asn-Gly-Asp-Phe-
Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH
其中，Y为Gly-Gly-Gly-Gly；
酸解试剂为三氟醋酸、1，2-乙二硫醇和水的混合溶剂，其用量为每克树脂4～15ml；酸解试剂混合溶剂的配比为：TFA的体积比为80～95％，EDT的体积比为1～10％，余量为水。
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