CN103864895A - 制备比伐卢定的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于通过汇聚五个片段的合成方法制备具有下式的20-mer肽的比伐卢定的方法，以及涉及一些它的肽中间体。H-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp-Phe--Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OH(I)。

Description

制备比伐卢定的方法
本申请是申请日为2009年12月17日、中国专利申请号为200980152943.3(国际申请号为PCT/EP2009/009080)、发明名称为“制备比伐卢定的方法”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及新颖的比伐卢定的汇聚合成方法，比伐卢定是具有下式的20-mer肽
H-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp-Phe-Glu--Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OH   (I)
本发明还涉及一些作为比伐卢定合成中的中间体的受保护的肽。
背景技术
由凝血酶介导的蛋白酶解处理是控制血液凝固的关键。水蛭素是潜在的临床凝血酶肽抑制剂，其是由65个氨基酸组成。但是也有更短的肽片段已被证明对血栓形成(危及生命的病征)是有效的。
US5，196,404公开了比伐卢定，其是这些更短的多肽中的一种，并且是强效的凝血酶抑制剂。比伐卢定也被称为水蛭肽-8(hirulog-8)、BG-8967、Efludan、
Figure BDA0000471833680000011
或者并具有在式I中给出的氨基酸序列。
WO98/50563描述了用于通过重组技术制备包括比伐卢定的各种肽的方法。所述方法包括表达作为融合蛋白一部分的肽，然后通过酰基受体使所述肽从所述融合蛋白释放。
Okayama等.Chem.Pharm.Bull.1996，44，1344-1350，和Steinmetzer等.Eur..J.Biochem.1999，265，598-605设计了在王氏树脂上采用固相合成各种水蛭肽。所述王氏树脂需要采用浓的三氟乙酸将所述肽从所述树脂上裂解下来。在用于制备比伐卢定的类似的固相合成方法中，WO9I/02750公开了以下的连续方法：将单个Boc-保护的氨基酸连接至Boc-L-亮氨酸-o-二乙烯苯树脂，然后通过采用HF/对甲酚/乙基甲基硫酸盐同时脱保护和脱除，并且随后是冷冻干燥和纯化。在两种情况下，从所述树脂上裂解所述肽需要强酸条件，而强酸条件可能会引起全部的脱保护并且可能导致不希望的氨基酸残基的副反应，因此负面影响了产品的纯度。此外，在固相合成中通常由氨基酸的错误掺入、单个氨基酸的重复连接(double-hits)和/或外消旋化作用引起副反应，并产生具有与所述目标肽的结构非常相似的结构的副产物。因此纯化方法变得艰巨并导致产率降低。尤其是更长的多肽在仍与固体载体连接时易于采取不规则的构象，这使其更难于连接其它的氨基酸至所述增长的链。因此，该问题随着所述肽的长度增加而变得更为严重。
WO2007/033383公开了基于固相合成或固相合成和溶液法合成的组合(混合方法)的用于制备比伐卢定的方法。在一实施方式中，在超酸不稳定的树脂上制备比伐卢定肽序列。在另一实施方式中，通过使侧链保护的N-末端肽片段与侧链保护的C-末端肽片段偶联来制备比伐卢定，并且随后采用强酸条件脱保护。在这种情况下，所述N-末端片段和所述C-末端片段的前体(即肽序列减去亮氨酸)均由固相合成制备。该策略的一个缺点是大量形成D-Tyr19--比伐卢定。该杂质难以去除，因此需要额外的劳动、成本以及损失产量来获得纯化的产物。另外，在WO2007/033383的实施例中得到的纯化的比伐卢定的量仅在克的范围内，这表明该方法不适于大规模制备具有良好的纯度的比伐卢定。
发明内容
本发明的目的是提供用于工业规模化生产的、可克服线性、固相合成的公知的缺点并且更有效合成比伐卢定的方法。已通过根据权利要求1所述的方法、权利要求19所述的肽片段和权利要求29所述的这些肽片段的用途实现该目的。优选的实施方式组成了从属权利要求2-18和20-28的主题。
本发明涉及遵循汇聚方法(即分别合成各片段然后在溶液相中偶联以构成目标肽)的方法。汇聚合成的急待解决的问题是找到合适的片段以及它们的偶联顺序以克服汇聚合成的公知的缺点。这些缺点是在偶联和分离期间的溶解度问题、与固相合成相比更低的反应率以及在偶联期间所述C-末端片段的更高的外消旋化风险。比伐卢定由20个氨基酸残基组成，以致于存在大量的可能的片段和偶联顺序。此外，比伐卢定包含有7个氨基酸残基，即-Arg3-、-Asn9-、-Asp11-、-Glu13-、-Glu14-、-Glu17-和-Glu18-，所有这些氨基酸残基都具有需要适当的保护和脱保护的反应性侧链官能团。所述相同的问题适用于单个片段的N-末端和C-末端的适当的保护和脱保护，因此增加了寻找可实现本发明的目的的路线艰巨性。
申请人意外的发现通过采用如下文中所描述的[(1+2)+(3+{4+5})]策略可方便地构建式I的比伐卢定。数字1、2和5代表式V、VI和X的三个肽片段，数字3代表式XIII的天冬氨酸衍生物以及数字4代表式XI的苯丙氨酸衍生物。本发明涉及用于在溶液相中制备式I的比伐卢定的方法，其包括以下步骤：
(a)使其中P1为保护基团的式(V)的可选地侧链保护的肽
P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH(SEQ ID NO4)   (V)，
与其中P2为保护基团的式(VI)的可选地侧链保护的肽
H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2(SEQ ID NO5)   (VI)
反应，以制备其中P1和P2为如上定义的式(VII)的可选地侧链保护的肽
P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2
(SEQ ID NO2)                                 (VII)，
(b)除去在步骤(a)中制备的肽的P2，以制备其中P1为如上定义的式(II)的可选地侧链保护的肽
P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH(SEQ ID NO2)                                 (II)，
(c)使其中P3为保护基团的式(X)的侧链保护的肽
H-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO8)
                                             (X)，
与其中P4为保护基团的式(XI)的苯丙氨酸
p4-Phe12-OH                                   (XI)
反应，以制备其中P3和P4为如上定义的式(XII)的侧链保护的肽
P4-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ IDNO9)                                         (XII)，
(d)除去在步骤(c)中制备的肽的P4，以制备相应的式(XII)的N-末端脱保护的侧链保护的肽，
(e)使在步骤(d)中制备的式XII的肽与其中P5为保护基团的式(XIII)的侧链保护的天冬氨酸反应
P5-Asp11-OH                                    (XIII)，
以制备其中P3和P5为如上定义的式(XIV)的侧链保护的肽
P5-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO3)                                 (XIV)，
(f)除去在步骤(e)中制备的肽的P5，以制备其中P3为如上定义的式(III)的侧链保护的肽
H-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO3)                                 (III)，
(g)使在步骤(b)中制备的式II的可选地侧链保护的肽与在步骤(f)中制备的式(III)的侧链保护的肽反应，以制备其中P1和P3为如上定义的式(IV)的侧链保护的肽
P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO1)
                                            (IV)，
(h)除去在步骤(g)中制备的肽的P1、P3和侧链保护基团，以制备式(I)的比伐卢定。
本发明的方法可以通过汇聚片段合成而非常高效地合成比伐卢定，这可容易地适用于工业规模化生产。
所述C-末端保护基团P2(针对肽VI)和P3(针对肽X)可以是与其它保护基团的正交性相一致的任意保护基团。适当的实施例是可通过皂化作用而除去的C-末端保护基团像甲基(Me)或乙基(Et)，或者可通过催化氢化反应而除去的C-末端保护基团。
在本发明的方法的实施方式中，在步骤(a)中，保护基团P1是对催化氢化反应稳定的保护基团，而保护基团P2是可通过催化氢化反应除去并且与可选地侧链保护基团正交的保护基团；在步骤(c)中，保护基团P3是可通过催化氢化反应除去的保护基团，而保护基团P4是与式X的肽的侧链保护基团正交的且与P3正交的保护基团；以及在步骤(e)中，保护基团P5是与式XII和式XIII的肽/氨基酸的侧链保护基团正交的保护基团或者与P3正交的保护基团，提供包括以下步骤的溶液相方法
(a)使其中P1为对催化氢化反应稳定的保护基团的式(V)的可选地侧链保护的肽
P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH(SEQ ID NO4)   (V)，
与式(VI)的可选地侧链保护的肽反应
H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2(SEQ ID NO5)   (VI)，
其中P2为可通过催化氢化反应而除去的并且与可选的侧链保护基团正交的保护基团，
以制备其中P1和P2为如上所述的式(VII)的可选地侧链保护的肽
P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2(SEQ ID NO2)                                 (VII)，
(b)除去步骤(a)中制备的肽的P2，以制备其中P1为如上定义的式(II)的可选地侧链保护的肽
P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH(SEQ ID NO2)                                 (II)，
(c)使其中P3为可通过催化氢化反应除去的保护基团的式(X)的侧链保护的肽
H-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO8)
                                          (X)，
与其中P4为与式X的肽的侧链保护基团正交的以及与P3正交的保护基团的式(XI)的苯丙氨酸
P4-Phe12-OH                                    (XI)
反应，以制备其中P3和P4为如上定义的式(XII)的侧链保护的肽
P4-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ IDNO9)                                         (XII)，
(d)除去步骤(c)中制备的肽的P4，以制备相应的N-末端脱保护的式(XII)的侧链保护的肽，
(e)使步骤(d)中制备的式XII的肽与式(XIII)的侧链保护的天冬氨酸反应
P5-Aspl1-OH                                    (XIII)，
其中P5为与式XII和式XIII的肽/氨基酸的侧链保护基团正交的以及与P3正交的保护基团，以制备其中P3和P5为如上定义的式(XIV)的侧链保护的肽
P5-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO3)                              (XIV)，
(f)除去步骤(e)中制备的肽的P5，以制备其中P3为如上定义的式(III)的侧链保护的肽
H-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO3)                                 (III)，
(g)使步骤(b)中制备的式II的可选地侧链保护的肽与步骤(f)中制备的式(III)的侧链保护的肽反应，以制备其中P1和P3为如上定义的式(IV)的侧链保护的肽
P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp-Phe--Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO1)
                                            (IV)，
(h)除去步骤(g)中制备的肽的P1、P3和侧链保护基团，以制
备式(I)的比伐卢定
H-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OH(SEQ ID NO1)。
在这里以及下文中，术语“正交”作为两个不同的保护基团的行为的描述特征，应被理解为是指一个保护基团可通过不会影响另一保护基团的某种方法裂解。例如，“与侧链保护基团正交的保护基团”是指可通过不会影响所述侧链保护基团的某种方法裂解的保护基团。
该策略的优点是其可在工业规模上应用，因此可制备具有优异纯度的比伐卢定且每批的制备得到的比伐卢定的数量为千克级，并且不会形成像D-Phe12-比伐卢定、D-Tyr19-比伐卢定或者Asp9-比伐卢定的不需要的杂质。例如，当使保护的片段Asp-Phe12与式X的保护的肽片段偶联时，可形成5％D-Phe12-比伐卢定，而该形成可意外地通过本发明的方法而抑制。如在本发明的方法中所应用的催化氢化反应具有的优点是：不像其它脱保护方法，该催化氢化反应是非常干净的反应方法，其不会诱导碳正离子的形成，因此不会形成不需要的从所述碳正离子和目标肽之间的反应产生的副产物。为了比较，在WO2007/033383中公开的路线中是通过采用叔丁基(tBu；如叔丁基醚或如叔丁基酯)实现保护，这是仅可通过酸水解(例如采用盐酸或三氟乙酸)而裂解的保护基团。所述酸水解诱导副产物(例如叔丁酯化的酪氨酸)的形成，由于所述副产物与最终产物的物理化学性质相似，在最终产物中难以除去所述副产物。酸水解的另一个缺点是处理大量的强酸(例如三氟乙酸)，会引发生产和环境的安全问题，尤其是在工业规模上的生产和环境的安全问题。
为了进一步比较，如果可通过皂化反应除去的C-末端保护基团(例如Et)被用作为用于式VI和式VII的肽的P2，其在碱性条件下的去除会诱导天冬酰胺残基(-Asn9-)和精氨酸残基(-Arg3-)大量裂解。即使皂化反应不是采用酸或采用碱来完成的，而是采用更温和的酶促反应的方法(例如采用枯草杆菌蛋白酶进行皂化反应)来完成，也可观察到由所述天冬酰胺残基的裂解而引起Asp9-比伐卢定的大量形成。
在本发明的各单个反应步骤之前、期间和之后，所有的肽片段以及所有的偶联产物可以本身的形式或以适当的盐形式存在，这取决于所述分子的物理化学性质和/或反应条件。合适的盐为例如与三乙胺(TEA)、二环己胺(DCHA)、盐酸(HCl)和三氟乙酸(TFA)形成的盐。
在步骤(h)中，P1、P3和侧链保护基团可在以后或者同时被除去。
优选地，在步骤(h)中，首先同时除去P3和侧链保护基团，然后除去P1。
通常，在进行下一步骤之前会将步骤(a)至(g)中的每一个步骤之后得到的肽片段进行分离。申请人意外的发现在步骤(h)中，在同时除去P3和侧链保护基团后得到的肽的分离在除去P1之前可以被免除，而得到相似的收率并且对纯度不产生负面影响。这是令人惊讶的，因为正常情况下分离步骤是必不可少的以除去副产物，所述副产物可能也在下一步脱保护步骤反应并因此降低目标肽的纯度。由于分离通常必然伴随有产品的损失，因此这个发现对整个方法的成本和时间具有积极的影响，并且通常产生更高产量的P1-脱保护的肽。因此，在本发明所述的方法的更优选的实施方式中，在步骤(h)中，在同时除去P3和侧链保护基团后得到的肽在除去P1之前不进行分离。
任意公知的对催化氢化反应稳定的保护基团可用作为P1。合适的实施例为叔丁氧基羰基(Boc)、2-(二苯基-4-基)丙-2-基氧基羰基(Bpoc)、2-(3，5-二甲氧基苯基)丙-2-基氧基羰基(Ddz)、芴-9-基甲氧基羰基(Fmoc)、金刚烷-1-氧基羰基(Adc)、叔-戊基氧基羰基(Aoc)、二苯基氧膦基(Dpp)、2-(甲磺酰基)乙氧基羰基(Msc)和邻苯二甲酰基(Pht)。优选地，P1为Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc，更优选地P1为Boc。
任意分别与式II的片段(针对P4)、式XIII的氨基酸和式XIV的片段(针对P5)的侧链保护基团正交的以及与P3正交的公知的合适的保护基团可用作为保护基团P4和P5。优选地，P4和P5对催化氢化反应稳定并与侧链保护基团正交以及与P3正交。例如，合适的保护基团是Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc、Adc、Aoc、Dpp、Msc和Pht。优选地，P4和/或P5是Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc；更优选地P4和/或P5是Boc。
在本发明所述的方法的一优选实施方式中，P1、P4和P5中的至少一个是Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc；优选P1、P4和P5中的至少一个是Boc。
任意可通过催化氢化反应除去的公知的保护基团可用作为保护基团P3。合适的实施例是苄基(Bzl)、苄基氧基甲基(Bom)、苯甲酰基(Pac)、4-硝基苄基(ONbz)、4-吡啶基甲基(Pic)以及4-磺酸基苄基。优选地，P3是Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic或4-磺酸基苄基，条件是如果P4或P5是Boc、Bpoc或Ddz，P3不是Bom。更优选地，P3是Bzl。保护基团Bom是对酸敏感的，而保护基团Boc、Bpoc和Ddz由酸裂解，即Bom与Boc、Bpoc或Ddz是不正交的。在这里和下文中，这个行为排除了同时采用Bom和保护基团Boc、Bpoc或Ddz中之一。
任意可通过催化氢化反应除去的——以及在侧链保护的情况下，同时与侧链保护基团正交的——公知的保护基团可用作为保护基团P2。合适的实施例是Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic和4-磺酸基苄基。优选地，P2是Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic或4-磺酸基苄基；更优选地，P2是Bzl。
在一优选实施方式中，P2和P3中的至少一个是Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic或4-磺酸基苄基，条件是，如果P4或P5是Boc、Bpoc或Ddz，P3不是Bom。优选地，P2和P3中的至少一个是Bzl。
在更优选的实施方式中，P1、P4和P5中的至少一个是Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc；并且P2和P3中的至少一个是Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic或4-磺酸基苄基，条件是，如果P4或P5是Boc、Bpoc或Ddz，那么P3不是Bom。优选地，P1、P4和P5中的至少一个是Boc而P2和P3中的至少一个是Bzl。
优选地，在本发明所述的方法中，采用选自Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic和4-磺酸基苄基的侧链保护基团中的至少一种保护所述式III、IV、X和XII-XIV的侧链保护的肽/氨基酸；条件是，如果P4或P5是Boc、Bpoc或Ddz，没有一个所述侧链保护基团是Bom。
具体地，在本发明所述的方法中，采用至少一个Bzl作为侧链保护基团保护式III、IV、X和XII-XIV的侧链保护的肽/氨基酸。
通常式V的肽是采用诸如硝基的合适的侧链保护基团在精氨酸残基侧链保护的，以避免不需要的副反应。通常，式VI的肽是采用合适的侧链保护基团在天冬酰胺残基侧链保护的，特别是采用Fomc对N-末端保护，以避免不需要的副反应。合适的实施例是三苯甲基(Trt)，尤其是采用Fomc对N-末端保护的情况下。
意外地，申请人发现对于式V和VI的肽，可以免除侧链保护，这使得它们的组装和它们的偶联产物(式VII的肽)的C-末端脱保护变得更为容易。这个发现允许不考虑C末端和侧链保护之间的正交，因而使得所述路线更为简单。另一个优点是相应的未保护的起始原料在购买时比保护的起始原料更便宜，这特别是对于大规模生产是重要的。
优选地，在本发明的方法中，在步骤(a)中式V和VI的可选地侧链保护的肽中的至少一种是侧链未保护的。假如肽均是侧链未保护的，在步骤(a)和(b)中得到的式VII和II的肽也是侧链未保护的。
更优选地，在本发明的方法中，
在步骤(a)中，式V和VI的肽都是侧链未保护的；
在步骤(c)中，采用选自Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic和4-磺酸基苄基的侧链保护基团中的至少一种保护式X的肽，优选是Bzl，条件是，如果P4和P5是Boc、Bpoc或Ddz，没有一个所述侧链保护基团是Bom；以及
在步骤(e)中，采用选自Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic和4-磺酸基苄基的侧链保护基团保护式XIII的天冬氨酸衍生物，优选是Bzl，条件是，如果P4和P5是Boc、Bpoc或Ddz，没有一个所述侧链保护基团是Bom。
甚至更优选地，在本发明的方法中，在步骤(a)中，式V和VI的肽均是侧链未保护的；并且在步骤(c)和(e)中，至少一个侧链保护基团是Bzl。
在本发明的方法的最优选的实施方式中，在步骤(c)中，采用五个侧链保护基团保护四个谷氨酸的侧链和酪氨酸的侧链来保护式X的肽，因此提供式(Xb)的肽
H-Glu(OP6)-Glu(OP7)-Ile15-Pro-Glu(OP8)-Glu(OP9)-Tyr(P10)-Leu20--OP3(SEQ ID8)                                  (Xb)，
其中P3是可采用催化氢化反应除去的保护基团，优选地P3是Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic或4-磺酸基苄基；更优选地P3是Bzl；以及
P6至P10中的每一个独立地选自Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic和4-磺酸基苄基；优选地P6至P10中的每一个是Bzl；以及
在步骤(e)中式XIII的侧链保护的天冬氨酸是
P5-Asp(OP11)11-OH，
其中P5是与式XII和XIII的肽/氨基酸的侧链保护基团正交的以及与P3正交的保护基团；优选地P5对催化氢化反应稳定，并且与所述侧链保护基团正交以及与P3正交；更优选地P5是Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc；最优选地P5是Boc；以及P11是选自Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic和4-磺酸基苄基；优选地，P11是Bzl。
这里以及下文中，对于C-末端和侧链，缩写“OP[编号]”表示酯(在所述侧链和C末端的羧酸都反应后)，而缩写“P[编号]”表示醚。例如，“OBzl”表示苄酯(在与侧链或C末端的羧基反应后)，而缩写“Bzl”表示二甲苯醚(在与例如酪氨酸的酚羟基反应后)。
优选地，在本发明的方法中，P1、P4和P5是Boc；P2、P3、P6、P7、P8、P9、P10和P11是Bzl；
更优选地，P1、P4和P5是Boc，P2、P3、P6、P7、P8、P9、P10和P11是Bzl，并且式V和VI的肽是侧链未保护的，提供包括以下步骤的溶液相方法
(a)使
Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH(SEQ ID NO4)
与
H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl(SEQ ID NO5)
反应以制备
Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl(SEQ ID NO2)
(b)除去步骤(a)中制备的肽的Bzl以制备
Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH(SEQ ID NO2)，
(c)使
H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)--Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID8)
与
Boc-Phe12-OH
反应以制备
Boc-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)--Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO9)，
(d)除去步骤(c)中制备的肽的Boc以制备相应的N末端脱保护的肽，
(e)使步骤(d)中制备的肽与
Boc-Asp(OBzl)11-OH
反应以制备
Boc-Asp(OBzl)11-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro--Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO3)
(f)除去步骤(e)中制备的肽的Boc以制备
H-Asp(OBzl)11-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)--Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO3)
(g)使在步骤(b)中制备的肽与步骤(f)中制备的肽反应以制备
Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10--Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)--Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO1)，以及
(h)除去在步骤(g)中制备的肽的Boc、C末端保护的Bzl和所有的侧链保护的Bzl，以制备式I的比伐卢定。
该优选的实施方式是非常简单的并且不需要复杂的保护基团策略。
优选地，在步骤(h)中，首先同时除去C末端保护的Bzl和所有侧链保护的Bzl，得到N末端Boc保护的比伐卢定Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp-Phe-Glu--Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OH(SEQ ID NO1)，并且然后去除Boc。
优选地，在同时除去C末端保护的Bzl和所有的侧链保护的Bzl之后得到的N末端Boc保护的比伐卢定在除去Boc之前不需要分离。
C末端保护的基团P2、P3以及P6至P11的侧链保护基团，在它们是可通过催化氢化反应去除的情况下，可通过本领域技术人员公知的任意催化氢化反应的方法来去除。氢化反应可通过采用氢元素或采用合适的供氢体(例如甲酸、甲酸铵、1，3-环己二烯、1，4-环己二烯或硼烷加合物(例如叔-BuNH2·BH3))来完成。合适的氢化反应催化剂为例如贵金属基氢化反应催化剂，尤其是被称为铂系金属(即铑、钌、钯、锇、铱和铂)的金属。方便地，所述氢化反应催化剂是位于例如炭的载体上。根据所需要的活性，可以使所述氢化反应催化剂“中毒”特别是硫化以降低其活性。
可选地，可以添加合适的共催化剂以支持氢化反应。所述共催化剂可以是钒或钼化合物，例如五氧化二钒(V2O5)、偏钒酸铵(NH4VO3)或钼酸钠(Na2MoO4)。
在一优选实施方式中，催化剂被回收，这对于生产成本和环境均具有积极的影响。对于催化剂的回收，可采用任意适于回收催化剂的处理方法。
优选地，所述去除的步骤(b)和(h)中的至少一个是在溶剂中与氢气和钯/炭一起实施的。作为溶剂，可采用任意可溶解反应物的惰性液体溶剂。可采用的溶剂包括卤代芳香烃(例如氯苯和三氟甲苯)；卤代烃(例如二氯甲烷和二氯乙烯)；醇(例如甲醇、乙醇、2-丙醇、丁醇和苯甲醇)；卤代醇(例如2,2,2-三氟乙醇)；羧酸(例如乙酸)；羧酸酯和内酯(例如乙酸乙酯、乙酸甲酯和戊内酯)；以及包含有杂原子的有机溶剂(例如N-甲基吡咯烷酮(NMP)或N,N-二甲基甲酰胺(DMF))。所述溶剂可以单独、或者作为溶剂混合物或者作为与水的混合物来使用。根据肽片段的溶解度，甚至可以仅采用水作为溶剂。因此，在步骤(b)中的去除可以在仅采用水的溶剂中完成。
优选的溶剂选自DMF、丙酮、乙酸、丙酮和水的混合物以及乙酸和水的混合物。
在一优选实施方式中，所述去除的步骤(b)是在选自DMF、丙酮、水、丙酮和水的混合物的溶剂中进行；尤其是在DMF中进行的。
更优选地，所述去除的步骤(b)是在DMF中进行的。意外地，已发现在去除步骤(b)中采用的溶剂对最终的比伐卢定的杂质分布(impurity profile)有影响。已观察到，与例如丙酮和水的混合物相比较，DMF是有利的，以至于可以抑制在-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-(SEQ ID NO2)的双掺入之后的杂质的形成。
在另一优选实施方式中，所述去除步骤(h)在乙酸或乙酸和水的混合物中进行；具体在乙酸和水的混合物中进行。
所述去除步骤(b)和(h)的氢化方法可在大气压或超大气压下进行。通常的压力为1至100bar。有利地，采用1至70bar；具体地采用2至10bar。
所述去除步骤(b)和(h)的氢化反应可在低温或升高的温度下进行。示例性的温度为-20℃至70℃。优选的温度是0℃至60℃，而更优选的温度是10℃至40℃。
本发明的方法的偶联步骤(a)、(c)、(e)和(g)在溶液相中进行，并且在采用在肽合成领域中公知的反应条件下进行。各个侧链未保护的或保护的肽片段/氨基酸衍生物的偶联可采用原位偶联试剂可选地作为像盐酸盐一样的盐来完成，所述原位偶联试剂例如为磷鎓(phoshonium)偶联试剂或脲(uronium)偶联试剂，例如苯并三唑-1-基氧基-三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(BOP)、苯并三唑-1-基氧基-三(吡咯烷基)磷鎓六氟磷酸盐(PyBOP)、O-(苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟硼酸盐(HBTU)、O-(6-氯苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟硼酸盐(HCTU)、O-(6-氯苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸盐(TCTU)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟硼酸盐(HATU)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸盐(TATU)、O-(苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)以及O-[氰基-(乙氧基羰基)甲基氨基]-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸盐(TOTU)、或碳二亚胺偶联试剂，例如二异丙基碳二亚胺(DIC)、二环己基碳二亚胺(DCC)和水溶的碳二亚胺(WSCDI)例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)。其它的偶联方法采用预先制备的活性酯(N-羟基丁二酰亚胺(HOSu)和对硝基苯酚(HONp)酯)、预先制备的对称的酸酐、不对称的酸酐例如N-羧酸酐(NCAs)和酰氯(例如酰氟或酰氯)。优选的偶联试剂是碳二亚胺偶联试剂，最优选的是DIC或EDC，合适的作为EDC盐例如EDC·HCl。
所述偶联步骤(a)、(c)、(e)和(g)的反应混合物可有利地包含有碱，优选叔胺碱，其可以将羧基组分去质子化并中和氨基组分的平衡离子，从而促进了所述原位反应。合适的碱是例如三烷基胺(例如N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)或三乙胺(TEA))；N，N-二烷基苯胺(例如N，N-二乙基苯胺)；2，4，6-三烷基吡啶(例如2，4，6-三甲基吡啶)；以及N-烷基吗啉(例如N-甲基吗啉)。特别是，所述反应混合物有利地包含有作为碱的TEA或DIPEA。
所述偶联步骤(a)、(c)、(e)和(g)的反应混合物还可包含有辅助的亲和试剂作为添加剂，这是因为所述辅助的亲和试剂在抑制不希望的副反应方面有积极作用。可采用任意公知的辅助亲和试剂。合适的辅助的亲和试剂的实施例是1-羟基苯并三唑(HOBt)、N-羟基丁二酰亚胺(HOSu)、N-羟基-3，4-二氢-4-氧代-1,2，3-苯并三唑(HOOBt)和1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)。优选地，所述偶联步骤的反应混合物还包含有HOBt。
在一优选的具体实施方式中，所述偶联步骤(a)、(c)、(e)和(g)的偶联混合物选自DIC/HOBt/TEA、EDC/HOBt/DIPEA和EDC/HOBt/TEA。
作为偶联步骤(a)、(c)、(e)和(g)的溶剂，可采用可溶解反应物的任意惰性液体溶剂。可采用的偶联溶剂是水溶性溶剂(例如二甲亚砜(DMSO)、二氧六环、四氢呋喃(THF)、1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、N，N-二甲基乙酰胺(DMA)或它们的任意混合物)；非水溶性溶剂(例如二氯甲烷(DCM)、乙酸乙酯或它们的任意混合物)；以及在水溶性溶剂和非水溶性溶剂之间的任意合适的混合物(包括与水的混合物)。优选的溶剂是DMF或DMF和水的混合物。
所述步骤(d)、(f)和(h)的N-末端脱保护可采用在肽合成领域中公知的反应条件下并根据保护基团P1、P4和P5的性质来进行。在保护基团为Boc的情况下，脱保护可适当地采用酸(优选采用三氟乙酸)来完成，所述酸可单独使用或者作为与惰性溶剂(例如甲苯、THF或者甲苯和THF的混合物)的混合物而使用。在保护基团是Fmoc的情况下，可通过与碱(有利地与二级胺例如哌啶或二乙胺)反应而实现N-末端的脱保护。通常，N-末端脱保护可在溶剂中进行，所述溶剂可以是不干扰反应物的任意溶剂，例如氯代烃例如二氯甲烷；烷基化酰胺和内酰胺例如二甲基甲酰胺或1-甲基-2-吡咯烷酮；芳香烃例如甲苯；醚例如THF或它们的任意混合物。优选地，所述N-末端Boc基团的脱保护在甲苯或在苯酚、甲苯和THF的混合物中进行。
在步骤(h)制备得到的粗品比伐卢定可采用常规的方法(例如制备级HPLC或反流分布法)来进行纯化。可重复进行纯化步骤。
可对在步骤(a)至(g)之后得到的肽片段采用相同的方法。
可根据在肽化学中公知的分离方法(例如沉淀或冷冻干燥，冷冻干燥又称为冻干法)分离式I的最终的比伐卢定。
式V和VI的可选地侧链保护的肽和式X的侧链保护的肽可采用常规的肽合成方法来制备，所述常规的肽合成方法为例如溶液相合成(又名：均相肽合成，缩写为HPPS)、固相肽合成(SPPS)或称为混合合成的SPPS和HPPS的组合(又名：混合相肽合成，缩写为MPPS)。
在本发明所述的方法的一实施方式中，通过在前述的方法中采用溶液相合成方法制备式V的可选地侧链保护的肽、式VI的可选地侧链保护的肽和式X的侧链保护的肽中的至少一种。优选地，这些肽以相应的二肽(即序列模式-D-Phe1-Pro-、-Arg3-Pro-、-Gly5-Gly-、-Gly7-Gly-、-Asn9-Gly-、-Glu13-Glu-、-Ile15-Pro-、-Glu17-Glu-或-Tyr19-Leu-)为起始进行组装。所述N-末端保护基团、C-末端保护基团和侧链保护基团以及反应条件可以是本领域技术人员公知的，优选为与上述相同或者相似。
具体地，用于在溶液相中制备式(V)的可选地侧链保护的肽的方法
P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH(SEQ ID NO4)   (V)，
优选为侧链未保护的肽Va，
其中
P1是保护基团，优选P1是对催化氢化反应稳定的保护基团，更优选地P1是Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc，最优选地P1是Boc；
所述方法包括以下步骤：
(a)除去式(XVI)的可选地侧链保护的二肽的P12
P12-Arg-Pro4-OP13                         (XVI)，
优选为侧链未保护的二肽XVIa，
其中
P12是保护基团，优选P12是与侧链保护基团正交的和与P13正交的保护基团，更优选地P12是对催化氢化反应稳定的并且与侧链保护基团正交的和与P13正交的保护基团，甚至更优选地P12是Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc，最优选地P12是Boc；以及
P13是例如为Bzl、甲基(Me)或乙基(Et)的保护基团；优选地P13是可通过催化氢化反应除去的并且与侧链保护基团正交的保护基团，更优选地P13是Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic和4-磺酸基苄基，最优选地P13是Bzl；
条件是如果P12是Boc、Bpoc或Ddz，那P13不是Bom；
(b)使在步骤(a)中制备的N-末端脱保护的、可选地侧链保护的二肽，优选相应的侧链未保护的二肽，与式(XVII)的可选地侧链保护的二肽反应
P1-D-Phe1-Pro-OW                                (XVII)，
优选与侧链未保护的二肽XVIIa反应，
其中
P1为如上定义，且W是氢或预活化的基团例如五氟苯基(Pfp)，
以制备式(XV)的可选地侧链保护的肽
P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OP13(SEQ ID NO4)(XV)，
优选所述侧链未保护的肽XVa，
其中
P1和P13为如上定义，以及
(c)除去在步骤(b)中制备的式XV的可选地侧链保护的肽的P13，优选侧链未保护的肽XVa，以制备式V的可选地侧链保护的肽；优选制备侧链未保护的肽Va。
还具体地，用于在溶液相中制备式(VI)的可选地侧链保护的肽优选为侧链未保护的肽VIa的方法
H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2(SEQ ID NO5)(VI)，
其中
P2是保护基团，优选P2是可通过催化氢化反应除去的并且与可选的侧链保护基团正交的保护基团，更优选地P2是Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic或4-磺酸基苄基，最优选地P2是Bzl；
所述方法包括以下步骤：
(a)除去式(XVIII)的可选地侧链保护的二肽优选为侧链未保护的二肽XVIIIa的P14
P14-Asn-Gly10-OP2                         (XVIII)，
其中
P14是保护基团，优选P14是与侧链保护基团正交的和与P2正交的保护基团，更优选地P14是对催化氢化反应稳定的并且与侧链保护基团正交的和与P2正交的保护基团，甚至更优选地P14是Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc，最优选地P14是Boc；以及
P2为如上定义；
条件是，如果P14是Boc、Bpoc或Ddz，那么P2不是Bom；
(b)使在步骤(a)中制备的N-末端脱保护的、可选地侧链保护的二肽，优选侧链未保护的二肽，与式(IXX)的四甘氨酸反应P15-Gly5-Gly-Gly-Gly-OH(SEQ ID NO10)   (IXX)，
其中
P15是保护基团，优选地P15是与式XX的肽的侧链保护基团正交的保护基团，更优选地P15是对催化氢化反应稳定的并且与式XX的肽的侧链保护基团正交的保护基团，甚至更优选地P15是Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc，最优选地P15是Boc；
以制备式(XX)的可选地侧链保护的肽
P15-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2(SEQ ID NO5)(XX)，
优选所述侧链未保护的肽XXa，
其中
P2和P15为如上定义，
条件是，如果P15是Boc、Bpoc或Ddz，那么P2不是Bom
以及
(c)除去在步骤(b)中制备的式XX的可选地侧链保护的肽优选侧链未保护的肽XXa的P15，以制备式VI的可选地侧链保护的肽；优选制备侧链未保护的肽VIa。
进一步具体地，用于在溶液相中制备式(X)的侧链保护的肽的方法
H-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO8)
                                                 (X)，
优选为式(Xb)的肽
H-Glu(OP6)-Glu(OP7)-Ile15-Pro-Glu(OP8)-Glu(OP9)-Tyr(P10)--Leu20-OP3(SEQ ID8)                   (Xb)，
其中
P3是保护基团，优选P3是可通过催化氢化反应除去的保护基团，更优选地P3是Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic或4-磺酸基苄基，最优选地P3是Bzl，和
P6至P10中的每一个独立地选自Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic和4-磺酸基苄基，优选地P6至P10的每一个是Bzl，
所述方法包括以下步骤：
(a)除去式(VIII)的侧链保护的肽的P16
P16-Glu-Glu-Ty-Leu20-OP3(SEQ ID NO6)    (VIII)，
优选为式(VIIIb)的肽的P16
P16-Glu(OP8)-Glu(OP9)-Tyr(P10)-Leu20-OP3(SEQ ID NO6)
                                             (VIIIb)，
其中
P3和P8至P10为如上定义，以及
P16是保护基团，优选P16是与侧链保护基团正交的和与P3正交的保护基团，更优选地P16是对催化氢化反应稳定的并且与侧链保护基团正交的和与P3正交的保护基团，甚至更优选地P16是Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc，最优选地P16是Boc；
条件是，如果P16是Boc、Bpoc或Ddz，那么P3不是Bom；
(b)使在步骤(a)中制备的式VIII的N-末端脱保护的、侧链保
护的二肽，优选相应的肽VIIIb，与式(IX)的侧链保护的肽反应
P17-Glu-Glu-Ile15-Pro-OH(SEQ ID NO7)   (IX)，
优选为
P17-Glu(OP6)-Glu(OP7)-Ile15-Pro-OH(SEQ ID NO7)  (IXb)，
其中
P6和P7为如上定义，以及
P17是保护基团，优选地P17是与侧链保护基团正交的保护基团，更优选地P17是对催化氢化反应稳定的并且与侧链保护基团正交的保护基团，甚至更优选地P17是Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc，最优选地P17是Boc；
以制备式(XXI)的侧链保护的肽
P17-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO8)
                                              (XXI)，
优选为式(XXIb)的肽
P17-Glu(OP6)-Glu(OP7)-Ile15-Pro-Glu(OP8)-Glu(OP9)--Tyr(P10)-Leu20-OP3(SEQ ID8)      (XXIb)，
其中
P3、P6至P10和P17为如上定义，
条件是，如果P17是Boc、Bpoc或Ddz，那么P3或P6至P10中的任一个不是Bom，以及
(c)除去在步骤(b)中制备的式XXI的侧链保护的肽优选为相应的肽XXIb的P17，以制备式X的侧链保护的肽；优选制备肽Xb。
在本发明所述的方法的另一实施方式中，所述肽中的至少一种选自式V的可选地侧链保护的肽、式VI的可选地侧链保护的肽和式X的侧链保护的肽，其是通过在前述的方法中采用溶液相合成方法制备。因此，可采用包括公知的SPPS构建块和SPPS条件的任意公知SPPS方法。可采用本领域技术人员公知的并且可用于制备保护的肽的所有的树脂。这里，应以宽的方式解释树脂。因此，术语“树脂”应理解为是指例如单独的固体载体或直接连接至连接子的固体载体，可选地在两者之间选择。树脂可以是不可溶解的或可溶解的。可溶解的聚合物聚乙二醇(可溶解的PEG聚合物)是可溶解的树脂固体载体的示例，因此在组装所述各单个构建块之后形成可溶解的肽-树脂。优选的树脂是具有三苯甲基或溴二苯甲基的聚苯乙烯基树脂。三苯甲基树脂的示例是2-氯三苯甲基氯化物树脂(CTC树脂)、三苯甲基氯化物树脂、4-甲基三苯甲基氯化物树脂和4-甲氧基三苯甲基氯化物树脂。优选地，所述CTC树脂用于合成所述肽片段。
本发明的另一个目的是提供作为本发明所述的方法中的中间体的有用的肽。具体地，这些肽中的一种是选自以下的肽
(i)式(V)的可选地侧链保护的肽
P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH(SEQ ID NO4)   (V)，
其中P1是保护基团，优选地P1是对催化氢化反应稳定的保护基团，更优选地P1是Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc，最优选地P1是Boc；以及
所述肽是采用例如硝基的合适的侧链保护基团在精氨酸残基上可选地侧链保护的；
(ii)式(VI)的可选地侧链保护的肽
H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2(SEQ ID NO5)   (VI)，其中P2是保护基团，优选地P2是可通过催化氢化反应除去的并且与可选地侧链保护基团正交的保护基团，更优选地P2是Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic和4-磺酸基苄基，最优选地P2是Bzl；以及
所述肽是采用例如三苯甲基(Trt)的合适的侧链保护基团在天冬酰胺残基上可选地侧链保护的；
(iii)式(VII)的可选地侧链保护的肽
P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2(SEQ ID NO2)                                  (VII)，
其中P1、P2和可选的侧链保护基团以及P1、P2和可选的侧链保护基团的优选定义为如上定义；
(iv)式(IIa)的侧链保护的肽
P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH(SEQ ID NO2)                                  (IIa)，
其中P1和侧链保护基团以及P1和可选的侧链保护基团的优选定义为如上定义，
除了Boc-D-Phe1-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)--Gly10-OH中Pbf是五甲基二氢苯并呋喃磺酰基以及Trt是三苯甲基外。所述肽已在WO2007/033383中公开作为在CTC树脂进行固相合成的产物。与之相反，本发明所述的式IIa的侧链保护的肽可通过不同的方法合成，即通过溶液相合成方法合成；
(v)式(IIb)的侧链未保护的肽
P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH(SEQ ID NO2)                                  (IIb)，
其中P1和P1的优选定义为如上定义；
(vi)式(X)的侧链保护的肽
H-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO8)
                                               (X)，
其中P3是保护基团，优选地P3是可通过催化氢化反应除去的保护基团，更优选地P3是Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic或4-磺酸基苄基，最优选地P3是Bzl；以及
(各)所述侧链保护基团是至少一种合适的侧链保护基团，优选地选自Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic和4-磺酸基苄基，更优选地为Bzl；
(vii)式(XII)的侧链保护的肽
P4-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO9)
                                               (XII)，
其中P3和侧链保护基团以及P3和可选地侧链保护基团的优选定义为如上所定义；以及
P4是保护基团，优选地P4是与式X的肽的侧链保护基团正交的和与P3正交的保护基团，更优选地P4是Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc，最优选地P4是Boc，条件是，如果P4是Boc、Bpoc或Ddz，那么P3不是Bom；
或
P4是氢；
(viii)式(XIV)的侧链保护的肽
P5-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQID NO3)                                         (XIV)，
其中P3和侧链保护基团以及P3和可选地侧链保护基团的优选定义为如上所定义；
以及
P5是保护基团，优选地P5是与式XII和式XIII的肽/氨基酸的侧链保护基团正交的和与P3正交的保护基团，更优选地P5是Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc，最优选地P5是Boc，条件是，如果P5是Boc、Bpoc或Ddz，那么P3不是Bom，除了Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile15-Pro--Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu20-OtBu中tBu是叔丁基以外。所述肽已在WO2007/033383中公开作为在前体肽(即肽序列减去Leu)和H-Leu-OtBu之间的反应的产物。如在WO2007/033383中公开的所述前体肽已在前述步骤中通过在CTC树脂上固相合成而形成。在与H-Leu-OtBu反应后，所述公开的肽在继续进行下一步骤之前不进行分离。与之相反，本发明所述的式XIV的侧链保护的肽可通过不同的方法合成，即通过溶液相合成方法合成，并且在其合成之后进行对其分离；
(ix)式(III)的侧链保护的肽
H-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQID NO3)                                         (III)，
其中P3和侧链保护基团以及P3和可选地侧链保护基团的优选定义为如上所定义，除了H-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile15-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu20-OtBu以外。所述肽已在WO2007/033383中被公开。其是上述的N-末端脱保护的肽。因此，如上所述，它的合成的方法与本发明的式III的侧链保护的肽不同；
以及
(x)式(IV)的侧链保护的肽
P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp-Phe--Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO1)
                                                 (IV)，
其中P1、P3和侧链保护基团以及P1、P3和可选地侧链保护基团的优选定义为如上所定义，除了Boc-D-Phe1-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)--Gly10-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-lle15-Pro--Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu20-OtBu以外。所述肽已在WO2007/033383中被公开为在Boc-D-Phe1-Pro-Arg(Pbf)-Pro--Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly10-OH和H-Asp(OtBu)-Phe--Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile15-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)--Leu20-OtBu(它们均已在上文有描述)偶联后得到的产物。因此，它的偶联产物的合成方法与本发明的式IV的侧链保护的肽的合成方法不同。
在一优选实施方式中，式V的肽是侧链未保护的并且具有下式Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH(SEQ ID NO4)，
其包括比伐卢定的位置1-4的氨基酸序列。
在另一优选实施方式中，式VI的肽是侧链未保护的并且具有下式
H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl(SEQ ID NO5)，其包括比伐卢定的位置5-10的氨基酸序列。
在另一优选实施方式中，式VII的肽是侧链未保护的并且具有下式
Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl(SEQ ID NO2)，
其包括比伐卢定的位置1-10的氨基酸序列。
在另一优选实施方式中，式IIb的侧链未保护的肽是Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH(SEQ ID NO2)，
其包括比伐卢定的位置l-10的氨基酸序列。
在另一优选实施方式中，式X的侧链保护的肽是
H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)--Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO8)，
其包括比伐卢定的位置13-20的氨基酸序列。
在另一优选实施方式中，式XII的侧链保护的肽是Boc-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)--Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO9)，或
H-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)--Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO9)，
其均包括比伐卢定的位置12-20的氨基酸序列。
在另一优选实施方式中，式XIV的侧链保护的肽是
Boc-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)--Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO3)，
其包括比伐卢定的位置11-20的氨基酸序列。
在另一优选实施方式中，式III的侧链保护的肽是H-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)--Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO3)，
其包括比伐卢定的位置11-20的氨基酸序列。
在另一优选实施方式中，式IV的侧链保护的肽是Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10--Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)--Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO1)，
其包括比伐卢定的位置1-20的氨基酸序列。
在另一方面，本发明涉及选自以下组的肽
(i)式(V)的可选地侧链保护的肽
P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH(SEQ ID NO4)       (V)，其中P1是保护基团，优选地P1是对催化氢化反应稳定的保护基团，更优选地P1是Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc；最优选地P1是Boc；以及
所述肽是采用例如硝基的合适的侧链保护基团在精氨酸残基上可选地侧链保护的；
优选地，所述肽V是侧链未保护的并且具有下式Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH(SEQ ID NO4)；
(ii)式(VI)的可选地侧链保护的肽
H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2(SEQ ID NO5)   (VI)，其中P2是保护基团，优选地P2是可通过催化氢化反应除去的并且与可选的侧链保护基团正交的保护基团，更优选地P2是Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic或4-磺酸基苄基，最优选地P2是Bzl；以及
所述肽是采用例如三苯甲基(Trt)的合适的侧链保护基团在天冬酰胺残基上可选地侧链保护的；
优选地，所述肽VI是侧链未保护的并且具有下式H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl(SEQ ID NO5)；
(iii)式(VII)的可选地侧链保护的肽
P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2(SEQ ID NO2)                                  (VII)，
其中P1、P2和侧链保护基团以及P1、P2和可选地侧链保护基团的优选定义为如上所定义；
优选地，所述肽VII是侧链未保护的并且具有下式Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl(SEQ ID NO2)；
(iv)式(IIa)的侧链保护的肽
P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH
(SEQ ID NO2)                                  (IIa)，
其中P1和侧链保护基团以及P1和可选地侧链保护基团的优选定义为如上所定义，
除了Boc-D-Phe1-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)--Gly10-OH以外，其中Pbf是五甲基二氢苯并呋喃磺酰基和Trt是三苯甲基。所述肽已在WO2007/033383中公开作为在CTC树脂进行固相合成的产物。与之相反，本发明所述的式IIa的侧链保护的肽可通过不同的方法合成，即通过溶液相合成方法合成；
(v)式(IIb)的侧链未保护的肽
P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH(SEQ ID NO2)                                  (IIb)，
其中P1以及P1的优选定义为如上所定义；
优选地，式IIb的侧链未保护的肽是
Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH(SEQ ID NO2)；
(vi)式(X)的侧链保护的肽
H-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO8)
                                               (X)，
其中P3是保护基团，优选地P3是可通过催化氢化反应除去的保护基团，更优选地P3是Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic或4-磺酸基苄基，最优选地P3是Bzl；以及
所述(各)侧链保护基团优选地选自Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic和4-磺酸基苄基，更优选地为Bzl；
优选地，式X的侧链保护的肽是
H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)--Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO8)；
(vii)式(XII)的侧链保护的肽
P4-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ IDNO9)                                           (XII)，
其中P3和侧链保护基团以及P3和可选地侧链保护基团的优选定义为如上所定义；以及
P4是保护基团，优选地P4是与式X的肽的侧链保护基团正交的和与P3正交的保护基团，更优选地P4是Boc、即oc、Ddz、Fmoc或Msc，最优选地P4是Boc，
条件是，如果P4是Boc、Bpoc或Ddz，那么P3不是Bom；
或
P4是氢；
优选地，式XII的侧链保护的肽是
Boc-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)--Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO9)，或H-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)--Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO9)；
(yiii)式(XIV)的侧链保护的肽
P5-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQID NO3)                                        (XIV)，
其中P3和侧链保护基团以及P3和可选地侧链保护基团的优选定义为如上所定义；
以及
P5是保护基团，优选地P5是与式XII和式XIII的肽/氨基酸的侧链保护基团正交的和与P3正交的保护基团，更优选地P5是Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc，最优选地P5是Boc，条件是，如果P5是Boc、Bpoc或Ddz，那么P3不是Bom，
除了Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile15-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu20-OtBu中tBu是叔丁基以外。所述肽已在WO2007/033383中公开作为前体肽(即肽序列减去Leu)和H-Leu-OtBu之间的反应的产物。如在WO2007/033383中公开的所述前体肽已在前述步骤中通过在CTC树脂上固相合成而形成。在与H-Leu-OtBu的反应后，所述公开的肽在继续进行下一步之前不进行分离。在与H-Leu-OtBu反应后，所述公开的肽在继续进行下一步骤之前不进行分离。与之相反，本发明所述的式XIV的侧链保护的肽可通过不同的方法合成，即通过溶液相合成方法形成，并且在其形成之后对其进行分离；优选地，式XIV的侧链保护的肽是
Boc-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)--Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO3)；
(ix)式(III)的侧链保护的肽
H-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3   (SEQID NO3)
其中P3和侧链保护基团以及P3和可选地侧链保护基团的优选
定义为如上所定义，
除了H-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile1s-Pro--Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu20-OtBu以外。所述肽已在WO2007/033383中公开。它是上述的N-末端脱保护的肽。因此，如上所述，它的合成的方法与本发明的式III的侧链保护的肽不同；
优选地，式III的侧链保护的肽是
H-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)--Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO3)；
以及
(x)式(IV)的侧链保护的肽
P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO1)(IV)，其中P1、P3和侧链保护基团以及P1、P3和可选地侧链保护基团的优选定义为如上所定义，
除了Boc-D-Phe1-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)--Gly10-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile15-Pro--Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu20-OtBu以外。所述肽已在WO2007/033383中公开为在Boc-D-Phe1-Pro-Arg(Pbf)-Pro--Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Glyl0-OH和H-Asp(OtBu)-Phe--Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile15-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)--Leu20-OtBu(它们均已在上文有描述)偶联后得到的产物。因此，它的偶联产物的合成方法与本发明的式IV的侧链保护的肽的合成方法不同；
优选地，式IV的侧链保护的肽是
Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10--Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)--Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO1)；
作为合成式(I)的比伐卢定的中间体的应用
H-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly0-Asp-Phe-G1u-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OH(SEQ ID NO1)(I)。
本发明还涉及用于制备式I的比伐卢定的方法，所述方法包括以下步骤
(a)使其中P1为保护基团的式(IIc)的肽
P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH
(SEQ ID NO2)                                 (IIc)，
与其中P3和P6至P11中的每一个是Bzl的式(IIIc)的肽反应
H-Asp(OP11)-Phe-Glu(OP6)-Glu(OP7)-Ile15-Pro-Glu(OP8)-Glu(OP9)-Tyr(P10)-Leu20-OP3(SEQ ID NO3)   (IIIc)，
以制备得到其中P1、P3和P6至P11为如上定义的式(IVc)的肽
P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10--Asp(OP11)-Phe-Glu(OP6)-Glu(OP7)-Ile15-Pro-Glu(OP8)--Glu(OP9)-Tyr(P10)-Leu20-OP3(SEQ ID NO1)(IVc)；
(b)除去步骤(a)中制备的肽的侧链和C-末端的保护基团P3和P6至P11；以及
(c)除去步骤(b)中制备的肽的N-末端保护基团P1以制备得到式I的比伐卢定。
本发明的方法可以通过汇聚片段合成方法高效合成比伐卢定，其易于适用于工业化生产。而且，该用于制备比伐卢定的路线是非常简单的并且不需要采用复杂的保护基团策略。此外，可选择各种构建块(片段)以避免或减少在组装期间的外消旋化作用。
在本发明的各单个反应之前、期间和之后，所有的片段以及所有的偶联产物可以本身的形式或以适当的盐形式存在，这取决于所述分子的物理化学性质和/或反应条件。合适的平衡离子为例如与三乙胺(TEA)、二环己胺(DCHA)、盐酸(HCl)和三氟乙酸(TFA)的盐形式。
可采用任意的对催化氢化反应稳定的保护基团作为保护基团P1，所述任意的对催化氢化反应稳定的保护基团例如为叔丁氧基羰基(Boc)、芴-9-基甲氧基羰基(Fmoc)、2-(3，5-二甲氧基苯基)丙烷-2-基氧基羰基(Ddz)、金刚烷基-1-氧基羰基(Adc)(adamantly-1-oxycarbonyl)、叔-戊基氧基羰基(Aoc)、二苯基氧膦基(Dpp)、2-(甲磺酰基)乙氧基羰基(Msc)和邻苯二甲酰基(Pht)。优选地，保护基团P1为Boc、Fmoc或Ddz。
优选地，保护基团P3和P6至P11是苄基(Bzl)。这里以及下文中，缩写“OBzl”表示苄酯(在与侧链或C末端的羧基反应后)，而缩写“Bzl”表示二甲苯醚(在与例如酪氨酸的酚羟基反应后)。
可采用在肽合成领域中公知的标准反应条件进行步骤(a)至(c)。
优选在溶液中进行偶联和脱保护步骤(a)、(b)和(c)。
针对偶联步骤(a)，优选采用DMF作为溶剂。第一个脱保护步骤(b)优选在乙酸和/或水中进行，而第二个脱保护步骤(c)优选在甲苯中进行。
在一优选实施方式中，采用HOBt、EDC·HCl和TEA的组合完成偶联步骤(a)。
在一优选实施方式中，采用氢气和钯/炭进行所述第一个脱保护步骤(b)。
在一优选实施方式中，采用TFA进行所述第二个脱保护步骤(c)。
在步骤(c)后得到的粗制的产物可通过常规方法(例如制备级HPLC、反流分布法或等效的方法)进行纯化。如果步骤(a)和(b)后得到的中间体需要纯化，可采用相同的方法进行纯化。
可采用常规的肽合成方法(例如溶液相合成法(HPPS)或固相合成法(SPPS))制备保护的肽片段IIc和IIIc。在SPPS的情况下，可采用本领域技术人员公知的并可用于制备保护的肽的所有的树脂。在本文中，应以宽的方式解释树脂。因此，术语“树脂”应理解为是指例如单独的固体载体或直接连接至连接分子的固体载体，可选地在两者之间进行选择。树脂可以是不可溶解的或可溶解的。所述可溶解的聚合物聚乙二醇是可溶解的树脂固体载体的示例。优选的树脂是具有三苯甲基或溴二苯甲基的聚苯乙烯基树脂。三苯甲基树脂的示例是2-氯三苯甲基氯化物树脂(CTC树脂)、三苯甲基氯化物树脂、4-甲基三苯甲基氯化物树脂和4-甲氧基三苯甲基氯化物树脂。优选地，所述CTC树脂用于合成包含有游离羧基官能团的片段。
在一优选实施方式中，采用溶液相合成法制备所述保护的肽片段IIc和IIIc。
本发明的另一个目的是提供作为本发明所述的方法中的中间体的有用的肽。具体地，这些肽中的一种是式IVc的保护的肽，其中P1是保护基团；优选地P1是Boc或H；以及P3和P6至P11是Bzl。
作为本发明的方法中的中间体的特别有用的另一个肽是式IIc的N-末端保护的肽，其中P1是保护基团，优选P1是Boc。
在另一方面，本发明还涉及用于制备其中P1为Boc的式(IIc)的N-末端保护的肽的方法
P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH
(SEQ ID NO2)                                  (IIc)，其包括：
(a)除去式(Vc)的肽的C-末端保护基团
P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OP13(SEQ ID NO4)   (Vc)，
其中P1是Boc而P13是诸如Bzl、甲基(Me)或乙基(Et)的保护基团；优选地P13是Bzl；
以得到其中P13是H的式Vc的N-末端保护的、C-末端未保护的肽；
(b)除去其中P15是Boc的式(VIc)的肽的N-末端保护基团
P15-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl(SEQ ID NO5)
                                               (VIc)，
得到其中P15为H的式VIc的C-末端保护的、N-末端未保护的肽；
(c)使在步骤(a)中制备的其中P13是H的式Vc的肽与在步骤(b)中制备的其中P15是H的式VIc的肽反应，得到其中
P1是Boc的式(VIIc)的肽
P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl
(SEQ ID NO2)                                 (VIIc)；
以及
(d)除去在步骤(c)中制备的肽的C-末端保护基团，以得到式IIc的N-末端保护的肽。
可采用肽合成领域中公知的标准反应条件进行步骤(a)至(d)。
优选在溶液中进行偶联和脱保护步骤(a)、(b)、(c)和(d)。
针对偶联步骤(c)，优选采用DMF作为溶剂。第一个脱保护步骤(a)优选在丙酮中进行，而第二个脱保护步骤(b)优选在甲苯和/或THF中进行。第三个脱保护步骤(d)优选在选自DMF、丙酮、水、丙酮和水的混合物的溶剂中进行。
在一优选实施方式中，采用氢气和钯/炭进行第一个脱保护步骤(a)。
在一优选实施方式中，采用TFA进行第二个脱保护步骤(b)。
在一优选实施方式中，采用HOBt、DIC和TEA的组合来完成偶联步骤(c)。
在一优选实施方式中，采用氢气和钯/炭进行第三个脱保护步骤(d)。
在步骤(d)后得到的粗制的产物可通过常规方法(例如制备级HPLC、反流分布法或等效的方法)进行纯化。如果步骤(a)、(b)和(c)后得到的中间体需要纯化，可采用相同的方法进行纯化。
可采用常规的肽合成方法(例如溶液相合成法(HPPS)或固相合成法(SPPS))制备保护的肽片段Vc和VIc。在SPPS的情况下，可采用本领域技术人员公知的并可用于制备保护的肽的所有的树脂。在本文中，应以宽的方式解释树脂。因此，术语“树脂”应理解为是指例如单独的固体载体或直接连接至连接分子的固体载体，可选地在两者之间进行选择。树脂可以是不可溶解的或可溶解的。所述可溶解的聚合物聚乙二醇是可溶解的树脂固体载体的示例，因此生成可溶解的肽-树脂的结合物。优选的树脂是具有三苯甲基或溴二苯甲基的聚苯乙烯基树脂。三苯甲基树脂的示例是2-氯三苯甲基氯化物树脂(CTC树脂)、三苯甲基氯化物树脂、4-甲基三苯甲基氯化物树脂和4-甲氧基三苯甲基氯化物树脂。优选地，所述CTC树脂用于合成包含有游离羧基官能团的片段。
在一优选实施方式中，采用溶液相合成法制备所述保护的肽片段Vc和VIc。
本发明的另一个目的是提供作为用于制备式IIc的N-末端保护的肽的本发明所述的方法中的中间体的有用的保护的肽。具体地，这些肽中的一种是式Vc的C-末端和N-末端保护的肽，其中P13是保护基团，优选是Bzl；这些肽中的另一种是具有游离C-末端的式Vc的N-末端保护的肽。
作为本发明所述的方法中的中间体的特别有用的另一种肽，是式VIc的C-末端保护的肽，其中P15是Boc；或P15是H。
作为用于制备比伐卢定的方法中的中间体的特别有用的另一种肽是式IIIc的保护的肽，其中P3和P6至P11是Bzl。
在另一方面，本发明还涉及用于制备其中P3和P6至P11是Bzl的式(IIIc)的保护的肽
H-Asp(OP11)-Phe-Glu(OP6)-Glu(OP7)-Ile15-Pro-Glu(OP8)--Glu(OP9)-Tyr(P10)-Leu20-OP3(SEQ ID NO3)   (IIIc)，其包括：
(a)除去式(VIIIc)的肽的N-末端保护基团
P16-Glu(OP8)-Glu(OP9)-Tyr(P10)-Leu20-OP3(SEQ ID NO6)
                                             (VIIIc)，
其中P3和P8至P10是Bzl且P16是Boc，
以得到其中P16是H的式VIIIc的C-末端保护的、N-末端未保护的肽；
(b)使在步骤(a)中制备的其中P16是H而P3和P8至P10是Bzl的式VIIIc的肽与其中P17是Boc而P6和P7是Bzl的式(IXc)的肽反应
P17-Glu(OP6)-Glu(OP7)-Ile15-Pro-OH(SEQ ID NO7)
                                               (IXc)，
以得到其中P17是Boc而P3和P6至P10是Bzl的式(Xc)的肽
P17-Glu(OP6)-Glu(OP7)-Ile15-Pro-Glu(OP8)-Glu(OP9)--Tyr(P10)-Leu20-OP3(SEQ ID NO8)   (Xc)；
(c)除去在步骤(b)中制备的式Xc的肽的N-末端保护基团，其中P3和P6至P10是Bzl；而P17是Boc，
以得到其中P3和P6至P10是Bzl而P17是H的式Xc的C-末端保护的、N-末端未保护的肽；
(d)使在步骤(c)中制备的其中P17是H而P3和P6至P10是Bzl的式Xc的肽与式(XI)的保护的氨基酸反应Boc-Phe12-OH                                       (XI)，
以得到其中P3和P6至P10是Bzl而P4是Boc的式(XIIc)的肽
P4-Phe-Glu(OP6)-Glu(OP7)-Ile15-Pro-Glu(OP8)-Glu(OP9)--Tyr(P10)-Leu20-OP3(SEQ ID NO9)   (XIIc)，
(e)除去在步骤(d)中制备的式XIIc的肽的N-末端保护基团，
其中P3和P6至P10是Bzl而P4是Boc，
以得到其中P3和P6至P10是Bzl而P4是H的式XIIc的C-末端保护的、N-末端未保护的肽；
(f)使在步骤(e)中制备的其中P4是H而P3和P6至P10是Bzl的式XIIc的肽与其中P11是Bzl的式(XIIIc)的保护的氨基酸
Boc-Asp(OP11)11-OH                            (XIIIc)，
反应以得到其中P3和P6至P11是Bzl的式(XIVc)的肽Boc-Asp(OP11)-Phe-Glu(OP6)-Glu(OP7)-Ile15-Pro-Glu(OP8)--Glu(OP9)-Tyr(P10)-Leu20-OP3   (SEQ ID NO3)；
以及
(g)除去在步骤(f)中制备的肽的N-末端保护基团，以得到式IIIc的C-末端保护的肽。
采用肽合成领域中公知的标准反应条件进行步骤(a)至(g)。
优选在溶液中进行偶联和脱保护步骤(a)至(g)。
针对偶联步骤(b)、(d)和(f)，优选采用DMF作为溶剂。优选在作为溶剂的甲苯和THF的混合物中进行脱保护步骤(a)、(c)、(e)和(g)。
在优选的实施方式中，采用HOBt、EDC·HCl的组合完成偶联步骤(b)、(d)和(f)，而步骤(b)采用碱TEA，步骤(d)和(f)分别采用DIPEA。在另一优选的实施方式中，采用TFA和苯酚进行脱保护步骤(a)、(c)、(e)和(g)。
在步骤(g)后得到的粗制的产物可通过常规方法(例如制备级HPLC、反流分布法或等效的方法)进行纯化。如果步骤(a)至(f)后得到的中间体需要纯化，可采用相同的方法进行纯化。
可采用常规的肽合成方法(例如溶液相合成法(HPPS)或固相合成法(SPPS))制备保护的肽片段VIIIc、IXc、XI和XIIIc。在SPPS的情况下，可采用本领域技术人员公知的并可用于制备保护的肽的所有的树脂。在本文中，应以宽的方式解释树脂。因此，术语“树脂”应理解为是指例如单独的固体载体或直接连接至连接分子的固体载体，可选地在两者之间进行选择。树脂可以是不可溶解的或可溶解的。所述可溶解的聚合物聚乙二醇是可溶解的树脂固体载体的示例。优选的树脂是具有三苯甲基或溴二苯甲基的聚苯乙烯基树脂。三苯甲基树脂的示例是2-氯三苯甲基氯化物树脂(CTC树脂)、三苯甲基氯化物树脂、4-甲基三苯甲基氯化物树脂和4-甲氧基三苯甲基氯化物树脂。优选地，所述CTC树脂用于合成包含有游离羧基官能团的片段。
在一优选实施方式中，采用溶液相合成法制备所述保护的肽片段VIIIc、IXc、XI和XIIIc。
本发明的另一个目的是提供保护的肽，所述保护的肽可用作为用于制备式IIIc的C-末端保护的肽的本发明所述的方法中的中间体。具体地，这些肽中的一种是式XIVc的保护的肽，其中P3和P6至P11是Bzl。
可特别用作为本发明的方法中的中间体的另一种肽是式XIIc的侧链保护的肽，其中P3和P6至P10是Bzl，而P4是Boc保护基团，或P4是H。
可特别用作为本发明的方法中的中间体的另一种肽是式Xc的保护的肽，其中P3和P6至P10是Bzl，而P17是Boc保护基团，或P17是H。
可特别用作为本发明的方法中的中间体的另一种肽是式IXc的保护的肽，其中P6和P7是Bzl，而优选P17是Boc。
可特别用作为本发明的方法中的中间体的另一种肽是式VIIIc的保护的肽，其中P3和P8至P10是Bzl，而P16是Boc保护基团，或P16是H。
在另一方面，本发明还涉及任意上述作为合成比伐卢定中的中间体的肽的应用。
具体实施方式
以下的非限制的实施例将对本发明的代表性具体实施方式进行详细描述。
缩写：
Boc                           叔丁氧羰基
Bzl                           苄基
DCC                           1，3-二环己基碳二亚胺
DCHA                          二环己胺
DCU                           二环己基脲
DIC                           二异丙基碳二亚胺
DIPEA                         N，N-二异丙基乙胺
DMF                           N，N-二甲基甲酰胺
EDC·HCl                      1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳
                              二亚胺盐酸盐
equiv.                        当量
HOBt                          1-羟基苯并三唑
MTBE                          甲基叔丁基醚
NMM                           N-甲基吗啉
HOPfp                         五氟苯酚
OPfp                           五氟苯基酯
HOSu                           N-羟基丁二酰亚胺
Su                             N-丁二酰亚胺基
TEA                            三乙胺
TFA                            三氟乙酸
THF                            四氢呋喃
实施例1：制备H-Asn-Gly 10 -OBzl.TFA
在20℃向TFA(90L)、甲苯(388L)和THF(45L)的混合物中加入Boc-Asn-Gly-OBzl(90.20kg；Hexagon Labs Inc.，美国)。在≤22℃向得到的混合物中缓慢加入TFA(198L)。在20℃使反应完成。通过HPLC监测所述裂解的完成。
然后，缓慢加入THF，并在真空蒸发所述反应混合物。采用甲苯和THF的混合物进行三共沸蒸馏。得到H-Asn-Gly10-OBzl·TFA，为油状残留物，用乙酸乙酯稀释。得到的溶液直接用于下一步化学步骤(参见实施例3)。收率：100％。纯度(HPLC)：99.3％。
实施例2：制备Boc-Gly 5 -Gly-Gly-Gly-OH·TEA(SEQ ID NO 10)
在20℃向Boc-Gly5-Gly-Gly-Gly-OEt(SEQ ID NO10)[98.11kg；Bonora等，GazzettaChimica Italiana1980，110，503-510，analogouSlypreparedfrom Boc-Gly-Gly-OH(Senn Chemicals，瑞士)和H-Gly-Gly-OEt·HCl(Senn Chemicals，瑞士)]在丙酮(78.44L)和处理过的水(processed water)(491L)的混合物中的悬浮液中缓慢加入TEA(73.1L)。在20℃使反应完成。通过HPLC监测所述皂化反应的完成。
在真空蒸发所述溶液，并采用处理过的水调节所述残留物的体积至456L。Boc-Gly5-Gly-Gly-Gly-OH·TEA(SEQ ID NO10)的溶液直接用于下一步化学步骤(参见实施例3)。收率：100％。纯度(HPLC)：99.6％。
实施例3：制备Boc-Gly 5 -Gly-Gly-Gly-Asn-Gly 10 -OBzl(SEQ ID  NO5)
在0℃采用TEA调节H-Asn-Gly10-OBzl·TFA(573L，参见实施例1)的乙酸乙酯溶液的pH值至6-6.5。按照实施例2制备得到的B0c-Gly5-Gly-Gly-Gly-OH(SEQ ID NO10)的溶液冷却至0℃，并加入上述溶液中，然后加入HOBt(28.52kg)和EDC·HCl(69.81kg)。在0℃用TEA(121L)调节pH值至6-6.5。使反应混合物升温至室温。
在偶联反应完成后(在约10h以后；按HPLC指示)，向所述反应混合物中加入NaCl。冷却得到的悬浮液并过滤得到固体残留物，用NaCl水溶液洗涤多次，然后冷却。在真空干燥得到的固体，得到130.15kg(100％)的Boc-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10--OBzl(SEQ ID NO5)，纯度为97.9％(HPLC)。
实施例4：制备H-Gly 5 -Gly-Gly-Gly-Asn-Gly 10 -OBzl·TFA (SEQ ID NO5)
在≤22℃向TFA(131L)、甲苯(525L)和THF(105L)的混合物中缓慢加入Boc-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl(SEQ ID NO5)(131.20kg，参见实施例3)。在≤22℃向得到的反应混合物中缓慢加入TFA(289L)。所述反应在20℃在约1.5h内反应完成(由HPLC监测)。
真空浓缩得到的反应混合物，得到的残留物倒入二异丙醚中。将得到的悬浮液过滤得到固体，用二异丙醚洗涤所述固体多次，然后在真空干燥得到130.99kg H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Glyl0--OBzl·TFA(SEQ ID NO5)，纯度为97.9％(HPLC)。
实施例5：制备H-Arg-Pro-OBzl·2HCl
在≤22℃向Boc-Arg-Pro-OBzl·HCl(95.00kg；Hexagon LabsInc.，美国)在乙酸(1910L)和THF(19L)中的悬浮液中缓慢加入盐酸(1M)在乙酸(380L)中的溶液。(在约1小时后)通过HPLC监测裂解反应的完成。
真空浓缩得到的反应混合物。首先与乙酸一起进行共沸蒸馏，然后与DMF一起进行共沸蒸馏。得到呈油状残留物的H-Arg-Pro-OBzl·2HCl，用DMF稀释，得到的体积为约380L。得到的溶液直接用于下一步化学步骤(参见实施例7)。收率：100％。纯度(HPLC)：96％。
实施例6：制备Boc-D-Phe-Pro-OPfp
在≤24℃向Boc-D-Phe-Pro-OH(33.33kg；Bachem AG，瑞士)在乙酸乙酯(183L)的悬浮液中加入HOPfp(17.78kg)在乙酸乙酯(1OL)中的溶液。在-6℃向得到的反应混合物中缓慢加入DCC(21.44kg)在乙酸乙酯(83.3L)中的溶液。然后使得到的混合物升温至室温。通过HPLC监测偶联反应的完成(约2h)。
通过过滤除去DCU盐并用乙酸乙酯洗涤。在真空蒸发得到的滤液直到残留体积达到约80L。与甲苯一起进行多次共沸蒸馏。使得到的油状残留物在石油醚中沉淀。过滤得到的固体，用石油醚洗涤并在真空干燥以得到26.3kg(54％)Boc-D-Phe-Pro-OPfp，纯度为99.3％(HPLC)。
实施例7：制备Boc-D-Phe 1 -Pro-Arg-Pro-OBzl·HCl(SEQ ID  NO4)
在20℃用DMF(360L)稀释H-Arg3-Pro-OBzl·2HCl(103.00kg；561L溶液；参见实施例5)的溶液。在低于55℃真空蒸发DMF(82L)。然后在20℃向H-Arg3-Pro-OBzl·2HCl的溶液加入Boc-D-Phe1-Pro-OPfp(121.54kg；参见实施例6)。在0℃采用TEA(58L)调节得到的混合物的pH值至6.5。根据HPLC监测的指示，在0℃反应约20h，使其反应完成。
过滤掉得到的悬浮液的固体部分，并用DMF洗涤所述固体部分。得到的滤液在真空浓缩直到残留的体积为约385L。加入去离子水、NaCl和乙酸乙酯的混合物。分离各相，依次用NaHCO3水溶液、Na2CO3水溶液、在食盐水中的HCl溶液以及最后用食盐水洗涤得到的有机相。在真空浓缩有机相，得到油状残留物，通过与甲苯一起共沸蒸馏干燥，并在20℃在二异丙醚中沉淀。过滤得到的悬浮液，得到固体，用二异丙醚洗涤多次，并在真空下干燥，得到106kg的Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OBzl·HCl(SEQ ID NO4)，纯度为96％(HPLC)。
实施例8：制备Boc-D-Phe 1 -Pro-Arg-Pro-OH(SEQ ID NO4)
在20℃用TFA/THF(50/50，V/V，0.03L)的混合物调节Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OBzl·HCl(SEQ ID NO4)(33.58kg，参见实施例7)在丙酮(67L)中的溶液的pH值至4。向钯/炭(3.36kg)在丙酮(17L)中的悬浮液中加入得到的混合物。在20℃在3bar氢气压力进行氢化反应至少2h。通过HPLC监测氢化反应的完成。
将反应混合物经过纤维素滤芯过滤。得到的滤饼用丙酮洗涤数次。合并的滤液在真空下浓缩。通过采用丙酮和甲苯的混合物与得到的油状残留物共沸蒸馏而使其干燥。采用乙酸乙酯稀释得到的油状残留物，并倒入二异丙醚中。过滤得到的悬浮液，并用二异丙醚洗涤得到的沉淀多次，在真空下干燥，得到31.4kg的Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH(SEQ ID NO4)，纯度为99.4％(HPLC)。
实施例9：制备Boc-D-Phe 1 -Pro-Arg-Pro-Gly 5 -Gly-Gly-Gly-Asn- -Gly 10 -OBzl(SEO ID NO2)
在≤22℃采用TEA(9L)调节H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl·TFA(SEQ ID NO5)(25.20kg，参见实施例4)在DMF(504L)和去离子水(25L)中的溶液的pH值至6.5-7。在≤22℃缓慢加入Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH(SEQ ID NO4)(25.46kg，参见实施例8)和HOBt(1.02kg)。在≤12℃向得到的反应混合物中缓慢加入DIC(9.5L)。在≤12℃采用TEA(0.3L)调节得到的混合物的pH值至7-7.5。根据HPLC和TLC监测指示，在10℃反应10天直至反应完成。
真空浓缩得到的反应混合物，得到油状残留物，在乙酸乙酯和二异丙醚的混合物中沉淀。多次除去上清液，并用相同体积的二异丙醚代替。过滤所述混合物得到固体，用二异丙醚洗涤三次，在真空干燥，得到30.50kg(76％)的Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl(SEQ IDNO2)，纯度为83.4％(HPLC)。
实施例10：制备Boc-D-Phe 1 -pro-Arg-Pro-Gly 5 -Gly-Gly-Gly-Asn- -Gly 10 -OH(SEQ ID NO2)
将Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl(SEQ ID NO2)(23.43kg净肽重量，参见实施例9)在丙酮(43L)和去离子水(9L)的混合物中的溶液加入到钯/炭(0.75kg)在丙酮(3L)的悬浮液中。在20℃在约3bar氢气压力进行氢化反应11h。通过HPLC监测氢化反应的完成。
向得到的反应混合物加入去离子水(36L)，并且将所述反应混合物经过纤维素滤芯过滤。得到的滤饼用去离子水和丙酮的2：8混合物洗涤数次。合并的滤液在真空下浓缩。通过采用DMF和甲苯的混合物与得到的残留物共沸蒸馏而使其干燥，得到21.5kg的Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH(SEQ ID NO2)，纯度为80％(HPLC)。
实施例11：制备Boc-Tyr(Bzl)-Leu 20 -OBzl
将H-Leu-OBzl·对甲苯磺酸盐(22.2kg；Bachem AG，瑞士)悬浮在乙酸乙酯(108L)中，然后在室温加入TEA(约7.1L)。将Boc-Tyr(Bzl)-OH(20kg；Senn Chemicals，瑞士)和HOBt(7.3kg)以固体形式加入。在-6℃向得到的混合物中加入DCC(12.2kg)在DMF(40L)中的溶液。通过TLC和HPLC监测所述反应的完成。
过滤除去产生的DCU。依次采用KHSO4水溶液和食盐水的混合物、KHSO4水溶液、NaHCO3水溶液和食盐水洗涤得到的滤液。真空蒸发得到的有机相。得到的残留物溶于乙酸乙酯中，然后在石油醚中沉淀。过滤固体，用石油醚洗涤并在真空干燥。在母液溶液真空浓缩并在石油醚中沉淀后再次得到产物。过滤固体，用石油醚洗涤并在真空干燥。混合两次得到的产物，得到25.9kg(84％)的Boc-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl，纯度为97％(HPLC)。
实施例12：制备H-Tyr(Bzl)-Leu 20 -OBzl·TFA
在20℃向Boc-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(25.9kg,参见实施例11)、苯酚(1.3kg)、甲苯(104L)和THF(21L)的混合物中缓慢加入TFA(83L)。在20℃反应完成。通过HPLC监测裂解反应的完成。
在真空蒸发得到的反应混合物。采用甲苯和THF的混合物进行共沸蒸馏。然后向残留物中加入乙酸乙酯和石油醚。过滤固体，用乙酸乙酯和石油醚的混合物洗涤，然后用石油醚洗涤，最后在真空下干燥，得到23.7kg(89％)的H-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl·TFA，纯度为98％(HPLC)。
实施例13：制备Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu 20 -OBzl (SEQ ID NO6)
向H-Tyr(Bzl)-Leu-OBzl·TFA(23.7kg，参见实施例12)在DMF(80L)中的溶液中加入Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-OSu(42.90kg，Senn Chemicals，瑞士)。在0℃用DIPEA缓慢调节得到的反应混合物的pH值至7-7.5。采用HPLC监测偶联反应的完成。
真空蒸发得到的反应混合物，并将油状残留物倒入处理过的水中。过滤固体，用处理过的水洗涤，在乙腈和处理过的水的混合物中再次制成浆料，最后在真空干燥，得到40.3kg的Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO6)，纯度为92％(HPLC)。
实施例14：制备H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu 20 - OBzl·TFA(SEO ID NO6)
在15℃向TFA(117L)、苯酚(5.87kg)、甲苯(470L)和THF(94L)的混合物中缓慢加入Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO6)(117.45kg，参见实施例13)。在≤17℃向得到的混合物中缓慢加入另外的TFA(282L)。在15℃完成所述反应。通过HPLC监测裂解反应的完成(3h)。
在低于35℃在真空蒸发得到的反应混合物。通过与甲苯/THF的混合物共沸蒸馏以及然后与甲苯共沸蒸馏而除去残留的TFA。向得到油状的残留物加入MTBE(825L)。然后，向得到的悬浮液加入石油醚。冷却后，过滤得到的固体，并用石油醚洗涤多次。在石油醚中再次悬浮并过滤后，用石油醚洗涤得到的固体。再次重复该操作。然后固体在真空干燥，得到114.86kg(96％)的H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl·TFA(SEQ ID NO6)，纯度为96％(HPLC)。
实施例15：制备Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile 15 -Pro- -OH·DCHA(SEQ ID NO7)
向H-Ile-Pro-OH·TFA(36kg，Bachem AG，瑞士)在DMF(433L)中的溶液缓慢加入Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-OSu(62kg，SennChemicals，瑞士)。在0℃用DIPEA调节pH值至7-7.5。通过HPLC监测反应的完成。
在真空下蒸发得到的反应混合物，并用乙酸乙酯稀释得到的油状残留物。用KHS04水溶液和食盐水洗涤得到的混合物。在真空蒸发得到的有机相，并通过与甲苯共沸蒸馏来干燥所述油状残留物。用甲苯稀释得到的油状残留物，并用DCHA调节pH值至7-7.5。然后向得到的混合物中加入石油醚。从而将产生的固体过滤，用石油醚洗涤并在真空干燥，得到102kg的Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-OH·DCHA(SEQ ID NO7)，纯度为89％(HPLC)。
实施例16：制备Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile 15 -Pro-Glu(OBzl)- -Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu 20 -OBzl(SEO ID NO8)
在≤24℃向H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl·TFA(SEQ ID NO6)(110.39kg，净肽重量，参见实施例14)在DMF(451L)中的溶液中缓慢加入Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro--OH·DCHA(SEQ ID NO7)(98.88kg，参见实施例15)和HOBt(13.82kg)。在-6℃向得到的混合物中分小份加入EDC·HCl(22.99kg)。在-6℃用TEA(12L)调节得到的反应混合物的pH值至6.5-7。在10℃通过HPLC监测偶联反应的完成。
过滤除去盐。在真空蒸发得到的滤液。得到的油状残留物(470L)在NaHCO3溶液中沉淀。过滤固体并用处理过的水洗涤多次。在处理过的水中再次悬浮后，加入乙腈。然后冷却得到的悬浮液。过滤固体，用水洗涤并在真空干燥，得到160.34kg(88％)的Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)--Leu20-OBzl(SEQ ID NO8)，纯度为90％(HPLC)。
实施例17：制备H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile 15 -Pro-Glu(OBzl)- -Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu 20 -OBzl·TFA(SEQ ID NO8)
在≤l5℃向TFA(72L)、甲苯(289L)和THF(6L)的混合物加入Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)--Leu20-OBzl(SEQ ID NO8)(72.24kg，参见实施例16)。在≤22℃向得到的混合物中缓慢加入另外的TFA(159L)。在20℃反应2.5h使反应完成(通过HPLC监测)。真空蒸发反应混合物。通过与甲苯和THF的混合物进行多次共沸蒸馏而除去残留的TFA。用甲苯稀释油状残留物并倒入二异丙基醚中。过滤固体，用二异丙基醚洗涤多次。在乙腈和二异丙基醚的混合物中再次悬浮后，然后过滤固体，用二异丙基醚洗涤多次，最后在真空干燥，得到61.7kg(87％)的H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)--Leu20-OBzl·TFA(SEQ ID NO8)，纯度为88.9％(HPLC)。
实施例18：制备Boc-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile 15 -Pro- -Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu 20 -OBzl(SEQ ID NO9)
在≤24℃向H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)--Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl·TFA(SEQ ID NO8)(61.63kg，参见实施例17)在DMF(264L)中的溶液缓慢加入Boc-Phe-OH(10.03kg；Senn Chemicals AG，瑞士)和HOBt(4.95kg)。在-5℃缓慢加入EDC·HCl(8.53kg)。在-5℃用DIPEA(47.5L)逐渐调节得到的反应混合物的pH值至6.5-7。使偶联反应在10℃反应23h至反应完成(通过HPLC监测)。
真空蒸发得到的反应混合物。得到的油状残留物在NaHCO3溶液中悬浮。过滤固体，用处理过的水洗涤多次，并在真空干燥，得到67.64kg(95％)的Boc-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO9)，纯度为87.9％(HPLC)。
实施例19：制备H-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile 15 -Pro- -Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu 20 -OBzl·TFA(SEQ ID NO9)
在15℃向TFA(68L)、苯酚(3.38kg)、甲苯(271L)和THF(54L)的混合物中分小份加入B0c-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro--Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO9)(67.66kg，参见实施例18)。在15℃向得到的混合物中缓慢加入另外的TFA(149L)。通过HPLC监测裂解反应的完成(4.3h)。
得到的反应混合物在真空蒸发。通过与甲苯和THF的混合物进行多次共沸蒸馏除去残留的TFA。用甲苯稀释油状残留物并倒入二异丙基醚中。过滤固体，用二异丙基醚洗涤多次，并在真空干燥，得到67.25kg(99％)的H-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro--Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl·TFA(SEQ ID NO9)，纯度为86.6％(HPLC)。
实施例20：制备Boc-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile 15 - -Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu 20 -OBzl(SEQ ID NO3)
在≤20℃向H-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)--Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl·TFA(SEQ ID NO9)(60.46kg净肽重量，参见实施例19)在DMF(370L)中的溶液中分小份加入Boc-Asp(OBzl)11-OH(20.22kg)(Senn Chemicals AG，瑞士)和HOBt(8.42kg)。在-5℃向得到的反应混合物中缓慢加入EDC·HCl(13.38kg)。在-5℃用DIPEA(27L)逐渐调节所述得到的反应混合物的pH值至6.5-7。然后使偶联反应在10℃反应35h至反应完成(通过HPLC监测)。
然后得到的反应混合物在真空蒸发。将所述得到的油状残留物缓慢加入到NaHCO3水溶液中。得到的悬浮液过滤并在去离子水中再次悬浮。在过滤并且用去离子水洗涤多次并用乙腈和去离子水洗涤一次以后，在真空干燥所述得到的固体，得到64kg(96％)的Boc-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-
-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO3)，纯度为81.4％(HPLC)。
实施例21：制备H-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)- -Ile 15 -Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu 20 -OBzl·TFA (SEQIDNO3)
在低于15℃的温度向TFA(64L)、苯酚(3.2kg)、甲苯(265L)和THF(51L)的混合物中分小份加入Boc-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)--Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO3)(64.00kg，参见实施例20)。在≤15℃向得到的反应混合物缓慢加入另外的TFA(141L)。裂解反应在15℃进行4.8h(由HPLC监测)。
得到的反应混合物在真空浓缩。在20℃将所述得到的油状残留物加入到二异丙基醚中进行沉淀。过滤所述得到的悬浮液，在二异丙基醚中再次悬浮并再次过滤。用二异丙基醚洗涤得到的固体，并在真空干燥，得到61.4kg(净肽重量)(95％)的H-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)--Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl·TFA(SEQ ID NO3)，纯度为77.6％(HPLC)。
实施例22：制备Boc-D-Phe 1 -Pro-Arg-Pro-Gly 5 -Gly-Gly-Gly- Asn-Gly 10 -Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile 15 -Pro-Glu(OBzl)- -Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu 20 -OBzl(SEQ ID NO1)
在≤24℃向Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH(SEQ ID NO2)(65.47kg，参见实施例10)在DMF(345L)的溶液中分小份加入H-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl·TFA(SEQ ID NO3)(104.40kg，参见实施例21)和HOBt(8.42kg)。在-5℃缓慢加入EDC·HCl(12.46kg)。在-5℃用TEA(16.5L)逐渐调节所述得到的反应混合物的pH值至6.5-7。偶联反应在-5℃进行22h直至反应完成(由HPLC监测)。
用去离子水缓慢稀释所述得到的反应混合物。过滤所述得到的悬浮液，用去离子水洗涤，并在真空干燥，得到72kg(50％)的Boc-D-1Phe-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp(OBzl)--Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)--Leu20-OBzl(SEQ ID NO1)，纯度为81.4％(HPLC)。
实施例23：制备H-D-Phe 1 -Pro-Arg-Pro-Gly 5 -Gly-Gly-Gly- -Asn-Gly 10 -Asp-Phe-Glu-Glu-Ile 15 -Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu 20 -OH·2TFA (比伐卢定)(SEQ ID NO1)
将Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)--Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO1)(15.00kg，参见实施例22)在乙酸(53L)中的悬浮液加入到钯/炭(1.13kg)、去离子水(6L)和乙酸(5L)的混合物中。在≤37℃在3bar氢气压力下进行氢化反应(由HPLC监测)。
在反应完成后(5h)，将得到的反应混合物冷却并用去离子水和乙酸稀释。将反应混合物经过纤维素滤芯过滤，并用乙酸和处理过的水的混合物将该纤维素滤芯洗脱多次。得到的滤液在真空浓缩。采用卡尔·费歇尔滴定法检测所述得到的残留物的含水量(含水量<5.0％)。
然后向所述油状的残留物中加入甲苯，接着加入TFA。裂解反应的完成(一小时以后)采用HPLC进行监测。
得到的反应混合物在真空浓缩。将所述得到的油状残留物加入到二异丙基醚中进行沉淀。过滤所述得到的悬浮液以得到固体，并用二异丙基醚洗涤多次，然后在真空干燥，得到8.41kg(净肽重量)(78％)的粗制的H-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Glys-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10--Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-H·2TFA(比伐卢定)(SEQ ID NO1)，比伐卢定粗品的纯度为65％(HPLC)。通过HPLC检测发现该粗品中不含有D-Phe12-比伐卢定，即在位置12没有发生外消旋化。
采用制备级HPLC在C18反相固定相上纯化所述粗制的肽。第一步，采用醋酸铵/水/乙腈梯度洗脱纯化所述粗制的肽，然后在第二步，采用三氟乙酸/水/乙腈梯度洗脱。对包含有纯产物的洗脱的流分进行浓缩并冻干，得到白色粉末状的5.89kg(70％，以粗制的肽中比伐卢定的含量计算)的H-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp-Phe-Glu--Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-H·2TFA(比伐卢定)(SEQ IDNO1)，纯度为99％(HPLC)。没有检测到D-Phe12-比伐卢定和D-Tyr19-比伐卢定，并且检测的彼此杂质不超过0.2％(HPLC)。

Claims (7)

1.选自以下的组的肽
(vi)式(X)的侧链保护的肽
H-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO8)
                                               (X)，
其中P3是可通过催化氢化反应除去的保护基团；
(vii)式(XII)的侧链保护的肽
P4-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO9)                               (XII)，
其中P3为如上定义；以及P4是与式X的肽的侧链保护基团正交的和与P3正交的保护基团；或P4是氢；
(viii)式(XIV)的侧链保护的肽
P5-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO3)                               (XIV)，
其中P5是与式XII和XIII的肽/氨基酸的侧链保护基团正交的和与P3正交的保护基团；以及P3为如上定义；除了Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile15-Pro--Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu20-OtBu以外。
(ix)式(III)的侧链保护的肽
H-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO3)                                (III)，
其中P3为如上定义，除了H-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)--Glu(OtBu)-Ile15-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu20--OtBu以外；以及
(x)式(IV)的侧链保护的肽
P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp--Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3
(SEQ ID NO1)                                (IV)，
其中P1是对催化氢化反应稳定的保护基团，P3为如上定义；
除了
Boc-D-Phe1-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly10-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile15-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu20-OtBu以外。
2.根据权利要求1所述的肽，其中式X的侧链保护的肽是H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)--Leu20-OBzl(SEQ ID NO8)。
3.根据权利要求1所述的肽，其中式XII的侧链保护的肽是Boc-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)--Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO9)，或H-Phe-Glu(OBzl)--Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO9)。
4.根据权利要求1所述的肽，其中式XIV的侧链保护的肽是Boc-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-PrO-Glu(OBzl)--Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl   (SEQ ID NO3)。
5.根据权利要求1所述的肽，其中式III的侧链保护的肽是H-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)--Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl   (SEQ ID NO3)。
6.根据权利要求1所述的肽，其中式IV的侧链保护的肽是Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp(OBzl)--Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)--Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl   (SEQ ID NO1)。
7.根据权利要求1至6的任一项所述的任意的肽的作为合成比伐卢定的中间体的用途。
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