TW201630927A - 比伐盧定（Ｂｉｖａｌｉｒｕｄｉｎ）的製造方法 - Google Patents
比伐盧定（Ｂｉｖａｌｉｒｕｄｉｎ）的製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- TW201630927A TW201630927A TW105115041A TW105115041A TW201630927A TW 201630927 A TW201630927 A TW 201630927A TW 105115041 A TW105115041 A TW 105115041A TW 105115041 A TW105115041 A TW 105115041A TW 201630927 A TW201630927 A TW 201630927A
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- gly
- glu
- pro
- obzl
- peptide
- Prior art date
Links
- 108010055460 bivalirudin Proteins 0.000 title claims abstract description 63
- 229960001500 bivalirudin Drugs 0.000 title claims abstract description 60
- OIRCOABEOLEUMC-GEJPAHFPSA-N bivalirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 OIRCOABEOLEUMC-GEJPAHFPSA-N 0.000 title claims abstract description 54
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 70
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 15
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 283
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 34
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 29
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 218
- 238000009903 catalytic hydrogenation reaction Methods 0.000 claims description 34
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 abstract description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 16
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 104
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 87
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 69
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 63
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 62
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 62
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 61
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 51
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 49
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 48
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 46
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 42
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 42
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 41
- -1 Boc-protected amino Chemical group 0.000 description 38
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 38
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 38
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 38
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 37
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 37
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 34
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 30
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 30
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 26
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 24
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 22
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 21
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 19
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 18
- ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N Diisopropyl ether Chemical compound CC(C)OC(C)C ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 17
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 17
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 16
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 16
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 16
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 15
- WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 1,2-Dichloroethane Chemical group ClCCCl WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 description 13
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 12
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 12
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 12
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 12
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 11
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 11
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 11
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000010533 azeotropic distillation Methods 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 9
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 9
- XBPCUCUWBYBCDP-UHFFFAOYSA-N Dicyclohexylamine Chemical compound C1CCCCC1NC1CCCCC1 XBPCUCUWBYBCDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 6
- BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N diisopropylcarbodiimide Natural products CC(C)NC(=O)NC(C)C BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 6
- 150000003839 salts Chemical group 0.000 description 6
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 5
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 5
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 5
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000007127 saponification reaction Methods 0.000 description 5
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 5
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- VUTZFAOGDXUYEJ-UHFFFAOYSA-N 1-[chloro(diphenyl)methyl]-4-methylbenzene Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1C(Cl)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 VUTZFAOGDXUYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JFLSOKIMYBSASW-UHFFFAOYSA-N 1-chloro-2-[chloro(diphenyl)methyl]benzene Chemical compound ClC1=CC=CC=C1C(Cl)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 JFLSOKIMYBSASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 4
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 4
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 4
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 4
- 239000012038 nucleophile Substances 0.000 description 4
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 4
- 230000006340 racemization Effects 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- HBEJJYHFTZDAHZ-QMMMGPOBSA-N tert-butyl (2s)-2-amino-4-methylpentanoate Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)OC(C)(C)C HBEJJYHFTZDAHZ-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- JBWKIWSBJXDJDT-UHFFFAOYSA-N triphenylmethyl chloride Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(C=1C=CC=CC=1)(Cl)C1=CC=CC=C1 JBWKIWSBJXDJDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SOHLZANWVLCPHK-LBPRGKRZSA-N (2s)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-4-oxo-4-phenylmethoxybutanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(=O)OCC1=CC=CC=C1 SOHLZANWVLCPHK-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 3
- CNBUSIJNWNXLQQ-NSHDSACASA-N (2s)-3-(4-hydroxyphenyl)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]propanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 CNBUSIJNWNXLQQ-NSHDSACASA-N 0.000 description 3
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N N-Methylmorpholine Chemical compound CN1CCOCC1 SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 3
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 3
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 3
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 3
- GNTDGMZSJNCJKK-UHFFFAOYSA-N divanadium pentaoxide Chemical compound O=[V](=O)O[V](=O)=O GNTDGMZSJNCJKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 3
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 3
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 3
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 3
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KSDTXRUIZMTBNV-INIZCTEOSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)butanedioic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 KSDTXRUIZMTBNV-INIZCTEOSA-N 0.000 description 2
- GETTZEONDQJALK-UHFFFAOYSA-N (trifluoromethyl)benzene Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC=C1 GETTZEONDQJALK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FPIRBHDGWMWJEP-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxy-7-azabenzotriazole Chemical compound C1=CN=C2N(O)N=NC2=C1 FPIRBHDGWMWJEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BWZVCCNYKMEVEX-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-Trimethylpyridine Chemical compound CC1=CC(C)=NC(C)=C1 BWZVCCNYKMEVEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OZJPLYNZGCXSJM-UHFFFAOYSA-N 5-valerolactone Chemical compound O=C1CCCCO1 OZJPLYNZGCXSJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-MRVPVSSYSA-N D-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-MRVPVSSYSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 description 2
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 description 2
- QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N Hydroquinone Chemical compound OC1=CC=C(O)C=C1 QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 2
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 2
- 150000004945 aromatic hydrocarbons Chemical class 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001509 aspartic acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UORVGPXVDQYIDP-UHFFFAOYSA-N borane Chemical compound B UORVGPXVDQYIDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000004744 butyloxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- MVPPADPHJFYWMZ-UHFFFAOYSA-N chlorobenzene Chemical compound ClC1=CC=CC=C1 MVPPADPHJFYWMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MGNZXYYWBUKAII-UHFFFAOYSA-N cyclohexa-1,3-diene Chemical compound C1CC=CC=C1 MGNZXYYWBUKAII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GGSUCNLOZRCGPQ-UHFFFAOYSA-N diethylaniline Chemical compound CCN(CC)C1=CC=CC=C1 GGSUCNLOZRCGPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000012065 filter cake Substances 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010019832 glycyl-asparaginyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hcl hcl Chemical compound Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 description 2
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- IWDCLRJOBJJRNH-UHFFFAOYSA-N p-cresol Chemical compound CC1=CC=C(O)C=C1 IWDCLRJOBJJRNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001148 pentyloxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical class [H]S* 0.000 description 2
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 2
- 239000003021 water soluble solvent Substances 0.000 description 2
- ZPRHVPHDENDZTP-CABCVRRESA-N (2s)-1-[(2r)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-3-phenylpropanoyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound C([C@@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 ZPRHVPHDENDZTP-CABCVRRESA-N 0.000 description 1
- ZAVSPTOJKOFMTA-SFHVURJKSA-N (2s)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-3-(4-phenylmethoxyphenyl)propanoic acid Chemical compound C1=CC(C[C@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)=CC=C1OCC1=CC=CC=C1 ZAVSPTOJKOFMTA-SFHVURJKSA-N 0.000 description 1
- ZYJPUMXJBDHSIF-NSHDSACASA-N (2s)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-3-phenylpropanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ZYJPUMXJBDHSIF-NSHDSACASA-N 0.000 description 1
- RHUYHJGZWVXEHW-UHFFFAOYSA-N 1,1-Dimethyhydrazine Chemical compound CN(C)N RHUYHJGZWVXEHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DURPTKYDGMDSBL-UHFFFAOYSA-N 1-butoxybutane Chemical compound CCCCOCCCC DURPTKYDGMDSBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZOSMPLGIBBPIGW-UHFFFAOYSA-N 1-methylpyrrole 1H-pyridin-2-one Chemical group N1C(C=CC=C1)=O.CN1C=CC=C1 ZOSMPLGIBBPIGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001462 1-pyrrolyl group Chemical group [*]N1C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- IHWDSEPNZDYMNF-UHFFFAOYSA-N 1H-indol-2-amine Chemical group C1=CC=C2NC(N)=CC2=C1 IHWDSEPNZDYMNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XBNGYFFABRKICK-UHFFFAOYSA-N 2,3,4,5,6-pentafluorophenol Chemical compound OC1=C(F)C(F)=C(F)C(F)=C1F XBNGYFFABRKICK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HWBAHOVOSOAFLE-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]acetyl]amino]acetic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O HWBAHOVOSOAFLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QMOQBVOBWVNSNO-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[2-[(2-azaniumylacetyl)amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetate Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O QMOQBVOBWVNSNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCQCHGYLTSGIGX-GHXANHINSA-N 4-[[(3ar,5ar,5br,7ar,9s,11ar,11br,13as)-5a,5b,8,8,11a-pentamethyl-3a-[(5-methylpyridine-3-carbonyl)amino]-2-oxo-1-propan-2-yl-4,5,6,7,7a,9,10,11,11b,12,13,13a-dodecahydro-3h-cyclopenta[a]chrysen-9-yl]oxy]-2,2-dimethyl-4-oxobutanoic acid Chemical compound N([C@@]12CC[C@@]3(C)[C@]4(C)CC[C@H]5C(C)(C)[C@@H](OC(=O)CC(C)(C)C(O)=O)CC[C@]5(C)[C@H]4CC[C@@H]3C1=C(C(C2)=O)C(C)C)C(=O)C1=CN=CC(C)=C1 QCQCHGYLTSGIGX-GHXANHINSA-N 0.000 description 1
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N Asn-Gly Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- YZQCXOFQZKCETR-UWVGGRQHSA-N Asp-Phe Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 YZQCXOFQZKCETR-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 101800001415 Bri23 peptide Proteins 0.000 description 1
- 102400000107 C-terminal peptide Human genes 0.000 description 1
- 101800000655 C-terminal peptide Proteins 0.000 description 1
- MHZGKXUYDGKKIU-UHFFFAOYSA-N Decylamine Chemical class CCCCCCCCCCN MHZGKXUYDGKKIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 239000007821 HATU Substances 0.000 description 1
- BBIXOODYWPFNDT-CIUDSAMLSA-N Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O BBIXOODYWPFNDT-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 238000003109 Karl Fischer titration Methods 0.000 description 1
- RNKSNIBMTUYWSH-YFKPBYRVSA-N L-prolylglycine Chemical compound [O-]C(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 RNKSNIBMTUYWSH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N Methyl tert-butyl ether Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102400000108 N-terminal peptide Human genes 0.000 description 1
- 101800000597 N-terminal peptide Proteins 0.000 description 1
- 101800004196 Peptide P4 Proteins 0.000 description 1
- 101800005164 Peptide V Proteins 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N Ruthenium Chemical compound [Ru] KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 1
- 239000012317 TBTU Substances 0.000 description 1
- 101000712605 Theromyzon tessulatum Theromin Proteins 0.000 description 1
- 229940122388 Thrombin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N Trifluoroethanol Chemical compound OCC(F)(F)F RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102400000700 Tumor necrosis factor, membrane form Human genes 0.000 description 1
- 101800000716 Tumor necrosis factor, membrane form Proteins 0.000 description 1
- 239000003875 Wang resin Substances 0.000 description 1
- 241000289690 Xenarthra Species 0.000 description 1
- VORIUEAZEKLUSJ-UHFFFAOYSA-M [(6-chlorobenzotriazol-1-yl)oxy-(dimethylamino)methylidene]-dimethylazanium;trifluoroborane;fluoride Chemical compound [F-].FB(F)F.C1=C(Cl)C=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1 VORIUEAZEKLUSJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NERFNHBZJXXFGY-UHFFFAOYSA-N [4-[(4-methylphenyl)methoxy]phenyl]methanol Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1COC1=CC=C(CO)C=C1 NERFNHBZJXXFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGYIJVNZSDYBOE-UHFFFAOYSA-N [CH2]C1=CC=NC=C1 Chemical group [CH2]C1=CC=NC=C1 DGYIJVNZSDYBOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPQVGDGSRVMNMR-JCTPKUEWSA-N [[(z)-(1-cyano-2-ethoxy-2-oxoethylidene)amino]oxy-(dimethylamino)methylidene]-dimethylazanium;tetrafluoroborate Chemical compound F[B-](F)(F)F.CCOC(=O)C(\C#N)=N/OC(N(C)C)=[N+](C)C FPQVGDGSRVMNMR-JCTPKUEWSA-N 0.000 description 1
- CLZISMQKJZCZDN-UHFFFAOYSA-N [benzotriazol-1-yloxy(dimethylamino)methylidene]-dimethylazanium Chemical compound C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1 CLZISMQKJZCZDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KXKVLQRXCPHEJC-UHFFFAOYSA-N acetic acid trimethyl ester Natural products COC(C)=O KXKVLQRXCPHEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940003354 angiomax Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-L aspartate group Chemical group N[C@@H](CC(=O)[O-])C(=O)[O-] CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-L 0.000 description 1
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- UNTBPXHCXVWYOI-UHFFFAOYSA-O azanium;oxido(dioxo)vanadium Chemical compound [NH4+].[O-][V](=O)=O UNTBPXHCXVWYOI-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- MBRRYUQWSOODEO-LBPRGKRZSA-N benzyl (2s)-2-amino-4-methylpentanoate Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)OCC1=CC=CC=C1 MBRRYUQWSOODEO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 229910000085 borane Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 150000001733 carboxylic acid esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 1
- 150000008280 chlorinated hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 150000001804 chlorine Chemical class 0.000 description 1
- HGCIXCUEYOPUTN-UHFFFAOYSA-N cis-cyclohexene Natural products C1CCC=CC1 HGCIXCUEYOPUTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 description 1
- UVJHQYIOXKWHFD-UHFFFAOYSA-N cyclohexa-1,4-diene Chemical compound C1C=CCC=C1 UVJHQYIOXKWHFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N diethylamine Chemical compound CCNCC HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- LFAVEINQLWIXRA-UHFFFAOYSA-N ethyl 2-[(2-aminoacetyl)amino]acetate Chemical compound CCOC(=O)CNC(=O)CN LFAVEINQLWIXRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKLNYGDWYRKFKR-UHFFFAOYSA-N ethyl methyl sulfate Chemical compound CCOS(=O)(=O)OC JKLNYGDWYRKFKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 108010001064 glycyl-glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 150000008282 halocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 239000000852 hydrogen donor Substances 0.000 description 1
- 239000012442 inert solvent Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229910052741 iridium Inorganic materials 0.000 description 1
- GKOZUEZYRPOHIO-UHFFFAOYSA-N iridium atom Chemical compound [Ir] GKOZUEZYRPOHIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000005078 molybdenum compound Substances 0.000 description 1
- 150000002752 molybdenum compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 1
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 229910000510 noble metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229910052762 osmium Inorganic materials 0.000 description 1
- SYQBFIAQOQZEGI-UHFFFAOYSA-N osmium atom Chemical compound [Os] SYQBFIAQOQZEGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000006503 p-nitrobenzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1[N+]([O-])=O)C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000538 pentafluorophenyl group Chemical group FC1=C(F)C(F)=C(*)C(F)=C1F 0.000 description 1
- 150000002993 phenylalanine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-O phosphonium Chemical compound [PH4+] XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108010070643 prolylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 125000004076 pyridyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 229910052703 rhodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010948 rhodium Substances 0.000 description 1
- MHOVAHRLVXNVSD-UHFFFAOYSA-N rhodium atom Chemical compound [Rh] MHOVAHRLVXNVSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052707 ruthenium Inorganic materials 0.000 description 1
- DCKVNWZUADLDEH-UHFFFAOYSA-N sec-butyl acetate Chemical compound CCC(C)OC(C)=O DCKVNWZUADLDEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 1
- 235000015393 sodium molybdate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011684 sodium molybdate Substances 0.000 description 1
- TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N sodium molybdate (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 150000003512 tertiary amines Chemical class 0.000 description 1
- 239000003868 thrombin inhibitor Substances 0.000 description 1
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005270 trialkylamine group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003668 tyrosines Chemical class 0.000 description 1
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 description 1
- LEONUFNNVUYDNQ-UHFFFAOYSA-N vanadium atom Chemical compound [V] LEONUFNNVUYDNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004073 vulcanization Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000003799 water insoluble solvent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/10—Tetrapeptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/10—Tetrapeptides
- C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/1016—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本發明係關於一種經由5個片段彙集合成來製造為下式之二十聚體肽的比伐盧定(bivalirudin)之方法H-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OH (I)，以及關於其若干種肽中間物。
Description
本發明係關於一種為下式之二十聚體肽的比伐盧定之新穎彙集合成H-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OH (I)。
本發明另外係關於若干種作為比伐盧定合成中之中間物的經保護之肽。
藉由凝血酶進行蛋白水解加工在控制血液凝結中起關鍵作用。水蛭素(hirudin)為一種潛在的臨床凝血酶肽抑制劑，其由65個胺基酸組成。但較短之肽區段亦已證實有效治療血栓形成(一種危及生命之病狀)。
US 5,196,404揭示此等較短肽之一比伐盧定，其為有效凝血酶抑制劑。比伐盧定亦稱為水蛭肽(hirulog)-8、BG-8967、依盧丹(Efludan)、Angiomax®或Hirulog®且具有式I中所給出之胺基酸序列。
WO 98/50563描述一種藉由重組技術來製備多種肽(包括比伐盧定)之方法。該方法包含使肽表現為融合蛋白質之一部分，隨後由醯基受體自該融合蛋白質釋放該肽。
Okayama等人Chem.Pharm.Bull. 1996, 44,1344-1350及Steinmetzer等人Eur.J.Biochem. 1999, 265,598-605設計在王樹脂(Wang resin)上固相合成不同水蛭肽。王樹脂需要用濃三氟乙酸使肽自樹脂裂解。在製備比伐盧定之類似固相合成方法中，WO 91/02750揭示一種依序方法：將單一經Boc保護之胺基酸連接於Boc-L-白胺酸-o-二乙烯基苯樹脂，隨後使用HF/對甲酚/硫酸乙基甲酯同時脫除保護基及脫離，且隨後凍乾及純化。在兩種情況下，使肽自樹脂裂解需要侵蝕性酸性條件，可能伴隨整體脫除保護基且可能導致與胺基酸殘基進行不欲副反應，因此不利地影響產物純度。此外，副反應通常藉由錯誤併入、單一胺基酸之雙重命中(double-hit)及/或外消旋化而出現在固相合成中且產生具有極類似於目標肽之結構的副產物。因此難以純化且導致產量損失。當尚連接於固體載體時，尤其較長肽易採用不規則構形，使得更難以將其他胺基酸連接於生長中之鏈。因此，此問題隨肽長度增加而增加。
WO 2007/033383揭示一種製造比伐盧定之方法，其係基於固相合成或固相合成與溶液合成之組合(混合方法)。在一具體實例中，在高度酸不穩定樹脂上製備比伐盧定肽序列。在另一具體實例中，藉由使側鏈經保護之N端肽片段與側鏈經保護之C端肽片段偶合且隨後使用強酸性條件脫除保護基來製備比伐盧定。在此情況下，該等N端片段以及該C端片段之前驅體(亦即減去Leu之肽序列)皆藉由固相合成來製備。此策略之缺點之一為實質上形成D-Tyr19-比伐盧定。此雜質難以移除，因此需要額外努力、成本及產量損失來獲得純化產物。另外，WO 2007/033383之實施例中所獲得之經純化比伐盧定的量僅在數公克範圍內，說明此方法不適於大
規模製造高純度比伐盧定。
本發明之一目標在於提供一種更有效之比伐盧定合成，其克服線性固相合成之已知缺點且適於工業規模製造。此目標已藉由如申請專利範圍第1項之方法、如申請專利範圍第19項之肽片段及如申請專利範圍第29項之此等肽片段之用途來達成。較佳具體實例構成附屬項申請專利範圍第2-18及20-28項之標的。
本發明係關於一種按照彙集方法之方法，亦即分別合成個別片段且接著在溶液相中偶合來構建所需肽。彙集合成之挑戰在於找到適合的片段及其偶合順序以克服彙集合成之已知缺點。此等缺點為偶合及分離期間之溶解性問題、相較於固相合成反應速率較低、及偶合期間C端片段外消旋化危險高得多。比伐盧定由20個胺基酸殘基組成，以至於存在大量的可能片段及偶合順序。另外，比伐盧定含有7個胺基酸殘基，亦即-Arg3-、-Asn9-、-Asp11-、-Glu13-、-Glu14-、-Glu17-及-Glu18-，所有均具有需要適當保護及脫除保護之反應性側鏈官能基。單一片段之N端及C端亦需要適當保護及脫除保護，因此增加找到達成本發明目標之途徑的挑戰性。
申請者意外地發現式I之比伐盧定宜藉由如下所定義之[(1+2)+(3+{4+5})]策略來構建。數字1、2及5表示式V、VI及X之3個肽片段，數字3表示式XIII之天冬胺酸衍生物，且數字4表示式XI之苯丙胺
酸衍生物。本發明係關於一種在溶液相中製造式I之比伐盧定的方法，其包含以下步驟：(a)使下式之視情況側鏈經保護之肽P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH(SEQ ID NO 4) (V)，其中P1為保護基，與下式之視情況側鏈經保護之肽反應H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2(SEQ ID NO 5) (VI)，其中P2為保護基，產生下式之視情況側鏈經保護之肽P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2(SEQ ID NO 2) (VII)，其中P1及P2如上所定義，(b)移除步驟(a)中所產生之肽的P2，產生下式之視情況側鏈經保護之肽P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH(SEQ ID NO 2) (II)，其中P1如上所定義，(c)使下式之側鏈經保護之肽H-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3
(SEQ ID NO 8) (X)，其中P3為保護基，與下式之苯丙胺酸反應P4-Phe12-OH (XI)，其中P4為保護基，產生下式之側鏈經保護之肽P4-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO 9) (XII)，其中P3及P4如上所定義，(d)移除步驟(c)中所產生之肽的P4，產生式XII之N端保護基經脫除及側鏈經保護之相應肽，(e)使步驟(d)中所產生之式XII之肽與下式之側鏈經保護之天冬胺酸反應P5-Asp11-OH (XIII)，其中P5為保護基，產生下式之側鏈經保護之肽P5-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO 3) (XIV)，其中P3及P5如上所定義，(f)移除步驟(e)中所產生之肽的P5，產生下式之視情況側鏈經保護之肽H-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO 3) (III)，
其中P3如上所定義，(g)使步驟(b)中所產生的式II之視情況側鏈經保護之肽與步驟(f)中所產生的式III之側鏈經保護之肽反應，產生下式之側鏈經保護之肽P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO 1) (IV)，其中P1及P3如上所定義，(h)移除步驟(g)中所產生之肽的P1、P3及側鏈保護基，產生式I之比伐盧定。
本發明之方法經由彙集片段合成，非常有效地合成比伐盧定，可容易適合於工業規模製造。
C端保護基P2(對於肽VI)及P3(對於肽X)可為與其他保護基正交之任何保護基。適合實例為可藉由皂化移除之C端保護基，如甲基(Me)或乙基(Et)，或可藉由催化性氫化移除之C端保護基。
在本發明方法之一具體實例中，在步驟(a)中，保護基P1為對催化性氫化穩定之保護基且保護基P2為可藉由催化性氫化移除且與視情況存在之側鏈保護基正交的保護基；在步驟(c)中，保護基P3為可藉由催化性氫化移除之保護基且保護基P4為與式X之肽之側鏈保護基及P3正交的保護基；且在步驟(e)中，保護基P5為與式XII及XIII之肽/胺基酸之側鏈保護基及P3正交的保護基，從而得到包含以下步驟之溶液相方法：(a)使下式之視情況側鏈經保護之肽P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH
(SEQ ID NO 4) (V)，其中P1為對催化性氫化穩定之保護基，與下式之視情況側鏈經保護之肽反應H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2(SEQ ID NO 5) (VI)，其中P2為可藉由催化性氫化移除且與視情況存在之側鏈保護基正交的保護基，產生下式之視情況側鏈經保護之肽P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2(SEQ ID NO 2) (VII)，其中P1及P2如上所定義，(b)移除步驟(a)中所產生之肽的P2，產生下式之視情況側鏈經保護之肽P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH(SEQ ID NO 2) (II)，其中P1如上所定義，(c)使下式之側鏈經保護之肽H-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO 8) (X)，其中P3為可藉由催化性氫化移除之保護基，與下式之苯丙胺酸反應P4-Phe12-OH (XI)，其中P4為與式X之肽之側鏈保護基及P3正交的保護基，
產生下式之側鏈經保護之肽P4-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO 9) (XII)，其中P3及P4如上所定義，(d)移除步驟(c)中所產生之肽的P4，產生式XII之N端保護基經脫除及側鏈經保護之相應肽，(e)使步驟(d)中所產生之式XII之肽與下式之側鏈經保護之天冬胺酸反應P5-Asp11-OH (XIII)，其中P5為與式XII及XIII之肽/胺基酸之側鏈保護基及P3正交的保護基，產生下式之側鏈經保護之肽P5-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO 3) (XIV)，其中P3及P5如上所定義，(f)移除步驟(e)中所產生之肽的P5，產生下式之視情況側鏈經保護之肽H-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO 3) (III)，其中P3如上所定義，(g)使步驟(b)中所產生的式II之視情況側鏈經保護之肽與步驟(f)中所產生的式III之側鏈經保護之肽反應，產生下式之側鏈經保護之肽P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-
Gly10-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO 1) (IV)，其中P1及P3如上所定義，(h)移除步驟(g)中所產生之肽之P1、P3及側鏈保護基，產生下式之比伐盧定H-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Ash-Gly10-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OH(SEQ ID NO 1) (I)。
此處及下文中，作為特性化兩個不同保護基之行為屬性的術語「正交(orthogonal)」應理解為意謂一保護基可藉由某種方法裂解而不會影響另一保護基。舉例而言，「與側鏈保護基正交之保護基」意謂可藉由某種方法裂解而不會影響側鏈保護基之保護基。
此策略之優點在於其可以商業規模應用，因此能夠製造具有極佳純度且每批數公斤量之比伐盧定而不形成難處理之雜質，如D-Phe12-比伐盧定、D Tyr19-比伐盧定或Asp9-比伐盧定。舉例而言，當使經保護之Asp-Phe12片段與式X之經保護之肽片段偶合時，形成5%D-Phe12-比伐盧定，此形成可意外地由本發明方法抑制。如本發明方法中所應用之催化性氫化的優點在於其為非常乾淨之反應方法，不同於其他脫除保護基方法，其不會誘發碳陽離子形成，使得由該等碳陽離子與目標肽之間的反應所產生之不欲副產物不會形成。比較之下，WO 2007/033383中所揭示之途徑中，藉由使用第三丁基(tBu；呈第三丁基醚或第三丁酯形式)來保護，第三丁基為僅可藉由酸解(例如用鹽酸或三氟乙酸)來裂解之保護基。此酸解會誘
發諸如第三丁基化酪胺酸之副產物形成，該等副產物由於具有相似物理化學性質而難以在最終產物中除去。酸解之另一缺點在於處置大量強酸(諸如三氟乙酸)對製造與環境皆產生安全問題，尤其是商業規模。
進一步比較之，若使用可藉由皂化移除之C端保護基(諸如Et)作為式VI及VII之肽之P2，則在鹼性條件下將其移除可誘發天冬醯胺殘基(-Asn9-)及精胺酸殘基(-Arg3-)實質上降解。即使既不用酸，亦不用鹼，而用酶促反應之較溫和方法(如用酶枯草桿菌蛋白(subtilisin)皂化)來實現皂化，亦觀察到天冬醯胺殘基之降解引起實質上形成Asp9-比伐盧定。
在本發明之單一反應步驟之前、期間及之後，所有肽片段以及所有偶合產物均可按原樣或以適合之鹽形式存在，視分子之物理化學性質及/或反應條件而定。適合之鹽為例如與三乙胺(TEA)、二環己基胺(DCHA)、鹽酸(HCl)及三氟乙酸(TFA)形成之鹽。
在步驟(h)中，P1、P3及側鏈保護基可隨後或同時移除。
較佳地，在步驟(h)中，首先同時移除P3及側鏈保護基，且隨後移除P1。
典型地，步驟(a)至(g)中每一者後所獲得之肽片段在進行下一步驟之前分離。申請者意外地發現，在步驟(h)中，在移除P1之前可無需分離在同時移除P3及側鏈保護基後所獲得之肽，同時獲得類似產量且對純度無負作用。此令人驚訝，因為通常分離步驟對於移除在隨後脫除保護基步驟中反應且由此降低目標肽之純度的副產物而言必不可少。此發現對整個製程之成本及時間具有積極作用且典型地使脫除P1之肽的產量較高，因為分離通常使產物有所損失。因此，在本發明方法之一更佳具體
實例中，在步驟(h)中，在移除P1之前不分離在同時移除P3及側鏈保護基後所獲得之肽。
對催化性氫化穩定之任何通常已知之保護基可用作P1。適合實例為第三丁氧羰基(Boc)、2-(聯苯-4-基)丙-2-基氧羰基(Bpoc)、2-(3,5-二甲氧基苯基)丙-2-基氧羰基(Ddz)、茀-9-基甲氧羰基(Fmoc)、金剛烷基-1-氧羰基(Adc)、第三戊氧羰基(Aoc)、二苯基膦基(Dpp)、2-(甲基磺醯基)乙氧羰基(Msc)及酞醯基(Pht)。P1較佳為Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc，P1更佳為Boc。
可使用分別與式II之片段(對於P4)、式XIII之胺基酸及式XIV之片段(對於P5)的側鏈保護基及P3正交之任何通常已知及適合之保護基作為保護基P4及P5。較佳地，P4及P5對催化性氫化穩定且與側鏈保護基及P3正交。舉例而言，適合保護基為Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc、Adc、Aoc、Dpp、Msc及Pht。P4及/或P5較佳為Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc；P4及/或P5更佳為Boc。
在本發明方法之一較佳具體實例中，P1、P4及P5中至少一者為Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc；P1、P4及P5中至少一者較佳為Boc。
可使用可藉由催化性氫化移除之任何通常已知之保護基作為保護基P3。適合實例為苯甲基(Bzl)、苯甲氧基甲基(Bom)、苯甲醯甲基(Pac)、4-硝基苯甲基(ONbz)、4-吡啶基甲基(Pic)及4-磺酸基苯甲基。P3較佳為Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic或4-磺酸基苯甲基，其限制條件為若P4或P5為Boc、Bpoc或Ddz，則P3不為Bom。P3更佳為Bzl。保護基Bom對酸敏感且保護基Boc、Bpoc及Ddz可由酸裂解，亦即Bom不與Boc、Bpoc
或Dzd正交。此處及下文中，此行為排除同時使用Bom與保護基Boc、Bpoc或Dzd中之一者。
可使用可藉由催化性氫化移除且在側鏈經保護之情況下同時與側鏈保護基正交之任何通常已知的保護基作為保護基P2。適合實例為Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic及4-磺酸基苯甲基。P2較佳為Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic或4-磺酸基苯甲基；P2更佳為Bzl。
在一較佳具體實例中，P2及P3中至少一者為Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic或4-磺酸基苯甲基，其限制條件為若P4或P5為Boc、Bpoc或Ddz，則P3不為Bom。P2與P3中至少一者較佳為Bzl。
在一更佳具體實例中，P1、P4及P5中至少一者為Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc；且P2及P3中至少一者為Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic或4-磺酸基苯甲基，其限制條件為若P4或P5為Boc、Bpoc或Ddz，則P3不為Bom。較佳地，P1、P4及P5中至少一者為Boc且P2及P3中至少一者為Bzl。
較佳地，在本發明之方法中，式III、IV、X及XII-XIV之側鏈經保護之肽/胺基酸經至少一個選自由Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic及4-磺酸基苯甲基所組成之群組的側鏈保護基保護；其限制條件為若P4或P5為Boc、Bpoc或Ddz，則側鏈保護基均不為Bom。
詳言之，在本發明之方法中，式III、IV、X及XII-XIV之側鏈經保護之肽/胺基酸經至少一個作為側鏈保護基之Bzl保護。
典型地，式V之肽的側鏈在精胺酸殘基處經適合側鏈保護基(諸如硝基)保護，以避免不欲副反應。典型地，式VI之肽的側鏈在天
冬醯胺殘基處經適合側鏈保護基保護，尤其對於N端經Fmoc保護，以避免不欲副反應。適合實例為三苯甲基(Trt)，尤其在N端經Fmoc保護之情況下。
意外地，申請者發現對於式V及VI之肽可無需側鏈保護，此便於其組裝與其偶合產物(亦即式VII之肽)之C端脫除保護基。此發現允許不考慮C端與側鏈保護之間的正交性，因此使途徑更為簡單。另一優點在於相應未經保護之起始物質比經保護之物質購買便宜，此對於大規模製造尤為重要。
較佳地，在本發明之方法中，在步驟(a)中，式V及VI之視情況側鏈經保護之肽中至少一者的側鏈未經保護。在兩種肽之側鏈皆未經保護之情況下，步驟(a)及(b)中所得之式VII及II之肽的側鏈亦未經保護。
最佳地，在本發明之方法中，在步驟(a)中，式V與VI之肽的側鏈皆未經保護；在步驟(c)中，式X之肽經至少一個選自由Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic及4-磺酸基苯甲基所組成之群組的側鏈保護基、較佳Bzl保護，其限制條件為若P4或P5為Boc、Bpoc或Ddz，則側鏈保護基均不為Bom；及在步驟(e)中，式X之天冬胺酸衍生物經選自由Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic及4-磺酸基苯甲基所組成之群組的側鏈保護基、較佳Bzl保護，其限制條件為若P4或P5為Boc、Bpoc或Ddz，則側鏈保護基均不為Bom。
甚至更佳地，在本發明之方法中，在步驟(a)中，式V與VI之肽的側鏈均未經保護；且在步驟(c)與(e)中，至少一個側鏈保護基為Bzl。
在本發明方法之一最佳具體實例中，在步驟(c)中，式X之肽的側鏈經保護4個麩胺酸及1個酪胺酸之側鏈的5個側鏈保護基保護，由此得到下式之肽H-Glu(OP6)-Glu(OP7)-Ile15-Pro-Glu(OP8)-Glu(OP9)-Tyr(P10)-Leu20-OP3(SEQ ID 8) (Xb)，其中P3為可藉由催化性氫化移除之保護基，P3較佳為Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic或4-磺酸基苯甲基；P3更佳為Bzl；且P6至P10各自獨立地選自由Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic及4-磺酸基苯甲基所組成之群組；P6至P10各自較佳為Bzl；且在步驟(e)中，式XIII之側鏈經保護之天冬胺酸為P5-Asp(OP11)11-OH，其中P5為與式XII及XIII之肽/胺基酸的側鏈保護基及P3正交之保護基；P5較佳對催化性氫化為穩定的且與側鏈保護基及P3正交；P5更佳為Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc；P5最佳為Boc；且P11係選自由Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic及4-磺酸基苯甲基所組成之群組；P11較佳為Bzl。
此處及下文中，對於C端與側鏈，縮寫「OP[數字]」表示酯(與側鏈及C端兩者之羧酸反應後)，而縮寫「P[數字]」表示醚。舉例而言，「OBzl」表示苯甲酯(與側鏈或C端之羧基反應後)，而縮寫「Bzl」表示苯甲醚(與例如酪胺酸之酚系羥基反應後)。
較佳地，在本發明之方法中，P1、P4及P5為Boc；P2、P3、P6、P7、P8、P9、P10及P11為Bzl；
更佳地，P1、P4及P5為Boc，P2、P3、P6、P7、P8、P9、P10及P11為Bzl且式V及VI之肽的側鏈未經保護，從而得到包含以下步驟之溶液相方法：(a)使Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH(SEQ ID NO 4)與H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl(SEQ ID NO 5)反應，產生Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl(SEQ ID NO 2)(b)移除步驟(a)中所產生之肽的Bzl，產生Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH(SEQ ID NO 2)(c)使H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID 8)與Boc-Phe12-OH反應，產生Boc-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO 9)，(d)移除步驟(c)中所產生之肽的Boc，產生N端保護基脫除之相應肽，
(e)使步驟(d)中所產生之肽與Boc-Asp(OBzl)11-OH反應，產生Boc-Asp(OBzl)11-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO 3)(f)移除步驟(e)中所產生之肽的Boc，產生H-Asp(OBzl)11-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO 3)(g)使步驟(b)中所產生之肽與步驟(f)中所產生之肽反應，產生Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO 1)，及(h)移除步驟(g)中所產生之肽的Boc、保護C端之Bzl及所有保護側鏈之Bzl，產生式I之比伐盧定。
此較佳具體實例非常簡單且無需複雜的保護基策略。
較佳地，在步驟(h)中，首先同時移除保護C端之Bzl及所有保護側鏈之Bzl，得到N端經Boc保護之比伐盧定Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OH(SEQ ID NO 1)，且隨後移除Boc。
較佳地，同時移除保護C端之Bzl及所有保護側鏈之Bzl後所獲得之N端經Boc保護的比伐盧定在移除Boc之前不分離。
C端保護基P2、P3以及側鏈保護基P6至P11在其可藉由催化性氫化移除之情況下可藉由熟習此項技術者已知之任何催化性氫化方法來移除。氫化可藉由元素氫或藉由使用適合之氫供體來完成，該氫供體如甲酸、甲酸銨、1,3-環已二烯、1,4-環已二烯或硼烷加合物(諸如tert-BuNH2．BH3)。適合氫化催化劑為例如基於貴金屬之氫化催化劑，尤其為稱為鉑類金屬之金屬，亦即銠、釕、鈀、鋨、銥及鉑。氫化催化劑宜在載體(諸如木炭)上。視所需活性而定，氫化催化劑可「中毒」以降低其活性，詳言之經硫化。
視情況，可將適合助催化劑添加至載體氫化中。該等助催化劑可為釩或鉬化合物，如氧化釩(V)(V2O5)、偏釩酸銨(NH4VO3)或鉬酸鈉(Na2MoO4)。
在一較佳具體實例中，催化劑再循環，此對生產成本與環境皆具有正面作用。對於催化劑再循環，可應用任何適於催化劑再循環之處理。
較佳地，移除步驟(b)及(h)中之至少一者在溶劑中以氫氣及鈀/木炭進行。可使用可溶解反應物之任何惰性液體溶劑作為溶劑。適用溶劑包括鹵化芳族烴，諸如氯苯及三氟甲苯；鹵化烴，諸如二氯甲烷及二氯乙烯；醇，諸如甲醇、乙醇、2-丙醇、丁醇及苯甲醇；鹵化醇，諸如2,2,2-三氟乙醇；羧酸，諸如乙酸；羧酸酯及內酯，諸如乙酸乙酯、乙酸甲酯及戊內酯；及含有雜原子之有機溶劑，諸如N-甲基吡咯啶酮(NMP)或N,N-二甲基甲醯胺(DMF)。溶劑可單獨使用，以溶劑混合物形式或以與水之混合物形式使用。視肽片段之溶解性而定，甚至可使用純水。因此，在
步驟(b)中，可在作為溶劑之純水中移除。
較佳溶劑係選自由DMF、丙酮、乙酸、丙酮與水之混合物及乙酸與水之混合物所組成之群組。
在一較佳具體實例中，移除步驟(b)在選自由DMF、丙酮、水及丙酮與水之混合物所組成之群組的溶劑中進行；尤其在DMF中進行。
移除步驟(b)更佳在DMF中進行。意外地發現移除步驟(b)中所用之溶劑對最後比伐盧定之雜質概況有影響。觀察到DMF優於例如丙酮與水之混合物，從而雙重併入-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-(SEQ ID NO 2)後所形成之雜質可得以抑制。
在另一較佳具體實例中，移除步驟(h)在乙酸或乙酸與水之混合物中進行；尤其在乙酸與水之混合物中進行。
移除步驟(b)及(h)之氫化過程可於大氣壓力或超大氣壓力下進行。典型壓力為1巴(bar)至100巴。宜使用1巴至70巴、尤其2巴至10巴。
移除步驟(b)及(h)之氫化反應可於低溫或高溫下進行。例示性溫度範圍為-20℃至70℃。較佳為0℃與60℃之間的溫度，且最佳為10℃至40℃之範圍。
本發明方法之偶合步驟(a)、(c)、(e)及(g)在溶液相中進行且可使用肽合成技術中已知之反應條件進行。各別側鏈未經保護或經保護之肽片段/胺基酸衍生物之偶合可使用當場偶合劑完成，例如鏻或偶合劑，如六氟磷酸苯并三唑-1-基氧基-參(二甲基胺基)鏻(BOP)、六氟磷酸苯并三唑-1-基氧基-參(N-吡咯啶基)鏻(PyBOP)、六氟磷酸O-(苯并三唑-1-
基)-1,1,3,3-四甲基(HBTU)、六氟磷酸O-(6-氯苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基(HCTU)、四氟硼酸O-(6-氯苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基(TCTU)、六氟磷酸O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基(HATU)、四氟硼酸O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基(TATU)、四氟硼酸O-(苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基(TBTU)及四氟硼酸O-[氰基(乙氧羰基)亞甲胺基]-1,1,3,3-四甲基(TOTU)；或碳化二亞胺偶合劑，如二異丙基碳化二亞胺(DIC)、二環己基碳化二亞胺(DCC)及水溶性碳化二亞胺(WSCDI)，如1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺(EDC)，視情況呈鹽形式，如呈鹽酸鹽形式。其他偶合技術使用預先形成之活性酯，諸如N-羥基丁二醯亞胺(HOSu)及對硝基苯酚(HONp)酯；預先形成之對稱酸酐、非對稱酸酐，諸如N-羧酸酐(NCA)；及醯鹵，諸如醯氟或醯氯。較佳偶合劑為碳化二亞胺偶合劑，最佳為DIC或EDC，適合為EDC鹽，諸如EDC．HCl。
偶合步驟(a)、(c)、(e)及(g)之反應混合物宜含有鹼，較佳為三級胺鹼，其脫除羧基組份之質子且中和胺基組份之相對離子，且因此促進當場反應。適合鹼為例如三烷基胺，如N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)或三乙胺(TEA)；N,N-二烷基苯胺，如N,N-二乙基苯胺；2,4,6-三烷基吡啶，如2,4,6-三甲基吡啶；及N-烷基嗎啉，如N-甲基嗎啉。詳言之，反應混合物宜含有TEA或DIPEA作為鹼。
偶合步驟(a)、(c)、(e)及(g)之反應混合物可另外含有輔助親核試劑作為添加劑，因為該等親核試劑對抑制不欲副反應具有積極作用。可應用任何已知之輔助親核試劑。適合輔助親核試劑之實例為1-羥基苯并三唑(HOBt)、N-羥基丁二醯亞胺(HOSu)、N-羥基-3,4-二氫-4-側氧
基-1,2,3-苯并三(HOOBt)及1-羥基-7-氮雜苯并三唑(HOAt)。偶合步驟之反應混合物較佳另外含有HOBt。
在一較佳具體實例中，偶合步驟(a)、(c)、(e)及(g)之偶合混合物係選自由DIC/HOBt/TEA、EDC/HOBt/DIPEA及EDC/HOBt/TEA所組成之群組。
可使用可溶解反應物之任何惰性液體溶劑作為偶合步驟(a)、(c)、(e)及(g)之溶劑。適用偶合溶劑為水溶性溶劑，如二甲亞碸(DMSO)、二噁烷、四氫呋喃(THF)、1-甲基-2-吡咯啶酮(NMP)、N,N-二甲基甲醯胺(DMF)、N,N-二甲基乙醯胺(DMA)或其任何混合物；非水溶性溶劑，如二氯甲烷(DCM)、乙酸乙酯或其任何混合物；及水溶性溶劑與非水溶性溶劑之間的任何適合混合物，包括與水之混合物。較佳溶劑為DMF或DMF與水之混合物。
步驟(d)、(f)及(h)之N端保護基脫除可使用肽合成技術中已知之反應條件進行且視保護基P1、P4及P5之性質而定。在保護基為Boc之情況下，適合由酸、較佳由三氟乙酸來脫除保護基，該酸可以純形式或以與惰性溶劑(如甲苯、THF或甲苯與THF之混合物)之混合物形式應用。在保護基為Fmoc之情況下，可藉由與鹼、宜與二級胺(諸如哌啶或二乙胺)反應來脫除N端保護基。典型地，脫除N端保護基在溶劑中進行，該溶劑可為不干擾反應物之任何溶劑，如氯化烴，諸如二氯甲烷；烷基化醯胺及內醯胺，諸如二甲基甲醯胺或1-甲基-2-吡咯啶酮；芳族烴，諸如甲苯；醚，諸如THF或其任何混合物。脫除N端Boc基團較佳在甲苯中或在苯酚、甲苯及THF之混合物中進行。
步驟(h)後所獲得之粗比伐盧定可藉由習知方法，如製備型HPLC或逆流分布法來純化。可重複純化步驟。
上述情況亦適用於步驟(a)至(g)後所獲得之肽片段。
最終式I之比伐盧定可根據肽化學中已知之分離方法，諸如沈澱或凍乾來分離。
式V及VI之視情況側鏈經保護之肽及式X之側鏈經保護之肽可使用習知肽合成方法來製備，例如溶液相合成(同義詞：均相肽合成，縮寫為HPPS)、固相肽合成(SPPS)或SPPS與HPPS之組合，稱為混合合成(同義詞：混合相肽合成，縮寫為MPPS)。
在本發明方法之一具體實例中，選自由式V之視情況側鏈經保護之肽、式VI之視情況側鏈經保護之肽及式X之側鏈經保護之肽組成的群之肽中之至少一者在在先的程序中藉由溶液相合成來製備。較佳地，此等肽以相應二肽，亦即序列模式-D-Phe1-Pro-、-Arg3-Pro-、-Gly5-Gly-、-Gly7-Gly-、-Asn9-Gly-、-Glu13-Glu-、-I1e15-Pro-、-Glu17-Glu-或-Tyr19-Leu-開始組裝。N端、C端及側鏈保護基以及反應條件可為如熟習此項技術者已知之任何保護基及條件，較佳與上文所述相同或相似。
詳言之，在溶液相中製造下式之視情況側鏈經保護之肽P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH(SEQ ID NO 4) (V)，較佳為側鏈未經保護之肽Va，其中P1為保護基，P1較佳為對催化性氫化穩定之保護基，P1更佳為Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc，P1最佳為Boc；
的方法包含以下步驟：(a)移除下式之視情況側鏈經保護之二肽P12-Arg-Pro4-OP13 (XVI)，較佳為側鏈未經保護之二肽XVIa，的P12，其中P12為保護基，P12較佳為與側鏈保護基及P13正交之保護基，P12更佳為對催化性氫化穩定且與側鏈保護基及P13正交之保護基，P12更佳為Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc，P12最佳為Boc；且P13為保護基，諸如Bzl、甲基(Me)或乙基(Et)；P13較佳為可藉由催化性氫化移除且與側鏈保護基正交之保護基，P13更佳為Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic或4-磺酸基苯甲基，P13最佳為Bzl；其限制條件為若P12為Boc、Bpoc或Ddz，則P13不為Bom；(b)使步驟(a)中所產生之N端保護基脫除且視情況側鏈經保護之二肽、較佳相應側鏈未經保護之二肽與下式之視情況側鏈經保護之二肽反應P1-D-Phe1-Pro-OW (XVII)，較佳與側鏈未經保護之二肽XVIIa反應，其中P1如上所定義，且W為氫或預先活化基團，諸如五氟苯基(Pfp)，產生下式之視情況側鏈經保護之肽P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OP13(SEQ ID NO 4) (XV)，較佳為側鏈未經保護之肽XVa，
其中P1及P13如上所定義，及(c)移除步驟(b)中所產生之式XV之視情況側鏈經保護之肽、較佳側鏈未經保護之肽XVa的P13，產生式V之視情況側鏈經保護之肽；較佳為側鏈未經保護之肽Va。
亦詳言之，在溶液相中製造下式之視情況側鏈經保護之肽H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2(SEQ ID NO 5) (VI)，較佳為側鏈未經保護之肽VIa，其中P2為保護基，P2較佳為可藉由催化性氫化移除且與視情況存在之側鏈保護基正交的保護基，P2更佳為Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic或4-磺酸基苯甲基，P2最佳為Bzl，的方法包含以下步驟：(a)移除下式之視情況側鏈經保護之二肽P14-Asn-Gly10-OP2 (XVIII)，較佳為側鏈未經保護之二肽XVIIIa的P14，其中P14為保護基，P14較佳為與側鏈保護基及P2正交之保護基，P14更佳為對催化性氫化穩定且與側鏈保護基及P2正交之保護基，P14更佳為Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc，P14最佳為Boc；且P2如上所定義；其限制條件為若P14為Boc、Bpoc或Ddz，則P2不為Bom；
(b)使步驟(a)中所產生之N端保護基脫除且視情況側鏈經保護之二肽、較佳側鏈未經保護之相應二肽與下式之四甘胺酸反應P15-Gly5-Gly-Gly-Gly-OH(SEQ ID NO 10) (IXX)，其中P15為保護基，P15較佳為與式XX之肽之側鏈保護基正交的保護基，P15更佳為對催化性氫化穩定且與式XX之肽之側鏈保護基正交的保護基，P15更佳為Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc，P15最佳為Boc；產生下式之視情況側鏈經保護之肽P15-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2(SEQ ID NO 5) (XX)，較佳為側鏈未經保護之肽XXa，其中P2及P15如上所定義，其限制條件為若P15為Boc、Bpoc或Ddz，則P2不為Bom；及(c)移除步驟(b)中所產生的式XX之視情況側鏈經保護之肽、較佳側鏈未經保護之肽XXa的P15，產生式VI之視情況側鏈經保護之肽，較佳為側鏈未經保護之肽VIa。
另外詳言之，在溶液相中製造下式之視情況側鏈經保護之肽H-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO 8) (X)，
較佳下式之肽的方法H-Glu(OP6)-Glu(OP7)-Ile15-Pro-Glu(OP8)-Glu(OP9)-Tyr(P10)-Leu20-OP3(SEQ ID 8) (Xb)，其中P3為保護基，P3較佳為可藉由催化性氫化移除之保護基，P3更佳為Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic或4-磺酸基苯甲基，P3最佳為Bzl，且P6至P10各自獨立地選自由Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic及4-磺酸基苯甲基所組成之群組，P6至P10各自較佳為Bzl，其包含以下步驟：(a)移除下式之側鏈經保護之肽P16-Glu-Glu-Ty-Leu20-OP3(SEQ ID NO 6) (VIII)，較佳下式之肽的P16P16-Glu(OP8)-Glu(OP9)-Tyr(P10)-Leu20-OP3(SEQ ID NO 6) (VIIIb)，其中P3及P8至P10如上所定義，且P16為保護基，P16較佳為與側鏈保護基及P3正交之保護基，P16更佳為對催化性氫化穩定且與側鏈保護基及P3正交之保護基，P16更佳為Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc，P16最佳為Boc；其限制條件為若P16為Boc、Bpoc或Ddz，則P3不為Bom；(b)使步驟(a)中所產生的式VIII之N端保護基脫除且側鏈經保護之肽、
較佳相應肽VIIIb與下式之側鏈經保護之肽反應P17-Glu-Glu-Ile15-Pro-OH(SEQ ID NO 7) (IX)，較佳與以下反應P17-Glu(OP6)-Glu(OP7)-Ile15-Pro-OH(SEQ ID NO 7) (IXb)，其中P6及P7如上所定義，且P17為保護基，P17較佳為與側鏈保護基正交之保護基，P17更佳為對催化性氫化穩定且與側鏈保護基正交之保護基，P17更佳為Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc，P17最佳為Boc，產生下式之側鏈經保護之肽P17-Glu-Glu-Ilel5-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO 8) (XXI)，較佳為下式之肽P17-Glu(OP6)-Glu(OP7)-Ile15-Pro-Glu(OP8)-Glu(OP9)-Tyr(P10)-Leu20-OP3(SEQ ID 8) (XXIb)其中P3、P6至P10及P17如上所定義，其限制條件為若P17為Boc、Bpoc或Ddz，則P3或P6至P10中之任一者不為Bom，及(c)移除步驟(b)中所產生的式XXI之側鏈經保護之肽、較佳相應肽XXIb
之P17，產生式X之側鏈經保護之肽，較佳為肽Xb。
在本發明方法之另一具體實例中，選自由式V之視情況側鏈經保護之肽、式VI之視情況側鏈經保護之肽及式X之側鏈經保護之肽組成的群之肽中之至少一者在在先的程序中藉由固相合成來製備。從而可使用任何通常已知之SPPS方法，包括SPPS構建嵌段及SPPS條件。可應用熟習此項技術者已知且允許製備經保護之肽的所有樹脂。此處，樹脂應以廣泛方式解釋。因此，術語「樹脂」應理解為意謂例如單獨固體載體，或直接連接於連接子之固體載體，中間視情況存在柄狀物。樹脂可為不可溶或可溶的。可溶性聚合物聚乙二醇(可溶性PEG聚合物)為可溶性樹脂之固體載體的一實例，因此在組裝單一構建嵌段後形成可溶性肽-樹脂。較佳樹脂為具有三苯甲基或溴二苯甲基之基於聚苯乙烯之樹脂。三苯甲基樹脂之實例為氯化2-氯三苯甲基樹脂(CTC樹脂)、氯化三苯甲基樹脂、氯化4-甲基三苯甲基樹脂及氯化4-甲氧基三苯甲基樹脂。CTC樹脂較佳適用於合成該等肽片段。
本發明之另一目標為提供適用作本發明方法中之中間物的肽。詳言之，此等肽之一為選自由以下者所組成之群組的肽：(i)下式之視情況側鏈經保護之肽P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH(SEQ ID NO 4) (V)，其中P1為保護基，P1較佳為對催化性氫化穩定之保護基，P1更佳為Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc，P1最佳為Boc；且該肽的側鏈視情況在精胺酸殘基處經適合側鏈保護基(諸如硝
基)保護；(ii)下式之視情況側鏈經保護之肽H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2(SEQ ID NO 5) (VI)，其中P2為保護基，P2較佳為可藉由催化性氫化移除且與視情況存在之側鏈保護基正交的保護基，P2更佳為Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic或4-磺酸基苯甲基，P2最佳為Bzl，且該肽的側鏈視情況在天冬醯胺殘基處經適合側鏈保護基(諸如三苯甲基(Trt))保護；(iii)下式之視情況側鏈經保護之肽P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2(SEQ ID NO 2) (VII)，其中P1、P2及視情況存在之側鏈保護基以及P1、P2及視情況存在之側鏈保護基之較佳含義如上所定義；(iv)下式之側鏈經保護之肽P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH(SEQ ID NO 2) (IIa)，其中P1及側鏈保護基以及P1及視情況存在之側鏈保護基之較佳含義如上所定義，除了Boc-D-Phe1-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly10-OH，其中Pbf為五甲基二氫苯并呋喃磺醯基且Trt為三苯甲基。此肽作為CTC樹脂上固相合成之產物揭示於WO 2007/033383中。相比之
下，本發明式IIa之側鏈經保護之肽藉由不同方式，亦即藉由溶液相合成來形成；(v)下式之側鏈未經保護之肽P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH(SEQ ID NO 2) (IIb)，其中P1以及P1之較佳含義如上所定義；(vi)下式之側鏈經保護之肽H-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO 8) (X)，其中P3為保護基，P3較佳為可藉由催化性氫化移除之保護基，P3更佳為Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic或4-磺酸基苯甲基，P3最佳為Bzl；且側鏈保護基為至少一個適合側鏈保護基，較佳選自由Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic及4-磺酸基苯甲基所組成之群組，更佳為Bzl；(vii)下式之側鏈經保護之肽P4-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO 9) (XII)，其中P3及側鏈保護基以及P3及視情況存在之側鏈保護基之較佳含義如上所定義；且P4為保護基，P4較佳為與式X之肽之側鏈保護基及P3正交的保護基，P4更佳為Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc，P4最佳為Boc，其限制條件為若P4為Boc、Bpoc或Ddz，則P3不為Bom；
或P4為氫；(viii)下式之側鏈經保護之肽P5-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO 3) (XIV)，其中P3及側鏈保護基以及P3及側鏈保護基之較佳含義如上所定義；且P5為保護基，P5較佳為與式XII及XIII之肽/胺基酸之側鏈保護基及P3正交的保護基，P5更佳為Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc，P5最佳為Boc，其限制條件為若P5為Boc、Bpoc或Ddz，則P3不為Bom，除了Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile15-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu20-OtBu，其中tBu為第三丁基。此肽作為前驅肽(亦即減去Leu之肽序列)及H-Leu-OtBu之間反應的產物揭示於WO 2007/033383中。如WO 2007/033383中所揭示之前驅肽已在前述步驟中藉由CTC樹脂上固相合成而形成。在與H-Leu-OtBu反應後，在繼續下一步之前不分離所揭示之肽。相比之下，本發明式XIV之側鏈經保護之肽藉由不同方式，亦即藉由溶液相合成來形成，且在其形成後分離之；(ix)下式之側鏈經保護之肽H-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3
(SEQ ID NO 3) (III)，其中P3及側鏈保護基以及P3及側鏈保護基之較佳含義如上所定義，除了H-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile15-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu20-OtBu。此肽揭示於WO 2007/033383中。其為上述N端保護基脫除之肽。因此，如上文所解釋，其形成方式不同於本發明式III之側鏈經保護之肽；及(x)下式之側鏈經保護之肽P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO 1) (IV)，其中P1、P3及側鏈保護基以及P1、P3及視情況存在之側鏈保護基之較佳含義如上所定義，除了Boc-D-Phe1-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly10-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile15-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu20-OtBu。此肽作為Boc-D-Phe1-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly10-OH與H-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile15-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu20-OtBu(兩者皆如上文所解釋)偶合後之產物揭示於WO 2007/033383中。因此，形成此偶合產物之方式不同於形成本發明式IV之側鏈經保護之肽的方式。
在一較佳具體實例中，式V之肽的側鏈未經保護且具有下式
Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH(SEQ ID NO 4)，其包含比伐盧定之胺基酸位置1-4的序列。
在另一較佳具體實例中，式VI之肽的側鏈未經保護且具有下式H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl(SEQ ID NO 5)，其包含比伐盧定之胺基酸位置5-10的序列。
在另一較佳具體實例中，式VII之肽的側鏈未經保護且具有下式Boo-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl(SEQ ID NO 2)，其包含比伐盧定之胺基酸位置1-10的序列。
在另一較佳具體實例中，式IIb之側鏈未經保護之肽為Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH(SEQ ID NO 2)，其包含比伐盧定之胺基酸位置1-10的序列。
在另一較佳具體實例中，式X之側鏈經保護之肽為H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO 8)，其包含比伐盧定之胺基酸位置13-20的序列。
在另一較佳具體實例中，式XII之側鏈經保護之肽為Boc-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO 9)，或
H-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO 9)，兩者皆包含比伐盧定之胺基酸位置12-20的序列。
在另一較佳具體實例中，式XIV之側鏈經保護之肽為Boc-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO 3)，其包含比伐盧定之胺基酸位置11-20的序列。
在另一較佳具體實例中，式III之側鏈經保護之肽為H-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO 3)，其包含比伐盧定之胺基酸位置11-20的序列。
在另一較佳具體實例中，式IV之側鏈經保護之肽為Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO 1)，其包含比伐盧定之胺基酸位置1-20的序列。
在另一態樣中，本發明係關於一種選自由以下者所組成之群組之肽的用途：(i)下式之視情況側鏈經保護之肽P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH(SEQ ID NO 4) (V)，其中P1為保護基，P1較佳為對催化性氫化穩定之保護基，P1更
佳為Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc，P1最佳為Boc；且該肽的側鏈視情況在精胺酸殘基處經適合側鏈保護基(諸如硝基)保護；較佳地，肽V的側鏈未經保護且具有下式Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH(SEQ ID NO 4)；(i)下式之視情況側鏈經保護之肽H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2(SEQ ID NO 5) (VI)，其中P2為保護基，P2較佳為可藉由催化性氫化移除且與視情況存在之側鏈保護基正交的保護基，P2更佳為Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic或4-磺酸基苯甲基，P2最佳為Bzl；且該肽的側鏈視情況在天冬醯胺殘基處經適合側鏈保護基(諸如三苯甲基(Trt))保護；較佳地，該肽VI的側鏈未經保護且具有下式H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl(SEQ ID NO 5)；(iii)下式之視情況側鏈經保護之肽P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2(SEQ ID NO 2) (VII)，其中P1、P2及視情況存在之側鏈保護基以及P1、P2及視情況存在之側鏈保護基之較佳含義如上所定義；較佳地，該肽VII之側鏈未經保護且具有下式Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl
(SEQ ID NO 2)；(iv)下式之側鏈經保護之肽P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH(SEQ ID NO 2) (IIa)，其中P1及側鏈保護基以及P1及視情況存在之側鏈保護基之較佳含義如上所定義，除了Boc-D-Phe1-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly10-OH，其中Pbf為五甲基二氫苯并呋喃磺醯基且Trt為三苯甲基。此肽作為CTC樹脂上固相合成之產物揭示於WO 2007/033383中。相比之下，本發明式IIa之側鏈經保護之肽藉由不同方式，亦即藉由溶液相合成來形成；(v)下式之側鏈未經保護之肽P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH(SEQ ID NO 2) (IIb)，其中P1以及P1之較佳含義如上所定義；較佳地，式IIb之側鏈未經保護之肽為Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH(SEQ ID NO 2)；(vi)下式之側鏈經保護之肽H-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO 8) (X)，其中P3為保護基，P3較佳為可藉由催化性氫化移除之保護基，
P3更佳為Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic或4-磺酸基苯甲基，P3最佳為Bzl；且側鏈保護基較佳選自由Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic及4-磺酸基苯甲基所組成之群組，更佳為Bzl；較佳地，式X之側鏈經保護之肽為H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO 8)；(vii)下式之側鏈經保護之肽P4-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO 9) (XII)，其中P3及側鏈保護基以及P3及視情況存在之側鏈保護基之較佳含義如上所定義；且P4為保護基，P4較佳為與式X之肽之側鏈保護基及P3正交的保護基，P4更佳為Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc，P4最佳為Boo，其限制條件為若P4為Boc、Bpoc或Ddz，則P3不為Bom；或P4為氫；較佳地，式XII之側鏈經保護之肽為Boc-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO 9)，或H-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO 9)；
(viii)下式之側鏈經保護之肽P5-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO 3) (XIV)，其中P3及側鏈保護基以及P3及側鏈保護基之較佳含義如上所定義；且P5為保護基，P5較佳為與式XII及XIII之肽/胺基酸之側鏈保護基及P3正交的保護基，P5更佳為Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc，P5最佳為Boc，其限制條件為若P5為Boc、Bpoc或Ddz，則P3不為Bom，除了Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile15-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu20-OtBu，其中tBu為第三丁基。此肽作為前驅肽(亦即減去Leu之肽序列)及H-Leu-OtBu之間反應的產物揭示於WO 2007/033383中。如WO 2007/033383中所揭示之前驅肽已在前述步驟中藉由CTC樹脂上固相合成而形成。在與H-Leu-OtBu反應後，在繼續下一步之前不分離所揭示之肽。相比之下，本發明式XIV之側鏈經保護之肽藉由不同方式，亦即藉由溶液相合成來形成，且在形成後分離之；較佳地，式XIV之側鏈經保護之肽為Boc-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO 3)；(ix)下式之側鏈經保護之肽
H-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO 3) (III)，其中P3及側鏈保護基以及P3及側鏈保護基之較佳含義如上所定義，除了H-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile15-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu20-OtBu。此肽揭示於WO 2007/033383中。其為上述N端保護基脫除之肽。因此，如上文所解釋，其形成方式不同於本發明式III之側鏈經保護之肽；較佳地，式III之側鏈經保護之肽為H-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO 3)；及(x)下式之側鏈經保護之肽P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO 1) (IV)，其中P1、P3及側鏈保護基以及P1、P3及視情況存在之側鏈保護基之較佳含義如上所定義，除了Boc-D-Phe1-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly10-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ilel5-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu20-OtBu。此肽作為Boc-D-Phe1-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly10-OH與H-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile15-Pro-
Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu20-OtBu(兩者皆如上文所解釋)偶合後之產物揭示於WO 2007/033383中。因此，形成此偶合產物之方式不同於形成本發明式IV之側鏈經保護之肽的方式；較佳地，式IV之側鏈經保護之肽為Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO 1)；作為合成下式之比伐盧定中的中間物H-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OH(SEQ ID NO 1) (I)。
本發明亦係關於一種製造式I之比伐盧定的方法，其包含以下步驟：(a)使下式之肽P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH(SEQ ID NO 2) (IIc)，其中P1為保護基，與下式之肽反應H-Asp(OP11)-Phe-Glu(OP6)-Glu(OP7)-Ile15-Pro-Glu(OP8)-Glu(OP9)-Tyr(P10)-Leu20-OP3(SEQ ID NO 3) (IIIc)，其中P3及P6至P11各為Bzl，得到下式之肽
P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp(OP11)-Phe-Glu(OP6)-Glu(OP7)-Ile15-Pro-Glu(OP8)-Glu(OP9)-Tyr(P10)-Leu20-OP3(SEQ ID NO 1) (IVc)，其中P1、P3及P6至P11如上所定義；(b)移除步驟(a)中所產生之肽的側鏈及C端保護基P3及P6至P11；及(c)移除步驟(b)中所產生之肽的N端保護基P1，得到式I之比伐盧定。
本發明之方法經由彙集片段合成，非常有效地合成比伐盧定，可容易適合於工業規模製造。此外，比伐盧定之此製備途徑非常簡單且無需使用複雜的保護基策略。另外，選擇多種構建嵌段(片段)以避免組裝期間外消旋化或使其最少。
在本發明之反應之前、期間及之後，所有片段以及所有偶合產物均可按原樣存在或可以適合之鹽形式存在，視分子之物理化學性質及/或反應條件而定。適合相對離子為例如三乙胺(TEA)、二環己基胺(DCHA)、鹽酸(HCl)及三氟乙酸(TFA)之鹽形式。
可使用對催化性氫化穩定之任何保護基作為保護基P1，諸如第三丁氧羰基(Boc)、茀-9-基甲氧羰基(Fmoc)、2-(3,5-二甲氧基苯基)丙-2-基氧羰基(Ddz)、金剛烷基-1-氧羰基(Adc)、第三戊氧羰基(Aoc)、二苯基膦基(Dpp)、2-(甲基磺醯基)乙氧羰基(Msc)及酞醯基(Pht)。保護基P1較佳為Boc、Fmoc或Ddz。
保護基P3及P6至P11較佳為苯甲基(Bzl)。此處及下文中，縮寫「OBzl」表示苯甲酯(與側鏈及C端兩者之羧酸反應後)，而縮寫「Bzl」
表示苯甲醚(與例如酪胺酸之酚系羥基反應後)。
步驟(a)至(c)可使用肽合成技術中已知之標準反應條件進行。
偶合及脫除保護基步驟(a)、(b)及(c)較佳在溶液中進行。
對於偶合步驟(a)，較佳使用DMF作為溶劑。第一脫除保護基步驟(b)較佳在乙酸及/或水中進行，而第二脫除保護基步驟(c)較佳在甲苯中進行。
在一較佳具體實例中，偶合步驟(a)在HOBt、EDC．HCl及TEA之組合下完成。
在一較佳具體實例中，第一脫除保護基步驟(b)以氫氣及鈀/木炭進行。
在一較佳具體實例中，第二脫除保護基步驟(c)在TFA下進行。
步驟(c)後所獲得之粗產物可藉由習知方法，例如用製備型HPLC、逆流分布法或等效方法來純化。若需要純化，則上述情況亦適用於步驟(a)及(b)後所獲得之中間物。
經保護之肽片段IIc及IIIc可使用習知肽合成方法來製備，例如溶液相合成(HPPS)或固相合成(SPPS)。在SPPS之情況下，可應用熟習此項技術者已知且允許製備經保護之肽的所有樹脂。此處，樹脂應以廣泛方式解釋。因此，術語「樹脂」應理解為意謂例如單獨固體載體，或直接連接於連接子之固體載體，中間視情況存在柄狀物。樹脂可為不可溶
或可溶的。可溶性聚合物聚乙二醇為可溶性樹脂之固體載體的一實例。較佳樹脂為具有三苯甲基或溴二苯甲基之基於聚苯乙烯之樹脂。三苯甲基樹脂之實例為氯化2-氯三苯甲基樹脂(CTC樹脂)、氯化三苯甲基樹脂、氯化4-甲基三苯甲基樹脂及氯化4-甲氧基三苯甲基樹脂。CTC樹脂較佳適用於合成含有自由羧基官能基之片段。
在一較佳具體實例中，經保護之肽片段IIc及IIIc使用溶液相合成來製備。
本發明之另一目標為提供適用作本發明方法中之中間物的經保護之肽。詳言之，此等肽之一為式IVc之經保護之肽，其中P1為保護基；P1較佳為Boc或H；且P3及P6至P11為Bzl。
尤其適用作本發明方法中之中間物的另一肽為式IIc之N端經保護之肽，其中P1為保護基，P1較佳為Boc。
在另一態樣中，本發明亦關於一種製造下式之N端經保護之肽的方法P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH(SEQ ID NO 2) (IIc)，其中P1為Boc，該方法包含：(a)移除下式之肽之C端保護基P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OP13(SEQ ID NO 4) (Vc)，其中P1為Boc，且P13為保護基，諸如Bzl、甲基(Me)及乙基
(Et)；P13較佳為Bzl；得到式Vc之N端經保護且C端未經保護之肽，其中P13為H；(b)移除下式之肽之N端保護基P15-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl(SEQ ID NO 5) (VIc)，其中P15為Boc，得到式VIc之C端經保護且N端未經保護之肽，其中P15為H；(c)使步驟(a)中所產生之式Vc之肽，其中P13為H，與步驟(b)中所產生之式VIc之肽反應，其中P15為H，得到下式之肽P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl(SEQ ID NO 2) (VIIc)，其中P1為Boc；及(d)移除步驟(c)中所產生之肽之C端保護基，得到式IIc之N端經保護之肽。
步驟(a)至(d)可使用肽合成技術中已知之標準反應條件進行。
偶合及脫除保護基步驟(a)、(b)、(c)及(d)較佳在溶液中進行。
對於偶合步驟(c)，較佳使用DMF作為溶劑。第一脫除保護基步驟(a)較佳在丙酮中進行，而第二脫除保護基步驟(b)較佳在甲苯及/或THF中進行。第三脫除保護基步驟(d)較佳在選自由DMF、丙酮、
水及丙酮與水之混合物所組成之群組的溶劑中進行。
在一較佳具體實例中，第一脫除保護基步驟(a)以氫氣及鈀/木炭進行。
在一較佳具體實例中，第二脫除保護基步驟(b)在TFA下進行。
在一較佳具體實例中，偶合步驟(c)在HOBt、DIC及TEA之組合下完成。
在一較佳具體實例中，第三脫除保護基步驟(d)以氫氣及鈀/木炭進行。
步驟(d)後所獲得之粗產物可藉由習知方法，例如用製備型HPLC、逆流分布法或等效方法來純化。若需要純化，則上述情況亦適用於步驟(a)、(b)及(c)後所獲得之中間物。
經保護之肽片段Vc及VIc可使用習知肽合成方法來製備，例如溶液相合成(HPPS)或固相合成(SPPS)。在SPPS之情況下，可應用熟習此項技術者已知且允許製備經保護之肽的所有樹脂。此處，樹脂應以廣泛方式解釋。因此，術語「樹脂」應理解為意謂例如單獨固體載體，或直接連接於連接子之固體載體，中間視情況存在柄狀物。樹脂可為不可溶或可溶的。可溶性聚合物聚乙二醇為可溶性樹脂之固體載體的一實例，由此產生可溶性肽-樹脂結合物。較佳樹脂為具有三苯甲基或溴二苯甲基之基於聚苯乙烯之樹脂。三苯甲基樹脂之實例為氯化2-氯三苯甲基樹脂(CTC樹脂)、氯化三苯甲基樹脂、氯化4-甲基三苯甲基樹脂及氯化4-甲氧基三苯甲基樹脂。CTC樹脂較佳適用於合成含有自由羧基官能基之片段。
在一較佳具體實例中，經保護之肽片段Vc及VIc使用溶液相合成來製備。
本發明之另一目標為提供一種經保護之肽，其適用作製造式IIc之N端經保護之肽的本發明方法中之中間物。詳言之，此等肽之一為式Vc之C端及N端經保護之肽，其中P13為保護基，較佳為Bzl。此等肽中之另一者為具有自由C端的式Vc之N端經保護之肽。
尤其適用作本發明方法中之中間物的另一肽為式VIc之C端經保護之肽，其中P15為Boc；或P15為H。
尤其適用作本發明方法中之中間物的另一肽為式VIIc之C端及N端經保護之肽，其中P1為保護基，P1較佳為Boc。
尤其適用作比伐盧定之製造方法中之中間物的另一肽為式IIIc之經保護之肽，其中P3及P6至P11為Bzl。
在另一態樣中，本發明亦係關於一種製造下式之經保護之肽的方法H-Asp(OP11)-Phe-Glu(OP6)-Glu(OP7)-Ile15-Pro-Glu(OP8)-Glu(OP9)-Tyr(P10)-Leu20-OP3(SEQ ID NO 3) (IIIc)，其中P3及P6至P11為Bzl，該方法包含：(a)移除下式之肽之N端保護基P16-Glu(OP8)-Glu(OP9)-Tyr(P10)-Leu20-OP3(SEQ ID NO 6) (VIIIc)，
其中P3及P8至P10為Bzl且P16為Boc，得到式VIIIc之C端經保護且N端未經保護之肽，其中P16為H；(b)使步驟(a)中所產生之式VIIIc之肽(其中P16為H且P3及P8至P10為Bzl)與下式之肽反應P17-Glu(OP6)-Glu(OP7)-Ile15-Pro-OH(SEQ ID NO 7) (IXc)，其中P17為Boc；且P6及P7為Bzl，得到下式之肽P17-Glu(OP6)-Glu(OP7)-Ile15-Pro-Glu(OP8)-Glu(OP9)-Tyr(P10)-Leu20-OP3(SEQ ID NO 8) (Xc)，其中P17為Boc；且P3及P6至P10為Bzl；(c)移除步驟(b)中所產生的式Xc之肽之N端保護基，其中P3及P6至P10為Bzl；且P17為Boc，得到式Xc之C端經保護且N端未經保護之肽，其中P3及P6至P10為Bzl且P17為H；(d)使步驟(c)中所產生之式Xc之肽(其中P17為H；且P3及P6至P10為Bzl)與下式之經保護之胺基酸反應Boc-Phe12-OH (XI)得到下式之肽P4-Phe-Glu(OP6)-Glu(OP7)-Ile15-Pro-Glu(OP8)-Glu(OP9)-Tyr(P10)-Leu20-OP3
(SEQ ID NO 9) (XIIc)，其中P3及P6至P10為Bzl；且P4為Boc；(e)移除步驟(d)中所產生的式XIIc之肽之N端保護基，其中P3及P6至P10為Bzl且P4為Boc，得到式XIIc之C端經保護且N端未經保護之肽，其中P3及P6至P10為Bzl；且P4為H；(f)使步驟(e)中所產生之式XIIc之肽，其中P4為H，且P3及P6至P10為Bzl，與下式之經保護之胺基酸反應Boc-Asp(OP11)11-OH (XIIIc)，其中P11為Bzl，得到下式之肽Boc-Asp(OP11)-Phe-Glu(OP6)-Glu(OP7)-Ile15-Pro-Glu(OP8)-Glu(OP9)-Tyr(P10)-Leu20-OP3(SEQ ID NO 3) (XIVc)，其中P3及P6至P11為Bzl；及(g)移除步驟(f)中所產生之肽之N端保護基，得到式IIIc之C端經保護之肽。
步驟(a)至(g)可使用肽合成技術中已知之標準反應條件進行。
偶合及脫除保護基步驟(a)至(g)較佳在溶液中進行。
對於偶合步驟(b)、(d)及(f)，較佳使用DMF作為溶劑。
脫除保護基步驟(a)、(c)、(e)及(g)較佳在作為溶劑之甲苯與THF之混合物中進行。
在一較佳具體實例中，偶合步驟(b)、(d)及(f)在HOBt、EDC．HCl及分別對於步驟(b)為鹼TEA、對於步驟(d)及(f)為DIPEA之組合下完成。在另一較佳具體實例中，步驟(a)、(c)、(e)及(g)之保護基脫除藉由使用TFA及苯酚來進行。
步驟(g)後所獲得之粗產物可藉由習知方法，例如用製備型HPLC、逆流分布法或等效方法來純化。若需要純化，則上述情況亦適用於步驟(a)至(f)後所獲得之中間物。
經保護之肽片段VIIIc、IXc、XI及XIIIc可使用習知肽合成方法來製備，例如溶液相合成(HPPS)或固相合成(SPPS)。在SPPS之情況下，可應用熟習此項技術者已知且允許製備經保護之肽的所有樹脂。此處，樹脂應以廣泛方式解釋。因此，術語「樹脂」應理解為意謂例如單獨固體載體，或直接連接於連接子之固體載體，中間視情況存在柄狀物。樹脂可為不可溶或可溶的。可溶性聚合物聚乙二醇為可溶性樹脂之固體載體的一實例。較佳樹脂為具有三苯甲基或溴二苯甲基之基於聚苯乙烯之樹脂。三苯甲基樹脂之實例為氯化2-氯三苯甲基樹脂(CTC樹脂)、氯化三苯甲基樹脂、氯化4-甲基三苯甲基樹脂及氯化4-甲氧基三苯甲基樹脂。CTC樹脂較佳適用於合成含有自由羧基官能基之片段。
在一較佳具體實例中，經保護之肽片段VIIIc、IXc、XI及XIIIc使用溶液相合成來製備。
本發明之另一目標為提供一種經保護之肽，其適用作製造
式IIIc之C端經保護之肽的本發明方法中之中間物。詳言之，此等肽之一為式XIVc之經保護之肽，其中P3及P6至P11為Bzl。
尤其適用作本發明方法中之中間物的另一肽為式XIIc之側鏈經保護之肽，其中P3及P6至P10為Bzl；且P4為Boc保護基，或P4為H。
尤其適用作本發明方法中之中間物的另一肽為式Xc之側鏈經保護之肽，其中P3及P6至P10為Bzl；且P17為Boc保護基，或P17為H。
尤其適用作本發明方法中之中間物的另一肽為式IXc之經保護之肽，其中P6及P7為Bzl；且P17較佳為Boc。
尤其適用作本發明方法中之中間物的另一肽為式VIIIc之側鏈經保護之肽，其中P3及P8至P10為Bzl；且P16為Boc保護基，或P16為H。
在另一態樣中，本發明亦係關於一種任何上述肽作為比伐盧定合成中之中間物的用途。
實施例
以下非限制性實施例將詳細說明本發明之代表性具體實例。
縮寫：
實施例1：製備H-Asn-Gly10-OBzl．TFA
於20℃下添加Boc-Asn-Gly-OBzl(90.20kg；Hexagon Labs Inc.，USA)至TFA(90L)、甲苯(388L)及THF(45L)之混合物中。於22℃下緩慢添加TFA(198L)至混合物中。於20℃下使反應完成。由HPLC監測裂解完成。
接著緩慢添加THF，且於真空中蒸發反應混合物。與甲苯與THF之混合物一起進行三次共沸蒸餾。獲得呈油狀殘餘物形式之H-Asn-Gly10-OBzl．TFA，用乙酸乙酯稀釋。此溶液直接用於下一化學步驟中(參見實施例3)。產率：100%。純度(根據HPLC)：99.3%。
實施例2：製備Boc-Gly5-Gly-Gly-Gly-OH．TEA(SEQ ID NO 10)
於20℃下緩慢添加TEA(73.1L)至Boc-Gly5-Gly-Gly-Gly-OEt(SEQ ID NO 10)[98.11kg；Bonora等人，Gazzetta Chinica Italiana 1980,110,503-510，類似地由Boc-Gly-Gly-OH(Senn Chemicals，Switzerland)及H-Gly-Gly-OEt．HCl(Senn Chemicals，Switzerland)製備]於丙酮(78.44L)與經處理之水(491L)之混合物中的懸浮液中。於20℃下使反應完成。由HPLC監測皂化完成。
於真空中蒸發溶液，且用經處理之水調整殘餘物體積至456L。此Boc-Gly5-Gly-Gly-Gly-OH．TEA(SEQ ID NO 10)溶液直接用於下一化學步驟中(參見實施例3)。產率：100%。純度(根據HPLC)：99.6%。
實施例3：製備Boc-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl(SEQ ID NO 5)
於0℃下用TEA將H-Asn-Gly10-OBzl．TFA(573L，參見實施例1)之乙酸乙酯溶液的pH值調至6-6.5。如自實施例2獲得之Boc-Gly5-Gly-Gly-Gly-OH(SEQ ID NO 10)溶液冷卻至0℃且添加，隨後添加HOBt(28.52kg)及EDC．HCl(69.81kg)。於0℃下用TEA(121L)將pH值調至6-6.5。使反應混合物升溫以達到室溫。
在完成偶合後(約10h後；如HPLC所指示)，添加NaCl
至反應混合物中。冷卻懸浮液及過濾，得到固體殘餘物，用NaCl水溶液洗滌若干次且接著冷卻。於真空中乾燥所得固體，得到130.15kg(100%)Boc-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl(SEQ ID NO 5)，純度為97.9%(根據HPLC)。
實施例4：製備H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl．TFA(SEQ ID NO 5)
於22℃之溫度下緩慢添加Boc-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl(SEQ ID NO 5)(131.20kg，參見實施例3)至TFA(131L)、甲苯(525L)及THF(105L)之混合物中。於22℃之溫度下緩慢添加TFA(289L)至反應混合物中。於20℃下使反應在約1.5小時內完成(由HPLC監測)。
於真空中濃縮反應混合物，且殘餘物傾倒於二異丙醚中。過濾所得懸浮液，得到固體，用二異丙醚洗滌若干次且接著於真空中乾燥，得到130.99kg H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl．TFA(SEQ ID NO 5)，純度為97.5%(根據HPLC)。
實施例5：製備H-Arg-Pro-OBzl．2HCl
於22℃下緩慢添加於乙酸(380L)中之鹽酸(1M)至Boc-Arg-Pro-OBzl．HCl(95.00kg；Hexagon Labs Inc.，USA)於乙酸(190L)及THF(19L)中之懸浮液中。由HPLC監測裂解完成(約1小時後)。
於真空中蒸發反應混合物。首先與乙酸一起共沸蒸餾，且接著與DMF一起共沸蒸餾。得到呈油狀殘餘物形式之H-Arg-Pro-OBzl．2 HCl，用DMF稀釋，獲得約380L之體積。所得溶液直接用於下一化學步驟中(參
見實施例7)。產率：100%。純度(根據HPLC)：96%。
實施例6：製備Boc-D-Phe-Pro-OPfp
於24℃下添加HOPfp(17.78kg)於乙酸乙酯(10L)中之溶液至Boc-D-Phe-Pro-OH(33.33kg；Bachem AG，Switzerland)於乙酸乙酯(183L)中之懸浮液中。於-6℃下緩慢添加DCC(21.44kg)於乙酸乙酯(83.3L)中之溶液至反應混合物中。接著混合物升溫至室溫。由HPLC監測偶合完成(約2小時)。
藉由過濾移除DCU鹽且用乙酸乙酯洗滌。於真空中蒸發濾液，直至達到約80L之殘餘體積。與甲苯一起共沸蒸餾若干次。油狀殘餘物於石油醚中沈澱。過濾固體，用石油醚洗滌且於真空中乾燥，獲得26.3kg(54%)Boc-D-Phe-Pro-OPfp，純度為99.3%(根據HPLC)。
實施例7：製備Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OBzl．HCl(SEQ ID NO 4)
於20℃下用DMF(360L)稀釋H-Arg3-Pro-OBzl．2HCl之溶液(103.00kg；561L溶液；參見實施例5)。在低於55℃下於真空中蒸發DMF(82L)。
接著於20℃下添加Boc-D-Phe1-Pro-OPfp(121.54kg；參見實施例6)至H-Arg3-Pro-OBzl．2HCl溶液中。於0℃下用TEA(58L)將所得混合物之pH值調至6.5。於0℃下使反應完成，歷時約20小時，如HPLC監測所指示。
濾除所得懸浮液之固體部分且用DMF洗滌。於真空中濃縮濾液，直至殘餘體積為約385L。添加去離子水、NaCl及乙酸乙酯之混合物。
分離各相且依次用NaHCO3水溶液、Na2CO3水溶液、HCl之鹽水溶液及最後用鹽水洗滌有機相。於真空中濃縮有機相，得到油狀殘餘物，藉由與甲苯一起共沸蒸餾來脫水且於20℃下在二異丙醚中沈澱。過濾所得懸浮液，得到固體，用二異丙醚洗滌若干次且於真空中乾燥，得到106kg Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OBzl．HCl(SEQ ID NO 4)，純度為96%(根據HPLC)。
實施例8：製備Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH(SEQ ID NO 4)
於20℃下用TFA/THF之混合物(50/50，V/V，0.03L)將Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OBzl．HCl(SEQ ID NO 4)(33.58kg，參見實施例7)於丙酮(67L)中之溶液的pH值調至4。添加所得混合物至鈀/木炭(3.36kg)於丙酮(17L)中之懸浮液中。在20℃下於約3巴氫氣壓力下氫化至少2小時。由HPLC監測氫化完成。
經纖維素濾筒過濾反應混合物。用丙酮洗滌濾餅若干次。於真空中濃縮合併之濾液。藉由使用丙酮與甲苯之混合物進行共沸蒸餾，使所得油狀殘餘物脫水。用乙酸乙酯稀釋油狀殘餘物且傾倒於二異丙醚中。過濾所得懸浮液，且用二異丙醚洗滌沈澱物若干次並於真空中乾燥，得到31.4kg Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH(SEQ ID NO 4)，純度為99.4%(根據HPLC)。
實施例9：製備Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl(SEQ ID NO 2)
於22℃下使用TEA(9L)將H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl．TFA(SEQ ID NO 5)(25.20kg，參見實施例4)於DMF(504L)及去離子水(25L)中之溶液的pH值調至6.5-7。於22℃下緩慢添加
Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH(SEQ ID NO 4)(25.46kg，參見實施例8)及HOBt(1.02kg)。於12℃下緩慢添加DIC(9.5L)至反應混合物中。於12℃下使用TEA(0.3L)將所得混合物之pH值調至7-7.5。於10℃下使反應完成，歷時10天，如HPLC及TLC所監測。
於真空中濃縮反應混合物，得到油狀殘餘物，使其於乙酸乙酯與二異丙醚之混合物中沈澱。移除上清液若干次且用相同體積之二異丙醚置換。過濾混合物，得到固體，用二異丙醚洗滌三次且於真空中乾燥，得到30.50kg(76%)Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl(SEQ ID NO 2)，純度為83.4%(根據HPLC)。
實施例10：製備Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH(SEQ ID NO 2)
添加Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl(SEQ ID NO 2)(23.43kg淨肽重量，參見實施例9)於丙酮(43L)與去離子水(9L)之混合物中的溶液至鈀/木炭(0.75kg)於丙酮(3L)中之懸浮液中。在20℃下於約3巴氫氣壓力下氫化11小時。由HPLC監測氫化完成。
添加去離子水(36L)至反應混合物中且經纖維素濾筒過濾所得混合物。用去離子水與丙酮之2：8混合物洗滌濾餅若干次。於真空中濃縮合併之濾液。藉由使用DMF與甲苯之混合物進行共沸蒸餾，使所得殘餘物脫水，得到21.5kg Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH(SEQ ID NO 2)，純度為80%(根據HPLC)。
實施例11：製備Boc-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl
將H-Leu-OBzl．對甲苯磺酸鹽(22.2kg；Bachem AG，Switzerland)懸浮於乙酸乙酯(108L)中，接著於室溫下添加TEA(約7.1L)。添加呈固體狀之Boc-Tyr(Bzl)-OH(20kg；Senn Chemicals，Switzerland)及HOBt(7.3kg)。於-6℃下添加DCC(12.2kg)於DMF(40L)中之溶液至混合物中。由TLC及HPLC監測反應完成。
藉由過濾來移除所形成之DCU。依次用KHSO4水溶液與鹽水之混合物、KHSO4水溶液、NaHCO3水溶液及鹽水洗滌濾液。於真空中蒸發有機相。將殘餘物溶解於乙酸乙酯中，且接著於石油醚中沈澱。過濾固體，用石油醚洗滌且於真空中乾燥。於真空中濃縮母液溶液及於石油醚中沈澱後，獲得第二批物質。過濾固體，用石油醚洗滌且於真空中乾燥。接著混合兩批物質，得到25.9kg(84%)Boc-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl，純度為97%(根據HPLC)。
實施例12：製備H-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl．TFA
於20℃下緩慢添加TFA(83L)至Boc-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(25.9kg，參見實施例11)、苯酚(1.3kg)、甲苯(104L)及THF(21L)之混合物中。於20℃下使反應完成。由HPLC監測裂解完成。
於真空中蒸發反應混合物。與甲苯與THF之混合物一起共沸蒸餾。接著添加乙酸乙酯及石油醚至殘餘物中。過濾固體，依次用乙酸乙酯與石油醚之混合物及石油醚洗滌，且最後於真空中乾燥，得到23.7kg(89%)H-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl．TFA，純度為98%(根據HPLC)。
實施例13：製備Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO 6)
添加Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-OSu(42.90kg，Senn Chemicals，Switzerland)至H-Tyr(Bzl)-Leu-OBzl．TFA(23.7kg，參見實施例12)於DMF(80L)中之溶液中。於0℃下用DIPEA將反應混合物之pH值緩慢調至7-7.5。於20℃下使反應混合物完成反應。由HPLC監測偶合完成。
於真空中蒸發反應混合物，且油狀殘餘物傾倒於經處理之水中。過濾固體，用經處理之水洗滌，於乙腈與經處理之水的混合物中再形成漿料且最後於真空中乾燥，得到40.3kg Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO 6)，純度為92%(根據HPLC)。
實施例14：製備H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl．TFA(SEQ ID NO 6)
於15℃下緩慢添加Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO 6)(117.45kg，參見實施例13)至TFA(117L)、苯酚(5.87kg)、甲苯(470L)及THF(94L)之混合物中。於17℃下再緩慢添加TFA(282L)至混合物中。於15℃下使反應完成。由HPLC監測裂解完成(3小時)。
在低於35℃下於真空中蒸發反應混合物。藉由與甲苯/THF之混合物一起共沸蒸餾，且接著與甲苯一起共沸蒸餾，來移除殘餘TFA。添加MTBE(825L)至油狀殘餘物中。接著添加石油醚至所得懸浮液中。冷卻後，過濾固體且用石油醚洗滌若干次。再懸浮於石油醚中且過濾後，用石油醚洗滌固體。重複一次此程序。接著於真空中乾燥固體，得到114.86kg(96%)H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl．TFA(SEQ ID NO 6)，純度為96%(根據HPLC)。
實施例15：製備Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-OH．DCHA(SEQ ID NO 7)
緩慢添加Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-OSu(62kg，Senn Chemicals，Switzerland)至H-Ile-Pro-OH．TFA(36kg，Bachem AG，Switzerland)於DMF(433L)中之溶液中。於0℃下用DIPEA將pH值調至7-7.5。由HPLC監測反應完成。
於真空中蒸發反應混合物且用乙酸乙酯稀釋油狀殘餘物。用KHSO4水溶液及鹽水洗滌混合物。於真空中蒸發有機層，且藉由與甲苯一起共沸蒸餾，使油狀殘餘物脫水。用甲苯稀釋油狀殘餘物，且用DCHA將pH值調至7-7.5。接著添加石油醚至混合物中。過濾由此獲得之固體，用石油醚洗滌且於真空中乾燥，得到102kg Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-OH．DCHA(SEQ ID NO 7)，純度為89%(根據HPLC)。
實施例16：製備Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO 8)
於24℃下緩慢添加Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-OH．DCHA(SEQ ID NO 7)(98.88kg，參見實施例15)及HOBt(13.82kg)至H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl．TFA(SEQ ID NO 6)(110.39kg，淨肽重量，參見實施例14)於DMF(451L)中之溶液中。於-6℃下分小份添加EDC．HCl(22.99kg)至混合物中。於-6℃下用TEA(12L)將反應混合物之pH值調至6.5-7。於10℃下使偶合完成，歷時16小時，如HPLC所監測。
藉由過濾來移除鹽。於真空中蒸發濾液。使油狀殘餘物(470
L)於NaHCO3溶液中沈澱。過濾固體且用經處理之水洗滌若干次。再懸浮於經處理之水中後，添加乙腈。接著冷卻懸浮液。過濾固體，用水洗滌且於真空中乾燥，得到160.34kg(88%)Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO 8)，純度為90%(根據HPLC)。
實施例17：製備H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl．TFA(SEQ ID NO 8)
於15℃下添加Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO 8)(72.24kg，參見實施例16)至TFA(72L)、甲苯(289L)及THF(6L)之混合物中。於22℃下再緩慢添加TFA(159L)至混合物中。於20℃下使反應完成，歷時2.5小時(由HPLC監測)。於真空中蒸發反應混合物。藉由與甲苯與THF之混合物一起共沸蒸餾若干次來移除殘餘TFA。用甲苯稀釋油狀殘餘物且傾倒於二異丙醚中。過濾固體且用二異丙醚洗滌若干次。再懸浮於乙腈與二異丙醚之混合物中後，接著過濾固體，用二異丙醚洗滌若干次且最後於真空中乾燥，得到61.7kg(87%)H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl．TFA(SEQ ID NO 8)，純度為88.9%(根據HPLC)。
實施例18：製備Boc-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO 9)
於24℃下緩慢添加Boc-Phe-OH(10.03kg；Senn Chemicals AG，Switzerland)及HOBt(4.95kg)至H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl．TFA(SEQ ID NO 8)(61.63kg，
參見實施例17)於DMF(264L)中之溶液中。於-5℃下緩慢添加EDC．HCl(8.53kg)。於-5℃下用DIPEA(47.5L)將反應混合物之pH值逐漸調至6.5-7。於10℃下使偶合完成，歷時23小時(由HPLC監測)。
於真空中蒸發反應混合物。將油狀殘餘物懸浮於NaHCO3溶液中。過濾固體，用經處理之水洗滌若干次且於真空中乾燥，得到67.64kg(95%)Boc-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO 9)，純度為87.9%(根據HPLC)。
實施例19：製備H-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl．TFA(SEQ ID NO 9)
於15℃下分小份添加Boc-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO 9)(67.66kg，參見實施例18)至TFA(68L)、苯酚(3.38kg)、甲苯(271L)及THF(54L)之混合物中。於15℃下再緩慢添加TFA(149L)至混合物中。由HPLC監測裂解完成(4.3小時)。
於真空中蒸發反應混合物。藉由與甲苯與THF之混合物一起共沸蒸餾若干次來移除殘餘TFA。用甲苯稀釋油狀殘餘物且傾倒於二異丙醚中。過濾固體，用二異丙醚洗滌若干次且於真空中乾燥，得到67.25kg(99%)H-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl．TFA(SEQ ID NO 9)，純度為86.6%(根據HPLC)。
實施例20：製備Boc-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ilel5-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO 3)
於20℃下分小份添加Boc-Asp(OBzl)11-OH(20.22kg)(Senn
Chemicals AG，Switzerland)及HOBt(8.42kg)至H-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl．TFA(SEQ ID NO 9)(60.46kg淨肽重量，參見實施例19)於DMF(370L)中之溶液中。於-5℃下緩慢添加EDC．HCl(13.38kg)至反應混合物中。於-5℃下用DIPEA(27L)將所得混合物之pH值逐漸調至6.5-7。接著於10℃下使偶合反應完成，歷時35小時(由HPLC監測)。
接著於真空中濃縮反應混合物。緩慢添加所得油狀殘餘物至NaHCO3水溶液中。過濾所得懸浮液且再懸浮於去離子水中。過濾且用去離子水洗滌若干次並用乙腈與去離子水之混合物洗滌一次後，於真空中乾燥所得固體，得到64kg(96%)Boc-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO 3)，純度為81.4%(根據HPLC)。
實施例21：製備H-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl．TFA(SEQ ID NO 3)
於低於15℃之溫度下分小份添加Boc-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO 3)(64.00kg，參見實施例20)至TFA(64L)、苯酚(3.2kg)、甲苯(265L)及THF(51L)之混合物中。於15℃下再緩慢添加TFA(141L)至反應混合物中。於15℃下裂解，歷時4.8小時(由HPLC監測)。
於真空中濃縮反應混合物。於20℃下添加所得油狀殘餘物至二異丙醚中以沈澱。過濾所得懸浮液，再懸浮於二異丙醚中且再次過濾。用二異丙醚洗滌固體且於真空中乾燥，得到61.4kg(淨肽重量)(95%)
H-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl．TFA(SEQ ID NO 3)，純度為77.6%(根據HPLC)。
實施例22：製備Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO 1)
於24℃下分小份添加H-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl．TFA(SEQ ID NO 3)(104.40kg，參見實施例21)及HOBt(8.42kg)至Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH(SEQ ID NO 2)(65.47kg，參見實施例10)於DMF(345L)中之溶液中。於-5℃下緩慢添加EDC．HCl(12.46kg)。於-5℃下用TEA(16.5L)將反應混合物之pH值逐漸調至6.5-7。於-5℃下使偶合完成，歷時22小時(由HPLC監測)。
用去離子水緩慢稀釋反應混合物。過濾所得懸浮液，用去離子水洗滌且於真空中乾燥，得到72kg(50%)Boc-D-1Phe-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl(SEQ ID NO 1)，純度為81.4%(根據HPLC)。
實施例23：製備H-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OH．2TFA(比伐盧定)(SEQ ID NO 1)
添加Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-O
Bzl(SEQ ID NO 1)(15.00kg，參見實施例22)於乙酸(53L)中之懸浮液至鈀/木炭(1.13kg)、去離子水(6L)及乙酸(5L)之混合物中。在37℃下於約3巴氫氣壓力下氫化(由HPLC監測)。
完成(5小時)後，冷卻反應混合物且用去離子水及乙酸稀釋。經纖維素濾筒過濾所得混合物，用乙酸與經處理之水的混合物洗提若干次。於真空中濃縮濾液。藉由卡耳-費雪滴定法(Karl Fischer titration)測試所得殘餘物之水含量(水含量<5.0%)。
接著添加甲苯至油狀殘餘物中，隨後添加TFA。由HPLC監測裂解完成(1小時後)。
於真空中濃縮反應混合物。添加所得油狀殘餘物至二異丙醚中以沈澱。過濾所得懸浮液，得到固體，用二異丙醚洗滌若干次且於真空中乾燥，得到8.41kg(淨肽重量)(78%)粗H-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-H．2TFA(比伐盧定)(SEQ ID NO 1)，粗比伐盧定之純度為65%(根據HPLC)。經HPLC偵測，無D-Phe12-比伐盧定雜質形成，亦即位置12未出現外消旋化。
藉由C18逆相固定相上之製備型HPLC來純化粗肽。在第一步驟中藉由用乙酸銨/水/乙腈進行梯度洗提來純化粗比伐盧定，且在第二步驟中藉由用三氟乙酸/水/乙腈進行梯度洗提來純化。濃縮含有純產物之洗提液部分且凍乾，得到5.89kg(70%，以粗肽中之比伐盧定含量計)呈白色粉末狀之H-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-H．2TFA(比伐盧定)(SEQ ID NO 1)，純度為99%(根據HPLC)。經偵測，無D-Phe12-比伐盧定及D-Tyr19-比伐盧定形成，且
所偵測到之其他各雜質不超過0.2%(根據HPLC)。
<110> 隆沙布萊恩公司
<120> 比伐盧定(Bivalirudin)的製造方法
<130> TW103128940
<160> 10
<170> PatentIn 3.3版
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的構築體
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (1)..(1)
<223> Phe之D鏡相異構物(D-Phe)
<400> 1
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的構築體
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (1)..(1)
<223> Phe之D鏡相異構物(D-Phe)
<400> 2
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的構築體
<400> 3
<210> 4
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的構築體
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (1)..(1)
<223> Phe之D鏡相異構物(D-Phe)
<400> 4
<210> 5
<21> 6
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的構築體
<400> 5
<210> 6
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的構築體
<400> 6
<210> 7
<21> 4
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的構築體
<400> 7
<210> 8
<21> 8
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的構築體
<400> 8
<210> 9
<21> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的構築體
<400> 9
<210> 10
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的構築體
<400> 10
Claims (5)
- 一種肽，其係選自由以下者所組成之群組：(i)下式之視情況側鏈經保護之肽H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2(SEQ ID NO 5) (VI)，其中P2為可藉由催化性氫化移除且與視情況存在之側鏈保護基正交的保護基；(ii)下式之視情況側鏈經保護之肽P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2(SEQ ID NO 2) (VII)，其中P1為對催化性氫化穩定之保護基且P2為如上所定義；(iii)下式之側鏈經保護之肽P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH(SEQ ID NO 2) (IIa)，其中P1如上所定義，除了Boc-D-Phe1-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly10-OH；(iv)下式之側鏈未經保護之肽P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH(SEQ ID NO 2) (IIb)，其中P1如上所定義。
- 如申請專利範圍第1項之肽，其中該式VI之視情況側鏈經保護之肽為H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl(SEQ ID NO 5)。
- 如申請專利範圍第1項之肽，其中該式VII之視情況側鏈經保護之肽為Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl(SEQ ID NO 2)。
- 如申請專利範圍第1項之肽，其中該式IIb之側鏈未經保護之肽為Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH(SEQ ID NO 2)。
- 一種任一如申請專利範圍第1至4項中任一項之肽的用途，其用作比伐盧定合成中之中間物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP08022479 | 2008-12-29 | ||
| US26047109P | 2009-11-12 | 2009-11-12 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TW201630927A true TW201630927A (zh) | 2016-09-01 |
| TWI599580B TWI599580B (zh) | 2017-09-21 |
Family
ID=42060981
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TW105115041A TWI599580B (zh) | 2008-12-29 | 2009-12-21 | 比伐盧定（Ｂｉｖａｌｉｒｕｄｉｎ）的製造方法 |
| TW103128940A TWI538919B (zh) | 2008-12-29 | 2009-12-21 | 比伐盧定（Ｂｉｖａｌｉｒｕｄｉｎ）的製造方法 |
| TW098143850A TWI453216B (zh) | 2008-12-29 | 2009-12-21 | 比伐盧定（Ｂｉｖａｌｉｒｕｄｉｎ）的製造方法 |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TW103128940A TWI538919B (zh) | 2008-12-29 | 2009-12-21 | 比伐盧定（Ｂｉｖａｌｉｒｕｄｉｎ）的製造方法 |
| TW098143850A TWI453216B (zh) | 2008-12-29 | 2009-12-21 | 比伐盧定（Ｂｉｖａｌｉｒｕｄｉｎ）的製造方法 |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US8921517B2 (zh) |
| EP (1) | EP2382232B1 (zh) |
| JP (2) | JP5730781B2 (zh) |
| KR (1) | KR101653950B1 (zh) |
| CN (3) | CN103864895A (zh) |
| AR (1) | AR074944A1 (zh) |
| AU (1) | AU2009335350A1 (zh) |
| CA (2) | CA2916716C (zh) |
| CO (1) | CO6400148A2 (zh) |
| DK (1) | DK2382232T3 (zh) |
| EA (1) | EA201101015A1 (zh) |
| ES (1) | ES2439502T3 (zh) |
| HK (1) | HK1162527A1 (zh) |
| IL (1) | IL213457A (zh) |
| MX (1) | MX2011006950A (zh) |
| SG (1) | SG171859A1 (zh) |
| TW (3) | TWI599580B (zh) |
| WO (1) | WO2010075983A1 (zh) |
| ZA (1) | ZA201104195B (zh) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE602005023429D1 (de) | 2004-10-19 | 2010-10-21 | Lonza Ag | Verfahren zur festphasen-peptidsynthese |
| EP2349307B1 (en) * | 2008-09-03 | 2015-03-04 | ScinoPharm Taiwan, Ltd. | Process for making bivalirudin |
| US7985733B1 (en) | 2010-01-06 | 2011-07-26 | The Medicines Company | Buffer-based method for preparing bivalirudin drug product |
| CN102816208B (zh) * | 2011-06-10 | 2016-11-23 | 江苏豪森药业集团有限公司 | 一种比伐卢定的液相合成方法 |
| CN102532274B (zh) * | 2012-02-13 | 2014-04-23 | 成都圣诺生物制药有限公司 | 一种比伐卢定的制备方法 |
| CN102731624B (zh) * | 2012-06-14 | 2015-09-23 | 无锡市凯利药业有限公司 | 一种固相片段法合成比伐卢定的方法 |
| CN102702325B (zh) * | 2012-06-19 | 2015-09-23 | 深圳翰宇药业股份有限公司 | 一种抗凝血多肽的制备方法 |
| EP2864349A4 (en) * | 2012-06-20 | 2016-02-24 | Univ California | DYNAMIC BIOMIMETIC SYNZYM CATALYST, CATALYSIS AND CATALYST SYSTEMS |
| WO2014032257A1 (zh) * | 2012-08-30 | 2014-03-06 | 深圳翰宇药业股份有限公司 | 一种比伐卢定的制备方法 |
| CN103965293B (zh) * | 2013-02-05 | 2020-02-14 | 深圳信立泰药业股份有限公司 | 一种高纯度比伐卢定及其工业化制备方法 |
| CN103242431B (zh) * | 2013-05-20 | 2015-05-13 | 齐鲁制药有限公司 | 一种比伐卢定的制备方法 |
| CN110204611B (zh) * | 2019-06-26 | 2023-11-07 | 海南中和药业股份有限公司 | 一种固相片段法合成比伐卢定 |
| CN115073587B (zh) * | 2022-07-08 | 2024-08-23 | 厦门胜泽泰医药科技有限公司 | 一种半连续液相合成比伐芦定的合成工艺 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990003391A1 (en) * | 1988-09-29 | 1990-04-05 | Biogen, Inc. | Hirudin peptides |
| US5196404B1 (en) * | 1989-08-18 | 1996-09-10 | Biogen Inc | Inhibitors of thrombin |
| GB9708918D0 (en) | 1997-05-01 | 1997-06-25 | Ppl Therapeutics Scotland Ltd | Methods |
| EP1543039B1 (en) * | 2002-08-12 | 2011-07-13 | The Council Of The Queensland Institute Of Medical Research | Novel immunogenic lipopeptides comprising t-helper and b-cell epitopes |
| US7812158B2 (en) * | 2003-10-31 | 2010-10-12 | University Of Massachusetts | Coupling agents for peptide synthesis |
| DE602005023429D1 (de) * | 2004-10-19 | 2010-10-21 | Lonza Ag | Verfahren zur festphasen-peptidsynthese |
| WO2006081249A2 (en) | 2005-01-25 | 2006-08-03 | Cell Therapeutics, Inc. | Conjugates of biologically active proteins having a modified in vivo half-life |
| CN101111516B (zh) * | 2005-01-25 | 2013-02-27 | 细胞治疗学公司 | 体内半衰期改变的生物活性蛋白质偶联物 |
| EP1805204A2 (en) * | 2005-09-14 | 2007-07-11 | Novetide Ltd. | Process for production of bivalirudin |
| US20070213505A1 (en) * | 2006-03-08 | 2007-09-13 | David Epstein | Solution Synthesis of Peptide Cell Growth Stimulators |
| CN101033249B (zh) * | 2006-03-10 | 2011-05-11 | 周逸明 | 固相多肽合成比筏芦定的制备方法 |
| EP2349307B1 (en) * | 2008-09-03 | 2015-03-04 | ScinoPharm Taiwan, Ltd. | Process for making bivalirudin |
-
2009
- 2009-12-17 CN CN201410073797.8A patent/CN103864895A/zh active Pending
- 2009-12-17 ES ES09795927.4T patent/ES2439502T3/es active Active
- 2009-12-17 MX MX2011006950A patent/MX2011006950A/es unknown
- 2009-12-17 US US13/139,956 patent/US8921517B2/en active Active
- 2009-12-17 AU AU2009335350A patent/AU2009335350A1/en not_active Abandoned
- 2009-12-17 KR KR1020117017887A patent/KR101653950B1/ko active IP Right Grant
- 2009-12-17 CA CA2916716A patent/CA2916716C/en active Active
- 2009-12-17 WO PCT/EP2009/009080 patent/WO2010075983A1/en active Application Filing
- 2009-12-17 SG SG2011039179A patent/SG171859A1/en unknown
- 2009-12-17 CN CN200980152943.3A patent/CN102264757B/zh active Active
- 2009-12-17 JP JP2011543985A patent/JP5730781B2/ja active Active
- 2009-12-17 CN CN201410073688.6A patent/CN103864894B/zh active Active
- 2009-12-17 DK DK09795927.4T patent/DK2382232T3/da active
- 2009-12-17 CA CA2744627A patent/CA2744627C/en active Active
- 2009-12-17 EA EA201101015A patent/EA201101015A1/ru unknown
- 2009-12-17 EP EP09795927.4A patent/EP2382232B1/en active Active
- 2009-12-21 TW TW105115041A patent/TWI599580B/zh not_active IP Right Cessation
- 2009-12-21 TW TW103128940A patent/TWI538919B/zh not_active IP Right Cessation
- 2009-12-21 TW TW098143850A patent/TWI453216B/zh not_active IP Right Cessation
- 2009-12-29 AR ARP090105164A patent/AR074944A1/es not_active Application Discontinuation
-
2011
- 2011-06-06 ZA ZA2011/04195A patent/ZA201104195B/en unknown
- 2011-06-09 IL IL213457A patent/IL213457A/en active IP Right Grant
- 2011-06-20 CO CO11076777A patent/CO6400148A2/es not_active Application Discontinuation
-
2012
- 2012-03-16 HK HK12102674.5A patent/HK1162527A1/zh not_active IP Right Cessation
-
2014
- 2014-11-25 US US14/552,807 patent/US20150080550A1/en not_active Abandoned
- 2014-11-27 JP JP2014240227A patent/JP5996618B2/ja active Active
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| TWI599580B (zh) | 比伐盧定（Ｂｉｖａｌｉｒｕｄｉｎ）的製造方法 | |
| US20110160431A1 (en) | Production of peptides containing poly-gly sequences using fmoc chemistry | |
| US20110319594A1 (en) | Method for producing bivalirudin | |
| US20140128572A1 (en) | Process For Extraction Of Peptides And Its Application In Liquid Phase Peptide Synthesis | |
| US20170029467A1 (en) | Method of producing bivalirudin | |
| US20100292436A1 (en) | Method for producing bivalirudin | |
| CN112912390B (zh) | Glp-1类似物的制备方法 | |
| EP3781586B1 (en) | A method for production of high purity icatibant | |
| CN113150108B (zh) | 一种利拉鲁肽的固相合成方法 | |
| CN114945580B (zh) | 用于合成南吉博肽的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees |