JP3466614B2 - 血栓症のインヒビター - Google Patents

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【発明の詳細な説明】 関連出願 本出願は1993年２月12日に出願した米国特許出願第08
/017125号および現在放棄されている1992年２月14日に
出願した米国特許出願第07/836123号の一部継続出願で
あり、該米国特許出願の明細書および図面もこの出願の
一部をなす。

発明の分野 １つの観点によれば、本発明はトロンビンまたは第X
a因子に対する強いインヒビターである化合物に関す
る。他の観点から本発明は、哺乳類の血液凝固の強力で
特異的なインヒビターとして有用なペプチドアルデヒド
類縁体、その薬学的に許容され得る塩および薬学的に許
容され得るこれらの組成物に関する。さらに他の観点に
おいては、本発明はこれらのインヒビターの、異常な血
栓症に特徴付けられる哺乳類の疾患の治療用剤の用途に
関する。

発明の背景 正常な止血は凝血塊の生成（血液凝固）および凝血塊
の溶解（フィブリノリシス）の間の複雑なバランスの結
果による。血液細胞、特定の血漿タンパク質および血管
表面の複雑な相互作用により傷害や血液の消失が生じな
い限り順調の血液の流れを維持している。

血液凝固は、血漿中の複数の特定セリンプロテアーゼ
のザイモゲン類が限定的タンパク質分解によって活性化
されて増幅される、一連の反応の頂点である。ネマーソ
ンとノッシール、アニュアル・レビュー・オブ・メディ
シン33:479（1982）。この一連の反応の結果、不溶性の
フィブリンマトリックスが形成されるが、これは初期止
血プラグとして必要である。活性化反応間の相互作用お
よび増幅作用は外因性および内因性の血液凝固経路を介
して生じる。この経路は非常に相互依存しており、セリ
ンプロテアーゼである第X a因子の産生で収束する。第X
a因子は血液凝固カスケードの最後から２番目の反応を
触媒するが、これはセリンプロテアーゼであるトロンビ
ンの生成工程である。この反応は第X a因子、非酵素補
因子V aおよび、粘着、活性化された血小板の表面また
は全身を循環する膜性微粒子の表面上に結合されている
基質プロトロンビンからなるプロトロンビナーゼ複合体
が生成した後に生じる。

第Ｘ因子をその活性形である第X a因子に変えるタン
パク質分解による活性化は、内因性経路または外因性経
路のいずれででも起こり得る。内因性経路は血液凝固に
必要な成分がすべて血液内に由来することから「内因
性」と呼ばれる。サイトウ、「正常な止血機構」止血異
常、第27〜29頁、グルン・アンド・ストラットン・イン
コーポレイテッド（オー・ディー・ランドフ、エム・デ
ィーおよびシィー・ディーフォーブス編集1984）。この
経路にはセリンプロテアーゼのザイモゲンである第IX因
子と第XI因子、および非酵素的補因子である第VIII因子
を含む。内因性経路が開始されると、第XI因子が第XI a
因子へと活性化される。第XI a因子は、第IX因子から第
IX a因子への活性化を触媒し、第IX a因子は適当なリン
脂質表面上の第VIII因子の活性形と共にテナーゼ（tena
se）複合体を生成する。該複合体はさらに、ザイモゲン
である第Ｘ因子からセリンプロテアーゼである第X a因
子形成を刺激し、その結果凝血塊が生じる。

外因性経路は第VII因子に結合し、活性化させる因子
である組織因子が血液外に由来するものであるために
「外因性」と呼ばれる。サイトウ、同。この経路の主な
成分は、セリンプロテアーゼのザイモゲンである第VII
因子、および膜結合性タンパク質である組織因子であ
る。後者はこの酵素に対する必須の非酵素補因子であ
る。外因性経路が開始されると、ザイモゲンである第VI
I因子が痕跡量の活性化された第VII因子（第VII a因
子）によって活性化され、いずれも血管損傷部位の膜表
面へ新たに露出された組織因子と結合する。第VII a因
子／組織因子複合体はセリンプロテアーゼである第X a
因子を、そのザイモゲン第Ｘ因子を活性化して生成す
る。傷を受けた組織が血液にさらされると、外因性血液
凝固経路が開始される。

ザイモゲンである第Ｘ因子を触媒活性であるX aへ変
えるタンパク質分解酵素による活性化によって、52個の
アミノ酸の活性化ペプチドが重鎖サブユニットのアミノ
末端から分離される。内因性活性化反応は非酵素補因子
である第VIII a因子と巨大分子複合体を形成している第
IX a因子により触媒される。外因性経路による第X a因
子の形成反応は第VII a因子および組織因子の触媒性複
合体により触媒される。両反応はカルシウムイオンの存
在下、適当なリン脂質表面上で行われる。内因性または
外因性のいずれかの経路による第Ｘ因子の活性化に続い
て産生される活性生成物は、α−第X a因子である。第
２のタンパク質分解性切断は自己触媒性の反応であると
考えられており、これは重鎖のカルボキシ末端からの14
個のアミノ酸からなるペプチドの分離によりβ第X a因
子が生成される反応である。活性化された分子の両方の
形態は、血漿内における凝固の促進またはペプチジルク
ロモジェニック基質の加水分解の促進能として測定し得
る同様の触媒活性を示す。

トロンビンの生成は、マンら、「ビタミンＫ依存性酵
素複合体の表面依存性反応」、ブロッド、76:1〜16（19
90）に説明されているように、触媒性プロトロンビナー
ゼ複合体の構築に続く、第X a因子の触媒によりなされ
る。この複合体は第X a因子、非酵素補因子V aおよび基
質であるプロトロンビンから成り、これらすべては適当
なリン脂質表面上で組合わされている。効果的な触媒の
ための巨大分子複合体が形成されることによって、ヘパ
リン−抗トロンビンIIIが仲介する阻害作用のごとき天
然の抗凝固機構からX aが保護される。テイトとローゼ
ンベルグ「第X a因子のヘパリン−抗トロンビン複合体
による中和からの保護」、ジャーナル・オブ・クリニカ
ル・インベスティゲイション71:1383−1391（1983）。
さらに、プロトロンビナーゼ複合体中において第X a因
子が隔離されていることにより、抗トロンビンIIIを必
要とする外来性のヘパリン治療における抗凝固効果の発
現に対しても抵抗性を示す結果となる。

トロンビンは血栓生成の主要なメディエーターであ
る。トロンビンは循環しているフィブリノーゲンからの
不溶性フィブリンが生成される直接の原因となるよう働
く。さらに、トロンビンはザイモゲンである第XIII因子
を、フィブリン架橋をクロスリンクさせて血栓の安定性
を共有結合的に強化させる、活性トランスグルタミナー
ゼである第XIII a因子に活性化する。ローランドとコニ
シ、アチーブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・
バイオフィジックス、105:58（1964）。トロンビンは、
フィブリンの多い凝血塊の生成および安定化における直
接的な役割の他に、血管および血液内の数多くの細胞成
分に対する生物調節的役割を担っていることが報告され
ている。シューマン、アナルス・オブ・ニュー・ヨーク
・アカデミー・オブ・サイエンス、405:349（1986）。

トロンビンは血小板活性化に対する最も強力なアゴニ
ストであり、血小板依存性動脈血栓の生成における主要
な病態生理学的メディエーターであると考えられてい
る。エヂットら、ジャーナル・オブ・クリニカル・イン
ベスティゲーションズ、84:18（1989）。トロンビンの
媒介する血小板活性化は主に、フィブリノーゲンおよび
フィブロネクチンのごとき接着性リガンドと、グリコプ
ロテインII b/III aのごとき血小板インテグリン受容体
との間の二価の相互作用を介して生じるリガンド誘導性
血小板凝集を導く。このような活性コンフォメーション
はトロンビンの活性化の後に続いて生成される。ベーン
トとフィリップス、「パレートレッツ・イン・バイオロ
ジー・アンド・パソロジー」43〜74頁、エルスフィアー
／ノース・オランダ・バイオメディカル・プレス（ゴー
ドン編集、1981）。トロンビンに活性化された血小板
は、新規なプロトロンビナーゼとテナーゼ（第IX a因
子、第VIII a因子および第Ｘ因子）すなわちそ活性化血
小板および該血小板から誘導される微粒子の膜表面上の
触媒複合体の構築を通してさらなるトロンビンの産生を
持続し得、これに続いて非酵素補因子である第Ｖ因子お
よび第VIII因子がそれぞれ活性化される。タンスら、ブ
ロッド、77:2641（1991）。このポジティブなフィード
バック経路によって血栓の近辺の局部的に高濃度のトロ
ンビンが、血栓のさらなる成長および伸展を支持するの
である。マンら、ブロッド、76:1（1990）。

血栓生成の前段階の効果とは対照的に、トロンビンは
止血において他の観点からも拘わっている。他の効果に
は、重要な生理的抗凝固作用剤としての効果が含まれ
る。トロンビンのこの抗凝固効果はトロンビンが内皮細
胞膜の糖タンパク質であるトロンボモジュリンへ結合し
た後に生じる。この結合によって、トロンビンの基質特
異性が変わり、これによって循環しているプロテインＣ
を認識し、タンパク質分解的に活性プロテインＣ（aP
C）へと活性化させることが可能となると説明されてい
る。ムッシ、バイオケミストリー、27:769（1988）。aP
Cはセリンプロテアーゼであり、非酵素補体第V a因子お
よび第VIII a因子を選択的に不活性化させ、プロトロン
ビナーゼおよびテナーゼ触媒複合体によるトロンビンの
形成をそれぞれダウンレギュレーションする。エスモ
ン、サイエンス、235:1348（1987）。トロンボモジュリ
ンが無い条件下におけるトロンビンによるプロテインＣ
の活性化は認められない。

トロンビンは、血管平滑筋細胞のごとき間葉由来の細
胞を含む、様々な種類の細胞に対する強力な直接マイト
ジェンとなることもさらに示されている。チェンとブッ
ハナン、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー、72:131（19
75）。トロンビンの血管平滑筋細胞との直接的な相互作
用により血管が収縮される。ワルツら、プロシーディン
グス・オブ・ソサエティー・フォア・エクスペリメンタ
ル・バイオロジー・アンド・メディシン、180:518（198
5）。トロンビンは、血管内皮細胞からの様々な生理活
性物質を遊離させることを含む、直接分泌促進剤として
働く。この遊離される物質には組織プラスミノーゲン活
性化剤も含まれる。レバインら、トロンボシス・アンド
・ヘモスタシス、56:115（1986）。上記のごとき血管細
胞に対する直接的な作用に加え、トロンビンは血管平滑
筋細胞に対して間接的に強い細胞増殖誘導性活性を示
す。即ちトロンビンは血小板を活性化させた後、血小板
のα顆粒に含まれるいくつかの強力な成長因子（例えば
血小板由来成長因子および表皮成長因子）が遊離すると
いう作用も示す。ロス、ニュー・イングランド・ジャー
ナル・オブ・メディシン、314:408（1986）。

重篤疾患には止血異常が関与していることが多い。冠
動脈血管系については、形成されたアテローム性動脈硬
化症プラークの破裂に起因する異常な血栓の生成が、急
性心筋梗塞および不安定なアンギナの主な原因となる。
さらに、冠血管閉塞性血栓の治療としては血栓溶解治療
または経皮的冠血管拡張形成法（PTCA）のいずれかが行
われているが、治療された血管の急性血栓性再閉塞を伴
うことが多く、これには早急に血栓の再溶解の必要があ
る。静脈血管に関しては下肢または腹部の大手術を行っ
た患者には高率で静脈内に血栓が形成され、その結果血
流が減少して四肢に影響が及び、肺動脈閉栓症にかかり
やすくなる。血管内凝血異常の拡散は通常、敗血症ショ
ックの間、ある種のウイルスの感染および癌の場合の血
管系に起こり、これは凝固因子の急速な消失および、広
範囲の器官の損傷を導き、生命を脅かすこととなる全身
性の血栓生成に特徴付けるられる。

冠動脈血管における病原性血栓は、今日の医学におい
て最も臨床的に興味をもたれている分野である。という
のは、病原性血栓が急性心筋梗塞の主な原因であり、ま
たこの急性心筋梗塞は西側諸国においての主要な死因の
うちのひとつであるという理由による。動脈血栓症の再
発もまた、閉塞した冠血管を血栓溶解剤または経皮的冠
血管拡張形成法（PTCA）のそれぞれにより酵素または機
械的に再開通させたあとに生じる疾患の主な原因として
残っている。ロス、トロンボシス・イン・カルディオバ
スクラー・ディスオーダー第327頁、サウンダーズ・コ
ーポレイション（ヒュスターとバーストレート編集、19
91年）；キャリフとウイラーソン、同、第389頁。静脈
血管内における血栓症と比べると、動脈血栓は血液凝固
カスケードの結果のフィブリン形成と、細胞成分、特に
動脈の血栓中の大きな割合を占める血小板との複雑な相
互作用の結果物である。現在、急性動脈血栓または再血
栓の治療または予防効果のある治療法は知られていな
い、というのは、臨床的に最も広く使用されている、静
脈内投与する抗凝血剤であるヘパリンが、この症状に効
果があるという結果が得られていないからである。プリ
ンスとヒルシュ、ジャーナル・オブ・アメリカン・カレ
ッジ・オブ・カルディオロジー、67:3A（1991）。

通常PTCAの後に発生する、予測し得ない血管閉塞の再
発の他にも、再開通させた血管の再狭搾はこの処置の後
１から６カ月の後に30から40％の患者に認められる。キ
ャリフら、ジャーナル・オブ・アメリカン・カレッジ・
オブ・カルディオロジー、17:2B（1991）。これらの患
者には、PTCAをもう一度行う処置、または冠動脈バイパ
ス手術を行うことによって新たに形成された狭搾をを除
く処置のいずれかが必要である。機械的な損傷を受けた
血管の再狭搾は血栓生成によって生じるのではなく、周
囲の平滑筋細胞の過増殖性応答が長時間続くことによ
る、筋肉の量の増加のために生じる血管口径の減少に起
因する。同。動脈血栓の場合と同様に、機械的に再開通
させた後に生じる血管再狭搾の予防のための薬による治
療には現在のところ有効なものは無い。

安全で有効な治療用抗凝血剤の必要性については、ひ
とつの試みとして血液凝固カスケードの最後から２番目
の段階でセリンプロテアーゼであるトロンビンを形成す
る触媒として働く第X a因子の役割に焦点をあてた。

最も好ましいトロンビンの天然基質はP3認識サブサイ
トにおいて非荷電アミノ酸を含有するものであることが
報告されている。例えば、トロンビンの主な生理的基質
であるフィブリノーゲンのＡα鎖上には、当該位置にグ
リシン残基があることが報告されており、一方、Ｂβ鎖
には当該位置にセリン残基がある： P4 P3 P2 P1 P1' −Gly−Gly−Val−Arg/Gly フィブリノーゲンＡα鎖 −Phe−Ser−Ala−Arg/Gly フィブリノーゲンＢβ鎖 非荷電残基をP3位に有するペプチジル誘導体はトロン
ビンの活性部位に結合し、これによってフィブリノーゲ
ンからフィブリンへの転換および細胞の活性化が抑制さ
れることが報告されている。さらに、このような誘導体
にはアルデヒド、クロロメチルケトンまたはホウ酸官能
基のいずれかがP1アミノと結合している。例えば、基質
類似ペプチジル誘導体、例えばＤ−フェニルアラニル−
プロリル−アルギニナル（Ｄ−Phe−Pro−Arg−al）、
Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−アルギニン−クロロ
メチルケトン（Ｐ−PACK）およびアセチル−Ｄ−フェニ
ルアラニル−プロリル−ボロアルギニン（Ac−（Ｄ−Ph
e）−Pro−boroArg）が酵素の活性部位に直接結合して
トロンビンの活性を抑制することが報告されている。バ
ジャス、シンポジア・バイオロジカ・ハンガリカ、25:2
77（1984）、バジャスら、ジャーナル・オブ・メディシ
ナル・ケミストリー、33:1729（1990）およびバジャス
ら、インターナショナル・ジャーナル・オブ・ペプチド
・プロテイン・リサーチ、12:217（1970）；ケットナー
とショウ、メソッズ・オブ・エンザイモロジー、80:826
（1987）；ケットナーら、欧州特許願EP293,881号（198
8年12月７日公開）；ケットナーら、ジャーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリー、265:18209（199
0）。これらの分子は血小板量の多い動脈血栓を予防す
るための強力な抗凝血剤であることが報告されている。
ケリーら、トロンボシス・アンド・ヘモスタシス、65:7
36、要約257（1991）。トロンビンの阻害剤として提案
または報告されている他のペプチジルアルデヒドもあ
る。ベイら、EP363,284（1990年４月11日公開）および
バラスブラマニアンら、EP526,877（1993年２月10日公
開）。

トロンビンの活性部位阻害剤であると言われているペ
プチジル化合物としてはしかし、非荷電アミノ酸をP3認
識サブサイトに有する構造と異なる構造のものも報告さ
れている。化合物、アルガトロバン（Argatroban）（ま
たは2R,4R−４−メチル−１−［Ｎ−２−（３−メチル
−1,2,3,4−テトラヒドロ−８−キノリンスルホニル）
Ｌ−アルギニナル］−２−ピペリジンカルボン酸とも言
う）もまた、トロンビンの活性部位に直接結合し、トロ
ンビンの非ペプチジル阻害剤のうちでは最も強いそして
選択的な化合物であると報告されている。オカモトら、
バイオケミストリー・アンド・バイオフィジオロジー・
リサーチ・コミュニケーション、101:440（1981）。ア
ルガトロバンは強い抗血栓剤であることが、いくつかの
急性動脈血栓の実験モデルにて報告されている。ジャン
ら、サーキュレイション、81:219（1990）およびサーキ
ュレイション・リサーチ、67:1552（1990）。

トロンビンの阻害剤であると言われており、その作用
機構が、酵素の活性部位および他の部位への結合である
と考えられているペプチジル化合物が報告されている。
ヒルジン（Hirudin）とその様々なペプチジル誘導体
は、フィブリノーゲンからフィブリンへの転化および血
小板活性化の両方を、トロンビンの活性部位とエキソ部
位またはエキソ部位のみに結合することによって阻害す
ることが報告されている。マークワード、トロンボシス
・アンド・ヘモスタシス、66:141（1991）、ヒルジンは
水蛭唾液腺抽出物から単離された65アミノ酸からなるポ
リペプチドとして報告されている。これは既知のトロン
ビンの阻害剤のなかで最も強い阻害剤のひとつであると
言われている。マルキとワリス、トロンボシス・アンド
・ヘモスタシス、64:344（1990）。ヒルジンは、トロン
ビン上のそれぞれ異なっており、物理的に離れているア
ニオン結合性エキソ部位および触媒活性部位に結合して
トロンビンの活性を抑制すると報告されている。ライデ
ル、既出。ヒルジンはインビトロにおいて強い抗血栓剤
であることが報告されている。マークワードら、ファル
マジー、43:202（1988）；ケリーら、ブロッド、77:1
（1991）。抗血栓効果に加えて、ヒルジンはさらに平滑
筋の増殖、およびこれに付随するアテローム性動脈硬化
症に対する外科手術の後の再狭搾に対する効果を有する
ことが報告されている。サーレムボックら、サーキュレ
イション、84:232（1991）。

ヒルゲン（Hirugen）はヒルジンの陰イオン性カルボ
キシ末端から誘導されたペプチドであると報告されてい
る。ヒルゲンはトロンビンの陰イオン結合性エキソ部位
のみに結合し、これによってフィブリンの生成を阻害す
るが、トロンビンのブロックされていない活性部位に結
合する小さい合成基質の触媒的ターンオーバーは阻害し
ない。マラガノールら、ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー、264:8692（1989）；ナスキら、ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、265:
13484（1990）。ヒルジンのヒルゲンとなる領域は、Ｘ
線結晶解析によって判明したトロンビンのエキソ部位へ
結合する部位として報告されている。スクルチャプツァ
ク−ジャンクンら、トロンボシス・アンド・ヘモスタシ
ス、65:830、要約507（1991）。さらに、ヒルゲンの結
合はトロンビンによる特定の小さな合成基質の触媒的回
転を上げることが報告されており、これはトロンビンの
酵素活性部位に関する変化が、コンフォメーションのエ
キソ部位の占有を伴うことを示す。リウ、既出。ヒルゲ
ンはまた、トロンビンが媒介する血小板凝集をブロック
することが報告されている。ジャクボウスキーとマラガ
ノール、ブロッド、75:399（1990）。

ヒルログ（Hirulog）はトロンビンの好ましい基質認
識部位に基づくスペーサーとなるペプチドＤ−フェニル
−アラニル−プロリル−アルギニンに結合したヒルゲン
様配列からなる合成鏡像分子として報告されている。ヒ
ルゲン様配列はこのペプチドと該ペプチドのＣ末端で結
合している言われている。マラガノンら、バイオケミス
トリー、29:7095（1990）。ヒルログはフィブリン濃度
の高いおよび血小板濃度の高い、いずれの血栓に対して
も効果的な抗血栓剤として使用される。マラガノンら、
トロンボシス・アンド・ヘモスタシス、65:651、要約17
（1991）。

発明の概要 一つの観点によれば、本発明は抗血栓症剤として有用
な化合物に関する。

一つの観点によれば、本発明は、次式： AcR−A₁−Ｌ−Pro−Ｌ−Arg−al （II） （式中、AcRは疎水性アシル基または疎水性スルホニ
ル基を示し、A₁はグルタミン酸（Glu）もしくはアスパ
ラギン酸（Asp）またはGluもしくはAspの等価物を示
す） で表わされ、トロンビンおよび／または第X a因子に対
して約200nM以下のIC₅₀を有し、かつ、プラスミンに対
しては、トロンビンまたは第X a因子に対するIC₅₀のう
ちの低い方よりも大きなIC₅₀値を有する化合物に関す
る。これらの化合物は血栓症のインヒビターとして有用
である。

好ましい観点によれば、本発明は以下の式： ［式中、（ａ）R₁は、Ｘが−Ｃ（＝Ｏ）−もしくは−Ｏ
−Ｃ（＝Ｏ）−の場合には約５から約10炭素原子のアル
キル基、またはＸが−Ｓ（O₂）−、−NH−Ｓ（O₂）−も
しくは−Ｏ−Ｓ（O₂）−の場合には１から約10炭素原子
のアルキル基；約５から約８炭素原子の環状アルキル基
で置換された１から約３炭素原子のアルキル基；随意に
約５から約８炭素原子の環状アルキル基で置換された約
３から約６炭素原子のアルケニル基；随意にY₁でモノ置
換または随意にY₁とY₂でジ置換された約６から約14炭素
原子のアリール基；アリール環上が随意にY₁でモノ置換
または随意にY₁とY₂によってジ置換された約６から約15
炭素原子のアラルキル基；アリール環上が随意にY₁でモ
ノ置換または随意にY₁とY₂でジ置換された約８から約15
炭素原子のアラルケニル基;1から約12炭素原子のパーフ
ルオロアルキル基；約６から約14炭素原子のパーフルオ
ロアリール基；約４から約８炭素原子のトリメチルシリ
ルアルキル基； からなる群から選択される （Y₁およびY₂は独立して、ブロモ、クロロ、フルオロ、
Z₁−、HO−、Z₁O−、NH₂−、Z₁−NH−、（Z₁,Z₂）Ｎ
−、Z₁−Ｃ（Ｏ）−NH−、HS−、Z₁−Ｓ−、Z₁−Ｓ
（Ｏ）−、Z₁S（O₂）−、HO−Ｓ（O₂）−、Z₁−Ｏ−Ｓ
（O₂）−、NH₂−Ｓ（O₂）−およびZ₁−NH−Ｓ（O₂）−
からなる群から選択される、 （Z₁およびZ₂は独立してトリフルオロメチル、ペンタフ
ルオロエチル、１から約12炭素原子のアルキル基、約６
から約14炭素原子のアリール基および約６から約15炭素
原子のアラルキル基からなる群から選択される））； （ｂ） Ｘは−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−
Ｓ（O₂）−、−NHS（O₂）−または−Ｏ−Ｓ（O₂）−で
ある； （ｃ） ｍは１または２である； （ｄ） R₂はCO₂H、−CO₂R'または （R'は１から約４炭素原子のアルキル基、約６から約14
炭素原子のアリール基又は約６から約14炭素原子のアラ
ルキル基である）である； （ｅ） R₃は−（CH₂）_３−NH−Ｃ（＝NH）−NH₂;また
は薬学的に許容されるその塩である。］ で示される化合物を含む ペプチジルアルギニンアルデヒドは水溶液中において
は平衡状態にあることが報告されている。バジャスら、
ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー33;172
9（1990）。以下に示したごとき３つの構造にはアルギ
ニンアルデヒド（Ａ）、アルデヒド水化物（Ｂ）、およ
び２つの環状アミノ構造（ＣおよびＤ）を含む。Ｒ基は
本発明の態様の化合物の残りを示す。本発明のペプチド
アルデヒドにはその定義内ですべての等価な化合物を含
む。

他の観点において、本発明は上述の化合物の治療有効
量と薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を含む。
さらに他の観点においては、本発明は上述の化合物およ
び医薬組成物を、哺乳類の血液凝固経路の異常に特徴付
けられる疾患の予防または治療に用いる方法を含む。

定義 本発明によってここで使用する下記の用語は、特に言
及しない限り、次の様に定義される。

「アルキル」は直鎖、分枝鎖および環状基を含む飽和
脂肪族基を示す。

「アルケニル」は少なくとも１の炭素−炭素二重結合
を有し、直鎖、分枝鎖および環状基を含む不飽和炭化水
素基を示す。

「アリール」は共役π電子系を有する少なくとも１個
の環を有する芳香族基であって、随意に置換されていて
もよい炭素環式アリール基、ヘテロ環式アリール基およ
びビアリール基が含まれる。

「アラルキル」はアリール基によって置換されたアル
キル基を示す。適当なアラルキル基としては、随意に置
換されていてもよいベンジル基およびピコリル基等が含
まれる。

「アラルケニル」は１個のアリール基で置換されてい
るアルケニル基を示す。好ましいアラルケニル基には随
意に置換されていてもよいスチレニル基等を含む。

「アルキレン」は２価の直鎖状または分枝鎖状の飽和
脂肪族残基を示す。

「アルキレンカルボキシ」はalk−COOHを示す（alkは
アルキレンである）。

「カルボキサミド」は−Ｃ（Ｏ）−NH₂を示す。

「アルキレンカルボキサミド」は基−alk−Ｃ（Ｏ）N
H₂（alkはアルキレンである）を示す。

「アルキレンヒドロキシ」は基−alk−OH（alkはアル
キレンである）を示す。

「アミノ酸」は天然および非天然のアミノ酸であって
Ｌ−型またはＤ−型のいずれかであるものを示す。天然
のアミノ酸には、アラニン（Ala）、アルギニン（Ar
g）、アスパラギン（Asn）、アスパラギン酸（Asp）、
システイン（Cys）、グルタミン（Gln）、グルタミン酸
（Glu）、グリシン（Gly）、ヒスチジン（His）、イソ
ロイシン（Ile）、ロイシン（Leu）、リジン（Lys）、
メチオニン（Mety）、フェニルアラニン（Phe）、プロ
リン（Pro）、セリン（Ser）、トレオニン（Thr）、ト
リプトファン（Trp）、チロシン（Tyr）およびバリン
（Val）を含む。非天然アミノ酸には例えば、アゼチジ
ンカルボン酸、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジ
ピン酸、β−アラニン、アミノプロピオン酸、２−アミ
ノブチル酸、４−アミノブチル酸、６−アミノカプロイ
ン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソブチル
酸、３−アミノイソブチル酸、２−アミノピメリン酸、
2,4−ジアミノイソブチル酸、デスモシン、2,2'−ジア
ミノピメリン酸、2,3−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エ
チルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ヒドロキシリ
ジン、アロ−ヒドロキシリジン、３−ヒドロキシプロリ
ン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−
イソロイシン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロ
イシン、Ｎ−メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシ
ン、オルニチンおよびピペコール酸が含まれるが、これ
らに限定されない。

「アミノ酸残基」は−NH−CH（Ｒ）−CO−（式中、Ｒ
は各アミノ酸基で異なる側鎖基を示す）で示される基で
ある。環状アミノ酸においては、残基は （式中、ｘは１、２または３であり、それぞれアゼチジ
ンカルボン酸、プロリンまたはピペコール酸残基を示
す）で示される基である。

「疎水性アシル基」は基R₁−Ｃ（＝Ｏ）（R₁はアルキ
ル、アリール、アラルキルまたは他の非極性基である）
を示す。

「疎水性スルホニル基」は基R₁−Ｓ（O₂）−（R₁はア
ルキル、アリール、アラルキルまたは他の非極性基であ
る）を示す。

「メチレン」は−CH₂−を示す。

「パーフルオロアルキル」は各水素がフッ素に置換さ
れているアルキル基を意味する。好ましいパーフルオロ
アルキル基にはパーフルオロメチル（構造はCF₃−）お
よびパーフルオロエチル（構造はCF₃−CF₂−）および類
似の基である。

「パーフルオロアリール」は各水素がフッ素に置換さ
れているアリール基を意味する。好ましいパーフルオロ
アリール基にはパーフルオロフェニル（構造は である）および２−パーフルオロナフチル（構造 である）および類似の基が含まれる。

さらに、以下の略語は次の意義を有する。

「Ala（Tzl）」は（Ｒ）−３−テトラゾリル−２−ア
ミノプロピオン酸を示す。

「Arg−al」はＬ−アルギニナルを示す。

「Asp」はＬ−アスパラギン酸を示す。

「Asp（OCH₃）」はＬ−アスパラギン酸β−メチルエ
ステルを示す。

「Bn」はベンジルを示す。

「BzlSO₂」はベンジルスルホニルを示す。

「Boc」はｔ−ブトキシカルボニルを示す。

「BocPro−OH」はＮ−Boc−Ｌ−プロリンを示す。

「Bom」はベンジルオキシメチルを示す。

「BOP」はベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−ト
リス−（ジメチルアミノ）−ホスホニウム−ヘキサフル
オロホスフェートを示す。

「ブライン（Brine）」は塩化ナトリウムの飽和水溶
液を示す。

「ｎ−BuSO₂」はｎ−ブチルスルホニルを示す。

「Cbz」はベンジルオキシカルボニルを示す。

「CDI」はカルボニルジイミダゾールを示す。

「ChxAc」は１−シクロヘキシルアセチルを示す。

「ChxPA」は３−シクロヘキシルプロパノイルを示
す。

「DCM」はジクロロメタンを示す。

「DIEA」はジイソプロピルエチルアミンを示す。

「DMF」はN,N−ジメチルホルムアミドを示す。

「EtOAc」は酢酸エチルを示す。

「EDC」はエチル−３−（３−ジメチルアミノ）−プ
ロピルカルボジイミド塩酸塩を示す。

「Fm」は９−フルオレンメチルを示す。

「HOBt」は１−ヒドロキシベンゾトリアゾルモノヒド
レートを示す。

「HCA」は３−フェニルプロピオニルを示す。

「IPA」はイソプロパノールを示す。

「αMeHCA」は２−メチル−３−フェニルプロピオニ
ルを示す。

「MeOH」はメタノールを示す。

「４−MePhSO₂」は４−メチルフェニルスルホニルを
示す。

「4MeV」は４−メチルペンタイノルを示す。

「NaOAc」は酢酸ナトリウムを示す。

「NpAc」は１−ナフチルアセチルを示す。

「２−NpSO₂」は２−ナフチルスルホニルを示す。

「NMM」は４−メチルモルホリンを示す。

「Oct」はオクタノイルを示す。

「Ph」はフェニル基を示す。

「Pro」はＬ−プロリンを示す。

「2PrPent」は２−プロピルペントイルを示す。

「TUBU」は２−（1H−ベンゾトリアゾル−１−イル）
−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボ
ーレートを示す。

「TEA」はトリエチルアミンを示す。

「TFA」はトリフルオロ酢酸を示す。

「THF」はテトラビトロフランを示す。

図面の簡単な説明 図１は、本発明による１種以上の化合物を調製するの
に使用した固相試薬の製造法を示す反応スキームであ
る。図１において、Bnはベンジルを示し、ｔ−Buはｔ−
ブチルを示し、Bocはｔ−ブトキシカルボニルを示す。

図２は、本発明による１種以上の化合物の調製に用い
た化合物の合成法を示す反応スキームである。図２にお
いて、「ｉ」は「pTsOH/FmOH、トルエン／還流」を示
し、「ii」は「Boc−Asp−β−ベンジルエステル/BOP/N
MM/DMF」を示し、「iii」は「トリエチルアミン／還
流」を示す。

図３は、本発明による化合物の液相法による合成例を
示す反応スキームである。図３において、「ｉ」は「CD
Iおよびｔ−ブチルカルバゼート」を示し、「ii」は「T
FA/DCM」を示し、「iii」は「1/NaOAc」を示し、「iv」
は「遊離酸（例えば図２の（23））としての保護ペプチ
ド（またはそのアナログ）/BOP/NMM/DMF」を示し、
「ｖ」は「H₂/Pd」を示し、「vi」は「H₃O⁺」を示し、
「vii」は「トリメチル酢酸/DCC/1−ヒドロキシベンゾ
トリアゾール/DMF」を示す。あるいは、「ｖ」が「HF/
アニソール」であり、「vi」が「ホルムアルデヒド/H₃O
⁺」であってもよい。

好ましい態様の詳細な説明 好ましい化合物 好ましい観点によれば、本発明は次式： AcR−A₁−Ｌ−Pro−Arg−al （式中、AcRは疎水性アシル基または疎水性スルホニ
ル基を示し、A₁はグルタミン酸（Glu）もしくはアスパ
ラギン酸（Asp）またはGluもしくはAspの等価物を示
す）で表わされ、トロンビンおよび／または第X a因子
に対して約200nM以下のIC₅₀を有し、かつ、プラスミン
に対しては、トロンビンまたは第X a因子に対するIC₅₀
のうちの低い方よりも大きなIC₅₀を有する化合物に関す
る。

「等価物」は、アミノ酸の一般式A₁または疎水性アシ
ル基もしくは疎水性スルホニル基の変形物であって、所
定のアミノ酸または疎水性アシル基もしくは疎水性スル
ホニル基を使用する場合と比べて、当該化合物の阻害能
に有害な影響をほとんど及ぼさない変形物を含むことを
意味する。一般に、適当な疎水性アシル基は、アシル
（カルボニル）炭素原子のほかに、少なくとも約５個の
炭素原子を有し、また、有効な阻害活性を発揮するのに
十分な疎水性を有する。同様に、適当な疎水性スルホニ
ル基はスルホニル硫黄原子のほかに、少なくとも約５個
の炭素原子を有し、また、有効な阻害活性を発揮するの
に十分な疎水性を有する。GluまたはAspはカルボキシル
化された非環式アミノ酸およびその等価物である。この
ような等価物には、グルタミン酸のγ−R'エステル、ア
スパラギン酸のβ−R'エステルまたはGluもしくはAspの
カルボン酸基にテトラゾールが置換したR'−置換テトラ
ゾールが含まれる。この場合、R'は水素原子、１から約
６炭素原子の低級アルキル基または約６から約15炭素原
子のアラルキル基である。

本発明の一つの観点によれば、ペプチドアルデヒドの
誘導体が提供される。この種の化合物は次式（I A）で
表わされる： 式（I A）で表わされる好ましい化合物には、R₃が−
（CH₂）_３−NH−Ｃ（＝NH）−NH₂である化合物を含む。
即ちP1がＬ−アルギニナルである化合物である。

別の好ましい化合物にはP2残基がＬ−プロリンである
化合物も含まれる。

別の好ましい化合物にはさらに、ｍが１または２であ
る化合物も含まれる。

好ましい化合物には、さらにR₂が−CO₂H、−CO₂R'、
または （R'は水素原子、約１〜約４炭素原子のアルキル基、約
６〜約14炭素原子のアリール基または約６〜約14炭素原
子のアラルキル基を示す）である化合物が含まれる。特
に好ましい化合物は、R'がメチル基である化合物であ
る。

本発明による好ましい化合物にはさらにP4（即ちR₁−
Ｘ−）が保護基である化合物、即ちP3の末端アミノ基が
保護されている化合物を含む。この保護基には以下の化
合物が含まれる： （１） Ｘが−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−
Ｓ（O₂）−、−NH−Ｓ（O₂）−または−Ｏ−Ｓ（O₂）−
であり； （２） R₁は、Ｘが−Ｃ（＝Ｏ）−もしくは−Ｏ−Ｃ
（＝Ｏ）−の場合には約５から約10炭素原子のアルキル
基、または、Ｘが−Ｓ（O₂）−、−NH−Ｓ（O₂）−もし
くは−Ｏ−Ｓ（O₂）−の場合には１から約10炭素原子の
アルキル基；約５から約８炭素原子の環状アルキル基で
置換された１から約３炭素原子のアルキル基；随意に約
５から約８炭素原子の環状アルキル基で置換された約３
から約６炭素原子のアルケニル基；随意にY₁でモノ置換
または随意にY₁とY₂でジ置換された約６から約14炭素原
子のアリール基；アリール環上が随意にY₁でモノ置換ま
たは随意にY₁とY₂でジ置換された約６から約15炭素原子
のアラルキル基；アリール環内が随意にY₁でモノ置換ま
たは随意にY₁とY₂でジ置換された約８から約15炭素原子
のアラルケニル基;1から約12炭素原子のパーフルオロア
ルキル基；約６から約14炭素原子のパーフルオロアリー
ル基；約４から約８炭素原子のトリメチルシリルアルキ
ル基； からなる群から選択される （Y₁およびY₂は独立して、ブロモ、クロロ、フルオロ、
Z₁−、HO−、Z₁O−、NH₂−、Z₁−NH−、（Z₁,Z₂）Ｎ
−、Z₁−Ｃ（Ｏ）−NH−、HS−、Z₁−Ｓ−、Z₁−Ｓ
（Ｏ）−、Z₁S（O₂）−、HO−Ｓ（O₂）−、Z₁−Ｏ−Ｓ
（O₂）−、NH₂−Ｓ（O₂）−およびZ₁−NH−Ｓ（O₂）−
からなる群から選択される、 （Z₁およびZ₂は独立してトリフルオロメチル、ペンタフ
ルオロエチル、１から約12炭素原子のアルキル基、約６
から約14炭素原子のアリール基および約６から約15炭素
原子のアラルキル基からなる群から選択される））。

特に好ましい化合物はＸが−Ｃ（＝Ｏ）−またはＳ
（O₂）−である化合物を含む。

特に好ましい化合物には、R₁が約５から約10炭素原子
のアルキル、約５から約８炭素原子の環状アルキルで置
換された炭素原子１から約３のアルキル、随意にY₁でモ
ノ置換されたかまたは随意にY₁とY₂でジ置換された約６
から約14炭素原子のアリール、随意にY₁でモノ置換され
たかまたは随意にY₁とY₂でジ置換された約６から約15炭
素原子のアラルキル、 であるものが含まれる。適当なアルキル基にはメチル、
エチル、プロピル、1,1−ジメチルエチル、２−メチル
プロピル、2,2−ジメチルプロピル、ブチル、３−メチ
ルブチル、１−プロピルブチル、ペンチル、ヘキシル、
シクロペンチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシ
ル、シクロヘキシルメチル、アダマンチル、およびアダ
マンチルメチルが含まれる。適当な環状アルキル基には
シクロペンチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシ
ル、シクロヘキシルメチル、アダマンチル、およびアダ
マンチルメチルが含まれる。好ましいアリール基にはフ
ェニル、ナフチル、ビフェニル、２−チエニル、２−ピ
ロリルおよび２−フリルが含まれる。好ましいアラルキ
ル基にはフェニルメチル、ジフェニルメチル、ビフェニ
ル、ビフェニルメチル、ナフチル、ナフチルメチル、α
−フェニルメチルフェニルおよび２−フェニルエチレン
が含まれる。

より好ましい化合物にはＸが−Ｃ（＝Ｏ）−の場合に
R₁が３−メチルブチル、４−ヘプチル、２−シクロヘキ
シルエチル、２−フェニルエチルおよび１−ナフチルメ
チルであるものが含まれる。その他のより好ましい化合
物としては、Ｘが−Ｓ（O₂）−である場合にR₁がブチ
ル、４−メチルフェニル、ベンジル、ナフチル、 である化合物が含まれる。

式（IA）の好ましい化合物は以下のものを含む： 特に好ましい式（Ｉ）の化合物は以下のものを含む： 式（Ｉ）の好ましい化合物にはまた、その薬学的に許
容される塩も含む。「薬学的に許容される塩」という語
は式（Ｉ）の化合物を有機または無機酸と結合させて誘
導した化合物である。これらの塩は遊離の塩基としても
塩としても有用である。実際上、塩の使用は塩基の使用
と同等であり、両方の形態の化合物が本発明に包含され
る。

好ましい化合物の調製 本発明によるペプチドアルデヒドは固相法または液相
法のいずれによって合成してもよい。特定の条件下で
は、本明細書に記載の液相法が好ましい。

いずれの方法においても使用する出発原料は化学薬品
メーカー、例えば、アルドリッチ（Aldrich）社、シグ
マ（Sigma）社およびノバ・バイオケミカルズ（Nova Bi
ochemicals）社等からの市販品として容易に入手し得
る。

これらの化合物の合成工程において、これらの方法に
おいて用いるアミノ酸誘導体の官能基を保護基によって
保護し、カップリング反応中における交差反応を防止す
る。適当な保護基の例とこれらの用法は次の文献に記載
されており、該記載内容は本明細書の一部を成すもので
ある。「ザ・ペプタイズ：アナリシス、シンセシス、バ
イオロジー」、アカデミックプレス、第３巻（グロスお
よびマイエンホーファー編、1981年）および第９巻（ウ
デンフリエンドおよびマイエンホーファー編、1987
年）。

本発明によるペプチドアルデヒド誘導体は後述の文献
に記載の方法によって合成してもよく、あるいは、ウェ
ッブによる1991年12月13日付の米国特許出願第07/807,4
74号明細書に記載された固相合成試薬と合成法によるア
ミノ酸誘導体の逐次的化学結合法によって合成してもよ
い（該明細書の当該開示内容も本明細書の一部を成
す）。

図１に、固相合成法によってアミノ酸誘導体が結合さ
れる固相試薬の合成法を示す。以下の実施例８に示すよ
うに、本発明による化合物の中間体を、ホルムアルデヒ
ド（TFA溶媒）を用いる処理によって固相から脱離させ
た後、活性炭に担持したPd触媒上での水素化による脱保
護によって、本発明による化合物を調製することができ
る。

あるいは、実施例14と15に示すように、本発明による
化合物は、HF/アニソールを用いる処理によって、脱保
護セミカルバゾンの形態で固相から脱離させ、次いで、
該セミカルバゾンを希塩酸中でホルムアルデヒドを用い
て処理することによって本発明による化合物に変換させ
る。

本発明によるペプチドアルデヒドは溶液相法によって
合成してもよい。好ましい方法の概要を図２および図３
に示す。図２は、本発明による化合物の合成に用いる化
合物の合成プロセスを示す。図３は、本発明による化合
物を溶液相で合成するための好ましいプロセスを示す。
ペプチドアルデヒドを溶液合成する別の方法は、例え
ば、次の文献に記載されている：マッコネルらの前記文
献、第87頁および該文献の引用文献、バジャスツら、ジ
ャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー33:1729
（1990）、カワムラら、Chem.Pharm.Bull.、17:1902（1
969）、およびソメノら、Chem.Pharm.Bull.、34:1748
（1986）。

好ましい化合物の選択 本発明による化合物は、トロンビンまたは第X a因子
を阻害するが、プラスミンを実質的に阻害しないことに
よって特徴づけられる。本発明の好ましい化合物は以下
のごとく選別すればよい。

本発明による化合物を緩衝液中に溶解させて、アッセ
イ濃度が０〜100μＭの溶液を調製する。トロンビン、
第X a因子およびプラスミンに対するアッセイにおいて
は、発色性の合成基質を、被験化合物と問題となる酵素
を含有する溶液に添加し、該酵素の残余の触媒活性を分
光光度法によって測定する。化合物のIC₅₀は基質の代謝
回転から決定される。IC₅₀は、基質の代謝回転の50％を
阻害する被験化合物の濃度である。実施例Ａには本発明
の化合物を選別するのに用いたインビトロアッセイを示
した。

本発明の化合物は、トロンビンまたは第X a因子のア
ッセイにおいては、好ましくは約200nMのIC₅₀を有する
が、プラスミンのアッセイにおいては、トロンビンと第
X a因子に対するIC₅₀のうちの低い方より低くないIC₅₀
値を有するのが好ましい。好ましい化合物は、トロンビ
ンもしくは第X a因子のアッセイまたは両方のアッセイ
において、約100nMもしくはそれ以下のIC₅₀を示す。

医薬組成物 他の観点から本発明は、本発明の化合物の治療有効量
および薬学的に許容される担体もしくは希釈剤を含有す
る保存または投与のための医薬組成物を包含する。

本発明の化合物の「治療有効量」は、投与経路、被処
置哺乳類の種類、および処置する特定の哺乳類の生理的
特徴等によって変化する。これらの要因および投与量を
決定する該要因との関係は、医学の分野における当業者
にとっては周知である。用量および投与方法は、最適な
効果が得られるよう調整されるが、体重、食餌、併用す
る薬物および医学における当業者に認識されているその
他の要因に基づいて変化する。

本発明の化合物の「治療有効量」は所望の効果と治療
上の徴候によって広い範囲にわたる。典型的には、用量
は体重1kgあたり約0.01mgから100mg、より好ましくは1k
gあたり0.01mgから10mgである。

治療用途に用いる「薬学的に許容される担体もしくは
希釈剤」は製薬業界においてよく知られており、例えば
レミントンの「ファーマシュウティカル・サイエンシ
ズ」、マック・パブリッシング社（A.R.ジェナーロ編、
1985年）に記載されている。保存剤、安定剤、染料およ
びフレーバー剤もまた、医薬組成物に添加してもよい。
例えば、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸およびｐ−ヒ
ドロキシ安息香酸エステルを保存剤として添加してもよ
い。同、149ページ。さらに、抗酸化剤および懸濁剤を
添加してもよい。同。

本発明の医薬組成物は経口投与用には錠剤、カプセル
剤またはエリキシル剤として、直腸内投与用には坐薬と
して、注射投与用には無菌溶液または懸濁液として製剤
化して使用してもよい。投与量および投与方法は最適な
効能が得られるように調整せてればよいが、体重、食
餌、同時投薬および医学の分野における当業者が認識し
ている他の因子によって変化する。

毎日の主薬として静脈内投与する場合等、非経口投与
で投与する場合、注射し得る医薬組成物は従来の処方で
製造すればよく、溶液や懸濁液の液体でであっても投与
前に液体中に溶液もしくは懸濁液とする固体であっても
エマルジョンであってもよい。好ましい希釈剤は例えば
水、生理的食塩水、デキストロース、マンニトール、ラ
クトース、レシチン、アルブミン、グルタミン酸ナトリ
ウム、塩酸システイン、またはこれらの類似物を含む。
さらに、随意に注射し得る医薬組成物には、湿潤剤、pH
調整剤、その他の少量の非毒性助剤を添加してもよい。
随意に吸収強化剤形（例えばリポソーム）としてもよ
い。

用途および方法 上述のごとく選択された場合、本発明の化合物は強力
なトロンビンおよびトロンビンの生成（第X a因子を直
接阻害する）の阻害剤として、血栓の異常生成の予防ま
たは治療剤として有用であるのと同様に有用である。

本発明の化合物は血液採取管内で血液が凝固するのを
防止するためのインビトロ診断剤としても有用である。
静脈穿針により得られる血液を採血管内に導入する、ス
トッパーを有し、管内が真空である採血管は当業者によ
く知られている。キャステン、スペシメン、コレクショ
ン「ラボラトリー・テスト・ハンドブック」第２版、レ
キシコンプ・インコーポレイテッド、クリーブランド第
16〜17頁（ヤコブスら編、1990年）。凝血防止のための
添加剤を含まない吸引式採血管は、哺乳類の血清を血液
から単離する場合に有用である。これに対して、凝血防
止添加剤（ヘパリン塩、EDTA塩、クエン酸塩またはオキ
サレート塩等）を含有する場合には、哺乳類の血液から
血漿を単離するのに有用である。本発明の化合物は第X
a因子またはトロンビンの強力なインヒビターであり、
それ自身を血液採取管内に取り込ませれば、該管内に吸
引された哺乳類血液の凝血を防止できる。

本発明の化合物を単独でも、本発明の他の化合物と組
み合わせて、他の公知の凝血防止剤と組み合わせて採血
管に用い得る。このような採血管に添加する量は、該採
血管内に哺乳類の血液が導入された際に、当該血液が凝
固するのを防止するのに十分な量である。かかる採血管
に該化合物を添加するのは、該化合物の液体組成物、固
体組成物または液体組成物を凍結乾燥した固体としての
ごとく、当業者によく知られた方法で行えばよい。本発
明の化合物は採血管内へ、哺乳類の血液２から10mlと混
合した場合の凝血を防止するのに十分な濃度になる量で
ある。典型的には、必要な濃度は約１から1000nMであ
り、10から100nMが好ましい。

本発明はさらに哺乳類の異常な血栓に関係する症状の
予防または治療のために、該哺乳類へ本発明の化合物ま
たは医薬組成物の治療有効量を投与する方法も含む。

化合物の「治療有効量」は投与経路、治療対象哺乳
類、および治療しようとする動物の特別な生理的状態が
挙げられる。用量を決定するにあたってのこれらの因子
およびその関係は、医学分野の当業者にはよく知られて
いる。

「血栓生成の異常に特徴付けられる症状」には動脈お
よび静脈血管系内の両方の血栓を含む。冠動脈血管系に
関しては、血栓形成の異常は急性心筋梗塞および不安定
アンギナの主要な原因となる確立されたアテローム性動
脈硬化性プラグの破裂を引き起こし、並びに血栓融解療
法またはPTCAの結果もたらされる閉塞性の冠状血栓形成
によって特徴づけられる。静脈管系に関しては、血栓形
成の異常は、四肢の下部または腹部領域において大手術
を受ける患者に認められる、冒された四肢への血流の低
減と肺塞栓症へ導く疾病素質を引き起こす静脈血管系に
形成される血栓によって特徴づけられる。血栓形成の異
常はまた、敗血症ショック、特定のウイルス性感染およ
び癌で患っている場合に、両方の血管系においてみられ
る散在性の血管内凝固障害を引き起こすが、この症状に
は凝固因子の急激な消費および生命の危機をもたらす広
範囲に及ぶ器官不全へとつながる全身性の血栓形成によ
って特徴づけられる。

本発明の方法を実施するに際しては、上記の化合物ま
たは組成物を単独で使用しても、本発明の化合物の複数
種を互いに併用してもよく、さらに、他の治療剤または
診断剤と併用してもよい。これらの化合物はインビボで
（通常は哺乳類の体内）、好ましくはヒトの生体に使用
してもよく、あるいはインビトロで使用してもよい。

インビボ使用する場合には、該化合物または組成物を
種々の方法、例えば、非経口投与法、静脈内投与法、皮
下投与法、筋肉内投与法、結腸内投与法、直腸内投与
法、鼻腔内投与法または腹腔内投与法等によって、種々
の投与形態で投与すればよい。当業者には明らかなよう
に、有効な生体内投与量および特定の投与形式は処置さ
れる哺乳類の年令、体重および種、使用する化合物の種
類および該化合物を使用する特定の用途等によって変化
する。有効投与量、即ち、所望の効能を得るのに必要な
投与量の決定法は当業者の技術的範囲内の事項である。
典型的には、化合物の投与量は、比較的低い量から始
め、所望の効能が得られるまで増量して決定される。

本発明の化合物の用量は、所望の効果および治療の徴
候によって広く変化する。典型的な用量は約0.01mg/kg
（体重）から100mg/kg（体重）、好ましくは0.01から10
mg/kg（体重）である。投与は好ましくは毎日の主薬と
して静脈内投与のごとき非経口投与することである。

注射剤は従来の処方で製造すればよく、溶液や懸濁液
の液体でであっても投与前に液体中に溶液もしくは懸濁
液とする固体であってもエマルジョンであってもよい。
好ましい希釈剤は例えば水、生理的食塩水、デキストロ
ース、マンニトール、ラクトース、レシチン、アルブミ
ン、グルタミン酸ナトリウム、塩酸システイン、または
これらの類似物を含む。さらに、注射し得る医薬組成物
には随意に湿潤剤、pH調整剤、その他の少量の非毒性助
剤を添加してもよい。また随意に吸収強化剤形（例えば
リポソーム）を使用してもよい。

本発明の理解を助けるために、以下に一連の実験の結
果を示した実施例を記載する。以下の実施例は本発明に
関するものであるが、本発明を限定するものと考えては
ならず、そして現在または将来開発される本発明の改変
のうち、当業者が現在本明細書の記載と特許請求の範囲
の記載から本願発明に含有されると考えるものは本発明
の範囲に入る。

本発明は以下の実施例によりさらに詳細に説明する。
最初の７つの実施例を図１に記載した。

実施例 実施例１ α−Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−N^g−ニトロアルギニ
ナルの製造 A.製造法1: 標題化合物であるα−ｔ−ブトキシカルボニル−N^g−
ニトロ−アルギニナルの以下の製造方法はBoc−アミノ
酸アルデヒド類の一般製造法の具体例である。パテル
（Patel）等著、バイオケミカ・エ・バイオフィジカ・
アクタ（Biochim.Biophys.Acta）、第748巻、第321〜33
0頁（1983年）を参照。乾燥THF200mL中で、Boc−N^g−ニ
トロアルギニン12.7g（40ミリモル）およびカルボニル
ジイミダゾール7.0g（CDI;43ミリモル）を室温で加え、
30分間撹拌した。反応混合物を−78℃に冷却し、LiAlH₄
溶液35mL（THF中で1M）を30分かけて滴加した。反応物
を−78℃で更に数時間撹拌した。つぎに、アセトン18mL
を加え、この混合物を1N塩酸400mLに迅速に加えた。混
合物を酢酸エチル100mLで２回抽出した。酢酸エチル洗
浄液を合わせ、ついで、水100mL、飽和NaHCO₃および飽
和NaCl100mLで各々２回洗浄した。溶液を乾燥（MgSO₄）
し、濃縮し、泡を得た。α−ｔ−ブトキシカルボニル−
N^g−ニトロ−アルギニナルの粗重量は6.36g（21ミリモ
ル；収率52％）であった。

B.製造法2: 別法として、標題化合物を、フェレンツ（Fehrent
z）、J.A.およびカストロ（Castro）、B.等著、シンセ
サス（Synthesis）、第676巻（1983年）の製造法の変形
により製造した。

約０℃に冷却されているジクロロメタン75mL中のN,O
−ジメチルヒドロキシルアミン8.42g（94ミリモル）の
懸濁物を撹拌しながら、そこにＮ−メチルピペリジン1
1.4mLをゆっくりと加えた。溶液を20分間撹拌し、遊離
ヒドロキシルアミンを得、ついで次の工程に使用のため
に冷却し続けた。

分液漏斗中で、Boc−N^g−ニトロアルギニン30.0g（94
ミリモル）をテトラヒドロフラン約1400mL中で加熱する
ことにより溶解し、ついで、窒素下で０℃に冷却した。
Ｎ−メチルピペリジン11.4mLおよびイソブチルクロロホ
ルメート12.14mL（94ミリモル）を加え、混合物を10分
間撹拌した。上記で製造された遊離ヒドロキシルアミン
を同時に加え、反応混合物を室温に温め、ついで一夜撹
拌した。

生じた沈殿物を濾過により除去し、ついでテトラヒド
ロフラン200mLで洗浄した。真空下で濾液を約150mLに濃
縮した後に、酢酸エチル200mLを加え、ついで、溶液を
氷冷した。冷却した酢酸エチル相を0.2N塩酸75mLで２
回、0.5N水酸化ナトリウム75mLで２回、ブライン75mLで
１回洗浄した後に、有機相を無水硫酸マグネシウム上で
乾燥した。真空中の濃縮で、固体状Boc−N^g−ニトロア
ルギニン−Ｎ−メチル−Ｏ−メチルカルボキサミド22.7
g（収率70％）を回収した。ジクロロメタン／メタノー
ル（シリカゲル）9:1による薄層クロマトグラフ分析は
１スポットを示した。

フラスコを窒素雰囲気下に置き、−50℃に冷却し、つ
いで、1N水素化アルミニウムリチウム（テトラヒドロフ
ラン中）70mL（70ミリモル）および乾燥テトラヒドロフ
ラン500mLを充填した。乾燥テトロヒドロフラン中にBoc
−N^g−ニトロアルギニン−Ｎ−メチル−Ｏ−メチルカル
ボキサミド66ミリモルを含む溶液50mLを、反応混合物の
温度を−50℃に維持しながら、ゆっくりと加えた。反応
混合物を冷却を中止することにより０℃に温めた後に−
30℃に再冷却し、その温度で、2N硫酸水素カリウム100m
L（0.2モル）を約10〜15分間かけて撹拌しながら加え
た。ついで、反応混合物を２時間室温で撹拌した。沈殿
物を濾取した後に、濾液を真空下で濃縮し100mLにし
た。濃縮物を酢酸エチル800mLに注ぎ、ついで1N塩酸50m
Lで２回、飽和炭酸水素ナトリウム50mLで２回およびブ
ライン50mLで１回逐次洗浄した。合わせた水性抽出物を
酢酸エチル３〜100mLで抽出した。酢酸エチル洗液の全
てを合わせ、ついで、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し
た。混合物を真空下で濃縮し、標題化合物18.5g（95
％）を得た。

実施例２ トランス−４−（アミノメチル）−シクロヘキサンカル
ボン酸ベンジルエステルパラ−トルエンスルホネート塩
の製造 トランス−４−（アミノメチル）−シクロヘキサンカ
ルボン酸50g（0.318モル）、ｐ−トルエンスルホン酸6
1.7g（0.324モル）、ベンジルアルコール250mL（2.4モ
ル）およびトルエン250mLを合わせて、撹拌した。混合
物を24時間還流し、遊離した水をディーン−スターク
（Dean−Stark）装置により共沸して除去した。還流５
時間後に透明な溶液を得た。溶液を室温に冷却し、生成
物を結晶化した。混合物を真空濾過し、エーテルで洗浄
し、真空炉で乾燥し、128.12g（収率96％）を得た。引
例：グリーンスタイン（Greenstein）、ジェッセ（Jess
e） P.およびウィニッツ（Winitz）、ミルトン（Milto
n）著、ケミストリー・オブ・ディ・アミノ・アッシズ
（Chemistry of the Amino Acids）、第２巻、第942頁
（1986年）。¹H NMR（CD₃OD） δ 1.05（m,2H）,1.43
（m,2H）,1.59（m,1H）,1.85（m,2H）,2.03（m,2H）,2.
33（m,1H）,2.35（s,3H）,2.75（d,2H）,5.09（s,2H）,
7.23（d,2H）,7.32（m,5H）,7.69（d,2H）．融点154〜1
56℃。

実施例３ １−ｔ−ブトキシカルボニル−セミカルバジディル−ト
ランス−４−メチルシクロヘキサンカルボン酸ベンジル
エステルの製造 カルボニルジイミダゾール（CDI）3.24g（0.02モル）
を窒素下室温でジメチルホルムアミド（DMF）45mL中に
溶解した。DMF45mL中のｔ−ブチルカルバザート2.48g
（0.02モル）溶液を滴加した。次に、実施例２の固体状
のベンジルエステル8.38g（0.02モル）を加えた後に30
分間にわたってトリエチルアミン（TEA）3.06mLを滴加
した。反応物を室温で窒素下１時間撹拌した。水（100m
L）を加え、この混合物を酢酸エチル50mLで３回抽出し
た。酢酸エチル層を合わせ、1N HCl、水、NaHCO₃、NaCl
各々75mLで２回ずつ抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾
燥した。混合物を濾過し、溶液を濃縮して油を得た。こ
の物質を酢酸エチル／ヘキサンからの再結晶により精製
（融点＝106〜108℃）または次の工程に直接使用でき
た。¹H NMR（CDCl₃） δ 0.94（m,2H）,1.42（m,2H）,
1.45（s,9H）,1.81（m,2H）,2.02（m,2H）,2.27（m,1
H）,3.17（t,2H）,5.09（s,2H）,5.51（t,1H）,6.46
（s,2H）,7.34（m,4H）． 実施例４ １−（ｔ−ブトキシカルボニル）−３−セミカルバジデ
ィル−トランス−４−メチル−シクロヘキサンカルボン
酸の製造 上記の実施例３の粗製Boc−ベンジルエステルに、メ
タノール（MeOH）250mLおよび10％活性炭上パラジウム5
00mgを加えた。5psiで１時間水素化器上で振盪後に、混
合物をセライトとともに透明ガラス濾過器を通して濾過
した。溶液を濃縮して泡状物を得、塩化メチレンを加
え、沈殿物を生成した。混合物を５℃で65時間保存し
た。結晶化物質をエーテルで濾過し、粗製生成物4.0g
（12.7ミリモル；実施例２の化合物から得られた全収率
62％）を得た。¹H NMR（CD₃OD） δ 0.96,（m,2H）,
1.42（m,2H）,1.46（s,9H）,1.82（m,2H）,1.97（m,2
H）,2.18（m,1H）,3.0（t,2H）．融点＝185〜189℃。

実施例５ セミカルバジディル−トランス−４−メチルシクロヘキ
サンカルボン酸トリフルオロ酢酸塩の製造 実施例４の化合物315mg（１ミリモル）を０℃でトリ
フルオロ酢酸（TFA）10mLに加え、生じた溶液を30分間
撹拌した。この後、溶液をエーテル75mLに滴加した。沈
殿を生成し、この混合物を濾過し、エーテルで洗浄し
た。粗製生成物の重量は254mg（0.77ミリモル）であっ
た；収率（77％）。¹H NMR（CD₃OD），δ1.0（m,2H）,
1.38（m,2H）,1.43（m,1H）,1.84（m,2H）,2.01（m,2
H）,2.22（m,1H）,3.04（d,2H）．融点＝154〜156℃。

実施例６ α−（ｔ−ブトキシカルボニル）−N^g−ニトロアルギニ
ナル−セミカルバゾニル−トランス−４−メチル−シク
ロヘキサンカルボン酸の製造 水45mLを含むエタノール135mL中の実施例５の化合物1
3.7g（41.6ミリモル）および実施例１の粗製化合物18.0
g（〜59ミリモル）の溶液を、酢酸ナトリウム（NaOAc）
9.41g（69ミリモル）で処理し、１時間還流した。この
溶液を冷却し、ついで、0.1N塩酸中に注ぎ、酢酸エチル
３回抽出した。合わせた有機相を水、ついで、ブライン
で洗浄し、乾燥（MgSO₄）し、小容量に濃縮した。この
濁った混合物を５℃で一夜放置し、生成物を沈殿させ、
濾過により分離し、真空下で乾燥した。これにより、9.
9gを得、使用した実施例５の化合物に基づく収率は47％
であった。¹H NMR（CD₃OD） δ 1.0（m,2H）,1.43
（s,9H）,1.45〜2.20（m,13H）,3.09（d,2H）,3.30（m,
2H）,4.18（bs,1H）,7.10（d,1H）．融点＝162〜163
℃。

実施例７ セミカルバゾン固相の製造 反応容器中にメチルベンズヒドラルアミン（methyl−
benzhydralamine）（MBHA）樹脂0.8g（0.5ミリモル、0.
62g/モル）を入れ、ジクロロメタン（DCM）で１回（全
ての洗浄には１〜２分間撹拌している溶媒10mLが必要で
ある）、ジメチルホルムアミド（DMF）で３回、10％ジ
イソプロピルエチルアミン（DIEA）/DMFで２回、および
DMFで４回で洗浄することにより、固相試薬である標題
樹脂を製造した。DMF5mL、４−メチルモルホリン１ミリ
モル（102μＬ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキ
シ−トリス−（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサ
フルオロホスフェート（BOP試薬）１ミリモル（443mg）
および実施例６の化合物１ミリモル（500mg）を加え、1
6時間回転輪上で混合し、DMFで３回、10％DIEA/DMFで２
回およびDMFで３回洗浄した。ついで、樹脂をDCM、メタ
ノールおよびエーテルで逐次洗浄した。標題樹脂はニン
ヒドリンにより98〜99％カップリングしたことを示し
た。

ついで、以下の実施例で示されるように標準ｔ−Boc
法を使用して常用ペプチド合成器で、アミノ酸またはア
ミノ酸類似体を用いてＮ−末端で樹脂を延長した。

ペプチド類似体の製造をアプライド・バイオシステム
社製430A型ペプチド合成器で430A取り扱い説明書中のｔ
−Boc化学条件を使用して行った。生じた保護ペプチド
アルデヒドはホルムアルデヒドで支持体から切断でき、
ついで、水素/Pdで脱保護できる。窒素基はアルデヒド
を還元しないで、グアニジン基から除去できる。

実施例８ Ｎ−４−（メチルペンタノイル）−Ｌ−アスパルチル−
Ｌ−プロリル−アルギニナルの製造 標題化合物をアプライド・バイオシステムズ社製430A
型ペプチド合成器を使用してして製造した。使用したBo
c化学条件は装置取り扱い説明書に記載の通りであっ
た。

実施例７の樹脂0.500gを50％トリフルオロ酢酸（ジク
ロロメタン中）で処理してBoc保護基を除去することに
より、すぐに使用できるようにした。洗浄し、10％ジイ
ソプロピルエチルアミン（ジクロロメタン中）で処理し
て酸性を中和した後に、連続法で市販のBoc−保護アミ
ノ酸類を支持試薬にカップリング（およびアミノ酸支持
体鎖を延長）した。

従って、Ｎ−Boc−Ｌ−プロリンをジメチルホルムア
ミド中のジクロロヘキシルカルボジイミドおよび１−ヒ
ドロキシベンゾトリアゾールを使用して樹脂に結合した
後に、50％トリフルオロ酢酸（ジクロロメタン中）で処
理し、Boc保護基を除去し、洗浄し、および10％ジイソ
プロピルエチルアミン（ジクロロメタン中）で洗浄し、
酸性を中和した。Ｎ−Boc−Ｌ−アスパラギン酸−β−
ベンジルエステルを同じ方法でカップリングし、脱保護
した。４−メチルペンタン酸を、ジメチルホルムアミド
中ジクロロヘキシルカルボジイミドおよび１−ヒドロキ
シベンゾトリアゾールを使用して固相上でペプチドにカ
ップリングした。

ペプチドアルデヒドを、テトラヒドロフラン5mL、酢
酸1mL、ホルムアデヒド1mLおよび1N塩酸0.100mLを含む
混合物で１時間撹拌しつつ処理することにより固相から
ペプチドアルデヒドを除去した。この混合物を濾過した
後に、樹脂をテトラヒドロフラン10mLで洗浄した。合わ
せた濾液を水100mLで希釈し、酢酸エチルで抽出した。
ついで、酢酸エチル相を飽和塩化ナトリウムで洗浄し、
硫酸マグネシウム上で乾燥し、真空下で濃縮した。

ペプチドアルデヒドのニトロおよびベンジル保護基を
除去するために、濃縮したペプチドアルデヒドを10％水
を含有するメタノール10mL、1N塩酸0.300mLおよび炭素
上のパラジウム0.200gの混合物中に取り、45分間5psiで
水素で処理した。混合物をセライトとともに微細ガラス
フィルター（fine fritted filter）を通して濾過し、1
0％水を含有するメタノールで洗浄し、濃縮し、粗製ペ
プチドアルデヒドを得た。

ついで、生じたペプチドアルデヒドを、アセトニトリ
ルが５％〜40％である水−アセトニトリル（ともに、0.
1％トリフルオロ酢酸を含む）勾配で溶出し、粒径10ミ
クロンの細孔径300オングストロームのＣ−18カラム上
で逆相HPLCを使用し精製した。カラム画分を分析用HPLC
により分析し、純品を含む画分を溜めて、凍結乾燥し
て、標題化合物を得た。高速原子衝撃質量分析計（fast
atom bombardment mass spectrometry）により468.3a.
m.u.の理論分子量を確認した。

実施例９ Ｎ−オクタニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−プロリル−Ｌ
−アルギニナルの製造 標題化合物を実施例８に記載と同様の方法で製造し、
精製した。

Ｎ−Boc−Ｌ−プロリンを、まず、実施例７の樹脂に
結合し、ついで、Ｎ−Boc−Ｌ−アスパラギン酸−β−
ベンジルエステルを結合した。50％トリフルオロ酢酸
（ジクロロメタン中）で処理してｔ−Boc保護基を除去
した後に、洗浄し、酸性を中和し、オクタン酸（４−メ
チルペンタン酸の代わり）を固相上でペプチドに結合し
た。標題化合物を脱保護および精製後に得た。高速原子
衝撃質量分析計により、理論分子量496.3a.m.u.を確認
した。

実施例10 Ｎ−（３−フェニルプロピオニル）−Ｌ−アスパルチル
−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニナルの製造 標題化合物を実施例８に記載と同様の方法で製造し、
精製した。

Ｎ−Boc−Ｌ−プロリンを、まず、実施例７の樹脂に
結合し、ついでＮ−Boc−Ｌ−アスパラギン酸−β−ベ
ンジルエステルを結合した。50％トリフルオロ酢酸（ジ
クロロメタン中）で処理してｔ−Boc保護基を除去した
後に、洗浄し、酸性を中和し、３−フェニルプロピオン
酸（４−メチルペンタン酸の代わり）を固相上でペプチ
ドに結合した。標題化合物を脱保護および精製後に得
た。高速原子衝撃質量分析計により、理論分子量502.3
a.m.u.を確認した。

実施例11 Ｎ−ｔ−（（＋／−）−２−メチル−３−フェニルプロ
ピオニル）−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ア
ルギニナルの製造 標題化合物を実施例８に記載と同様の方法で製造し、
精製した。

Ｎ−Boc−Ｌ−プロリンを、まず、実施例７の樹脂に
結合し、ついでＮ−Boc−Ｌ−アスパラギン酸−β−ベ
ンジルエステルに結合した。50％トリフルオロ酢酸（ジ
クロロメタン中）で処理してｔ−Boc保護基を除去した
後に、洗浄し、酸性を中和し、（＋／−）−２−メチル
−３−フェニルプロピオン酸（４−メチルペンタン酸の
代わり）を固相上でペプチドに結合した。標題化合物を
脱保護および精製後に得た。高速原子衝撃質量分析計に
より、理論分子量516.3a.m.u.を確認した。

実施例12 Ｎ−（１−シクロヘキシルアセチル）−Ｌ−アスパルチ
ル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニナルの製造 標題化合物を実施例８に記載と同様の方法で製造し、
精製した。

Ｎ−Boc−Ｌ−プロリンを、まず、実施例７の樹脂に
結合し、ついでＮ−Boc−Ｌ−アスパラギン酸−β−ベ
ンジルエステルを結合した。50％トリフルオロ酢酸（ジ
クロロメタン中で）で処理してｔ−Boc保護基を除去
し、洗浄して酸性を中和した後に、酢酸シクロヘキサン
（４−メチルペンタン酸の代わり）を固相上でペプチド
に結合した。更に脱保護および精製後に標題化合物を得
た。高速原子衝撃質量分析計により理論分子量494.6a.
m.u.を確認した。

実施例13 Ｎ−（３−フェニルプロピオニル−Ｌ−グルタミル−Ｌ
−プロリル−Ｌ−アルギニナルの製造 標題化合物を実施例８に記載と同様の方法で製造し、
精製した。

Ｎ−Boc−Ｌ−プロリンを、まず、実施例７の樹脂に
結合し、ついで、Ｎ−Boc−Ｌ−グルタミン酸−β−ベ
ンジルエステル（Ｎ−Boc−Ｌ−アスパラギン酸−β−
ベンジルエステルの代わり）を結合した。50％トリフル
オロ酢酸（ジクロロメタン中）で処理してｔ−Boc保護
基を除去し、洗浄して酸性を中和した後に、３−フェニ
ルプロピオン酸（４−メチルペンタン酸の代わり）を固
相上でペプチドに結合した。標題化合物を脱保護および
精製後に得た。高速原子衝撃質量分析計により、理論分
子量516.3a.m.u.を確認した。

固相からの本発明の化合物の中間体を除去する別法
を、実施例14および15に表す。

実施例14 Ｎ−（３−シクロヘキサンプロピオニル）−Ｌ−アスパ
ルチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニナル−セミカルバ
ゾニル−トランス−４−アミノメチルシクロヘキサンカ
ルボキサミドの製造 標題化合物を実施例８に記載と同様の方法で実施例７
の樹脂上で製造した。Ｎ−Boc−Ｌ−プロリンを、ま
ず、実施例７の樹脂に、ついで、Ｎ−Boc−Ｌ−アスパ
ラギン酸−β−ベンジルエステルに結合した。50％トリ
フルオロ酢酸（ジクロロメタン中）で処理してｔ−Boc
保護基を除去し、洗浄して酸性を中和した後に、３−シ
クロヘキサンプロピオン酸（４−メチルペンタン酸の代
わり）を固相上でペプチドに結合した。

MBHA（メチルベンズヒドリルアミン）樹脂支持ペプチ
ド300mgを円筒テフロン反応器に入れた。アニソール300
μＬを加え、反応フラスコをねじ山によりHF装置に取り
付けた。無水HF3mLを−20℃でフラスコ中へ液化した。
反応混合物を磁気撹拌器で−20℃で0.5時間撹拌し、０
℃に加温し、更に１時間撹拌した。HFを窒素流下で除去
し、粗製生成物を0.1M炭酸水素アンモニウム50mL樹脂か
ら抽出した。この水性抽出物をジエチルエーテル（３×
25ml）で洗浄し、凍結し、凍結乾燥し、白色泡状として
粗製生成物を得た。このセミカルバゾンを、45分間かけ
て15％〜40％の水（15mM炭酸水素アンモニウム含有、pH
＝7.1）−アセトニトリル勾配で溶出し、粒径10ミクロ
ン、細孔径300オングストロームのＣ−18カラムを使用
して精製した。カラム画分を分析用HPLCにより分析し、
および生成物を含む画分（保持時間＝18分）を溜め、凍
結し、凍結乾燥し、白色粉末（60mg、0.085ミリモル）
を得た。

実施例15 Ｎ−（３−シクロヘキサンプロピオニル）−Ｌ−アスパ
ルチル−Ｌ−プロリン−Ｌ−アルギニナルの製造 実施例14のセミカルバゾン（60mg、0.085ミリモル）
をTFA水溶液（pH＝１に緩衝化した）14.1mLおよび37％
ホルムアルデヒド（8.5ミリモル、100当量）636μＬの
混合物で処理した。この混合物を23℃で0.5時間撹拌
し、0.2μｍフィルターを通して濾過し、45分間かけて1
0％〜30％になる水（0.1％トリフルオロ酢酸含有）−ア
セトニトリル勾配で溶出し、粒径10ミクロン、細孔径30
0オングストロームのＣ−18カラム上で逆相HPLCを使用
し精製した。カラム画分を分析用HPLCにより分析し、お
よび生成物を含む画分（保持時間＝17分）を溜め、凍結
乾燥後に、生成物20mg（0.039ミリモル）を得た。この
物質の質量分析は509.2amuでＭ＋１ピークを表した。

実施例16 Ｎ−（２−プロピルペンタノイル）−Ｌ−アスパルチル
−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニナルの製造 標題化合物を実施例14および15記載の同様の方法で製
造し、樹脂から切断し、脱保護および精製した。

Ｎ−Boc−Ｌ−プロリンを、まず、実施例７の樹脂に
結合し、ついでＮ−Boc−Ｌ−アスパラギン酸−β−ベ
ンジルエステルを結合した。50％トリフルオロ酢酸（ジ
クロロメタン中）で処理してｔ−Boc保護基を除去し、
洗浄して酸性を中和した後に、２−プロピルペンタン酸
（４−メチルペンタン酸の代わり）を固相上でペプチド
に結合した。標題化合物を脱保護および精製後に得た。
高速原子衝撃質量分析計により、理論分子量496.3a.m.
u.を確認した。

本発明の化合物の液相製造法は実施例17〜46に示す。

実施例17 １−ｔ−ブトキシカルボニル−セミカルバジディル−４
−ジフェニルメタンの製造 ジメチルホルムアミド（DMF）225mL中カルボニルジイ
ミダゾール（CDI）16.2g（0.10モル）の溶液を室温で製
造し、窒素下で撹拌した。ついで、DMF225mL中ｔ−ブチ
ルカルバザート13.2g（0.100モル）の溶液を30分かけて
滴加した。つぎに、DMF100mL中のジフェニルメチルアミ
ン18.3g（0.10モル）を30分かけて加えた。反応物を窒
素下室温で１時間撹拌した。水（10mL）を加え、この混
合物を真空下で約150mLに濃縮した。この溶液を水500mL
に注ぎ、酢酸エチル400mLで抽出した。酢酸エチル相を1
N HCl、H₂O、飽和NaHCO₃、ブラインで各々75mL2回ずつ
抽出し、MgSO₄で乾燥した。混合物を濾過し、溶液を濃
縮し、白色泡状の標題化合物29.5g（収率85％）を得
た。この物質を酢酸エチル／ヘキサンから再結晶により
精製できるが、次の工程に直接使用するのに十分な純度
であった；融点142〜143℃。計算値C₁₉H₂₃N₃O₃:C,66.8
4;H,6.79;N,12.31。実測値:C,66.46;H,6.75;N;12.90. 実施例18 セミカルバジディル−４−ジフェニルメタントリフルオ
ロ酢酸塩の製造 ジクロロメタン12.5mL中実施例17の化合物3.43g（10
ミリモル）の溶液を０℃トリフルオロ酢酸（TFA）12.5m
Lで処理し、同温で30分間撹拌した。この後、溶液をエ
ーテル75mLに滴加した。沈殿を生成し、混合物を濾過
し、エーテルを洗浄した。粗製標題化合物の重量は2.7g
（収率80％）であった：融点182〜184℃。

実施例19 α−Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−N^g−ニトロアル
ギニナル−セミカルバゾニル−４−Ｎ−ジフェニルメタ
ンの製造 水6mLを含むエタノール20mL中実施例18の化合物2.65g
（7.8ミリモル）および実施例１の化合物（α−Ｎ−
（ｔ−ブトキシカルボニル）−N^g−ニトロ−アルギニナ
ル）2.36g（7.8ミリモル）の溶液を、酢酸ナトリウム1.
2g（8.8ミリモル）で処理し、１時間還流した。この溶
液を冷却し、ついで、水に注ぎ、酢酸エチルで３回抽出
した。合わせた有機相を水、0.1N HCl、ブラインで洗浄
し、乾燥（MgSO₄）し、小容量に濃縮した。白色固体状
残渣をアセトニトリル／エーテルから再結晶した。これ
により標題化合物3.2g（実施例18の化合物を基礎として
収率78％）を得た；融点78〜79℃。

実施例20 N^g−ニトロ−アルギニナル−セミカルバゾニル−４−Ｎ
−ジフェニルメタントリフルオロ酢酸塩の製造 ジクロロメタン5mL中の実施例19の化合物0.53g（1.0
ミリモル）の溶液を０℃でトリフルオロ酢酸（TFA）5mL
で処理し、同温で30分間撹拌した。この後に、溶液をエ
ーテル40mLに滴加した。沈殿を生成し、混合物を濾過
し、エーテルで洗浄した。これにより純粋白色固体とし
て標題化合物0.51gを得た（収率97％）：融点159〜160
℃。

実施例21 Ｌ−プロリン−９−フルオレンメチルエステル−ｐ−ト
ルエンスルホン酸塩の製造 トルエン600mL中Ｌ−プロリン15.99g（139.0ミリモ
ル）、９−フルオレンメタノール30.0g（152.9ミリモ
ル）およびｐ−トルエンスルホン酸の溶液を還流し、水
をジーン−スタークトラップで除去した。26時間後、反
応物を濃縮し、次の工程で直接使用する油状の標題化合
物64g（収率99％）を得た。

実施例22 α−Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−アスパルチ
ル−β−（ベンジルエステル）−Ｌ−プロリン−９−フ
ルオレンメチルエステルの製造 DMF100mL中実施例21の化合物（Ｌ−プロリン−９−フ
ルオレンメチルエステル−ｐ−トルエンスルホン酸塩）
（15.44g、33.2ミリモル）、α−Ｎ−（ｔ−ブトキシカ
ルボニル）−Ｌ−アスパラギン酸−β−（ベンジルエス
テル）（9.35g、41.9ミリモル）、ベンゾトリアゾール
−１−イルオキシ−トリス−（ジメチルアミノ）−ホス
ホニウムヘキサフルオロホスフェート（BOP試薬）18.6g
（42.0ミリモル）の溶液を氷浴中で撹拌した。この溶液
を１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（0.45、3.
34ミリモル）、ジイソプロピルエチルアミン（19.0mL、
198ミリモル）で処理し、反応物を０〜５℃で1.5時間撹
拌した。この後、反応混合物を酢酸エチル600mLに注
ぎ、クエン酸飽和水溶液、水、飽和炭化水素ナトリウム
および最後にブラインで逐次抽出した。有機相を乾燥
（MgSO₄）し、真空下で濃縮し、油として標題化合物18g
（粗収率91％）を得、次の工程で直接使用した。

実施例23 α−Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−アスパルチ
ル−β−（ベンジルエステル）−Ｌ−プロリンの製造 上記の実施例22のα−Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニ
ル）−Ｌ−アスパルチル−β−（ベンジルエステル）−
Ｌ−プロリン−９−フルオレンメチルエステルからの粗
製油（17.5g、29.2ミリモル）をトリエチルアミン250mL
中に懸濁し、１時間還流した。この混合物を濃縮し、油
を得、酢酸エチル600mL中に溶解した。酢酸エチル相を
クエン酸で１回、ブライン１回洗浄し、乾燥（MgSO₄）
し、濃縮し、油を得た。この物質をカラムクロマトグラ
フィー（シリカゲル、10〜20％THF/DCM）により精製
し、7.5g（21の化合物から全収率38％）を得た。

実施例24 α−Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−アスパルチ
ル−β−（ベンジルエステル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−N^g
−ニトロ−アルギニナル−セミカルバゾニル−４−Ｎ−
ジフェニルメタンの製造 実施例23のα−Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ
−アスパルチル−β−（ベンジルエステル）−Ｌ−プロ
リン（11.29g、26.9ミリモル）をDMF60mL中に溶解し
た。この溶液をＮ−メチルモルホリン（NMM、11.9mL、1
08ミリモル）、BOP（11.9g、27ミリモル）および実施例
20の化合物（14.64g、28ミリモル）で処理し、ついで、
２時間撹拌した。この混合物を酢酸エチル700mLに注
ぎ、1Nクエン酸、飽和NaHCO₃、水、ブラインで洗浄し、
乾燥（MgSO₄）し、濃縮し、泡を得た。この物質をカラ
ムクロマトグラフィー（シリカゲル、６〜20％IPA/DC
M）により精製し、12.5g（実施例23の化合物からの全収
率38％）を得た。

実施例25 Ｌ−アスパルチル−β−（ベンジルエステル）−Ｌ−プ
ロリル−Ｌ−N^g−ニトロ−アルギニナル−セミカルバゾ
ニル−４−Ｎ−ジフェニルメタンの製造 前もって０℃に冷却したジクロロメタン中50％トリフ
ルオロ酢酸100mLの溶液に、実施例24のα−Ｎ−（ｔ−
ブトキシカルボニル）−Ｌ−アスパルチル−β−（ベン
ジルエステル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−N^g−ニトロ−アル
ギニナル−セミカルバゾニル−４−Ｎ−ジフェニルメタ
ン10.0g（12.1ミリモル）を加えた。同温で１時間半反
応混合物を撹拌し、ついでエーテル1000mLにそれを注
ぎ、沈殿物を得た。沈殿物を濾取し、エーテルで洗浄
し、標題化合物を得た。

実施例26 Ｎ−（３−フェニルプロピオニル）−Ｌ−アスパルチル
−β−（ベンジルエステル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−N^g−
ニトロ−アルギニナル−セミカルボゾニル−４−Ｎ−ジ
フェニルメタンの製造 THF20mL中の実施例25のＬ−アスパルチル−β−（ベ
ンジルエステル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−N^g−ニトロ−ア
ルギニナル−セミカルバゾニル−４−Ｎ−ジフェニルメ
タン0.91g（1.08ミリモル）の溶液。この溶液を乾燥ピ
リジン0.16mLおよび３−フェニルプロピオン酸クロリド
0.297mL（2.2ミリモル）で処理し、ついで水分を保ちな
がら１時間撹拌した。反応混合物を水に注ぎ、酢酸エチ
ルで抽出した。有機抽出物を1M HCl水溶液、水、５％Na
HCO₃水溶液で逐次洗浄し、最後に飽和NaClで洗浄した。
酢酸エチル抽出液を乾燥（MgSO₄）し、減圧下で濃縮し
た。生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ジクロロ
メタン中10％イソプロパノール）により精製し、標題化
合物Ｎ−（３−フェニルプロピオニル）−Ｌ−アスパル
チル−β−（ベンジルエステル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−
N^g−ニトロ−アルギニナル−セミカルバゾニル−４−Ｎ
−ジフェニルメタン0.7gを得た。

実施例27 Ｎ−（３−フェニルプロピオニル）−Ｌ−アスパルチル
−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニナルの製造の別法 実施例26の化合物をアニソール0.70mLを入れたテフロ
ンHF容器に移した。これを乾燥窒素流下で−78℃に冷却
した。ついで、無水HF（〜10mL）を容器中へ液化した。
反応物を撹拌し、−20℃に加温し、30分間その温度に保
った。反応物を０℃に加温し、HFを乾燥窒素流下で蒸発
させた。HF蒸発後、0.1M NH₄HCO₃50mlを加え、得られた
溶液を３回ジエチルエーテルで抽出した。ついで、水相
（Ｎ−（３−フェニルプロピオニル）−Ｌ−アスパルチ
ル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニナル−セミカルバゾン
含有）を氷酢酸4.9mL、1M HCl水溶液5.6mLおよび47％ホ
ルムアミド水溶液2.7mLで処理した。ついで、この溶液
を１時間撹拌した（セミカルバゾンを加水分解するため
に）。ついで、反応混合物を300mm×50mm混合カラム
（オールテック社製、商品番号Ｃ−6000B）に適用し、5
0mMリン酸塩緩衝液で溶出した。標題化合物を含有する
画分を合わせ、蒸発した。ついで、得られたペプチドア
ルデヒドを、アセトニトリル５％〜40％である水−アセ
トニトリル（0.1％トリフルオロ酢酸をともに含む）勾
配で溶出し、粒径10ミクロ、細孔径300オングストロー
ムのＣ−18カラム上で逆相HPLCを使用して脱塩した。
た。カラム画分を分析用HPLCにより分析し、純粋な生成
物を含有する画分を溜め、凍結乾燥し、標題化合物を得
た。高速原子衝撃質量分析計により理論分子量502a.m.
u.を確認した。

実施例28 α−Boc−Ｌ−アスパラギン酸−β−メチルエステルの
製造 乾燥無水メタノール（100mL）を、氷浴中で撹拌しな
がら窒素雰囲気下でナトリウム金属（0.26g、10.8ミリ
モル）で処理した。ナトリウムを溶解した後に、無水メ
タノール20mL中α−Boc−Ｌ−アスパラギン酸−β−ベ
ンジルエステル（3.2g、10.0ミリモル）を加えた。この
溶液を撹拌し、TLCによりエステル交換した。約20時間
後、氷酢酸1mLを加え、反応混合物を小容量に濃縮し
た。この残渣を0.5N HCl水溶液へ注ぎ、酢酸エチルで抽
出した。酢酸エチル相を水、ついで、ブラインで洗浄
し、乾燥（MgSO₄）し、濃縮した。標題化合物（〜3g）
を次の工程に使用した。

実施例29 α−Boc−Ｌ−アスパルチル−β−（メチルエステル）
−Ｌ−プロリンベンジルエステルの製造 DMF90mL中実施例28の化合物（α−Boc−Ｌ−アルパル
チル−β−（メチルエステル））（8.9g、3.6ミリモ
ル）、BOP（15.9g、36ミリモル）、Ｌ−プロリンベンジ
ルエステル（8.7g、36ミリモル）の溶液をNMM（19.7m
L）で処理した。この溶液を３時間撹拌し、ついで、1M
HClへ注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機相を1M HCl、1
M NaOH、水で逐次洗浄し、最後にブラインで洗浄し、つ
いで乾燥（MgSO₄）し、濃縮した。これにより粗製生成
物16.8gを得た。¹H NMR（CDCl₃） δ 1.42（s,9H）,
2.0（m,3H）,2.2（m,1H）,2.65（m,2H）,3.67（s,3H）,
3.76（m,2H）,4.57（m,1H）,4.86（m,1H）,5.15（dd,2
H）,5.40（d,1H）,7.35（m,5H）． 実施例30 Ｎ−（３−フェニルプロピオニル）−Ｌ−アスパルチル
−β−（メチルエステル）−Ｌ−プロリンベンジルエス
テルの製造 75％TFA/CH₂Cl₂100mL中実施例29の化合物（8.4g、19.
3ミリモル）の溶液を氷浴中で1.5時間撹拌し、ついで濃
縮し、油を得た。この残渣をトルエン中に溶解し、濃縮
して過剰のTFAを除去した。これをTHF75mL中に溶解し、
３−フェニルプロピオン酸クロリド（21.6ミリモル）、
ついでNaHCO₃飽和水溶液100mLを加えた。この混合物を7
0分間激しく撹拌し、ついで、酢酸エチルおよびNaHCO₃
飽和水溶液の混合物に注いだ。混合物を振盪し、有機相
を水およびブラインで洗浄し、ついで乾燥（MgSO₄）
し、濃縮した。この残渣をフラッシュクロマトグラフィ
ー（０〜２％CH₃OH/CH₂Cl₂）により精製し、標題化合物
を得た。TLC（シリカ）;R_f＝0.5（２％MeOH/CH₂Cl₂）。

実施例31 Ｎ−（３−フェニルプロピオニル）−Ｌ−アスパルチル
−β−（メチルエステル）−Ｌ−プロリンの製造 メタノール125mL中実施例30の化合物（2.8g、6.0ミリ
モル）の溶液を炭素上10％パラジウム280mgで処理し、
振盪しながら1.5時間水素雰囲気（15psig）に付した。
この後に、懸濁物を濾過し、濃縮し標題化合物を得た。
¹H NMR（CDCl₃） δ 2.1（m,3H）,2.2（m,1H）,2.53
（t,3H）,2.91（t,3H）,2.6〜2.9（m,2H）,3.65（s,3
H）,3.7（m,2H）,4.38（dd,1H）,4.86（m,1H）,5.05
（m,2H）,7.23（m,5H）,8.37（d,1H）． 実施例32 Ｎ−（３−フェニルプロピオニル）−Ｌ−アスパルチル
−β−（メチルエステル）−Ｌ−プロリル−N^g−ニトロ
−Ｌ−アルギニナルセミカルバゾニル−４−Ｎ−ジフェ
ニルメタンの製造 DMF13mL中実施例31の化合物（1.7g、4.5ミリモル）、
BOP（2.0g、4.5ミリモル）、実施例20の化合物（2.3g、
4.5ミリモル）の溶液を、NMM2.3mLで処理した。この溶
液を３時間撹拌した後に、水に注ぎ、酢酸エチルで抽出
した。有機相を1M HCl、1M NaOH、水で洗浄し、つい
で、乾燥（MgSO₄）し、濃縮した。残渣をフラッシュク
ロマトグラフィー（０〜10％CH₃OH/CH₂Cl₂）により精製
した。R_f＝0.37で標題化合物のシングルスポットを得た
（シリカガル上ジクロロメタン中10％メタノールを使用
するTLCにおいて）。

実施例33 Ｎ−（３−フェニルプロピオニル）−Ｌ−アスパルチル
−β−（メチルエステル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギ
ニナルの製造 実施例32の全ての化合物をアニソール0.70mLとともに
テフロンHF容器（teflon HF vessel）に移した。これ
を、乾燥窒素流（a stream of dry nitrogen）のもと−
78℃まで冷却した。その後、無水HF（〜10mLl）を容器
へ液化させた。その反応物を攪拌し、−20℃まで温め、
その温度で30分間維持した。その反応物を０℃まで温
め、乾燥窒素流のもとHFを蒸発させた。HFが蒸発した
後、0.1M NH₄HCO₃50mlを添加し、その結果生じた溶液を
ジエチルエーテルで３回抽出した。次に、その水性相
（Ｎ−（３−フェニルプロピオニル）−Ｌ−アスパルチ
ル−β−（メチルエステル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−アル
ギニナル−セミカルバゾンを含有する）を氷酢酸4.9m
L、1M HCl水溶液5.6mLおよび47％ホルムアルデヒド水溶
液2.7mLで処理した。この溶液を１時間攪拌した（セミ
カルバゾンを加水分解するため）。次に、粒度10ミクロ
ン、細孔サイズ300オングストロームのＣ−18カラムで
の逆相HPLCを用いて、その結果生じたペプトチドアルデ
ヒドをアセトニトリルの勾配が５％〜40％に及ぶ水−ア
セトニトリル（双方に0.1％トリフルオロ酢酸含有）勾
配で溶出させて精製する。そのカラム分留を分析用HPLC
で分析し、純粋な生成物を含有する分留を溜め、凍結乾
燥し、表題の化合物を得た。高速原子衝撃質量分析によ
り、理論分子量516原子質量単位を確証した。

実施例34 Ｎ−（２−プロピルペンタノイル）−Ｌ−アスパルチル
−β−（メチルエステル）−Ｌ−プロリンベンジルエス
テルの製造 実施例30の化合物（8.4g、19.3ミリモル）の75％TFA/
CH₂Cl₂100mL溶液を氷浴中で1.5時間攪拌し、その後オイ
ルに濃縮した。この残留物をトルエンに溶解し、濃縮し
て過剰なTFAを除去した。これを、DMF35mL中の２−プロ
ピルペンタン酸（2.44mL、15.6ミリモル）、BOP（6.91
g）、およびNMM（78ミリモル）の混合物に添加した。こ
の溶液を1.2時間攪拌し、実施例33と同様にして、操作
した。その生成物を、勾配が10〜50％のエチルアセテー
ト／ヘキサンを用いてフラッシュクロマトグラフィーに
より精製した。これにより、表題の化合物2.0gをオイル
として得た（TLC R_f＝0.3 40％エチルアセテート／ヘキ
サン中）。

実施例35 Ｎ−（２−プロピルペンタノイル）−Ｌ−アスパルチル
−β−（メチルエステル）−Ｌ−プロリンの製造 実施例34の化合物（2.0g、4.34ミリモル）のメタノー
ル90mL溶液を10％炭素上パラジウム（palladium on car
bon）200mgで処理した。これを、15psigにて1.5時間水
素添加した。これを濾過し、濃縮して表題の化合物を1.
46g得た。その表題の化合物の融点は157−159℃であっ
た。

実施例36 Ｎ−（２−プロピルペンタノイル）−Ｌ−アスパルチル
−β−（メチルエステル）−Ｌ−プロリル−N^g−ニトロ
−Ｌ−アルギニナルセミカルバゾニル−４−Ｎ−ジフェ
ニルメタンの製造 実施例34の化合物（1.67g、4.5ミリモル）、BOP（2.0
g、4.5ミリモル）、実施例20の化合物（2.3g、4.5ミリ
モル）のDMF13mL溶液をNMM2.3mLで処理した。この溶液
を２時間攪拌し、その後水に注ぎエチルアセテートで抽
出した。その有機相を1M HCl、1M NaOH、水で洗浄し、
次に乾燥させ（MgSO₄）、濃縮した。その残留物をフラ
ッシュクロマトグラフィー（０〜８％CH₃OH/CH₂Cl₂）に
より精製した。これにより純粋な表題の化合物を1.2g得
た。R_f＝0.54で表題化合物のスポット１つを得た（シリ
カゲルによるジクロロメタン中の10％メタノールを用い
たTLCにて）。

実施例37 Ｎ−（２−プロピルペンタノイル）−Ｌ−アスパルチル
−β−（メチルエステル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギ
ニナルの製造 実施例36からの化合物を、実施例33と同様にして、脱
保護し、精製し、表題の化合物を得た。高速原子衝撃質
量分析により、理論分子量510.3原子質量単位を確証し
た。

実施例38 Ｎ−Boc−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−アスパルチル−
Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニナルの製造 当該分野では、表題の化合物は開示されている。バジ
ュツ（Bajusz）、S.等著、ホリア・ヘマトール・レイプ
チッグ（Folia Haematol.Leipzig）、第109巻：第16頁
（1982年）；バジュツ S.著、シンポシア・バイオロジ
カ・ハンガリカ（Symposia Biologica Hungarica）、第
25巻：第277頁（1984年）；バジュツ、S.等著、ジャー
ナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（J.Med.Che
m.）、第33巻：第1729頁（1990年）を見よ。それは実施
例ＡおよびＢに記載のアッセイ中の対照として使用する
ために下記のようにして製造された。

表題の化合物を実施例８と同様の方法で合成し、精製
した。まず、Ｎ−Boc−Ｌ−プロリンを実施例７の樹脂
に結合し、ついでＮ−Boc−Ｄ−フェニルアラニンを結
合した。最終カップリング後、50％トリフルオロ酢酸で
の処理を省略した。標題の化合物が次の脱保護および精
製後に得られた。高速原子衝撃質量分析により、理論分
子量502原子質量単位を確証した。

実施例39 ３−シアノ−２−（1,1−ジメチルエトキシ）メタンア
ミドプロピオン酸の製造 Boc−Ｌ−アスパラギン20.0g（86ミリモル、１当量）
を乾燥ピリジン120mLに溶解し、乾燥ピリジン60mLに溶
解したジシクロヘキシルカルボジイミド20.0g（97ミリ
モル、1.3当量）を30分以上かけてで滴下した。反応物
を23℃にて３時間攪拌し、２μｍナイロンフィルターで
濾過した。濾液をロータリーエバポレーターにて真空で
濃縮し、100mLの水を添加した。そのpHを40％NaOH（a
q.）で10に調節し、その溶液を再度もう一度２μｍナイ
ロンフィルターで濾過した。濾液をダウエクス（Dowe
x）50X8−400イオン交換樹脂120mLの床に通過させ、そ
の樹脂を1:1のメタノール：水４カラム容積で洗浄し
た。濾液を真空で濃縮して、表題の化合物17.5g（収率9
5％）を白色固体として得た。¹H−NMR（CD₃OD）:4.40p.
p.m（ｍ、1H）;2.95p.p.m（ｍ、2H）;1.40p.p.m（ｓ、9
H）。

実施例40 ３−テトラゾリル−２−（1,1−ジメチルエトキシ）メ
タンアミドプロピオン酸の製造 実施例39の化合物（３−シアノ−２−（1,1−ジメチ
ルエトキシ）メタンアミドプロピオン酸）17.5g（82ミ
リモル、１当量）をTHF125mLに溶解し、トリブチルチン
アジド40.5g（129ミリモル、1.5当量）を添加した。反
応混合物を還流に至らせ、そこで３日間維持した。反応
混合物を冷却し、ロータリーエバポレーターにて真空で
揮発分を除去した。残留物を0.5M NaOH300mLに溶解し、
この水溶液をエチルアセテート（４×100mL）で洗浄し
た。水性相をダウエクス（Dowex）50X8−400イオン交換
樹脂125mLの床に通過させ、樹脂を1:1のメタノール：水
４カラム容積で洗浄した。ロータリーエバポレーターに
て真空で揮発分を除去して、表題の化合物17.9gを白色
固体として得た（収率85％）。¹H−NMR（CD₃OD）:4.55
p.p.m（ｍ、1H）;3.40p.p.m（ｍ、2H）;1.40p.p.m
（ｓ、9H）。この物質は、固相ペプチド合成での使用に
適している。

実施例41 ３−（Ｎ−２−メチル）テトラゾリル−２−（1,1−ジ
メチルエトキシ）メタンアミドプロピオン酸メチルエス
テルおよび３−（Ｎ−３−メチル）テトラゾリル−２−
（1,1−ジメチルエトキシ）メタン−アミドプロピオン
酸メチルエステルの製造 実施例40の化合物（３−テトラゾリル−２−（1,1−
ジメチルエトキシ）メタンアミドプロピオン酸）1.5g
（5.8ミリモル、1.0当量）を乾燥DMF13mLに溶解し、セ
シウムカーボネート3.9g（12.0ミリモル、2.1当量）を
添加した。この後、シリンジによりヨウ化メチルを930
μｌ（14.5ミリモル、2.5当量）添加した。反応混合物
を23℃にて３時間攪拌し、0.5M HCl50mLに注いだ。これ
を、エチルアセテート（３×50mL）で抽出した。併せた
有機相を0.5M HCl50mL、飽和NaHCO₃50mL、およびブライ
ン50mLで洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥させた後、有
機相をデカントし、ロートバップ（rotovap）にて真空
で揮発分を除去して、表題化合物の混合物を黄色オイル
として得た。一方の異性体が最初に溶出する（他方の異
性体Rf＝0.15に対するRf＝0.3）シリカのクロマトグラ
フィー（50％EtOAc/ヘキサン）により異性体を分離し
た。純粋な生成物を含有する留分を併せ、ロータリーエ
バポレーターにて揮発分を除去して、表題の化合物のそ
れぞれの純粋な生成物0.60gを得た。¹H−NMR（CDCl₃）:
2番目に溶出する異性体:5.8p.p.m（ｄ、1H）、4.75p.p.
m（ｍ、1H）;4.05p.p.m（ｓ、3H）;3.75p.p.m（ｓ、3
H）;3.4p.p.m（ｍ、2H）;1.5p.p.m（ｓ、9H）。最初に
溶出する異性体:5.75p.p.m（ｄ、1H）、4.75p.p.m
（ｍ、1H）;4.30p.p.m（ｓ、3H）;3.75p.p.m（ｓ、3
H）;3.65p.p.m（ｍ、2H）;1.7p.p.m（ｓ、9H）。

実施例42 ３−（Ｎ−２−メチル）テトラゾリル−２−（1,1−ジ
メチルエトキシ）メタンアミドプロピオン酸または３−
（Ｎ−３−メチル）テトラゾリル−２−（1,1−ジメチ
ルエトキシ）メタンアミドプロピオン酸の製造 実施例41の化合物（３−（Ｎ−２−メチル）テトラゾ
リル−２−（1,1−ジメチルエトキシ）−メタンアミド
プロピオン酸メチルエステルまたは３−（Ｎ−３−メチ
ル）テトラゾリル−２−（1,1−ジメチルエトキシ）−
メタンアミドプロピオン酸メチルエステル）0.5g（1.75
ミリモル、1.0当量）をメタノール12mLに溶解し、1.0M
LiOH（aq.）2.3mL（1.3当量）を添加した。出発原料をT
LC分析（シリカゲルでの1:1 EtOAc:ヘキサン）により観
察できない場合、反応物を23℃にて２時間攪拌する。反
応混合物をダウエクス（Dowex）50X8−400イオン交換樹
脂10mLの床に通過させ、その樹脂を1:1のメタノール：
水４カラム容積で洗浄する。真空で溶媒を除去して、適
当な表題の生成物を得る。

実施例43 ３−テトラゾリル−２−（1,1−ジメチルエトキシ）メ
タンアミドプロピオン酸メチルエステルの製造 実施例40の化合物（３−テトラゾリル−２−（1,1−
ジメチルエトキシ）−メタンアミドプロピオン酸）1.66
g（6.5ミリモル、１当量）を乾燥THF26mLに入れ、カル
ボニルジイミダゾール3.14g（19.4ミリモル、３当量）
を添加し、その後イミダゾール88mg（1.3ミリモル、0.2
当量）を添加した。反応混合物を23℃にて3.5時間攪拌
した。メタノール20mLを添加し、その混合物をさらに0.
5時間攪拌した。揮発分をロータリーエバポレーターに
て真空で除去し、粗製物をエチルアセテート100mLに入
れた。有機相を0.5M HCl（２×25mL）で洗浄し、硫酸ナ
トリウムで乾燥させた。乾燥剤（dessicant）からデカ
ントした後、有機相を真空で濃縮し、（２〜10％MeOH/C
H₂Cl₂、１％酢酸、シリカ）でのクロマトグラフィーに
より表題の化合物を精製して、720mgの生成物を得た。N
MR（CDCl₃）5.8p.p.m（ｄ、1H）、4.75p.p.m（ｓ、1
H）、3.8p.p.m（ｓ、3H）、3.55p.p.m（ｍ、2H）、1.4
p.p.m（ｓ、9H）。

実施例44 ３−（Ｎ−２−ベンジルオキシメチル）テトラゾリル−
２−（1,1−ジメチルエトキシ）メタンアミドプロピオ
ン酸メチルエステルおよび３−（Ｎ−３−ベンジルオキ
シメチル）テトラゾリル−２−（1,1−ジメチルエトキ
シ）メタンアミドプロピオン酸メチルエステルの製造 実施例43の化合物（３−テトラゾリル−２−（1,1−
ジメチルエトキシ）−メタンアミドプロピオン酸メチル
エステル）1.28g（4.7ミリモル、１当量）を乾燥THF9.5
mLに入れ、ベンジルオキシメチルクロライド0.65mL（5.
6ミリモル、1.2当量）をシリンジで添加し、その後ジイ
ソプロピルエチルアミン1.05mL（6.1ミリモル、1.3当
量）を添加した。反応混合物を23℃にて１時間攪拌し、
エチルアセテート100mLで希釈した。有機相を0.5M HCl
（２×50mL）、飽和NaHCO₃（50mL）、およびブライン
（50mL）で洗浄し、その後硫酸ナトリウムで乾燥させ
た。有機相をデカントし、真空で濃縮した。クロマトグ
ラフィー（1:1 EtOAc/ヘキサン、シリカ）により、表題
の化合物（Rf＝0.4、1.05g;Rf0.25、0.67g）が得られ
た。後の反応で、どちらの異性体を用いてもよい。

実施例45 ３−（Ｎ−２−ベンジルオキシメチル）テトラゾリル−
２−（４−メチルバレロイルアミド）プロピオン酸メチ
ルエステルまたは３−（Ｎ−３−ベンジルオキシメチ
ル）テトラゾリル−２−（４−メチルバレロイルアミ
ド）プロピオン酸メチルエステル ４−メチルバレリアン酸2.0gをオキサリルクロライド
10mLに入れ、この混合物を窒素雰囲気下にて23℃で一晩
中攪拌する。この後、乾燥トルエン100mLを添加し、真
空で揮発分を除去して、以下で示されるようにして用い
られる酸塩化物を得た。

実施例44の化合物（３−（Ｎ−２−ベンジルオキシメ
チル）テトラゾリル−２−（1,1−ジメチルエトキシ）
メタンアミド−プロピオン酸メチルエステルまたは３−
（Ｎ−３−ベンジルオキシメチル）テトラゾリル−２−
（1,1−ジメチルエトキシ）メタンアミド−プロピオン
酸メチルエステル）1.0g（2.5ミリモル、１当量）を−
５℃にてトリフルオロ酢酸10mLに入れ、この溶液を0.5
時間攪拌し、この後真空で濃縮する。粗製のトリフルオ
ロ酢酸塩をトルエンに入れ、これを再度濃縮して、いか
なる残留トリフルオロ酢酸を除去する。次に粗製のトリ
フルオロ酢酸塩を乾燥THF5mLに入れ、上記されたように
して製造された４−メチルバレロイルクロライド0.52g
（3.8ミリモル、1.5当量）を添加し、その後トリエチル
アミン1.07mLを添加する。反応混合物を23℃にて２時間
攪拌し、エチルアセテート50mLで希釈する。有機相を0.
5M HCl（２×25mL）、飽和NaHCO₃（25mL）、ブライン
（25mL）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させる。デカ
ントした後、有機相を真空で濃縮し、シリカでのクロマ
トグラフィー（1:1 EtOAc/ヘキサン）により精製して、
相当する表題の化合物を得る。

実施例46 ３−（Ｎ−２−ベンジルオキシメチル）テトラゾリル−
２−（４−メチルバレロイルアミド）プロピオン酸また
は３−（Ｎ−３−ベンジルオキシメチル）テトラゾリル
−２−（４−メチルバレロイルアミド）プロピオン酸の
製造 実施例45の化合物（３−（Ｎ−２−ベンジルオキシメ
チル）テトラゾリル−２−（４−メチルバレロイルアミ
ド）プロピオン酸メチルエステルまたは３−（Ｎ−３−
ベンジルオキシメチル）テトラゾリル−２−（４−メチ
ルバレロイルアミド）プロピオン酸メチルエステル）の
メタノール溶液0.15Mを製造し、1.5当量の1M LiOH（e
q.）を添加する。反応混合物を出発原料がTLCによりな
くなるまで（約３時間）攪拌し、ダウエクス（Dowex）5
0X8−400イオン交換樹脂に通過させ、その樹脂を1:1の
メタノール：水４カラム容積で洗浄する。真空で濾液を
濃縮して、相当する表題の生成物を得る。

実施例47 Boc−Ｌ−プロリル−Ｌ−N^g−ニトロ−アルギニナル−
セミカルバゾニル−４−Ｎ−ジフェニルメタンの製造 実施例20の化合物（N^g−ニトロ−アルギナル−セミカ
ルバゾニル−４−Ｎ−ジフェニルメタントリフルオロ酢
酸塩）5.0g（9.6ミリモル、１当量）、Ｎ−ｔ−ブトキ
シカルボニル−Ｌ−プロリン2.15g（11.5ミリモル、1.2
当量）、BOP試薬5.53g（12.5ミリモル、1.3当量）、お
よびＮ−ヒドロキシベンズトリアゾールモノハイドレー
ト0.15g（0.96ミリモル、0.1当量）を乾燥DMF38mLに入
れ、Ｎ−メチルモルホリン6.3mL（57.6ミリモル、６当
量）をシリンジにより添加する。反応混合物を３時間攪
拌し、エチルアセテート300mLで希釈する。有機相を4M
HCl（30mL）、1M NaOH（２×30mL）、およびブライン
（30mL）で洗浄し、その後硫酸ナトリウムで乾燥させ
る。有機相をデカントし、真空で濃縮して、シリカの1:
10MeOH/メチレンクロライドでのクロマトグラフをする
ことができる粗製の表題化合物を得る。

実施例48 ３−（Ｎ−２−ベンジルオキシメチル）テトラゾリル−
２−（４−メチルバレロイルアミド）プロピオノイル−
Ｌ−プロリル−Ｌ−N^g−ニトロ−アルギニナル−セミカ
ルバゾニル−４−Ｎ−ジフェニルメタンまたは３−（Ｎ
−３−ベンジルオキシメチル）テトラゾリル−２−（４
−メチルバレロイルアミド）プロピオノイル−Ｌ−プロ
リル−Ｌ−N^g−ニトロ−アルギニナル−セミカルバゾニ
ル−４−Ｎ−ジフェニルメタンの製造 実施例47の化合物（Boc−Ｌ−プロリル−Ｌ−N^g−ニ
トロ−アルギニナル−セミカルバゾニル−４−Ｎ−ジフ
ェニルメタン）2.5ミリモル（１当量）を−５℃にてト
リフルオロ酢酸10mLに入れ、この溶液を0.5時間攪拌
し、その後真空で濃縮する。粗製のトリフルオロ酢酸塩
をトルエンに入れ、これを再度濃縮して、残留するいか
なるトリフルオロ酢酸を除去する。実施例46の化合物
（３−（Ｎ−２−ベンジルオキシメチル）テトラゾリル
−２−（４−メチルバレロイルアミド）プロピオン酸ま
たは３−（Ｎ−３−ベンジルオキシメチル）テトラゾリ
ル−２−（４−メチルバレロイルアミド）プロピオン
酸）３ミリモル（1.2当量）、BOP試薬3.25ミリモル（1.
3当量）、およびＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールモ
ノハイドレート0.25ミリモル（0.1当量）を乾燥DMF10mL
に入れ、Ｎ−メチルモルホリン15ミリモル（６当量）を
シリンジで添加する。反応混合物を３時間攪拌し、エチ
ルアセテート100mLで希釈する。有機相を4M HCl（10m
L）、1M NaOH（２×10mL）、およびブライン（10mL）で
洗浄し、その後硫酸ナトリウムで乾燥させる。有機相を
デカントし、真空で濃縮して粗製物を得、これはシリカ
の1:10のMeOH/メチレンクロライドでクロマトグラフす
ることができ、相当する表題の化合物を得る。

実施例49 ３−テトラゾリル−２−（４−メチルバレロイルアミ
ド）プロピオノイル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニナル
の製造 実施例48の全ての生成物をアニソール0.70mLとともに
テフロンHF容器に入れる。これを、乾燥窒素流のもと−
78℃まで冷却する。その後、無水HF（〜10ml）をその容
器へ液化させる。その反応物を攪拌し、−20℃まで温
め、その温度で30分間維持する。その反応物を０℃まで
温め、乾燥窒素流のもとHFを蒸発させる。HFが蒸発した
後、0.1M NH₄HCO₃50mlを添加し、その結果生じた溶液を
ジエチルエーテルで３回抽出する。次に、その水性相
（２−（４−メチルバレロイルアミド）プロピオノイル
−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニナルセミカルバゾンを含
有する）を氷酢酸4.9mL、1M HCl水溶液5.6mLおよび47％
ホルムアルデヒド水溶液2.7mLで処理する。この溶液を
１時間攪拌する（セミカルバゾンを加水分解するた
め）。次に、粒度10ミクロン、細孔サイズ300オングス
トロームのＣ−18カラムでの逆相HPLCを用いて、その結
果生じたペプトチドアルデヒドをアセトニトリルの勾配
が５％〜40％に及ぶ水−アセトニトリル（双方に0.1％
トリフルオロ酢酸含有）勾配で溶出させて精製する。そ
のカラム分留を分析用HPLCで分析し、純粋な生成物を含
有する分留を溜め、凍結乾燥し、表題の生成物を得る。

もしくは、実施例49の化合物は実施例50〜56で示され
る手段により合成されてよい。

実施例50 １−アミド−３−ベンジルオキシメタンアミド−1,4−
ブタンジオイックアシッド（butanedioic acid）メチル
エステル Cbz−Ｌ−アスパラギン15.0g（56.4ミリモル、１当
量）を乾燥メチレンクロライド100mLに溶解し、オキサ
リルクロライド50mL（573ミリモル、10当量）を10分間
以上かけて滴下した。反応物を23℃にて４時間攪拌し、
その後ロータリーエバポレーターにて真空で揮発分を除
去した。メタノール100mLを添加し、その混合物を23℃
にて0.5時間攪拌した。反応混合物を真空で濃縮し、フ
ラッシュクロマトグラフィー（０〜５％メタノール／メ
チレンクロライド）によりその粗製物を精製して、表題
の化合物12.45gを得た。¹H−NMR（CDCl₃）:7.4p.p.m
（ｍ、5H）;6.1p.p.m（ｄ、1H）;5.8p.p.m（ｄ、2H）;
5.1p.p.m（ｓ、2H）;4.6p.p.m（ｍ、1H）;3.75p.p.m
（ｓ、3H）;2.85p.p.m（ｍ、2H）。

実施例51 ３−シアノ−２−ベンジルオキシメタンアミドプロピオ
ン酸メチルエステルの製造 実施例50の化合物（Cbz−Ｌ−アスパラギン、メチル
エステル）5.0g（17.9ミリモル、１当量）を乾燥ピリジ
ン10mLに溶解し、ベンゼンスルホニルクロライド3.0mL
（23.2ミリモル、1.3当量）をシリンジで添加した。反
応物を50℃にて３時間攪拌した。1M HCl50mLを添加し、
その水溶液をエチルアセテート（２×100mL）で抽出し
た。有機相を併せて、1M HCl50mL、飽和NaHCO₃50mL、お
よびブラインで洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥させた
後、有機相をデカントし、真空で濃縮した。粗製物をフ
ラッシュクロマトグラフィー（10％EtOAc/メチレンクロ
ライド、Rf＝0.45）により精製して、表題の化合物4.1g
を得た。¹H−NMR（CDCl₃）:7.4p.p.m（ｍ、5H）;5.7p.
p.m（ｍ、1H）;5.1p.p.m（ｓ、2H）;4.6p.p.m（ｍ、1
H）;3.8p.p.m（ｓ、3H）;3.0p.p.m（ｍ、2H）。

実施例52 ３−テトラゾリル−２−ベンジルオキシメタンアミドプ
ロピオン酸メチルエステルの製造 実施例51の化合物（３−シアノ−２−ベンジルオキシ
メタンアミドプロピオン酸メチルエステル）2.5g（9.54
ミリモル、１当量）を乾燥THF10mLに溶解し、トリ−ｎ
−ブチルチンアジド3.0g（9.54ミリモル、１当量）を添
加した。反応物を72時間還流させ、その後真空で濃縮し
た。1M NaOH50mLを添加し、その水溶液をエチルアセテ
ート（３×50mL）で抽出した。その水溶液を4M HClでpH
＝１に酸性化し、エチルアセテート（４×60mL）で抽出
した。硫酸ナトリウムで乾燥させた後、有機相をデカン
トし、真空で濃縮して、表題の化合物2.5gを得た。¹H−
NMR（CDCl₃）:7.3p.p.m（ｍ、5H）;6.1p.p.m（ｍ、1
H）;5.1p.p.m（ｓ、2H）;4.8p.p.m（ｍ、1H）;3.8p.p.m
（ｓ、3H）;3.5p.p.m（ｍ、2H）。

実施例53 ３−テトラゾリル−２−アミノプロピオン酸メチルエス
テル塩酸塩の製造 実施例52の化合物（３−テトラゾリル−２−ベンジル
オキシメタンアミドプロピオン酸メチルエステル）0.53
g（1.74ミリモル、１当量）をメタノール30mLに溶解
し、conc.HCl1mLを添加した。反応物を窒素でフラッシ
ュ（flush）し、10％炭素上パラジウム80mgを添加し
た。その溶液に40psiにて２時間水素添加した。その触
媒を濾過し、その後真空で濃縮して、表題の化合物354m
gを得た。¹H−NMR（CD₃OD）:4.7p.p.m（ｍ、1H）;3.8p.
p.m（ｓ、3H）;3.6p.p.m（ｍ、2H）。

実施例54 ３−テトラゾリル−２−（４−メチルバレロイルアミ
ド）プロピオン酸メチルエステルの製造 実施例53の化合物（３−テトラゾリル−２−アミノプ
ロピオン酸メチルエステル塩酸塩）353mg（1.74ミリモ
ル、１当量）、４−メチルバレリアン酸262μＬ（2.09
ミリモル、1.2当量）、BOP試薬1.0g（2.26ミリモル、1.
3当量）、およびＮ−ヒドロキシベンズトリアゾールモ
ノハイドレート27mg（0.174ミリモル、0.1当量）を乾燥
DMF5mLに入れ、Ｎ−メチルモルホリン960μＬ（8.7ミリ
モル、５当量）をシリンジにより添加した。反応混合物
を23℃にて18時間攪拌し、その後エチルアセテート100m
Lで希釈した。有機相を20％クエン酸（10mL）およびブ
ライン（10mL）で洗浄し、その後硫酸ナトリウムで乾燥
させる。有機相をデカントし、真空で濃縮して粗製物を
得、これをMeOH/メチレンクロライド（２〜10％、１％
酢酸）でシリカのクロマトグラフをして、表題の化合物
230mgを得る（Rf＝0.30;10％MeOH/メチレンクロライ
ド、１％酢酸）。¹H−NMR（CDCl₃）:7.0p.p.m（ｄ、1
H）;5.05p.p.m（ｍ、1H）;3.8p.p.m（ｓ、3H）;3.6p.p.
m（ｍ、2H）;1.5p.p.m（ｍ、3H）;0.8p.p.m（ｄ、6
H）。

実施例55 ３−テトラゾリル−２−（４−メチルバレロイルアミ
ド）プロピオン酸の製造 実施例54の化合物（３−テトラゾリル−２−（４−メ
チルバレロイルアミド）プロピオン酸メチルエステル）
51mg（0.19ミリモル、１当量）、水酸化リチウム16mg
（0.38ミリモル、２当量）を水1.5mLに入れ、その反応
混合物を２時間攪拌した。1M HCl35μＬを添加し、その
溶液を真空で濃縮して、その後の反応でそのまま使用さ
れる表題の化合物を得た。¹H−NMR（CD₃OD）:4.6p.p.m
（ｍ、1H）;3.4p.p.m（ｍ、1H）;3.2p.p.m（ｍ、1H）;
2.15p.p.m（ｍ、2H）;1.4p.p.m（ｍ、3H）;0.8p.p.m
（ｄ、6H）。

実施例56 ３−（Ｎ−３−ベンジルオキシメチル）テトラゾリル−
２−（４−メチルバレロイルアミド）プロピオニル−Ｌ
−プロリル−Ｌ−N^g−ニトロ−アルギニナル−セミカル
バゾニル−４−Ｎ−ジフェニルメタンの製造 実施例19の化合物（Boc−Ｌ−プロリル−Ｌ−N^g−ニ
トロ−アルギニナル−セミカルバゾニル−４−Ｎ−ジフ
ェニルメタン）120mg（0.28ミリモル、１当量）を−５
℃にてトリフルオロ酢酸5mLに入れ、この溶液を0.5時間
攪拌し、その後真空で濃縮した。その粗製のトリフルオ
ロ酢酸塩をトルエンに入れ、これを再度濃縮して、残留
するいかなるトリフルオロ酢酸を除去する。実施例55の
化合物（３−テトラゾリル−２−（４−メチルバレロイ
ルアミド）プロピオン酸）48mg（0.23ミリモル、1.2当
量）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチ
ルカルボジイミドハイドロクロライド48mg（0.25ミリモ
ル、1.3当量）、および４−ジメチルアミノピリジン2mg
（0.02ミリモル、0.1当量）を乾燥DMF3mLに入れ、ジイ
ソプロピルエチルアミン100μＬ（0.57ミリモル、３当
量）をシリンジで添加した。反応混合物を23℃にて18時
間攪拌し、20％クエン酸10mLに注いだ。水溶液をエチル
アセテート（６×15mL）で抽出し、併せた有機相を硫酸
ナトリウムで乾燥させた。有機相をデカントし、真空で
濃縮して、粗製物を得、これを2mm分取TLCシリカゲルプ
レート（10％MeOH/メチレンクロライド、１％酢酸）で
クロマトグラフした。Rfが0.25のバンド（band）を回収
し、10％MeOH/エチルアセテートに入れ、濾過した。真
空で揮発分を除去して、表題の化合物30mgを得た。¹H−
NMR（CD₃OD）:7.3p.p.m（ｍ、10H）;7.1p.p.m（ｄ、1
H）;6.1p.p.m（ｓ、1H）;4.7p.p.m（ｍ、1H）;4.5p.p.m
（ｍ、1H）;4.3p.p.m（ｍ、1H）;3.6p.p.m（ｍ、1H）;
3.2p.p.m（ｍ、2H）;2.8p.p.m（ｍ、1H）;2.1p.p.m
（ｍ、3H）;1.2−1.9p.p.m（ｍ、13H）。

実施例57 ３−テトラゾリル−２−（４−メチルバレロイルアミ
ド）プロピオニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニナルの
製造 実施例56の全ての生成物をアニソール0.70mLとともに
テフロンHF容器に移した。これを、乾燥窒素流のもと−
78℃まで冷却した。その後、無水HF（〜10ml）を容器へ
液化させた。その反応物を攪拌し、−20℃まで温め、そ
の温度で30分間維持した。その反応物を０℃まで温め、
乾燥窒素流のもとHFを蒸発させた。HFが蒸発した後、0.
1M NH₄HCO₃50mlを添加し、その結果生じた溶液をジエチ
ルエーテルで３回抽出した。次に、その水性相（２−
（バレロイルアミド）プロピオニル−Ｌ−プロリル−Ｌ
−アルギニナル−セミカルバゾンを含有する）を氷酢酸
4.9mL、1M HCl水溶液5.6mLおよび47％ホルムアルデヒド
水溶液2.7mLで処理した。この溶液を１時間攪拌した
（セミカルバゾンを加水分解するため）。次に、粒度10
ミクロン、細孔サイズ300オングストロームのＣ−18カ
ラムでの逆相HPLCを用いて、その結果生じたペプトチド
アルデヒドをアセトニトリルの勾配が５％〜40％に及ぶ
水−アセトニトリル（双方に0.1％トリフルオロ酢酸含
有）勾配で溶出させて精製した。そのカラム分留を分析
用HPLCで分析し、純粋な生成物を含有する分留を溜め、
凍結乾燥し、表題の生成物を得た。高速原子衝撃質量分
析により、理論分子量492原子質量単位を確証した。

実施例58 Ｎ−Boc−Ｌ−アスパルチル−（β−メチルエステル）
−Ｌ−プロリン−Ｏ−ベンジルエステルの製造 Ｎ−Boc−Ｌ−アスパラギン酸−（β−メチルエステ
ル）57.58g（0.232モル）、Ｌ−プロリン−（Ｏ−ベン
ジルエステル）ハイドロクロライド50g（0.208モル）、
乾燥ジメチルホルムアミド（DMF）640ml、およびBOP102
g（0.237モル）の溶液を４−メチルモルホリン（NMM）1
27.47mLで処理し、窒素雰囲気下で一晩中攪拌した。こ
の溶液を水1000mLに注ぎ、エチルアセテート300mLで３
回抽出した。併せた有機相を水、10％HCl、飽和炭酸水
素ナトリウム水溶液、およびブライン300mLで３回洗浄
した。その有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧
下で蒸発させた。これにより、表題の化合物91.39g（収
率97.7％）（粘稠オイル）を得た。¹H−NMR（CDCl₃）:
7.33（Ｍ、5H）、5.42（ｍ、1H）、5.19、5.12（ｄ、
ｄ、2H）、4.56（ｂ、1H）、3.77（ｍ、2H）、3.67
（ｓ、3H）、2.72（ｍ、1H）、2.58（ｍ、1H）、2.18
（ｍ、1H）、1.97（ｍ、1H）、1.43（ｓ、9H）。

実施例59 Ｌ−アスパルチル−β−（メチルエステル）−Ｌ−プロ
リン−Ｏ−ベンジルエステル塩酸塩の製造 実施例58の化合物125.2g（0.288モル）の溶液をジオ
キサン500mLに溶解し、HCl（ｇ）で飽和されたジオキサ
ン500mLの溶液に０℃にて添加した。3.5時間後、TLCに
より残留している出発原料はないことを確認した。溶媒
を減圧下で蒸発させて、褐色ガラス（a brown glass）
を得た。その固体を減圧下で24時間放置し、粗製の表題
化合物145g（収率＞100％）を得た。これは、さらなる
精製なしに使用される。

実施例60 Ｎ−（ブチルスルホニル）−Ｌ−アスパルチル−（β−
メチルエステル）−Ｌ−プロリン−Ｏ−ベンジルエステ
ルの製造 実施例59の化合物12.2g（0.033モル）、ｎ−ブチル−
スルホニルクロライド3.9mL（0.03モル）、アセトニト
リル500mlおよび乾燥DMF7mLの溶液を０℃まで冷却し
た。この溶液をピリジン7mLで処理し、室温まで一晩中
温めた。この溶液を水1000mLに注ぎ、エチルアセテート
300mLで３回抽出した。併せた有機相を水、10％HCl、飽
和炭酸水素ナトリウム水溶液、およびブライン300mLで
３回洗浄した。その有機相を硫酸マグネシウムで乾燥さ
せ、減圧下で蒸発させた。これにより、表題の化合物5.
35g（収率36.3％）を褐色オイルとして得た。Rf＝0.95
（10％MeOH/メチレンクロライド）。

実施例61 Ｎ−（ブチルスルホニル）−Ｌ−アスパルチル−（β−
メチルエステル）−Ｌ−プロリンの製造 パール・ハイドロゲネーター（Parr Hydrogenator）
中、実施例60の化合物5.35g（0.012モル）、メタノール
250mLおよび10％炭素上パラジウム1.3gの溶液を水素40p
siで加圧した。この混合物を２時間振盪し、次に微細ガ
ラスフィルターを用いて、その混合物をセライトを通し
て濾過した。その溶液を濃縮し、白色ガラスとして表題
の化合物3.33g（77.6％）を得た。Rf＝0.18（10％MeOH/
メチレンクロライド）。

実施例62 Ｎ−（ブチルスルホニル）−Ｌ−アスパルチル（β−メ
チルエステル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニナルの製
造 実施例７からの樹脂0.5g（0.25ミリモル保護アミノ
基）を反応容器に置き、次にジクロロメタン５〜10mLで
３回洗浄した。

総時間35分間で50％トリフルオロ酢酸（ジクロロメタ
ン中）５〜10mLで２回連続処理することにより、Boc保
護基を除去して、樹脂を使用準備した。その樹脂を５％
ジイソプロピルエチルアミン（ジメチルホルムアミド
中）５〜10mLに７分間浸漬して置くことにより酸性度を
中性化した後、その樹脂をジメチルホルムアミド、ジク
ロロメタン、およびジメチルホルムアミドそれぞれ５〜
10mLで２回連続的に洗浄した。

粉々の樹脂をジメチルホルムアミド5mL中、懸濁さ
せ、次にNMM（101mg、1.0ミリモル）、実施例61の化合
物（397mg、1.0ミリモル）、TBTU（321mg、1.0ミリモ
ル）、HOBt（135mg、0.9ミリモル）およびDMF（3mL）で
処理した。室温（20〜25℃）で３時間攪拌後、樹脂を濾
過し、ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、メタノ
ールおよびジエチルエーテル５〜10mLで３回洗浄し、次
に減圧下で乾燥させた。

乾燥した樹脂を反応容器に置き、アニソール（0.5m
L）を添加した。その反応容器を−20℃まで冷却後、攪
拌しながら気体フッ化水素（12.0mL）を反応混合物に滴
下させた。−20℃にて２時間攪拌後、その反応混合物を
０℃まで温め、次に０℃にてフッ化水素を窒素流のもと
蒸留して除いた。樹脂をジエチルエーテル５〜10mLで２
回洗浄し、次に表題の化合物を0.1M炭酸水素アンモニウ
ム（50mL）および水（200mL）で樹脂から抽出した。水
性抽出液を併せ、ジエチルエーテル５〜10mLで３回抽出
し、凍結させ凍結乾燥して、表題生成物の粗製のセミカ
ルバゾン（170mg）を得た。

粗製のセミカルバゾン（40mg、0.06ミリモル）を反応
容器に置き、その後酢酸1.4mL、THF2.9mL、およびトリ
フルオロ酢酸（水中）1.4mLを入れpHを１にした。反応
混合物の攪拌を始め、エチルアセトアセテート0.2mLを
添加した。セミカルバゾンが粗製の表題生成物に変換す
るまで、１〜８時間毎にエチルアセトアセテートを添加
した。その後反応混合物を真空で濃くして乾燥させた。

粒度10ミクロン、細孔サイズ300オングストロームの
Ｃ−18カラムでの逆相HPLCを用いて、粗製の表題生成物
をアセトニトリルの勾配が５％〜40％に及ぶ水−アセト
ニトリル（双方に0.1％トリフルオロ酢酸含有）勾配で
溶出させて精製した。そのカラム分留を分析用HPLCで分
析し、純粋な生成物を含有する分留を溜め、凍結乾燥し
て、純粋な表題生成物を得た。高速原子衝撃質量分析に
より、理論分子量504原子質量単位を確証した。

実施例63 Ｎ−（２−ナフチルスルホニル）−Ｌ−アスパルチル−
（β−メチルエステル）−Ｌ−プロリン−Ｏ−ベンジル
エステルの製造 実施例59の化合物12.2g（0.033モル）、２−ナフタレ
ン−スルホニルクロライド6.8g（0.03モル）、アセトニ
トリル500mLおよび乾燥DMF7mLの溶液を０℃まで冷却し
た。この溶液をピリジン7mLで処理し、一晩中室温まで
温めた。この溶液を水1000mLに注ぎ、エチルアセテート
300mLで３回抽出した。併せた有機相を水、10％HCl、飽
和炭酸水素ナトリウム水溶液、およびブライン300mLで
３回洗浄した。その有機相を硫酸マグネシウムで乾燥さ
せ、減圧下で蒸発させた。これにより、表題の化合物1
2.76g（収率81.2％）を薄黄色固体として得た。Rf＝0.7
2（10％MeOH/メチレンクロライド）。

実施例64 Ｎ−（２−ナフチルスルホニル）−Ｌ−アスパルチル−
（β−メチルエステル）−Ｌ−プロリンの製造 パール・ハイドロゲネーター（Parr Hydrogenator）
中、実施例63の化合物12.76g（0.024モル）、メタノー
ル250mLおよび10％炭素上パラジウム1.3gの溶液を水素
の40psiで加圧した。この混合物を２時間振盪し、次に
微細ガラスフィルターを用いて、その混合物をセライト
を通して濾過した。その溶液を濃縮し、白色固体として
表題の化合物9.22g（87.3％）を得た。Rf＝0.12（10％M
eOH/メチレンクロライド）。

実施例65 Ｎ−（２−ナフチルスルホニル）−Ｌ−アスパルチル−
（β−メチルエステル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニ
ナルの製造 実施例61の化合物を実施例64の化合物（397mg、1.0ミ
リモル）に代えたこと以外、実施例62と同様の方法によ
り表題の化合物を製造した。高速原子衝撃質量分析によ
り、理論分子量574原子質量単位を確証した。

実施例66 Ｎ−（４−メチルフェニルスルホニル）−Ｌ−アスパル
チル−（β−メチルエステル）−Ｌ−プロリン−Ｏ−ベ
ンジルエステルの製造 実施例59の化合物12.2g（0.033モル）、トシルクロラ
イド5.72g（0.03モル）、アセトニトリル450mLおよび乾
燥DMF7mLの溶液を０℃まで冷却した。この溶液をピリジ
ン7mLで処理し、一晩中室温まで温めた。この溶液を水1
000mLに注ぎ、エチルアセテート300mLで３回抽出した。
併せた有機相を水、10％HCl、飽和炭酸水素ナトリウム
水溶液、およびブライン300mLで３回洗浄した。その有
機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下で蒸発させ
た。これにより、表題の化合物4.21g（収率28.7％）を
薄褐色オイルとして得た。Rf＝0.90（10％MeOH/メチレ
ンクロライド）。

実施例67 Ｎ−（４−メチルフェニルスルホニル）−Ｌ−アスパル
チル−（β−メチルエステル）−Ｌ−プロリンの調製 実施例66の化合物4.21g（0.012モル）、メタノール25
0mLおよび炭素上の10％パラジウム1.3gの溶液をパルの
ヒドロゲネーター（Parr Hydrogenator）中で40psiの水
素で加圧した。この混合物を２時間振とうし、次に混合
物を微粉ガラスフィルターを用いてセライトを通して濾
過した。溶液を濃縮して白色ガラス状の標題化合物3.17
g（92.4％）を得た。Rf＝0.11（メタノール／塩化メチ
レン中10％）。

実施例68 Ｎ−（４−メチルフェニルスルホニル）−Ｌ−アスパル
チル−（β−メチルエステル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−ア
ルギニナルの調製 実施例62に記載したと同じ方法で、実施例61の化合物
の代わりに実施例67の化合物（397mg、1.0mmole）を用
いて標題化合物を調製した。高速原子衝撃質量分析法に
より理論分子量538a.m.u.を確認した。

実施例69 Ｎ−Boc−Ｌ−アスパラギン酸−（β−メチルエステ
ル）−Ｏ−ベンジルエステルの合成 ０℃に冷却した、乾燥アセトニトリル（60mL）中のＮ
−Boc−アスパラギン酸−（β−メチルエステル）溶液
6.2g（25mmole）中へ、HOBt（5.1g、33mmole）、次いで
EDC（5.3g、27.5mmole）およびベンジルアルコール（2.
58mL、25mmole）を加えた。それから混合物を氷温浴中
で12時間撹拌し、それを室温へ暖めた。粗反応混合物を
真空内に移した後、酢酸エチル（200mL）、次いで水（5
0mL）を加えた。次いで有機相を分離し、飽和重炭酸ナ
トリウム溶液（50mL）、ブライン（50mL）および飽和ク
エン酸溶液（50mL）で洗浄した。有機相を分離し、硫酸
マグネシウムで乾燥した。次いで溶液を濾過し、それか
ら濾液を真空内に移して粗製エステルを得た。生成物
を、溶離液として4:1（ヘキサン：酢酸エチル）を用い
てフラッシュカラムクロマトグラフィー（SiO₂、100g）
により、精製し、標題化合物の白色固体3.5g（収率41
％）を得た。Rf＝0.32（4:1 ヘキサン：酢酸エチル）。

実施例70 Ｌ−アスパラギン酸−（β−メチルエステル）−Ｏ−ベ
ンジルエステル塩酸塩の調製 ０℃の乾燥ジオキサン50mL中の実施例69の化合物（3.5
g、10.3mmole）溶液中へ４モル濃度の塩酸のジオキサン
溶液50mLを加えた。TLC分析（4:1 ヘキサン：酢酸エチ
ル）で出発物質が検出されなくなるまで、混合物を０℃
で１時間撹拌した。次いで溶液を真空内に移し、標記化
合物2.65g（収率94％）を白色固体として得た。Rf＝0.2
（4:1 ヘキサン：酢酸エチル）。

実施例71 Ｎ−ベンジルスルホニル−Ｌ−アスパラギン酸−（β−
メチルエステル）−Ｏ−ベンジルエステルの調製 ０℃の乾燥アセトニトリル（50mL）中の実施例70の化
合物（2.6g、9.5mmole）の溶液中へ、ベンジルスルホニ
ルクロライド（1.8g、9.5mmole）、次いでピリジン（2.
4mL、30.0mmole）を加えた。混合物を終夜（12時間）室
温に温めておいた。それから混合物を真空内に移して、
酢酸エチル（150mL）を加えた。次いで有機相を飽和重
炭酸ナトリウム（50mL）、ブライン（50mL）および飽和
クエン酸（50mL）で洗浄した。有機相を乾燥（硫酸マグ
ネシウム）、濾過して真空内に移して粗製物質を得た。
化合物を、溶離液として7:3 ヘキサン：酢酸エチルを用
いてフラッシュクロマトグラフィー（SiO₂、100g）によ
り精製し、標題化合物2.87g（収率78％）を油状物とし
て得た。Rf＝0.39（1:1 ヘキサン：酢酸エチル）。

実施例71 Ｎ−ベンジルスルホニル−Ｌ−アスパラギン酸−（β−
メチルエステル）の調製 実施例70の化合物（2.8g、7.3mmole）のメタノール
（60mL）溶液に、0.5gの10％パラジウム／炭素を加え、
混合物を１気圧、25℃で12時間水素化した。次いで混合
物を濾過し、真空内に移して標題化合物の透明粘稠な油
1.93g（収率88％）を得た。Rf＝0.25（9:1 CHCl₃:MeO
H）。

実施例72 Ｎ−フェニルスルホニル−Ｌ−アスパルチル−（β−メ
チルエステル）−Ｌ−プロピル−Ｌ−アルギニナルの調
製 実施例７からの樹脂（0.25mmole、アミノ基保護）の
0.5gを反応容器に入れ、次いで５〜10mLのジクロロメタ
ンで３回洗浄した。

樹脂は50％トリフルオロ酢酸（ジクロロメタン溶液）
の５〜10mLで２回連続して全体で35分間処理してBoc保
護基を除去して使用できる状態にした。樹脂を５％ジイ
ソプロピルエチルアミン（ジメチルホルムアミド溶液）
の５〜10mL中に７分間浸けて酸性を中和した後、樹脂
を、５〜10mLのジメチルホルムアミドで２回、ジクロロ
メタンおよびジメチルホルムアミドで連続して洗浄し
た。塊の壊れた樹脂を5mLのジメチルホルムアミド中に
懸濁し、次いでNMM（101mg、1.0mmole）、Ｎ−Boc−Ｌ
−プロリン（215mg、1.0mmole）、BOP（443mg、1.0mmol
e）、HOBt（135mg、0.9mmole）およびDMF（5mL）で処理
した。室温（20〜25℃）で２時間撹拌後、樹脂を濾過し
て除き、ジメチルホルムアミドの５〜10mLで３回および
続いてジクロロメタンで洗浄した。

樹脂（Ｎ−Boc−Ｌ−プロリンを結合している）を、5
0％トリフルオロ酢酸（ジクロロメタン溶液）の５〜10m
Lで２回、全35分間連続して処理することにより、（結
合したBoc−Ｌ−プロリンから）Boc保護基をはずしてす
ぐに使用できる状態にした。樹脂を５％ジイソプロピル
エチルアミン（ジメチルホルムアミド溶液）の５〜10mL
中に７分間浸けて酸性を中和した後、樹脂を、５〜10mL
のジメチルホルムアミドで２回、ジクロロメタンおよび
ジメチルホルムアミドで連続して洗浄した。塊の壊れた
樹脂を5mLのジメチルホルムアミド中に懸濁し、次いでN
MM（101mg、1.0mmole）、実施例71の化合物（284mg、1.
0mmole）、BOP（443mg、1.0mmole）、HOBt（135mg、0.9
mmole）およびDMF（５−10mL）で処理した。室温（20〜
25℃）で２時間撹拌後、樹脂を濾過して除き、ジメチル
ホルムアミドの５〜10mLで３回および引き続きジクロロ
メタンで洗浄した。

純粋な標題化合物を、セミカルバゾンとしての除去、
粗製の標題化合物への変換および実施例62に記載した方
法による精製によって樹脂から回収した。高速原子衝撃
質量分析法により理論分子量538a.m.u.を確認した。

実施例73 Ｎ−シクロヘキシルスルフェミル−Ｌ−アスパラギン酸
−（β−メチルエステル）−Ｏ−ベンジルエステルの調
製 シクロヘキシルアミンスルファミン酸ナトリウム塩
（アルドリッチ（Aldrich）社製、2.01g、10.0mmole）
に、6mLのオキシ塩化リンを加える。次に懸濁液を４時
間100℃に加熱する。次いで混合物を室温に冷却し、真
空内でオキシ塩化リンを取り除いて固体を得る。それか
らこの固体を乾燥アセトニトリル（35mL）中に懸濁し、
混合物を０℃に冷却する。この混合物に実施例70のアス
パラギン酸−（β−メチルエステル）ベンジルエステル
塩酸塩（2.73g、10.0mmole）を、次いでピリジン（2.6m
L、30.0mmole）を加える。混合物を氷温浴中で10時間に
かけて室温まで温める。アセトニトリルを真空内で除
き、残留物質を酢酸エチル中に取り出す。有機相を飽和
重炭酸ナトリウム水溶液、ブラインおよび１モル濃度の
塩酸水溶液で洗浄する。有機相を硫酸マグネシウムで乾
燥し、濾過して、真空内に移して、標題化合物を得る。

実施例74 Ｎ−シクロヘキシルスルファミル−Ｌ−アスパラギン酸
−（β−メチルエステル）の調製 実施例73の化合物を100mLのテトラヒドロフラン／メ
タノール1:1混合物に溶解し、0.5gの10％パラジウム／
炭素を加える。混合物を１気圧の水素で室温で４時間水
素化する。次に混合物を濾過し、真空内に移して標題化
合物を得る。

実施例75 Ｎ−シクロヘキシルスルファミル−Ｌ−アスパルチル−
（β−メチルエステル）−Ｌ−プロリン−Ｏ−ベンジル
エステルの調製 実施例74の化合物（2.46g、8.0mmole）の乾燥ジメチ
ルホルムアミド（10mL）溶液中へ、EDC（8.0mmole、1.5
3g）およびHOBt（10mmole、1.62g）を全部一時に加え
る。この混合物を０℃で10分間撹拌し、それからＬ−プ
ロリン−（Ｏ−ベンジルエステル）塩酸塩（8mmole、1.
93g）を加え、更にNMM（24mmole、2.6mL）を加える。反
応は氷温浴中で10時間かけて室温になるように行う。そ
れから反応混合物を酢酸エチルで希釈し、重炭酸ナトリ
ウムの飽和水溶液、ブラインおよび１モル濃度の塩酸水
溶液で洗浄する。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、
濾過して真空内に移し、標題の化合物を生成する。

実施例76 Ｎ−シクロヘキシルスルファミル−Ｌ−アスパルチル−
（β−メチルエステル）−Ｌ−プロリンの調製 実施例75の化合物（2.97g、6.0mmole）のメタノール
（60mL）溶液に、10％パラジウム／炭素を加え、混合物
を大気圧下で12時間水素化する。次いで混合物をセライ
トの充填物を通して濾過し、溶媒を真空中で除去して標
題の化合物を得る。

実施例77 Ｎ−シクロヘキシルスルファミル−Ｌ−アスパルチル−
（β−メチルエステル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニ
ナルの調製 実施例62に記載したと同じ方法で、実施例61の化合物
を実施例76の化合物（1.0mmole）に代えることにより標
題の化合物を得る。

実施例78 Ｎ−メトキシスルホニル−Ｌ−アスパルチル−（β−メ
チルエステル）−Ｌ−プロリン−Ｏ−ベンジルエステル
の調製 硫酸メチルのナトリウム塩（アルドリッチ、1.34g、1
0.0mmole）に、10mLのオキシ塩化リンを加え、混合物を
100℃に３時間加熱する。反応を室温に冷却し、真空中
でオキシ塩化リンを除いて、白色の残留物を残す。次い
で残留物を乾燥アセトニトリル（25mL）と混合し、氷浴
中で０℃に冷却する。次に実施例70のアスパラギン酸−
（β−メチルエステル）ベンジルエステル塩酸塩（3.7
g、10mmole）を全量一度に加え、次いでピリジン（2.6m
L、30mmole）を加える。反応を氷浴中で10時間かけて室
温まで温める。真空にしてアセトニトリルを除き、残留
物を酢酸エチルで希釈する。有機相を重炭酸ナトリウム
の飽和水溶液、ブラインおよび１モル濃度の塩酸水溶液
で洗浄する。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過
し、溶媒を真空中で除去して標題の化合物を得る。

実施例79 Ｎ−メトキシスルホニル−Ｌ−アスパルチル−（β−メ
チルエステル）−Ｌ−プロリンの調製 実施例78の化合物を150mLのメタノールに溶解し、0.5
gの10％パラジウム／炭素を加える。次に混合物を大気
圧下で４時間水素化する。混合物を濾過し、溶媒を真空
にして除き、標題の化合物を得る。

実施例80 Ｎ−メトキシスルホニル−Ｌ−アスパルチル−（β−メ
チルエステル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニナルの調
製 標題の化合物を、実施例72に記載と同じ方法で、実施
例71の化合物の代わりに実施例79の化合物（1.0mmole）
を用いて調製した。

実施例Ａ 選定した精製凝固酵素のインビトロでの抑制性 トロンビン、第X a因子およびプラスミン触媒活性の
インヒビターとして作用する本発明の化合物の能力は、
精製ヒト酵素を用いて、酵素活性を50％抑制する濃度
（IC₅₀）を決定することにより評価した。

ずべてのアッセイに使用した緩衝剤はHBSA（10mM HEP
ES、pH7.5、150mM塩化ナトリウム、0.1％子牛血清アル
ブミン）であった。IC₅₀決定用のアッセイはコーニング
・ミクロタイター・プレート（Corning microtiter pla
te）の適当なウエル中で、50μＬのHBSA、HBSA中に希釈
した特定濃度（広い濃度範囲をカバーしている）の試験
化合物（またはV₀（無抑制速度）測定用のHBSA単独）の
50μＬ、およびHBSA中に希釈した酵素の50μＬを組み合
わせて行った。室温での30分のインキュベーションに続
いて、下記で特定した濃度の基質50μＬをウエルに加え
て、最終全体積を200μＬにした。クロモゲンによる基
質加水分解の初期の速度は、サーモマックス（Thermo M
ax;登録商標）キネティック・マイクロプレート・リー
ダー（Kinetic Microplate Reader）を用いて、加えた
基質の５％までの量が用いられる５分間の、405nmの吸
収の変化により測定した。初期加水分解速度を50％低下
する添加インヒビターの濃度をIC₅₀として定義した。

トロンビンアッセイ 色原体基質ペファクローム（Pefachrome）ｔ−PA（ペ
ンタファーム社（Pentapharm Ltd.）から入手したCH₃SO
₂−Ｄ−ヘキサヒドロチロシン−グリシル−Ｌ−アルギ
ニン−ｐ−ニトロアニリン）を用いてトロンビン触媒活
性を測定した。基質は脱イオン水に溶解し、アッセイを
行うに先立って、最終濃度が300μＭ（Kmの約10倍）に
なるようにHBSA中に希釈した。精製ヒトαトロンビンは
エンザイム・リサーチ・ラボラトリーズ社から得た。酵
素をアッセイ開始に先立ってHBSA中に希釈して最終濃度
を0.25nMにした 第X a因子アッセイ 第X a因子触媒活性は、カビ・ダイアゴノスティカ（K
abi Diagonostica）社から入手した基質、S2765（Ｎ−
α−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−アルギニニル−Ｌ
−グリシル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド−ジ
ヒドロクロライド）を用いて測定した。基質を脱イオン
水に溶解し、アッセイを行うに先立って、最終濃度が25
0μＭ（Kmの約５倍）となるようにHBSA中に希釈した。
ヒト第X a因子をエンザイム・リサーチ・ラボラトリー
ズから入手した精製ヒト第Ｘ因子から、ボック、ピー・
イー（Bock,P.E.）他著、アーキブズ・オブ・バイオケ
ミカル・バイオフィジオロジー（Archives of Biochem.
Biophys.）、第273巻、第375頁（1989年）に記載されて
いる方法により調製した。酵素はアッセイを実施するの
先立って、最終濃度が0.5nMとなるようにHBSA中へ希釈
した。

プラスミンアッセイ プラスミン触媒活性を、カビ・ダイアゴノスチカ社か
ら入手した色原体基質Ｓ−2251［Ｄ−ヴァリル−Ｌ−ロ
イシル−Ｌ−リジン−ｐ−ニトロアニリドジヒドロクロ
ライド］を用いて測定した。基質を脱イオン水に溶解
し、アッセイを行うに先立って、最終濃度が300μＭ（K
mの約５倍）となるようにHBSA中に希釈した。精製ヒト
プラスミンをエンザイム・リサーチ・ラボラトリーズ・
インコーポレイテドから入手した。酵素は、アッセイを
行うに先立って、最終濃度が1.0nMとなるようにHBSA中
へ希釈した。

下の表１には、選定した試験化合物のIC₅₀値を、対照
化合物である、Boc−（Ｄ−Phe）−Pro−Arg−alと比較
して記載してある。

このデータは、これらの群のインヒビター類が、血液
凝固過程に含まれる特定の酵素類のインヒビターとして
使用できることを示している。

実施例 B 血栓形成の実験モデル 実施例10の化合物、HCA−Asp−Pro−Arg−alの抗血栓
形成特性を、以下のFeCl₃誘発による血小板依存性動脈
血栓形成のラットモデルである急性動脈血栓形成用に確
立されている実験モデルを用いて評価した。

このモデルは直接トロンビン阻害剤のごとき強い抗血
栓形成剤を評価するのに用いられてきた、詳しく解析さ
れている血小板依存性の動脈血栓形成の特有のモデルで
ある。参照：クルツ、ケー・ディー（Kurz,K.D.）、メ
イン、ビー・ダブリュ（Main,B.W.）およびサンダスキ
ー、ジー・イー（Sandusky,G.E.）著、トロンボシス・
リサーチ（Thromb.Res.,）、第60巻、第269〜280頁（19
90年）。このモデルにおける血栓の発現は比較的ヘパリ
ン感受性が少なく、このことは当モデルが、バルーン血
管形成術、または酵素的血栓溶解によって再開通させた
冠血管内に新たに認められる血栓形成に臨床的により近
いモデルであることを示す。本モデルにおいては、血小
板が豊富な閉塞性血栓を、濾紙に含浸させた新鮮なFeCl
₃溶液で処理したラット頸動脈のセグメントに生成させ
る。FeCl₃は動脈の処置されたセグメント内に拡散し、
血栓形成の原因となる内皮細胞の脱落が生じる。FeCl₃
投与の後の閉塞性血栓形成に及ぼす試験化合物の効果
を、超音波フロートメトリーによって監視し、これを一
次データとして用いた。フロートメトリーの使用は、凝
血塊の生成を温度により追跡するオリジナル方法の改良
法である。クルツ、ケー・ディー（Kurz,K.D.）、メイ
ン、ビー・ダブリュ（Main,B.W.）およびサンダスキ
ー、ジー・イー（Sandusky,G.E.）著、トロンボシス・
リサーチ（Thromb.Res.,）、第60巻、第269〜280頁（19
90年）。

オスのハーラン・スプラグー・ドゥレーラット（420
−450g）を少なくとも実験の72時間前から環境に慣らし
た。動物は手術の12時間前から絶食したが、水は自由に
飲めるようにした。動物は、ネンブタールで麻酔し、血
圧の測定、薬物および麻酔の注入のためにカテーテルを
埋め込んで準備した。頸部の中心を切開した後、先を鈍
にした器具を用いた切開および伸展操作によって頸動脈
鞘から2cmの血管を分離、左頸動脈を確保した。分離し
た血管の基部側の末端および末梢側の末端の下部へ絹糸
を挿入し、基部側末端の周囲の超音波フロー・プローブ
（トランソニック）の設置のためのクリアランスとし
た。プローブを定常アームに固定した。

手術の後、動物をコントロール（生理的食塩水の注
入）および試験化合物（実施例８の化合物）投与群、そ
れぞれ１群の１用量につき少なくとも６匹となるように
ランダム化した。フロー・プローブを取り付けた後に被
検化合物を投与し、血栓形成刺激を与える30分前から安
定化させた。ｔ＝０において、直径3mmの濾紙（ワット
マン＃３）を10mlの新たに調製したFeCl₃の35％水溶液
に浸したものを、分離させた頸動脈の、フロー・プロー
ブの反対側の頸動脈セグメントへ適応した。血圧、血
流、心拍数および呼吸を60分間モニターした。

血管閉塞の発生（血流が０となった点として定義し
た）を一次データとして記録した。60分間の観察期間の
後、フロー・プローブを除き、過剰の流体を清浄した。
末梢側および中枢側の糸を縛り、動脈クランプを中枢お
よび末梢側の末端からかなり離れた部位に止めた。分離
していたセグメントを切り出し、濾紙上で吸収させて乾
燥し、重量を測定した。凝血塊を除いた後、セグメント
の重量を再計量し、その差を全凝血塊重量とした。試験
の後、動物を安楽死させた。

実施例10の化合物の抗血栓形成剤としての、本インビ
ボモデルにおける有効性を、血管閉塞の発生の減少およ
び凝血塊重量の縮小にて評価した。結果を表IIに示す。

これらのインビボのデータは明らかに実験的血栓形成
の十分確立したモデルにおける実施例10の化合物の抗血
栓形成効果を示している。

フロントページの続き (72)発明者 ピアソン、ダニエル・アンドルー アメリカ合衆国03110ニュー・ハンプシ ャー、ベッドフォード、ビールズ・ロー ド149番 (72)発明者 アベルマン、マシュー・マーク アメリカ合衆国92075カリフォルニア、 ソラナ・ビーチ、ナンバー・3312、ステ ィーブンス・アベニュー873番 (56)参考文献 特開 平４−257600（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−242616（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−89498（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−122749（ＪＰ，Ａ) 国際公開92／007869（ＷＯ，Ａ１) Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，36（３）, 314−319 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 5/06 - 5/117 ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (29)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の式： ［式中、（ａ）R₁は以下 （１） Ｘが−Ｃ（＝Ｏ）−もしくは−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）
   −の場合には５から10炭素原子のアルキル基、またはＸ
   が−Ｓ（O₂）−、−NH−Ｓ（O₂）−もしくは −Ｏ−Ｓ（O₂）−の場合には１から10炭素原子のアルキ
   ル基、 （２） ５から８炭素原子の環状アルキル基で置換され
   た１から３炭素原子のアルキル基、 （３） 随意に５から８炭素原子の環状アルキル基で置
   換された３から６炭素原子のアルケニル基、 （４） 随意にY₁でモノ置換またはY₁とY₂でジ置換され
   た６から14炭素原子のアリール基、 （５） アリール環上が随意にY₁でモノ置換またはY₁と
   Y₂でジ置換された６から15炭素原子のアラルキル基、 （６） アリール環上が随意にY₁でモノ置換または随意
   にY₁およびY₂でジ置換された８から15炭素原子のアラル
   ケニル基、 （７） １から12炭素原子のパーフルオロアルキル基、 （８） ６から14炭素原子のパーフルオロアリール基、 （９） ４から８炭素原子のトリメチルシリルアルキル
   基、 （10） からなる群から選択される （Y₁およびY₂は独立して、ブロモ、クロロ、フルオロ、
   Z₁−、HO−、Z₁O−、NH₂−、Z₁−NH−、（Z₁,Z₂）Ｎ
   −、Z₁−Ｃ（Ｏ）−NH−、HS−、Z₁−Ｓ−、Z₁−Ｓ
   （Ｏ）−、Z₁S（O₂）−、HO−Ｓ（O₂）−、Z₁−Ｏ−Ｓ
   （O₂）−、NH₂−Ｓ（O₂）−およびZ₁−NH−Ｓ（O₂）−
   からなる群から選択される、 （Z₁およびZ₂は独立してトリフルオロメチル、ペンタフ
   ルオロエチル、１から12炭素原子のアルキル基、６から
   14炭素原子のアリール基および６から15炭素原子のアラ
   ルキル基からなる群から選択される））。； （ｂ） Ｘは−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−
   Ｓ（O₂）−、−NHS（O₂）−または−Ｏ−Ｓ（O₂）−で
   ある。； （ｃ） ｍは１または２である。； （ｄ） R₂はCO₂H、−CO₂R'または （R'は１から４炭素原子のアルキル基、６から14炭素原
   子のアリール基またはは６から14炭素原子のアラルキル
   基である）である。； （ｅ） R₃は−（CH₂）_３−NH−Ｃ（＝NH）−NH₂;また
   は薬学的に許容されるその塩である。］ で示される化合物。
2. 【請求項２】Ｘが−Ｃ（＝Ｏ）−である請求項１の化合
   物。
3. 【請求項３】R₁が５から10炭素原子のアルキル基;5から
   ８炭素原子の環状アルキル基で置換された１から３炭素
   原子のアルキル基；所望によりY₁でモノ置換された炭素
   原子６から14のアリール基；またはアリール環上が随意
   にY₁でモノ置換された６から15炭素原子のアラルキル基
   である、請求項２の化合物。
4. 【請求項４】R₁が３−メチルブチル、４−ヘプチル、２
   −シクロヘキシルエチル、２−フェニルエチルおよび１
   −ナフチルメチルからなる群から選択される、請求項３
   の化合物。
5. 【請求項５】R₂が−CO₂Hである請求項４の化合物。
6. 【請求項６】以下の化合物： からなる群から選択される請求項５の化合物。
7. 【請求項７】下式で示される請求項６の化合物。
8. 【請求項８】R₂が−CO₂CH₃、−CO₂CH₂CH₃または−CO₂CH
   ₂CH₂CH₃である請求項４の化合物。
9. 【請求項９】R₂が−CO₂CH₃である請求項８の化合物。
10. 【請求項１０】以下の化合物： からなる群から選択される請求項９の化合物。
11. 【請求項１１】下式で示される請求項10の化合物。
12. 【請求項１２】R₂が である請求項４の化合物。
13. 【請求項１３】以下の化合物： からなる群から選択される、請求項12の化合物。
14. 【請求項１４】下式で示される請求項13の化合物。
15. 【請求項１５】下式で示される請求項13の化合物。
16. 【請求項１６】下式で示される請求項13の化合物。
17. 【請求項１７】Ｘが−SO₂−である、請求項１の化合
    物。
18. 【請求項１８】R₁が５から10炭素原子のアルキル基;5か
    ら８炭素原子の環状アルキル基で置換された１から３炭
    素原子のアルキル基；随意に Y₁でモノ置換された６から14炭素原子のアリール基；及
    びアリール環上が随意にY₁でモノ置換された６から15炭
    素原子のアラルキル基； からなる群から選択される、請求項17の化合物。
19. 【請求項１９】R₂が−CO₂Hである請求項18の化合物。
20. 【請求項２０】以下の化合物： からなる群から選択される、請求項19の化合物。
21. 【請求項２１】R₂が−CO₂CH₃、−CO₂CH₂CH₃または−CO₂
    CH₂CH₂CH₃である、請求項18の化合物。
22. 【請求項２２】R₂が−CO₂CH₃である、請求項21の化合
    物。
23. 【請求項２３】以下の化合物： からなる群から選択される、請求項22の化合物。
24. 【請求項２４】以下の化合物： からなる群から選択される、請求項23記載の化合物。
25. 【請求項２５】R₂が である請求項18記載の化合物。
26. 【請求項２６】以下の化合物： からなる群から選択される、請求項25の化合物。
27. 【請求項２７】以下の化合物： からなる群から選択される、請求項１の化合物。
28. 【請求項２８】式： AcR−A₁−Ｌ−Pro−Arg−al （式中、AcRはR₁−Ｃ（＝Ｏ）−またはR₁−Ｓ（O₂）−
    であり、R₁が以下 （１） ５から10炭素原子のアルキル基、 （２） ５から８炭素原子の環状アルキル基で置換され
    た１から３炭素原子のアルキル基 （３） 随意に５から８炭素原子の環状アルキル基で置
    換された３から６炭素原子のアルケニル基、 （４） 随意にY₁でモノ置換またはY₁とY₂でジ置換され
    た６から14炭素原子のアリール基、 （５） アリール環上が随意にY₁でモノ置換またはY₁と
    Y₂でジ置換された６から15炭素原子のアラルキル基、 （６） アリール環上が随意にY₁でモノ置換または随意
    にY₁およびY₂でジ置換された８から15炭素原子のアラル
    ケニル基、 （７） ５から12炭素原子のパーフルオロアルキル基、 （８） ６から14炭素原子のパーフルオロアリール基、 （９） ５から８炭素原子のトリメチルシリルアルキル
    基、 からなる群から選択される基を示す、 （Y₁およびY₂は独立して、ブロモ、クロロ、フルオロ、
    Z₁−、HO−、Z₁O−、NH₂−、Z₁−NH−、（Z₁,Z₂）Ｎ
    −、Z₁−Ｃ（Ｏ）−NH−、HS−、Z₁−Ｓ−、Z₁−Ｓ
    （Ｏ）−、Z₁S（O₂）−、HO−Ｓ（O₂）−、Z₁−Ｏ−Ｓ
    （O₂）−、NH₂−Ｓ（O₂）−およびZ₁−NH−Ｓ（O₂）−
    からなる群から選択される、 （Z₁およびZ₂は独立してトリフルオロメチル、ペンタフ
    ルオロエチル、１から12炭素原子のアルキル基、６から
    14炭素原子のアリール基および６から15炭素原子のアラ
    ルキル基からなる群から選択される）） A₁はグルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸のγ
    −R'エステル、アスパラギン酸のβ−R'エステル、グル
    タミン酸もしくはアスパラギン酸のカルボン酸基とテト
    ラゾールが置換した基（R'は１〜６炭素原子の低級アル
    キル基、６〜14炭素原子のアリール基または６〜14炭素
    原子のアラルキル基を示す）からなる群から選択され
    る） で示され、トロンビンおよび／または第X a因子に対す
    るIC₅₀が200nM以下であり、プラスミンに対するIC
    ₅₀が、トロンビンまたは第X a因子に対するIC₅₀値のう
    ちの低い方より高い化合物。
29. 【請求項２９】治療上許容される担体と請求項１、２、
    ３、４、５、６、７、８、９、10、11、12、13、14、1
    5、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27
    または28の化合物の治療有効量を含有する、血栓生成異
    常に特徴付けられる、哺乳類の症状を予防または治療す
    るための医薬組成物。