JPH05199881A

JPH05199881A - 小麦胚芽凝集素蛋白質の微生物学的製造法

Info

Publication number: JPH05199881A
Application number: JP23725491A
Authority: JP
Inventors: Yoshifumi Chikami; 芳文地神; Michirou Muraki; 三智郎村木; Hitoshi Nagahora; 仁長洞
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1991-08-23
Filing date: 1991-08-23
Publication date: 1993-08-10
Anticipated expiration: 2009-09-21
Also published as: JPH0673458B2; GB2258868A; GB9217769D0

Abstract

(57)【要約】【構成】特定のヌクレオチド配列で表わされる小麦胚
芽凝集素の成熟体構造遺伝子、該ヌクレオチド配列を含
む組換えプラスミド、該組換えプラスミドで形質転換さ
れた形質転換体微生物および該形質転換体微生物を培養
して小麦胚芽凝集素を製造する方法。【効果】本発明において、ＷＧＡの生産に遺伝子工学
的手法を採用することにより純度の高いＷＧＡを安定に
かつ多量に製造することができた。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は化学的に合成した小麦胚
芽凝集素遺伝子を用いた遺伝子工学的手法による小麦胚
芽凝集素の製造法に関する。

【０００２】

【従来技術】小麦胚芽凝集素（wheat germ agglutinin,
以下ＷＧＡと略す）は、小麦胚芽中に見いだされる蛋
白質であり、ガン細胞を特異的に凝集させる活性をもつ
ことが知られている［J.C. Aub et al., Proc. Natl. A
cad. Sci. USA, Vol.50, p.613 (1963)］。また、ＷＧ
Ａは、N-アセチルグルコサミン（GlcNAc）や N- アセチ
ルノイラミン酸（NeuNAc）（別名シアル酸）を含むオリ
ゴ糖や糖蛋白質、糖脂質などに特異的に結合する作用を
有するため、これを利用した生体成分の分離・分析用試
薬としても市販され、ＷＧＡ単品だけでなく、種々の担
体に固定化したＷＧＡとしても一般に利用されている。
ＷＧＡは、さらに、ガン患者の血清や体液中に存在する
ガン関連糖蛋白質と特異的に結合することから、腫瘍マ
ーカーの一つとして、ガンの診断にも利用できる（日本
特開、昭62-257062 および昭62ー257063 ）。

【０００３】ＷＧＡは従来、小麦胚芽から精製すること
により調製されている［例えば、Nagata and Burger,
J. Biol. Chem., Vol.249, p.3116 (1974) 及び Nagata
et al., Methods in Enzymology, p.611, Academic Pr
ess (1974) ］が、市販のＷＧＡは数種類のＷＧＡ同族
体（アイソマー）を含んだ混合物として通常供給されて
いる。これは小麦胚芽の遺伝子構成の反映であるが、特
定の品種の胚芽を用いても２〜３種類のＷＧＡアイソマ
ーが含まれることが分かっている［Rice, Biochim. Bio
phys. Acta, Vol.444, p.175 (1976) ］。ＷＧＡアイソ
マーの相互分離とそれらの精製はかなり煩雑で時間がか
かり、コストも高くなるため、市販のＷＧＡは同族体の
混合物のまま供給されている場合が多いのが現状であ
る。

【０００４】また、ＷＧＡの生産量と価格は、原料とな
る小麦胚芽の供給量および価格により変動するが、小麦
の生産そのものが気候など自然環境により影響をうけや
すいため、ＷＧＡの原料である小麦胚芽も、その供給お
よび価格が不安定になる欠点をもっている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
ＷＧＡの生産と供給における質的、量的欠点を克服する
ため、組換えＤＮＡ技術により、純粋なＷＧＡを、安定
にしかも多量に、分泌生産し、これを提供することを目
的とするものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は次の
構成を含むものである。（１）配列番号１のヌクレオチド配列で表わされる小
麦胚芽凝集素の成熟体構造遺伝子。（２）上記（１）記載の小麦胚芽凝集素の構造遺伝子
の５’端に分泌に必要なシグナルペプチドをコードする
ＤＮＡ領域を、また３’端に翻訳終止信号ＴＧＡＴＡＡ
を、それぞれ有する小麦胚芽凝集素遺伝子。（３）上記（１）記載の小麦胚芽凝集素の構造遺伝子
の５’端に分泌に必要なシグナルペプチドをコードする
ＤＮＡ領域を、また３’端に翻訳終止信号ＴＧＡＴＡＡ
を、それぞれ有する小麦胚芽凝集素遺伝子を含む組換え
プラスミドＤＮＡ。（４）発現プロモーターが酵母プロモーターであり、
かつ、シグナルペプチドをコードする領域が該酵母プロ
モーターの下流側で、かつ小麦胚芽凝集素遺伝子の上流
にあり、いずれもこれらと解読枠が一致していることを
特徴とする上記（３）記載の組換えプラスミド。（５）宿主細胞を上記（３）または上記（４）記載の
小麦胚芽凝集素遺伝子を含む組換えプラスミドＤＮＡで
形質転換した形質転換体微生物。（６）宿主細胞が酵母である上記（５）記載の形質転
換体微生物。（７）酵母が、サッカロミセス属に属する酵母株、あ
るいは液胞局在性蛋白質を細胞外に分泌する突然変異を
有するサッカロミセス属に属する酵母変異株であること
を特徴とする上記（６）記載の形質転換体微生物。（８）酵母変異株が、KS-58-2Ddelであることを特徴
とする上記（７）記載の形質転換体微生物。（９）上記（５）乃至上記（８）のいずれか記載の形
質転換体微生物を培地に培養して、培養物から小麦胚芽
凝集素を採取することを特徴とする小麦胚芽凝集素の製
造法。（１０）配列番号２のヌクレオチド配列で表わされる
小麦胚芽凝集素前駆体をコードする遺伝子。（１１）上記（１０）記載の小麦胚芽凝集素前駆体を
コードする遺伝子の５’端に分泌に必要なシグナルペプ
チドをコードするＤＮＡ領域を、また３’端に翻訳終止
信号ＴＧＡＴＡＡを、それぞれ有する小麦胚芽凝集素前
駆体をコードする遺伝子。（１２）上記（１０）記載の小麦胚芽凝集素前駆体を
コードする遺伝子の５’端に分泌に必要なシグナルペプ
チドをコードするＤＮＡ領域を、また３’端に翻訳終止
信号ＴＧＡＴＡＡを、それぞれ有する小麦胚芽凝集素前
駆体をコードする遺伝子を含む組換えプラスミドＤＮ
Ａ。（１３）発現プロモーターが酵母プロモーターであ
り、かつ、シグナルペプチドをコードする領域が該酵母
プロモーターの下流側で、かつ小麦胚芽凝集素遺伝子の
上流にあり、いずれもこれらと解読枠が一致しているこ
とを特徴とする上記（１２）記載の組換えプラスミドＤ
ＮＡ。（１４）宿主細胞を上記（１２）または上記（１４）
記載の小麦胚芽凝集素遺伝子を含む組換えプラスミドＤ
ＮＡで形質転換した形質転換体微生物。（１５）宿主細胞が酵母である上記（１４）記載の形
質転換体微生物。（１６）酵母が、サッカロミセス属に属する酵母株、
あるいは液胞局在性蛋白質を細胞外に分泌する突然変異
を有するサッカロミセス属に属する酵母変異株であるこ
とを特徴とする上記（１５）記載の形質転換体微生物。（１７）酵母変異株が、KS-58-2Ddelであることを特
徴とする上記（１６）記載の形質転換体微生物。（１８）上記（１４）乃至上記（１７）のいずれか記
載の形質転換体微生物を培地に培養して、培養物から小
麦胚芽凝集素を採取することを特徴とする小麦胚芽凝集
素の製造法。

【０００７】以下、本発明を詳細に説明する。合成ＷＧ
Ａ遺伝子を用いて組換えＤＮＡ技術により、ＷＧＡを製
造する方法は、基本的には下記の工程よりなる。１）遺伝子の設計２）遺伝子の化学合成と適当な発現用ベクターへの遺伝
子の組み込み３）得られた組換えプラスミドによる適当な宿主の形質
転換と形質転換体の培養によるＷＧＡ蛋白質の産生およ
び回収ところで、一般に遺伝子工学の手法により有用蛋白質を
生産する際、細胞内に蓄積させた場合には、細胞を回収
し、これを破砕した後、ここから目的の蛋白質を分離・
精製する必要がある。しかし、細胞内には多量の夾雑蛋
白質が存在するため、分離・精製がきわめて困難とな
る。さらに、酵母細胞を使用する時には、酵母細胞が強
固な細胞壁をもっているため、細胞を効率よく破砕する
ことも必須となる。したがって、組換えＤＮＡ技術を利
用して蛋白質を生産させる際も、蛋白質を細胞外に分泌
させる方法がきわめて有効である。しかし、蛋白質が効
率よく分泌されるか否かは蛋白質の性状や特性に大きく
依存するため、その条件設定は個々の蛋白質ごとに実験
的に設定する必要がある。

【０００８】ＷＧＡ蛋白質は植物体中では細胞内の液胞
またはプロテインボディーといわれるオルガネラに局在
している［M. A. Mansfield et al., Planta, Vol. 17
3, p.482-489 (1988) ］。このプロテインボディーは液
胞が断片化した構造体と推定されることから、植物体内
でこの蛋白質は小胞体（ＥＲ）の膜上で生合成された
後、細胞内の分泌経路によりＥＲからゴルジ体まで輸送
され、その後液胞またはプロテインボディーに輸送され
るものと考えられている［N. V. Raikhel et al., Cur
r. Top. Plant. Biochem. Physiol., Vol. 7, p. 83-89
(1988)］。したがって、酵母細胞でＷＧＡ遺伝子を発
現させた場合も、通常は、植物細胞と同様、酵母の液胞
またはこれに相当するオルガネラに輸送されてしまうと
推定される。しかし、一方、酵母細胞では、本来液胞に
局在しているカルボキシペプチダーゼＹ（ＣＰＹ）蛋白
質で、この遺伝子を多コピープラスミド上で高発現させ
ると細胞外に分泌されることが報告されている［T. H.
Stevens et al., J. Biol. Chem., Vol. 102, p.1551-1
557 (1986)］。この理由は、ゴルジ体から液胞への輸送
選別に関与している細胞内成分の量に限度があり、ＣＰ
Ｙ蛋白質の生産量がこの限度をこえるとゴルジ体から液
胞への選別ができなくなり、分泌顆粒に輸送されて最終
的には細胞外に分泌してしまうためであると考えられて
いる［T. H. Stevens et al., J. Biol. Chem., Vol. 1
02, p.1551-1557 (1986)］。このため、本来液胞に輸送
されるＷＧＡ蛋白質についても、高発現プロモーターの
支配下で発現させるか、あるいはゴルジ体から液胞への
輸送選別に欠損変異をもつ酵母の変異株を使用すること
により、ＷＧＡ蛋白質を酵母の細胞外に分泌させること
が可能であろうと考えた。

【０００９】ＷＧＡ蛋白質には３〜４種類の同族体（ア
イソマー）が存在するが、このうち３種類（ＷＧＡI 、
II、III ）については、そのアミノ酸配列およびｃ−Ｄ
ＮＡの塩基配列が報告されている。このうち、ＷＧＡII
はＸ線結晶解析によりその立体構造が詳細に解析されて
いるうえ、ＷＧＡII蛋白質とオリゴ糖との複合体の立体
構造も解析されており、糖鎖との結合様式についても多
くの情報が蓄積されている。そこで酵母を宿主としてＷ
ＧＡ蛋白質の分泌発現を検討するための１具体例として
は、ＷＧＡII蛋白質について検討した。具体的には、報
告されているＷＧＡII蛋白質のアミノ酸配列をもとにし
て、しかしアミノ酸に対応するＤＮＡ上のコドンとし
て、小麦のコドンではなく、酵母の頻用コドンを用いて
ＷＧＡII遺伝子を設計・化学合成した。しかし、本発明
はこのＷＧＡII の製造法に限定されるものではなく、
ＷＧＡII遺伝子に公知の方法により部位特異的変異を導
入したＷＧＡI 遺伝子またはＷＧＡIII 遺伝子を作成
し、これを酵母で分泌発現する際にも、また上記の遺伝
子を酵母以外の他の適当な宿主細胞で分泌発現する際に
も適用されるべきものである。

【００１０】（１）遺伝子の設計ＷＧＡII遺伝子については、ｃ−ＤＮＡの塩基配列が報
告されており［Smithand Raikel, Plant Molecular Bio
logy, Vol.13, p.601-603 (1989) ］、それより以前に
報告されていたアミノ酸配列［（Wright and Olafsdott
ir, J. Biol. Chem, Vol.261, p.7191-7195 (1986)］に
は、３カ所で誤りがあったことが指摘されている（１０
９番目でSer からPhe に、１３４番目でGly からLys
に、そして１５０番目でGly からTrp に）。そこでＷＧ
ＡII遺伝子の設計には、ｃ−ＤＮＡ配列から推定される
アミノ酸配列を利用した。しかし、ＷＧＡII蛋白質から
決定されたアミノ酸配列とｃ−ＤＮＡから推定されたア
ミノ酸配列とはそれでもまだ３７番目で異なっており、
前者の方法ではAsp 、後者の方法ではAsn と報告されて
いる。蛋白質レベルでのアミノ酸配列の分析結果の解釈
としては、Asn からAsp への脱アミノ化が生体内でおこ
っている可能性もあるが、一般的には、アミノ酸配列分
析に適したペプチド断片を蛋白質から調製する際、ある
いはペプチド断片の分離・精製の操作の過程で脱アミノ
化したものと考えられる。したがって、本発明における
１具体例としては、成熟型ＷＧＡII蛋白質の３７番目ア
ミノ酸残基として、ｃ−ＤＮＡから推定されるAsn を採
用した。

【００１１】しかし、このアミノ酸配列に相当するＷＧ
ＡII遺伝子をデザインするにあたっては、遺伝子コドン
の縮重により複数のコドン選択が可能である。特に小麦
など植物で頻用されているコドン［Smith and Raikel,
Plant Molecular Biology, Vol.13, p.601-603 (1989)
］と酵母で頻用されるコドン［Bennetzen and Hall,J.
Biol. Chem., Vol. 257, p. 3026-3031 (1982) ］は必
ずしも一致していない。そこで、ＷＧＡII遺伝子の設計
にあたっては、i ）合成遺伝子の発現に適当と思われる
酵母において最も許容されるコドンを使用する。ii）遺
伝子中に特定の制限酵素認識部位を設けて、サブクロー
ニングしやすくする。iii ）同一鎖上または相補鎖上に
自己相補的あるいは正しい配列以外のものと相補的であ
るような配列を極力さける、などに配慮した。このよう
な諸条件を満足する１具体例としては、前記本発明の構
成（１）または（１０）に記載したものである。本発明
は第一に上記のＤＮＡ配列で示されるＷＧＡ発現のため
の合成遺伝子を有するＤＮＡに関するが、本発明ＤＮＡ
としては上記合成遺伝子の他、その５’末端に翻訳開始
コドンや分泌のためのシグナルペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列を連結したもの、あるいは、その３’末端に翻
訳停止コドンを連結したもの、あるいはこの両者を連結
したもの、そしてこれらの５’末端と３’末端にそれぞ
れ制限酵素切断部位をもつものを含み、発現のための便
宜や遺伝子組換え等の操作の便宜を図ることができる。
またこの他、これらＤＮＡを組み込んだプラスミドも本
発明に入るものである。

【００１２】小麦胚芽中では、ＷＧＡ蛋白質は成熟型Ｗ
ＧＡ蛋白質領域の他に、そのアミノ末端（Ｎ末端）に翻
訳開始に必要なMet を含めて２８アミノ酸残基からなる
プレペプチドをもっているほか、そのカルボキシル末端
（Ｃ末端）には１５アミノ酸残基からなる余計なプロペ
プチドをもっており、いわゆるプレプロ型の前駆体ＷＧ
Ａ蛋白質として生合成されることが、そのｃ−ＤＮＡ配
列の分析から推定されている［N. V. Raikhel and T.
A. Wilkins, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 84,
p. 6745-6749 (1987) および Smith and Raikel, Plant
Molecular Biology, Vol.13, p.601-603 (1989)］。

【００１３】したがって、この前駆体ＷＧＡ（プレプロ
ＷＧＡ）蛋白質に対応するＤＮＡ配列をそのまま用いて
タバコなどの植物細胞で発現させることも可能である
が、このままでは発現されたＷＧＡ蛋白質は液胞に輸送
されてしまう［T. A. Wilkinset al., The Plant Cell,
Vol. 2., p. 301-313 (1990)］。したがって、植物以
外の細胞などを利用して、しかも分泌発現を成功させる
何等かの方法を開発する必要がある。しかし、このＷＧ
Ａ本来の分泌シグナルは植物以外の細胞で正しく機能す
るかどうか疑問である。例えば、ヒト・インターフェロ
ンの酵母での分泌では、２３アミノ酸残基からなるヒト
由来の分泌シグナルはヘテロなシグナル切断点を示し、
酵母での機能としては不完全なものである［R. A. Hitz
eman et al., Science, Vol. 219, p. 620 (1983) ］。
一般に酵母の分泌シグナルの長さは１５〜２０アミノ酸
残基からなるものが多く、ＷＧＡのもつシグナルの長さ
（２８アミノ酸残基）はこれより長い。一方、酵母で異
種蛋白質の分泌に有効な分泌シグナルとしては、酵母本
来のものだけでなく、異種生物由来のシグナルや、疎水
性のLeu クラスターを含み１５アミノ酸からなる人工の
シグナルも、効率よく機能することが報告されている
［Y. Yamamoto et al., Biochem. Biophys. Res.Commu
n. Vol. 149, p. 431 (1987)］。したがって、酵母によ
るＷＧＡ蛋白質の分泌発現を検討する際にも、酵母で機
能する上記の種々の分泌シグナルが利用可能である。こ
の具体的な１例としては、上記の人工シグナルペプチド
をコードするＤＮＡ断片を化学合成して使用した結果を
後に実施例で示す。なお、このシグナルペプチド（以下
プレ領域という）に対応するＤＮＡを連結するＷＧＡ遺
伝子としては、Ｃ末端プロ領域を持たない成熟体型ＷＧ
Ａ遺伝子のほか、Ｃ末端プロ領域を持つ前駆体型ＷＧＡ
遺伝子も使用することができる。そこで、プレＷＧＡ遺
伝子（分泌シグナル＋成熟体型ＷＧＡをコードするＤＮ
Ａ領域）およびプレプロＷＧＡ遺伝子（分泌シグナル＋
前駆体型ＷＧＡをコードするＤＮＡ領域）を各々作成し
て、その発現について検討した。

【００１４】なお、これらのＷＧＡ遺伝子を含むＤＮＡ
を発現させる宿主細胞としては種々のものが使用可能で
あるが、酵母を宿主とする場合の１具体例は、酵母の解
糖系遺伝子の一つで発現効率の高いＥＮＯ１プロモータ
ーを利用するものである［K.Ichikawa et al., Agric.
Biol. Chem., Vol. 53, p. 1445-1447 (1989)］。一
方、酵母で異種蛋白質を分泌発現するための遺伝子とし
ては酵母のα- ファクターのプロモーターおよびプレプ
ロ領域がよく利用されている［例えばBrake et al., Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 81, p. 4642 (1984)
、Bitter et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.
81, p. 5330 (1984)など］。そこで本発明における他の
具体例としては、酵母のα- ファクター遺伝子のプロモ
ーターおよびプレプロ領域をもつＤＮＡ領域の下流に、
上記の成熟体型ＷＧＡ遺伝子またはＣ末端プロ領域をも
つ前駆体型ＷＧＡ遺伝子を連結した分泌発現用遺伝子を
作成したものを示す。しかし、これら種々の分泌発現用
遺伝子が酵母内で正しく発現し、培地中に分泌された組
換えＷＧＡ蛋白質が、小麦胚芽から単離されたＷＧＡII
蛋白質と同一のアミノ酸配列や糖鎖の結合活性をもつか
否かは容易に予測できない。また、成熟型ＷＧＡ蛋白質
のＣ末端領域をもつプロＷＧＡ蛋白質が酵母の分泌過程
で正しく切断されるか否かは興味深い点である。しか
し、後述の実施例でも明かなようにＷＧＡ前駆体蛋白質
は酵母によってシグナルペプチドだけでなく、Ｃ末端の
プロ領域も正しく切断され、小麦胚芽から単離されたＷ
ＧＡII蛋白質と同一の分子量をもつほか、糖鎖の結合比
活性も小麦胚芽由来のＷＧＡIIと同一であることが本発
明により明かとなった。

【００１５】（２）遺伝子の合成と発現用プラスミドの
構築上記のＷＧＡ遺伝子は例えば約１５〜４５個の核酸塩基
鎖長をもつ複数個のオリゴデオキシヌクレオチドを合成
し、それらを連結することによって製造することができ
る。例えば、配列番号３に示したような３２個のオリゴ
ヌクレオチド・フラグメントに分割して、たとえば［Mu
raki et al, Agric. Biol. Chem., Vol.50, p. 713-723
(1986)］にしたがって合成することができるし、オリ
ゴヌクレオチド・フラグメントは既知の方法でハイブリ
ダイズさせ、酵素的に連結することができる［例えばAg
arwal et al, Nature, Vol.227, p.27-34 (1970) ］。
なお、このフラグメントへの分割法は上記のものに限定
される必要はなく、前記の自己会合が回避できることな
どに留意すれば、種々の分割が可能である。次の段階と
しては、このようにして得られた合成遺伝子またはその
断片を量的に増やすために、まず適当なベクターに組み
込みサブクローニングすることであるが、以下では、そ
の１具体例として、成熟体型ＷＧＡ遺伝子と前駆体型Ｗ
ＧＡ遺伝子に分けて上記のステップを詳しく説明する。

【００１６】２−１成熟体型ＷＧＡ遺伝子の合成とク
ローニング１７１個のアミノ酸からなる成熟型ＷＧＡ蛋白質はアミ
ノ酸配列の解析や立体構造の解析結果などから、空間的
にはっきりした４個のドメイン（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ）から
成り、それぞれのドメインはお互いにきわめて相同性の
高い配列をもつ４１個の長さのアミノ酸で構成されるこ
とがわかっている［C. S. Wright, J. Mol. Biol., Vo
l. 194, p. 501-529 (1987)］。したがって、遺伝子の
設計および合成にあたっては、ヌクレオチドフラグメン
トが正しい配列以外のものとハイブリダイズするのをさ
けるため、ＷＧＡ遺伝子の前半部分については、オリゴ
ヌクレオチド・ブロックが上記のドメインＡおよびＢと
一致するように分割した。しかし、この分割法ではブロ
ックのＤＮＡ断片を組み上げる際、酵素的に連結するス
テップが多くなり、結果的に連結反応の最終産物の収率
が低下して、その後のサブクローニングに成功する頻度
が低下することが判明した。そこで、ＷＧＡ遺伝子の後
半部分については、上記のドメインＣおよびＤに相当す
るＤＮＡをまとめて１つのブロックとしてＤＮＡ断片の
組み上げを行った。なお、ドメインＡに相当するＡブロ
ックについては、７番目（Gly ）と８番目（Ser ）にま
たがる部位に制限酵素BamHI 部位を設け、このサイトか
ら下流をとりあえず作成し、これよりＮ末端側について
は、後述の分泌シグナルを作成するときに同時に作成
し、BamHI 部位で翻訳解読枠が一致するように設計し
た。

【００１７】上記のように設計した遺伝子を合成するに
は、＋，−両鎖のそれぞれについて、これらをいくつか
のフラグメントに分けて、それらを化学的に合成し、各
々のフラグメントを連結する方法によれば良い。各鎖は
１５〜４５塩基からなり各々が少なくとも６塩基ずつ重
なる様に３２個程度のフラグメントに分けるのが好まし
い。以上の操作の概要は図１に要約して示した。ドメイ
ンＡに相当するＡブロックの組み上げについては図１Ａ
に示したが、このＡドメインの最終的な酵素的連結産物
は制限酵素SpeIで消化後、サブクローニング用のベクタ
ーであるPhagescript のBamHI-XbaI断片と連結してクロ
ーニングした。このクローン化ＤＮＡからBamHI,SacI二
重消化によりＷＧＡ遺伝子断片を含むＤＮＡを回収した
のち、これをさらに制限酵素MaeIで消化して得たBamHI-
MaeI断片を、ＢブロックおよびＣ＋Ｄブロックとの連結
用ＤＮＡ断片とした。また、ドメインＢに相当するＢブ
ロックについても、同様に、最終的な酵素的連結産物を
制限酵素SpeI,ApaI で二重消化後、Bluscript KS(+) の
SpeI-ApaI 部位にサブクローニングした。このクローン
化ＤＮＡからApaI,SacI 消化によりＷＧＡ遺伝子断片を
含むＤＮＡを回収したのち、これをさらに制限酵素MaeI
で消化して得たMaeI-ApaI 断片を各ブロック間の連結用
ＤＮＡ断片とした（図１Ｂ参照）。

【００１８】一方、ドメインＣとＤに相当するＣ＋Ｄブ
ロックについては、上述のようにオリゴヌクレオチドフ
ラグメントの鎖長をＡやＢドメインに相当するブロック
の場合の２〜３倍としたため、酵素的連結の回数は上記
のＡまたはＢブロックを作成するときと殆ど同じである
にも拘らず、最終連結産物の鎖長はＣ＋Ｄに相当する約
２倍の長さになっている。このＣ＋Ｄブロックはその
５’末端および３’末端にそれぞれApaI部位、Hind III
部位をもつため、Phagescript のApaI-Hind III部位に
サブクローニングしたのち、これをApaI,Hind III で消
化してＷＧＡ遺伝子断片を含むＤＮＡを回収して各ブロ
ック間の連結用ＤＮＡ断片とした（図１Ｃ参照）。

【００１９】最後に、上記で調製したＡ、Ｂ、Ｃ＋Ｄの
各ＤＮＡ断片を図１Ｄに示した順序で連結し、これをプ
ラスミドベクターpUC18 のBamHI-Hind III部位にクロー
ン化した。この様にして作成した成熟型ＷＧＡ遺伝子の
塩基配列が設計通りのものであることは、このＤＮＡ断
片の＋鎖、ー鎖の両鎖の全領域について、公知のＤＮＡ
塩基配列決定法［例えば、F. Sanger et al., Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA,Vol. 74, p. 5463 (1977)によるdi
deoxy nucleotide法］により塩基配列を分析して、確認
した。

【００２０】２−２分泌シグナルをもつＷＧＡ（プレ
ＷＧＡ）遺伝子の合成と発現用ベクターへの導入前述の様に、ＷＧＡ蛋白質は小麦中では成熟型ＷＧＡの
Ｎ−末端およびＣ−末端にそれぞれ分泌シグナルあるい
は１５アミノ酸からなる余分なペプチド（ＣＴ）をもっ
たプレプロ体として合成される。このうち、分泌シグナ
ルは蛋白質が生合成されるとともにＥＲ内腔に運ばれ、
その後、分泌経路を経て細胞外に輸送されるために必須
の機能をもっている。したがって、酵母でＷＧＡ蛋白質
を分泌発現させる際にもこの分泌シグナルを成熟型ＷＧ
ＡのＮ−末端側に付加する必要がある。分泌シグナルと
しては、勿論、インベルターゼや酸性フォスファターゼ
など酵母本来のシグナルも利用できるし、ニワトリ・リ
ゾチームのシグナルといった酵母以外（異種）のシグナ
ルも使用できる。また、分泌シグナルの構造とＥＲ膜の
透過性との解析結果から提案されている疎水性のアミノ
酸クラスターをもつ人工分泌シグナル［Y. Yamamoto et
al., Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol. 149, p.
431 (1987)］も使用できる。ここでは、これらの１具体
例として上記の人工分泌シグナルを使用したものについ
て以下に説明するが、本発明はこれに限定されるもので
はない。

【００２１】人工分泌シグナルに相当するＤＮＡの塩基
配列およびこれを分割したオリゴヌクレオチド断片の構
成を配列番号３の配列の最上部に示した。なお、この配
列で、シグナルに相当する部分（-15 〜-1のアミノ酸残
基に相当する部分）の５’側の塩基配列は酵母のＥＮＯ
１遺伝子の転写開始点から翻訳開始点までの配列と同一
であり、かつ、この５’末端には制限酵素SalI部位を、
また、この３’側には成熟型ＷＧＡ蛋白質のＮ末端側７
〜８アミノ酸に相当する領域を含み、かつその末端には
制限酵素BamHI部位をもっている（配列番号３の配列のS
1〜S4に相当する領域を参照）。なお、これらのオリゴ
ヌクレオチド断片の化学合成と酵素的連結は公知の方法
によって行った。一方、上記２ー１項でクローン化した
ＷＧＡ遺伝子は、成熟型ＷＧＡのＮ末端側７〜８アミノ
酸を欠失しており、その５’末端にBamHI 部位を、また
その３’末端には１７１番目のアミノ酸および２ケの翻
訳終止コドンの後にHindIII 部位をもっている。そこで
シグナル部分とＷＧＡ遺伝子部分の両者をBamHI 部位で
連結した後、プラスミドベクターpNJ1053 ［このプラス
ミドベクターはプラスミドpESH(K.Ichikawa et al.,Agr
i. Biol. Chem. Vol.53, p.1445 〜1447(1989)) のHLY
遺伝子部分をプラスミドpBR322のSalI-HindIII断片と置
き換えたもの］のSalI-HindIII部位にクローン化した
（図２Ａ）。なお、このプラスミドベクターpNJ1053 の
SalI部位は酵母のENOIプロモーターの転写開始点の３’
側に存在するため、この部位に翻訳開始コドンATG から
始まる遺伝子を挿入すれば、その転写と翻訳が効率的に
おこることが確認されている［K. Ichikawa et al., Ag
ric. Biol. Chem., Vol. 53, p.1445-1447 (1989) ］。
このプラスミドをｐＳＷ（SIGNAL-WGAの略）と命名した
（図２Ａ参照）。なお、このようにして作成したシグナ
ルをもつプレＷＧＡ遺伝子のシグナル配列および連結部
分の塩基配列が設計通りであることは、前述のように、
公知の塩基配列決定法により、確認した。

【００２２】２−３分泌シグナルをもつ前駆体型ＷＧ
Ａ（プレプロＷＧＡ）遺伝子の合成と発現用ベクターへ
の導入次に、上記の分泌シグナルを持つ成熟型ＷＧＡ遺伝子の
３’末端に小麦胚芽で確認されている１５アミノ酸残基
からなるＣ末端の延長ペプチドを付加したプレプロＷＧ
Ａ遺伝子を合成した。このＣ末端プロ領域（ＣＴペプチ
ド）の小麦胚芽中での機能は不明であるが、ＷＧＡ蛋白
質が適切な立体構造に組み上がるために必要であるかも
知れないし、また分泌経路を効率よく輸送されるのに必
要なのかも知れない。いずれにしてもこのＷＧＡ蛋白質
前駆体が酵母細胞内で分泌効率の向上に機能するかどう
か、また、このＷＧＡ前駆体が酵母で正しく認識されて
成熟型ＷＧＡに変換されるか否かは興味深い点である。

【００２３】配列番号４には設計したＣＴペプチドをコ
ードするＤＮＡの塩基配列と合成オリゴヌクレオチド断
片の構成を示した。この領域の５’末端は制限酵素SmaI
/AvaI 部位をもっており、成熟型ＷＧＡ遺伝子をAvaI切
断したものと連結できるように設計してある。ＣＴ１〜
ＣＴ４で示した４つの断片を前述の方法によりハイブリ
ダイズさせたのち、酵素的に連結した。この連結生成物
はその５’末端にAvaI部位を、またその３’末端にはHi
nd III部位をもっているため、先にクローン化したプラ
スミドp ＳＷ上のＷＧＡ遺伝子を含むSalI-AvaI 断片と
AvaI部位で連結した後、これをM13mp19 ベクターのSalI
-Hind III 部位に挿入した。このクローン化ＤＮＡ断片
でシグナルを含む成熟型ＷＧＡ遺伝子とＣＴ部分とが正
しく連結していることはその塩基配列を上記の公知の方
法により調べることにより、確認した。このようにして
作成した上記のSalI-Hind III 断片は分泌シグナルをも
つ成熟型ＷＧＡ遺伝子の３’末端にＣＴに相当するＤＮ
Ａが連結したプレプロＷＧＡ遺伝子の構造をもつもので
ある。この遺伝子を発現させるためのプラスミドとして
は上記のSalI-Hind III 断片を酵母ＥＮＯ１プロモータ
ーをもつプラスミドpNJ1053 のSalI-Hind III 部位に挿
入することにより作成した（図２Ａ参照）。このプラス
ミドはｐＳＷＣ（SIGNAL-WGA-CT の略）と命名した。一
方、酵母のα- ファクター遺伝子のプロモーターとプレ
プロ領域を利用する分泌発現プラスミド〔pPW(pMFα-pr
epro-WGAの略),pPWC(pMFα-prepro-WGA-CTの略) 〕の構
築法については、図２Ｂに詳しくその手順を示した。な
お、この構築法の詳細については、実施例７を参照され
たい。

【００２４】（３）形質転換と酵母によるＷＧＡ蛋白質
の分泌生産前項で記述した合成ＤＮＡ断片の「クローン化」は、実
際には得られた合成遺伝子を含むベクターを大腸菌など
の宿主を形質転換することにより達成される。形質転換
の方法それ自体は公知であり、宿主として大腸菌を用い
る場合は、例えばCohen らの方法［S.N. Cohen et. a
l., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.69, p.2110 (19
72) ］により、又、宿主として酵母を用いる場合は、例
えば、Hinnenらの方法［A. Hinnen et. al., Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, Vol. 75, p.1927 (1978) ］やIto
らの方法［Ito et. al., J. Bacteriol., Vol. 153, p.
163-168 (1983) ］によって、形質転換が可能である。
宿主としては、大腸菌では例えば、E. coli C600 ［Ne
lsonら、Virology, Vol. 108, p.338-350 (1981)］であ
り、酵母での１具体例は、S. cerevisiae KK4 ［Nogi e
t. al., Mol. Gen. Genet., Vol. 195, p.29-34 (198
4)］やヒト・リゾチームを多量菌体外に分泌するssl1変
異をもつS. cerevisiae であるKS-58-2D ［Suzuki et.
al., Vol. 219, p.58-64 (1989)］である。なお、ヒト
・リゾチームを高分泌する酵母変異株の取得法とそれを
用いたヒト・リゾチームの製造法については、前述の文
献のほか、本発明者の一部等により、特開昭64-47377号
公報にもその詳細が開示されている。また、ＷＧＡ遺伝
子を組み込んだ組換えプラスミドによる形質転換は上記
の宿主に限定されるものではなく、公知の種々のS. cer
evisiae 誘導体（例えば、Yeast Genetic Stock Cent
er カタログ参照）を使用することができる。これらの
ものはYeast Genetic Stock Center および公認の微生
物機関、例えば American Type Culture Collection
に寄託されておりそこから分譲が可能である。

【００２５】なお、発現の宿主としては、酵母だけでな
く、カビなどの微生物がひろく利用できるほか、動物細
胞や昆虫細胞およびこれらで増殖複製するウィルスなど
を利用することもできる。また、発現用のベクターとし
ては各々の宿主に適した発現用プロモーターの下流に、
プレＷＧＡ遺伝子またはプレプロＷＧＡ遺伝子を挿入す
るためのSalI切断部位を有するプラスミドが望ましい。
酵母における形質転換体の１具体例は、野生型S.cerevi
siae KK4 または ssl1変異をもつKS-58-2Ddelを上記の
プラスミドｐＳＷまたはｐＳＷＣで形質転換させて得た
形質転換体、または同じ酵母をプラスミドpPW または p
PWC で形質転換した形質転換体であって、本発明ではこ
れをそれぞれ、S. cerevisiae KK4 (pSW) または KS-58
-2Ddel (pSW) 、S. cerevisiae KK4 (pSWC) または KS
-58-2Ddel (pSWC) 、S. cerevisiae KK4 (pPW) または
KS-58-2Ddel(pPW)、S. cerevisiae KK4 (pPWC) または
KS-58-2Ddel(pPWC) と命名した。

【００２６】このようにして得た形質転換体を分子生物
学および発酵学の分野で公知の常法にしたがって培養す
ればＷＧＡ蛋白質が分泌生産される。酵母を使用する場
合の培地としては、例えばBurkholder最少培地［Proc.
Natl. Acad. Sci., USA, Vol.77, p.4505 (1980)］が挙
げられる。培養は通常２０℃〜４０℃，好ましくは２５
℃〜３７℃で、２４〜１４４時間、好ましくは３６〜１
２０時間行い、必要に応じて通気や攪拌を行ったり、炭
素源を逐次添加して補給することもできる。培養終了
後、それ自体は公知の方法で菌体と上清とを分離する。
このようにして菌体内あるいは菌体外に産生されたＷＧ
Ａ蛋白質は通常の蛋白質精製法、例えば、塩析、等電点
沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル瀘過クロマ
トグラフィー、高速クロマトグラフィー（HPLC、FPLC）
などにしたがって精製でき、目的のＷＧＡ蛋白質を得る
ことができる。またこのようにして得たＷＧＡ蛋白質の
生物活性、例えば糖鎖の特異的な結合活性はＷＧＡが特
異的に結合することが公知であるＮ−アセチルグルコサ
ミンを含む糖蛋白質に対する結合活性を調べることによ
り確認することができる。具体的には、例えばオボアル
ブミン蛋白質をマイクロタイタープレート上に吸着さ
せ、これに結合するＷＧＡ蛋白質を市販の抗ＷＧＡ抗体
を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡ法［渋谷直人、バイ
オサイエンスとインダストリー、４７巻、p. 1301-1302
(1989) ］により検出することができる。また、ＷＧＡ
が細胞凝集活性をもつことはヒトまたはウマの赤血球が
ＷＧＡ蛋白質の存在下で凝集することを肉眼で観察する
ことにより確認することができる。以下、実施例により
本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限
定されるものではない。

【００２７】

【発明の効果】本発明において、ＷＧＡの生産に遺伝子
工学的手法を採用することにより純度の高いＷＧＡを安
定にかつ多量に製造することができた。

【００２８】

【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。ただし、これら実施例により本発明の技術的範囲を
限定するものではない。なお、以下で使用する試薬のう
ち制限酵素については宝酒造社製または東洋紡績社製の
ものを用いた。

【００２９】実施例１オリゴヌクレオチドの合成：Ｓ
１〜Ｓ４、１〜３２、およびＣＴ１〜ＣＴ４に相当する
各々のオリゴヌクレオチドフラグメントは、固相合成法
により、Applied Biosystems社製のＤＮＡ合成機（mode
l 391 ）を用いて合成した。ホスホアミダイト試薬等の
合成用試薬はすべてApplied Biosystems社製のものを用
い、付属のオペレーターズマニュアルにしたがって使用
した。合成したオリゴヌクレオチドは、核酸塩基と５’
水酸基が保護され、リン酸保護基が脱保護された状態で
シリカゲル担体から切り出し、回収した。これらの保護
デオキシオリゴヌクレオチド 1mlに、28％アンモニア水
3mlを加え、密栓容器中、６０℃、８〜１６時間処理す
ることにより、５’末端のジメトキシトリチル基以外は
すべて脱保護されたオリゴヌクレオチドを得た。溶液中
のアンモニアをＮ₂ガスを吹き付けて除去した後、Mille
x-GS フィルター（ポアサイズ 0.22μｍ、Millipore社
製）により瀘過し、C18逆相カラム（Cosmosil 5 C18,
（株）半井化学製）を用いて高速液体クロマトグラフ
ィーにより分離・精製し、最も遅く溶出される画分を回
収した。この画分を 2mlに濃縮し、等量の酢酸を加え
て、３０分間放置し、ジメトキシトリチル基を除去し
た。酢酸をエーテルによって抽出した後、上記の方法に
よりC18 逆相クロマトグラフィーで精製し、 4〜13 Ｏ
Ｄ260 単位の完全に脱保護されたオリゴヌクレオチド約
148 〜481 μg を得た。

【００３０】実施例２オリゴヌクレオチドのハイブリ
ッド形成とその酵素的連結：成熟体ＷＧＡII遺伝子２本
鎖のＡ、Ｂ、Ｃ＋Ｄブロックを作成するための酵素的連
結法の概略は図１Ａ〜図１Ｃに示してある。ここでは、
その詳細を記載する。５’末端が制限酵素サイトとなっ
ているNo.1, 18, 19, 32を除き、オリゴヌクレオチド各
40μgを全液量が100 μl で、しかも50mM Tris-HCl (p
H 7.5), 10mMMgCl2, 15 mM DTT, 0.4mM Na2EDTA, 1mM A
TPの組成となるように調製し、Ｔ4ポリヌクレオチドキ
ナーゼ (EC 2.7.1.78)(16 unit/ μl, 1μl)を加え、３
７℃で、１時間インキュベートした。反応液を飽和フェ
ノールで洗い、3M 酢酸ナトリウム（pH 5.2）とエタノ
ールを加え、−８０℃で１０分間保ち、オリゴマーを沈
澱させ、20mM Tris-HCl (pH7.5), 10mM MgCl2 を含む10
0 μl の緩衝液を加えた。５’- 位をリン酸化したｎ番
目とｎ＋1 番目（ｎ：奇数）のオリゴマーを等モル混合
し、６５℃で１０分間、３７℃で２０分間、インキュベ
ートした後、室温で１０分間放置してアニーリングし、
２本鎖を形成させた。図１Ａ〜図１Ｃの連結スキームに
したがって、隣接する２本鎖を混合し、全液量が60μl
で、しかも20mM Tris-HCl (pH7.5), 10mM MgCl2, 1mM
ATP, 10mM DTT になるように調製し、Ｔ4 ＤＮＡリガー
ゼ (EC 6.5.1.1)( 5 unit/μl, 2μl)を加え、２０℃で
３０分間インキュベートして連結した。各連結段階で
は、反応液の一部分をアクリルアミドゲル電気泳動に付
し、反応の完結と副反応の有無を確認した。Ｃ＋Ｄブロ
ックについては、最終の連結段階で副反応による多数の
バンドが認められたため、８％ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動を行い、目的とするバンドを含むゲルを切り
出し、ゲルを細片化したのち、遠心限外瀘過（Millipor
e 社製、ウルトラフリーC3HV）にて溶出した。

【００３１】最終ステップの反応を終えたＡブロック断
片とゲルから溶出回収したＣ＋Ｄブロック断片は、フェ
ノールで洗い、3M 酢酸ナトリウム（pH 5.2 ）とエタ
ノールを加え、ー８０℃で１０分間保ち、沈澱させた
後、前述と同様にしてＴ4 ＤＮＡキナーゼで５’末端を
リン酸化した。サブクローニングのために、Ａブロック
とＢブロックの末端部分は、制限酵素SpeIおよびApaIで
切り落とし、粘着末端を露出させた。具体的には、Ｂブ
ロックについてはＤＮＡ断片2.18 μgを、10mM Tris-HC
l(pH 7.5), 10mM MgCl2, 1 mM DTT および18単位のApaI
を含む300 μl の反応液中で３７℃で、１時間反応させ
た後、26.1μl の1 M NaCl と 2μl の SpeI (10 unit
/ μl)を加え、再び、３７℃で１時間反応させた。ま
た、Ａブロックについては、ＤＮＡ断片 3μg を、10 m
M Tris-HCl(pH7.5), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM D
TT および10単位のSpeIを含む 50 μl の反応液中で、
３７℃、１時間反応させた。このようにして制限酵素処
理をしたＡブロックとＢブロックは、フェノールで洗っ
た後、エタノール沈澱を行った。

【００３２】実施例３各ブロック断片のサブクローニ
ングファージスクリプト（Phagescript ）SK(STRATAGENE 社
製; 東洋紡：Code No.SC221201) 10μg に50ユニットの
ApaIを加え、50μl の反応液 (10mM Tris-HCl(pH7.5),
10 mM MgCl2, 1mM DTT)中で３７℃、１時間作用させた
後、6.95 μlの1M KCl と 5μl の Hind III (10 unit/
μl)を加え、さらに１時間反応させた。フェノールで
除蛋白、冷エタノールで沈澱させた後、0.7% アガロー
スゲル電気泳動を行い、目的のバンドを含むゲル部分を
切り出して、透析チューブ内に封入し、泳動用緩衝液内
に沈め、電気的に溶出した。これを、フェノールで処理
し、冷エタノールで沈澱させた。該ＤＮＡに実施例２で
調製したＣ＋ＤブロックＤＮＡ断片 19.2 μg を混合
し、100 μl の連結反応液（20 mM Tris-HCl (pH7.
5), 10 mM MgCl2, 1 mM DTT,1 mM ATP,Ｔ4 ＤＮＡリガ
ーゼ、12.5ユニット）中、１６℃、１時間反応させて、
ＤＮＡを連結した。このうち、半量を用い、大腸菌XL1-
Blue株(STRATAGENE 社製; 東洋紡：Code No.SC212301)
にCohen らの方法（S. N. Cohen et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, Vol. 69, p. 2110 (1972))にしたがっ
て、形質転換した。プレート上の指標大腸菌のプラーク
が、ＤＮＡ断片の挿入のないものではX-Gal の分解によ
り青色を呈するのに対し、ＤＮＡ断片の挿入のあるもの
では無色になることを利用して目的の形質転換体を選択
し、この形質転換体の中から、アルカリ抽出法（H. C.
Birnboim and J. Doly, Nucl. Acids Res., Vol. 7, p.
1513 (1979)）によってプラスミドを単離し、分子量お
よび制限酵素による分解パターンを調べ、ファージスク
リプトSK のApaI-Hind III 部位にＣ＋Ｄブロックの挿
入されたプラスミドを得た（図１Ｃ）。

【００３３】同様の方法によって、ＡブロックとＢブロ
ックのＤＮＡ断片は、ファージスクリプトSKのBamHI-Xb
aI部位、ブルースクリプト（Bluscript ）KS(+)(STRATA
GENE社製; 東洋紡：Code No.SC212207) のSpeI-ApaI 部
位に各々挿入した。ＡブロックＤＮＡ断片は両端にBamH
I サイトとSpeIサイトを持つことから、最初はファージ
スクリプトSKのマルチクローニングサイトのBamHI-SpeI
部位に導入することを試みたが、成功しなかった。BamH
I とSpeI部位が隣接しているため、BamHI とSpeIの両制
限酵素で切断されなかったためと思われる。そこで、Sp
eI部位と同一の粘着末端をもつXbaI部位を用いて、BamH
I-XbaI部位に挿入した（図１Ａ、図１Ｂ参照）。各ブロ
ックＤＮＡ断片の塩基配列は、既知のデオキシヌクレオ
チド法 (F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA, Vol. 74, p.5463 (1977)) によるＤＮＡ塩基配列を
両ストランドの全域について分析することにより、設計
通りであることを確認した。

【００３４】実施例４ＷＧＡ遺伝子のサブクローニン
グ：Ｃ＋ＤブロックＤＮＡ断片を導入したファージスク
リプトSK 500μg を、500unitの制限酵素ApaIを含む反
応液 (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl2, 1mM DT
T) 1.2ml 中、３７℃、２時間反応させた後、86.1μl
の 1 M KCl と 38.5 μl の Hind III(10 unit/μl)
を加え、さらに３７℃、一夜反応させた。フェノールに
よる除蛋白、エタノール沈澱の後、８％ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行い、0.27 Kb のＣ＋ＤブロックＤ
ＮＡ断片を回収した。ＡブロックＤＮＡ断片に関して
は、基本的にはＣ＋Ｄブロックと同様であるが、この断
片がファージスクリプトSK のBamHI-XbaI部位に導入さ
れていることから、マルチクローニングサイトのXbaI部
位の外側にあるSacI部位を用いて、一担、Ａブロックの
ＤＮＡ断片を含むBamHI-SacIによる２重消化によって、
ＤＮＡ断片を切り出した。そしてこの断片をさらに、Sp
eIにより生じる４baseの粘着末端部分と同じ塩基配列を
認識するMaeIにより消化し、BamHI とMaeI部位の両末端
をもつＡブロックＤＮＡ断片を得た。ＢブロックＤＮＡ
断片に関しても、ＡブロックＤＮＡ断片と連結するため
に、末端に同じMaeIの切り口をもつ必要があることか
ら、ＢブロックＤＮＡ断片を導入したBluescript KS(+)
から、一度、SacI-ApaI による２重消化を行ったのち、
これをさらにMaeIで消化することにより、MaeIとApaIの
両末端をもつＢブロックＤＮＡ断片を得た。

【００３５】このようにして調製したＡブロック、Ｂブ
ロック、Ｃ＋Ｄブロックの各ＤＮＡ断片は図１Ｄのよう
にして連結した。ＢブロックとＣ＋ＤブロックＤＮＡ断
片を混合し、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼを含む実施例２に記載
した反応液 350μl 中で、１６℃、一夜反応させた。フ
ェノール処理、エタノール沈澱の後、MaeI 30 unitを含
む反応液 (20 mM Tris-HCl (pH8.0), 250 mM NaCl, 6
mM MgCl2, 7 mM β- メルカプトエタノール, 100 μg/
mlBSA) 150 μl 中、４５℃、１時間反応させた後、８
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、0.39 kb の
Ｂ＋（Ｃ＋Ｄ）ブロックＤＮＡ断片を回収した。次に、
ＡブロックＤＮＡ断片とＢ＋（Ｃ＋Ｄ）ブロックＤＮＡ
断片とを混合し、上記と同様の方法で連結反応を行い B
amH III とHind IIIによる二重消化をした後、フェノー
ル処理、エタノール沈澱を行い、Ａ＋Ｂ＋（Ｃ＋Ｄ）ブ
ロックＤＮＡ断片、即ち、成熟体型ＷＧＡ遺伝子を作成
した。一方、pUC18 プラスミド（東洋紡：Code No.PU
C-018) 10 μg を、30 unit のHind IIIを含む反応液
(10mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl2, 1 mm DTT, 65
mM KCl) 100μl 中、３７℃、一夜反応させ、0.7%アガ
ロースゲル電気泳動により、線状化したプラスミドＤＮ
Ａを回収した。この 5μg と上記、成熟体型ＷＧＡ遺伝
子（Ａ＋Ｂ＋（Ｃ＋Ｄ））45μg とを混ぜ、上記と同様
の方法にて連結反応を行った。該ＤＮＡを用い、大腸菌
JM109 株（東洋紡：Code No.DNA-900)にCohen らの方法
にしたがって形質転換した。アンピシリン耐性を指標に
して選択した形質転換体の中から、アルカリ抽出法によ
ってプラスミドＤＮＡを単離し、その分子量および制限
酵素による分解パターンを調べることにより、成熟体型
ＷＧＡ遺伝子の導入されたプラスミドを取得した。

【００３６】実施例５成熟体型ＷＧＡ遺伝子分泌発現
用プラスミドの構築：図２Ａに構築の概略を示した。具
体的には以下に記す。酵母を用いた異種蛋白質の分泌発
現用に改良した人工シグナル配列（Y. Yamamoto et a
l., Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol. 149, p.431
(1987) ）をコードするオリゴヌクレオチドＳ１〜Ｓ４
を実施例１に記載した方法にしたがって合成した。これ
らのフラグメントは、実施例２に記載した方法にしたが
って、Ｓ２とＳ３をリン酸化し、アニーニングと連結を
行った後、再び、末端をリン酸化した。一方、実施例４
で作成した成熟体型ＷＧＡ遺伝子を挿入したpUC18 プラ
スミド200μg を、同じく実施例４で記載した場合と同
様、制限酵素BamHI とHind IIIの２重消化を行った後、
８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、0.5 kbの
成熟体型ＷＧＡ遺伝子断片を回収した。シグナル部分
（Ｓ１〜Ｓ４）のＤＮＡ断片と成熟体型ＷＧＡ遺伝子断
片とを等モル混合し、実施例１に記載した方法にしたが
って、連結した。フェノール処理、エタノール沈澱の
後、40 unitの Hind III を含む反応液（65 mM KCl, 10
mMTri s-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl2, 1 mM DTT ） 10
0μl 中、３７℃、１時間反応させ、さらに、9 μl 1M
KCl, 8 μl dH20, 3 μl SalI (15 unit/μl) を加
え、３７℃、１時間反応させ、再びフェノール処理、エ
タノール沈澱を行い、分泌シグナルを連結したＷＧＡ遺
伝子（SIG-WGA ）６μg を得た。

【００３７】一方、プラスミド pNJ1053を上記と同様、
制限酵素 Hind III と SalI で２重消化し、反応物を0.
7%アガロースゲル電気泳動によって分離し、8.6 kbのＤ
ＮＡ断片を回収した。このプラスミドＤＮＡ 0.04 μg
と上記SIG-WGA 遺伝子の半量とを混合し、実施例３に記
載した方法にしたがって、連結反応を行った。これを、
大腸菌XL1-Blue株にCohen らの方法にしたがって、形質
転換した。アンピシリン耐性を指標として選択した形質
転換体の中から、アルカリ抽出法によってプラスミドを
単離し、分子量および制限酵素による分解パターン調べ
ることにより、pNJ1053 の酵母ＥＮＯ１プロモーター下
流の SalI-Hind III部位に、SIG-WGA 遺伝子が挿入され
た、酵母での成熟体型ＷＧＡ遺伝子分泌発現プラスミド
ｐＳＷ 1,145mgを得た。

【００３８】実施例６前駆体ＷＧＡ蛋白質遺伝子分泌
発現用プラスミドの構築：構築の概略は図２Ａの後半部
分に示した。ＣＴペプチドをコードしたオリゴヌクレオ
チドＣＴ１〜ＣＴ４を、実施例１に記載した方法にした
がって合成した。つぎに、実施例２に記載した方法にし
たがって、ＣＴ２とＣＴ３をリン酸化し、ＣＴ１とＣＴ
２およびＣＴ３とＣＴ４をアニーリング、連結したの
ち、再び末端のリン酸化を行い、ＣＴペプチドをコード
するブロックＤＮＡ断片を得た。一方、実施例５で作成
したｐＳＷプラスミド 330μg を、実施例５に記載した
方法にしたがって、制限酵素SalIとHind IIIで２重消化
し、８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、0.58
Kb の SIG-WGA 遺伝子断片を回収した。このSIG-WGA
遺伝子断片 18 μg を、20 unit の制限酵素AvaIを含む
反応液 (10 mM Tris-HCl(pH 7.5), 10 mM MgCl2, 1 mM
DTT, 25 mM NaCl) 100 μl 中、３７℃、２時間反応さ
せた後、８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、
0.53 Kb のＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片 6.4
μg と上記ＣＴペプチドをコードするＤＮＡ断片 1.6μ
g を混合し、実施例２に記載した方法により連結した
後、前述と同様、制限酵素SalIとHind IIIで２重消化し
た。５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、分泌
シグナルとＣＴペプチドを有する0.63 Kb のＷＧＡ遺伝
子（SIG-WGA-CT遺伝子）断片2.1 μg を回収した。次
に、プラスミドM13mp19 （東洋紡： Code No.M13-019）
20μg を、前述と同様、制限酵素SalIとHind IIIで２重
消化後、0.8 ％アガロースゲル電気泳動を行い、7.5 kb
のプラスミドＤＮＡ断片を回収した。このプラスミド
ＤＮＡ 0.4μg と上記SIG-WGA-CT遺伝子断片 2μg を混
合し、実施例２に記載した方法にしたがって連結した。
これを大腸菌 XL1 - Blue 株にCohen らの方法により形
質転換した。実施例３に記載した様に X-galの分解によ
る青色を呈せず、ＤＮＡ断片の挿入により無色となった
ファージの中から、アルカリ抽出法によってプラスミド
を単離し、分子量および制限酵素による分解パターンを
調べ、M13mp19 の SalI-Hind III部位に SIG-WGA-CT 遺
伝子断片が導入されたプラスミドを得た。このファー
ジから、ssDNA を回収し、既知の dideoxynucleotide
法によるＤＮＡ塩基配列によって、SIG-WGA-CT 遺伝子
の塩基配列が設計通りであることを確認した。

【００３９】さらに、上記 SIG-WGA-CT 遺伝子を導入し
た M13mp19から、前述と同様、制限酵素SalIと Hind II
I で２重消化した後、５％ポリアクリルアミドゲル電気
泳動を行い、0.63 kb のSIG-WGA-CT遺伝子断片を回収し
た。このＤＮＡ断片と実施例５で調製したSalI-Hind II
I 部位を欠失したpNJ1053 とを実施例５に記載した方法
で連結した。これを大腸菌 XL1-Blue 株にCohen らの方
法にしたがって形質転換し、アンピシリン耐性を指標と
して選択した形質転換体の中から、アルカリ抽出法によ
ってプラスミドを単離し、分子量および制限酵素による
分解パターンを調べ、pNJ1053 の酵母ＥＮＯ１プロモー
ター下流の SalI-Hind III部位に SIG-WGA-CT 遺伝子の
挿入された、前駆体ＷＧＡ蛋白質分泌発現用プラスミド
ｐＳＷＣを得た。

【００４０】実施例７酵母のα−ファクター遺伝子の
プロモーターとプレプロ領域を利用する成熟型ＷＧＡ遺
伝子およびプロＷＧＡ遺伝子の分泌発現用プラスミドの
構築：構築の概略は図２Ｂに示した。具体的には以下の
ようにして行った。 EcoRI部位にαーファクターのプロ
モーターから構造遺伝子全領域を含む1.7 KbのＤＮＡ断
片をもつpLS01 プラスミド［K. Inokuchi et al., Mol.
Cell. Biol., Vol. 7, p. 3185-3193 (1987) ］ 260μ
g を300 unit の制限酵素EcoRI と600 unitのHind III
を含む反応液（10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgC
l2, 1 mM DTT,75 mM KCl）中で、３７℃、一夜反応させ
た後、0.7%アガロースゲル電気泳動にて、酵母αーファ
クターのプロモーターからプレプロ領域を含む1.2 Kb
のＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片の末端のEcoR
I 部位をSalI部位に変換するため、実施例１に記載した
方法にしたがって、SalI-EcoRIアダプターを合成した。上記のアダプター 20 μg に40 unit のＴ
4 ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡（株）製）を 100
μl の反応液（50mM Tris-HCl （pH 7.5），10mMMgCl2,
15mM DTT, 0.4mM Na2EDTA, 1mM ATP ）中で３７℃、１
時間作用させ、５’末端をリン酸化した。この 1μg の
アダプターと、40μg の上記 α- ファクターのプロモ
ーターからプレプロ領域のＤＮＡ断片を混合し、実施例
２記載の条件下でＴ4ＤＮＡリガーゼの作用で結合させ
た後、制限酵素 SalIとHind IIIで消化した。次に８
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、末端にSalI
部位とHind III部位を有する、α- ファクターのプロモ
ーターからプレプロ領域のＤＮＡ断片を回収した。上記
断片のα- ファクターのプレプロ領域と成熟体及び前駆
体ＷＧＡ遺伝子とをインフレームで連結するために、実
施例１記載の方法にしたがって下記の合成アダプターを合成した。各オリゴヌクレオチド40μg を上記と同様
Ｔ4 ポリヌクレオチドキナーゼを作用させ 5’末端を
リン酸化した後、このＤＮＡ 8μg と上記α- ファクタ
ーのプロモーターからプレプロ領域を含むＤＮＡ断片 2
5 μg を混合し、実施例２記載の条件下でＴ4 ＤＮＡ
リガーゼを作用させ連結した。これを制限酵素 SalI及
びBamHIで二重消化した後、 0.8% アガロースゲル電気
泳動を行い、ＷＧＡ遺伝子との連結部をもち、かつα-
ファクターのプロモーターからプレプロを含む約 1.2kb
のＤＮＡ断片を回収した。

【００４１】一方、実施例４で作成した、成熟型ＷＧＡ
遺伝子を挿入した pUC18 プラスミド 200μg を、200
ユニットの制限酵素 Hind III を含む200 μl の反応液
（10mM Tris-HCl(pH 7.5), 10mM MgCl2, 1mM DTT, 65mM
KCl）中で、３７℃、１時間３０分間反応させた後、18
μl 1M KCl, 6 μl dH2O, 16μl BamH1 （200 ユニッ
ト）を加え、さらに１時間反応させた。これを８％ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を行い、0.5 kbの成熟型
ＷＧＡ遺伝子を回収した。このＤＮＡ断片 30 μg と、
上記ＷＧＡ遺伝子との連結部をもち、α- ファクターの
プロモーターからプレプロ領域を含むＤＮＡ断片 10 μ
g とを混合し、実施例２記載の条件下でＴ4 ＤＮＡリガ
ーゼの作用で結合させた。これを制限酵素 Sal IとHind
IIIで二重消化の後、0.8%アガロースゲル電気泳動を行
い、ＤＮＡをゲルから回収し、α-ファクターのプロモ
ーター下にプレプロ領域とインフレームで連結された成
熟型ＷＧＡ遺伝子（MFα-WGA遺伝子）を得た。このＤＮ
Ａ断片を、実施例６と同様の方法で、M13mp19 の Sal I
- Hind III 部位の間に挿入した。このファージから、
ssＤＮＡを回収し、MFα- ＷＧＡ遺伝子の塩基配列を、
既知のデオキシヌクレオチド法によるＤＮＡ塩基配列分
析によって確認した。 MFα-WGA 及び MF α-WGA-CT
遺伝子の酵母での発現ベクターは、以下のようにして構
築した。pNJ1053 100 μg を、105 ユニットの制限酵素
Sma I を含む200 μl の反応液（10mM Tris-HCl(pH7.
5), 7mM MgCl2, 20mM KCl, 7mM 2-mercaptoethanol, 10
0 μg/ml BSA）中、３０℃、１時間反応させた後、実施
例１記載の方法にしたがって合成し、5 ’末端をリン酸
化したSalIリンカー 0.3 μg と混ぜ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼを作用させて連結
した。これを再び、SmaI で消化した後、Cohen らの方
法にしたがって、大腸菌 XL1-Blue に形質転換した。ア
ンピシリン耐性を指標として選択した形質転換体の中か
ら、アルカリ抽出法によってプラスミドを単離し、Sal
I 消化によって 0.95 Kb のＤＮＡ断片が生じることを
確認し、pNJ1053 のSmaI部位にSal I リンカーを導入し
たpNJ1054を得た。このpNJ1054 37.5μg を、実施例５
記載の条件下で制限酵素SalIとHindIIIで二重消化した
後、0.8% アガロースゲル電気泳動にてＥＮＯ１プロモ
ーターを欠いた7.3 KbのＤＮＡを得た。このベクター側
ＤＮＡ 2μg と前述のM13mp19 の SalI-Hind III部位間
のMFα-WGA をSalI-Hind III の二重消化によって切り
出したＤＮＡ断片 1.5μg とを混合し、実施例２記載の
方法にしたがってＴ4ＤＮＡリガーゼを作用させ、連結
した。このＤＮＡを Cohenらの方法にしたがって、大腸
菌XL1-Blueに形質転換した後、アンピシリン耐性を指標
として選択した形質転換体の中からアルカリ抽出法によ
ってプラスミドを単離し、制限酵素による分解パターン
を調べ、酵母α- ファクターのプレプロ領域をもつ成熟
型ＷＧＡ蛋白質分泌発現プラスミド（ｐＰＷ）182.5μg
を得た。一方、ＣＴペプチドを有する前駆体 WGA に関
しても、上記と全く同様の方法により、酵母α- ファク
ターのプレプロ領域をもつ発現プラスミド（ｐＰＷＣ）
245μgを作成した。

【００４２】実施例８酵母形質転換体の調製４種の成熟体及び前駆体ＷＧＡ遺伝子分泌発現用プラス
ミド pSW, pSWC, pPW及び pPWC を用いて酵母野生株
Saccharomyces cerevisiae KK4 株（MAT α,ura3,his
1,or his3,trp,leu2,gal80 ）または高分泌酵母変異
株 KS-58-2Ddel株（MAT α,leu2,ura3,his,ssl1 ）
を、既知の酢酸リチウム法（例えば、ltoet al., J. Ba
cteriol., Vol. 153, p. 163 (1983)）で形質転換し、
該プラスミドを保持するロイシン非要求性の形質転換体
を得た。これらの形質転換体を各々S.c.KK4(pSW), S.c.
KK4(pSWC),S.c.KK4(pPW) S.c. 及び KK4(pPWC) および
S.c.KS-58-2Ddel(pSW), S.c.KS-58-2Ddel(pSWC), S.c.K
S-58-2Ddel(pPW),S.c.KS-58-2Ddel(pPWC) と命名した。
また、発現の有無をチェックするコントロールとして、
ＷＧＡ遺伝子を持たないプラスミドpNJ1053 をもつKK4
株とKS-58-2Ddel株（各々KK4(pNJ1053)およびKS-58-2Dd
el(pNJ1053) と命名した）も同様の方法により作成し
た。

【００４３】ここで得られる形質転換体は工業技術院微
生物工業技術研究所に寄託している。その寄託番号は次
の通りである。 S.c.KS-58-2Ddel (pSW) 微工研菌寄第１２４４４号 S.c.KS-58-2Ddel (pSWC) 微工研菌寄第１２４４２号 S.c.KS-58-2Ddel (pPW) 微工研菌寄第１２４４３号 S.c.KS-58-2Ddel (pPWC) 微工研菌寄第１２４４１号

【００４４】実施例９分泌発現プラスミドをもった酵
母野生株および高分泌変異株の培養実施例８で作成した種々のプラスミドをもつ酵母形質転
換体は、それぞれ、ロイシンを除いた各種アミノ酸（終
濃度20〜375mg/ｌ）と過剰量のヒスチジン（終濃度400m
g/ｌ）、アデニンサルフェイト（終濃度20mg/ｌ）、過
剰量のウラシル（終濃度400mg/ｌ）を含む最小培地（D
ifco 社製、アミノ酸不含バクト酵母窒素塩基）（Sherm
an et al., Methods in Yeast Genetics, p. 62, Cold
Spring Harbour (1982)参照）に炭素源として８％グル
コースを加え３０℃で５日間、振盪培養を行った。

【００４５】実施例１０分泌生産されたＷＧＡ蛋白質
のウェスタンブロット法による解析実施例９の方法により、３０℃、５日間培養した培養液
40mlを取り、遠心分離して酵母細胞を除き、培養上清画
分を得た。これを凍結乾燥の後、５mlの脱イオン水に溶
解し、脱イオン水に対して充分透析した。再度、凍結乾
燥と透析を行い、333 倍に濃縮した。このうち、15μl
（5ml 培養上清に相当する）に同量の Laemmli's buffe
r 〔80mM Tris-HCl(pH6.8), 2% SDS, 10% グリセロー
ル、100mMDTT, 2mM PMSF, 0.001% BPB〕を加え、１０分
間煮沸した。急冷後、全量30μｌをSDS-15%PAGE に掛
け、１５０Ｖで３時間電気泳動した。泳動後、分泌され
た蛋白質をPVDFメンブランフィルター（イモビロン、ミ
リポア社製）へ転写した。具体的には、アトー社製のト
ランスブロット装置を用いて、転写用緩衝液（25 mM Tr
is-HCl (pH7.5), 192 mM glycine, 0.1% SDS, 15% meth
anol）中で、１０Ｖ、１時間、転写させた。得られたメ
ンブランフィルターをTBS 緩衝液（100 mM Tris-HCl (p
H 7.5), 150 mM NaCl ）に１０分間浸した後、ブロッキ
ング溶液（TBS に３％のゼラチンを溶解したもの）に入
れ、３０分間振盪した。次に、ウサギ抗ＷＧＡ抗体（Ｓ
ＩＧＭＡ社製、Lot No. 128-8810）の５００倍希釈溶液
中に上記のメンブランフィルターを入れ、一夜ゆっくり
と振盪した後、TTBS（TBS に0.05% Tween20 を加えたも
の）で１０分間ずつ、２回、ゆっくり振盪しながら洗浄
した。得られたメンブランフィルターを125ＩーproteinA
New England Nuclear社 NEX146L10溶液中に入れ、１時
間かるく振盪して反応させた後、TTBSで１０分、TBSで
１０分、ゆっくり振盪しながら洗浄した。得られたメン
ブランフィルターを乾燥後、オートラジオグラフィーで
検出した。

【００４６】結果は図３に示した通りで、市販のＷＧＡ
標準品（（株) ホーネンコーポレーション製）と同一の
移動度を示す位置に、抗ＷＧＡ抗体と反応する鮮明な単
一のバンドが確認された。プラスミドｐＳＷをもつ酵母
で市販のＷＧＡ標準品と同一サイズのＷＧＡを生成する
ことから、人工分泌シグナルは酵母内でＷＧＡとの融合
部分で正しく切断されることがわかった。さらに、ＣＴ
ペプチドを有する前駆体ＷＧＡ分泌発現用プラスミドｐ
ＳＷＣをもつ酵母でも、ＷＧＡ標準品と同じ位置にバン
ドが検出され、その分泌量はＣＴペプチドをもたないｐ
ＰＷの場合の約２倍であることは特筆すべきことであ
る。このことは、ＣＴペプチドの付加が分泌量の増加に
効果のあることを示すとともに、小麦胚芽中と同様、酵
母細胞内でもプレプロＷＧＡからＣＴペプチド部分が切
断されることを示している。また、上記の結果はＭＦα
のプレプロ領域に融合したＷＧＡ蛋白質も融合部位で正
しく切断され、ＷＧＡ標準品と同一の分子量を与えるこ
とを示している。但し、ＷＧＡの分泌量はＭＦαのプレ
プロ型よりもＥＮＯ１プロモーターと人工分泌シグナル
の組み合せ型のほうが有意に高かった。さらに、注目す
べきことは、ヒト・リゾチームを高分泌する変異株とし
て単離した酵母変異株であり、液胞蛋白質を細胞外にミ
スソーティングする変異ｓｓｌ１をもつ株であるKS-58-
2DdelのＷＧＡ蛋白質分泌量が、野生株KK4 に比べて約
２０倍以上高いことである。この結果は明かに、液胞へ
の蛋白質輸送に欠損をもつ変異株の利用がＷＧＡの分泌
生産に有利であることを示している。なお、ＷＧＡ蛋白
質の分泌量が最も多かったのはKS-58-2Ddel(pSWC)を用
いた場合で、その分泌量は約２００μg/l であった。

【００４７】実施例１１分泌生産されたＷＧＡ蛋白質
の分離・精製酵母形質転換体KS-58-2Ddel(pSWC)を、実施例９の培地
６L 中で３０℃、５日間培養した。培養液を遠心分離し
て酵母細胞を除き、培養上清画分を得た。この上清画分
を凍結乾燥の後、少量（100 〜 150 ml ）の脱イオン水
を加え、20 mM酢酸緩衝液（pH 4.0）に対して充分に透
析した。透析後、濃縮脱塩した試料をFPLCシステム（Ph
armacia 社製）を用い、陽イオン交換カラムMono S HR5
/5 （Pharmacia 社製）で分離した。実施例１２で述
べる糖鎖の結合活性をもつ画分は1ml/minの流速で20 mM
酢酸緩衝液（pH 4.0）存在下、0.01M NaCl/minのNaCl
直線濃度勾配にかけることによって、約２０〜４０分に
溶出された。以上のクロマトグラフィーにおける溶出パ
ターンと活性画分の位置を図４Ａに示した。この活性画
分を集め、遠心限外瀘過器（Millipore 社製、ウルトラ
フリー２０、再生セルロース膜）により、20 mM Tris-H
Cl(pH 9.5)緩衝液にバッファー交換した後、陰イオン交
換カラムMono Q HR5/5（Pharmacia 社製）で分離した。
1ml/min の流速で 20 mM Tris-HCl(pH 9.5) 緩衝液存在
下、６０分間の0 〜0.3 M NaClの直線濃度勾配で溶出し
た。この時の溶出パターンと各画分の活性を図４Ｂに示
した。活性を有する画分を遠心限外瀘過器（Millipore
社製、ウルトラフリーCL、UFC4LGC25 、再生セルロース
膜）により、20 mM クエン酸緩衝液（pH 3.8）に置換
し、再び、陽イオン交換カラム Mono S HR5/5 （Pharma
cia 社）で分離した。1ml/min の流速で20 mM クエン酸
緩衝液（pH 3.8）存在下、0.01M NaCl/minのNaCl直線濃
度勾配で溶出した。図４Ｃにこの溶出パターンを示した
が、糖鎖結合活性は約２７分で溶出する主要ピークに検
出された。また、市販のＷＧＡ標品（ＷＧＡ I, II, II
I の混合物）を陽イオン交換カラムMono Sにより上記と
同一のNaCl直線濃度勾配で分離精製した。図４Ｄにこの
時のＷＧＡイソレクチン蛋白質の分離パターンを示した
が、組換えＷＧＡ蛋白質の溶出位置は約２７分で溶出す
るＷＧＡ IIの溶出位置と一致していた。上記クロマト
グラフィーによる組換えＷＧＡ分離精製におけるメイン
ピーク（図４Ｃ参照）を分取し、SDS-15%PAGEを行った
結果が図５である。クマシーブリリアントブルーによる
染色により、組換え体酵母の分泌生産するＷＧＡ蛋白質
試料からは標準ＷＧＡ II 蛋白質と同一の移動度を示す
単一のバンドのみが検出された。なお、このようにして
精製した組換えＷＧＡ II 蛋白質の収量は約 100μg/l
であった。

【００４８】実施例１２分泌生産されたＷＧＡ蛋白質
の糖鎖結合活性の検出図６にＷＧＡ蛋白質の糖鎖結合活性の検出法を示した。
９６穴のマイクロタイタープレート（ELISA 用プレート
F-FORM, グライナー社製）の各ウエルに、１％オボアル
ブミン（ＳＩＧＭＡ社製、５X結晶）のPBS溶液を100μl
ずつ加え、室温で１時間放置し、プラスチック表面
をオボアルブミンでコートした。0.05% Tween 20 を含
むPBS で100 μl ずつ３回洗浄したのち、種々の濃度の
精製した組換えＷＧＡII蛋白質または実施例１１に示し
た方法により市販のＷＧＡ標品から分離精製したＷＧＡ
II蛋白質を含むPBS 溶液 50 μlを加え、室温で、１時
間放置した。0.05% Tween 20 のPBS 溶液で100 μl ず
つ３回洗浄後、抗ＷＧＡ抗体（ＳＩＧＭＡ社製、Lot. N
o. 128F8810 ）の１５０倍希釈PBS 溶液 50 μl を加
え、室温で１時間放置した。再度上記と同様に洗浄した
後、二次抗体として、抗ウサギＩｇＧ抗体とアルカリフ
ォスファターゼのコンジュゲート（E.Y.ラボラトリーズ
社）の３００倍希釈PBS 溶液 50 μl を加え、室温で１
時間放置した。洗浄後、p-ニトロフェニルフォスフェー
ト 1mg/ml を含むジエタノールアミン緩衝液（ジエタノ
ールアミン 9.7% vol, 0.5 mM MgCl2, 3mM NaN3, pH 9.
5）を50μl 加え、室温でp-ニトロフェノールの発色を
観察した。発色を 1N NaOH 50μ l を加えて止め、マイ
クロタイタープロートリーダー（コロナ社、MTP-32）に
て415nm の吸光度を測定した。結果は図７の如く、組換
えＷＧＡは標準ＷＧＡIIと同一の糖鎖結合比活性（蛋白
質当りの糖鎖結合能）を示した。なお、蛋白質の定量
は、ＢＣＡ蛋白質定量試薬（PIERCE社製）を用い、付属
のプロトコールにしたがって行った。ＷＧＡに関する限
り、ＢＣＡ法はクマシーブリリアント法に比べて、約７
０倍感度が高かった。以上の結果から、酵母で分泌生産
されたＷＧＡII蛋白質は小麦由来のＷＧＡと同一の糖鎖
結合活性をもつことが判明した。

【００４９】配列表１．配列番号１（１）配列の長さ：５１３（２）配列の型：核酸（３）鎖の数：二本鎖（４）トポロジー：直鎖状（５）配列の種類：合成ＤＮＡ（６）起源（ａ）生物名：なし（合成ＤＮＡ）（ｂ）株名：なし（７）配列の特徴：小麦胚芽凝集素蛋白質（WGA)成熱体
をコードする遺伝子配列（８）配列： CAA AGA TGT GGT GAA CAA GAA TCC AAC ATG 30 GTT TCT ACA CCA CTT GTT CTT AGG TTG TAC GAA TGT CCA AAC AAC TTG TGT TGT TCT CAA 60 CTT ACA GGT TTG TTG AAC ACA ACA AGA GTT TAC GGT TAC TGT GGT ATG GGT GGT GAT TAC 90 ATG CCA ATG ACA CCA TAC CCA CCA CTA ATG TGT GGT AAG GGT TGT CAA GAC GGT GCT TGT 120 ACA CCA TTC CCA ACA GTT CTG CCA CGA ACA TGG ACT AGT AAG AGA TGT GGT TCT CAA GCT 150 ACC TGA TCA TTC TCT ACA CCA AGA GTT CGA GGT GGT GCT ACT TGT CCA AAC AAC CAC TGT 180 CCA CCA CGA TGA ACA GGT TTG TTG GTG ACA TGT TCT CAA TAC GGT CAC TGT GGT TTC GGT 210 ACA AGA GTT ATG CCA GTG ACA CCA AAG CCA GCT GAG TAC TGT GGT GCT GGT TGT CAA GGG 240 CGA CTC ATG ACA CCA CGA CCA ACA GTT CCC GGC CCA TGT AGA GCT GAT ATC AAG TGT GGT 270 CCG GGT ACA TCT CGA CTA TAG TTC ACA CCA TCT CAA TCT GGT GGT AAG TTG TGT CCA AAC 300 AGA GTT AGA CCA CCA TTC AAC ACA GGT TTG AAC TTG TGT TGT TCT CAA TGG GGC AGC TGT 330 TTG AAC ACA ACA AGA GTT ACC CCG TCG ACA GGT TTG GGT TCT GAA TTT TGT GGT GGT GGT 360 CCA AAC CCA AGA CTT AAA ACA CCA CCA CCA TGT CAA TCT GGT GCA TGC TCT ACT GAC AAG 390 ACA GTT AGA CCA CGT ACG AGA TGA CTG TTC CCA TGT GGT AAG GAC GCC GGC GGT AGA GTT 420 GGT ACA CCA TTC CTG CGG CCG CCA TCT CAA TGT ACT AAC AAC TAC TGT TGT TCT AAG TGG 450 ACA TGA TTG TTG ATG ACA ACA AGA TTC ACC GGT TCT TGT GGT ATT GGT CCC GGG TAC TGT 480 CCA AGA ACA CCA TAA CCA GGG CCC ATG ACA GGT GCT GGT TGT CAA TCT GGT GGT TGT GAC 510 CCA CGA CCA ACA GTT AGA CCA CCA ACA CTG GCT CGA

【００５０】２．配列番号２（１）配列の長さ：５５８（２）配列の型：核酸（３）鎖の数：二本鎖（４）トポロジー：直鎖状（５）配列の種類：合成ＤＮＡ（６）起源（ａ）生物名：なし（合成ＤＮＡ）（ｂ）株名：なし（７）配列の特徴：小麦胚芽凝集素蛋白質（WGA)前駆体
をコードする遺伝子配列。（８）配列： CAA AGA TGT GGT GAA CAA GAA TCC AAC ATG 30 GTT TCT ACA CCA CTT GTT CTT AGG TTG TAC GAA TGT CCA AAC AAC TTG TGT TGT TCT CAA 60 CTT ACA GGT TTG TTG AAC ACA ACA AGA GTT TAC GGT TAC TGT GGT ATG GGT GGT GAT TAC 90 ATG CCA ATG ACA CCA TAC CCA CCA CTA ATG TGT GGT AAG GGT TGT CAA GAC GGT GCT TGT 120 ACA CCA TTC CCA ACA GTT CTG CCA CGA ACA TGG ACT AGT AAG AGA TGT GGT TCT CAA GCT 150 ACC TGA TCA TTC TCT ACA CCA AGA GTT CGA GGT GGT GCT ACT TGT CCA AAC AAC CAC TGT 180 CCA CCA CGA TGA ACA GGT TTG TTG GTG ACA TGT TCT CAA TAC GGT CAC TGT GGT TTC GGT 210 ACA AGA GTT ATG CCA GTG ACA CCA AAG CCA GCT GAG TAC TGT GGT GCT GGT TGT CAA GGG 240 CGA CTC ATG ACA CCA CGA CCA ACA GTT CCC GGC CCA TGT AGA GCT GAT ATC AAG TGT GGT 270 CCG GGT ACA TCT CGA CTA TAG TTC ACA CCA TCT CAA TCT GGT GGT AAG TTG TGT CCA AAC 300 AGA GTT AGA CCA CCA TTC AAC ACA GGT TTG AAC TTG TGT TGT TCT CAA TGG GGC AGC TGT 330 TTG AAC ACA ACA AGA GTT ACC CCG TCG ACA GGT TTG GGT TCT GAA TTT TGT GGT GGT GGT 360 CCA AAC CCA AGA CTT AAA ACA CCA CCA CCA TGT CAA TCT GGT GCA TGC TCT ACT GAC AAG 390 ACA GTT AGA CCA CGT ACG AGA TGA CTG TTC CCA TGT GGT AAG GAC GCC GGC GGT AGA GTT 420 GGT ACA CCA TTC CTG CGG CCG CCA TCT CAA TGT ACT AAC AAC TAC TGT TGT TCT AAG TGG 450 ACA TGA TTG TTG ATG ACA ACA AGA TTC ACC GGT TCT TGT GGT ATT GGT CCC GGG TAC TGT 480 CCA AGA ACA CCA TAA CCA GGG CCC ATG ACA GGT GCT GGT TGT CAA TCT GGT GGT TGT GAC 510 CCA CGA CCA ACA GTT AGA CCA CCA ACA CTG GCT GTT TTC GCT GGT GCT ATT ACC GCT AAC 540 CGA CAA AAG CGA CCA CGA TAA TGG CGA TTG TCC ACC TTG TTG GCT GAA AGG TGG AAC AAC CGA CTT

【００５１】３．配列番号３（１）配列の長さ：５８８（２）配列の型：核酸（３）鎖の数：二本鎖（４）トポロジー：直鎖状（５）配列の種類：合成ＤＮＡ（６）起源（ａ）生物名：なし（合成ＤＮＡ）（ｂ）株名：なし（７）配列の特徴：酵母のENo1プロモーターの１部、人
工分泌シグナル、WGA成熱体をコードする遺伝子から構
成される。（８）配列：

【００５２】

【化１】

【００５３】４．配列番号４（１）配列の長さ：９４（２）配列の型：核酸（３）鎖の数：二本鎖（４）トポロジー：直鎖状（５）配列の種類：合成ＤＮＡ（６）起源（ａ）生物名：なし（合成ＤＮＡ）（ｂ）株名：なし（７）配列の特徴：小麦胚芽凝集素蛋白質（WGA)の成熱
体のＣ末端側１部領域とWGA のプロ領域とをコードする
遺伝子配列（８）配列：

【００５４】

【化２】

【図面の簡単な説明】

【図１】（Ａ）Ａブロックの酵素的連結法とサブクロー
ニング（Ｂ）Ｂブロックの酵素的連結法とサブクローニング（Ｃ）Ｃ＋Ｄブロックの酵素的連結法とサブクローニン
グ（Ｄ）Ａ、Ｂ、Ｃ＋Ｄブロックの酵素的連結法とサブク
ローニング。

【図２】（Ａ）成熟体型および前駆体型ＷＧＡ遺伝子の
分泌発現用プラスミドの構築（Ｂ）酵母のα−ファクター遺伝子のプロモーターとプ
レプロ領域を利用する成熟型および前駆体型ＷＧＡ遺伝
子の分泌発現用プラスミドの構築。

【図３】分泌ＷＧＡ蛋白質のウエスタンブロット解析。

【図４】（Ａ）酵母培養液中のＷＧＡ蛋白質の Mono S
カラムによる分離（Ｂ）上記ＡにおけるＷＧＡ溶出画分のMono Q カラム
による分離精製（Ｃ）上記ＢにおけるＷＧＡ画分の Mono S カラムによ
る分離精製（Ｄ）市販のＷＧＡ標品（ＷＧＡI、II、IIIの混合物）
のMono S カラムによる分離。

【図５】組換えＷＧＡ蛋白質のＳＤＳー１５％ポリアク
リルアミドゲル電気泳動による純度検定。

【図６】ＷＧＡ蛋白質の糖鎖結合活性の測定法。

【図７】組換えＷＧＡ蛋白質と標準ＷＧＡ蛋白質におけ
る糖鎖結合活性の比較。

【手続補正書】

【提出日】平成４年１１月２日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】発明の詳細な説明

【補正方法】変更

【補正内容】

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【０００２】

【従来技術】小麦胚芽凝集素（ｗｈｅａｔｇｅｒｍ
ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，以下ＷＧＡと略す）は、小麦
胚芽中に見いだされる蛋白質であり、ガン細胞を特異的
に凝集させる活性をもつことが知られている［Ｊ．Ｃ．
Ａｕｄｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．５０，ｐ．６１３（１９
６３）］。また、ＷＧＡは、Ｎ−アセチルグルコサミン
（ＧｌｃＮＡｃ）やＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ
ＮＡｃ）（別名シアル酸）を含むオリゴ糖や糖蛋白質、
糖脂質などに特異的に結合する作用を有するため、これ
を利用した生体成分の分離・分析用試薬としても市販さ
れ、ＷＧＡ単品だけでなく、種々の担体に固定化したＷ
ＧＡとしても一般に利用されている。ＷＧＡは、さら
に、ガン患者の血清や体液中に存在するガン関連糖蛋白
質と特異的に結合することから、腫瘍マーカーの一つと
して、ガンの診断にも利用できる（特開昭６２−２５７
０６２号および特開昭６２−２５７０６３号）。

【０００３】ＷＧＡは従来、小麦胚芽から精製すること
により調製されている［例えば、Ｎａｇａｔａａｎｄ
Ｂｕｒｇｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．
２４９，ｐ．３１１６（１９７４）及びＮａｇａｔａ
ｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ，ｐ．６１１，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ
（１９７４）］が、市販のＷＧＡは数種類のＷＧＡ同族
体（アイソマー）を含んだ混合物として通常供給されて
いる。これは小麦胚芽の遺伝子構成の反映であるが、特
定の品種の胚芽を用いても２〜３種類のＷＧＡアイソマ
ーが含まれることが分かっている［Ｒｉｃｅ，Ｂｉｏｃ
ｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，Ｖｏｌ．４４４，
ｐ．１７５（１９７６）］。ＷＧＡアイソマーの相互分
離とそれらの精製はかなり煩雑で時間がかかり、コスト
も高くなるため、市販のＷＧＡは同族体の混合物のまま
供給されている場合が多いのが現状である。

【０００５】

【０００６】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は次の
構成を含むものである。（１）配列番号１のヌクレオチド配列で表わされる小
麦胚芽凝集素の成熟体構造遺伝子。（２）上記（１）記載の小麦胚芽凝集素の構造遺伝子
の５’端に分泌に必要なシグナルペプチドをコードする
ＤＮＡ領域を、また３’端に翻訳終止信号ＴＧＡＴＡＡ
を、それぞれ有する小麦胚芽凝集素遺伝子。（３）上記（１）記載の小麦胚芽凝集素の構造遺伝子
の５’端に分泌に必要なシグナルペプチドをコードする
ＤＮＡ領域を、また３’端に翻訳終止信号ＴＧＡＴＡＡ
を、それぞれ有する小麦胚芽凝集素遺伝子を含む組換え
プラスミドＤＮＡ。（４）発現プロモーターが酵母プロモーターであり、
かつ、シグナルペプチドをコードする領域が該酵母プロ
モーターの下流側で、かつ小麦胚芽凝集素遺伝子の上流
にあり、いずれもこれらと解読枠が一致していることを
特徴とする上記（３）記載の組換えプラスミド。（５）宿主細胞を上記（３）または上記（４）記載の
小麦胚芽凝集素遺伝子を含む組換えプラスミドＤＮＡで
形質転換した形質転換体微生物。（６）宿主細胞が酵母である上記（５）記載の形質転
換体微生物。（７）酵母が、サッカロミセス属に属する酵母株、あ
るいは液胞局在性蛋白質を細胞外に分泌する突然変異を
有するサッカロミセス属に属する酵母変異株であること
を特徴とする上記（６）記載の形質転換体微生物。（８）酵母変異株が、ＫＳ−５８−２Ｄｄｅｌである
ことを特徴とする上記（７）記載の形質転換体微生物。（９）上記（５）乃至上記（８）のいずれか記載の形
質転換体微生物を培地に培養して、培養物から小麦胚芽
凝集素を採取することを特徴とする小麦胚芽凝集素の製
造法。（１０）配列番号２のヌクレオチド配列で表わされる
小麦胚芽凝集素前駆体をコードする遺伝子。（１１）上記（１０）記載の小麦胚芽凝集素前駆体を
コードする遺伝子の５’端に分泌に必要なシグナルペプ
チドをコードするＤＮＡ領域を、また３’端に翻訳終止
信号ＴＧＡＴＡＡを、それぞれ有する小麦胚芽凝集素前
駆体をコードする遺伝子。（１２）上記（１０）記載の小麦胚芽凝集素前駆体を
コードする遺伝子の５’端に分泌に必要なシグナルペプ
チドをコードするＤＮＡ領域を、また３’端に翻訳終止
信号ＴＧＡＴＡＡを、それぞれ有する小麦胚芽凝集素前
駆体をコードする遺伝子を含む組換えプラスミドＤＮ
Ａ。（１３）発現プロモーターが酵母プロモーターであ
り、かつ、シグナルペプチドをコードする領域が該酵母
プロモーターの下流側で、かつ小麦胚芽凝集素遺伝子の
上流にあり、いずれもこれらと解読枠が一致しているこ
とを特徴とする上記（１２）記載の組換えプラスミドＤ
ＮＡ。（１４）宿主細胞を上記（１２）または上記（１４）
記載の小麦胚芽凝集素遺伝子を含む組換えプラスミドＤ
ＮＡで形質転換した形質転換体微生物。（１５）宿主細胞が酵母である上記（１４）記載の形
質転換体微生物。（１６）酵母が、サッカロミセス属に属する酵母株、
あるいは液胞局在性蛋白質を細胞外に分泌する突然変異
を有するサッカロミセス属に属する酵母変異株であるこ
とを特徴とする上記（１５）記載の形質転換体微生物。（１７）酵母変異株が、ＫＳ−５８−２Ｄｄｅｌであ
ることを特徴とする上記（１６）記載の形質転換体微生
物。（１８）上記（１４）乃至上記（１７）のいずれか記
載の形質転換体微生物を培地に培養して、培養物から小
麦胚芽凝集素を採取することを特徴とする小麦胚芽凝集
素の製造法。

【０００８】ＷＧＡ蛋白質は植物体中では細胞内の液胞
またはプロテインボディーといわれるオルガネラに局在
している［Ｍ．Ａ．Ｍａｎｓｆｉｅｌｄｅｔａ
ｌ．，Ｐｌａｎｔａ，Ｖｏｌ．１７３，ｐ．４８２−４
８９（１９８８）］。このプロテインボディーは液胞が
断片化した構造体と推定されることから、植物体内でこ
の蛋白質は小胞体（ＥＲ）の膜上で生合成された後、細
胞内の分泌経路によりＥＲからゴルジ体まで輸送され、
その後液胞またはプロテインボディーに輸送されるもの
と考えられている［Ｎ．Ｖ．Ｒａｉｋｈｅｌｅｔａ
ｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｐｌａｎｔ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｖｏｌ．７，ｐ．８３−８９
（１９８８）］。したがって、酵母細胞でＷＧＡ遺伝子
を発現させた場合も、通常は、植物細胞と同様、酵母の
液胞またはこれに相当するオルガネラに輸送されてしま
うと推定される。しかし、一方、酵母細胞では、本来液
胞に局在しているカルボキシペプチダーゼＹ（ＣＰＹ）
蛋白質で、この遺伝子を多コピープラスミド上で高発現
させると細胞外に分泌されることが報告されている
［Ｔ．Ｈ．Ｓｔｅｖｅｎｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１０２，ｐ．１５５１−１５
５７（１９８６）］。この理由は、ゴルジ体から液胞へ
の輸送選別に関与している細胞内成分の量に限度があ
り、ＣＰＹ蛋白質の生産量がこの限度をこえるとゴルジ
体から液胞への選別ができなくなり、分泌顆粒に輸送さ
れて最終的には細胞外に分泌してしまうためであると考
えられている［Ｔ．Ｈ．Ｓｔｅｖｅｎｓｅｔａ
ｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１０２，
ｐ．１５５１−１５５７（１９８６）］。このため、本
来液胞に輸送されるＷＧＡ蛋白質についても、高発現プ
ロモーターの支配下で発現させるか、あるいはゴルジ体
から液胞への輸送選別に欠損変異をもつ酵母の変異株を
使用することにより、ＷＧＡ蛋白質を酵母の細胞外に分
泌させることが可能であろうと考えた。

【０００９】ＷＧＡ蛋白質には３〜４種類の同族体（ア
イソマー）が存在するが、このうち３種類（ＷＧＡＩ、
ＩＩ、ＩＩＩ）については、そのアミノ酸配列およびｃ
−ＤＮＡの塩基配列が報告されている。このうち、ＷＧ
ＡＩＩはＸ線結晶解析によりその立体構造が詳細に解折
されているうえ、ＷＧＡＩＩ蛋白質とオリゴ糖との複合
体の立体構造も解析されており、糖鎖との結合様式につ
いても多くの情報が蓄積されている。そこで酵母を宿主
としてＷＧＡ蛋白質の分泌発現を検討するための１具体
例としては、ＷＧＡＩＩ蛋白質について検討した。具体
的には、報告されているＷＧＡＩＩ蛋白質のアミノ酸配
列をもとにして、しかしアミノ酸に対応するＤＮＡ上の
コドンとして、小麦のコドンではなく、酵母の頻用コド
ンを用いてＷＧＡＩＩ遺伝子を設計・化学合成した。し
かし、本発明はこのＷＧＡＩＩの製造法に限定されるも
のではなく、ＷＧＡＩＩ遺伝子に公知の方法により部位
特異的変異を導入したＷＧＡＩ遺伝子またはＷＧＡＩＩ
Ｉ遺伝子を作成し、これを酵母で分泌発現する際にも、
また上記の遺伝子を酵母以外の他の適当な宿主細胞で分
泌発現する際にも適用されるべきものである。

【００１０】（１）遺伝子の設計ＷＧＡＩＩ遺伝子については、ｃ−ＤＮＡの塩基配列が
報告されており［ＳｍｉｔｈａｎｄＲａｉｋｅｌ，
ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖ
ｏｌ．１３，ｐ．６０１−６０３（１９８９）］、それ
より以前に報告されていたアミノ酸配列［（Ｗｒｉｇｈ
ｔａｎｄＯｌａｆｓｄｏｔｔｉｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ，
Ｃｈｅｍ，Ｖｏｌ．２６１，ｐ．７１９１−７１９５
（１９８６）］には、３カ所で誤りがあったことが指摘
されている（１０９番目でＳｅｒからＰｈｅに、１３４
番目でＧｌｙからＬｙｓに、そして１５０番目でＧｌｙ
からＴｒｐに）。そこでＷＧＡＩＩ遺伝子の設計には、
ｃ−ＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列を利用し
た。しかし、ＷＧＡＩＩ蛋白質から決定されたアミノ酸
配列とｃ−ＤＮＡから推定されたアミノ酸配列とはそれ
でもまだ３７番目で異なっており、前者の方法ではＡｓ
ｐ、後者の方法ではＡｓｎと報告されている。蛋白質レ
ベルでのアミノ酸配列の分析結果の解釈としては、Ａｓ
ｎからＡｓｐへの脱アミノ化が生体内でおこっている可
能性もあるが、一般的には、アミノ酸配列分析に適した
ペプチド断片を蛋白質から調製する際、あるいはペプチ
ド断片の分離・精製の操作の過程で脱アミノ化したもの
と考えられる。したがって、本発明における１具体例と
しては、成熟型ＷＧＡＩＩ蛋白質の３７番目アミノ酸残
基として、ｃ−ＤＮＡから推定されるＡｓｎを採用し
た。

【００１１】しかし、このアミノ酸配列に相当するＷＧ
ＡＩＩ遺伝子をデザインするにあたっては、遺伝子コド
ンの縮重により複数のコドン選択が可能である。特に小
麦など植物で頻用されているコドン［Ｓｍｉｔｈａｎ
ｄＲａｉｋｅｌ，ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３，ｐ．６０１−６０３
（１９８９）］と酵母で頻用されるコドン［Ｂｅｎｎｅ
ｔｚｅｎａｎｄＨａｌｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，Ｖｏｌ．２５７，ｐ．３０２６−３０３１（１９
８２）］は必ずしも一致していない。そこで、ＷＧＡＩ
Ｉ遺伝子の設計にあたっては、ｉ）合成遺伝子の発現に
適当と思われる酵母において最も許容されるコドンを使
用する。ｉｉ）遺伝子中に特定の制限酵素認識部位を設
けて、サブクローニングしやすくする。ｉｉｉ）同一鎖
上または相補鎖上に自己相補的あるいは正しい配列以外
のものと相補的であるような配列を極力さける、などに
配慮した。このような諸条件を満足する１具体例として
は、前記本発明の構成（１）または（１０）に記截した
ものである。本発明は第一に上記のＤＮＡ配列で示され
るＷＧＡ発現のための合成遺伝子を有するＤＮＡに関す
るが、本発明ＤＮＡとしては上記合成遺伝子の他、その
５’末端に翻訳開始コドンや分泌のためのシグナルペプ
チドをコードするＤＮＡ配列を連結したもの、あるい
は、その３’末端に翻訳停止コドンを連結したもの、あ
るいはこの両者を連結したもの、そしてこれらの５’末
端と３’末端にそれぞれ制限酵素切断部位をもつものを
含み、発現のための便宜や遺伝子組換え等の操作の便宜
を図ることができる。またこの他、これらＤＮＡを組み
込んだプラスミドも本発明に入るものである。

【００１２】小麦胚芽中では、ＷＧＡ蛋白質は成熟型Ｗ
ＧＡ蛋白質領域の他に、そのアミノ末端（Ｎ末端）に翻
訳開始に必要なＭｅｔを含めて２８アミノ酸残基からな
るプレペプチドをもっているほか、そのカルボキシル末
端（Ｃ末端）には１５アミノ酸残基からなる余計なプロ
ペプチドをもっており、いわゆるプレプロ型の前駆体Ｗ
ＧＡ蛋白質として生合成されることが、そのｃ−ＤＮＡ
配列の分析から推定されている［Ｎ．Ｖ．Ｒａｉｋｈｅ
ｌａｎｄＴ．Ａ．Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８４，ｐ．
６７４５−６７４９（１９８７）およびＳｍｉｔｈ
ａｎｄＲａｉｋｅｌ，ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａ
ｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３，ｐ．６０１−６０
３（１９８９）］。

【００１３】したがって、この前駆体ＷＧＡ（プレプロ
ＷＧＡ）蛋白質に対応するＤＮＡ配列をそのまま用いて
タバコなどの植物細胞で発現させることも可能である
が、このままでは発現されたＷＧＡ蛋白質は液胞に輸送
されてしまう［Ｔ．Ａ．Ｗｉｌｋｉｎｓｅｔａｌ，Ｔ
ｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌ，Ｖｏｌ．２．，ｐ．３０
１−３１３（１９９０）］。したがって、植物以外の細
胞などを利用して、しかも分泌発現を成功させる何等か
の方法を開発する必要がある。しかし、このＷＧＡ本来
の分泌シグナルは植物以外の細胞で正しく機能するかど
うか疑問である。例えば、ヒト・インターフェロンの酵
母での分泌では、２３アミノ酸残基からなるヒト由来の
分泌シグナルはヘテロなシグナル切断点を示し、酵母で
の機能としては不完全なものである［Ｒ．Ａ．Ｈｉｔｚ
ｅｍａｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２
１９，ｐ．６２０（１９８３）］。一般に酵母の分泌シ
グナルの長さは１５〜２０アミノ酸残基からなるものが
多く、ＷＧＡのもつシグナルの長さ（２８アミノ酸残
基）はこれより長い。一方、酵母で異種蛋白質の分泌に
有効な分泌シグナルとしては、酵母本来のものだけでな
く、異種生物由来のシグナルや、疎水性のＬｅｕクラス
ターを含み１５アミノ酸からなる人工のシグナルも、効
率よく機能することが報告されている［Ｙ．Ｙａｍａｍ
ｏｔｏｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．Ｖｏｌ．１４９，ｐ．４３
１（１９８７）］。したがって、酵母によるＷＧＡ蛋白
質の分泌発現を検討する際にも、酵母で機能する上記の
種々の分泌シグナルが利用可能である。この具体的な１
例としては、上記の人工シグナルペプチドをコードする
ＤＮＡ断片を化学合成して使用した結果を後に実施例で
示す。なお、このシグナルペプチド（以下プレ領域とい
う）に対応するＤＮＡを連結するＷＧＡ遺伝子として
は、Ｃ末端プロ領域を持たない成熟体型ＷＧＡ遺伝子の
ほか、Ｃ末端プロ領域を持つ前駆体型ＷＧＡ遺伝子も使
用することができる。そこで、プレＷＧＡ遺伝子（分泌
シグナル＋成熟体型ＷＧＡをコードするＤＮＡ領域）お
よびプレプロＷＧＡ遺伝子（分泌シグナル＋前駆体型Ｗ
ＧＡをコードするＤＮＡ領域）を各々作成して、その発
現について検討した。

【００１４】なお、これらのＷＧＡ遺伝子を含むＤＮＡ
を発現させる宿主細胞としては種々のものが使用可能で
あるが、酵母を宿主とする場合の１具体例は、酵母の解
糖系遺伝子の一つで発現効率の高いＥＮＯ１プロモータ
ーを利用するものである［Ｋ．Ｉｃｈｉｋａｗａｅｔ
ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．ＢｉｏｌＣｈｅｍ．，Ｖｏ
ｌ．５３，ｐ．１４４５−１４４７（１９８９）］。一
方、酵母で異種蛋白質を分泌発現するための遺伝子とし
ては酵母のα−ファクターのプロモーターおよびプレプ
ロ領域がよく利用されている［例えばＢｒａｋｅｅｔ
ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ，Ｖｏｌ．８１，ｐ．４６４２（１９８４）、Ｂｉ
ｔｔｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８１，ｐ．５３３０
（１９８４）など］。そこで本発明における他の具体例
としては、酵母のα−ファクター遺伝子のプロモーター
およびプレプロ領域をもつＤＮＡ領域の下流に、上記の
成熟体型ＷＧＡ遺伝子またはＣ末端プロ領域をもつ前駆
体型ＷＧＡ遺伝子を連結した分泌発現用遺伝子を作成し
たものを示す。しかし、これら種々の分泌発現用遺伝子
が酵母内で正しく発現し、培地中に分泌された組換えＷ
ＧＡ蛋白質が、小麦胚芽から単離されたＷＧＡＩＩ蛋白
質と同一のアミノ酸配列や糖鎖の結合活性をもつか否か
は容易に予測できない。また、成熟型ＷＧＡ蛋白質のＣ
末端領域をもつプロＷＧＡ蛋白質が酵母の分泌過程で正
しく切断されるか否かは興昧深い点である。しかし、後
述の実施例でも明かなようにＷＧＡ前駆体蛋白質は酵母
によってシグナルペプチドだけでなく、Ｃ末端のプロ領
域も正しく切断され、小麦胚芽から単離されたＷＧＡＩ
Ｉ蛋白質と同一の分子量をもつほか、糖鎖の結合比活性
も小麦胚芽由来のＷＧＡＩＩと同一であることが本発明
により明かとなった。

【００１５】（２）遺伝子の合成と発現用プラスミドの
構築上記のＷＧＡ遺伝子は例えば約１５〜４５個の核酸塩基
鎖長をもつ複数個のオリゴデオキシヌクレオチドを合成
し、それらを連結することによって製造することができ
る。例えば、配列番号３に示したような３２個のオリゴ
ヌクレオチド・フラグメントに分割して、たとえば［Ｍ
ｕｒａｋｉｅｔａｌ，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．，Ｖｏｌ．５０，ｐ．７１３−７２３（１９８
６）］にしたがって合成することができるし、オリゴヌ
クレオチド・フラグメントは既知の方法でハイブリダイ
ズさせ、酵素的に連結することができる［例えばＡｇａ
ｒｗａｌｅｔａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．２２
７，ｐ．２７−３４（１９７０）］。なお、このフラ
グメントへの分割法は上記のものに限定される必要はな
く、前記の自己会合が回避できることなどに留意すれ
ば、種々の分割が可能である。次の段階としては、この
ようにして得られた合成遺伝子またはその断片を量的に
増やすために、まず適当なベクターに組み込みサブクロ
ーニングすることであるが、以下では、その１具体例と
して、成熟体型ＷＧＡ遺伝子と前駆体型ＷＧＡ遺伝子に
分けて上記のステップを詳しく説明する。

【００１６】２−１成熟体型ＷＧＡ遺伝子の合成とク
ローニング１７１個のアミノ酸からなる成熟型ＷＧＡ蛋白質はアミ
ノ酸配列の解析や立体構造の解析結果などから、空間的
にはっきりした４個のドメイン（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ）から
成り、それぞれのドメインはお互いにきわめて相同性の
高い配列をもつ４１個の長さのアミノ酸で構成されるこ
とがわかっている［Ｃ．Ｓ．Ｗｒｉｇｈｔ，Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１９４，ｐ．５０１−５２９
（１９８７）］。したがって、遺伝子の設計および合成
にあたっては、ヌクレオチドフラグメントが正しい配列
以外のものとハイブリダイズするのをさけるため、ＷＧ
Ａ遺伝子の前半部分については、オリゴヌクレオチド・
ブロックが上記のドメインＡおよびＢと一致するように
分割した。しかし、この分割法ではブロックのＤＮＡ断
片を組み上げる際、酵素的に連結するステップが多くな
り、結果的に連結反応の最終産物の収率が低下して、そ
の後のサブクローニングに成功する頻度が低下すること
が判明した。そこで、ＷＧＡ遺伝子の後半部分について
は、上記のドメインＣおよびＤに相当するＤＮＡをまと
めて１つのブロックとしてＤＮＡ断片の組み上げを行っ
た。なお、ドメインＡに相当するＡブロックについて
は、７番目（Ｇｌｙ）と８番目（Ｓｅｒ）にまたがる部
位に制限酵素ＢａｍＨＩ部位を設け、このサイトから下
流をとりあえず作成し、これよりＮ末端側については、
後述の分泌シグナルを作成するときに同時に作成し、Ｂ
ａｍＨＩ部位で翻訳解読枠が一致するように設計した。

【００１７】上記のように設計した遺伝子を合成するに
は、＋，−両鎖のそれぞれについて、これらをいくつか
のフラグメントに分けて、それらを化学的に合成し、各
々のフラグメントを連結する方法によれば良い。各鎖は
１５〜４５塩基からなり各々が少なくとも６塩基ずつ重
なる様に３２個程度のフラグメントに分けるのが好まし
い。以上の操作の概要は図１〜図４に要約して示した。
ドメインＡに相当するＡブロックの組み上げについては
図１に示したが、このＡドメインの最終的な酵素的連結
産物は制限酵素ＳｐｅＩで消化後、サブクローニング用
のベクターであるＰｈａｇｅｓｃｒｉｐｔのＢａｍＨＩ
−ＸｂａＩ断片と連結してクローニングした。このクロ
ーン化ＤＮＡからＢａｍＨＩ，ＳａｃＩ二重消化により
ＷＧＡ遺伝子断片を含むＤＮＡを回収したのち、これを
さらに制限酵素ＭａｅＩで消化して得たＢａｍＨＩ−Ｍ
ａｅＩ断片を、ＢブロックおよびＣ＋Ｄブロックとの連
結用ＤＮＡ断片とした。また、ドメインＢに相当するＢ
ブロックについても、同様に、最終的な酵素的連結産物
を制限酵素ＳｐｅＩ，ＡｐａＩで二重消化後、Ｂｌｕｓ
ｃｒｉｐｔＫＳ（＋）のＳｐｅＩ−ＡｐａＩ部位にサ
ブクローニングした。このクローン化ＤＮＡからＡｐａ
Ｉ，ＳａｃＩ消化によりＷＧＡ遺伝子断片を含むＤＮＡ
を回収したのち、これをさらに制限酵素ＭａｅＩで消化
して得たＭａｅＩ−ＡｐａＩ断片を各ブロック間の連結
用ＤＮＡ断片とした（図２参照）。

【００１８】一方、ドメインＣとＤに相当するＣ＋Ｄブ
ロックについては、上述のようにオリゴヌクレオチドフ
ラグメントの鎖長をＡやＢドメインに相当するブロック
の場合の２〜３倍としたため、酵素的連結の回数は上記
のＡまたはＢブロックを作成するときと殆ど同じである
にも拘らず、最終連結産物の鎖長はＣ＋Ｄに相当する約
２倍の長さになっている。このＣ＋Ｄブロックはその
５’末端および３’末端にそれぞれＡｐａＩ部位、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ部位をもつため、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔの
ＡｐａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローニングした
のち、これをＡｐａＩ，ＨｉｎｄＩＩＩで消化してＷＧ
Ａ遺伝子断片を含むＤＮＡを回収して各ブロック間の連
結用ＤＮＡ断片とした（図３参照）。

【００１９】最後に、上記で調製したＡ、Ｂ、Ｃ＋Ｄの
各ＤＮＡ断片を図４に示した順序で連結し、これをプラ
スミドベクターｐＵＣ１８のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位にクローン化した。この様にして作成した成熟
型ＷＧＡ遺伝子の塩基配列が設計通りのものであること
は、このＤＮＡ断片の＋鎖、一鎖の両鎖の全領域につい
て、公知のＤＮＡ塩基配列決定法［例えば、Ｆ．Ｓａｎ
ｇｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．７４，ｐ．５４６３（１
９７７）によるｄｉｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
法］により塩基配列を分析して、確認した。

【００２０】２−２分泌シグナルをもつＷＧＡ（プレ
ＷＧＡ）遺伝子の合成と発現用ベクターへの導入前述の様に、ＷＧＡ蛋白質は小麦中では成熟型ＷＧＡの
Ｎ−末端およびＣ−末端にそれぞれ分泌シグナルあるい
は１５アミノ酸からなる余分なペプチド（ＣＴ）をもっ
たプレプロ体として合成される。このうち、分泌シグナ
ルは蛋白質が生合成されるとともにＥＲ内腔に運ばれ、
その後、分泌経路を経て細胞外に輸送されるために必須
の機能をもっている。したがって、酵母でＷＧＡ蛋白質
を分泌発現させる際にもこの分泌シグナルを成熟型ＷＧ
ＡのＮ−末端側に付加する必要がある。分泌シグナルと
しては、勿論、インベルターゼや酸性フォスファターゼ
など酵母本来のシグナルも利用できるし、ニワトリ・リ
ゾチームのシグナルといった酵母以外（異種）のシグナ
ルも使用できる。また、分泌シグナルの構造とＥＲ膜の
透過性との解析結果から提案されている疎水性のアミノ
酸クラスターをもつ人工分泌シグナル［Ｙ．Ｙａｍａｍ
ｏｔｏｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．Ｖｏｌ．１４９，ｐ．４３
１（１９８７）］も使用できる。ここでは、これらの１
具体例として上記の人工分泌シグナルを使用したものに
ついて以下に説明するが、本発明はこれに限定されるも
のではない。

【００２１】人工分泌シグナルに相当するＤＮＡの塩基
配列およびこれを分割したオリゴヌクレオチド断片の構
成を配列番号３の配列の最上部に示した。なお、この配
列で、シグナルに相当する部分（−１５〜−１のアミノ
酸残基に相当する部分）の５’側の塩基配列は酵母のＥ
ＮＯ１遺伝子の転写開始点から翻訳開始点までの配列と
同一であり、かつ、この５’末端には制限酵素ＳａＩＩ
部位を、また、この３’側には成熟型ＷＧＡ蛋白質のＮ
末端側７〜８アミノ酸に相当する領域を含み、かつその
末端には制限酵素ＢａｍＨＩ部位をもっている（配列番
号３の配列のＳ１〜Ｓ４に相当する領域を参照）。な
お、これらのオリゴヌクレオチド断片の化学合成と酵素
的連結は公知の方法によって行った。一方、上記２−１
項でクローン化したＷＧＡ遺伝子は、成熟型ＷＧＡのＮ
末端側７〜８アミノ酸を欠失しており、その５’末端に
ＢａｍＨＩ部位を、またその３’末端には１７１番目の
アミノ酸および２ケの翻訳終止コドンの後にＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位をもっている。そこでシグナル部分とＷＧＡ遺
伝子部分の両者をＢａｍＨＩ部位で連結した後、プラス
ミドベクターｐＮＪ１０５３［このプラスミドベクター
はプラスミドｐＥＳＨ（Ｋ．Ｉｃｈｉｋａｗａｅｔ
ａｌ．，Ａｇｒｉ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．５
３，ｐ．１４４５〜１４４７（１９８９））のＨＬＹ遺
伝子部分をプラスミドｐＢＲ３２２のＳａｌＩ−Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ断片と置き換えたもの］のＳａｌＩ−Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ部位にクローン化した（図５）。なお、このプラ
スミドベクターｐＮＪ１０５３のＳａｌＩ部位は酵母の
ＥＮＯＩプロモーターの転写開始点の３’側に存在する
ため、この部位に翻訳開始コドンＡＴＧから始まる遺伝
子を挿入すれば、その転写と翻訳が効率的におこること
が確認されている［Ｋ．Ｉｃｈｉｋａｗａｅｔａ
ｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５
３，ｐ．１４４５−１４４７（１９８９）］。このプラ
スミドをｐＳＷ（ＳＩＧＮＡＬ−ＷＧＡの略）と命名し
た（図５参照）。なお、このようにして作成したシグナ
ルをもつプレＷＧＡ遺伝子のシグナル配列および連結部
分の塩基配列が設計通りであることは、前述のように、
公知の塩基配列決定法により、確認した。

【００２３】配列番号４には設計したＣＴペプチドをコ
ードするＤＮＡの塩基配列と合成オリゴヌクレオチド断
片の構成を示した。この領域の５’末端は制限酵素Ｓｍ
ａＩ／ＡｖａＩ部位をもっており、成熟型ＷＧＡ遺伝子
をＡＶａＩ切断したものと連結できるように設計してあ
る。ＣＴ１〜ＣＴ４で示した４つの断片を前述の方法に
よりハイブリダイズさせたのち、酵素的に連結した。こ
の連結生成物はその５’末端にＡＶａＩ部位を、またそ
の３’末端にはＨｉｎｄＩＩＩ部位をもっているた
め、先にクローン化したプラスミドｐＳＷ上のＷＧＡ遺
伝子を含むＳａｌＩ−ＡｖａＩ断片とＡｖａＩ部位で連
結した後、これをＭ１３ｍｐ１９ベクターのＳａｌＩ−
ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した。このクローン化ＤＮ
Ａ断片でシグナルを含む成熟型ＷＧＡ遺伝子とＣＴ部分
とが正しく連結していることはその塩基配列を上記の公
知の方法により調べることにより、確認した。このよう
にして作成した上記のＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片
は分泌シグナルをもつ成熟型ＷＧＡ遺伝子の３’末端に
ＣＴに相当するＤＮＡが連結したプレプロＷＧＡ遺伝子
の構造をもつものである。この遺伝子を発現させるため
のプラスミドとしては上記のＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ断片を酵母ＥＮＯ１プロモーターをもつプラスミドｐ
ＮＪ１０５３のＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入
することにより作成した（図５参照）。このプラスミド
はｐＳＷＣ（ＳＩＧＮＡＬ−ＷＧＡ−ＣＴの略）と命名
した。一方、酵母のα−ファクター遺伝子のプロモータ
ーとプレプロ領域を利用する分泌発現プラスミド［ｐＰ
Ｗ α−ｐｒｅｐｒｏ−ＷＧＡの略），ｐＰＷＣ（ｐＭ
Ｆα−ｐｒｅｐｒｏ−ＷＧＡ−ＣＴの略）〕の構築法に
ついては、図６に詳しくその手順を示した。なお、この
構築法の詳細については、実施例７を参照されたい。

【００２４】（３）形質転換と酵母によるＷＧＡ蛋白質
の分泌生産前項で記述した合成ＤＮＡ断片の「クローン化」は、実
際には得られた合成遺伝子を含むベクターを大腸菌など
の宿主を形質転換することにより達成される。形質転換
の方法それ自体は公知であり、宿主として大腸菌を用い
る場合は、例えばＣｏｈｅｎらの方法［Ｓ．Ｎ．Ｃｏｈ
ｅｎｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．６９，ｐ．２１１０（１９７
２）］により、又、宿主として酵母を用いる場合は、例
えば、Ｈｉｎｎｅｎらの方法［Ａ．Ｈｉｎｎｅｎｅ
ｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．７５，ｐ．１９２７（１９７
８）］やＩｔｏらの方法［Ｉｔｏｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１５３，ｐ．１６３−１
６８（１９８３）］によって、形質転換が可能であ
る。宿主としては、大腸菌では例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｃ６００［Ｎｅｌｓｏｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏ
ｌ．１０８，ｐ．３３８−３５０（１９８１）］であ
り、酵母での１具体例は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
ＫＫ４［Ｎｏｇｉｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．
Ｇｅｎｅｔ．，Ｖｏｌ．１９５，ｐ．２９−３４（１９
８４）］やヒト・リゾチームを多量菌体外に分泌するｓ
ｓｌｌ変異をもつＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであるＫＳ
−５８−２Ｄ［Ｓｕｚｕｋｉｅｔ．ａｌ．，Ｍｏ
ｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，Ｖｏｌ．２１９，ｐ．５８
−６４（１９８９）］である。なお、ヒト・リゾチーム
を高分泌する酵母変異株の取得法とそれを用いたヒト・
リゾチームの製造法については、前述の文献のほか、本
発明者の一部等により、特開昭６４−４７３７７号公報
にもその詳細が開示されている。また、ＷＧＡ遺伝子を
組み込んだ組換えプラスミドによる形質転換は上記の宿
主に限定されるものではなく、公知め種々のＳ．ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ誘導体（例えば、ＹｅａｓｔＧｅｎｅ
ｔｉｃＳｔｏｃｋＣｅｎｔｅｒカタログ参照）を
使用することができる。これらのものはＹｅａｓｔＧ
ｅｎｅｔｉｃＳｔｏｃｋＣｅｎｔｅｒおよび公認
の微生物機関、例えばＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ
ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されて
おりそこから分譲が可能である。

【００２５】なお、発現の宿主としては、酵母だけでな
く、カビなどの微生物がひろく利用できるほか、動物細
胞や昆虫細胞およびこれらで増殖複製するウィルスなど
を利用することもできる。また、発現用のベクターとし
ては各々の宿主に適した発現用プロモーターの下流に、
プレＷＧＡ遺伝子またはプレプロＷＧＡ遺伝子を挿入す
るためのＳａｌＩ切断部位を有するプラスミドが望まし
い。酵母における形質転換体の１具体例は、野生型Ｓ．
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＫＫ４またはｓｓｌｌ変異を
もつＫＳ−５８−２Ｄｄｅｌを上記のプラスミドｐＳＷ
またはｐＳＷＣで形質転換させて得た形質転換体、また
は同じ酵母をプラスミドｐＰＷまたはｐＰｗＣで形質転
換した形質転換体であって、本発明ではこれをそれぞ
れ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＫＫ４（ｐＳＷ）また
はＫＳ−５８−２Ｄｄｅｌ（ｐＳＷ）、Ｓ．ｃｅｒ
ｖｉｓｉａｅＫＫ４（ｐＳＷＣ）またはＫＳ−５８
−２Ｄｄｅ１（ｐＳＷＣ）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
ＫＫ４（ｐＰＷ）またはＫＳ−５８−２Ｄｄｅｌ（ｐ
ＰＷ）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＫＫ４（ｐＰＷ
Ｃ）またはＫＳ−５８−２Ｄｄｅｌ（ｐＰＷＣ）と
命名した。

【００２６】このようにして得た形質転換体を分子生物
学および発酵学の分野で公知の常法にしたがって培養す
ればＷＧＡ蛋白質が分泌生産される。酵母を使用する場
合の培地としては、例えばＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最少培
地［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳ
Ａ，Ｖｏｌ．７７，ｐ．４５０５（１９８０）］が挙げ
られる。培養は通常２０℃〜４０℃，好ましくは２５℃
〜３７℃で、２４〜１４４時間、好ましくは３６〜１２
０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を行ったり、炭素
源を逐次添加して補給することもできる。培養終了後、
それ自体は公知の方法で菌体と上清とを分離する。この
ようにして菌体内あるいは菌体外に産生されたＷＧＡ蛋
白質は通常の蛋白質精製法、例えば、塩析、等電点沈
澱、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル瀘過クロマト
グラフィー、高速クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、ＦＰ
ＬＣ）などにしたがって精製でき、目的のＷＧＡ蛋白質
を得ることができる。またこのようにして得たＷＧＡ蛋
白質の生物活性、例えば糖鎖の特異的な結合活性はＷＧ
Ａが特異的に結合することが公知であるＮ−アセチルグ
ルコサミンを含む糖蛋白質に対する結合活性を調べるこ
とにより確認することができる。具体的には、例えばオ
ボアルブミン蛋白質をマイクロタイタープレート上に吸
着させ、これに結合するＷＧＡ蛋白質を市販の抗ＷＧＡ
抗体を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡ法［渋谷直人、
バイオサイエンスとインダストリー、４７巻、ｐ．１３
０１−１３０２（１９８９）］により検出することがで
きる。また、ＷＧＡが細胞凝集活性をもつことはヒトま
たはウマの赤血球がＷＧＡ蛋白質の存在下で凝集するこ
とを肉眼で観察することにより確認することができる。
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。

【００２７】

【００２８】

【００２９】実施例１オリゴヌクレオチドの合成：Ｓ
１〜Ｓ４、１〜３２、およびＣＴ１〜ＣＴ４に相当する
各々のオリゴヌクレオチドフラグメントは、固相合成法
により、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製の
ＤＮＡ合成機（ｍｏｄｅｌ３９１）を用いて合成し
た。ホスホアミダイト試薬等の合成用試薬はすべてＡｐ
ｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のものを用い、
付属のオペレーターズマニュアルにしたがって使用し
た。合成したオリゴヌクレオチドは、核酸塩基と５’水
酸基が保護され、リン酸保護基が脱保護された状態でシ
リカゲル担体から切り出し、回収した。これらの保護デ
オキシオリゴヌクレオチド１ｍｌに、２８％アンモニア
水３ｍｌを加え、密栓容器中、６０℃、８〜１６時間処
理することにより、５’末端のジメトキシトリチル基以
外はすべて脱保護されたオリゴヌクレオチドを得た。溶
液中のアンモニアをＮ_２ガスを吹き付けて除去した後、
Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＳフィルター（ポアサイズ０．２２
μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）により瀘過し、Ｃ１８
逆相カラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ１８，（株）半
井化学製）を用いて高速液体クロマトグラフィーにより
分離・精製し、最も遅く溶出される画分を回収した。こ
の画分を２ｍｌに濃縮し、等量の酢酸を加えて、３０分
間放置し、ジメトキシトリチル基を除去した。酢酸をエ
ーテルによって抽出した後、上記の方法によりＣ１８逆
相クロマトグラフィーで精製し、４〜１３ＯＤ２６０
単位の完全に脱保護されたオリゴヌクレオチド約１４８
〜４８１μｇを得た。

【００３０】実施例２オリゴヌクレオチドのハイブリ
ッド形成とその酵素的連結：成熟体ＷＧＡＩＩ遺伝子２
本鎖のＡ、Ｂ、Ｃ＋Ｄブロックを作成するための酵素的
連結法の概略は図１〜図３に示してある。ここでは、そ
の詳細を記載する。５’末端が制限酵素サイトとなって
いるＮｏ．１，１８，１９，３２を除き、オリゴヌクレ
オチド各４０μｇを全液量が１００μｌで、しかも５０
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭＭ
ｇＣｌ２，１５ｍＭＤＴＴ，０．４ｍＭＮａ２ＥＤ
ＴＡ，１ｍＭＡＴＰの組成となるように調製し、Ｔ４
ポリヌクレオチドキナーゼ（ＥＣ２．７．１．７８）
（１６ｕｎｉｔ／μｌ，１μｌ）を加え、３７℃で、
１時間インキュベートした。反応液を飽和フェノールで
洗い、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）とエタノー
ルを加え、−８０℃で１０分間保ち、オリゴマーを沈澱
させ、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１
０ｍＭＭｇＣｌ２を含む１００μｌの緩衝液を加え
た。５’−位をリン酸化したｎ番目とｎ＋１番目（ｎ：
奇数）のオリゴマーを等モル混合し、６５℃で１０分
間、３７℃で２０分間、インキュベートした後、室温で
１０分間放置してアニーリングし、２本鎖を形成させ
た。図１〜図３の連結スキームにしたがって、隣接する
２本鎖を混合し、全液量が６０μｌで、しかも２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭＭｇＣ
１２，１ｍＭＡＴＰ，１０ｍＭＤＴＴになるように調
製し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＥＣ６．５．１．１）（５
ｕｎｉｔ／μｌ，２μｌ）を加え、２０℃で３０分間イ
ンキュベートして連結した。各連結段階では、反応液の
一部分をアクリルアミドゲル電気泳動に付し、反応の完
結と副反応の有無を確認した。Ｃ＋Ｄブロックについて
は、最終の連結段階で副反応による多数のバンドが認め
られたため、８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行い、目的とするバンドを含むゲルを切り出し、ゲルを
細片化したのち、遠心限外瀘過（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社
製、ウルトラフリーＣ３ＨＶ）にて溶出した。

【００３１】最終ステップの反応を終えたＡブロック断
片とゲルから溶出回収したＣ＋Ｄブロック断片は、フェ
ノールで洗い、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）
とエタノールを加え、−８０℃で１０分間保ち、沈澱さ
せた後、前述と同様にしてＴ４ＤＮＡキナーゼで５’末
端をリン酸化した。サブクローニングのために、Ａブロ
ックとＢブロックの末端部分は、制限酵素ＳｐｅＩおよ
びＡｐａＩで切り落とし、粘着末端を露出させた。具体
的には、ＢブロックについてはＤＮＡ断片２．１８ μ
ｇを、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１
０ｍＭＭｇＣｌ２，１ｍＭＤＴＴおよび１８単位の
ＡｐａＩを含む３００μｌの反応液中で３７℃で、１時
間反応させた後、２６．１μｌの１ＭＮａｃｌと２μｌ
のＳｐｅＩ（１０ｕｎｉｔ／μｌ）を加え、再び、３７
℃で１時間反応させた。また、Ａブロックについては、
ＤＮＡ断片３μｇを、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５），５０ｍＭＮａｃｌ，１０ｍＭＭｇＣｌ
２，１ｍＭＤＴＴおよび１０単位のＳｐｅＩを含む
５０μｌの反応液中で、３７℃、１時間反応させた。こ
のようにして制限酵素処理をしたＡブロックとＢブロッ
クは、フェノールで洗った後、エタノール沈澱を行っ
た。

【００３２】実施例３各ブロック断片のサブクローニ
ングファージスクリプト（Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ）ＳＫ
（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製；東洋紡：ＣｏｄｅＮ
ｏ．ＳＣ２２１２０１）１０μｇに５０ユニットのＡ
ｐａＩを加え、５０μｌの反応液（１０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭＭｇＣｌ２，１ｍ
ＭＤＴＴ）中で３７℃、１時間作用させた後、６．９５
μｌの１ＭＫＣｌと５μｌのＨｉｎｄＩＩＩ
（１０ｕｎｉｔ／μｌ）を加え、さｋに１時間反応させ
た。フェノールで除蛋白、冷エタノールで沈澱させた
後、０．７％アガロースゲル電気泳動を行い、目的の
バンドを含むゲル部分を切り出して、透析チューブ内に
封入し、泳動用緩衝液内に沈め、電気的に溶出した。こ
れを、フェノールで処理し、冷エタノールで沈澱させ
た。該ＤＮＡに実施例２で調製したＣ＋ＤブロックＤＮ
Ａ断片１９．２μｇを混合し、１００μｌの連結反応液
（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１
０ｍＭＭｇＣｌ２，１ｍＭＤＴＴ，１ｍＭＡＴ
Ｐ，Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、１２．５ユニット）中、１
６℃、１時間反応させて、ＤＮＡを連結した。このう
ち、半量を用い、大腸菌ＸＬｌ−Ｂｌｕｅ株（ＳＴＲＡ
ＴＡＧＥＮＥ社製；東洋紡：ＣｏｄｅＮｏ．ＳＣ２１
２３０１）にＣｏｈｅｎらの方法（Ｓ．Ｎ．Ｃｏｈｅｎ
ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．６９，ｐ．２１１０（１９７
２））にしたがって、形質転換した。プレート上の指標
大腸菌のプラークが、ＤＮＡ断片の挿入のないものでは
Ｘ−Ｇａｌの分解により青色を呈するのに対し、ＤＮＡ
断片の挿入のあるものでは無色になることを利用して目
的の形質転換体を選択し、この形質転換体の中から、ア
ルカリ抽出法（Ｈ．Ｃ．Ｂｉｒｎｂｏｉｍａｎｄ
Ｊ．Ｄｏｌｙ，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，Ｖｏ
ｌ．７，ｐ．１５１３（１９７９））によってプラスミ
ドを単離し、分子量および制限酵素による分解パターン
を調べ、ファージスクリプトＳＫのＡｐａＩ−Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ部位にＣ＋Ｄブロックの挿入されたプラスミ
ドを得た（図３）。

【００３３】同様の方法によって、ＡブロックとＢブロ
ックのＤＮＡ断片は、ファージスクリプトＳＫのＢａｍ
ＨＩ−ＸｂａＩ部位、ブルースクリプト（Ｂｌｕｓｃｒ
ｉｐｔ）ＫＳ（＋）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製；東洋
紡：ＣｏｄｅＮｏ．ＳＣ２１２２０７）のＳｐｅＩ−
ＡｐａＩ部位に各々挿入した。ＡブロックＤＮＡ断片は
両端にＢａｍＨＩサイトとＳｐｅＩサイトを持つことか
ら、最初はファージスクリプトＳＫのマルチクローニン
グサイトのＢａｍＨＩ−ＳｐｅＩ部位に導入することを
試みたが、成功しなかった。ＢａｍＨＩとＳｐｅＩ部位
が隣接しているため、ＢａｍＨＩとＳｐｅＩの両制限酵
素で切断されなかったためと思われる。そこで、Ｓｐｅ
Ｉ部位と同一の粘着末端をもつＸｂａＩ部位を用いて、
ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ部位に挿入した（図１、図２参
照）。各ブロックＤＮＡ断片の塩基配列は、既知のデオ
キシヌクレオチド法（Ｆ．Ｓａｎｇｅｒｅｔａ
ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，Ｖｏｌ．７４，ｐ．５４６３（１９７７））による
ＤＮＡ塩基配列を両ストランドの全域について分析する
ことにより、設計通りであることを確認した。

【００３４】実施例４ＷＧＡ遺伝子のサブクローニン
グ：Ｃ＋ＤブロックＤＮＡ断片を導入したファージスク
リプトＳＫ５００μｇを、５００ｕｎｉｔの制限酵素Ａ
ｐａＩを含む反応液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５），１０ｍＭＭｇＣｌ２，１ｍＭＤＴＴ）
１．２ｍｌ中、３７℃、２時間反応させた後、８６．１
μｌの１ＭＫＣｌと３８．５μｌのＨｉｎｄＩＩＩ
（１０ｕｎｉｔ／μｌ）を加え、さらに３７℃、一
夜反応させた。フェノールによる除蛋白、エタノール沈
澱の後、８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、
０．２７ＫｂのＣ＋ＤブロックＤＮＡ断片を回収した。
ＡブロックＤＮＡ断片に関しては、基本的にはＣ＋Ｄブ
ロックと同様であるが、この断片がファージスクリプト
ＳＫのＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ部位に導入されているこ
とから、マルチクローニングサイトのＸｂａＩ部位の外
側にあるＳａｃＩ部位を用いて、一担、ＡブロックのＤ
ＮＡ断片を含むＢａｍＨＩ−ＳａｃＩによる２重消化に
よって、ＤＮＡ断片を切り出した。そしてこの断片をさ
らに、ＳｐｅＩにより生じる４ｂａｓｅの粘着末端部分
と同じ塩基配列を認識するＭａｅＩにより消化し、Ｂａ
ｍＨＩとＭａｅＩ部位の両末端をもつＡブロックＤＮＡ
断片を得た。ＢブロックＤＮＡ断片に関しても、Ａブロ
ックＤＮＡ断片と連結するために、末端に同じＭａｅＩ
の切り口をもつ必要があることから、ＢブロックＤＮＡ
断片を導入したＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（＋）か
ら、一度、ＳａｃＩ−ＡｐａＩによる２重消化を行った
のち、これをさらにＭａｅＩで消化することにより、Ｍ
ａｅＩとＡｐａＩの両末端をもつＢブロックＤＮＡ断片
を得た。

【００３５】このようにして調製したＡブロック、Ｂブ
ロック、Ｃ＋Ｄブロックの各ＤＮＡ断片は図４のように
して連結した。ＢブロックとＣ＋ＤブロックＤＮＡ断片
を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含む実施例２に記載し
た反応液３５０μｌ中で、１６℃、一夜反応させた。フ
ェノール処理、エタノール沈澱の後、ＭａｅＩ３０ｕｎ
ｉｔを含む反応液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０），２５０ｍＭＮａｃｌ，６ｍＭＭｇＣｌ
２，７ｍＭ β−メルカプトエタノール，１００μｇ／
ｍｌＢＳＡ）１５０μｌ中、４５℃、１時間反応させた
後、８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、０．
３９ｋｂのＢ＋（Ｃ＋Ｄ）ブロックＤＮＡ断片を回収し
た。次に、ＡブロックＤＮＡ断片とＢ＋（Ｃ＋Ｄ）ブロ
ックＤＮＡ断片とを混合し、上記と同様の方法で連結反
応を行いＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩによる二重消化を
した後、フェノール処理、エタノール沈澱を行い、Ａ＋
Ｂ＋（Ｃ＋Ｄ）ブロックＤＮＡ断片、即ち、成熟体型Ｗ
ＧＡ遺伝子を作成した。一方、ｐＵＣ１８プラスミド
（東洋紡：ＣｏｄｅＮｏ．ＰＵＣ−０１８）１０μｇ
を、３０ｕｎｉｔのＨｉｎｄＩＩＩを含む反応液（１
０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭＭ
ｇＣｌ２，１ｍｍＤＴＴ，６５ｍＭＫＣｌ）１００
μｌ中、３７℃、一夜反応させ、０．７％アガロースゲ
ル電気泳動により、線状化したプラスミドＤＮＡを回収
した。この５μｇと上記、成熟体型ＷＧＡ遺伝子（Ａ＋
Ｂ＋（Ｃ＋Ｄ））４５μｇとを混ぜ、上記と同様の方法
にて連結反応を行った。該ＤＮＡを用い、大腸菌ＪＭ１
０９株（東洋紡：ＣｏｄｅＮｏ．ＤＮＡ−９００）に
Ｃｏｈｅｎらの方法にしたがって形質転換した。アンピ
シリン耐性を指標にして選択した形質転換体の中から、
アルカリ抽出法によってプラスミドＤＮＡを単離し、そ
の分子量および制限酵素による分解パターンを調べるこ
とにより、成熟体型ＷＧＡ遺伝子の導入されたプラスミ
ドを取得した。

【００３６】実施例５成熟体型ＷＧＡ遺伝子分泌発現
用プラスミドの構築：図５に構築の概略を示した。具体
的には以下に記す。酵母を用いた異種蛋白質の分泌発現
用に改良した人工シグナル配列（Ｙ．Ｙａｍａｍｏｔｏ
ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ
ｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．Ｖｏｌ．１４９，ｐ．４３１（１
９８７））をコードするオリゴヌクレオチドＳ１〜Ｓ４
を実施例１に記載した方法にしたがって合成した。これ
らのフラグメントは、実施例２に記載した方法にしたが
って、Ｓ２とＳ３をリン酸化し、アニーニングと連結を
行った後、再び、末端をリン酸化した。一方、実施例４
で作成した成熟体型ＷＧＡ遺伝子を挿入したｐＵＣ１８
プラスミド２００μｇを、同じく実施例４で記載した場
合と同様、制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩの２重
消化を行った後、８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
を行い、０．５ｋｂの成熟体型ＷＧＡ遺伝子断片を回収
した。シグナル部分（Ｓ１〜Ｓ４）のＤＮＡ断片と成熟
体型ＷＧＡ遺伝子断片とを等モル混合し、実施例１に記
載した方法にしたがって、連結した。フェノール処理、
エタノール沈澱の後、４０ｕｎｉｔのＨｉｎｄＩＩＩ
を含む反応液（６５ｍＭＫＣｌ，１０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭＭｇＣｌ２，１ｍ
ＭＤＴＴ）１００μｌ中、３７℃、１時間反応させ、
さらに、９μｌ１ＭＫＣｌ，８μｌｄＨ２０，３μ
ｌＳａｌＩ（１５ｕｎｉｔ／μｌ）を加え、３７℃、
１時間反応させ、再びフェノール処理、エタノール沈澱
を行い、分泌シグナルを連結したＷＧＡ遺伝子（ＳＩＧ
−ＷＧＡ）６μｇを得た。

【００３７】一方、プラスミドｐＮＪ１０５３を上記
と同様、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩで２重消化
し、反応物を０．７％アガロースゲル電気泳動によって
分離し、８．６ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。このプラ
スミドＤＮＡ０．０４μｇと上記ＳＩＧ−ＷＧＡ遺伝子
の半量とを混合し、実施例３に記載した方法にしたがっ
て、連結反応を行った。これを、大腸菌ＸＬｌ−Ｂｌｕ
ｅ株にＣｏｈｅｎらの方法にしたがって、形質転換し
た。アンピシリン耐性を指標として選択した形質転換体
の中から、アルカリ抽出法によってプラスミドを単離
し、分子量および制限酵素による分解パターン調べるこ
とにより、ｐＮＪ１０５３の酵母ＥＮＯ１プロモーター
下流のＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に、ＳＩＧ−ＷＧ
Ａ遺伝子が挿入された、酵母での成熟体型ＷＧＡ遺伝子
分泌発現プラスミドｐＳＷ１．１４５ｍｇを得た。

【００３８】実施例６前駆体ＷＧＡ蛋白質遺伝子分泌
発現用プラスミドの構築：構築の概略は図５の後半部分
に示した。ＣＴペプチドをコードしたオリゴヌクレオチ
ドＣＴ１〜ＣＴ４を、実施例１に記載した方法にしたが
って合成した。つぎに、実施例２に記載した方法にした
がって、ＣＴ２とＣＴ３をリン酸化し、ＣＴ１とＣＴ２
およびＣＴ３とＣＴ４をアニーリング、連結したのち、
再び末端のリン酸化を行い、ＣＴペプチドをコードする
ブロックＤＮＡ断片を得た。一方、実施例５で作成した
ｐＳＷプラスミド３３０μｇを、実施例５に記載した方
法にしたがって、制限酵素ＳａｌＩとＨｉｎｄＩＩＩ
で２重消化し、８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行い、０．５８ＫｂのＳＩＧ−ＷＧＡ遺伝子断片を回
収した。このＳＩＧ−ＷＧＡ遺伝子断片１８μｇを、２
０ｕｎｉｔの制限酵素ＡｖａＩを含む反応液（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭＭｇＣｌ
２，１ｍＭＤＴＴ，２５ｍＭＮａｃｌ）１００μｌ
中、３７℃、２時間反応させた後、８％ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行い、０．５３ＫｂのＤＮＡ断片を
回収した。このＤＮＡ断片６．４μｇと上記ＣＴペプチ
ドをコードするＤＮＡ断片１．６μｇを混合し、実施例
２に記載した方法により連結した後、前述と同様、制限
酵素ＳａｌＩとＨｉｎｄＩＩＩで２重消化した。５％
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、分泌シグナル
とＣＴペプチドを有する０．６３ＫｂのＷＧＡ遺伝子
（ＳＩＧ−ＷＧＡ−ＣＴ遺伝子）断片２．１μｇを回収
した。次に、プラスミドＭ１３ｍｐ１９（東洋紡：Ｃｏ
ｄｅＮｏ．Ｍ１３−０１９）２０μｇを、前述と同
様、制限酵素ＳａｌＩとＨｉｎｄＩＩＩで２重消化
後、０．８％アガロースゲル電気泳動を行い、７．５ｋ
ｂのプラスミドＤＮＡ断片を回収した。このプラスミ
ドＤＮＡ０．４μｇと上記ＳＩＧ−ＷＧＡ−ＣＴ遺伝子
断片２μｇを混合し、実施例２に記載した方法にしたが
って連結した。これを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株にＣｏ
ｈｅｎらの方法により形質転換した。実施例３に記載し
た様にＸ−ｇａｌの分解による青色を呈せず、ＤＮＡ断
片の挿入により無色となったファージの中から、アルカ
リ抽出法によってプラスミドを単離し、分子量および制
限酵素による分解パターンを調べ、Ｍ１３ｍｐ１９のＳ
ａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にＳＩＧ−ＷＧＡ−ＣＴ遺
伝子断片が導入されたプラスミドを得た。このファー
ジから、ｓｓＤＮＡを回収し、既知のｄｉｄｅｏｘｙｎ
ｕｃｌｅｏｔｉｄｅ法によるＤＮＡ塩基配列によっ
て、ＳＩＧ−ＷＧＡ−ＣＴ遺伝子の塩基配列が設計通り
であることを確認した。

【００３９】さらに、上記ＳＩＧ−ＷＧＡ−ＣＴ遺伝子
を導入したＭ１３ｍｐ１９から、前述と同様、制限酵素
ＳａｌＩとＨｉｎｄＩＩＩで２重消化した後、５％ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を行い、０．６３ｋｂの
ＳＩＧ−ＷＧＡ−ＣＴ遺伝子断片を回収した。このＤＮ
Ａ断片と実施例５で調製したＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ部位を欠失したｐＮＪ１０５３とを実施例５に記載し
た方法で連結した。これを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株に
Ｃｏｈｅｎらの方法にしたがって形質転換し、アンピシ
リン耐性を指標として選択した形質転換体の中から、ア
ルカリ抽出法によってプラスミドを単離し、分子量およ
び制限酵素による分解パターンを調べ、ｐＮＪ１０５３
の酵母ＥＮＯ１プロモーター下流のＳａｌＩ−Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ部位にＳＩＧ−ＷＧＡ−ＣＴ遺伝子の挿入され
た、前駆体ＷＧＡ蛋白質分泌発現用プラスミドｐＳＷＣ
を得た。

【００４０】実施例７酵母のα−ファクター遺伝子の
プロモーターとプレプロ領域を利用する成熟型ＷＧＡ遺
伝子およびプロＷＧＡ遺伝子の分泌発現用プラスミドの
構築：構築の概略は図６に示した。具体的には以下のよ
うにして行った。ＥｃｏＲＩ部位にα−ファクターのプ
ロモーターから構造遺伝子全領域を含む１．７ＫｂのＤ
ＮＡ断片をもつｐＬＳ０１プラスミド［Ｋ．Ｉｎｏｋｕ
ｃｈｉｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，Ｖｏｌ．７，ｐ．３１８５−３１９３（１９８
７）］２６０μｇを３００ｕｎｉｔの制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩと６００ｕｎｉｔのＨｉｎｄＩＩＩを含む反応
液（１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ７．５），１
０ｍＭＭｇＣｌ２，１ｍＭＤＴＴ，７５ｍＭＫＣ
ｌ）中で、３７℃、一夜反応させた後、０．７％アガロ
ースゲル電気泳動にて、酵母α−ファクターのプロモー
ターからプレプロ領域を含む１．２ＫｂのＤＮＡ断片
を回収した。このＤＮＡ断片の末端のＥｃｏＲＩ部位を
ＳａｌＩ部位に変換するため、実施例１に記載した方法
にしたがって、ＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩアダプターを合成した。上記のアダプター２０μｇに４０ｕｎｉｔ
のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡（株）製）を
１００μｌの反応液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５），１０ｍＭＭｇＣｌ２，１５ｍＭＤＴＴ，
０．４ｍＭＮａ２ＥＤＴＡ，１ｍＭＡＴＰ）中で３
７℃、１時間作用させ、５’末端をリン酸化した。この
１μｇのアダプターと、４０μｇの上記 α−ファクタ
ーのプロモーターからプレプロ領域のＤＮＡ断片を混合
し、実施例２記載の条件下でＴ４ＤＮＡリガーゼの作用
で結合させた後、制限酵素ＳａｌＩとＨｉｎｄＩＩＩで
消化した。次に８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
を行い、末端にＳａｌＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位を
有する、α−ファクターのプロモーターからプレプロ領
域のＤＮＡ断片を回収した。上記断片のα−ファクター
のプレプロ領域と成熟体及び前駆体ＷＧＡ遺伝子とをイ
ンフレームで連結するために、実施例１記載の方法にし
たがって下記の合成アダプターを合成した。各オリゴヌクレオチド４０μｇを上記と同
様Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを作用させ５’末端
をリン酸化した後、このＤＮＡ８μｇと上記α−ファク
ターのプロモーターからプレプロ領域を含むＤＮＡ断片
２５μｇを混合し、実施例２記載の条件下でＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを作用させ連結した。これを制限酵素Ｓａｌ
Ｉ及びＢａｍＨＩで二重消化した後、０．８％アガロー
スゲル電気泳動を行い、ＷＧＡ遺伝子との連結部をも
ち、かつα−ファクターのプロモーターからプレプロを
含む約１．２ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。

【００４１】一方、実施例４で作成した、成熟型ＷＧＡ
遺伝子を挿入したｐＵＣ１８プラスミド２００μｇ
を、２００ユニットの制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩを含む
２００μｌの反応液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５），１０ｍＭＭｇＣｌ２，１ｍＭＤＴＴ，
６５ｍＭＫＣｌ）中で、３７℃、１時間３０分間反応
させた後、１８μｌ１ＭＫＣｌ，６μｌｄＨ２
０，１６μｌＢａｍＨ１（２００ユニット）を加え、
さらに１時間反応させた。これを８％ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行い、０．５ｋｂの成熟型ＷＧＡ遺
伝子を回収した。このＤＮＡ断片３０μｇと、上記ＷＧ
Ａ遺伝子との連結部をもち、α−ファクターのプロモー
ターからプレプロ領域を含むＤＮＡ断片１０μｇとを混
合し、実施例２記載の条件下でＴ４ＤＮＡリガーゼの作
用で結合させた。これを制限酵素ＳａｌＩとＨｉｎｄ
ＩＩＩで二重消化の後、０．８％アガロースゲル電気泳
動を行い、ＤＮＡをゲルから回収し、α−ファクターの
プロモーター下にプレプロ領域とインフレームで連結さ
れた成熟型ＷＧＡ遺伝子（ＭＦα−ＷＧＡ遺伝子）を得
た。このＤＮＡ断片を、実施例６と同様の方法で、Ｍ１
３ｍｐ１９のＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に
挿入した。このファージから、ｓｓＤＮＡを回収し、Ｍ
Ｆα−ＷＧＡ遺伝子の塩基配列を、既知のデオキシヌク
レオチド法によるＤＮＡ塩基配列分析によって確認し
た。ＭＦα−ＷＧＡ及びＭＦ α−ＷＧＡ−ＣＴ遺
伝子の酵母での発現ベクターは、以下のようにして構築
した。ｐＮＪ１０５３１００μｇを、１０５ユニット
の制限酵素ＳｍａＩを含む２００μｌの反応液（１０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），７ｍＭＭｇＣ
ｌ２，２０ｍＭＫＣｌ，７ｍＭ２−ｍｅｒｃａｐｔ
ｏｅｔｈａｎｏｌ，１００μｇ／ｍｌＢＳＡ）中、３
０℃、１時間反応させた後、実施例１記載の方法にした
がって合成し、５’末端をリン酸化したＳａＩＩリンカ
ー０．３μｇと混ぜ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを作用させて連
結した。これを再び、ＳｍａＩで消化した後、Ｃｏｈｅ
ｎらの方法にしたがって、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅに形
質転換した。アンピシリン耐性を指標として選択した形
質転換体の中から、アルカリ抽出法によってプラスミド
を単離し、ＳａｌＩ消化によって０．９５ＫｂのＤＮ
Ａ断片が生じることを確認し、ｐＮＪ１０５３のＳｍａ
Ｉ部位にＳａｌＩリンカーを導入したｐＮＪ１０５４を
得た。このｐＮＪ１０５４３７．５μｇを、実施例５
記載の条件下で制限酵素ＳａｌＩとＨｉｎｄＩＩＩで二
重消化した後、０．８％アガロースゲル電気泳動にて
ＥＮＯ１プロモーターを欠いた７．３ＫｂのＤＮＡを得
た。このベクター側ＤＮＡ２μｇと前述のＭ１３ｍｐ１
９のＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位間のＭＦα−ＷＧ
ＡをＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩの二重消化によって
切り出したＤＮＡ断片１．５μｇとを混合し、実施例２
記載の方法にしたがってＴ４ＤＮＡリガーゼを作用さ
せ、連結した。このＤＮＡをＣｏｈｅｎらの方法にした
がって、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅに形質転換した後、ア
ンピシリン耐性を指標として選択した形質転換体の中か
らアルカリ抽出法によってプラスミドを単離し、制限酵
素による分解パターンを調べ、酵母α−ファクターのプ
レプロ領域をもつ成熟型ＷＧＡ蛋白質分泌発現プラスミ
ド（ｐＰＷ）１８２．５μｇを得た。一方、ＣＴペプチ
ドを有する前駆体ＷＧＡに関しても、上記と全く同様
の方法により、酵母α−ファクターのプレプロ領域をも
つ発現プラスミド（ｐＰＷＣ）２４５μｇを作成した。

【００４２】実施例８酵母形質転換体の調製４種の成熟体及び前駆体ＷＧＡ遺伝子分泌発現用プラス
ミドｐＳＷ，ｐＳＷＣ，ｐＰＷ及びｐＰＷＣを用いて
酵母野生株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅＫＫ４株（ＭＡＴ α，ｕｒａ３，ｈｉｓ
１，ｏｒｈｉｓ３，ｔｒｐ，ｌｅｕ２，ｇａｌ８０）
または高分泌酵母変異株ＫＳ−５８−２Ｄｄｅｌ株
（ＭＡＴ α，ｌｅｕ２，ｕｒａ３，ｈｉｓ，ｓｓｌ
ｌ）を、既知の酢酸リチウム法（例えば、Ｉｔｏｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１５
３，ｐ．１６３（１９８３））で形質転換し、該プラス
ミドを保持するロイシン非要求性の形質転換体を得た。
これらの形質転換体を各々Ｓ．ｃ．ＫＫ４（ｐＳＷ），
Ｓ．ｃ．ＫＫ４（ｐＳＷＣ），Ｓ．ｃ．ＫＫ４（ｐＰ
Ｗ），及びＳ．ｃ．ＫＫ４（ｐＰＷＣ），およびＳ．
ｃ．ＫＳ−５８−２Ｄｄｅｌ（ｐＳＷ），Ｓ．ｃ．Ｋ
Ｓ−５８−２Ｄｄｅｌ（ｐＳＷＣ），Ｓ．ｃ．ＫＳ−５
８−２Ｄｄｅｌ（ｐＰＷ），及びＳ．ｃ．ＫＳ−５８−
２Ｄｄｅｌ（ｐＰＷＣ）と命名した。また、発現の有無
をチェックするコントロールとして、ＷＧＡ遺伝子を持
たないプラスミドｐＮＪ１０５３をもつＫＫ４株とＫＳ
−５８−２Ｄｄｅｌ株（各々ＫＫ４（ｐＮＪ１０５３）
およびＫＳ−５８−２Ｄｄｅｌ（ｐＮＪ１０５３）と
命名した）も同様の方法により作成した。

【００４３】ここで得られる形質転換体は工業技術院微
生物工業技術研究所に寄託している。その寄託番号は次
の通りである。Ｓ．ｃ．ＫＳ−５８−２Ｄｄｅｌ（ｐＳＷ）微工研菌寄第１２４４４号Ｓ．ｃ．ＫＳ−５８−２Ｄｄｅｌ（ｐＳＷＣ）微工研菌寄第１２４４２号Ｓ．ｃ．ＫＳ−５８−２Ｄｄｅｌ（ｐＰＷ）微工研菌寄第１２４４３号Ｓ．ｃ．ＫＳ−５８−２Ｄｄｅｌ（ｐＰＷＣ）微工研菌寄第１２４４１号

【００４４】実施例９分泌発現プラスミドをもった酵
母野生株および高分泌変異株の培養実施例８で作成した種々のプラスミドをもつ酵母形質転
換体は、それぞれ、ロイシンを除いた各種アミノ酸（終
濃度２０〜３７５ｍｇ／ｌ）と過剰量のヒスチジン（終
濃度４００ｍｇ／ｌ）、アデニンサルフェイト（終濃度
２０ｍｇ／ｌ）、過剰量のウラシル（終濃度４００ｍｇ
／ｌ）を含む最小培地（Ｄｉｆｃｏ社製、アミノ酸不含
バクト酵母窒素塩基）（Ｓｈｅｒｍａｎｅｔａ
ｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＹｅａｓｔＧｅｎｅｔ
ｉｃｓ，ｐ．６２，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ
ｏｕｒ（１９８２）参照）に炭素源として８％グルコー
スを加え３０℃で５日間、振盪培養を行った。

【００４５】実施例１０分泌生産されたＷＧＡ蛋白質
のウェスタンブロット法による解析実施例９の方法により、３０℃、５日間培養した培養液
４０ｍｌを取り、遠心分離して酵母細胞を除き、培養上
清画分を得た。これを凍結乾燥の後、５ｍｌの脱イオン
水に溶解し、脱イオン水に対して充分透析した。再度、
凍結乾燥と透析を行い、３３３倍に濃縮した。このう
ち、１５μｌ（５ｍｌ培養上清に相当する）に同量のＬ
ａｅｍｍｌｉ’ｓｂｕｆｆｅｒ〔８０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ６．８），２％ＳＤＳ，１０％グリセロ
ール、１００ｍＭＤＴＴ，２ｍＭＰＭＳＦ，０．０
０１％ＢＰＢ〕を加え、１０分間煮沸した。急冷後、全
量３０μｌをＳＤＳ−１５％ＰＡＧＥに掛け、１５０Ｖ
で３時間電気泳動した。泳動後、分泌された蛋白質をＰ
ＶＤＦメンブランフィルター（イモビロン、ミリポア社
製）へ転写した。具体的には、アトー社製のトランスブ
ロット装置を用いて、転写用緩衝液（２５ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１９２ｍＭｇｌｙｃｉｎ
ｅ，０．１％ＳＤＳ，１５％ｍｅｔｈａｎｏｌ）中
で、１０Ｖ、１時間、転写させた。得られたメンブラン
フィルターをＴＢＳ緩衝液（１００ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭＮａＣｌ）に１０分
間浸した後、ブロッキング溶液（ＴＢＳに３％のゼラチ
ンを溶解したもの）に入れ、３０分間振盪した。次に、
ウサギ抗ＷＧＡ抗体（ＳＩＧＭＡ社製、ＬｏｔＮｏ．
１２８−８８１０）の５００倍希釈溶液中に上記のメン
ブランフィルターを入れ、一夜ゆっくりと振盪した後、
ＴＴＢＳ（ＴＢＳに０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を加えた
もの）で１０分間ずつ、２回、ゆっくり振盪しながら洗
浄した。得られたメンブランフィルターを１２５Ｉ−
ｐｒｏｔｅｉｎＡ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＮｕｃ
ｌｅａｒ社ＮＥＸ１４６Ｌ１０）溶液中に入れ、１時間
かるく振盪して反応させた後、ＴＴＢＳで１０分、ＴＢ
Ｓで１０分、ゆっくり振盪しながら洗浄した。得られた
メンブランフィルターを乾燥後、オートラジオグラフィ
ーで検出した。

【００４６】結果は図７に示した通りで、市販のＷＧＡ
標準品（（株）ホーネンコーポレーション製）と同一の
移動度を示す位置に、抗ＷＧＡ抗体と反応する鮮明な単
一のバンドが確認された。プラスミドｐＳＷをもつ酵母
で市販のＷＧＡ標準品と同一サイズのＷＧＡを生成する
ことから、人工分泌シグナルは酵母内でＷＧＡとの融合
部分で正しく切断されることがわかった。さらに、ＣＴ
ペプチドを有する前駆体ＷＧＡ分泌発現用プラスミドｐ
ＳＷＣをもつ酵母でも、ＷＧＡ標準品と同じ位置にバン
ドが検出され、その分泌量はＣＴペプチドをもたないｐ
ＳＷの場合の約２倍であることは特筆すべきことであ
る。このことは、ＣＴペプチドの付加が分泌量の増加に
効果のあることを示すとともに、小麦胚芽中と同様、酵
母細胞内でもプレプロＷＧＡからＣＴペプチド部分が切
断されることを示している。また、上記の結果はＭＦα
のプレプロ領域に融合したＷＧＡ蛋白質も融合部位で正
しく切断され、ＷＧＡ標準品と同一の分子量を与えるこ
とを示している。但し、ＷＧＡの分泌量はＭＦαのプレ
プロ型よりもＥＮＯ１プロモーターと人工分泌シグナル
の組み合せ型のほうが有意に高かった。さらに、注目す
べきことは、ヒト・リゾチームを高分泌する変異株とし
て単離した酵母変異株であり、液胞蛋白質を細胞外にミ
スソーティングする変異ｓｓｌｌをもつ株であるＫＳ−
５８−２ＤｄｅｌのＷＧＡ蛋白質分泌量が、野生株ＫＫ
４に比べて約２０倍以上高いことである。この結果は明
かに、液胞への蛋白質輸送に欠損をもつ変異株の利用が
ＷＧＡの分泌生産に有利であることを示している。な
お、ＷＧＡ蛋白質の分泌量が最も多かったのはＫＳ−５
８−２Ｄｄｅｌ（ｐＳＷＣ）を用いた場合で、その分泌
量は約２００μｇ／ｌであった。

【００４７】実施例１１分泌生産されたＷＧＡ蛋白質
の分離・精製酵母形質転換体ＫＳ−５８−２Ｄｄｅｌ（ｐＳＷＣ）
を、実施例９の培地６Ｌ中で３０℃、５日間培養した。
培養液を遠心分離して酵母細胞を除き、培養上清画分を
得た。この上清画分を凍結乾燥の後、少量（１００〜１
５０ｍｌ）の脱イオン水を加え、２０ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ４．０）に対して充分に透析した。透析後、濃縮
脱塩した試料をＦＰＬＣシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
社製）を用い、陽イオン交換カラムＭｏｎｏＳＨＲ
５／５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）で分離した。実
施例１２で述べる糖鎖の結合活性をもつ画分は１ｍｌ／
ｍｉｎの流速で２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）存在
下、０．０１ＭＮａＣｌ／ｍｉｎのＮａＣｌ直線濃度
勾配にかけることによって、約２０〜４０分に溶出され
た。以上のクロマトグラフィーにおける溶出パターンと
活性画分の位置を図８に示した。この活性画分を集め、
遠心限外瀘過器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、ウルトラフ
リー２０、再生セルロース膜）により、２０ｍＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）緩衝液にバッファー交換
した後、陰イオン交換カラムＭｏｎｏＱＨＲ５／５
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）で分離した。１ｍｌ／ｍｉ
ｎの流速で２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）
緩衝液存在下、６０分間の０〜０．３ＭＮａＣｌの直線
濃度勾配で溶出した。この時の溶出パターンと各画分の
活性を図９に示した。活性を有する画分を遠心限外瀘過
器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、ウルトラフリーＣＬ、Ｕ
ＦＣ４ＬＧＣ２５、再生セルロース膜）により、２０ｍ
Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．８）に置換し、再び、陽イ
オン交換カラムＭｏｎｏＳＨＲ５／５（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ社）で分離した。１ｍｌ／ｍｉｎの流速で２０ｍ
Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．８）存在下、０．０１Ｍ
ＮａＣ１／ｍｉｎのＮａＣｌ直線濃度勾配で溶出した。
図１０にこの溶出パターンを示したが、糖鎖結合活性は
約２７分で溶出する主要ピークに検出された。また、市
販のＷＧＡ標品（ＷＧＡＩ，ＩＩ，ＩＩＩの混合物）を
陽イオン交換カラムＭｏｎｏＳにより上記と同一のＮ
ａｃｌ直線濃度勾配で分離精製した。図１１にこの時の
ＷＧＡイソレクチン蛋白質の分離パターンを示したが、
組換えＷＧＡ蛋白質の溶出位置は約２７分で溶出するＷ
ＧＡＩＩの溶出位置と一致していた。上記クロマトグラ
フィーによる組換えＷＧＡ分離精製におけるメインピー
ク（図１０参照）を分取し、ＳＤＳ−１５％ＰＡＧＥを
行った結果が図１２である。クマシーブリリアントブル
ーによる染色により、組換え体酵母の分泌生産するＷＧ
Ａ蛋白質試料からは標準ＷＧＡＩＩ蛋白質と同一の移
動度を示す単一のバンドのみが検出された。なお、この
ようにして精製した組換えＷＧＡＩＩ蛋白質の収量は
約１００μｇ／ｌであった。

【００４８】実施例１２分泌生産されたＷＧＡ蛋白質
の糖鎖結合活性の検出図１３にＷＧＡ蛋白質の糖鎖結合活性の検出法を示し
た。９６穴のマイクロタイタープレート（ＥＬＩＳＡ用
プレートＦ−ＦＯＲＭ，グライナー社製）の各ウエル
に、１％オボアルブミン（ＳＩＧＭＡ社製、５Ｘ結晶）
のＰＢＳ溶液を１００μｌずつ加え、室温で１時間放置
し、プラスチック表面をオボアルブミンでコートした。
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで１００
μｌずつ３回洗浄したのち、種々の濃度の精製した組換
えＷＧＡＩＩ蛋白質または実施例１１に示した方法によ
り市販のＷＧＡ標品から分離精製したＷＧＡＩＩ蛋白質
を含むＰＢＳ溶液５０μｌを加え、室温で、１時間放置
した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳ溶液で
１００μｌずつ３回洗浄後、抗ＷＧＡ抗体（ＳＩＧＭＡ
社製、Ｌｏｔ．Ｎｏ．１２８Ｆ８８１０）の１５０倍希
釈ＰＢＳ溶液５０μｌを加え、室温で１時間放置した。
再度上記と同様に洗浄した後、二次抗体として、抗ウサ
ギＩｇＧ抗体とアルカリフォスファターゼのコンジュゲ
ート（Ｅ．Ｙ．ラボラトリーズ社）の３００倍希釈ＰＢ
Ｓ溶液５０μｌを加え、室温で１時間放置した。洗浄
後、ｐ−ニトロフェニルフォスフェート１ｍｇ／ｍｌを
含むジエタノールアミン緩衝液（ジエタノールアミン
９．７％ｖｏｌ，０．５ｍＭＭｇＣｌ２，３ｍＭＮ
ａＮ３，ｐＨ９．５）を５０μｌ加え、室温でｐ−ニト
ロフェノールの発色を観察した。発色を１ＮＮａＯＨ
５０μｌを加えて止め、マイクロタイタープロートリー
ダー（コロナ社、ＭＴＰ−３２）にて４１５ｎｍの吸光
度を測定した。結果は図１４の如く、組換えＷＧＡは標
準ＷＧＡＩＩと同一の糖鎖結合比活性（蛋白質当りの糖
鎖結合能）を示した。なお、蛋白質の定量は、ＢＣＡ蛋
白質定量試薬（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用い、付属のプロ
トコールにしたがって行った。ＷＧＡに関する限り、Ｂ
ＣＡ法はクマシーブリリアント法に比べて、約７０倍感
度が高かった。以上の結果から、酵母で分泌生産された
ＷＧＡＩＩ蛋白質は小麦由来のＷＧＡＩＩと同一の糖鎖
結合活性をもつことが判明した。

【００４９】

【配列表】

【００５０】

【００５１】３・配列番号３（１）配列の長さ：５８８（２）配列の型：核酸（３）鎖の数：二本鎖（４）トポロジー：直鎖状（５）配列の種類：合成ＤＮＡ（６）起源（ａ）生物名：なし（合成ＤＮＡ）（ｂ）株名：なし（７）配列の特徴：酵母のＥＮｏｌプロモーターの１
部、人工分泌シグナル、ＷＧＡ成熱体をコードする遺伝
子から構成される。（８）配列：

【０Ｏ５２】

【化１】

【００５３】４．配列番号４（１）配列の長さ：９４（２）配列の型：核酸（３）鎖の数：二本鎖（４）トポロジー：直鎖状（５）配列の種類：合成ＤＮＡ（６）起源（ａ）生物名：なし（合成ＤＮＡ）（ｂ）株名：なし（７）配列の特徴：小麦胚芽凝集素蛋白質（ＷＧＡ）の
成熱体のＣ末端側１部領域とＷＧＡのプロ領域とをコー
ドする遺伝子配列（８）配列：

【００５４】

【化２】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図面の簡単な説明

【補正方法】変更

【補正内容】

【図面の簡単な説明】

【図１】Ａブロックの酵素的連結法とサブクローニング
を示すフローチャートである。

【図２】Ｂブロックの酵素的連結法とサブクローニング
を示すフローチャートである。

【図３】Ｃ＋Ｄブロックの酵素的連結法とサブクローニ
ングを示すフローチャートである。

【図４】Ａ、Ｂ、Ｃ＋Ｄブロックの酵素的連結法とサブ
クローニングを示すフローチャートである。

【図５】成熟体型および前駆体型ＷＧＡ遺伝子の分泌発
現用プラスミドの構築法を示すフローチャートである。

【図６】酵母のα−ファクター遺伝子のプロモーターと
プレプロ領域を利用する成熟型および前駆体型ＷＧＡ遺
伝子の分泌発現用プラスミドの構築法を示すフローチャ
ートである。

【図７】分泌ＷＧＡ蛋白質のウエスタンブロット法によ
る解析図である。

【図８】酵母培養液中のＷＧＡ蛋白質のＭｏｎｏＳ
カラムによる分離の結果のクロマトグラムと活性画分の
位置を示すグラフである。

【図９】上記図８におけるＷＧＡ溶出画分のＭｏｎｏ
Ｑカラムによる分離精製の結果のクロマトグラムと活
性画分の位置を示すグラフである。

【図１０】上記図９におけるＷＧＡ画分のＭｏｎｏＳ
カラムによる分離精製の結果のクロマトグラムであ
る。

【図１１】市販のＷＧＡ標品（ＷＧＡＩ、ＩＩ、ＩＩＩ
の混合物）のＭｏｎｏＳカラムによる分離の結果の
クロマトグラムである。

【図１２】組換えＷＧＡ蛋白質のＳＤＳ−１５％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動による純度検定の結果を示す
電気泳動パターンである。

【図１３】ＷＧＡ蛋白質の糖鎖結合活性の検定法を示す
模式図である。

【図１４】組換えＷＧＡ蛋白質と標準ＷＧＡ蛋白質にお
ける糖鎖結合活性の比較のための、ＷＧＡ量と吸光度の
関係を示したグラフである。

【手続補正３】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図７】

【図６】

【図８】

【図９】

【図１２】

【図１０】

【図１１】

【図１３】

【図１４】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１のヌクレオチド配列で表わさ
れる小麦胚芽凝集素の成熟体構造遺伝子。
【請求項２】請求項１記載の小麦胚芽凝集素の構造遺
伝子の５’端に分泌に必要なシグナルペプチドをコード
するＤＮＡ領域を、また３’端に翻訳終止信号ＴＧＡＴ
ＡＡを、それぞれ有する小麦胚芽凝集素遺伝子。
【請求項３】請求項１記載の小麦胚芽凝集素の構造遺
伝子の５’端に分泌に必要なシグナルペプチドをコード
するＤＮＡ領域を、また３’端に翻訳終止信号ＴＧＡＴ
ＡＡを、それぞれ有する小麦胚芽凝集素遺伝子を含む組
換えプラスミドＤＮＡ。
【請求項４】発現プロモーターが酵母プロモーターで
あり、かつ、シグナルペプチドをコードする領域が該酵
母プロモーターの下流側で、かつ小麦胚芽凝集素遺伝子
の上流にあり、いずれもこれらと解読枠が一致している
ことを特徴とする請求項３記載の組換えプラスミド。
【請求項５】宿主細胞を請求項３または請求項４記載
の小麦胚芽凝集素遺伝子を含む組換えプラスミドＤＮＡ
で形質転換した形質転換体微生物。
【請求項６】宿主細胞が酵母である請求項５記載の形
質転換体微生物。
【請求項７】酵母が、サッカロミセス属に属する酵母
株、あるいは液胞局在性蛋白質を細胞外に分泌する突然
変異を有するサッカロミセス属に属する酵母変異株であ
ることを特徴とする請求項６記載の形質転換体微生物。
【請求項８】酵母変異株が、KS-58-2Ddelであること
を特徴とする請求項７記載の形質転換体微生物。
【請求項９】請求項５乃至請求項８のいずれかの項記
載の形質転換体微生物を培地に培養して、培養物から小
麦胚芽凝集素を採取することを特徴とする小麦胚芽凝集
素の製造法。
【請求項１０】配列番号２のヌクレオチド配列で表わ
される小麦胚芽凝集素前駆体をコードする遺伝子。
【請求項１１】請求項１０記載の小麦胚芽凝集素前駆
体をコードする遺伝子の５’端に分泌に必要なシグナル
ペプチドをコードするＤＮＡ領域を、また３’端に翻訳
終止信号ＴＧＡＴＡＡを、それぞれ有する小麦胚芽凝集
素前駆体をコードする遺伝子。
【請求項１２】請求項１０記載の小麦胚芽凝集素前駆
体をコードする遺伝子の５’端に分泌に必要なシグナル
ペプチドをコードするＤＮＡ領域を、また３’端に翻訳
終止信号ＴＧＡＴＡＡを、それぞれ有する小麦胚芽凝集
素前駆体をコードする遺伝子を含む組換えプラスミドＤ
ＮＡ。
【請求項１３】発現プロモーターが酵母プロモーターで
あり、かつ、シグナルペプチドをコードする領域が該酵
母プロモーターの下流側で、かつ小麦胚芽凝集素遺伝子
の上流にあり、いずれもこれらと解読枠が一致している
ことを特徴とする請求項１２記載の組換えプラスミドＤ
ＮＡ。
【請求項１４】宿主細胞を請求項１２または請求項１
３記載の小麦胚芽凝集素遺伝子を含む組換えプラスミド
ＤＮＡで形質転換した形質転換体微生物。
【請求項１５】宿主細胞が酵母である請求項１４記載
の形質転換体微生物。
【請求項１６】酵母が、サッカロミセス属に属する酵
母株、あるいは液胞局在性蛋白質を細胞外に分泌する突
然変異を有するサッカロミセス属に属する酵母変異株で
あることを特徴とする請求項１５記載の形質転換体微生
物。
【請求項１７】酵母変異株が、KS-58-2Ddelであるこ
とを特徴とする請求項１６記載の形質転換体微生物。
【請求項１８】請求項１４乃至請求項１７のいずれか
の項記載の形質転換体微生物を培地に培養して、培養物
から小麦胚芽凝集素を採取することを特徴とする小麦胚
芽凝集素の製造法。