WO2020169062A1 - 抗pd-l1抗体及其用途 - Google Patents

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杨毅
谢婧书
董春艳
杨放
陆程远
沈月雷
倪健
郭雅南
陈云云
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祐和医药科技(北京)有限公司
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    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
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    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
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    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Definitions

  • Cancer is currently one of the diseases causing the highest mortality in humans. According to statistics from the World Health Organization, in 2012, the number of global malignant tumor incidence and death cases reached 14 million and 8.2 million, with 3.07 million newly diagnosed cancer cases and 2.2 million deaths in China. In recent years, immune checkpoints have been considered as effective potential targets for the treatment of various cancers, and the development of antibody drugs against immune checkpoints has received increasing attention.
  • tumor cells can inhibit the activation and proliferation of tumor antigen-specific T cells by highly expressing PD-L1 molecules, binding to the receptor PD-1 on the surface of T cells, and transmitting negative regulatory signals, thereby evading the body’s immunity. Monitor and kill.
  • 3 PD-L1 antibody drugs have been approved by the FDA, namely the PD-L1 antibody Atezolizumab developed by Roche (for bladder cancer, locally advanced or metastatic urothelial cancer, metastatic non-small cell lung cancer), Merck /Pfizer co-developed anti-PD-L1 monoclonal antibody Avelumab (for rare skin cancer, Merck cell carcinoma, etc.) and Durvalumab (for advanced or metastatic urothelial cancer) developed by AstraZeneca.
  • PD-L1 antibodies are also being tried in combination.
  • Durvalumab is currently combined with 13 drugs with different mechanisms, including OX40, MEK, CTLA4, etc.
  • Antibody antibody, Ab;
  • Immunoglobulin immunoglobulin, Ig
  • Heavy chain constant domain heavy chain constant domain, CH;
  • Light chain variable domain light chain variable domain, VL;
  • Light chain constant domain light chain constant domain, CL;
  • Fab fragment antigen binding fragment, Fab
  • Antibody-dependent cytotoxicity antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC;
  • antibody refers to an immunoglobulin molecule that contains at least one antigen recognition site and can specifically bind to an antigen.
  • antibody mentioned in the present invention is understood in its broadest meaning, and includes monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, antibody fragments, multispecific antibodies containing at least two different antigen binding domains (such as bispecific antibodies). Sex antibody).
  • Antibodies also include murine antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies, and antibodies from other sources.
  • the antibody of the present invention can be derived from any animal, including but not limited to immunoglobulin molecules of humans, non-human primates, mice or rats.
  • immunoglobulins can be divided into five classes: IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, which can be further divided into different subclasses (isotypes), such as IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IGA1, IGA2, etc.
  • the amino acid sequence of the light chain the light chain can be classified as a lambda chain or a kappa chain.
  • the antibodies of the present invention can be of any type (such as IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM) or subclass (such as IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 or IgA2).
  • CDR refers to the complementarity determining region within the variable sequence of an antibody.
  • CDR1, CDR2, and CDR3 are three CDRs in each variable region of the heavy chain and light chain.
  • CDR1, CDR2, and CDR3 CDR1, CDR2, and CDR3.
  • the exact boundaries of these CDRs are defined differently according to different systems.
  • the system described by Kabat et al. Kabat et al. (Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) and (1991)) not only provides clear residue numbers for antibody variable regions
  • the system also provides residue boundaries defining the three CDRs. These CDRs can be called Kabat CDRs.
  • Each complementarity determining region can contain amino acid residues from the "complementarity determining region" as defined by Kabat. Chothia et al. ( Chothia & Lesk, J. Mol. Biol, 196: 901-917 (1987) and Chothia et al., Nature 342: 877-883 (-1989)) found that some sub-parts in Kabat CDR adopt almost the same peptide skeleton Although there is great diversity at the amino acid sequence level. These sub-parts are called L1, L2 and L3 or H1, H2 and H3, respectively, where “L” and “H” represent light chain and heavy chain regions, respectively. These regions It can be called Chothia CDR, which has a boundary that overlaps with Kabat CDR.
  • antibody variable region refers to the light chain and heavy chain of an antibody molecule including complementarity determining regions (CDR, CDR1, CDR2 and CDR3) and The part of the amino acid sequence of the framework region (FR).
  • CDR, CDR1, CDR2 and CDR3 complementarity determining regions
  • FR The part of the amino acid sequence of the framework region (FR).
  • VH refers to the variable domain of the heavy chain.
  • VL refers to the variable domain of the light chain.
  • chimeric antibody refers to an antibody in which the variable region is derived from a non-human species (e.g., derived from rodents) and the constant region is derived from a different species (e.g., human).
  • Chimeric antibodies can be produced by antibody engineering.
  • Antibody engineering is a term generally used for different kinds of modification of antibodies, and methods for antibody engineering are well known to those skilled in the art. Therefore, chimeric antibodies can be genetic or engineered recombinant antibodies. Methods of generating chimeric antibodies are known to those skilled in the art, and therefore, the generation of chimeric antibodies can be performed by methods other than those described herein.
  • Chimeric monoclonal antibodies are developed for human therapeutic applications to reduce the expected antibody immunogenicity of non-human antibodies, such as rodent antibodies. They can generally contain non-human (e.g., murine or rabbit) variable regions, which are specific for the antigen of interest, and human constant antibody heavy and light chain domains.
  • the term "variable region” or “variable domain” as used in the context of a chimeric antibody refers to a region containing the CDR and framework regions of both the heavy and light chains of an immunoglobulin, as described below.
  • humanized antibody refers to a genetically engineered non-human antibody that contains a modified human antibody constant domain and a non-human variable domain to contain a high level of human variable domains. Sequence homology. This can be achieved by grafting six non-human antibody CDRs (which together form the antigen binding site) onto the homologous human acceptor framework region (FR). In order to completely reconstruct the binding affinity and specificity of the parent antibody, it may be necessary to replace the framework residues from the parent antibody (ie, non-human antibody) into the human framework region (back mutation).
  • a humanized antibody may contain non-human CDR sequences, mainly human framework regions, which optionally contain one or more amino acid back mutations to the non-human amino acid sequence, and fully human constant regions.
  • additional amino acid modifications (which are not necessarily back mutations) can be applied to obtain humanized antibodies with preferred characteristics, such as affinity and biochemical properties and/or additional amino acid mutations can be introduced in the constant region.
  • the inventors generated a new anti-PD-L1 antibody and carried out a humanized modification on it.
  • the aforementioned antibodies and their humanized forms can effectively block the binding of PD-1/PD-L1, and show significant therapeutic effects in animal models of cancer.
  • the present invention relates to an anti-PD-L1 antibody or an antigen-binding fragment thereof, the anti-PD-L1 antibody having the following heavy chain complementarity determining region (CDR H):
  • the CDR H1 includes selected from SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 76, and SEQ ID NO: The amino acid sequence of 82;
  • the CDR H2 includes selected from SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 77, and SEQ ID NO: The amino acid sequence of 83; and
  • CDR H3 includes selected from SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 78, and SEQ ID NO: The amino acid sequence of 84.
  • the anti-PD-L1 antibody has the following CDR H:
  • the anti-PD-L1 antibody also has the following light chain complementarity determining regions (CDR L):
  • the CDR L1 includes selected from SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 79 and SEQ ID NO: The amino acid sequence of 85;
  • the CDR L2 includes selected from SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 80 and SEQ ID NO: The amino acid sequence of 86;
  • CDR L3 includes selected from SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 81, and SEQ ID NO: 87 amino acid sequence.
  • the anti-PD-L1 antibody has the following CDRs:
  • the anti-PD-L1 antibody has the following CDR H and CDR L:
  • the present invention relates to an anti-PD-L1 antibody or antigen-binding fragment thereof, wherein the anti-PD-L1 antibody has a heavy chain variable region (VH) comprising the following sequence:
  • amino acid sequence of a) has at least 60% sequence identity, for example at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98% or at least Amino acid sequence with 99% sequence identity; or
  • amino acid modification refers to the addition, substitution, insertion and/or deletion of one or more amino acids in the polypeptide chain.
  • the anti-PD-L1 antibody also has a light chain variable region (VL) comprising the following sequence:
  • the anti-PD-L1 antibody has the following VH and VL:
  • VH and VL containing the amino acid sequences of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 respectively;
  • VH and VL containing amino acid sequences with one or more amino acid modifications in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, respectively.
  • the anti-PD-L1 antibody has the following VH and VL:
  • VH and VL respectively comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 56 and SEQ ID NO: 57;
  • the anti-PD-L1 antibody has the following VH and VL:
  • VH and VL comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 58 and SEQ ID NO: 59, respectively;
  • the anti-PD-L1 antibody has the following VH and VL:
  • the anti-PD-L1 antibody has the following VH and VL:
  • the anti-PD-L1 antibodies may be murine antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies or fully human antibodies.
  • the amino acid modification when amino acid modification is involved, may be performed in the framework region of the variable region. In some embodiments, the amino acid modification is a humanized modification.
  • the present invention relates to humanized anti-PD-L1 antibodies of the present invention.
  • the humanized anti-PD-L1 antibody has an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 and SEQ ID NO: 42 VH, and VL comprising an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, and SEQ ID NO: 45.
  • the humanized anti-PD-L1 antibody has an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 34 VH of, and VL comprising an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 and SEQ ID NO: 38.
  • the antibody has a VH comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 and SEQ ID NO: 48, and comprising a VH selected from SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: VL of the amino acid sequence of 50 and SEQ ID NO: 51.
  • the antibody may further comprise a modification of the Fc region, which reduces the antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity of the antibody (ADCC) and/or complement dependent cytotoxicity (CDC).
  • the modification comprises the substitution N297A.
  • the antibody may be selected from IgG, IgA, IgM, IgE, and IgD isotypes. In some embodiments, the antibody is selected from IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 subtypes.
  • the antigen-binding fragment may be selected from the group consisting of Fab fragment, Fab' fragment, Fd fragment, Fd' fragment, Fv fragment, dAb fragment, F(ab' ) 2 fragments, single chain fragments, diabodies, and linear antibodies.
  • bispecific antibody refers to an artificially designed antibody, which is composed of two components with different antigen binding sites and can bind to two different antigen binding sites at the same time.
  • the bispecific antibody comprises a first antigen binding region that binds to PD-L1, and a second antigen binding region that binds to another antigen, and the first antigen binding region comprises the anti-PD-L1 of the present invention.
  • the another antigen may be selected from tumor-associated antigens and immune checkpoint molecules.
  • tumor-associated antigen refers to an antigen that is differentially expressed by cancer cells and therefore can be used to target cancer cells.
  • Tumor-associated antigens are antigens that can potentially stimulate obvious tumor-specific immune responses. Some of these antigens are encoded by normal cells, but not necessarily expressed by normal cells. These antigens can be characterized as those that are usually silent (ie not expressed) in normal cells, those that are expressed only at certain stages of differentiation, and those that are expressed over time, such as embryonic and fetal antigens.
  • cancer antigens are encoded by mutant cell genes such as oncogenes (e.g., activated ras oncogene), suppressor genes (e.g., mutant p53), and fusion proteins produced by internal deletions or chromosomal translocations.
  • cancer antigens can be encoded by viral genes, such as those carried on RNA and DNA tumor viruses. Many other tumor-associated antigens and antibodies against them are known and/or commercially available, and can also be produced by those skilled in the art.
  • Immune checkpoint protein receptors and their ligands mediate the suppression of T cell-mediated cytotoxicity, and are usually expressed on tumors or non-reactive T cells in the tumor microenvironment. And allow the tumor to evade immune attack. Inhibitors of the activity of immunosuppressive checkpoint protein receptors and their ligands can overcome the immunosuppressive tumor environment to allow the tumor's cytotoxic T cell attack.
  • immune checkpoint proteins include, but are not limited to, PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, OX40, LAG3, TIM3, TIGIT, and CD103.
  • immune checkpoint modulators can include, for example, antibodies, aptamers, small molecules, and soluble forms of checkpoint receptor proteins that target checkpoint proteins.
  • Antibodies specific for PD-L2, CTLA4, OX40, LAG3, TIM3, TIGIT and CD103 are known and/or commercialized, and can also be produced by those skilled in the art.
  • the invention relates to a nucleotide sequence.
  • the nucleotide sequence encodes the polypeptide chain of the anti-PD-L1 antibody of the present invention.
  • the nucleotide sequence encodes the VH or VL of the anti-PD-L1 antibody of the invention.
  • the invention in another aspect, relates to a vector comprising the nucleotide sequence of the invention.
  • Vector refers to a nucleic acid delivery vehicle into which polynucleotides can be inserted.
  • the vector can express the protein encoded by the inserted polynucleotide, the vector is called an expression vector.
  • the vector can be introduced into the host cell by transformation, transduction or transfection, and then the genetic material elements it carries can be expressed in the host cell.
  • the vector is recognized by those skilled in the art, including but not limited to: (1) plasmid; (2) phagemid; (3) cosmid; (4) artificial chromosome, such as yeast artificial chromosome, bacterial artificial chromosome or P1 source (5) bacteriophage such as lambda bacteriophage or M13 bacteriophage and (6) animal virus, such as retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, sporangia virus, poxvirus, baculovirus.
  • a vector can contain a variety of elements for controlling expression, including but not limited to promoter sequences, transcription initiation sequences, enhancer sequences, selection elements and reporter genes; in addition, the vector can also contain replication initiation sites.
  • the invention relates to a recombinant host cell comprising the nucleotide sequence or vector of the invention.
  • the present invention relates to a hybridoma cell that produces the anti-PD-L1 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention.
  • the present invention relates to a conjugate comprising the anti-PD-L1 antibody or antigen-binding fragment or bispecific antibody thereof of the present invention, and a part conjugated thereto.
  • the moiety may be selected from cytotoxins, radioisotopes, fluorescent labels, luminescent substances, chromogenic substances, or enzymes.
  • the present invention relates to a composition
  • a composition comprising the anti-PD-L1 antibody or antigen-binding fragment, bispecific antibody, or conjugate thereof of the present invention, and optionally one or more A pharmaceutically acceptable carrier, excipient and/or diluent.
  • the present invention relates to the use of the anti-PD-L1 antibody or antigen-binding fragment, bispecific antibody, conjugate, or composition of the present invention in the preparation of a medicament for treating diseases in a subject .
  • the therapeutic agent is selected from antibodies, chemotherapeutics, and small molecule compounds.
  • the therapeutic agent targets a tumor-associated antigen.
  • the therapeutic agent targets immune checkpoint molecules, which may be selected from PD-1, PD-L2, CTLA4, OX40, LAG3, TIM3, TIGIT, and CD103.
  • the mouse antibody was humanized. Specifically, partial amino acid sequences of the heavy chain variable region and light chain variable region of the murine antibodies 6A11, 3F2 and 7E4 were replaced with human sequences to optimize the affinity of the antibody to the antigen and improve the druggability. For each antibody, multiple humanized heavy chain variable region and light chain variable region sequences were generated. The amino acid sequences of the humanized heavy chain variable region and light chain variable region are shown in Table 4 below.
  • the 96-well cell culture plate was centrifuged at 1200 rpm for 5 minutes and washed twice with PBS. Subsequently, 50 ⁇ l of 1:100 dilution of anti-mouse IgG Fc-FITC and 1:100 dilution of streptavidin-PE secondary antibody were added to each well, and they were allowed to stand at 4°C for 30 minutes. Subsequently, the 96-well cell culture plate was centrifuged at 1200 rpm for 5 minutes, washed once with PBS, 200 ⁇ l PBS was added to each well and flow cytometric analysis was performed.
  • hPD-L1-His protein was injected into the sensor chip (30 ⁇ l/min, 100-400s) at a concentration of 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.5625 or 0.78125nM, and the dissociation time was 300- 1000s.
  • Kinetic association rates (kon) and kinetic dissociation rates (koff) can be obtained by 1:1 Langmuir binding model fitting with Bioacore T200 evaluation software ((Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B., 1994. Methods Enzymology 6.99-110).
  • Affinity rate constant KD koff/kon, all antibody affinity test fitting results are shown in Table 6.
  • mice with PD-L1 gene were used to prepare tumor animal models.
  • the mouse expresses the human-mouse chimeric PD-L1 protein (SEQ ID NO: 55), in which the extracellular region of the mouse PD-L1 protein is replaced by a human sequence: amino acids 21-128 of the mouse PD-L1 protein (SEQ ID NO: 55) ID NO: 53) is replaced by amino acids 21-128 of human PD-L1 protein (SEQ ID NO: 52).
  • the B-hPD-L1 mouse model provides a new detection method for preclinical animal experiments of PD-L1 monoclonal antibody drugs, which greatly improves the predictability of clinical trials (see PCT application number PCT/CN2017/099574 and China Application No. 201710757022.6, the above documents are incorporated herein by reference in their entirety).
  • TGI Tumor growth inhibition percentage
  • mice The body weight and tumor volume of the mice were measured twice a week, and the experiment was ended after 3 weeks.
  • the average body weight of the mice in the control group and the administration group increased steadily throughout the experimental period, and there was no significant difference between the groups, indicating that the anti-PD-L1 antibody did not cause significant toxicity to the mice after administration.
  • the growth of tumors in the administration group was inhibited to varying degrees.
  • the control group was injected with saline. It is administered on the first 1, 3, and 5 days of the week.
  • the body weight and tumor volume of the mice were measured twice a week, and the experiment was ended after 3 weeks.
  • the average body weight of the mice in the control group and the administration group increased steadily throughout the experimental period, and there was no significant difference between the groups, indicating that the anti-PD-L1 antibody did not cause significant toxicity to the mice after administration.
  • the growth of tumors in the administration group was inhibited to varying degrees.
  • mice aged 5-6 weeks were inoculated subcutaneously with MC38-hPD-L1 cells (5 ⁇ 10 5 /mouse). After the tumor volume reached 150 ⁇ 50mm 3, they were randomly divided into 7 groups, each with 5 only.
  • the administration group was treated with anti-PD-L1 chimeric antibody 33-10C9-mHvKv-IgG1, 24-1F4-mHvKv-IgG1, 23-2A6-mHvKv-IgG1, 23-4A8-mHvKv-IgG1, 23-2A5-mHvKv- IgG1 and 24-1C3-mHvKv-IgG1 were treated by intraperitoneal injection at a dose of 3 mg/kg.
  • the control group was injected with saline. It is administered on the first 1, 3, and 5 days of the week.
  • the body weight and tumor volume of the mice were measured twice a week, and the experiment was ended after 3 weeks.
  • mice Fifty-six B-hPD-L1 mice aged 5-6 weeks were inoculated subcutaneously with MC38-hPD-L1 cells (5 ⁇ 10 5 /mouse). After the tumor volume reached 150 ⁇ 50mm 3, they were randomly divided into 7 groups, 8 in each group only.
  • the administration group used anti-PD-L1 humanized antibodies 6A11-H1K3-IgG1-N297A, 6A11-H1K4-IgG1-N297A, 3F2-H1K1-IgG1-N297A, 3F2-H1K2-IgG1-N297A, 7E4-H1K1-IgG1 -N297A and 7E4-H2K1-IgG1-N297A were treated by intraperitoneal injection at a dose of 3 mg/kg.
  • the control group was injected with saline.
  • the drug was administered on the second and fifth days of the week, and the body weight and tumor volume were measured twice a week. The experiment was terminated after 3 weeks.
  • mice Twenty 5-6 weeks old B-hPD-L1 mice were inoculated subcutaneously with MC38-hPD-L1 cells (5 ⁇ 10 5 /mouse). After the tumor volume reached 150 ⁇ 50 mm 3, they were randomly divided into 4 groups, each with 5 only. The administration group was treated with 1mg/kg, 3mg/kg or 10mg/kg anti-PD-L1 antibody 07-6A11 by intraperitoneal injection, and the control group was injected with physiological saline. The drug was administered once every two days for a total of 8 times. Body weight and tumor volume were measured twice a week. The experiment was terminated after 3 weeks.
  • Table 14 below shows the TGI% results for each group. From the results, it can be seen that the curative effect of the combination of anti-PD-L1 antibody and anti-CTLA4 antibody or anti-OX40 antibody is significantly better than that of antibody alone, and can inhibit the growth of tumor cells more efficiently.
  • the mCTLA4 used was purchased from BioXcell with the article number BE0164; mOX40 was purchased from BioXcell with the article number BE0031.

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Abstract

本公开提供了抗PD-L1抗体及其抗原结合片段及其用途。本公开还提供了包含所述抗PD-L1抗体或其抗原结合片段的多特异性抗体例如双特异性抗体、缀合物和组合物，及其在治疗疾病例如癌症中的用途。

Description

抗PD-L1抗体及其用途 发明领域
本发明涉及生物医疗领域。更具体地，本发明涉及抗PD-L1抗体及其用途，特别是在癌症治疗中的用途。
技术背景
癌症是目前导致人类死亡率最高的疾病之一。据世界卫生组织统计，2012年全球恶性肿瘤发病和死亡病例数达到1400万和820万，中国新诊断癌症病例307万，死亡人数220万。近年，免疫检查点被认为是用于治疗各类癌症的有效潜在靶点，而针对免疫检查点的抗体药物的研发受到了越来越多的关注。
PD-1和PD-L1全称分别为程序性死亡受体1(programmed cell death-1)和程序性死亡受体-配体1(programmed cell death-ligand 1)，其作为免疫球蛋白超家族协同刺激分子的重要成员，主要参与自身免疫、肿瘤免疫等机体免疫调节过程。PD-1大小为40kDa的I型跨膜蛋白，是一种主要表达在活化T细胞上的抑制性受体。当与其配体PD-L1结合后，可显著抑制T细胞的活化和增殖。目前已知PD-1的配体有两个，分别是PD-L1(又称B7-H1)和PD-L2(又称B7-DC)。人PD-L1基因定位于染色体9p24，是编码290个氨基酸的I型跨膜蛋白，由胞外区IgV、IgC结构域、疏水性跨膜结构域及30个氨基酸的胞内域组成。PD-L1广泛表达在多种免疫细胞、上皮细胞和肿瘤细胞表面。而PD-L2主要表达在免疫细胞表面。目前的研究发现，肿瘤细胞通过高表达PD-L1分子，与T细胞表面的受体PD-1结合，传递负调控信号，来抑制肿瘤抗原特异性T细胞的活化和增殖，从而逃避机体的免疫监控和杀伤。
近年来，利用靶向PD-1/PD-L1蛋白的单克隆抗体药物，通过阻断PD-1/PD-L1的结合，进而促进体内T细胞的活化和增殖，达到杀伤肿瘤细胞的目的，已经应用于多种肿瘤，如黑色素瘤、淋巴癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、头颈癌、结肠癌等，并取得了一定的治疗效果。肿瘤免疫治疗已成为世界范围的研究热点和新药研发方向之一。
目前已有3个PD-L1抗体药物被FDA批准，分别是罗氏开发的PD-L1抗体Atezolizumab(用于膀胱癌、局部晚期或转移性尿路上皮癌、转移性非小细 胞肺癌)、默克/辉瑞合作开发的抗PD-L1单抗Avelumab(用于罕见皮肤癌、默克细胞癌等)以及阿斯利康开发的Durvalumab(用于晚期或转移性尿路上皮癌)。除单药外，PD-L1抗体也在进行联用的尝试，如Durvalumab目前与13个不同机制的药物进行联用，包括OX40，MEK，CTLA4等。已经上市的以PD-L1为靶点的单克隆抗体药物，在治疗癌症方面具有各自的优势和劣势，但售价高昂，还不能广泛应用和普及。因此，研发适用范围更广、能够更高效阻断PD-1/PD-L1信号通路的抗体药物，将为多种肿瘤和免疫系统相关疾病的治疗提供可能，具有巨大的应用潜力和市场价值。
发明内容
除非本文另有定义，与本发明结合使用的科学和技术术语及其缩略语应具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。以下列举了本文中使用的部分术语和缩略语。
抗体：antibody，Ab；
免疫球蛋白：immunoglobulin，Ig；
重链：heavy chain，HC；
轻链：light chain，LC；
重链可变区：heavy chain variable domain，VH；
重链恒定区：heavy chain constant domain，CH；
轻链可变区：light chain variable domain，VL；
轻链恒定区：light chain constant domain，CL；
互补决定区：complementarity determining region，CDR，是指抗体的抗原互补结合区；
Fab片段：antigen binding fragment，Fab；
Fc片段：fragment crystallizable region，Fc；
单克隆抗体：monoclonal antibodies，mAbs；
抗体依赖性细胞毒作用：antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC；
补体依赖性细胞毒性作用：complement dependent cytotoxicity，CDC；
双特异性抗体：bispecific antibody，BsAb。
如本文所用，术语“抗体”指包含至少一个抗原识别位点并能特异性结 合抗原的免疫球蛋白分子。本发明所提及的术语“抗体”以其最广泛的含义理解，并包含单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段、包含至少两个不同的抗原结合结构域的多特异性抗体(例如双特异性抗体)。抗体还包括鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体以及其它来源的抗体。本发明的抗体可以来源于任何动物，包括但不限于人、非人灵长类动物、小鼠或大鼠等的免疫球蛋白分子。抗体可以含有另外的改变，如非天然氨基酸，Fc效应子功能突变和糖基化位点突变。抗体还包括翻译后修饰的抗体、包含抗体的抗原决定簇的融合蛋白，以及包含对抗原识别位点的任何其它修饰的免疫球蛋白分子，只要这些抗体展现出所期望的生物活性。
根据抗体重链恒定区的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白分为5类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其还可以进一步分成不同的亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IGA1、IGA2等。根据轻链氨基酸序列，可将轻链分类为λ链或κ链。本发明的抗体可以是任何种类(如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)或亚类(如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2)。
术语“抗原结合片段”包括但不限于：Fab片段，其具有VL、CL、VH和CH1域；Fab'片段，其是在CH1域的C端具有一个或多个半胱氨酸残基的Fab片段；Fd片段，其具有VH和CH1域；Fd'片段，其具有VH和CH1域和在CH1域的C端的一个或多个半胱氨酸残基；Fv片段，其具有抗体的单一臂的VL和VH域；dAb片段，其由VH域或VL域组成；分离的CDR区；F(ab') 2片段，其是包含由铰链区处的二硫桥连接的两个Fab'片段的二价片段；单链抗体分子(例如单链Fv；scFv)；具有两个抗原结合位点的"双抗体"，其包含同一多肽链中与轻链可变域(VL)连接的重链可变域(VH)；"线性抗体"，其包含一对串联Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，该区段与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区；和任何前述物质的修饰的形式，其保留了抗原结合活性。
如本文所用，术语“CDR”是指抗体可变序列内的互补决定区。对于每个可变区，在重链和轻链的每个可变区中有三个CDR，其称为CDR1、CDR2和CDR3。这些CDR的确切边界根据不同的系统而不同定义。Kabat等人(Kabat et al,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987)和(1991))描述的系统不仅提供了适用于抗体可变区的明确的残基编号系统，而且还提供了限定三个CDR的残基边界。这些CDR可以称为Kabat CDR。每个互补决定区可以包含来自如由 Kabat定义的“互补决定区”的氨基酸残基。Chothia等人(Chothia&Lesk,J.Mol.Biol,196:901-917(1987)和Chothia et al.,Nature 342:877-883(-1989))发现，Kabat CDR内的某些子部分采用几乎相同的肽骨架构象，尽管在氨基酸序列水平上具有大的多样性。这些子部分分别称为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别表示轻链和重链区。这些区域可以称为Chothia CDR，其具有与Kabat CDR重叠的边界。还有其它CDR边界定义可以不严格遵循上述系统之一，但是仍将与Kabat CDR重叠，本文使用的方法可以利用根据任何这些系统定义的CDR，尽管优选实施方案使用Kabat或Chothia定义的CDR。如本文所用，“抗体可变区”是指抗体分子的轻链和重链中包括互补决定区(CDR，即CDR1、CDR2和CDR3)和框架区(FR)的氨基酸序列的部分。VH是指重链的可变域。VL是指轻链的可变域。
如本文所用的术语“嵌合抗体”是指其中可变区衍生自非人物种(例如衍生自啮齿动物)并且恒定区衍生自不同物种(例如人)的抗体。嵌合抗体可以通过抗体工程化生成。“抗体工程化”是一般用于抗体的不同种类的修饰的术语，并且用于抗体工程化的方法是本领域技术人员公知的。因此，嵌合抗体可以是遗传或工程化的重组抗体。生成嵌合抗体的方法是本领域技术人员已知的，并因此，嵌合抗体的生成可以通过除本文所述之外的其他方法进行。开发用于人类治疗应用的嵌合单克隆抗体以降低非人抗体(例如啮齿动物抗体)的预期抗体免疫原性。它们通常可含有非人(例如鼠或兔)可变区，其对感兴趣的抗原具有特异性，和人恒定抗体重链和轻链结构域。如在嵌合抗体的上下文中所用的术语“可变区”或“可变结构域”是指包含免疫球蛋白的重链和轻链两者的CDR和框架区的区域，如下所述。
如本文所用的术语“人源化抗体”是指遗传工程改造的非人抗体，其含有经修饰的人抗体恒定结构域和非人可变结构域，以含有与人可变结构域具有高水平的序列同源性。这可以通过将六个非人抗体CDR(其一起形成抗原结合位点)移植到同源人受体框架区(FR)上来实现。为了完全重建亲本抗体的结合亲和力和特异性，可能需要将框架残基从亲本抗体(即非人抗体)置换到人框架区中(回复突变)。因此，人源化抗体可以包含非人CDR序列，主要是人框架区，其任选地包含对非人氨基酸序列的一个或多个氨基酸回复突变，和完全人恒定区。任选地，可以应用另外的氨基酸修饰(其不一定是回复突变)，以获得具有优选特征的人源化抗体，例如亲和力和生化特性和/或可以 在恒定区引入另外的氨基酸突变。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本均质的抗体群体获得的抗体，即构成群体的各抗体是相同的，除了可以少量存在的可能的天然存在的突变外。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆制剂中的每种抗体针对抗原上相同的单一决定簇。如本文使用，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体，并且修饰语“单克隆抗体”不应被解释为需要通过任何特定方法生产抗体。
在本发明中，本发明人生成了新的抗PD-L1的抗体，并对其进行了人源化改造。上述抗体及其人源化形式能够有效阻断PD-1/PD-L1的结合，并在癌症动物模型中显示出显著的治疗效果。
相应地，在一个方面，本发明涉及一种抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，所述抗PD-L1抗体具有以下重链互补决定区(CDR H)：
CDR H1，所述CDR H1包含选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:82的氨基酸序列；
CDR H2，所述CDR H2包含选自SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:83的氨基酸序列；和
CDR H3，所述CDR H2包含选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:84的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体具有以下CDR H：
a)分别包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的CDR H1、CDR H2和CDR H3；
b)分别包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的CDR H1、CDR H2和CDR H3；
c)分别包含SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的CDR H1、CDR H2和CDR H3；
d)分别包含SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66的CDR H1、CDR H2和CDR H3；
e)分别包含SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72的CDR H1、CDR H2和CDR H3；
f)分别包含SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78的CDR H1、CDR H2和CDR H3；或者
g)分别包含SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:84的CDR H1、CDR H2和CDR H3。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体还具有以下轻链互补决定区(CDR L)：
CDR L1，所述CDR L1包含选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:85的氨基酸序列；
CDR L2，所述CDR L2包含选自SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:86的氨基酸序列；和
CDR L3，所述CDR L2包含选自SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:87的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体具有以下CDR L：
a)分别包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的CDR L1、CDR L2和CDR L3；
b)分别包含SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的CDR L1、CDR L2和CDR L3；
c)分别包含SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24的CDR L1、CDR L2和CDR L3；
d)分别包含SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:69的CDR L1、CDR L2和CDR L3；
e)分别包含SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:75的CDR L1、CDR L2和CDR L3；
f)分别包含SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:81的CDR L1、CDR L2和CDR L3；或者
g)分别包含SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:87的CDR  L1、CDR L2和CDR L3。
在优选的实施方案中，所述抗PD-L1抗体具有以下CDR H和CDR L：
a)分别包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的CDR H1、CDR H2和CDR H3，以及分别包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的CDR L1、CDR L2和CDR L3；
b)分别包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的CDR H1、CDR H2和CDR H3，以及分别包含SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的CDR L1、CDR L2和CDR L3；
c)分别包含SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的CDR H1、CDR H2和CDR H3，以及分别包含SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24的CDR L1、CDR L2和CDR L3；
d)分别包含SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66的CDR H1、CDR H2和CDR H3，以及分别包含SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:69的CDR L1、CDR L2和CDR L3；
e)分别包含SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72的CDR H1、CDR H2和CDR H3，以及分别包含SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:75的CDR L1、CDR L2和CDR L3；
f)分别包含SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78的CDR H1、CDR H2和CDR H3，以及分别包含SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:81的CDR L1、CDR L2和CDR L3；或者
g)分别包含SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:84的CDR H1、CDR H2和CDR H3，以及分别包含SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:87的CDR L1、CDR L2和CDR L3。
在另一个方面，本发明涉及一种抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗PD-L1抗体具有包含以下序列的重链可变区(VH)：
a)选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:62的氨基酸序列；
b)与a)的氨基酸序列具有至少60％序列同一性、例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％，至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；或者
c)在a)的氨基酸序列中进行了一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列，例 如1-5个，5-10个，10-20个，20-30个或30-40个氨基酸修饰，例如1-40个，1-30个，1-20个，1-10个或1-5个氨基酸修饰。
本文所用“氨基酸修饰”是指多肽链中一个或多个氨基酸的添加、取代、插入和/或删除。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体还具有包含以下序列的轻链可变区(VL)：
a)选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:63的氨基酸序列；
b)与a)的氨基酸序列具有至少60％序列同一性、例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％，至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；或者
c)在a)的氨基酸序列中进行了一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列，例如1-5个，5-10个或10-20个氨基酸修饰，例如1-20个，1-10个或1-5个氨基酸修饰。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体具有以下VH和VL：
a)分别包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH和VL；
b)分别包含与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2具有至少60％序列同一性、例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％，至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；或者
c)分别包含在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中进行了一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列的VH和VL。
在另一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体具有以下VH和VL：
a)分别包含SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VH和VL；
b)分别包含与SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4具有至少60％序列同一性、例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％，至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；或者
c)分别包含在SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中进行了一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列的VH和VL。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体具有以下VH和VL：
a)分别包含SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VH和VL；
b)分别包含与SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6具有至少60％序列同一性、 例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％，至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；或者
c)分别包含在SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中进行了一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列的VH和VL。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体具有以下VH和VL：
a)分别包含SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57的氨基酸序列的VH和VL；
b)分别包含与SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57具有至少60％序列同一性、例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％，至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；或者
c)分别包含在SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57中进行了一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列的VH和VL。
在另一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体具有以下VH和VL：
a)分别包含SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59的氨基酸序列的VH和VL；
b)分别包含与SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59具有至少60％序列同一性、例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％，至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；或者
c)分别包含在SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59中进行了一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列的VH和VL。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体具有以下VH和VL：
a)分别包含SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61的氨基酸序列的VH和VL；
b)分别包含与SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61具有至少60％序列同一性、例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％，至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；或者
c)分别包含在SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61中进行了一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列的VH和VL。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体具有以下VH和VL：
a)分别包含SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63的氨基酸序列的氨基酸序列VH和VL；
b)分别包含与SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63具有至少60％序列同一性、例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％，至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；或者
c)分别包含在SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63中进行了一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列的VH和VL。
在上述抗PD-L1抗体或其抗原结合片段的任意实施方案中，所述抗PD-L1抗体可以是鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。
在上述抗PD-L1抗体或其抗原结合片段的任意实施方案中，当涉及氨基酸修饰时，所述氨基酸修饰可以在可变区的框架区中进行。在一些实施方案中，所述氨基酸修饰是人源化修饰。
在一个方面，本发明涉及经人源化改造的本发明的抗PD-L1抗体。
在一些实施方案中，所述经人源化改造的抗PD-L1抗体具有包含选自SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VH，和包含选自SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45的氨基酸序列的VL。
在另一些实施方案中，所述经人源化改造的抗PD-L1抗体具有包含选自SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH，和包含选自SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，所述抗体具有包含选自SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48的氨基酸序列的VH，和包含选自SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51的氨基酸序列的VL。
在上述抗PD-L1抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，所述抗体还可以包含Fc区的修饰，所述Fc区的修饰降低所述抗体的抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和/或补体依赖的细胞毒作用(CDC)。在一些实施方案中，所述修饰包含取代N297A。
在上述抗PD-L1抗体或其抗原结合片段的任何实施方案中，所述抗体可以选自IgG、IgA、IgM、IgE和IgD同种型。在一些实施方案中，所述抗体选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型。
在上述抗PD-L1抗体或其抗原结合片段的任何实施方案中，所述抗原结合片段可以选自Fab片段、Fab’片段、Fd片段、Fd’片段、Fv片段、dAb片段、F(ab’)2片段、单链片段、双抗体、和线性抗体。
在另一个方面，本发明涉及一种双特异性抗体。本文所用“双特异性抗体”是指是人工设计的抗体，其由两个不同抗原结合位点的组分构成，可同 时与两种不同的抗原结合位点结合。
在一些实施方案中，所述双特异性抗体包含结合PD-L1的第一抗原结合区，和结合另一抗原的第二抗原结合区，所述第一抗原结合区包含本发明的抗PD-L1抗体的CDRH1、CDRH2和CDRH3，和/或CDRL1、CDRL2和CDRL3，本发明的抗PD-L1抗体的VH和/或VL。在一些实施方案中，所述另一抗原可以选自肿瘤相关抗原和免疫检查点分子。
本领域已经鉴定出与特定癌症相关的许多肿瘤相关抗原。如本文所用，术语“肿瘤相关抗原”是指由癌细胞差异表达，因此可以利用以靶向癌细胞的抗原。肿瘤相关抗原是可以潜在地刺激明显的肿瘤特异性免疫应答的抗原。这些抗原中的一些由正常细胞编码，但不一定由正常细胞表达。这些抗原可以表征为在正常细胞中通常是沉默(即不表达)的那些抗原、仅在某些分化阶段表达的那些抗原和那些在时间上表达的那些抗原，如胚胎和胎儿抗原。其它癌症抗原由突变细胞基因如癌基因(例如激活的ras癌基因)、抑制基因(例如突变型p53)和由内部缺失或染色体易位产生的融合蛋白编码。其它癌症抗原可以由病毒基因编码，如RNA和DNA肿瘤病毒上携带的基因。许多其它的肿瘤相关抗原及针对其的抗体是已知的和/或商品化的，并且也可以由本领域技术人员产生。
免疫检查点蛋白受体及其配体(本文统称为免疫检验点分子)介导T细胞介导的细胞毒性的抑制，并且通常由肿瘤或在肿瘤微环境中的无反应性T细胞上表达，并允许肿瘤逃避免疫攻击。免疫抑制检查点蛋白受体及其配体的活性的抑制剂可以克服免疫抑制性肿瘤环境，以允许肿瘤的细胞毒性T细胞攻击。免疫检查点蛋白质的实例包括但不限于PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3、TIGIT和CD103。此类蛋白质的活性的调节(包括抑制)可以通过免疫检查点调节剂完成，其可以包括例如靶向检查点蛋白质的抗体、适体、小分子和检测点受体蛋白质的可溶性形式，对PD-1、PD-L2、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3、TIGIT和CD103特异性的抗体是已知的和/或商品化的，并且也可以由本领域技术人员产生。
在一个方面，本发明涉及一种核苷酸序列。在一些实施方案中，所述核苷酸序列编码本发明的抗PD-L1抗体的多肽链。在另一些实施方案中，所述核苷酸序列编码本发明的抗PD-L1抗体的VH或VL。
在另一个方面，本发明涉及包含本发明的核苷酸序列的载体。
本文所用“载体”是指可以将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。而当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，该载体称为表达载体。载体可以通过转化、转导或者转染等方法导入宿主细胞，继而使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内获得表达。载体是本领域技术人员公认的、包括但不限于：(1)质粒；(2)噬菌粒；(3)柯斯质粒；(4)人工染色体，如酵母人工染色体、细菌人工染色体或P1来源的人工染色体；(5)噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及(6)动物病毒，如逆转录酶病毒、腺病毒、腺相关病毒、孢疹病毒、痘病毒、杆状病毒。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不局限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因；此外，载体还可以含有复制起始位点。
在一个方面，本发明涉及包含本发明的核苷酸序列或载体的重组宿主细胞。
在另一个方面，本发明涉及一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞产生本发明的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。
在一个方面，本发明涉及一种缀合物，所述缀合物包含本发明的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段或双特异性抗体，以及与其缀合的部分。在一些实施方案中，所述部分可以选自细胞毒素、放射性同位素、荧光标记物、发光物质、显色物质或酶。
在另一个方面，本发明涉及一种组合物，所述组合物包含本发明的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，双特异性抗体，或缀合物，和任选的一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。
短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断的范围内适合用于与人和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激性、变应性应答或其它问题或并发症，与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。如本文中所用，短语“药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂”是指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂、介质、包封材料、制造助剂或溶剂包封材料，其涉及维持本发明的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段的稳定性、溶解度或活性。
在一个方面，本发明涉及一种治疗受试者中的疾病的方法，所述方法包括对所述受试者施用本发明的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，双特异性抗体，缀合物，或组合物的步骤。
在另一个方面，本发明涉及本发明的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，双特异性抗体，缀合物，或组合物在治疗受试者中的疾病中的用途。
在再一个方面，本发明涉及本发明的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，双特异性抗体，缀合物，或组合物在制备用于治疗受试者中的疾病的药物中的用途。
在上述方法和用途的一些实施方案中，所述疾病可以是癌症。癌症的具体实例包括但不限于：基底细胞癌、胆管癌；膀胱癌；骨癌；乳腺癌；腹膜癌；宫颈癌；胆管癌；绒毛膜癌；结肠和直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌症；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌；胶质母细胞瘤；肝癌；肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)；淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤；黑色素瘤；骨髓瘤；神经母细胞瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫或子宫内膜癌；泌尿系统癌症；B细胞淋巴瘤；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性成淋巴细胞性白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞性白血病等。
在一些实施方案中，所述癌症选自黑色素瘤、淋巴瘤、膀胱癌、非小细胞肺癌、头颈癌、结肠癌和皮肤癌。
在上述方法和用途的一些实施方案中，还包括对所述受试者施用一种多种另外的治疗剂。在一些实施方案中，所述治疗剂选自抗体、化疗药物和小分子化合物。在一些实施方案中，所述治疗剂靶向肿瘤相关抗原。在另一些实施方案中，所述治疗剂靶向免疫检查点分子，所述免疫检查点分子可以选自PD-1、PD-L2、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3、TIGIT和CD103。
如本文所用，术语“化疗药物”是指具有在治疗以异常细胞生长为特征的疾病中的治疗有用性的任何化学试剂。如本文所用的化学治疗剂包括化学剂和生物剂。这些试剂发挥功能以抑制癌细胞实现持续存活所依赖的细胞活性。化疗剂的类别包括烷化/生物碱剂、抗代谢物、激素或激素类似物，以及各种各样的抗新生物药物。
附图说明
图1的流式细胞结果显示了本发明的抗PD-1抗体阻断生物素-hPD1配体 与PD-L1之间结合的作用。图1A显示了抗体08-3F2和07-6A11的结果；图1B显示了抗体17-7E4的结果；图1C显示了嵌合抗体24-1F4-mHvKv-IgG1、33-10C9-mHvKv-IgG1、23-2A6-mHvKv-IgG1和23-4A8-mHvKv-IgG1的结果。Atzeolizumab用作阳性对照。
图2的流式细胞图显示了本发明的抗PD-L1抗体与来源于不同物种的PD-L1蛋白以及嵌合PD-L1蛋白之间的交叉反应。图2A显示了抗体07-6A11、17-7E4和08-3F2的结果；图2B显示了嵌合抗体24-1F4-mHvKv-IgG1、33-10C9-mHvKv-IgG1、23-2A6-mHvKv-IgG1和23-4A8-mHvKv-IgG1的结果。NC：阴性对照。Atzeolizumab用作阳性对照。
图3显示了当使用所示的抗PD-L1抗体处理后，实验动物的体重随时间变化的折线图。图3A显示了实验动物的体重的绝对值随时间的变化。图3B显示了实验动物的体重随时间的百分比变化。生理盐水(PS)用作阴性对照。Atzeolizumab用作阳性对照。
图4显示了当使用所示的抗PD-L1抗体处理后，实验动物体内的肿瘤体积随时间变化的折线图。生理盐水(PS)用作阴性对照。Atzeolizumab用作阳性对照。
图5显示了当使用所示的抗PD-L1抗体处理后，实验动物的体重随时间变化的折线图。图5A显示了实验动物的体重的绝对值随时间的变化。图5B显示了实验动物的体重随时间的百分比变化。生理盐水(PS)用作阴性对照。
图6显示了当使用所示的抗PD-L1抗体处理后，实验动物体内的肿瘤体积随时间变化的折线图。生理盐水(PS)用作阴性对照。
图7显示了当使用所示的抗PD-L1抗体处理后，实验动物的体重随时间变化的折线图。图7A显示了实验动物的体重的绝对值随时间的变化。图7B显示了实验动物的体重随时间的百分比变化。生理盐水(PS)用作阴性对照。
图8显示了当使用所示的抗PD-L1抗体处理后，实验动物体内的肿瘤体积随时间变化的折线图。生理盐水(PS)用作阴性对照。
图9显示了当使用不同剂量的抗PD-L1抗体处理后，实验动物的体重随时间变化的折线图。图9A显示了实验动物的体重的绝对值随时间的变化。图9B显示了实验动物的体重随时间的百分比变化。生理盐水(PS)用作阴性对照。
图10显示了当使用不同剂量的的抗PD-L1抗体处理后，实验动物体内的肿瘤体积随时间变化的折线图。生理盐水(PS)用作阴性对照。
图11显示了当使用所示的抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗OX40抗体或其组合处理后，实验动物的体重随时间变化的折线图。图11A显示了实验动物的体重的绝对值随时间的变化。图11B显示了实验动物的体重随时间的百分比变化。生理盐水用作阴性对照。
图12A至图12C显示了当使用所示的抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗OX40抗体或其组合处理后，实验动物体内的肿瘤体积随时间变化的折线图。生理盐水用作阴性对照。
具体实施方式
以下将结合实施例进一步说明本发明的内容。应当理解以下实施例仅是说明性的，而不应被认为是对本发明范围的限制。
本文中使用的抗体名称中包括抗体来源、可变区和恒定区信息。例如嵌合抗体08-3F2-mHvKv-IgG1是由鼠源抗体08-3F2(“3F2”)的VH和VL区与人源IgG1恒定区组成的抗体；类似的，人源化抗体3F2-H1K2-IgG1是由鼠源抗体08-3F2(“3F2”)人源化的重链可变区H1和轻链可变区K2与人源IgG1恒定区组成的抗体。部分抗体的Fc端还有N297A突变(如，23-2A6-mHvKv-IgG1-N297A)，以通过突变糖基化位点消去Fc效应功能。
实施例1.抗体生成
通过使用重组人源PD-L1蛋白或编码重组人源PD-L1蛋白的表达质粒免疫小鼠，和随后构建杂交瘤细胞的方法，获得了本发明的抗PD-L1单克隆抗体08-3F2(“3F2”)、07-6A11(“6A11”)、17-7E4(“7E4”)、23-2A6(“2A6”)、23-4A8(“4A8”)、33-10C9(“10C9”)和24-1F4(“1F4”)。根据制造商的说明，利用GE AKTA蛋白色谱全自动纯化仪(GE Healthcare)进行抗体纯化。上述抗体的重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)和CDR的氨基酸序列如以下表1至表3所示。
表1.抗体的VH和VL序列
Figure PCTCN2020075983-appb-000001
Figure PCTCN2020075983-appb-000002
Figure PCTCN2020075983-appb-000003
表2.Kabat CDR序列
Figure PCTCN2020075983-appb-000004
Figure PCTCN2020075983-appb-000005
表3.Chothia CDR序列
Figure PCTCN2020075983-appb-000006
实施例2.抗体序列改造
接着，对鼠源抗体进行人源化改造。具体而言，将鼠源抗体6A11、3F2和7E4的重链可变区和轻链可变区的部分氨基酸序列用人源序列进行替换，优化抗体与抗原的亲和力，提高成药性。对于每种抗体，生成了多个人源化重链可变区和轻链可变区序列。人源化后的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列如以下表4所示。
表4.人源化抗体的可变区序列
Figure PCTCN2020075983-appb-000007
Figure PCTCN2020075983-appb-000008
Figure PCTCN2020075983-appb-000009
实施例3.抗体的结合检测
抗体对PD-L1与PD-1配体结合的阻断作用
本实验用于检测抗PD-L1抗体对PD-L1与PD-1配体结合的阻断能力。具体实验操作如下：取96孔细胞培养板，每孔加入表达人源PD-L1蛋白的CHO-hPD-L1细胞(25μl，2x10 4细胞/孔)。将纯化腹水按照50、5、0.5、0.05、0.005μg/ml的浓度进行稀释，血清按照以1：100稀释后，每孔加入25μl，并于4℃静置30分钟。将Biotin-hPD-1蛋白稀释至0.4μg/ml后，每孔加入50μl，并于4℃静置15分钟。将96孔细胞培养板以1200rpm离心5分钟，使用PBS洗涤两次。随后，每孔加入50μl的1：100稀释的抗小鼠IgG Fc-FITC和1：100稀释的链霉亲和素-PE二抗，并于4℃静置30分钟。随后，将96孔细胞培养板以1200rpm离心5分钟，使用PBS洗涤一次后，每孔加入200μl PBS并进行流式细胞分析。
从图1A、图1B和图1C所示的结果可以看出，腹水纯化的抗PD-L1抗体(08-3F2、07-6A11和17-7E4)和嵌合抗PD-L1抗体(24-1F4-mHvKv-IgG1、 33-10C9-mHvKv-IgG1、23-2A6-mHvKv-IgG1、23-4A8-mHvKv-IgG1)浓度的增加，PE标记的Biotin-hPD-1荧光强度逐渐减弱，表明本发明的抗PD-L1抗体可以阻断人源PD-L1与PD-1配体的结合。
抗体交叉反应检测
分别将恒河猴PD-L1蛋白编码序列(rmPD-L1，SEQ ID NO：54)，小鼠PD-L1蛋白编码序列(mPD-L1，SEQ ID NO：53)和人鼠嵌合PD-L1(鼠PD-L1蛋白的胞外区域用人源蛋白片段替换)蛋白编码序列(chiPD-L1，SEQ ID NO：55)转入CHO细胞内进行蛋白表达，用于抗体交叉反应的检测。上述PD-L1蛋白的氨基酸序列如以下表5所示。
表5.不同物种的PD-L1蛋白序列
Figure PCTCN2020075983-appb-000010
Figure PCTCN2020075983-appb-000011
具体实验操作如下：取96孔细胞培养板，每孔加入上述表达不同PD-L1蛋白的CHO细胞(25μl，2x10 4细胞/孔)，再分别加入25ul腹水纯化的抗PD-L1抗体(1μg/ml)，并于4℃静置30分钟。将96孔细胞培养板以1200rpm离心5分钟，使用PBS洗涤两次。随后，每孔加入50μl的1：100稀释的抗小鼠IgG Fc-FITC，并于4℃静置30分钟。随后，将96孔细胞培养板以1200rpm离心5分钟，使用PBS洗涤一次后，每孔加入200μl PBS并进行流式细胞分析。
从图2A和图2B所示的结果可以看出，三种腹水纯化的抗PD-L1抗体(08-3F2、07-6A11和17-7E4)和四种抗PD-L1嵌合抗体(24-1F4-mHvKv-IgG1、33-10C9-mHvKv-IgG1、23-2A6-mHvKv-IgG1、23-4A8-mHvKv-IgG1)与鼠源PD-L1蛋白没有交叉反应，但与猴源PD-L1蛋白和人鼠嵌合PD-L1蛋白有较强的交叉反应。
抗体亲和力检测
随后，利用Biacore T200(Biacore)的Protein A传感芯片捕获抗体的方法，检测抗PD-L1嵌合抗体、人源化抗体和已上市对照抗体药物与hPD-L1-His(爱必信制备)结合的亲和力。
具体实验操作如下：将抗PD-L1嵌合抗体(07-6A11-mHvKv-IgG1、17-7E4-mHvKv-IgG1、08-3F2-mHvKv-IgG1、23-2A6-mHvKv-IgG1-N297A、23-4A8-mHvKv-IgG1-N297A、24-1F4-mHvKv-IgG1-N297A、33-10C9-mHvKv-IgG1-N297A，0.5ug/ml)、已上市对照抗体药物(Atezolizumab、Avelumab、Duralumab，0.5ug/ml)以及人源化抗体(6A11-H1K3-IgG1、6A11-H1K4-IgG1、6A11-H2K3-IgG1、6A11-H2K4-IgG1、6A11-H3K3-IgG1、6A11-H3K4-IgG1、6A11-H4K3-IgG1、6A11-H4K4-IgG1、7E4-H1K1-IgG1、7E4-H1K2-IgG1、7E4-H1K3-IgG1、7E4-H2K1-IgG1、7E4-H2K2-IgG1、7E4-H2K3-IgG1、7E4-H3K1-IgG1、7E4-H3K2-IgG1、 7E4-H3K3-IgG1、3F2-H1K1-IgG1、3F2-H1K2-IgG1、3F2-H1K3-IgG1、3F2-H2K1-IgG1、3F2-H2K2-IgG1、3F2-H2K3-IgG1、3F2-H3K1-IgG1、3F2-H3K2-IgG1、3F2-H3K3-IgG1、3F2-H4K1-IgG1、3F2-H4K2-IgG1、3F2-H4K3-IgG1)注入传感芯片(10μl/min，25s)，蛋白捕获为45-65RU。然后将hPD-L1-His蛋白分别以200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625或0.78125nM的浓度注入传感芯片(30μl/min，100-400s)，解离时间为300-1000s。用pH2.0的甘氨酸(30μl/min，10-20s)再生芯片后读取检测结果。动力结合速率(Kinetic association rates,kon)和动力解离速率(Kinetic dissociation rates,koff)可通过Bioacore T200测评软件进行1：1朗缪尔结合模型拟合获得((Karlsson,R.Roos,H.Fagerstam,L.Petersson,B.,1994.Methods Enzymology 6.99-110)。亲和力速率常数KD＝koff/kon，所有抗体亲和力检测拟合结果参见表6。
表6.抗PD-L1抗体亲和力检测
Figure PCTCN2020075983-appb-000012
Figure PCTCN2020075983-appb-000013
实施例4.抗体的热稳定性检测
利用Protein Thermal Shift Dye Kit(Thermo Fisher Scientific)和QuantStudioTM 5Real Time PCR Systems(Thermo Fisher Scientific)进行抗 体的热稳定性检测。对抗体蛋白加热去折叠后，用荧光染料标记暴露的疏水区域，通过检测荧光强度反应抗体的热稳定性。根据制造商的说明，将2μl抗体、10.5μl水、5μl Protein Thermal Shift缓冲液和2.5μl染料混合后，以1.6℃/秒的速度加热至25℃，再以0.05℃/秒的速度加热至99℃，检测抗体蛋白变性温度Tm值(如果有两个检测峰，一般以第二个峰值Fab的Tm为准)。
表7中显示了检测的嵌合抗体和人源化抗体的Tm值。此外，为了降低抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和补体依赖的细胞毒作用(CDC)，对获得的抗体进行糖基化修饰，以提高抗体的疗效和安全性。将部分抗体Fc区的某些氨基酸做了替换，例如，对抗体进行了N297A突变。
表7.抗体热稳定性
Figure PCTCN2020075983-appb-000014
Figure PCTCN2020075983-appb-000015
实施例5.抗体的体内药效检测
为了检测抗PD-L1抗体的体内药效，使用了PD-L1基因人源化小鼠制备肿瘤动物模型。该小鼠表达人鼠嵌合PD-L1蛋白(SEQ ID NO:55)，其中鼠PD-L1蛋白的胞外区被人源序列替换：鼠PD-L1蛋白的第21-128位氨基酸(SEQ ID NO:53)被人PD-L1蛋白的第21-128位氨基酸(SEQ ID NO:52)替换。该B-hPD-L1小鼠模型为PD-L1单抗药物的临床前动物实验提供了新的检测方法，极大地提高了临床实验的可预测性(参见PCT申请号PCT/CN2017/099574和中国申请号201710757022.6，上述文献通过引用整体 并入本文)。
肿瘤动物模型的制备过程如下：在B-hPD-L1小鼠体内通过皮下注射接种PD-L1基因人源化的鼠MC-38细胞(结肠癌细胞)。待肿瘤体积达到150±50mm 3后，将小鼠随机分成抗PD-L1抗体给药组和对照组(生理盐水)进行肿瘤抑制药效实验。通过腹腔注射给药。每周定期测量小鼠体重和肿瘤体积2次。肿瘤体积(mm 3)＝0.5x长径x短径 2。基于小鼠的体重计算给药剂量(0.3mg/kg或3mg/kg)。
肿瘤生长抑制率(the tumor growth inhibition percentage,TGI)计算公式：TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100，其中Ti是治疗组第i天的平均肿瘤体积；T0是治疗组第0天的平均肿瘤体积；Vi是对照组第i天的平均肿瘤体积；V0是对照组第0天的平均肿瘤体积。使用T-检验进行统计学分析。当TGI％大于60％时，表示对肿瘤生长具有显著抑制效果。P＜0.05表示统计结果具有显著差异。
抗PD-L1鼠源抗体08-3F2、17-7E4、17-8E9和07-6A11的体内药效实验
取5-6周龄的B-hPD-L1小鼠30只，皮下接种MC38-hPD-L1细胞(5x10 5/只)，待肿瘤体积达到150±50mm 3后随机分为7组，每组5只。给药组分别用抗PD-L1抗体08-3F2、17-7E4、17-8E9、07-6A11和阳性对照抗体药物Atezolizumab通过腹腔注射给药处理，剂量为3mg/kg，对照组注射生理盐水。每周第1、3、5天给药。每周2次测量小鼠的体重和肿瘤体积，3周后结束实验。如图3A和图3B所示，对照组和给药组小鼠的平均体重在整个实验周期都稳定增长，且组间无明显差异，表明抗PD-L1抗体给药后没有对小鼠产生明显的毒性。如图4中的结果所示(分组后21天的肿瘤体积数据)，与对照组相比，给药组中肿瘤的生长都受到不同程度的抑制。以下表8显示了各组的TGI％结果。
表8.肿瘤生长抑制率
Figure PCTCN2020075983-appb-000016
Figure PCTCN2020075983-appb-000017
上述结果表明，本发明的抗PD-L1鼠源抗体08-3F2、07-6A11、17-7E4和17-8E9都显示出肿瘤抑制效果，其中08-3F2、07-6A11和17-7E4组获得了比阳性对照抗体药物Atezolizumab更好的肿瘤抑制效果。
嵌合抗体07-6A11-mHvKv-IgG1、07-6A11-mHvKv-IgG4、 07-6A11-mHvKv-IgG1-N297A的体内药效实验
取5-6周龄的B-hPD-L1小鼠35只，皮下接种MC38-hPD-L1细胞(5x10 5/只)，待肿瘤体积达到150±50mm 3后随机分为7组，每组5只。给药组分别用抗PD-L1嵌合抗体07-6A11-mHvKv-IgG1、07-6A11-mHvKv-IgG4和07-6A11-mHvKv-IgG1-N297A，以及鼠源抗体07-6A11通过腹腔注射给药处理，对照组使用hIgG抗体处理，剂量为3mg/kg。每周第1、3、5天给药。每周2次测量小鼠的体重和肿瘤体积，3周后结束实验。对照组和给药组小鼠的平均体重在整个实验周期都稳定增长，且组间无明显差异，表明抗PD-L1抗体给药后没有对小鼠产生明显的毒性。并且，与对照组相比，给药组中肿瘤的生长都受到不同程度的抑制。
嵌合抗体08-3F2-mHvKv-IgG4、08-3F2-mHvKv-IgG1-N297A、 17-7E4-mHvKv-IgG4和17-7E4-mHvKv-IgG1-N297A的体内药效实验
取5-6周龄的B-hPD-L1小鼠35只，皮下接种MC38-hPD-L1细胞(5x10 5/只)，待肿瘤体积达到150±50mm 3后随机分为7组，每组5只。给药组分别用抗PD-L1嵌合抗体08-3F2-mHvKv-IgG4、08-3F2-mHvKv-IgG1-N297A、17-7E4-mHvKv-IgG4、17-7E4-mHvKv-IgG1-N297A，以及鼠源抗体07-6A11和08-3F2通过腹腔注射给药处理，剂量为3mg/kg，对照组注射生理盐水。每周第1、3、5天给药。每周2次测量小鼠的体重和肿瘤体积，3周后结束实验。对照组和给药组小鼠的平均体重在整个实验周期都稳定增长，且组间无明显差异，表明抗PD-L1抗体给药后没有对小鼠产生明显的毒性。并且，与对照组相比，给药组中肿瘤的生长都受到不同程度的抑制。
嵌合抗体33-10C9-mHvKv-IgG1、24-1F4-mHvKv-IgG1、 23-2A6-mHvKv-IgG1、23-4A8-mHvKv-IgG1、23-2A5-mHvKv-IgG1和 24-1C3-mHvKv-IgG1的体内药效实验
取5-6周龄的B-hPD-L1小鼠35只，皮下接种MC38-hPD-L1细胞(5x10 5/只)，待肿瘤体积达到150±50mm 3后随机分为7组，每组5只。给药组分别用抗PD-L1嵌合抗体33-10C9-mHvKv-IgG1、24-1F4-mHvKv-IgG1、23-2A6-mHvKv-IgG1、23-4A8-mHvKv-IgG1、23-2A5-mHvKv-IgG1和24-1C3-mHvKv-IgG1通过腹腔注射给药处理，剂量为3mg/kg，对照组注射生理盐水。每周第1、3、5天给药。每周2次测量小鼠的体重和肿瘤体积，3周后结束实验。如图5A和图5B所示，对照组和给药组小鼠的平均体重在整个实验周期都稳定增长，且组间无明显差异，表明抗PD-L1抗体给药后没有对小鼠产生明显的毒性。如图6中的结果所示(分组后25天的肿瘤体积数据)，与对照组相比，给药组中肿瘤的生长都受到不同程度的抑制。其中，嵌合抗体23-2A6-mHvKv-IgG1效果最好，其次为33-10C9-mHvKv-IgG1和23-4A8-mHvKv-IgG1。以下表9显示了各组的TGI％结果。
表9.肿瘤生长抑制率
Figure PCTCN2020075983-appb-000018
人源化抗体6A11-H1K3-IgG1-N297A、6A11-H1K4-IgG1-N297A、 3F2-H1K1-IgG1-N297A、3F2-H1K2-IgG1-N297A、7E4-H1K1-IgG1-N297A和 7E4-H2K1-IgG1-N297A的体内药效实验
取5-6周龄的B-hPD-L1小鼠56只，皮下接种MC38-hPD-L1细胞(5x10 5/只)，待肿瘤体积达到150±50mm 3后随机分为7组，每组8只。给药组分别用抗PD-L1人源化抗体6A11-H1K3-IgG1-N297A、6A11-H1K4-IgG1-N297A、3F2-H1K1-IgG1-N297A、3F2-H1K2-IgG1-N297A、7E4-H1K1-IgG1-N297A和 7E4-H2K1-IgG1-N297A通过腹腔注射给药处理，剂量为3mg/kg，对照组注射生理盐水。每周第2，5天给药，每周2次测量体重和肿瘤体积，3周后结束实验。如图7A和图7B所示，对照组和给药组小鼠的平均体重在整个实验周期都稳定增长，且组间无明显差异，表明抗PD-L1抗体给药后没有对小鼠产生明显的毒性。如图8中的结果所示(分组后24天的肿瘤体积数据)，与对照组相比，给药组中肿瘤的生长都受到不同程度的抑制。其中人源化抗体6A11-H1K3-IgG1-N297A效果最好，其次为3F2-H1K2-IgG1-N297A。以下表12显示了各组的TGI％结果。
表10.肿瘤生长抑制率
Figure PCTCN2020075983-appb-000019
不同剂量的抗PD-L1抗体的体内药效实验
取5-6周龄的B-hPD-L1小鼠20只，皮下接种MC38-hPD-L1细胞(5x10 5/只)，待肿瘤体积达到150±50mm 3后随机分为4组，每组5只。给药组分别用1mg/kg、3mg/kg或10mg/kg的抗PD-L1抗体07-6A11通过腹腔注射给药处理，对照组注射生理盐水。每两天给药一次，共给药8次，每周2次测量体重和肿瘤体积，3周后结束实验。如图9A和图9B所示，对照组和给药组小鼠的平均体重在整个实验周期都稳定增长，且组间无明显差异，表明抗PD-L1抗体给药后没有对小鼠产生明显的毒性。如图10中的结果所示(分组后18天的肿瘤体积数据)，与对照组相比，给药组中肿瘤的生长都受到不同程度的抑制,且抗体剂量越大，肿瘤抑制效果越好。以下表13显示了各组的TGI％结果。
表11.肿瘤生长抑制率
Figure PCTCN2020075983-appb-000020
抗PD-L1抗体与其它治疗剂的体内联合用药药效实验
取5-6周龄的B-hPD-L1小鼠35只，皮下接种MC38-hPD-L1细胞(5x10 5/只)，待肿瘤体积达到150±50mm 3后随机分为7组，每组5只。给药组分别用抗PD-L1鼠源抗体07-6A11(0.3mg/kg)，抗CTLA4抗体mCTLA4(1mg/kg)，抗OX40抗体mOX40(0.3mg/kg)或其组合通过腹腔注射给药处理，对照组注射生理盐水。其中抗PD-L1抗体每周第1，3，5天给药，抗CTLA4抗体和抗OX40每周第1，4天给药，每周2次测量体重和肿瘤体积，3周后结束实验。如图11A和图11B所示，对照组和给药组小鼠的平均体重在整个实验周期都稳定增长，且组间无明显差异，表明上述三种抗体单独给药或组合给药后没有对小鼠产生明显的毒性。如图12A、图12B和图12C中的结果所示(分组后21天的肿瘤体积数据)，给药组对肿瘤生长的都有不同程度的抑制。以下表14显示了各组的TGI％结果。从该结果可见，抗PD-L1抗体和抗CTLA4抗体或抗OX40抗体联用的疗效明显优于抗体单独使用的疗效，可以更高效的抑制肿瘤细胞的生长。其中，所使用的mCTLA4购自BioXcell，货号为BE0164；mOX40购自BioXcell，货号为BE0031。
表12.肿瘤生长抑制率
Figure PCTCN2020075983-appb-000021
Figure PCTCN2020075983-appb-000022

Claims (45)

  1. 一种抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，所述抗体具有以下重链互补决定区(CDR H)：
    CDR H1，所述CDR H1包含选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:82的氨基酸序列；
    CDR H2，所述CDR H2包含选自SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:83的氨基酸序列；和
    CDR H3，所述CDR H2包含选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:84的氨基酸序列。
  2. 如权利要求1所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有以下CDR H：
    a)分别包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的CDR H1、CDR H2和CDR H3；
    b)分别包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的CDR H1、CDR H2和CDR H3；
    c)分别包含SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的CDR H1、CDR H2和CDR H3；
    d)分别包含SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66的CDR H1、CDR H2和CDR H3；
    e)分别包含SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72的CDR H1、CDR H2和CDR H3；
    f)分别包含SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78的CDR H1、CDR H2和CDR H3；或者
    g)分别包含SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:84的CDR H1、CDR H2和CDR H3。
  3. 如权利要求1或2所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体还具有以下轻链互补决定区(CDR L)：
    CDR L1，所述CDR L1包含选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:85的氨基酸序列；
    CDR L2，所述CDR L2包含选自SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:86的氨基酸序列；和
    CDR L3，所述CDR L2包含选自SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:87的氨基酸序列。
  4. 如权利要求3所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有以下CDR L：
    a)分别包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的CDR L1、CDR L2和CDR L3；
    b)分别包含SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的CDR L1、CDR L2和CDR L3；
    c)分别包含SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24的CDR L1、CDR L2和CDR L3；
    d)分别包含SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:69的CDR L1、CDR L2和CDR L3；
    e)分别包含SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:75的CDR L1、CDR L2和CDR L3；
    f)分别包含SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:81的CDR L1、CDR L2和CDR L3；或者
    g)分别包含SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:87的CDR L1、CDR L2和CDR L3。
  5. 如权利要求4所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有以下CDR H和CDR L：
    a)分别包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的CDR H1、CDR H2和CDR H3，以及分别包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的CDR L1、CDR L2和CDR L3；
    b)分别包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的CDR H1、CDR H2和CDR H3，以及分别包含SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的CDR L1、CDR L2和CDR L3；
    c)分别包含SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的CDR H1、CDR H2和CDR H3，以及分别包含SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24的CDR L1、CDR L2和CDR L3；
    d)分别包含SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66的CDR H1、CDR H2和CDR H3，以及分别包含SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:69的CDR L1、CDR L2和CDR L3；
    e)分别包含SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72的CDR H1、CDR H2和CDR H3，以及分别包含SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:75的CDR L1、CDR L2和CDR L3；
    f)分别包含SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78的CDR H1、CDR H2和CDR H3，以及分别包含SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:81的CDR L1、CDR L2和CDR L3；或者
    g)分别包含SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:84的CDR H1、CDR H2和CDR H3，以及分别包含SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:87的CDR L1、CDR L2和CDR L3。
  6. 一种抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有包含以下序列的重链可变区(VH)：
    a)选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:62的氨基酸序列；
    b)与a)的氨基酸序列具有至少80％序列同一性，例如至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；或者
    c)在a)的氨基酸序列中进行了一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列。
  7. 如权利要求6所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体 还具有包含以下序列的轻链可变区(VL)：
    a)选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:63的氨基酸序列；
    b)与a)的氨基酸序列具有至少80％序列同一性，例如至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；或者
    c)在a)的氨基酸序列中进行了一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列。
  8. 如权利要求7所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有以下VH和VL：
    a)分别包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH和VL；
    b)分别包含与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2具有至少80％序列同一性，例如至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的VH和VL；或者
    c)分别包含在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中进行了一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列的VH和VL。
  9. 如权利要求7所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有以下VH和VL：
    a)分别包含SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VH和VL；
    b)分别包含与SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4具有至少80％序列同一性，例如至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的VH和VL；或者
    c)分别包含在SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中进行了一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列的VH和VL。
  10. 如权利要求7所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有以下VH和VL：
    a)分别包含SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VH和VL；
    b)分别包含与SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6具有至少80％序列同一性，例如至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的VH和VL；或者
    c)分别包含在SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中进行了一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列的VH和VL。
  11. 如权利要求7所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有以下VH和VL：
    a)分别包含SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57的氨基酸序列的VH和VL；
    b)分别包含与SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57具有至少80％序列同一性，例如至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的VH和VL；或者
    c)分别包含在SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57中进行了一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列的VH和VL。
  12. 如权利要求7所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有以下VH和VL：
    a)分别包含SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59的氨基酸序列的VH和VL；
    b)分别包含与SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59具有至少80％序列同一性，例如至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的VH和VL；或者
    c)分别包含在SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59中进行了一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列的VH和VL。
  13. 如权利要求7所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有以下VH和VL：
    a)分别包含SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61的氨基酸序列的VH和VL；
    b)分别包含与SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61具有至少80％序列同一性，例如至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的VH和VL；或者
    c)分别包含在SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61中进行了一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列的VH和VL。
  14. 如权利要求7所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体 具有以下VH和VL：
    a)分别包含SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63的氨基酸序列的氨基酸序列VH和VL；
    b)分别包含与SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63具有至少80％序列同一性，例如至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的VH和VL；或者
    c)分别包含在SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63中进行了一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列的VH和VL。
  15. 如权利要求1-14中任一项所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。
  16. 如权利要求6-14中任一项所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中所述氨基酸修饰在可变区的框架区中进行。
  17. 如权利要求6-14中任一项所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中所述氨基酸修饰是人源化修饰。
  18. 如权利要求8所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有包含选自SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VH，和包含选自SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45的氨基酸序列的VL。
  19. 如权利要求9所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有包含选自SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH，和包含选自SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VL。
  20. 如权利要求10所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有包含选自SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48的氨基酸序列的VH，和包含选自SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51的氨 基酸序列的VL。
  21. 如权利要求1-20中任一项所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含Fc区的修饰，所述Fc区的修饰降低所述抗体的抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和/或补体依赖的细胞毒作用(CDC)。
  22. 如权利要求21所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中所述修饰包含取代N297A。
  23. 如权利要求1-22中任一项的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体选自IgG、IgA、IgM、IgE和IgD同种型。
  24. 如权利要求1-23中任一项所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型。
  25. 如权利要求1-24中任一项所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab片段、Fab’片段、Fd片段、Fd’片段、Fv片段、dAb片段、F(ab’) 2片段、单链片段、双抗体(diabody)、和线性抗体。
  26. 一种双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含结合PD-L1的第一抗原结合区，和结合另一抗原的第二抗原结合区，所述第一抗原结合区包含如权利要求1-5中任一项所述的抗PD-L1抗体的CDRH1、CDRH2和CDRH3，和/或CDRL1、CDRL2和CDRL3，或权利要求6-20中任一项所述的抗PD-L1抗体的VH和/或VL。
  27. 如权利要求26所述的双特异性抗体，其中所述另一抗原选自肿瘤相关抗原和免疫检查点分子。
  28. 一种核苷酸序列，所述核苷酸序列编码如权利要求1-25中任一项所述的抗PD-L1抗体的多肽链。
  29. 一种核苷酸序列，所述核苷酸序列编码如权利要求6-20中任一项所述的抗PD-L1抗体的VH或VL。
  30. 一种载体，所述载体包含如权利要求28或29所述的核苷酸序列。
  31. 一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含如权利要求28或29所述的核苷酸序列，或如权利要求30所述的载体。
  32. 一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞产生如权利要求1-25中任一项所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。
  33. 一种缀合物，所述缀合物包含如权利要求1-25中任一项所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段或如权利要求26或27所述的双特异性抗体，以及与其缀合的部分，其中所述部分选自细胞毒素、放射性同位素、荧光标记物、发光物质、显色物质或酶。
  34. 一种组合物，所述组合物包含如权利要求1-25中任一项所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，如权利要求26或27所述的双特异性抗体或如权利要求33所述的缀合物，和任选的一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。
  35. 一种治疗受试者中的癌症的方法，所述方法包括对所述受试者施用如权利要求1-25中任一项所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，如权利要求26或27所述的双特异性抗体，如权利要求33所述的缀合物，或如权利要求34所述的组合物的步骤。
  36. 如权利要求35所述的方法，其中所述癌症选自黑色素瘤、淋巴瘤、膀胱癌、非小细胞肺癌、头颈癌、结肠癌和皮肤癌。
  37. 如权利要求35或36所述的方法，所述方法还包括对所述受试者施用一种多种另外的治疗剂。
  38. 如权利要求37所述的方法，其中所述治疗剂选自抗体、化疗药物和小分子化合物。
  39. 如权利要求37或38所述的方法，所述治疗剂靶向免疫检查点分子，所述免疫检查点分子选自PD-1、PD-L2、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3、TIGIT和CD103。
  40. 如权利要求1-25中任一项所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，如权利要求26或27所述的双特异性抗体，如权利要求33所述的缀合物，或如权利要求34所述的组合物在治疗受试者中的癌症中的用途。
  41. 如权利要求1-25中任一项所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，如权利要求26或27所述的双特异性抗体，如权利要求33所述的缀合物，或如权利要求34所述的组合物在制备用于治疗受试者中的癌症的药物中的用途。
  42. 如权利要求40或41所述的用途，其中所述癌症选自黑色素瘤、淋巴瘤、膀胱癌、非小细胞肺癌、头颈癌、结肠癌和皮肤癌。
  43. 如权利要求40-42中任一项所述的用途，其中所述抗PD-L1抗体或其抗原结合片段、缀合物或组合物与一种或多种另外的治疗剂联用。
  44. 如权利要求43所述的用途，其中所述治疗剂选自抗体、化疗药物和小分子化合物。
  45. 如权利要求43或44所述的用途，所述治疗剂靶向免疫检查点分子，所述免疫检查点分子选自PD-1、PD-L2、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3、TIGIT和CD103。
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Free format text: 1) APRESENTAR, EM ATE 60 (SESSENTA) DIAS, DOCUMENTOS COMPROBATORIOS QUE EXPLIQUEM E REGULARIZEM A DIVERGENCIA NO NOME DO INVENTOR CONSTANTE NA PUBLICACAO INTERNACIONAL WO/2020/169062 DE 27/08/2020 COMO YA'NAN GUO CONSTANTE NO FORMULARIO DA PETICAO INICIAL NO 870210076865 DE 20/08/2021 COMO YANAN GUO UMA VEZ QUE NAO HOUVE ENVIO DE DOCUMENTO COMPROVANDO QUE OS NOME CORRETO DO INVENTOR E O DECLARADO NA ENTRADA NACIONAL. 2) COM BASE NA PORTARIA 405 DE 21/12/2020, SOLICITA-SE QUE SEJA APRESENTADO, EM ATE 60 (SESSENTA) DIAS, NOVO CONTEUDO DE LISTAGEM DE SEQUENCIA POIS O CONTEUDO APRESENTADO NA PETICAO NO 870210090837 DE 01/10/2021 NAO POSSUI TODOS OS CAMPOS OBRIGATORIOS INFORMADOS, NAO CONSTANDO O

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