CN114457025A

CN114457025A - 一种表达btla阻断物的多能干细胞或其衍生物及应用

Info

Publication number: CN114457025A
Application number: CN202011186004.5A
Authority: CN
Inventors: 王淋立; 陈月花; 莫健; 杨建国
Original assignee: Future Intelligent Regenerative Medicine Research Institute Guangzhou Co ltd
Current assignee: Future Intelligent Regenerative Medicine Research Institute Guangzhou Co ltd
Priority date: 2020-10-30
Filing date: 2020-10-30
Publication date: 2022-05-10

Abstract

本发明公开了一种表达BTLA阻断物的多能干细胞或其衍生物及应用，该多能干细胞或其衍生物的基因组导入有BTLA阻断物的表达序列，所述BTLA阻断物为抗BTLA抗体、可溶性的BTLA负性共刺激分子中的至少一种。本发明提供的表达BTLA阻断物的多能干细胞或其衍生物，可用于自体细胞诱导iPSCs或分化成MSCs这类低免疫源性细胞进行运用，其可在体内持续表达BTLA阻断物，用于治疗BTLA高表达肿瘤及相关疾病。

Description

一种表达BTLA阻断物的多能干细胞或其衍生物及应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种表达BTLA阻断物的多能干细胞或其衍生物及应用。

背景技术

BTLA(the B and T lymphocyte attenuator,BTLA)是一个新的CD28超家族共刺激分子。BTLA主要表达于活化的B细胞、分化中的Th1和Th2细胞，但Th2细胞极化后则不再表达。BTLA是免疫抑制性受体，属于I型跨膜糖蛋白，其蛋白结构与细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)和程序性死亡受体1(PD-1)相似，包括胞外区域、跨膜区和一个胞质区。BTLA胞质区包括3个酪氨酸残基，两个免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)，磷酸化后可结合和激活酪氨酸酶SHP-1和SHP-2。另一酪氨酸残基被预测为Crb2招募位点，它还可以连接胞内磷脂酰肌醇激酶(PI3K)的p85亚基，经PI3K途径指导BTLA的共刺激的免疫调节。研究表明，疱疹病毒侵入介体(HVEM)与淋巴毒素类似物(LIGHT)相互作用提供正性共刺激信号，而HVEM与BTLA结合则产生负性共刺激信号。抗原呈递细胞(APC)上表达的HVEM与BTLA相互作用，产生抑制信号，特别是在B7-1低表达时。BTLA的配体是HVEM，而HVEM主要行使正向调节功能，与LIGHT作用，促进T、B细胞增殖及Ig的产生，通过NK细胞受体激活NK细胞并使其分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IFN-γ。BTLA与HVEM的相互作用传递抑制信号下调淋巴细胞的免疫应答。BTLA及HVEM主要通过在细胞表面的动态表达来调节T细胞和APC的功能，在CD4+T细胞的初次和再次免疫应答及CD8+T细胞的再次应答中，BTLA交联T细胞受体(TCR)来抑制T细胞活化。BTLA与配体结合不仅抑制T细胞增殖，下调T细胞活化标记CD25，还可抑制IFN-γ，IL-2，IL-4和IL-10等的产生。即BTLA的表达或BTLA-HVEM结合情况与T细胞的活化与增值密切相关，BTLA阻断物可作为肿瘤治疗药物。目前，仅君实生物BTLA单抗注射液处于临床阶段。但是这类抗体药物的作用时间短，需要长期进行注射，对于病人来说需要花费高昂的费用。

干细胞是一类具备自我更新能力及向特定功能体细胞分化能力的“种子”细胞，具有再生为各种组织器官和人体的潜力，在免疫应答、衰老、肿瘤发生等重大生物学活动中发挥着核心且不可替代的作用。依据干细胞特性的程度差异，主要将干细胞分为：全能干细胞(Totipotent stem cells)、多能干细胞(Pluripotent stem cells，PSCs)和成体干细胞(adult stem cell)。其中，多能干细胞PSCs具备几近无限的自我更新能力，以及在正常发育条件下向胚内所有胚层的器官、组织、细胞发育分化的潜能，典型的PSCs主要包括胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)、胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EGCs)、胚胎癌细胞(embryonic carcinoma cells，ECCs)，以及诱导多能干细胞(induced pluripotentstem cells，iPSCs)等，这类细胞由于其强大的功能，并且可以一定程度地通过伦理限制，因此具有十分深远和广泛的应用前景。

因此，开发一种可以在人体中表达BTLA阻断物的多能干细胞或其衍生物具有重要意义。

但是，无论是自体iPSCs细胞库，还是免疫配型PSCs细胞库的构思或建立都需要花费极大的财力、物力和人力。同种异基因供受体的器官、组织或细胞移植的分子免疫学基础主要是基于经典的主要组织相容性复合体MHC-I和MHC-II(人又作HLA-I、HLA-II)的配型。截至2019年6月，已鉴定和命名的HLA系统等位基因已超过20000个，仅经典的HLA-A、B、C的等位基因数分别都超过5000个，这些经典的HLA-I/II型等位基因各种可能的随机组合将是天文数字，并且随着新的等位基因的发现组合数随之增加，给器官、组织、细胞移植前的组织配型及供体选择带来极大的障碍，也给构建覆盖人群免疫配型PSCs细胞库带来巨大的困难。

于是，构建同种异体免疫兼容的通用型PSCs迫在眉睫。近年已有许多报道通过敲除B2M、CIITA等基因，实现HLA-I和HLA-II细胞表面或本身基因的缺失表达，进而使细胞具备免疫耐受或逃逸T/B细胞特异性免疫应答，产生免疫兼容的通用型PSCs，为更广泛的通用型PSCs源细胞、组织、器官应用奠定了重要的基础。也有报道细胞过表达CTLA4-Ig、PD-L1从而抑制同种异的免疫排斥。最近又有报道，在敲除B2M、CIITA的同时，敲入CD47，从而使细胞获得了逃逸除特异性免疫应答外，还具备免疫耐受或逃逸NK等细胞的固有免疫应答，从而使细胞具备了更加全面更强的免疫兼容特性。然而，这些方案要么免疫兼容不彻底，仍有通过其他途径发生同种异体的免疫排斥；要么彻底消除同种异体免疫排斥应答，但使供体源移植物的细胞本身同时丧失了抗原提呈的能力，这给受体带来了极大的致瘤性和病毒感染等疾病的风险。

为此，也有报道，不直接敲除B2M，而敲除HLA-A、HLA-B或一并敲除CIITA的同时，保留HLA-C，并构建12个覆盖人群超过90％的HLA-C免疫配型抗原，以此达到移植物的细胞仍具备一定程度的抗原提呈功能，并且同时能够通过HLA-C抑制NK细胞的固有免疫应答。但这类细胞，一来，HLA-I类抗原提呈的抗原类型缩小了三分之二以上，能够提呈的抗原完整性极大地不可逆的缩小，对于各种肿瘤、病毒以及其他疾病抗原的提呈具有极大的偏向性，仍然保留了相当程度的致瘤和病毒感染等疾病的风险，在CIITA同时敲除的情况下其致病风险更高；二来，12种高频率免疫配型的HLA-C抗原种族差异很大，通过我们核实计算部分地区仅能占到70％的比例，而中国、印度等人口大国目前尚未有权威的大样本量的HLA数据展示，这样制备出来的通用型PSCs使用仍受到巨大的配型空缺考验；第三，这种方法会经历数次反复的基因编辑工作，按每次基因编辑至少两轮单细胞分离培养计，整个过程至少需要六轮以上的单细胞分离培养，这些流程不可避免且极大概率地因多次基因编辑脱靶或染色质不稳定或因大量单细胞传代增殖造成细胞各种不可预测的突变，进而诱发致癌、代谢疾病等各种问题。由此可见，这类免疫兼容方案亦为“过渡时期”的权宜之计，仍有许多问题没有更好的解决。

此外，还有人设计通过诱导自杀基因在供体组织、细胞致病后诱导杀死，这样做的后果将产生严重的组织坏死、细胞因子风暴等不可预知的疾病风险问题，并且这类设计的细胞杀死后将不复存在合适的供体细胞、组织和器官又是一大难题。

发明内容

为了克服现有技术所存在的不足，本发明的第一方面的目的，在于提供一种表达BTLA阻断物的多能干细胞或其衍生物，包括表达BTLA阻断物的非免疫兼容的多能干细胞或其衍生物、表达BTLA阻断物的免疫兼容的多能干细胞或其衍生物、表达BTLA阻断物的免疫兼容可逆的多能干细胞或其衍生物中的至少一种；其中，表达BTLA阻断物的免疫兼容的多能干细胞或其衍生物可以通过如下方案实现：将多能干细胞或其衍生物基因组中的B2M和/或CIITA基因敲除和/或在多能干细胞或其衍生物的基因组敲入免疫兼容分子的表达序列；表达BTLA阻断物的免疫兼容可逆的多能干细胞或其衍生物通过如下方案实现：在多能干细胞或其衍生物的基因组敲入免疫兼容分子及诱导型基因表达系统，多能干细胞或其衍生物基因组中导入的免疫兼容分子的表达通过诱导型基因表达系统调控，而诱导型基因表达系统的开启与关闭受外源诱导物的调控；当免疫兼容分子正常表达时，多能干细胞或其衍生物中与免疫应答相关的基因的表达被抑制或过表达，可以消除或降低供体细胞和受体之间的同种异体免疫排斥应答；而当供体细胞发生病变时，可通过外源诱导物诱导关闭免疫兼容分子的表达，恢复供体细胞的抗原提呈能力，使受体能够清除病变的供体细胞。

本发明的第二个方面的目的，在于提供上述多能干细胞或其衍生物在制备BTLA高表达肿瘤治疗药物中的应用。

本发明的第三个方面的目的，在于提供一种制剂，包含上述多能干细胞或其衍生物。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种表达BTLA阻断物的多能干细胞或其衍生物，所述多能干细胞或其衍生物的基因组导入有BTLA阻断物的表达序列，所述BTLA阻断物为抗BTLA抗体、可溶性的BTLA负性共刺激分子(sBTLA)中的至少一种。

所述抗BTLA抗体优选为分泌型抗体。

所述抗BTLA抗体的重链序列如SEQ ID NO.1所示，轻链序列如SEQ ID NO.2所示；所述sBTLA的序列如SEQ ID NO.3所示。

所述BTLA阻断物的表达序列的导入位点为多能干细胞或其衍生物的基因组安全位点。

所述基因组安全位点包括AAVS1安全位点、eGSH安全位点、H11安全位点中的一种或多种。

作为本发明的另一个技术方案：所述多能干细胞或其衍生物的B2M和/或CIITA基因被敲除，从而得到一种表达BTLA阻断物的免疫兼容的多能干细胞或其衍生物。

作为本发明的另一个技术方案：所述多能干细胞或其衍生物的基因组还导入一种或多种免疫兼容分子表达序列，所述免疫兼容分子用于调控多能干细胞细胞或其衍生物中与免疫应答(同种异体免疫排斥)相关的基因的表达，从而得到一种表达BTLA阻断物的免疫兼容的多能干细胞或其衍生物。

所述与免疫应答相关的基因包括：

(1)主要组织相容性复合体基因，包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1和HLA-DPB1中的至少一种；

(2)主要组织相容性复合体相关基因，包括B2M和CIITA中的至少一种。

所述免疫兼容分子表达序列的导入位点为多能干细胞或其衍生物的基因组安全位点。

所述免疫兼容分子包括以下的任一种或多种：

(1)免疫耐受相关基因，包括CD47或HLA-G；

(2)HLA-C类分子，包括人群中比例合计超过90％的HLA-C复等位基因，或者超过90％的HLA-C复等位基因与B2M构成的融合蛋白基因；

(3)主要组织相容性复合体基因的shRNA和/或shRNA-miR，所述主要组织相容性复合体基因包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1和HLA-DPB1中的至少一种；

(4)主要组织相容性复合体相关基因的shRNA和/或shRNA-miR，所述主要组织相容性复合体相关基因包括B2M和CIITA中的至少一种。

所述B2M的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.6中的至少一种；

所述CIITA的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.16中的至少一种；

所述HLA-A的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.19中的至少一种；

所述HLA-B的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.20～SEQ ID NO.25中的至少一种；

所述HLA-C的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.26～SEQ ID NO.31中的至少一种；

所述HLA-DRA的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.32～SEQ ID NO.41中的至少一种；

所述HLA-DRB1的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.42～SEQ ID NO.46中的至少一种；

所述HLA-DRB3的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.47～SEQ ID NO.48中的至少一种；

所述HLA-DRB4的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.49～SEQ ID NO.58中的至少一种；

所述HLA-DRB5的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.59～SEQ ID NO.67中的至少一种；

所述HLA-DQA1的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.68～SEQ ID NO.74中的至少一种；

所述HLA-DQB1的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.75～SEQ ID NO.84中的至少一种；

所述HLA-DPA1的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.85～SEQ ID NO.94中的至少一种；

所述HLA-DPB1的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.95～SEQ IDNO.104中的至少一种。

所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因和/或抗干扰素效应分子。

所述shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因包括Drosha、Ago1、Ago2、Dicer1、Exportin-5、TRBP(TARBP2)、PACT(PRKRA)、DGCR8中的至少一种；所述抗干扰素效应分子为PKR、2-5As、IRF-3和IRF-7中的至少一种的shRNA和/或shRNA-miR。

所述shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因和/或抗干扰素效应分子的导入位点为多能干细胞或其衍生物的基因组安全位点。

所述PKR的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.105～SEQ ID NO.114中的至少一种；

所述2-5As的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.115～SEQ ID NO.144中的至少一种；

所述IRF-3的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.145～SEQ ID NO.154中的至少一种；

所述IRF-7的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.155～SEQ ID NO.164中的至少一种。

所述主要组织相容性复合体基因、主要组织相容性复合体相关基因、PKR、2-5As、IRF-3或IRF-7的shRNA和/或shRNA-miR的表达框架如下所示：

(1)shRNA表达框架：由5’到3’依次包括shRNA靶序列、茎环序列、shRNA靶序列的反向互补序列、Poly T；两个反向互补靶序列由中间一茎环序列分隔组成发夹结构，最后连上Poly T作为RNA聚合酶III的转录终止子；

(2)shRNA-miR表达框架：使用上述主要组织相容性复合体基因、主要组织相容性复合体相关基因、PKR、2-5As、IRF-3或IRF-7的shRNA-miR靶序列替换microRNA-30或者microRNA-155中的靶序列得到。

所述shRNA表达框架中的茎环序列长度为3～9个碱基；所述Poly T长度为5～6个碱基。

上述表达框架可根据需要在5’端加上组成型启动子或诱导型启动子，例如U6启动子、H1启动子，以及配套的启动子调控元件。

作为本发明的另一个技术方案：所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入诱导型基因表达系统，用于调控免疫兼容分子的表达，从而得到一种免疫兼容可逆的表达BTLA阻断物的多能干细胞或其衍生物。

所述诱导型基因表达系统为Tet-Off系统、二聚体诱导表达系统中的至少一种。

所述诱导型基因表达系统的导入位点为多能干细胞或其衍生物的基因组安全位点。

以上所述BTLA阻断物的表达序列、免疫兼容分子的表达序列、shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因、抗干扰素效应分子、诱导型基因表达系统的导入采用病毒载体干扰、非病毒载体转染或基因编辑的方法。

所述基因编辑的方法包括基因敲入。

以上所述多能干细胞包括胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、胚胎癌细胞、或者诱导多能干细胞；所述多能干细胞衍生物包括多能干细胞所分化的成体干细胞、各胚层细胞或组织。

所述成体干细胞包括间充质干细胞、神经干细胞。

本发明的第二个方面，提供上述多能干细胞或其衍生物在制备BTLA高表达肿瘤治疗药物中的应用。

本发明的第三个方面，提供一种制剂，包含上述多能干细胞或其衍生物。

所述制剂还包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

本发明的有益效果是：

本发明提供的表达BTLA阻断物的多能干细胞或其衍生物，可用于自体细胞诱导iPSCs或分化成MSCs这类低免疫源性细胞进行运用，其可在体内持续表达BTLA阻断物，用于治疗BTLA高表达肿瘤及相关疾病。

本发明提供的表达BTLA阻断物的免疫兼容的多能干细胞或其衍生物，由于多能干细胞或其衍生物中的B2M、CIITA基因被敲除，或者其基因组中导入了免疫兼容分子表达序列，因而此类多能干细胞或其衍生物的免疫源性低，将其移植到受体中时，可以克服供体细胞和受体之间的同种异体免疫排斥问题，使得供体细胞能够在受体内长时间持续表达BTLA阻断物。

本发明提供的表达BTLA阻断物的免疫兼容可逆的多能干细胞或其衍生物的基因组中导入诱导型基因表达系统以及免疫兼容分子表达序列。诱导型基因表达系统受外源诱导物的调控，通过调整外源诱导物的添加量、持续作用时间、种类来控制诱导型基因表达系统的开启与关闭，从而控制疫兼容分子表达序列的表达量。而免疫兼容分子可调控多能干细胞细胞或其衍生物中与免疫应答相关的基因的表达。当免疫兼容分子正常表达时，多能干细胞或其衍生物中与免疫应答相关的基因的表达被抑制或过表达，可以消除或降低供体细胞和受体之间的同种异体免疫排斥应答，使得供体细胞能够长时间在受体中持续表达BTLA阻断物。而当供体细胞发生病变时，可通过外源诱导物诱导关闭免疫兼容分子的表达，从而可逆地使供体细胞表面重新表达HLAⅠ类分子，恢复供体细胞的抗原提呈能力，使受体能够清除病变的细胞，从而提高了这类通用型多能干细胞或其衍生物的临床安全性，极大地扩展其在临床应用的价值。

此外，还可以通过调整外源诱导物的添加量、持续作用时间，让移植物逐步表达低浓度的HLA分子来刺激受体，使得受体对移植物逐步产生耐受，最终达到稳定的耐受。此时，即使移植物细胞表面表达不匹配的HLAⅠ类分子，也能够被受体免疫系统兼容，这样可以使得在诱导关闭移植物细胞中免疫兼容分子的表达后，受体免疫系统一方面能够重新识别移植物中HLAⅠ类分子提呈的有基因突变的细胞，清除病变细胞；另一方面，未发生突变的部分由于被上述诱导物训练产生同种异体HLAⅠ类分子耐受而不会被受体免疫系统清除。从而使受体免疫系统仅清除有害突变的移植物，保留正常功能的移植物，当有害的移植物清除后，又可以转入移植物细胞表面HLAⅠ类分子沉默的模式。由外源诱导物介导的移植物免疫耐受程序还可以在受体彻底耐受后，植入无诱导或其他方式诱导开启或关闭HLAⅠ类分子表面表达的移植物。

附图说明

图1是AAVS1 KI(Knock-in，下同)Vector(shRNA,组成型)质粒图谱。

图2是AAVS1 KI Vector(shRNA,诱导型)质粒图谱。

图3是AAVS1 KI Vector(shRNA-miR,组成型)质粒图谱。

图4是AAVS1 KI Vector(shRNA-miR,诱导型)质粒图谱。

图5是sgRNA clone B2M-1质粒图谱。

图6是sgRNA clone B2M-2质粒图谱。

图7是sgRNA clone CIITA-1质粒图谱。

图8是sgRNA clone CIITA-2质粒图谱。

图9是Cas9(D10A)质粒图谱。

图10是sgRNA Clone AAVS1-1质粒图谱。

图11是sgRNA Clone AAVS1-2质粒图谱。

具体实施方式

以下结合具体的实施例及附图对本发明的内容作进一步详细的说明。

应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

1实验材料与方法

1.1BTLA阻断物

抗BTLA抗体的重链(HC)序列如SEQ ID NO.1所示，轻链(LC)序列如SEQ ID NO.2所示。

sBTLA的序列如SEQ ID NO.3所示。

1.2多能干细胞或其衍生物

多能干细胞可选自胚胎干细胞(ESCs)、诱导多能干细胞(iPSCs)以及其他形式的多能干细胞，例如hPSCs-MSCs、NSCs、EBs细胞。其中：

ESCs：可选用HN4细胞，购自上海中科院。

iPSCs：使用我们所建立的第三代高效安全的episomal-iPSCs诱导系统(6F/BM1-4C)，pE3.1-OG--KS和pE3.1-L-Myc--hmiR302cluster经电转进入体细胞中，RM1培养2天，含2uMParnate的BioCISO-BM1培养2天，含2uM Parnate、0.25mM sodium butyrate、3uMCHIR99021和0.5uM PD03254901的BioCISO-BM1培养2天，在用干细胞培养基BioCISO培养到17天左右即可挑取iPSCs克隆，所挑取的iPSCs克隆经纯化、消化、传代以获得稳定的iPSCs。具体构建方法参见：Stem Cell Res Ther.2017Nov 2；8(1):245。

hPSCs-MSCs：将iPSCs使用干细胞培养基(BioCISO，含10uM TGFβ抑制剂SB431542)培养25天，期间80-90汇合度进行消化传代(2mg/mL Dispase消化)，1:3传代到Matrigel包被的培养板中，接着ESC-MSC培养基(knockout DMEM培养基，含10％KSR、NEAA、双抗、谷氨酰胺、β-巯基乙醇、10ng/mL bFGF和SB-431542)进行培养，每天换液，80-90汇合度进行传代(1:3传代)，连续培养20天即可。具体构建方法参见：Proc Natl Acad Sci U S A.2015；112(2):530-535。

NSCs：将iPSCs使用诱导培养基(knockout DMEM培养基，含10％KSR，含TGF-β抑制剂，BMP4抑制剂)培养14天，挑取玫瑰花环状的神经细胞到低粘附培养板中进行培养，培养基使用比例为1:1的DMEM/F12(含1％N2，Invitrogen)和Neurobasal培养基(含2％B27，Invitrogen)，还含有20ng/ml bFGF和20ng/ml EGF，进行培养，消化使用Accutase进行消化传代即可。具体构建方法参见：FASEB J.2014；28(11):4642-4656。

EBs细胞：将汇合度达到95％的iPSCs使用BioC-PDE1消化6min后使用机械刮传法将细胞刮成块状，沉降降细胞团块，沉降的细胞团块转移到低粘附培养板中使用BioCISO-EB1培养7天，隔天换液。7天后转移到Matrigel包被的培养板中继续使用BioCISO进行贴壁培养，7天后即可获得具有内、中、外三胚层结构的拟胚体(EBs)。具体构建方法参见：StemCell Res Ther.2017 Nov 2；8(1):245。

所述多能干细胞衍生物还包括多能干细胞所分化的成体干细胞、各胚层细胞或组织、器官；所述成体干细胞包括间充质干细胞或者神经干细胞。

1.3基因组安全位点

本发明技术方案中，基因敲入的基因组安全位点可选自AAVS1安全位点、eGSH安全位点，或者其它安全位点：

(1)AAVS1安全位点

AAVS1位点(别名“PPP1R2C位点”)位于人类基因组第19号染色体上，是一个经过验证、能够确保转入DNA片段预期功能的“安全港”位点。该位点是一个开放的染色体结构，能保证转入基因能被正常转录，且该位点插入外源目的片段对细胞无已知的副作用。

(2)eGSH安全位点

eGSH安全位点位于人类基因组第1号染色体上，是一个经过论文验证、能够确保转入DNA片段预期功能的另一个“安全港”位点。

(3)其它安全位点

H11安全位点(也叫Hipp11)，位于人的22号染色体，是Eif4enif1与Drg1这两个基因之间的一个位点，由Simon Hippenmeyer于2010年发现并命名，由于H11位点位于两个基因之间，故外源基因插入后影响內源基因表达的风险很小。H11位点被验证是一个基因间的安全的转录激活区域，是AAVS1、eGSH位点之外的一个新的“安全港”位点。

1.4诱导型基因表达系统

诱导型基因表达系统选自：tet-Off系统或者二聚体关闭表达系统：

(1)tet-Off系统

在没有四环素存在时，tTA蛋白持续作用在tet启动子上，使基因持续表达。在需要转基因保持在一个持续表达状态下，该系统是非常有用。加入四环素时，四环素可使tTA蛋白的结构变化，使其不能与启动子结合，从而使其驱动的基因表达水平下降。为了使该系统保持“关闭”状态，必须连续添加四环素。

本发明将tet-Off系统以及一种或多种免疫兼容分子的序列敲入多能干细胞的基因组安全位点处，通过四环素的添加与否精准开启或关闭免疫兼容分子的表达，从而可逆调控多能干细胞或其衍生物中主要组织相容性复合体相关基因的表达。

(2)二聚体关闭表达系统

二聚体介导的基因表达调控系统：化学调控靶基因转录的方法有很多种，最常见的是利用影响转录因子活性的别构调节物进行调控。其中的一个方法是运用二聚化的诱导剂或者二聚体在无活性的融合蛋白上重组有活性的转录因子。最常用的体系是将天然产物雷帕霉素(rapamydn)或者无生物活性的类似物作为二聚化的药物。雷帕霉素(或类似物)同胞质蛋白FKBP12(FKBP与FK506结合的蛋白)和一种大的丝-苏氨酸蛋白激酶，称为FRAP【FRBP-雷帕霉素相关蛋白，即mTOR(哺乳动物的雷帕霉素靶点)】有高度亲和性，又与这两种蛋白质相结合的功能，因此作为异源性二聚体将这两种蛋白质聚到一起。为调控靶基因转录，将DNA结合区域融合到一个或多个FKBP结构域，将转录抑制域融合到FRAP的93位氨基酸部位，称为FRB，这样足以结合FKBP-雷帕霉素复合物。只有在雷帕霉素存在的情况下，这两种融合蛋白才能发生二聚化。因而抑制具有与DNA结合区域相结合的位点的基因进行转录。

1.5免疫兼容分子

所述免疫兼容分子可以调控多能干细胞或其衍生物中同种异体免疫排斥相关基因的表达。

具体免疫兼容分子的种类及序列如表1所示。

表1 免疫兼容分子

以上shRNA或shRNA-miR免疫兼容分子的靶序列如表2所示。

表2 shRNA或shRNA-miR的靶序列

下面表5-表6的免疫兼容分子敲入方案中，各实验组别的shRNA或shRNA-miR序列均为采用表2中的靶序列1构建得到的shRNA或shRNA-miR免疫兼容分子。本领域的技术人员可以理解：以其他靶序列构建得到的shRNA或shRNA-miR免疫兼容分子同样可以实现本发明的技术效果，均落入本发明权利要求的保护范围。

1.6shRNA/miRNA加工复合体基因和抗干扰素效应分子

在细胞核内的初级miRNA(pri-miRNA)经过复合物Drosha-DGCR8进行微处理，将pri-miRNA裂解成前体miRNA(pre-miRNA)，这时会形成发夹结构。接着，经Exportin-5-Ran-GTP复合物将pre-miRNA转运出核。在胞浆中与双链RNA结合蛋白TRBP(TARBP2)结合的RNaseDicer酶将pre-miRNA分解成成熟的长度，miRNA在这时还处于双链状态。最后被转运进AGO2，形成RISC(RNA诱导沉默复合体)。最终miRNA双链的一条链保留在RISC复合物中，另外一条则排出被迅速降解掉。而DGCR8作为Drosha的主要结合蛋白，可以通过其C末端的两个双链RNA结合区域与pri-miRNA结合，招募并指导Drosha在pri-miRNA的正确位置剪切，生产pre-miRNA，pre-miRNA进一步被Dicer和TRBP/PACT加工剪切，形成成熟的miRNA。DGCR8的缺失或异常表达会影响Drosha的剪切活性，进而影响miRNA的活性，导致疾病的发生。TRBP能够招募Dicer复合体miRNA形成RISC Ago2。

本发明利用基因敲入技术，在基因组安全位点敲入可诱导关闭表达的针对HLA I类分子和HLA II类分子等的shRNA-miR表达序列时，优选同时敲入可诱导关闭表达的shRNA和/或miRNA加工机器包括Drosha(Accession number:NM_001100412)、Ago1(Accessionnumber:NM_012199)、Ago2(Accession number:NM_001164623)、Dicer1(Accessionnumber:NM_001195573)、Exportin-5(Accession number:NM_020750)、TRBP(Accessionnumber:NM_134323)、PACT(Accession number:NM_003690)和DGCR8(Accession number:NM_022720)，以便细胞不占用其他miRNA的加工，影响细胞功能。

此外，在IFN诱生的过程中，双链RNA所依赖的蛋白激酶(double-stranded RNA-dependent Protein Kinase,PKR)，它是整个细胞信号转导通路的关键因子，同时还有2’,5’寡腺苷酸合成酶(2,5-Oligoadenylate Synthetase,2-5As)，这两种酶与dsRNA诱生IFN密切相关。PKR能通过磷酸化真核细胞转录因子，从而抑制蛋白质合成，使细胞停滞于G0/G1和G2/M期，并诱导凋亡，而dsRNA可以促进2-5As合成，结果导致RNase即RNaseL的非特异性活化，降解细胞内所有的mRNA，致细胞死亡。I型干扰素的诱导特异性是通过IRF转录因子家族成员实现的，在细胞缺乏IRF-3和IRF-7的表达下，在很多病毒感染情况下I型干扰素是不能被诱导分泌的。缺乏IFN的应答，要使其恢复，需要上述两种蛋白质的共表达才行。

本发明利用基因敲入技术，在基因组安全位点处敲入免疫兼容分子shRNA-miR表达序列时，优选同时敲入可诱导关闭表达的针对抑制PKR、2-5As、IRF-3和IRF-7基因的shRNA和/或shRNA-miR表达序列，降低dsRNA诱发的干扰素反应，从而避免产生细胞毒性。

shRNA/miRNA加工复合体相关基因、抗干扰素效应分子、免疫兼容分子在基因组安全位点的插入位置顺序没有限定，它们之间可以以任何次序排列，而不会相互干扰或者影响基因组其它基因的结构和功能。

具体的抗干扰素效应分子的靶序列如表3所示。

表3 抗干扰素效应分子的靶序列

下面表5-表6的抗干扰素效应分子敲入方案中，各实验组别的抗干扰素效应分子的靶序列均为采用表3中的靶序列1构建得到的抗干扰素效应分子。本领域的技术人员可以理解：以其他靶序列构建得到的抗干扰素效应分子同样可以实现本发明的技术效果，均落入本发明权利要求的保护范围。

1.7免疫兼容分子、抗干扰素效应分子的shRNA或shRNA-miR的通用框架

免疫兼容分子、抗干扰素效应分子的shRNA或shRNA-miR的通用框架序列如下所示：

(1)shRNA组成型表达框架为：

GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGCTAGCGCCACC(SEQ ID NO.165)N₁...N₂₁TTCAAGAGA(SEQ IDNO.166)N₂₂...N₄₂TTTTTT；

其中：

a、N₁...N₂₁为对应基因的shRNA靶序列，N₂₂...N₄₂为对应基因的shRNA靶序列的反向互补序列；

b、如果质粒需要表达多个基因的shRNA，则每个基因分对应一个shRNA表达框架，然后无缝连接起来；

c、带不同抗性基因的组成型shRNA质粒，只有抗性基因不同，其它序列一样；

d、N表示A、T、G、C碱基；

e、SEQ ID NO.165为U6启动子序列；

f、SEQ ID NO.166为茎环序列。

(2)shRNA诱导型表达框架为：

GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGCTCGGTACCCGGGTCGAGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTGCTAGCGCCACC(SEQ ID NO.167)N₁...N₂₁TTCAAGAGA(SEQ ID NO.166)N₂₂...N₄₂TTTTTT；

其中：

a、N₁...N₂₁为对应基因的shRNA靶序列，N22...N42为对应基因的shRNA靶序列的反向互补序列；

d、N表示A、T、G、C碱基；

e、SEQ ID NO.167为H1TO启动子序列；

f、SEQ ID NO.166为茎环序列。

(3)shRNA-miR组成型或诱导型表达框架为：

以shRNA-miR靶序列替换microRNA-30中的靶序列得到，具体序列如下：

GAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCTTCAGGTTAACCCAACAGAAGGCTAAAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCG(SEQ ID NO.168)M₁N₁...N₂₁TAGTGAAGCCACAGATGTA(SEQ ID NO.169)N₂₂...N₄₂M₂TGCCTACTGCCTCGGACTTCAAGGGGCTACTTTAGGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAAT(SEQ ID NO.170)；

其中：

a、N₁...N₂₁为对应基因的shRNA-miR靶序列，N₂₂...N₄₂为对应基因的shRNA-miR靶序列的反向互补序列；

b、如果质粒需要表达多个基因的shRNA-miR，则每个基因分对应一个shRNA-miR表达框架，然后无缝连接起来；

c、带不同抗性基因的组成型shRNA-miR质粒，只有抗性基因不同，其它序列一样；

d、M碱基表示A或C碱基，N表示A、T、G、C碱基；

e、如果N₁为G碱基，则M₁为A碱基；否则M₁为C碱基；

f、M₁碱基与M₂碱基互补。

1.8基因编辑系统、基因编辑方法及检验方法

1.8.1基因编辑系统

本专利的基因编辑技术采用CRISPR-Cas9基因编辑系统。使用的Cas 9蛋白为Cas9(D10A)，Cas 9(D10A)与sgRNA结合，sgRNA负责特异识别靶序列(基因组DNA)，然后Cas 9(D10A)对该靶序列进行单链切割。基因组DNA发生双链断裂(DNA Double Strand Break,DSB)，必须有两组Cas 9(D10A)/sgRNA分别对基因组DNA的两条链进行切割，且切割的距离不能太远。Cas 9(D10A)/sgRNA方案与Cas 9/sgRNA方案相比，优点是特异性更高，脱靶的概率更低。本基因编辑系统使用的质粒或Donor片段分别为：Cas9(D10A)质粒、sgRNA clone质粒、Donor片段。

(1)Cas9(D10A)质粒：表达Cas 9(D10A)蛋白的质粒，在sgRNA的引导下特异性单链切割基因组DNA。

(2)sgRNA质粒：表达sgRNA的质粒，sgRNA(small guide RNA)是向导RNA(guideRNA，gRNA)，在基因编辑负责引导表达Cas 9(D10A)蛋白的靶向切割。

(3)Donor片段：两头含有重组臂，分别位于基因组DNA断裂位置的左右两边，中间含有需要插入的基因、片段或者表达元件。在Donor片段存在的情况下，细胞在基因组断裂的位置发生同源重组(Homologous recombination，HR)反应。如果不添加Donor片段，细胞的基因组断裂位置发生非同源末端连接(Non-homologous End Joining-NHEJ)反应。该片段由KI(Knock-in，下同)Vector质粒酶切后回收获取。

1.8.2组成型质粒和诱导型质粒

组成型质粒：从组成型质粒获取的Donor片段，敲入基因组DNA后，该片段的表达功能不可以进行调控。

诱导型质粒：从诱导型质粒获取的Donor片段，敲入基因组DNA后，该片段的表达功能可以通过添加诱导物的方法来调控，相当于对表达功能添加了一个开启或者关闭的开关。

1.8.3质粒构建方法

(1)Cas9(D10A)质粒：该质粒不再需要构建，直接从Addgene(Plasmid 41816,Addgene)订购。

(2)sgRNA质粒：原始的空白质粒从Addgene(Plasmid 41824,Addgene)订购，然后在网站(URL:https://cctop.cos.uni-heidelberg.de)输入DNA序列设计靶序列，最后把不同的靶序列分别放入空白的sgRNA质粒完成构建。

(3)KI Vector质粒：

a.Amp(R)-pUC origin片段的获取：设计PCR引物，以pUC18质粒为模板使用高保真酶(南京诺唯赞生物,P505-d1)通过PCR的方法，把该片段扩增出来并回收；

b.AAVS1或者eGSH重组臂的获取：提取人细胞的基因组DNA并设计对应的引物，然后以人的基因组DNA为模板使用高保真酶(南京诺唯赞生物,P505-d1)通过PCR的方法，把这类片段扩增出来并回收；

c.各个质粒元件的获取：设计各元件的PCR扩增引物，然后以含该元件的质粒为模板使用高保真酶(南京诺唯赞生物,P505-d1)通过PCR的方法，分别把各个质粒元件扩增出来并回收；

d.组装成完整质粒：使用多片段重组酶(南京诺唯赞生物，C113-02)把前面步骤获取的片段连接起来，形成一个完整的质粒。

1.8.4基因编辑过程

一、AAVS1基因敲入的单细胞克隆操作步骤(1)电转程序：

供体细胞准备：人多能干细胞。

试剂盒：Human Stem Cell

Kit 1。

仪器：电转仪。

培养基：BioCISO。

诱导质粒：Cas9D10A、sgRNA clone AAVS1-1、sgRNA clone AAVS1-2、AAVS1 neoVectoⅠ、AAVS1 neo VectorⅡ。

注：eGSH基因敲入使用的诱导质粒：Cas9D10A、sgRNA clone eGSH-1、sgRNA cloneeGSH-2、eGSH-neo/eGSH-puro(donor)这里的donor质粒与AAVS1的比较，只有左右重组臂不一样，其它元件都一样。由于eGSH的基因编辑过程与AAVS1的相同，后面就不再重复列举。

(2)电转后的人多能干细胞进行含G418和puro的双抗生素培养基进行筛选。

(3)进行单细胞克隆筛选及培养，获得单细胞克隆株。

二、AAVS1基因敲入的单细胞克隆株培养试剂

(1)培养基：BioCISO+300μg/mL G418+0.5μg/mL puro(应提前置于室温，避光条件放置30～60分钟，直至恢复到室温。注意：不应将BioCISO置于37℃进行预热，避免生物分子活性降低。)。

(2)基质胶：hESC级Matrigel(传代或复苏细胞前，将Matrigel工作液加入细胞培养瓶皿中并摇匀，确保Matrigel完全没过培养瓶皿底部，且在使用前任意一处Matrigel都不能干掉。为保证细胞能够更好的贴壁和存活，Matrigel放入37℃培养箱包被时间：1:100XMatrigel不能低于0.5小时；1:200X Matrigel不能低于2小时。)。

(3)消化液：使用DPBS溶解EDTA至终浓度为0.5mM，pH7.4(注意：EDTA不能使用水稀释，否则细胞会因渗透压降低而死亡。)。

(4)冻存液：60％BioCISO+30％ESCs级FBS+10％DMSO(冻存液最好现配现用。)。

三、常规维持传代培养过程

(1)传代的最佳时刻以及传代比例

a.传代最佳时刻：细胞整体汇合度达80％～90％；

b.传代最佳比例：1:4～1:7传代，次日最佳汇合度应维持在20％～30％。

(2)传代过程

a.事先将包被好的细胞培养瓶皿中的Matrigel吸走弃掉，加入适量培养基(BioCISO+300μg/mL G418+0.5μg/mL puro)，并放入37℃、5％CO₂培养箱中孵育；

b.待细胞符合传代的要求，吸掉培养基上清，加入适量的0.5mM EDTA消化液到细胞瓶皿中；

c.将细胞放入37℃、5％CO₂培养箱中孵育5～10分钟(消化至镜下观察到大部分细胞收缩变圆但还未漂浮即可，轻柔吹打细胞使其从壁上脱离，将细胞悬液吸到离心管内，200g离心5分钟；

d.离心后，弃上清，用培养基重悬细胞，轻柔反复吹打细胞数次至混匀，然后将细胞转移至事先准备好包被Matrigel的瓶皿中；

e.细胞转移至细胞瓶皿后，前后左右水平摇匀，镜下观察无异常后，摇匀置于37℃、5％CO₂培养箱中进行培养；

f.次日观察细胞贴壁存活状态，吸掉培养基每天正常按时换液。

四、细胞冻存

(1)按照常规传代的操作步骤，使用0.5mM EDTA消化细胞至大部分细胞收缩变圆但尚未漂浮，轻柔吹打细胞，收集细胞悬液，200g离心5分钟，弃上清，加入适量冻存液重悬细胞，将细胞转移至冻存管(建议六孔板汇合度80％冻存一支，冻存液体积为0.5mL/支)；

(2)将冻存管置于程序降温盒中，立即放入-80℃过夜(需保证冻存管每分钟温度下降1℃)；

(3)次日立即将细胞转移入液氮。

五、细胞复苏

(1)提前准备好Matrigel包被的细胞瓶皿，复苏细胞前，吸掉Matrigel，向细胞瓶皿中加入适量的BioCISO，置于37℃、5％CO₂培养箱中孵育；

(2)将冻存管从液氮中快速取出，立即放入37℃水浴锅中快速摇晃，使细胞快速融解，仔细观察待冰晶完全消失停止摇晃，将细胞转移至生物安全柜；

(3)提前加入10mL DMEM/F12(1:1)基础培养基至15mL离心管，并平衡至室温，使用巴氏吸管吸取1mL DMEM/F12(1:1)缓慢加入冻存管中，轻柔混匀，将细胞悬液转移到准备好的含有DMEM/F12(1:1)的15mL离心管中，200g离心5分钟；

(4)小心弃掉上清，加入适量BioCISO，轻轻混匀细胞，种到提前准备好的细胞瓶皿中，水平前后左右摇匀后，镜下观察无异常后，摇匀置于37℃、5％CO₂培养箱中培养；

(5)次日观察细胞贴壁存活状态，每天正常按时换液。若贴壁良好，则BioCISO更换为BioCISO+300μg/mL G418+0.5μg/mL puro。

1.8.5 AAVS1基因敲入检测方法

一、单细胞克隆AAVS1基因敲入检测

(1)AAVS1基因敲入检测说明

a.试验目的：PCR检测经过基因敲入处理的细胞，测试该细胞是否为纯合子；由于两个Donor片段只有抗性基因的序列具有差异性，因此要判断该细胞是否为纯合子(两条染色体分别敲入不同抗性基因的Donor片段)，就需要检测该细胞的基因组是否含有两种抗性基因的Donor片段，只有双敲入的细胞才有可能是正确的纯合子；

b.试验方法:首先在Donor质粒内部(非重组臂部分)设计一条引物，然后在基因组PPP1R12C(非重组臂部分)设计另一条引物；如果Donor片段在基因组能够正确插入，就会有目的条带出现，否则无目的条带出现)；

c.试验方案引物序列及PCR方案如表4所示。

表4 试验方案引物序列及PCR方案

二、eGSH基因敲入的检测方法跟AAVS1基因敲入检测原理和方法一样，这里不再描述。

1.8.6在基因组安全位点敲入基因方法的检验方法

(1)试验目的：PCR检测经过基因敲入处理的细胞，测试该细胞是否为纯合子。由于两个Donor片段只有抗性基因的序列具有差异性，因此要判断该细胞是否为纯合子(两条染色体分别敲入不同抗性基因的Donor片段)，就需要检测该细胞的基因组是否含有两种抗性基因的Donor片段，只有双敲入的细胞才有可能是正确的纯合子。

(2)试验方法：首先在Donor质粒内部(非重组臂部分)设计一条引物，然后在基因组(非重组臂部分)设计另一条引物。如果Donor片段在基因组能够正确插入，就会有目的条带出现，否则无目的条带出现。

1.9多能干细胞表达BTLA抗体、sBTLA的测定方法

使用ELISA(竞争法)对多能干细胞表达的BTLA抗体进行检测。收集表达BTLA抗体的多能干细胞培养上清，并与酶标的抗BTLA抗体混合(1:1)，再在已经包被BTLA抗原的酶标板上进行上样，对照组则加不表达BTLA抗体的多能干细胞培养上清，轻轻混匀。封板后置于37℃温育30min，洗涤5次后加入显色液显色15min，加入终止液50ul,读数测量450nm吸光度值。(BTLA抗体的表达量与颜色深浅成负相关)。

sBTLA检测同理。

1.10 ⁵¹Cr释放法检测BTLA抗体、sBTLA对T细胞杀伤肿瘤的影响

(1)效应细胞的准备：

T细胞分离：使用Ficoll密度梯度离心法(ficoll-hypaque density gradientcentrifugation)分离人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，再使用Dynabeads^TM CD3(Invitrogen^TM，货号：11151D)试剂盒分离出T细胞。将细胞重悬在含10％FBS的RPMI1640培养基中，通过台盼蓝染色计数细胞，并浓缩至1×10⁷细胞/mL。

(2)靶细胞的准备

肿瘤(MM黑色素瘤)细胞，将其消化重悬，通过台盼蓝染色计数细胞，配成1×10⁷细胞/mL的细胞悬液。

(3)⁵¹Cr释放试验

T细胞先用表达抗BTLA抗体的多能干细胞的培养基上清孵育30分钟，再与肿瘤细胞接触时，T就会攻击肿瘤细胞造成细胞裂解死亡。而未经表达抗BTLA抗体的多能干细胞的培养基上清孵育的会发生肿瘤细胞不被T细胞所识别，会发生免疫逃逸。所以通过检测培养基中⁵¹Cr的量，即可反应出T细胞杀伤肿瘤的能力。⁵¹Cr的释放到培养液中的量越少，肿瘤细胞越容易发生免疫逃逸。同理，用sBTLA孵育肿瘤细胞进行检测。

定量检测细胞介导的细胞毒作用，以放射性同位素⁵¹Cr标记靶细胞，与效应分子或细胞共孵育，根据靶细胞裂解所释放的⁵¹Cr放射脉冲数(cpm)而判断细胞毒活性：

a.将靶细胞用100μCi(Ci,放射性活度单位)的Na⁵¹CrO₄在37℃标记120min，每15分钟震摇一次，标记后再用清洗液离心清洗5次，最后重悬于培养液中，配成1×10⁶细胞/mL备用；

b.将靶细胞及T细胞加入96孔培养板中，每孔加100μL靶细胞(2.5×10³个)及100μL效应细胞(E/T＝1:2、1:5、1:10，E/T为靶细胞与效应细胞T的比)，同时设立自然释放对照孔(100μL靶细胞+100uL培养基)和最大释放孔(100μL靶细胞+100uL 2％SDS)；放置37℃，5％CO₂培养孵育4h。取出后用移液器吸出各孔上清液后，离心取上清液100μL，用γ计数仪测量cpm值；

c.结果计算：根据公式计算⁵¹Cr自然释放率和T细胞的活性：

注：一般要求⁵¹Cr自然释放率<10％。

1.11小鼠肿瘤治疗方法

在人源化NSG小鼠(The Jackson Laboratory(JAX))中，对其右腋下皮下注射5×10⁶肿瘤细胞(MM黑色素瘤，HCC肝癌，CRC结直肠癌)细胞，待肿瘤长到60mm³大小时，进行尾静脉注射200uLPBS(含人免疫细胞和1×10⁶的表达BTLA阻断物的多能干细胞衍生物)进行肿瘤治疗，其中只注射含人免疫细胞的组作为对照组。20天后处死小鼠，然后比较各组之间肿瘤大小，并进行差异性统计分析。

2.实验方案

将表达BTLA阻断物的基因、一个或多个免疫兼容分子、shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因、抗干扰素效应分子敲入到多能干细胞基因组安全位点的实验方案如表5-表6所示，其中，“+”号表示基因或核酸序列的敲入，“-”号表示基因敲除。

表5 组成型表达实验方案

选取的质粒以及具体的敲入位置情况如下：

总体原则：

抗BTLA抗体为分泌型抗体，其结构为：信号肽1(SEQ ID NO.179)+轻链(轻链的序列的末端添加终止密码子TGA)+EMCV IRESwt(SEQ ID NO.180)+信号肽2(SEQ ID NO.181)+重链(重链的序列的末端添加终止密码子TGA)。

sBTLA的结构为：信号肽3(SEQ ID NO.182)+sBTLA序列(sBTLA序列的末端添加终止密码子TGA)。

抗BTLA抗体或sBTLA序列放入对应质粒的MCS2的位置，shRNA放入对应质粒的shRNA表达框架内，shRNA-miR放入对应质粒的shRNA-miR表达框架内，其它基因放入对应质粒的MCS1的位置。各质粒的图谱如图1-图11所示。

注：sgRNA clone B2M质粒包含sgRNA clone B2M-1和sgRNA clone B2M-2质粒。sgRNA clone CIITA质粒包含sgRNA clone CIITA-1和sgRNA clone CIITA-2质粒。

(1)Aa1分组

AAVS1 KI Vector(shRNA,组成型)质粒的MCS2放入抗BTLA抗体序列。

(2)Aa2分组

AAVS1 KI Vector(shRNA,组成型)质粒的MCS2放入抗BTLA抗体序列。shRNA表达框架放入shRNA靶序列(若存在多个shRNA则无缝连接起来)。MCS1放入基因序列(若存在多个基因则使用EMCV IRESwt连接起来)。

(3)Aa3分组

AAVS1 KI Vector(shRNA-miR,组成型)质粒的MCS2放入抗BTLA抗体序列。shRNA-miR表达框架放入shRNA-miR靶序列(若存在多个shRNA-miR则无缝连接起来)。MCS1放入基因序列(若存在多个基因则使用EMCV IRESwt连接起来)。

(4)Aa4分组

AAVS1 KI Vector(shRNA,组成型)质粒的MCS2放入抗BTLA抗体序列，sgRNA cloneB2M质粒的靶序列放入B2M的sgRNA靶序列(SEQ ID NO.183和SEQ ID NO.184)，sgRNA cloneCIITA质粒的靶序列放入CIITA的sgRNA靶序列(SEQ ID NO.185和SEQ ID NO.186)。MCS1放入基因序列(若存在多个基因则使用EMCV IRESwt连接起来)。

(5)Aa5分组

同Aa2分组的方法。

(6)Aa6分组

同Aa3分组的方法。

(7)Ab1分组

AAVS1 KI Vector(shRNA,组成型)质粒的MCS2放入sBTLA序列。

(8)Ab2分组

AAVS1 KI Vector(shRNA,组成型)质粒的MCS2放入sBTLA序列。shRNA表达框架放入shRNA靶序列(若存在多个shRNA则无缝连接起来)。MCS1放入基因序列(若存在多个基因则使用EMCV IRESwt连接起来)。

(9)Ab3分组

AAVS1 KI Vector(shRNA-miR,组成型)质粒的MCS2放入sBTLA序列。shRNA-miR表达框架放入shRNA-miR靶序列(若存在多个shRNA-miR则无缝连接起来)。MCS1放入基因序列(若存在多个基因则使用EMCV IRESwt连接起来)。

(10)Ab4分组

AAVS1 KI Vector(shRNA,组成型)质粒的MCS2放入sBTLA序列，sgRNA clone B2M质粒的靶序列放入B2M的sgRNA靶序列，sgRNA clone CIITA质粒的靶序列放入CIITA的sgRNA靶序列。MCS1放入基因序列(若存在多个基因则使用EMCV IRESwt连接起来)。

(11)Ab5分组

同Ab2分组的方法。

(12)Ab6分组

同Ab3分组的方法。

表6 诱导型表达(免疫兼容可逆)实验方案

(1)Ba1分组：

AAVS1 KI Vector(shRNA,诱导型)质粒的MCS2放入抗BTLA抗体序列。shRNA表达框架放入shRNA靶序列(若存在多个shRNA则无缝连接起来)。MCS1放入基因序列(若存在多个基因则使用EMCV IRESwt连接起来)。

(2)Ba2分组：

AAVS1 KI Vector(shRNA-miR,诱导型)质粒的MCS2放入抗BTLA抗体序列。shRNA-miR表达框架放入shRNA-miR靶序列(若存在多个shRNA-miR则无缝连接起来)。MCS1放入基因序列(若存在多个基因则使用EMCV IRESwt连接起来)。

(3)Ba3分组：

同Ba1分组的方法。

(4)Ba4分组：

同Ba2分组的方法。

(5)Bb1分组：

AAVS1 KI Vector(shRNA,诱导型)质粒的MCS2放入sBTLA序列。shRNA表达框架放入shRNA靶序列(若存在多个shRNA则无缝连接起来)。MCS1放入基因序列(若存在多个基因则使用EMCV IRESwt连接起来)。

(6)Bb2分组：

AAVS1 KI Vector(shRNA-miR,诱导型)质粒的MCS2放入sBTLA序列。shRNA-miR表达框架放入shRNA-miR靶序列(若存在多个shRNA-miR则无缝连接起来)。MCS1放入基因序列(若存在多个基因则使用EMCV IRESwt连接起来)。

(7)Bb3分组：

同Bb1分组的方法。

(8)Bb4分组：

同Bb2分组的方法。

3.实验结果

3.1干细胞或其衍生物表达的BTLA抗体的阻断效果检测

将表5和表6各实验组方案敲入MSCs细胞的基因组安全位点，37℃，0.5％CO₂培养箱培养，收集培养基上清，并与酶标的抗BTLA抗体混合(1:1)(对照组则加不表达BTLA抗体的多能干细胞培养上清，轻轻混匀),再在已经包被BTLA抗原的酶标板上进行上样。封板后置于37℃温育30min，洗涤5次后加入显色液显色15min，加入终止液50uL,读数测量450nm吸光度值。各实验组的检测结果如表7所示。

表7 各实验组表达的BTLA抗体对BTLA的阻断效果

从上表可以看出，本发明的多能干细胞或其衍生物所表达的抗BTLA抗体能够有效结合BTLA。而且其表达量在各组中表达相对恒定，所以多能干细胞衍生物所表达的BTLA抗体不受细胞分化形态及其他外源基因(免疫兼容改造)所影响。

3.2干细胞或其衍生物表达的sBTLA的阻断效果检测

将表5和表6各实验组方案敲入MSCs细胞的基因组安全位点，37℃，0.5％CO₂培养箱培养，收集培养基上清，并与酶标的BTLA混合(1:1)(对照组则加不表达BTLA抗体的多能干细胞培养上清，轻轻混匀),再在已经包被HVEM的酶标板上进行上样。封板后置于37℃温育30min，洗涤5次后加入显色液显色15min，加入终止液50uL,读数测量450nm吸光度值。各实验组的检测结果如表8所示。

表8 各实验组表达的sBTLA对BTLA的阻断效果

从上表可以看出，本发明的多能干细胞或其衍生物所表达的sBTLA能够有效阻断BTLA结合HVEM。而且其表达量在各组中表达相对恒定，所以多能干细胞衍生物所表达的sBTLA不受细胞分化形态及其他外源基因(免疫兼容改造)所影响。

3.3表达BTLA阻断物的多能干细胞或其衍生物的抗肿瘤效果

将表5和表6各实验组方案敲入MSCs细胞的基因组安全位点，得到表达BTLA阻断物细胞。使用⁵¹Cr释放试验检验其抗肿瘤效果，结果如表9、表10所示。

表9 各实验组表达的BTLA抗体对T细胞杀伤肿瘤细胞的影响

分组	<sup>51</sup>Cr释放率平均值(％)	偏差(±)	独立样本T检验(*p<0.01)
				N(对照)	31.827	0.766	-
Aa1	56.474	0.790	*
				Aa2	55.000	0.316	*
Aa3	55.600	1.193	*
				Aa4	56.226	1.601	*
Aa5	56.042	1.290	*
				Aa6	57.230	1.252	*
Ba1	57.348	1.505	*
				Ba2	56.570	1.412	*
Ba3	56.326	1.485	*
				Ba4	58.059	1.372	*

注：N(对照)组是指未用表达BTLA抗体的多能干细胞或其衍生物的培养基上清处理细胞。独立样本T检验(*p<0.01)。

表10 各实验组表达的sBTLA对T细胞杀伤肿瘤细胞的影响

注：N(对照)组是指未用表达sBTLA的多能干细胞或其衍生物的培养基上清处理的细胞。独立样本T检验(*p<0.01)。

通过以上实验，可以证明本发明制备的表达BTLA阻断物的干细胞或其衍生物能有效阻断，激活T细胞而起到抗肿瘤作用。

3.4表达BTLA阻断物的多能干细胞或其衍生物的抗肿瘤治疗效果

在人源化NSG小鼠肿瘤模型中，我们对其进行注射能够表达BTLA抗体的hPSCs源衍生物(hPSCs-MSCs)，观察其MM黑色素瘤，HCC肝癌，CRC结直肠癌的肿瘤治疗的效果，只注射含人免疫细胞的组作为对照组。注:为避免免疫兼容问题，我们所使用的免疫细胞与hPSCs源衍生物均来源于同一人的，且采用B2M和CIITA基因敲除的免疫兼容方案。实验结果如11所示。

表11 表达BTLA抗体的多能干细胞或其衍生物的肿瘤治疗效果

注：对照组是指未注射表达BTLA抗体的多能干细胞或其源衍生物的NSG小鼠肿瘤模型。

通过以上实验，可以证明本发明制备的表达BTLA阻断物的干细胞或其衍生物能有效阻断BTLA而起到抗肿瘤作用。

3.5免疫兼容分子诱导型表达组的可逆性表达测试

通过上述实施例，表达BTLA阻断物的hPSCs源衍生物能有效阻断BTLA而起到抗肿瘤作用。我们还必须考虑hPSCs源衍生物的免疫兼容问题。因此我们选取一个合适的组合对免疫兼容进行测试。

我们利用MSCs的低免疫源性的特点，在人源化NSG小鼠肿瘤模型中，对其进行注射能够表达BTLA阻断物(抗BTLA抗体)的hPSCs源免疫兼容MSCs，观察其肿瘤(MM黑色素瘤)治疗的效果。注:所使用的免疫细胞与hPSCs源MSCs来源于为非同一人。

对照组是指未注射MSCs细胞的NSG小鼠肿瘤模型。

加Dox组别的处理是：在小鼠饮食中添加0.5mg/mL的Dox，进行饲养小鼠，从注射表达阻断物细胞开始，一直使用，直到试验结束。结果如表12所示。

表12 免疫兼容分子诱导型表达组的可逆性表达测试结果

以上实验表明：仅表达阻断物的MSCs(组2)，其具有低免疫源性，可以在异体内存在一定时间，所以其能够发挥一定的肿瘤治疗效果，而进行免疫兼容改造的(组3-11，包括组成型和可逆诱导型免疫兼容)，其免疫兼容效果更佳，比没有经免疫兼容改造的MSCs在体内存在时间更长(或能做到长期共存)，其发挥肿瘤治疗效果更佳，而组5为B2M和CIITA基因敲除组，其完全消除HLA-I和HLA-II类分子产生的影响，因此其肿瘤治疗效果最佳。但由于其组成型免疫兼容改造(基因敲入/敲除)，无法在移植物产生变异或不需要时进行清除，从而有组8-15方案设定。组12-15中在进行注射表达阻断物细胞进入小鼠的同时，对小鼠使用Dox诱导剂(一直使用)，注射表达阻断物细胞的小鼠的免疫兼容效果将被消除，其在体内存在时间与未经免疫兼容改造的MSCs相当，其肿瘤治疗效果也与未经免疫兼容改造的MSCs相当。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 未来智人再生医学研究院（广州）有限公司；王淋立

<120> 一种表达BTLA阻断物的多能干细胞或其衍生物及应用

<130>

<160> 186

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1347

<212> DNA

<213> human

<400> 1

caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctatccctc 60

acctgcactg tccatggtgg ctccatcaat cattactact ggagctggat ccggcagccc 120

ccagggaagg gactggaatg gattggatat atctattaca gtgggagcac caagtacaat 180

ccctccctca agagtcgcgt cagcatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240

aagctgacct ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt attgtgcgag agagtggccc 300

tactattact acgaaatgga cgtctggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctcagcc 360

agcaccaagg gccccagcgt gttccccctg gcccccagca gcaagagcac cagcggcggc 420

accgccgccc tgggctgcct ggtgaaggac tacttccccg agcccgtgac cgtgagctgg 480

aacagcggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttccccg ccgtgctgca gagcagcggc 540

ctgtacagcc tgagcagcgt ggtgaccgtg cccagcagca gcctgggcac ccagacctac 600

atctgcaacg tgaaccacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaggt ggagcccaag 660

agctgcgaca agacccacac ctgccccccc tgccccgccc ccgagctgct gggcggcccc 720

agcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagcag gacccccgag 780

gtgacctgcg tggtggtgga cgtgagccac gaggaccccg aggtgaagtt caactggtac 840

gtggacggcg tggaggtgca caacgccaag accaagccca gggaggagca gtacaacagc 900

acctacaggg tggtgagcgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 960

tacaagtgca aggtgagcaa caaggccctg cccgccccca tcgagaagac catcagcaag 1020

gccaagggcc agcccaggga gccccaggtg tacaccctgc cccccagcag ggacgagctg 1080

accaagaacc aggtgagcct gacctgcctg gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc 1140

gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccccgtgctg 1200

gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc aagctgaccg tggacaagag caggtggcag 1260

cagggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 1320

aagagcctga gcctgagccc cggcaag 1347

<210> 2

<211> 642

<212> DNA

<213> human

<400> 2

gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120

cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180

gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240

cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gttcatttcg gacgttcggc 300

caagggacca aggtggaaat caaaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642

<210> 3

<211> 366

<212> DNA

<213> human

<400> 3

aaagaatcat gtgatgtaca gctttatata aagagacaat ctgaacactc catcttagca 60

ggagatccct ttgaactaga atgccctgtg aaatactgtg ctaacaggcc tcatgtgact 120

tggtgcaagc tcaatggaac aacatgtgta aaacttgaag atagacaaac aagttggaag 180

gaagagaaga acatttcatt tttcattcta cattttgaac cagtgcttcc taatgacaat 240

gggtcatacc gctgttctgc aaattttcag tctaatctca ttgaaagcca ctcaacaact 300

ctttatgtga cagatgtaaa aagtgcctca gaacgaccct ccaaggacga aatggcaagc 360

agaccc 366

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 4

gggagcagag aattctctta t 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 5

ggagcagaga attctcttat c 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 6

gagcagagaa ttctcttatc c 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 7

gctacctgga gcttcttaac a 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 8

ggagcttctt aacagcgatg c 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 9

gggtctccag tatattcatc t 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 10

gcctcctgat gcacatgtac t 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 11

ggaagacctg ggaaagcttg t 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 12

ggctaagctt gtacaataac t 21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 13

gcggaatgaa ccacatcttg c 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 14

ggccttctct gaaggacatt g 21

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 15

ggactcaatg cactgacatt g 21

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 16

ggtacccact gctctggtta t 21

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 17

gctcccactc catgaggtat t 21

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 18

ggtatttctt cacatccgtg t 21

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 19

aggagacacg gaatgtgaag g 21

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 20

gctcccactc catgaggtat t 21

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 21

ggtatttcta cacctccgtg t 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 22

ggaccggaac acacagatct a 21

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 23

accggaacac acagatctac a 21

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 24

ggaacacaca gatctacaag g 21

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 25

gaacacacag atctacaagg c 21

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 26

ttcttacttc cctaatgaag t 21

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 27

aagttaagaa cctgaatata a 21

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 28

aacctgaata taaatttgtg t 21

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 29

acctgaatat aaatttgtgt t 21

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 30

aagcgttgat ggattaatta a 21

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 31

agcgttgatg gattaattaa a 21

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 32

gggtctggtg ggcatcatta t 21

<210> 33

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 33

ggtctggtgg gcatcattat t 21

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 34

gcatcattat tgggaccatc t 21

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 35

gcacatggag gtgatggtgt t 21

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 36

ggaggtgatg gtgtttctta g 21

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 37

gagaagatca ctgaagaaac t 21

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 38

gctttaatgg ctttacaaag c 21

<210> 39

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 39

ggctttacaa agctggcaat a 21

<210> 40

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 40

gctttacaaa gctggcaata t 21

<210> 41

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 41

gctccgtact ctaacatcta g 21

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 42

gatgaccaca ttcaaggaag a 21

<210> 43

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 43

gaccacattc aaggaagaac t 21

<210> 44

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 44

gctttcctgc ttggcagtta t 21

<210> 45

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 45

ggcagttatt cttccacaag a 21

<210> 46

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 46

gcagttattc ttccacaaga g 21

<210> 47

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 47

gcgtaagtct gagtgtcatt t 21

<210> 48

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 48

gacaatttaa ggaagaatct t 21

<210> 49

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 49

ggccatagtt ctccctgatt g 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 50

gccatagttc tccctgattg a 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> human

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gcagatgacc acattcaagg a 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> human

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gatgaccaca ttcaaggaag a 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> human

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gaccacattc aaggaagaac c 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 54

gctttgtcag gaccaggttg t 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 55

gaccaggttg ttactggttc a 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> human

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gaagcctcac agctttgatg g 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> human

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gatggcagtg cctcatcttc a 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> human

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ggcagtgcct catcttcaac t 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 59

gcagcaggat aagtatgagt g 21

<210> 60

<211> 21

<212> DNA

<213> human

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gcaggataag tatgagtgtc a 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> human

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ggttcctgca cagagacatc t 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> human

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gcacagagac atctataacc a 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 63

gagacatcta taaccaagag g 21

<210> 64

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 64

gagtactgga acagccagaa g 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 65

gctttcctgc ttggctctta t 21

<210> 66

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 66

ggctcttatt cttccacaag a 21

<210> 67

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 67

gctcttattc ttccacaaga g 21

<210> 68

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 68

ggatgtggaa cccacagata c 21

<210> 69

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 69

gatgtggaac ccacagatac a 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 70

gtggaaccca cagatacaga g 21

<210> 71

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 71

ggaacccaca gatacagaga g 21

<210> 72

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 72

gagccaactg tattgcctat t 21

<210> 73

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 73

agccaactgt attgcctatt t 21

<210> 74

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 74

gccaactgta ttgcctattt g 21

<210> 75

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 75

gggtagcaac tgtcaccttg a 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 76

ggatttcgtg ttccagttta a 21

<210> 77

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 77

gcatgtgcta cttcaccaac g 21

<210> 78

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 78

gcgtcttgtg accagataca t 21

<210> 79

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 79

gcttatgcct gcccagaatt c 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 80

gcaggaaatc actgcagaat g 21

<210> 81

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 81

gctcagtgca ttggccttag a 21

<210> 82

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 82

ggtgagtgct gtgtaaataa g 21

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<212> DNA

<213> human

<400> 83

gacatatata gtgatccttg g 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 84

ggaaagtcac atcgatcaag a 21

<210> 85

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 85

gctcacagtc atcaattata g 21

<210> 86

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 86

gccctgaaga cagaatgttc c 21

<210> 87

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 87

gcggaccatg tgtcaactta t 21

<210> 88

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 88

ggaccatgtg tcaacttatg c 21

<210> 89

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 89

gcgtttgtac agacgcatag a 21

<210> 90

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 90

ggctggctaa cattgctata t 21

<210> 91

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 91

gctggctaac attgctatat t 21

<210> 92

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 92

ggaccaggtc acatgtgaat a 21

<210> 93

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 93

ggaaaggtct gaggatattg a 21

<210> 94

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 94

ggcagattag gattccattc a 21

<210> 95

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 95

gcctgatagg acccatattc c 21

<210> 96

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 96

gcatccaata gacgtcattt g 21

<210> 97

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 97

gcgtcactgg cacagatata a 21

<210> 98

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 98

gctgtcacat aataagctaa g 21

<210> 99

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 99

gctaaggaag acagtatata g 21

<210> 100

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 100

gggatttcta aggaaggatg c 21

<210> 101

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 101

ggagttgaag agcagagatt c 21

<210> 102

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 102

gccagtgaac acttaccata g 21

<210> 103

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 103

gcttctctga agtctcattg a 21

<210> 104

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 104

ggctgcaact aacttcaaat a 21

<210> 105

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 105

ggatggattt gattatgatc c 21

<210> 106

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 106

ggaccttgga acaatggatt g 21

<210> 107

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 107

gctaattctt gctgaacttc t 21

<210> 108

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 108

gctgaacttc ttcatgtatg t 21

<210> 109

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 109

gcctcatctc tttgttctaa a 21

<210> 110

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 110

gctctggaga agatatattt g 21

<210> 111

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 111

gctcttgagg gaactaatag a 21

<210> 112

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 112

gggacggcat taatgtattc a 21

<210> 113

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 113

ggacaaacat gcaaactata g 21

<210> 114

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 114

gcagcaacca gctaccattc t 21

<210> 115

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 115

gcagttctgt tgccactctc t 21

<210> 116

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 116

gggagagttc atccaggaaa t 21

<210> 117

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 117

ggagagttca tccaggaaat t 21

<210> 118

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 118

gagagttcat ccaggaaatt a 21

<210> 119

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 119

gcctgtcaaa gagagagagc a 21

<210> 120

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 120

gctcagcttc gtactgagtt c 21

<210> 121

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 121

gcttcacaga actacagaga g 21

<210> 122

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 122

gcatctactg gacaaagtat t 21

<210> 123

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 123

ggctgaatta cccatgcttt a 21

<210> 124

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 124

gctgaattac ccatgcttta a 21

<210> 125

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 125

gggttggttt atccaggaat a 21

<210> 126

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 126

ggatcagaag agaagccaac g 21

<210> 127

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 127

ggttcaccat ccaggtgttc a 21

<210> 128

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 128

gctctcttct ctggaactaa c 21

<210> 129

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 129

gctagagtga ctccatctta a 21

<210> 130

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 130

gctgaccacc aattataatt g 21

<210> 131

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 131

gcagaatatt taaggccata c 21

<210> 132

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 132

gcccacttaa aggcagcatt a 21

<210> 133

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 133

ggtcatcaat accactgtta a 21

<210> 134

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 134

gcattcctcc ttctcctttc t 21

<210> 135

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 135

ggaggaactt tgtgaacatt c 21

<210> 136

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 136

gctgtaagaa ggatgctttc a 21

<210> 137

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 137

gctgcaggca ggattgtttc a 21

<210> 138

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 138

gcagttcgag gtcaagtttg a 21

<210> 139

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 139

gccaattagc tgagaagaat t 21

<210> 140

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 140

gcaggtttac agtgtatatg t 21

<210> 141

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 141

gcctacagag actagagtag g 21

<210> 142

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 142

gcagttgggt accttccatt c 21

<210> 143

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 143

gcaactcagg tgcatgatac a 21

<210> 144

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 144

gcatggcgct ggtacgtaaa t 21

<210> 145

<211> 19

<212> DNA

<213> human

<400> 145

gcctcgagtt tgagagcta 19

<210> 146

<211> 19

<212> DNA

<213> human

<400> 146

agacattctg gatgagtta 19

<210> 147

<211> 19

<212> DNA

<213> human

<400> 147

gggtctgtta cccaaagaa 19

<210> 148

<211> 19

<212> DNA

<213> human

<400> 148

ggtctgttac ccaaagaat 19

<210> 149

<211> 19

<212> DNA

<213> human

<400> 149

ggaaggaagc ggacgctca 19

<210> 150

<211> 19

<212> DNA

<213> human

<400> 150

ggaggcagta cttctgata 19

<210> 151

<211> 19

<212> DNA

<213> human

<400> 151

cgctctagag ctcagctga 19

<210> 152

<211> 19

<212> DNA

<213> human

<400> 152

ccaccacctc aaccaataa 19

<210> 153

<211> 19

<212> DNA

<213> human

<400> 153

atttcaagaa gtcgatcaa 19

<210> 154

<211> 19

<212> DNA

<213> human

<400> 154

gaagatctga ttaccttca 19

<210> 155

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 155

ggacactggt tcaacacctg t 21

<210> 156

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 156

ggttcaacac ctgtgacttc a 21

<210> 157

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 157

acctgtgact tcatgtgtgc g 21

<210> 158

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 158

gctggacgtg accatcatgt a 21

<210> 159

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 159

ggacgtgacc atcatgtaca a 21

<210> 160

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 160

gacgtgacca tcatgtacaa g 21

<210> 161

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 161

acgtgaccat catgtacaag g 21

<210> 162

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 162

acgctatacc atctacctgg g 21

<210> 163

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 163

gcctctatga cgacatcgag t 21

<210> 164

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 164

gacatcgagt gcttccttat g 21

<210> 165

<211> 253

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 165

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

cgctagcgcc acc 253

<210> 166

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 166

ttcaagaga 9

<210> 167

<211> 686

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 167

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

ctttaccact ccctatcagt gatagagaaa agtgaaagtc gagtttacca ctccctatca 300

gtgatagaga aaagtgaaag tcgagtttac cactccctat cagtgataga gaaaagtgaa 360

agtcgagttt accactccct atcagtgata gagaaaagtg aaagtcgagt ttaccactcc 420

ctatcagtga tagagaaaag tgaaagtcga gtttaccact ccctatcagt gatagagaaa 480

agtgaaagtc gagtttacca ctccctatca gtgatagaga aaagtgaaag tcgagctcgg 540

tacccgggtc gaggtaggcg tgtacggtgg gaggcctata taagcagagc tcgtttagtg 600

aaccgtcaga tcgcctggag acgccatcca cgctgttttg acctccatag aagacaccgg 660

gaccgatcca gcctgctagc gccacc 686

<210> 168

<211> 119

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 168

gaggcttcag tactttacag aatcgttgcc tgcacatctt ggaaacactt gctgggatta 60

cttcttcagg ttaacccaac agaaggctaa agaaggtata ttgctgttga cagtgagcg 119

<210> 169

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 169

tagtgaagcc acagatgta 19

<210> 170

<211> 119

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 170

tgcctactgc ctcggacttc aaggggctac tttaggagca attatcttgt ttactaaaac 60

tgaatacctt gctatctctt tgatacattt ttacaaagct gaattaaaat ggtataaat 119

<210> 171

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 171

ccatagctca gtctggtcta tc 22

<210> 172

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 172

tcaggatgat ctggacgaag ag 22

<210> 173

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 173

ccggtcctgg actttgtctc 20

<210> 174

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 174

ctcgacatcg gcaaggtgtg 20

<210> 175

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 175

cgcattggag tcgctttaac 20

<210> 176

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 176

cgagctgcaa gaactcttcc tcac 24

<210> 177

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 177

cacggcactt acctgtgttc tgg 23

<210> 178

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 178

cagtacaggc atccctgtga aag 23

<210> 179

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 179

atgaaacatc tgtggttctt ccttctcctg gtggcagctc ccagatgggt cctgtcc 57

<210> 180

<211> 590

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 180

cccctctccc tccccccccc ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg 60

tgcgtttgtc tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg 120

gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg 180

aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca 240

aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct 300

ctgcggccaa aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca 360

cgttgtgagt tggatagttg tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg tattcaacaa 420

ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggtg 480

cacatgcttt acatgtgttt agtcgaggtt aaaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg 540

ggacgtggtt ttcctttgaa aaacacgatg ataatatggc cacaaccatg 590

<210> 181

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 181

atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60

<210> 182

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 182

atgaagacat tgcctgccat gcttggaact gggaaattat tttgggtctt cttcttaatc 60

ccatatctgg acatctggaa catccatggg 90

<210> 183

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 183

cgcgagcaca gctaaggcca cgg 23

<210> 184

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 184

actctctctt tctggcctgg agg 23

<210> 185

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 185

acccagcagg gcgtggagcc agg 23

<210> 186

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 186

gtcagagccc caaggtaaaa agg 23

Claims

1.一种表达BTLA阻断物的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物的基因组导入有BTLA阻断物的表达序列，所述BTLA阻断物为抗BTLA抗体、可溶性的BTLA负性共刺激分子中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物的B2M和/或CIITA基因被敲除。

3.根据权利要求1所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物的基因组还导入一种或多种免疫兼容分子表达序列，所述免疫兼容分子用于调控多能干细胞细胞或其衍生物中与免疫应答相关的基因的表达。

4.根据权利要求3所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述与免疫应答相关的基因包括：

5.根据权利要求3所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述免疫兼容分子包括以下的任一种或多种：

(1)免疫耐受相关基因，包括CD47或HLA-G；

6.根据权利要求5所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：

所述HLA-DPB1的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.95～SEQ ID NO.104中的至少一种。

7.根据权利要求3所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因和/或抗干扰素效应分子。

8.根据权利要求7所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因包括Drosha、Ago1、Ago2、Dicer1、Exportin-5、TRBP(TARBP2)、PACT(PRKRA)、DGCR8中的至少一种；所述抗干扰素效应分子为PKR、2-5As、IRF-3和IRF-7中的至少一种的shRNA和/或shRNA-miR。

9.根据权利要求8所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：

所所述PKR的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.105～SEQ ID NO.114中的至少一种；

10.根据权利要求6或9所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述主要组织相容性复合体基因、主要组织相容性复合体相关基因、PKR、2-5As、IRF-3或IRF-7的shRNA和/或shRNA-miR的表达框架如下所示：

(1)shRNA表达框架：由5’到3’依次包括权利要求6或9所述shRNA靶序列、茎环序列、权利要求6或9所述shRNA靶序列的反向互补序列、Poly T；两个反向互补靶序列由中间一茎环序列分隔组成发夹结构，最后连上Poly T作为RNA聚合酶III的转录终止子；

(2)shRNA-miR表达框架：使用权利要求6或9所述shRNA-miR靶序列替换microRNA-30或者microRNA-155中的靶序列得到。

11.根据权利要求10所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述shRNA表达框架中的茎环序列长度为3～9个碱基；所述Poly T长度为5～6个碱基。

12.根据权利要求3或7所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入诱导型基因表达系统。

13.根据权利要求12所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述诱导型基因表达系统为Tet-Off系统、二聚体诱导表达系统中的至少一种。

14.根据权利要求12所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：

所述BTLA阻断物的表达序列、免疫兼容分子的表达序列、shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因、抗干扰素效应分子、诱导型基因表达系统的导入采用病毒载体干扰、非病毒载体转染或基因编辑的方法。

15.根据权利要求14所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述BTLA阻断物的表达序列、免疫兼容分子的表达序列、shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因、抗干扰素效应分子、诱导型基因表达系统的导入位点为多能干细胞或其衍生物的基因组安全位点。

16.根据权利要求15所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述基因组安全位点包括AAVS1安全位点、eGSH安全位点、H11安全位点中的一种或多种。

17.根据权利要求1～9、11、13～16中任一项所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞包括胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、胚胎癌细胞、或者诱导多能干细胞；

所述多能干细胞衍生物包括多能干细胞所分化的成体干细胞、各胚层细胞或组织；

所述成体干细胞包括间充质干细胞或者神经干细胞。

18.根据权利要求1～9、11、13～15中任一项所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述抗BTLA抗体的重链序列如SEQ ID NO.1所示，轻链序列如SEQ ID NO.2所示；所述可溶性的BTLA负性共刺激分子的序列如SEQ ID NO.3所示。

19.权利要求1～18中任一项所述的多能干细胞或其衍生物在制备BTLA高表达肿瘤治疗药物中的应用。

20.一种制剂，其特征在于：包含权利要求1～18中任一项所述的多能干细胞或其衍生物。