CN113166225A - 天然杀伤细胞组合物和治疗肿瘤的免疫疗法方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开的几个实施方案涉及使用免疫疗法治疗肿瘤。几个实施方案涉及肝肿瘤的治疗，例如肝细胞癌或来自另一个肿瘤位置的转移。其他实施方案涉及采用工程化改造为表达细胞毒性受体复合物的天然杀伤(NK)细胞和另外的抗癌剂治疗肿瘤的联合疗法。

Description

天然杀伤细胞组合物和治疗肿瘤的免疫疗法方法
相关申请
本申请要求于2018年9月13日提交的美国临时专利申请第62/730,939号，在2019年3月20日提交的美国临时专利申请第62/821,360号，2019年5月1日提交的美国临时专利申请第62/841,768号和2019年7月18日提交的美国临时专利申请第62/875,893号的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
背景技术
在主要类型的癌症中，肝癌是常见的。肝细胞癌是最常见的肝癌类型之一。与某些类型的继发性肝癌(例如，起源于另一种组织并迁移到肝脏)相比，肝细胞癌是一种原发性癌症(例如，起源于肝脏)。其它类型的肝癌，诸如由从结肠直肠癌转移引起的肝肿瘤也是常见的。
通过引用并入ASCII文本文件的材料
本申请通过引用并入与本文同时提交的以下ASCII文本文件中包含的序列表：文件名：NKT025WO_ST25；创建于2019年9月10日，大小为90.0KB。
发明概述
在几个实施方案中，本文提供了用于治疗肿瘤的方法和组合物。特别地，在几个实施方案中，将组合物局部递送至肿瘤。根据几个实施方案，提供了一种用于治疗原发性肝肿瘤的方法，该方法包括：进入患有原发性肝肿瘤的患者的肝内动脉，以及施用工程化改造为表达细胞毒性受体复合物的天然杀伤(NK)细胞群体。在几个实施方案中，带有工程化受体，例如如本文公开的CAR或嵌合受体的NK细胞与肿瘤细胞上的NK配体结合。然后产生细胞毒性信号，其导致肿瘤细胞的杀伤。
本文公开的几个实施方案涉及用于治疗癌症的联合疗法。几个实施方案采用表达嵌合受体或嵌合抗原受体的工程化免疫细胞(例如，天然杀伤细胞或T细胞)和另一种抗癌剂的组合。根据实施方案，使用各种抗癌剂，包括例如诸如组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、激酶(例如酪氨酸激酶)抑制剂、表皮生长因子受体信号传导抑制剂；血管内皮生长因子受体信号传导抑制剂、化学治疗剂、蛋白酶体抑制剂、放射、脱甲基化剂、酪氨酸激酶抑制剂、全反式维甲酸、丁酸钠等。在几个实施方案中，协同抗癌效应源自组合。
在几个实施方案中，提供了用于治疗肝肿瘤的联合疗法方案，该疗法方案包括(i)工程化改造为表达细胞毒性受体复合物的天然杀伤(NK)细胞群体，和(ii)至少一种另外的抗癌剂。
在几个实施方案中，疗法方案配置为将NK细胞群体局部施用于肝肿瘤。
在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物包含C型凝集素样受体的功能性片段，其中所述C型凝集素样受体包含天然杀伤组2D(NKG2D)受体和细胞毒性信号传导复合物，其包含跨膜域、共刺激域和信号传导域。在几个实施方案中，C型凝集素样受体的功能性片段包含SEQ ID NO.24，其具有高度序列同一性(例如，约85％，约90％，约95％，约96％，约97％，约98％或约99％的序列同一性)的片段，或其保留C型凝集素样受体的片段的至少一部分配体结合功能的片段，包含SEQ ID NO.24。
在几个实施方案中，要通过疗法方案治疗的肝肿瘤源自肝细胞癌。在几个实施方案中，肝肿瘤继发于不同位置处的肿瘤。例如，在几个实施方案中，肝肿瘤是结肠直肠癌的原发性转移。
在几个实施方案中，细胞毒性信号传导复合物的信号传导域包含OX40域。在几个实施方案中，OX40域与具有SEQ ID NO.35的序列的OX40域至少95％相同。在几个实施方案中，OX40域可以被截短为比SEQ ID NO.35短的序列，但仍保留刺激功能。在几个实施方案中，信号传导构建体包含两个、三个、四个或更多个OX40域，其有利地增强了NK细胞的活化。在几个实施方案中，细胞毒性信号传导复合物的信号传导域还包含CD3zeta域。在几个实施方案中，CD3zeta域与具有SEQ ID NO.32的序列的CD3zeta域至少95％相同。在几个实施方案中，将CD3zeta域截短或修饰以增强细胞毒性受体复合物的信号传导和/或包装(例如在载体中)。例如，在几个实施方案中，信号传导域包括半-ITAM域。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物还包含IL15。在几个实施方案中，IL15包括膜结合的IL15(mbIL15)。在几个实施方案中，mbIL15与具有SEQ ID NO.39的序列的mbIL15至少95％相同。在几个实施方案中，将mbIL15截短和/或突变，例如以便增强工程化NK细胞的刺激。在几个实施方案中，mbIL15由也编码细胞毒性受体复合物的剩余部分的多核苷酸编码。在几个实施方案中，在分开的多核苷酸上提供mbIL15，将所述多核苷酸与编码细胞毒性受体复合物的多核苷酸一起分开导入NK细胞中。
在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物由SEQ ID NO:7的核酸序列编码。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物由与SEQ ID NO:7约80％，约85％，约90％，约91％，约92％，约93％，约94％或约95％相同的核酸序列编码。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。根据实施方案，细胞毒性受体复合物与SEQ ID NO:8是约80％，约85％，约90％，约91％，约92％，约93％，约94％或约95％相同的。
在几个实施方案中，该方案配置为在施用NK细胞群体之前、同时或之后施用至少一种另外的抗癌剂。在几个实施方案中，另外的抗癌剂比工程化的NK细胞更频繁地施用，例如，抗癌剂每天施用，而NK细胞相隔一或几周施用。在几个实施方案中，由于另外的抗癌剂诱导细胞毒性受体复合物的受体部分的一种或多种配体的表达和/或由于其进一步刺激NK细胞活性或寿命，另外的抗癌剂与工程化的NK细胞协同作用。
在几个实施方案中，另外的抗癌剂是酪氨酸激酶抑制剂。在几个实施方案中，药剂是索拉非尼(sorafenib)。在几个实施方案中，抗癌剂是索拉非尼、尼洛替尼(nilotinib)、伊马替尼(imantinib)、吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、舒尼替尼(sunitinib)、adavosertib、拉帕替尼(lapatinib)或其组合(例如，两种、三种、四种或更多种的组合)。
在几个实施方案中，另外的抗癌剂是抗体。例如，在几个实施方案中，抗体是单克隆抗体、scFv或抗体片段。在几个实施方案中，另外的抗癌剂是西妥昔单抗(cetuximab)、达雷木单抗(daratumumab)、利妥昔单抗(rituximab)、阿托珠单抗(obinutuzumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)或其组合。在几个实施方案中，另外的抗癌剂是组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂。可以使用各种HDAC抑制剂。例如，在几个实施方案中，HDAC抑制剂是丙戊酸、FR901228、MS-275、丁酸苯酯、PDX101、丙戊酸钠、辛二酰苯胺异羟肟酸(suberoylanilidehydroxamic acid)或其组合。
取决于实施方案，可以将更广泛使用的抗癌剂与本文公开的工程化的NK细胞偶联。在几个实施方案中，另外的抗癌剂是化学治疗剂。例如，在几个实施方案中，化学治疗剂是顺铂、羟基脲、5-氟尿嘧啶、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、依托泊苷或其组合。除了一些实施方案外或代替一些实施方案，采用高剂量电离辐射。在几个实施方案中，当与工程化NK细胞的局部递送组合时，这是特别有效的，因为这两种治疗都是局部递送的。
在几个实施方案中，另外的抗癌剂是蛋白酶体抑制剂。在几个实施方案中，蛋白酶体抑制剂是硼替佐米。在几个实施方案中，另外的抗癌剂是全反式维甲酸、丁酸钠或其组合。在几个实施方案中，另外的抗癌剂是NK检查点途径抑制剂。在此类实施方案中，抑制剂起到阻断NK检查点途径的免疫抑制性质的作用，从而增强NK细胞(内源性和工程化两者)的活性。在几个实施方案中，NK检查点抑制剂是CD73拮抗剂、CD39拮抗剂、腺苷免疫抑制信号传导途径拮抗剂或其组合。同样，在几个实施方案中，其他方法用于增强NK细胞活性，例如针对TIM3和/或TGF beta受体的抗体。在另外的实施方案中，另外的抗癌剂是吲哚胺2,3-加双氧酶的抑制剂。在几个实施方案中，使用其他试剂的组合，例如辐射与NK检查点抑制剂和工程化的NK细胞组合。在此类实施方案中，不同作用机制和不同信号传导途径的利用导致对靶肿瘤细胞的协同细胞毒性效应。在一些实施方案中，将以下两种或更多种组合：酪氨酸激酶抑制剂、抗体、化学治疗剂、HDAC抑制剂、脱甲基化剂、蛋白酶体抑制剂、检查点抑制剂和其他抗癌或抗增殖剂。
在几个实施方案中，提供了本文公开的联合疗法在治疗肝癌中的用途。在几个实施方案中，提供了本文公开的联合疗法在制备用于治疗肝癌的药物中的用途。
在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物包含C型凝集素样受体的功能性片段，以及细胞毒性信号传导复合物，其包含跨膜域、共刺激域和信号传导域。在几个实施方案中，C型凝集素样受体包含天然杀伤组2D(NKG2D)受体。在几个实施方案中，C型凝集素样受体的功能性片段包含SEQ ID NO.24。
在几个实施方案中，还提供了用于治疗肝肿瘤的方法，所述方法包括向患有肝肿瘤的患者施用包含工程化为表达细胞毒性受体复合物的NK细胞群体的组合物，其中细胞毒性受体该复合物包含结合天然杀伤2D组(NKG2D)受体的配体的胞外域，包含跨膜域、共刺激域和信号传导域的细胞毒性信号传导复合物，并且其中施用包括注射到患者的肝内动脉中。在几个实施方案中，胞外域由SEQ ID NO.23的多核苷酸的至少一部分编码。在几个实施方案中，胞外域是野生型NKG2D受体的胞外域的一部分。令人惊讶地，在几个实施方案中，胞外域的部分保留结合NKG2D受体的配体的能力。此外，根据几个实施方案，不需要辅助蛋白来有效表达NKG2D受体的胞外域。例如，在几个实施方案中，有效的NKG2D胞外域表达和/或功能不需要DAP10。同样，在几个实施方案中，有效的NKG2D胞外域表达和/或功能不需要DAP12。
在几个实施方案中，NKG2D的配体选自MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6及其组合。在几个实施方案中，其他肿瘤相关配体可以是结合的。在几个实施方案中，NKG2D受体是人NKG2D受体的片段。在替代实施方案中，可以使用非人序列。
在几个实施方案中，提供了一种治疗肝细胞癌的方法，该方法包括向患有肝细胞癌的患者施用包含工程化改造为表达细胞毒性受体复合物的天然杀伤(NK)细胞群体的组合物，其中细胞毒性受体复合物包含偶联至跨膜域的胞外域，所述跨膜域还偶联至信号传导域，其中胞外域包含天然杀伤组2D(NKG2D)受体的片段，其中片段NKG2D受体与由SEQ IDNO.24的多核苷酸编码的NKG2D受体片段至少95％同源，其中施用包括注射到患者的肝内动脉中。
在几个实施方案中，细胞毒性信号传导复合物的信号传导域包含OX40域。在几个实施方案中，细胞毒性信号传导复合物的信号传导域还包含CD3zeta域。取决于实施方案，CD3zeta域包含至少一个基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)基序。在几个实施方案中，不存在ITAM基序。在几个实施方案中，共刺激域包含IL-15。在几个实施方案中，IL-15由NK细胞以结合膜的IL-15表达。在几个实施方案中，通过分泌性IL-15的表达来补充膜结合的IL-15。在几个实施方案中，替代IL-15或除了IL-15之外，可以使用替代性白介素。
在几个实施方案中，细胞毒性信号传导复合物的跨膜域源自CD8 alpha。在几个实施方案中，跨膜域包含第一和第二亚域。在一些此类实施方案中，第一亚域包含CD8 alpha跨膜域。在一些此类实施方案中，第二亚域包含CD8alpha铰链。
在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物与由SEQ ID NO.7的多核苷酸编码的细胞毒性受体复合物至少80％同源。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物与由SEQ IDNO.7的多核苷酸编码的细胞毒性受体复合物至少85％同源。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物与由SEQ ID NO.7的多核苷酸编码的细胞毒性受体复合物至少90％同源。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物与由SEQ ID NO.7的多核苷酸编码的细胞毒性受体复合物至少95％同源。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物与具有SEQ ID NO.8的氨基酸序列的细胞毒性受体复合物至少80％同源。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物与具有SEQ ID NO.8的氨基酸序列的细胞毒性受体复合物至少90％同源。在几个实施方案中，所述细胞毒性受体复合物与由选自下组的多核苷酸编码的细胞毒性受体复合物至少80％同源：SEQ ID NO.1、3、5、9、11、13、15、15、17、19和21。在其他实施方案中，细胞毒性受体复合物可以与指定序列具有较小的同源性，但保留所有或基本上所有与参考受体复合物相同的功能。
在几个实施方案中，经皮施用本文所述的细胞/组合物。在几个实施方案中，经皮进入肝内动脉，并且其中通过输注施用细胞群体。在一个实施方案中，通过皮肤的针穿刺替换使用开放手术方法来靶向肝脏。在一个实施方案中，使用导管系统。在一些实施方案中使用有线系统(over-the-wire system)。在几个实施方案中，靶向肝系统外的肿瘤(例如实体瘤)或其他部位。
在一个实施方案中，将针穿过皮肤并放入诸如动脉或静脉的血管中。将诸如导丝的导引器引入到容器中。然后将针更换成导管或鞘，该导管或鞘在导引器上前进并进入血管。移除导引器，并更换成导管或其他医疗装置以用于递送本文所述的细胞/组合物。导管可以是部分或全部柔性的，以在曲折的血管中航行。在一些实施方案中，导管可以适应于肝动脉或门静脉的形状和大小。在一个实施方案中，在一段时间内递送细胞/组合物。在另一个实施方案中，细胞/组合物以单次推注递送。在其他实施方案中，细胞/组合物在基底上递送。在一些实施方案中，图像或其他引导用于促进递送。在一些实施方案中，细胞/组合物用于靶向的局部递送，使得将至少95％，97％，99％或100％的细胞/组合物递送并保留在靶物位置处。在一个实施方案中，仅靶向肝动脉，而非门静脉。在几个实施方案中，通过经动脉递送(例如，经动脉向肝动脉的递送)施用表达嵌合受体的NK细胞。
在几个实施方案中还提供了非经皮施用。在一些实施方案中，以静脉内、肌内、腹膜内、经由动脉和/或通过开放手术途径递送细胞和组合物。在一些实施方案中，治疗位于除肝以外的区域中的肿瘤(例如卵巢、胰、肾和其他器官)。尽管本文描述了NK细胞和组合物，但替换NK细胞或者除了NK细胞外(包括但不限于CAR T细胞、抗体、表皮生长因子受体抑制剂、抗肿瘤药等)，可以递送其他细胞或生物制剂/药物。在一些实施方案中，与NK细胞组合提供西妥昔单抗、达雷木单抗、利妥昔单抗、阿托珠单抗和曲妥珠单抗中的一种或多种。在几个实施方案中，与本文公开的工程化NK细胞组合提供一种或多种酪氨酸激酶抑制剂。例如，在几个实施方案中，索拉非尼与本文公开的工程化NK细胞联合施用。在几个实施方案中，舒尼替尼与本文公开的工程化NK细胞联合施用。在几个实施方案中，一种或多种化学治疗剂与本文公开的工程化NK细胞联合施用。在几个实施方案中，顺铂、羟基脲、5-氟尿嘧啶、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C和/或依托泊苷中的一种或多种与本文公开的工程化NK细胞联合施用。在几个实施方案中，高剂量电离辐射与本文公开的工程化NK细胞联合施用。在几个实施方案中，一种或多种蛋白酶体抑制剂与本文公开的工程化的NK细胞联合施用。在几个实施方案中，硼替佐米(例如
Figure BDA0003017782500000071
)与本文公开的工程化的NK细胞联合施用。在几个实施方案中，一种或多种HDAC抑制剂与本文公开的工程化的NK细胞联合施用。在几个实施方案中，雷米地辛(remidepsin)(例如，FR901228)、恩提诺特(entinostat)(例如，MS-275)、丁酸苯酯、贝利司他(belinostat)(例如，PDX101)、丙戊酸钠、辛二酰苯胺基异羟肟酸和/或丙戊酸与一种或多种本文公开的工程化的NK细胞联合施用。在几个实施方案中，全反式视黄酸和/或丁酸钠中的一种或多种与本文公开的工程化的NK细胞联合施用。在几个实施方案中，一种或多种脱甲基剂与本文公开的工程化的NK细胞联合施用。例如，在几个实施方案中，azazytidine和/或地西他滨(decitabine)与本文公开的工程化的NK细胞联合施用。在几个实施方案中，施用的另外的试剂例如通过诱导本文公开的工程化受体的配体的上调而使靶肿瘤细胞对工程化的NK细胞更易感。
在一些实施方案中，本文所述的细胞/组合物的递送与其他诊断和/或治疗方式一起施用。例如，可以将肿瘤消融(例如，冷冻疗法)、化学疗法、解剖等作为另外的疗法来施用。在几个实施方案中，提供了跨动脉化学栓塞、超声消融、微波消融、激光疗法、伽马刀放射手术、乙醇注射和/或放射栓塞。在一个实施方案中，细胞/组合物增强了这些其他疗法的功效，减少不希望的副作用和/或减少治疗时间。在一些实施方案中提供了增加递送、定位和/或功效的技术，包括但不限于增强细胞膜通透性的技术，例如电穿孔。
在几个实施方案中，所施用的NK细胞群体就患者而言是自体的。在替代实施方案中，所施用的NK细胞群体就患者而言是同种异体的。NK细胞是病毒感染的、受损和恶性的细胞的先天免疫传感器。NK不限于单一表位；它们读取极其多种的活化和抑制信号，以节省健康的细胞并杀死患病的细胞。还有，NK细胞增殖信号(例如，响应IL15、IL18、IL21、IL2、IL21)与驱动细胞毒性的信号(例如，通过NKG2D、NKG2C、CD16、DNAM-1、2B4、NKp44和/或NKp30的信号传导)不同。在几个实施方案中，根据本文公开的实施方案的工程化NK细胞的使用是有利的，因为此类工程化NK细胞：(i)能够区分健康细胞和癌细胞，(ii)能够靶向多种抗原，(iii)能够靶向许多肿瘤细胞过表达的天然配体，(iv)能够靶向检查点抑制剂，和/或(v)能够降低和/或消除移植物抗宿主病的风险。在几个实施方案中，根据本文公开的实施方案的工程化细胞具有在有限细胞死亡的情况下耐受冷冻保存的能力。在几个实施方案中，这使得现成的产品成为可能。仍在另外的实施方案中，所施用的群体是混合的自体/同种异体群体。在几个实施方案中，T细胞与NK细胞联合施用或代替NK细胞施用。在几个实施方案中，治疗方法还包括向患者施用IL-2。
在几个实施方案中，方法还包括在进入肝内动脉之前定位肝内动脉的位置。几个实施方案采用步骤来阻塞不向肝脏供应血液的血管。取决于实施方案，每1周一次、每2周一次、每3周一次或每4周一次重复NK细胞群体的施用。在几个实施方案中，所施用的组合物导致肿瘤负荷降低至少25％。在几个实施方案中，降低的肿瘤负荷是肝细胞癌肿瘤负荷的降低。在几个实施方案中，所施用的组合物包含约107至约1010个NK细胞。
在几个实施方案中，细胞毒性信号传导复合物的信号传导域包含CD3zeta域，并且胞外域由SEQ ID NO.24的多核苷酸编码。在几个实施方案中，CD3zeta域包含至少一个基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)基序。在几个实施方案中，细胞毒性信号传导复合物的信号传导域还包含OX40域。在几个实施方案中，细胞毒性信号传导复合物还包含4-1BB域。在几个实施方案中，细胞毒性信号传导复合物的信号传导域还包含CD28域。在几个实施方案中，细胞毒性信号传导复合物的信号传导域还包含NKp80域。
在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物由SEQ ID NO.1的核酸序列编码。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物由SEQ ID NO.3的核酸序列编码。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物具有SEQ ID NO.4的氨基酸序列。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物由SEQ IDNO.5的核酸序列编码。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物具有SEQ ID NO.6的氨基酸序列。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物由SEQ ID NO.7的核酸序列编码。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物具有SEQ ID NO.8的氨基酸序列。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物由SEQ ID NO.9的核酸序列编码。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物具有SEQ ID NO.10的氨基酸序列。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物由SEQ IDNO.11的核酸序列编码。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物具有SEQ ID NO.12的氨基酸序列。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物由SEQ ID NO.13的核酸序列编码。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物具有SEQ ID NO.14的氨基酸序列。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物由SEQ ID NO.15的核酸序列编码。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物具有SEQ ID NO.16的氨基酸序列。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物由SEQ IDNO.17的核酸序列编码。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物具有SEQ ID NO.18的氨基酸序列。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物由SEQ ID NO.19的核酸序列编码。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物具有SEQ ID NO.20的氨基酸序列。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物由SEQ ID NO.21的核酸序列编码。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物具有SEQ ID NO.22的氨基酸序列。
上面概述并在下面进一步详细阐述的组合物和相关方法描述了从业者采取的某些动作；然而，应当理解，它们也可以包括另一方对那些动作的指示。因此，诸如“将工程化NK细胞群体局部施用于肝”的动作包括“指示将工程化NK细胞群体局部施用于肝”。
附图简述
图1A-1G表示根据本文公开的几个实施方案的用于在NK细胞中表达的细胞毒性受体复合物构建体的示意图。
图2A-2D表示根据本文公开的几个实施方案的用于在NK细胞中表达的其他细胞毒性受体复合物构建体的示意图。
图3A至3C描绘了与天然NK细胞(NT NK)或根据本文公开的实施方案的工程化NK细胞(NKX101)共培养时由培养的肝细胞癌细胞释放的各种因子的浓度相关的数据。
图4A-4J显示了当以不同效应子:靶物比率与各种肝细胞癌细胞系共培养时由天然NK细胞(NT NK)或根据本文公开的实施方案的工程化NK细胞(NKX101)诱导的细胞毒性作用程度相关的数据。图4J在对NKX101的抗性方面汇总了细胞系，如通过以效应子与靶物比率1:2时仍能存活的对照细胞的百分比测量。图4K-4S描绘了当以不同效应子:靶物比率与各种肝细胞癌细胞系共培养时由天然NK细胞(供体号)或根据本文公开的实施方案的工程化NK细胞(NKX101(加上供体号))诱导的细胞毒性作用程度相关的其它数据。图4T-4BB反映了图4F-4S中显示的那些痕线的汇总数据。Y轴显示基于未处理的HCC细胞数量的对照百分比(PoC)(计算为[(平均实验值)/(对照平均值)*100]。
图5显示了用于在减轻小鼠肝细胞癌肿瘤负荷中体内评估NKX101的方案的示意图。在HCC施用后8天，对接受肝细胞癌细胞(带有萤火虫萤光素酶的SNU449细胞)的小鼠IP施用3x106个细胞(未修饰的NK或NKX101)或PBS。NKX101的转导效率为约57％，而残留的CD3+T细胞小于2％。
图6A-6F显示了与接受PBS(A和D)，未修饰的NK(B和E)或NKX101(C和F)的小鼠的肿瘤负荷相关的数据。A，B和C中显示了接受指定细胞(或PBS)并随时间描绘肿瘤负荷的小鼠的生物发光图像。D，E和F中显示了相应的线图，随时间描绘了肿瘤负荷。
图7A-7E描绘了当单独使用或与本文提供的工程化NK细胞结合使用时，与索拉非尼针对各种肿瘤细胞系的功效相关的数据。图7A描绘了与指示的HCC细胞系在不同剂量的小分子索拉非尼(其抑制Raf-1，B-Raf和VEGFR-2信号传导途径)上的存活百分比相关的数据。图7B是索拉非尼针对HCC细胞系的列表EC50剂量。图7C-7E描绘了在指定的效应子:靶物比率下酪氨酸激酶抑制剂(索拉非尼)与天然NK细胞或NKX101的各种组合的细胞毒性。
图8A-8I描绘了与使用Bamomab抗体测量的指定肝细胞癌细胞类型中各种NKG2D受体配体和对照标志物的表达相关的数据。NKG2D配体被虚线框包围，而对照被实心框包围。
图9A-9F描绘了就指定的NKG2D受体配体的表达程度而言与各种HCC细胞系的细胞毒性程度相关的数据。
图10A-10G描绘了与各种HCC细胞系(A和B)上的NKG2D-Fc的表达程度以及NKG2D-Fc的表达与指定的NKG2D受体配体之间的相关性程度相关的数据。
图11A-11B描绘了与在经工程化改造以表达萤光素酶的2种模型HCC细胞系中在4小时终点测量的NKX101细胞的增强的体外细胞毒性相关的数据(11A显示了Hep3b细胞；11B显示了SNU449细胞)。显示了在K562-mbIL15-41BBL刺激性细胞的情况下扩增后第21天来自2个供体的NKX101和未修饰(NT NK)的NK细胞的平均值。使用Prism 4参数非线性回归分析计算的EC50值。
图12A-12I描绘了使用PE缀合的抗体(来自R&D Systems)测量的指定的肝细胞癌细胞类型中各种NKG2D受体配体和对照标志物的表达相关的数据。NKG2D配体被虚线框包围，而对照被实心框包围。
图13A-13I描述了使用来自图12的PE缀合的抗体和来自图8的BAMOmAb抗体在指定的各种指定的肝细胞癌细胞系中NKG2D配体表达的汇总数据。数据显示为dMFI(delta均值荧光强度，计算为检测到的靶MFI-抗体同种型MFI(例如背景))。
图14A-14F涉及HCC中特定NKG2D配体变化的研究。这些数据绘制了所有NKG2D配体的表达水平(Y轴)，如通过NKG2D-Fc相对于指定的特定NKG2D配体对配体的结合(X轴)测量。
图15A-15C描绘了在3种工程化为表达萤光素酶的模型HCC细胞系中在4小时终点测量的NKX101细胞的细胞毒性数据(15A显示了Hep3b细胞；15B显示了Huh-7细胞，而15C显示了SNU449细胞)。显示在K562-mbIL15-41BBL刺激性细胞的情况下扩增后第21天，来自2个供体的NKX101和未修饰(供体号)NK细胞的平均值。
图16A-16G涉及各种肝细胞癌细胞表达萤光素酶的工程化。用于转导细胞系的载体包括CD19表达标签，以允许对转导细胞进行MACS CD19阳性选择。图16A-16F显示了每种指定细胞系的流式细胞术数据。图16G总结了如通过萤光素酶表达(以相对光单位/10,000个细胞)测量的细胞的成功生成。
图17A-17N涉及与索拉非尼浓度有关的总NKG2D配体和PD-L1的表达。图17A-17F描绘了响应不同浓度的索拉非尼，在指定的肿瘤细胞系中总的NKG2D配体表达变化相关的流式细胞术数据(总表达基于NKG2D-Fc融合物的使用，因此可检测到NKG2D可以结合的任何配体)。图17G-17L描绘了响应于各种浓度的索拉非尼，指定的肿瘤细胞系中PD-L1表达的变化相关的流式细胞术数据。图17M和17N是总结流式细胞术数据的线图。
图18A-18T涉及与干扰素gamma(IFNg)浓度有关的总NKG2D配体和PD-L1的表达。图18A-18I描绘了响应各种浓度的IFNg，指示的肿瘤细胞系中总NKG2D配体表达变化相关的流式细胞术数据(总表达基于NKG2D-Fc融合物的使用，因此可检测到NKG2D可以结合的任何配体)。图18J-18S描绘了响应于各种浓度的IFNg，指定的肿瘤细胞系中的PD-L1表达变化相关的流式细胞术数据。图18S和18T是总结流式细胞术数据的线图。
图19A-19D涉及未被嵌合受体构建体转导的NK细胞的PD-1表达或NKX101细胞的PD-1表达。
图20A-20E涉及通过工程化萤光素酶表达性结肠直肠癌(CRC)细胞系的CD19表达。用于转导细胞系的载体包括CD19表达标签，以允许对转导细胞进行MACS CD19阳性选择。
图21A-21E涉及通过工程化为表达萤光素酶的CRC细胞表达各种NKG2D配体。
图22A-22F显示了涉及CD3消耗之前(A-C)和(D-F)之后来自3个供体的NK细胞的CD56表达的流式细胞术数据。
图23A-23C显示了涉及来自两个供体的NK细胞中工程化NK细胞(NKX101)(与非转导NK细胞(NTNK)相比)的NKG2D受体表达的流式细胞术数据。
图24A-24C描绘了来自四个不同供体的NKX101细胞对指定的CRC细胞系的细胞毒性数据以及相关的EC50值。在K562-mbIL15-41BBL刺激性细胞的情况下扩增后第14-21天收集的数据。
图25A-25F显示了涉及来自两个供体并且工程化为表达NKX101的NK细胞的表征的流式细胞术数据。图25A-B和D-E涉及在CD3消耗之前(A-B)和(D-E)之后来自两个供体的NK细胞的CD56表达。图25C和25F显示了涉及来自这两个供体的NK细胞中NKX101表达(与非转导的NK细胞(NTNK)相比)的流式细胞术数据。
图26A-26C描绘了响应于非转导的NK细胞(NTNK)或表达NKX101的NK细胞，由指定的CRC细胞系释放的细胞因子的分析。
图27A-27E显示了在图26A-26E中分析和总结的每种细胞因子的标准曲线。
图28A-28B显示了与扩增期间NK细胞的活化性受体表达相关的流式细胞术数据。
图29A-29C显示了根据本文公开的实施方案的工程化的NK细胞的体内持久性和细胞毒性的数据。图29A显示了本文公开的工程化NK细胞的非限制性实施方案的增强的体内持久性。图29B显示了本文公开的工程化NK细胞的非限制性实施方案的增强的体内细胞毒性数据。图29C显示了在图29B的数据基础上的生物发光强度成像数据。
图30A-30B涉及来自THP1 AML异种移植物模型的数据。图30A描绘了与根据本文公开的实施方案的NKG2D CAR对急性骨髓性白血病细胞的细胞毒性相关的体内数据。图30B提供了体内数据的总结。
图31描绘了与根据本文公开的实施方案的NKG2D CAR对各种急性骨髓性白血病细胞的细胞毒性相关的汇总数据。
图32A-32K涉及如本文公开的NK细胞和工程化NK细胞的进一步表征。图32A显示了用于表征本文公开的工程化NK细胞及其对冷冻保存的响应的示意性方案。图32B显示了与工程化NK细胞存活力相关的数据。图32C显示了与工程化NK细胞存活细胞回收相关的数据。图32D显示了与细胞毒性的工程化NK细胞保留相关的数据。图32E显示了与扩增期间工程化NK细胞的某些标志物表达相关的汇总数据。图32F显示了与在扩增期间工程化NK细胞的某些标志物表达相关的其他汇总数据。图32G显示了与扩增期间工程化NK细胞的CD16表达相关的汇总数据。图32H显示了与扩增期间工程化NK细胞的标志物表达相关的汇总数据。图32I显示了与扩增期间工程化NK细胞的标志物表达强度相关的汇总数据。图32J显示了与单独用饲养细胞扩增期间工程化NK细胞的标志物表达相关的汇总数据。图32K显示了与用饲养细胞和其他细胞因子扩增期间工程化NK细胞的标志物表达相关的汇总数据。
图33A-33C涉及根据本文公开的实施方案的工程化NK细胞或在靶细胞(此处为Raji和Nalm6细胞)上的各种表面标志物的表达。图33A显示了根据本文公开的几个实施方案在表达NKG2D CAR的NK细胞上的CD16表达。图33B显示了Raji和Nalm6肿瘤细胞上的CD19表达。图33C显示了在Raji和Nalm6肿瘤细胞上的CD20表达。
图34显示了与当暴露于表达NKG2D CAR的非限制性实例的NK细胞以及抗CD20抗体时Raji细胞生长减少相关的数据。
图35A-35B涉及当暴露于表达NKG2D CAR的非限制性实例的NK细胞以及HDAC抑制剂时对HL60白血病细胞生长的抑制。图35A显示了在指定构建体的情况下的HL60细胞生长。图35B显示了与HDAC抑制剂施用结合的相同构建体。
图36描绘了与表达如本文所公开的NKG2D CAR的非限制性实施方案的各种免疫细胞类型存在下细胞生长减少相关的数据。
发明详述
将药物产品递送至治疗活性部位是影响药物性能和安全性的重要因素。在细胞免疫治疗的情况下，递送问题可能是有效疗法的另一个障碍，因为效应细胞类型经常被排除在肿瘤微环境之外。虽然NK细胞的肿瘤浸润与几种肿瘤类型的预后良好相关，但也已观察到NK细胞难以浸润某些肿瘤类型(例如，肾细胞癌、结肠直肠癌和黑素瘤)。缺乏浸润(可能与NK细胞表达的趋化因子受体全集中的缺口有关)可以解释结合某些肿瘤采用过继输注的NK细胞获得的各种临床结果。
一些疗法受益于治疗剂向肝脏的局部递送。例如，已经证明了通过肝内动脉施用化学治疗剂。类似地，已经进行了CAR T细胞向肝脏的区域递送以治疗肝细胞癌。
根据本文公开的几个实施方案，使用NK细胞的细胞疗法是用于肝细胞癌的有吸引力的选择。NKG2D受体的配体在肝细胞癌中表达，并且NKG2D受体的过表达在体外和体内改善了NK细胞对肝细胞癌衍生的细胞系的细胞毒性。此外，尽管源自肝细胞癌患者的NK细胞可以表现出耗竭的迹象，但暴露于IL-15可以恢复某些功能性。在一些实施方案中，NK细胞的肝内递送是使用这些细胞治疗肝细胞癌的高效方法。在几个实施方案中，使用工程化的NK细胞的基于NK的疗法比天然NK细胞进一步提高功效。例如，根据一些实施方案，将NK细胞工程化改造以表达包含NKG2D受体(或其部分)的细胞毒性受体复合物。根据一些实施方案，将NK细胞工程化改造以表达IL-15，在一些实施方案中以分泌形式表达，而在一些实施方案中，IL-15是膜结合的。虽然NK对肝细胞癌的浸润可能受到限制，并潜在被肿瘤微环境抑制，但此类工程化NK细胞向肝脏的局部递送既可以确保将有效剂量递送至疾病部位，又可以将细胞包含在需要它们的解剖区室中，从而限制了潜在的脱靶毒性。因此，如下文更详细地讨论，局部递送此类工程化NK细胞的此类组合物和方法增强了NK对NKG2D配体的敏感性并提高了它们抵抗肿瘤微环境的抑制力的能力，并提供了增强的抗癌疗法。
用于免疫疗法的工程化NK细胞
各种类型的免疫细胞可用于细胞免疫疗法。一些实施方案涉及基于T细胞的组合物(例如，表达如本文公开的基于NKG2D的细胞毒性受体复合物的那些)和方法。几个实施方案涉及基于NK细胞的组合物和方法。根据几个实施方案，包含工程化NK细胞的组合物具有某些有利的特征。NK细胞实现自体或供体来源的同种异体细胞的使用。根据几个实施方案，工程化的NK细胞对正常细胞具有最小的细胞毒性。当结合例如经由肝内动脉的局部递送时，优点得到进一步增强。工程化NK细胞还具有相当大的细胞毒性作用，相对于已经相当有力的天然NK细胞升高得出乎意料。
根据几个实施方案，将NK细胞工程化改造以表达一种或多种细胞毒性受体复合物。根据实施方案，复合物包含与肿瘤配体结合的域(例如，胞外域)，和包含跨膜域、信号传导域和/或共刺激域的细胞毒性信号传导复合物。每个域可以包括一个或多个亚域。
结合肿瘤配体的域
在几个实施方案中，利用工程化NK细胞的识别和破坏肿瘤细胞的能力。NK细胞在细胞表面上表达抑制性和活化性受体。抑制性受体与健康细胞表面上表达的自身分子结合(从而防止针对“自身”细胞的免疫应答)，而活化性受体与异常细胞(如肿瘤细胞)上表达的配体结合。有利于活化性受体的抑制性受体和活化性受体活化之间的平衡中的“倾斜”导致NK细胞活化和靶(例如肿瘤)细胞裂解。天然杀伤组2成员D(NKG2D)是NK细胞活化受体，其可识别细胞上表达的多种配体。各种NKG2D配体的表面表达在健康细胞中通常较低，但在例如恶性转化后上调。被NKG2D识别的配体的非限制性实例包括但不限于MICA，MICB，ULBP1，ULBP2，ULBP3，ULBP4，ULBP5和ULBP6，以及在靶细胞上表达的控制NK细胞的溶细胞性或细胞毒性功能的其他分子。
在几个实施方案中，将细胞工程化改造以表达包含全长NKG2D作为细胞外组分以识别肿瘤细胞(例如，肝细胞)表面上的配体的细胞毒性受体复合物。在一个实施方案中，全长NKG2D具有SEQ ID NO.24的核酸序列。
在几个实施方案中，将细胞工程化改造以表达包含NKG2D功能性片段作为细胞外组分以识别肿瘤细胞(例如，肝细胞)表面上的配体的细胞毒性受体复合物。在一实施方案中，NKG2D的功能性片段具有SEQ ID NO.24的核酸序列。在几个实施方案中，NKG2D的片段与全长野生型NKG2D是至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％或至少95％同源的。在几个实施方案中，片段可以具有来自SEQ ID NO.24的一个或多个另外的突变，但保留配体结合功能，或在某些实施方案中具有增强的配体结合功能。在几个实施方案中，NKG2D片段以二聚体、三聚体或其他连环体(concatameric)形式提供，此类实施方案提供增强的配体结合活性。在几个实施方案中，编码NKG2D片段的序列任选地是完全或部分密码子优化的。在一个实施方案中，编码密码子优化的NKG2D片段的序列包含SEQ ID NO.25的序列。有利地，根据几个实施方案，功能性片段缺乏其天然的跨膜或细胞内域，但是保留其结合NKG2D的配体以及在配体结合时转导活化信号的能力。此类片段的另一个优点是不需要表达DAP10以将NKG2D定位于细胞膜。因此，在几个实施方案中，由本文公开的多肽编码的细胞毒性受体复合物不包含DAP10。
在几个实施方案中，将细胞毒性受体复合物配置为二聚体。取决于实施方案，二聚化可包括同二聚体或异二聚体。在几个实施方案中，二聚化导致细胞毒性受体复合物(因此表达该受体的NK细胞)的配体识别改善，从而导致不良毒性作用的减少(或缺乏)。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物采用内部二聚体或一种或多种组分亚基的重复。例如，在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物可任选地包含与第二NKG2D胞外域偶联的第一NKG2D胞外域，以及跨膜/信号传导区(或不同的跨膜区以及不同的信号传导区)。
在几个实施方案中，各种域/亚域通过接头分开，例如使用GS3接头(SEQ ID NO:41)(或GSn接头)。这提供了沿多核苷酸分开受体复合物的各个组分部分的潜力，这可以增强受体复合物的表达。
细胞毒性信号传导复合物
如本文所公开，根据几个实施方案，所提供的细胞毒性受体复合物包含与靶细胞表面上的配体结合的域，并且还包含细胞毒性信号传导复合物。在几个实施方案中，细胞毒性信号传导复合物包含至少一个跨膜域、至少一个共刺激域和/或至少一个信号传导域。在一些实施方案中，一个给定的域构成一个以上的组成部分，例如，共同刺激域可以包括两个亚域。此外，在一些实施方案中，域可以起到多种功能，例如跨膜域也可以用来提供信号传导功能。
跨膜域
在几个实施方案中，采用的NKG2D域保留其正常跨膜域的至少一部分。然而，在几个实施方案中，跨膜域包含CD8(通常在T细胞和NK细胞两者上表达的跨膜糖蛋白)的至少一部分。在几个实施方案中，跨膜域包含CD8α。在几个实施方案中，跨膜域被称为“铰链”。在几个实施方案中，CD8α的“铰链”具有SEQ ID NO.26的序列。在几个实施方案中，CD8α铰链被截短或修饰，并且与具有SEQ ID NO.26序列的CD8α铰链至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％同源。
在几个实施方案中，跨膜域包含CD8α跨膜区。在几个实施方案中，CD8α跨膜域具有SEQ ID NO.27的序列。在几个实施方案中，CD8α铰链被截短或修饰，并且与具有SEQ IDNO.27序列的CD8α至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％同源。
在几个实施方案中，跨膜域包含IgG4短铰链。在几个实施方案中，IgG4短铰链跨膜域具有SEQ ID NO.28的序列。在几个实施方案中，CD8α铰链被截短或修饰，并且与具有SEQID NO.28的序列的CD8α至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％同源。
在几个实施方案中，细胞毒性信号传导复合物包含CD28域。在几个实施方案中，跨膜域包含CD28，而在几个实施方案中，CD28域是细胞内信号传导域，而在几个实施方案中，CD28域是跨膜/细胞内信号传导域。在几个实施方案中，CD28跨膜域具有SEQ ID NO.29的序列。在几个实施方案中，CD28跨膜域可以被截短或修饰，使得其与具有SEQ ID NO.29的序列的CD28至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％同源。在几个实施方案中，CD28信号传导域具有SEQ ID NO.40的序列。在几个实施方案中，CD28信号传导域可以被截短或修饰，使得它与具有SEQ ID NO.40的序列的CD28至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％同源。在几个实施方案中，CD28用作构建体中的唯一跨膜/信号传导域，但是，在几个实施方案中，CD28可以与一个或多个其他域一起使用。
在几个实施方案中，CD28用作构建体中的唯一跨膜/信号传导域，但是，在几个实施方案中，CD28可以与一个或多个其他域一起使用。例如，在一些实施方案中使用CD28，OX40、4-1BB和/或CD3zeta的组合。
在几个实施方案中，跨膜域包含T细胞CD3 T细胞受体复合物(由zeta,alpha,beta,gamma,delta和epsilon亚基组成)的跨膜域。在几个实施方案中，使用整个跨膜域，而在一些实施方案中，使用其片段。在一些实施方案中，1至20个(例如1、2、3、4、5、6、8、10、15或更多)细胞外CD3zeta残基直接邻近CD3zeta跨膜域。在一些实施方案中，CD3zeta跨膜域具有SEQ ID NO.30的序列。在几个实施方案中，CD3zeta跨膜域可以被截短或修饰，使得它与具有SEQ ID NO.30的序列的CD3zeta跨膜域至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％同源。在几个实施方案中，对CD3zeta跨膜域的修饰包含额外的核酸残基以增加域的长度。
共刺激域
在几个实施方案中，除了各种跨膜域和信号传导域(以及跨膜/信号传导域的组合)之外，还可以提供另外的共活化分子。这些可以是例如进一步增强免疫细胞活性的某些分子。在几个实施方案中可以使用细胞因子。例如，使用某些白介素，例如IL-2和/或IL-15作为非限制性实例。在一些实施方案中，将用于疗法的免疫细胞工程化改造为以分泌形式表达此类分子。在另外的实施方案中，将此类共刺激域工程化改造为膜结合的，充当自分泌刺激分子(或甚至作为对递送的邻近细胞的旁分泌刺激物)。在几个实施方案中，将NK细胞工程化以表达膜结合的白介素15(mbIL15)。在此类实施方案中，NK上的mbIL15表达通过增强NK细胞的增殖和/或寿命来增强工程化NK细胞的细胞毒性作用。在几个实施方案中，mbIL15具有SEQ ID NO.39的核酸序列。在几个实施方案中，mbIL15可以被截短或修饰，以使其与SEQ ID NO.39的序列至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％同源。
在一些实施方案中，工程化的细胞毒性受体复合物由包括一个或多个胞质溶胶蛋白酶切割位点，例如T2A切割位点，P2A切割位点，E2A切割位点和/或F2A切割的多核苷酸编码。此类位点被胞质溶胶蛋白酶识别和切割，这可以导致由多核苷酸编码的受体的各个组成部分的分开(和分开表达)。因此，取决于实施方案，可以在单个载体中或通过多个载体将工程化细胞毒性受体复合物的各个组成部分递送至NK细胞。因此，如在附图中示意性所示，构建体可以由单个多核苷酸编码，但是还包括切割位点，使得构建体的下游元件作为单独的蛋白质被细胞表达(在具有IL-15的某些实施方案中就是如此)。在几个实施方案中，使用T2A切割位点。在几个实施方案中，T2A切割位点具有SEQ ID NO.38的核酸序列。在几个实施方案中，mbIL15可以被截短或修饰，以使其与SEQ ID NO.38的序列至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％同源。
信号传导域
在几个实施方案中，通过4-1BB(也称为CD137和肿瘤坏死因子受体超家族成员9(TNFRSF 9))提供信号传导。尽管4-1BB作为活化的T细胞的刺激分子具有天然作用(例如，4-1BB的交联增强T细胞增殖和细胞溶解活性)，但如本文公开，一些实施方案在NK细胞的情况下利用4-1BB活性功能。在几个实施方案中，4-1BB具有SEQ ID NO.31的序列。在几个实施方案中，4-1BB可以被截短或修饰，使得其与具有SEQ ID NO.31的序列的4-1BB至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％同源。在几个实施方案中，4-1BB是唯一的信号传导域。然而，在几个实施方案中，通过使用其活性协同起作用的多个信号传导域来实现增强的信号传导。
在几个实施方案中，根据本文公开的几个实施方案工程化改造的NK细胞包含CD3T细胞受体复合物的至少一个亚基(或其片段)。在几个实施方案中，信号传导域包含CD3zeta亚基。在几个实施方案中，CD3zeta具有SEQ ID NO.32的序列。在几个实施方案中，CD3zeta可以被截短或修饰，以使得它与具有SEQ ID NO.32序列的CD3 zeta至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％同源。
在几个实施方案中，将CD3 zeta进行突变(例如，氨基酸突变，插入或缺失)，使得域不再包括规范的基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)基序。在一些实施方案中，所得的工程化NK细胞表现出对靶细胞的特别增强的细胞毒性，具有有限或减少的不良副作用。在几个实施方案中，信号传导域包含非ITAM CD3 zeta亚基。在几个实施方案中，非ITAMCD3 zeta具有SEQ ID NO.33的序列。在几个实施方案中，非ITAM CD3 zeta可以被截短或修饰，使得其与具有SEQ ID NO.33的序列的非ITAM CD3 zeta至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％同源。
在几个实施方案中，这是由在该给定实施方案中使用的细胞毒性受体复合物的各个部分的协同相互作用导致的。在几个实施方案中，CD3zeta与4-1BB结合提供协同刺激作用，从而提供特别有效的(例如，细胞毒性的)NK细胞。
在几个实施方案中，信号传导域包括OX40域。在几个实施方案中，OX40域是细胞内信号传导域。在几个实施方案中，OX40细胞内信号传导域具有SEQ ID NO.35的序列。在几个实施方案中，OX40细胞内信号传导域可以被截短或修饰，使得其与具有SEQ ID NO.35的序列的OX40至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％同源。在几个实施方案中，OX40用作构建体中的唯一跨膜/信号传导域，但是，在几个实施方案中，OX40可以与一个或多个其他域一起使用。例如，在一些实施方案中使用CD28、OX40、4-1BB和/或CD3zeta的组合。
在几个实施方案中，信号传导域包括NKp80域。在几个实施方案中，NKp80域是细胞内信号传导域。在几个实施方案中，NKp80细胞内信号传导域具有SEQ ID NO.36的序列。在几个实施方案中，NKp80细胞内信号传导域可以被截短或修饰，使得其与具有SEQ ID NO.36的序列的OX40至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％同源。在几个实施方案中，NKp80用作构建体中的唯一跨膜/信号传导域，但是，在几个实施方案中，NKp80可以与一个或多个其他域一起使用。例如，在一些实施方案中使用CD28、OX40、4-1BB和/或CD3zeta的组合。
在几个实施方案中，信号传导域包含CD16的片段。在几个实施方案中，CD16的片段是CD16的胞内区(CD16IC)。在几个实施方案中，CD16IC域是细胞内信号传导域。在几个实施方案中，CD16IC细胞内信号传导域具有SEQ ID NO.37的序列。在几个实施方案中，CD16IC细胞内信号传导域可以被截短或修饰，使得其与具有SEQ ID NO.37的序列的OX40至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％同源。在几个实施方案中，CD16IC用作构建体中的唯一跨膜/信号传导域，但是，在几个实施方案中，CD16IC可以与一个或多个其他域一起使用。例如，在一些实施方案中使用CD28、OX40、4-1BB和/或CD3zeta的组合。
细胞毒性受体复合物构建体
与以上所述一致，本文提供了多种细胞毒性受体复合物(也称为细胞毒性受体)。这些复合物在NK细胞中的表达允许靶向和破坏特定靶细胞，例如癌细胞，特别是癌性肝细胞。此类细胞毒性受体复合物的非限制性实例在下文中更详细地讨论。
在几个实施方案中，提供了编码NKG2D/4-1BB/CD3z细胞毒性受体复合物的多核苷酸(参见图1A，NK45-1)。此类受体复合物包含胞外域，该胞外域包含结合NKG2D的天然配体的NKG2D片段。构建体还包含IgG4铰链和CD8α跨膜域，4-1BB亚域和CD3zeta ITAM亚域(共同充当信号传导域)以及IL-15域(充当共刺激域)。在几个实施方案中，此细胞毒性受体复合物由SEQ ID NO:1的核酸序列编码。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物包含SEQ IDNO:2的氨基酸序列。如示意性描绘，构建体包含IL-15，其在几个实施方案中使表达此构建体的NK细胞对靶肿瘤细胞特别有效。应当理解，根据几个实施方案，IL-15可以在单独的构建体上编码。在一些实施方案中，细胞毒性受体复合物的序列可以与SEQ ID NO.1不同，但取决于实施方案，保持与SEQ ID NO.1至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％或至少95％同源。另外，如上文指示，也可以使用不同的胞外域，例如SEQ ID NO.23或25的胞外域，作为非限制性示例。
在几个实施方案中，提供了编码NKG2D/CD28/CD3z细胞毒性受体复合物的多核苷酸(参见图1B，NK45-2)。此类受体复合物包含胞外域，该胞外域包含结合NKG2D的天然配体的NKG2D片段。构建体进一步包含CD8α铰链和CD28跨膜域，CD28信号传导亚域和CD3zetaITAM亚域(共同充当信号传导域)以及IL-15域(充当共刺激域)。在几个实施方案中，此细胞毒性受体复合物由SEQ ID NO:3的核酸序列编码。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。如示意性描绘，构建体包含IL-15，其在几个实施方案中使表达该构建体的NK细胞对靶肿瘤细胞特别有效。应当理解，根据几个实施方案，IL-15可以在单独的构建体上编码。在一些实施方案中，细胞毒性受体复合物的序列可以与SEQ IDNO.3不同，但取决于实施方案，保持与SEQ ID NO.3至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％或至少95％同源。另外，如上文指示，也可以使用不同的胞外域，例如SEQ IDNO.23或25的胞外域，作为非限制性示例。
在几个实施方案中，提供了编码NKG2D(SH)/CD28/CD3z细胞毒性受体复合物的多核苷酸(参见图1C，NK45-3)。此类受体复合物包含胞外域，该胞外域包含结合NKG2D的天然配体的NKG2D片段。构建体还包含IgG4短铰链和CD28跨膜域，CD28信号传导亚域和CD3zetaITAM亚域(共同充当信号传导域)以及IL-15域(充当共刺激域)。在几个实施方案中，此细胞毒性受体复合物由SEQ ID NO:5的核酸序列编码。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。如示意性描绘，构建体包含IL-15，其在几个实施方案中使表达该构建体的NK细胞对靶肿瘤细胞特别有效。应当理解，根据几个实施方案，IL-15可以在单独的构建体上编码。在一些实施方案中，细胞毒性受体复合物的序列可以与SEQ IDNO.5不同，但取决于实施方案，保持与SEQ ID NO.5至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％或至少95％同源。另外，如上文指示，也可以使用不同的胞外域，例如SEQ IDNO.23或25的胞外域，作为非限制性示例。
在几个实施方案中，提供了编码NKG2D/OX40/CD3z细胞毒性受体复合物的多核苷酸(参见图1D，NK45-4)。此类受体复合物包含胞外域，该胞外域包含结合NKG2D的天然配体的NKG2D片段。该构建体进一步包含CD8α铰链和CD8α跨膜域，OX40信号传导亚域和CD3zetaITAM亚域(共同充当信号传导域)以及IL-15域(充当共刺激域)。在几个实施方案中，该细胞毒性受体复合物由SEQ ID NO:7的核酸序列编码。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。如示意性描绘，构建体包含IL-15，其在几个实施方案中使表达该构建体的NK细胞对靶肿瘤细胞特别有效。应当理解，根据几个实施方案，IL-15可以在单独的构建体上编码。在一些实施方案中，细胞毒性受体复合物的序列可以与SEQ IDNO.7不同，但取决于实施方案，保持与SEQ ID NO.7至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％或至少95％同源。另外，如上文指示，也可以使用不同的胞外域，例如SEQ IDNO.23或25的胞外域，作为非限制性示例。
在几个实施方案中，提供了编码NKG2D(SH)/OX40/CD3z细胞毒性受体复合物的多核苷酸(参见图1E，NK45-5)。此类受体复合物包含胞外域，该胞外域包含结合NKG2D的天然配体的NKG2D片段。该构建体进一步包含IgG4短铰链和CD8α跨膜域，OX40信号传导亚域和CD3zeta ITAM亚域(共同充当信号传导域)以及IL-15域(充当共刺激域)。在几个实施方案中，此细胞毒性受体复合物由SEQ ID NO:9的核酸序列编码。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。如示意性描绘，构建体包含IL-15，其在几个实施方案中使表达该构建体的NK细胞对靶肿瘤细胞特别有效。应当理解，根据几个实施方案，IL-15可以在单独的构建体上编码。在一些实施方案中，细胞毒性受体复合物的序列可以与SEQ ID NO.9不同，但取决于实施方案，保持与SEQ ID NO.9至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％或至少95％同源。另外，如上文指示，也可以使用不同的胞外域，例如SEQ ID NO.23或25的胞外域，作为非限制性示例。
在几个实施方案中，提供了编码NKG2D/CD3TM/CD28/CD3z细胞毒性受体复合物的多核苷酸(参见图1F，NK45-6)。此类受体复合物包含胞外域，该胞外域包含结合NKG2D的天然配体的NKG2D片段。此构建体进一步包含CD8α铰链和CD3跨膜域，CD28信号传导亚域和CD3zeta ITAM亚域(共同充当信号传导域)以及IL-15域(充当共刺激域)。在几个实施方案中，该细胞毒性受体复合物由SEQ ID NO:11的核酸序列编码。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。如示意性描绘，构建体包含IL-15，其在几个实施方案中使表达该构建体的NK细胞对靶肿瘤细胞特别有效。应当理解，根据几个实施方案，IL-15可以在单独的构建体上编码。在一些实施方案中，细胞毒性受体复合物的序列可以与SEQ ID NO.11不同，但取决于实施方案，保持与SEQ ID NO.11至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％或至少95％同源。另外，如上文指示，也可以使用不同的胞外域，例如SEQ ID NO.23或25的胞外域，作为非限制性示例。
在几个实施方案中，提供了编码NKG2D/CD28/4-1BB/CD3z细胞毒性受体复合物的多核苷酸(参见图1G，NK45-7)。此类受体复合物包含胞外域，该胞外域包含结合NKG2D的天然配体的NKG2D片段。构建体还包含CD8α铰链和CD28跨膜域，CD28信号传导亚域，4-1BB信号传导亚域和CD3zeta ITAM亚域(共同充当信号传导域)以及IL-15域(充当共刺激域)。在几个实施方案中，该细胞毒性受体复合物由SEQ ID NO:13的核酸序列编码。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。如示意性描绘，构建体包含IL-15，其在几个实施方案中使表达该构建体的NK细胞对靶肿瘤细胞特别有效。应当理解，根据几个实施方案，IL-15可以在单独的构建体上编码。在一些实施方案中，细胞毒性受体复合物的序列可以与SEQ ID NO.13不同，但取决于实施方案，保持与SEQ ID NO.13至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％或至少95％同源。另外，如上文指示，也可以使用不同的胞外域，例如SEQ ID NO.23或25的胞外域，作为非限制性示例。
在几个实施方案中，提供了编码NKG2D/CD8TM/4-1BB/CD3z细胞毒性受体复合物的多核苷酸(参见图2A，NK26-8)。此类受体复合物包含胞外域，该胞外域包含结合NKG2D的天然配体的NKG2D片段。构建体进一步包含CD8α铰链和CD8α跨膜域，4-1BB信号传导亚域和CD3zeta ITAM亚域(共同充当信号传导域)以及IL-15域(充当共刺激域)。在几个实施方案中，此细胞毒性受体复合物由SEQ ID NO:15的核酸序列编码。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。如示意性描绘，构建体包含IL-15，其在几个实施方案中使表达该构建体的NK细胞对靶肿瘤细胞特别有效。应当理解，根据几个实施方案，IL-15可以在单独的构建体上编码。在一些实施方案中，细胞毒性受体复合物的序列可以与SEQ ID NO.15不同，但取决于实施方案，保持与SEQ ID NO.15至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％或至少95％同源。另外，如上文指示，也可以使用不同的胞外域，例如SEQ ID NO.23或25的胞外域，作为非限制性示例。
在几个实施方案中，提供了编码NKG2D/CD3TM/4-1BB/CD3z(neg)细胞毒性受体复合物的多核苷酸(参见图2B，NK39-5)。此类受体复合物包含胞外域，该胞外域包含结合NKG2D的天然配体的NKG2D片段。此构建体进一步包含CD8α铰链和CD3跨膜域，4-1BB信号传导亚域和非ITAM CD3zeta亚域(共同充当信号传导域)以及IL-15域(充当共刺激域)。在几个实施方案中，此细胞毒性受体复合物由SEQ ID NO:17的核酸序列编码。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。如示意性描绘，构建体包含IL-15，其在几个实施方案中使表达该构建体的NK细胞对靶肿瘤细胞特别有效。应当理解，根据几个实施方案，IL-15可以在单独的构建体上编码。在一些实施方案中，细胞毒性受体复合物的序列可以与SEQ ID NO.18不同，但取决于实施方案，保持与SEQ ID NO.18至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％或至少95％同源。另外，如上文指示，也可以使用不同的胞外域，例如SEQ ID NO.23或25的胞外域，作为非限制性示例。
在几个实施方案中，提供了编码NKG2D/CD3TM/4-1BB/NKp80细胞毒性受体复合物的多核苷酸(参见图2C，NK39-6)。此类受体复合物包含胞外域，该胞外域包含结合NKG2D的天然配体的NKG2D片段。该构建体还包含CD8α铰链和CD3跨膜域，4-1BB信号传导亚域和NKp80信号传导亚域(共同充当信号传导域)以及IL-15域(充当共刺激域)。在几个实施方案中，此细胞毒性受体复合物由SEQ ID NO:19的核酸序列编码。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。如示意性描绘，构建体包含IL-15，其在几个实施方案中使表达该构建体的NK细胞对靶肿瘤细胞特别有效。应当理解，根据几个实施方案，IL-15可以在单独的构建体上编码。在一些实施方案中，细胞毒性受体复合物的序列可以与SEQ ID NO.19不同，但取决于实施方案，保持与SEQ ID NO.19至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％或至少95％同源。另外，如上文指示，也可以使用不同的胞外域，例如SEQ ID NO.23或25的胞外域，作为非限制性示例。
在几个实施方案中，提供了编码NKG2D/CD3TM/CD16IC/4-1BB细胞毒性受体复合物的多核苷酸(参见图2D，NK39-10)。此类受体复合物包含胞外域，该胞外域包含结合NKG2D的天然配体的NKG2D片段。构建体还包含CD8α铰链和CD3跨膜域，CD16细胞内信号传导亚域和4-1BB信号传导亚域和NKp80信号传导亚域(共同充当信号传导域)以及IL-15域(充当共刺激域)。在几个实施方案中，此细胞毒性受体复合物由SEQ ID NO:21的核酸序列编码。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。如示意性描绘，构建体包含IL-15，其在几个实施方案中使表达该构建体的NK细胞对靶肿瘤细胞特别有效。应当理解，根据几个实施方案，IL-15可以在单独的构建体上编码。在一些实施方案中，细胞毒性受体复合物的序列可以与SEQ ID NO.21不同，但取决于实施方案，保持与SEQ ID NO.21至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％或至少95％同源。另外，如上文指示，也可以使用不同的胞外域，例如SEQ ID NO.23或25的胞外域，作为非限制性示例。
任选地，取决于实施方案，本文公开的任何多核苷酸还可编码细胞毒性受体复合物的一个或多个组成亚基的截短和/或变体，而保持赋予针对靶细胞的细胞毒性作用的能力。另外，本文公开的任何多核苷酸还可以任选地包括针对细胞毒性受体复合物的整个或部分各个组成域的密码子优化的核苷酸序列。如本文所用，术语“片段”和“截短的”应被赋予其普通含义，并且还应包括蛋白质的N-和C-端缺失变体。
可以将编码本文所述的细胞毒性受体复合物的多核苷酸插入载体中，以实现在NK细胞中的表达。在一个实施方案中，多核苷酸与至少一种用于表达细胞毒性受体复合物的调节元件(例如启动子)可操作连接。在特定的实施方案中，使用转录调节元件，例如内部核糖体进入位点(IRES)或增强子元件，来指导细胞毒性受体复合物的转录。在一些实施方案中，多核苷酸包含一个或多个胞质溶胶蛋白酶切割位点，如本文所讨论。取决于实施方案，可以在单个或多个载体中将细胞毒性受体复合物的各种组成部分递送至NK细胞。无论所用载体的数量如何，任何多核苷酸均可任选地包含标签序列，从而允许鉴定表达该构建体的NK细胞的存在。例如，在几个实施方案中，使用FLAG标签(DYKDDDDK，SEQ ID NO.42)。也可用其他标签序列，例如多组氨酸标签(His标签)(HHHHHH，SEQ ID NO.43)，HA标签或myc标签(EQKLISEEDL；SEQ ID NO:44)。或者，使用绿色荧光蛋白或其他荧光部分。也可以使用标签类型的组合来个别识别细胞毒性受体复合物的亚成分。
在几个实施方案中，编码细胞毒性受体复合物的多核苷酸是可以例如通过电穿孔引入NK细胞的mRNA。在另一个实施方案中，载体是病毒，优选逆转录病毒，其可以通过转导引入NK细胞。在几个实施方案中，载体是鼠干细胞病毒(MSCV)。在另外的实施方案中，可以使用其他载体，例如慢病毒，腺病毒，腺伴随病毒等。在几个实施方案中，使用非HIV衍生的逆转录病毒。或者，可以使用质粒、噬菌粒、粘粒、病毒载体、噬菌体、人工染色体。
在一个实施方案中，在NK细胞中瞬时表达细胞毒性受体复合物。在另一个实施方案中，在NK细胞中稳定表达细胞毒性受体复合物。在另一个实施方案中，NK细胞是自体细胞。在另一个实施方案中，NK细胞是供体来源的(同种异体的)细胞。
施用和给药
本文进一步提供了治疗患有癌症，特别是肝细胞癌的受试者的方法，其包括向所述受试者施用包含经工程化改造以表达如本文所公开的细胞毒性受体复合物的NK细胞的组合物。在某些实施方案中，用本文所述的遗传工程化细胞治疗受试者达到以下一种，两种，三种，四种或更多种效果，包括例如：(i)疾病或与之相关的症状的严重性的降低或改善；(ii)与疾病有关的症状的持续时间的缩短；(iii)预防疾病或与之相关的症状的发展；(iv)疾病或与之相关的症状的消退；(v)预防与疾病有关的症状的发展或发作；(vi)预防与疾病有关的症状复发；(vii)减少受试者的住院；(viii)住院长度的缩短；(ix)患有疾病的受试者的存活增加；(x)与疾病有关的症状数量减少；(xi)另一种疗法的预防或治疗作用的增强，改善，补充，互补或提升。
施用可以通过多种途径进行，包括但不限于静脉内，动脉内，皮下，肌内，肝内，腹膜内和/或局部递送至受影响的组织。在几个实施方案中，通过注射至例如肝内动脉来局部实现对肝脏的施用。在另外的实施方案中，施用是局部的，以完成对其他器官的治疗。例如，在几个实施方案中，施用本文公开的组合物以治疗卵巢癌。在一些实施方案中，通过腹膜内施用进行此类治疗。可根据给定受试者的体重，疾病类型和状态以及期望的治疗积极性容易地确定给定受试者的NK细胞剂量，但取决于具体实施方案，其范围为每kg约105个细胞至每kg约1012个细胞(例如105-107,107-1010,1010-1012及其中的重叠范围)。在一个实施方案中，使用剂量递增方案。在几个实施方案中，施用一定范围的NK细胞，例如约1x106个细胞/kg至约1x108个细胞/kg。剂量也可以至少部分地由期望的效应子:靶物比率确定。在几个实施方案中，剂量可产生约100:1，约50:1，约25:10，10:1，约5:1，约3:1，约2:1，约1:1，约1:2，约1:5，约1:10，约1:25，约1:50，约1:100或它们之间的其他比率(包括端点)的效应子:靶物比率。取决于实施方案，可以治疗各种类型的癌症。在几个实施方案中，治疗肝细胞癌。本文提供的其他实施方案包括以下癌症的非限制性实例的治疗或预防，包括但不限于急性成淋巴细胞性白血病(ALL)，急性髓样白血病(AML)，肾上腺皮质癌，卡波西肉瘤，淋巴瘤，胃肠癌，阑尾癌，中枢神经系统癌，基底细胞癌，胆管癌，膀胱癌，骨癌，脑肿瘤(包括但不限于星形细胞瘤，脊髓肿瘤，脑干神经胶质瘤，胶质母细胞瘤，颅咽管瘤，室管膜母细胞瘤，室管膜瘤，髓母细胞瘤，髓上皮瘤)，乳腺癌，支气管肿瘤，伯基特淋巴瘤，宫颈癌，结肠癌，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，慢性骨髓性白血病(CML)，慢性骨髓增生性病症，导管癌，子宫内膜癌，食道癌，胃癌，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，毛细胞白血病，肾细胞癌，白血病，口腔癌，鼻咽癌，肝癌，肝显性转移性结肠直肠癌(dominant metastatic colorectal cancer)，胆管上皮癌，肺癌(包括但不限于非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌)，胰腺癌，肠癌，淋巴瘤，黑素瘤，眼癌，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，垂体癌，子宫癌和阴道癌。
在一些实施方案中，本文还提供了核酸和氨基酸序列，它们与相应的SEQ ID NO:1-44的核酸或氨基酸序列相比具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％(及其中的范围)的同源性，并且与相应的SEQ ID NO:1-44相比还表现出一种或多种功能：包括但不限于(i)增强的增殖，(ii)增强的活化，(iii)增强的对呈现配体的细胞的细胞毒性活性，含有由核酸或氨基酸序列编码的受体的NK细胞结合所述配体，(iv)对肿瘤或感染部位的增强的归巢，(v)降低的脱靶细胞毒性作用，(vi)免疫刺激性细胞因子和趋化因子(包括但不限于IFNg，TNFa，IL-22，CCL3，CCL4和CCL5)的分泌增强，(vii)刺激进一步的先天性和适应性免疫应答的能力增强，以及(viii)其组合。
另外，在几个实施方案中，提供了在考虑核酸密码的简并性的情况下对应于本文公开的任何核酸的氨基酸序列。此外，与本文明确公开的序列不同但具有功能相似性或等效性的那些序列(无论是核酸还是氨基酸)也涵盖在本公开的范围内。前述内容包括突变体、截短、取代或其他类型的修饰。
在几个实施方案中，编码公开的细胞毒性受体复合物的多核苷酸是mRNA。在一些实施方案中，多核苷酸是DNA。在一些实施方案中，多核苷酸与至少一种用于表达细胞毒性受体复合物的调节元件可操作连接。
根据几个实施方案，另外提供了编码本文提供的任何多核苷酸的包含多核苷酸的载体，其中多核苷酸任选地与至少一种用于表达细胞毒性受体复合物的调节元件的可操作连接。在几个实施方案中，载体是逆转录病毒。
本文进一步提供了工程化天然杀伤细胞，其包含如本文所公开的多核苷酸、载体或细胞毒性受体复合物。在几个实施方案中，这些NK细胞适合于局部递送至肿瘤部位例如肝脏，用于治疗或预防疾病，例如肝细胞癌。
另外提供了一种治疗肝肿瘤的方法，该方法包括向患有肝肿瘤的患者施用包含经工程化改造以表达细胞毒性受体复合物的天然杀伤(NK)细胞群体的组合物，其中细胞毒性受体复合物包含结合天然杀伤组2D(NKG2D)受体的配体的胞外域和细胞毒性信号传导复合物，其中NKG2D的配体选自MICA，MICB，ULBP1，ULBP2，ULBP3，ULBP4，ULBP5，ULBP6及其组合，其中胞外域由SEQ ID NO.23的多核苷酸的至少一部分编码，所述细胞毒性信号传导复合物包含跨膜域，共刺激域和信号传导域，并且其中施用包括注射到患者的肝内动脉中。在几个实施方案中，组合物包含约107至约1010个NK细胞。在几个实施方案中，方法进一步包括向患者施用IL-2。在几个实施方案中，细胞毒性信号传导复合物的信号传导域包含CD3zeta域，并且其中胞外域由SEQ ID NO.24的多核苷酸编码。在几个实施方案中，CD3zeta域包含至少一个基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)基序。在几个实施方案中，细胞毒性信号传导复合物的信号传导域还包含OX40域。在几个实施方案中，细胞毒性信号传导复合物的信号传导域还包含4-1BB域。在几个实施方案中，细胞毒性信号传导复合物的信号传导域还包含CD28域。在几个实施方案中，细胞毒性信号传导复合物的信号传导域还包含NKp80域。
另外提供了一种治疗肝细胞癌的方法，该方法包括向患有肝细胞癌的患者施用包含经工程化改造以表达细胞毒性受体复合物的天然杀伤(NK)细胞群体的组合物，其中细胞毒性受体复合物包括与跨膜域偶联的胞外域，所述跨膜域进一步与信号传导域偶联，其中胞外域包含天然杀伤组2D(NKG2D)受体的片段，其中NKG2D受体的片段与SEQ ID NO.24的多核苷酸编码的NKG2D受体片段具有至少95％的序列同一性，其中施用包括注射到患者的肝内动脉中。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物由SEQ ID NO.1的核酸序列编码。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物由SEQ ID NO.3的核酸序列编码。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物具有SEQ ID NO.4的氨基酸序列。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物由SEQ IDNO.5的核酸序列编码。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物具有SEQ ID NO.6的氨基酸序列。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物由SEQ ID NO.7的核酸序列编码。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物具有SEQ ID NO.8的氨基酸序列。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物由SEQ ID NO.9的核酸序列编码。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物具有SEQ ID NO.10的氨基酸序列。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物由SEQ IDNO.11的核酸序列编码。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物具有SEQ ID NO.12的氨基酸序列。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物由SEQ ID NO.13的核酸序列编码。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物具有SEQ ID NO.14的氨基酸序列。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物由SEQ ID NO.15的核酸序列编码。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物具有SEQ ID NO.16的氨基酸序列。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物由SEQ IDNO.17的核酸序列编码。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物具有SEQ ID NO.18的氨基酸序列。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物由SEQ ID NO.19的核酸序列编码。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物具有SEQ ID NO.20的氨基酸序列。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物由SEQ ID NO.21的核酸序列编码。在几个实施方案中，细胞毒性受体复合物具有SEQ ID NO.22的氨基酸序列。在几个实施方案中，向患者肝内动脉的注射是经皮注射。在几个实施方案中，NK细胞对患者是自体的。在几个实施方案中，方法进一步包括施用IL-2。在几个实施方案中，方法进一步包括施用另外的抗癌剂。在几个实施方案中，另外的抗癌剂是酪氨酸激酶抑制剂。在几个实施方案中，酪氨酸激酶抑制剂选自索拉非尼，尼洛替尼，伊马替尼，吉非替尼，厄洛替尼，舒尼替尼，adavosertib，拉帕替尼及其组合。
另外提供了一种用于治疗原发性肝肿瘤的方法，所述方法包括向患有肝细胞癌的患者施用包含经工程化改造以表达细胞毒性受体复合物的天然杀伤(NK)细胞群体的组合物，其中细胞毒性受体复合物包含与跨膜域偶联的胞外域，该跨膜域还与信号传导域偶联，其中胞外域包含天然杀伤组2D(NKG2D)受体的片段，其中细胞毒性受体复合物包含与SEQID NO:8在序列上至少90％相同的氨基酸序列；以及在施用NK细胞群体之前、同时或之后施用至少一种另外的抗癌剂，其中另外的抗癌剂是索拉非尼，尼洛替尼，伊马替尼，吉非替尼，厄洛替尼，舒尼替尼，adavosertib，拉帕替尼及其组合。
另外提供了用于治疗原发性肝肿瘤的联合疗法的系统，其包括组合物，所述组合物包含经工程化改造以表达细胞毒性受体复合物的天然杀伤(NK)细胞群体，其中细胞毒性受体复合物包含与跨膜域偶联的胞外域，所述跨膜域进一步偶联至信号传导域，其中胞外域包含天然杀伤组2D(NKG2D)受体的片段，其中细胞毒性受体复合物包含与SEQ ID NO:8在序列上至少90％相同的氨基酸序列；和至少一种另外的抗癌剂，其中另外的抗癌剂是索拉非尼，尼洛替尼，伊马替尼，吉非替尼，厄洛替尼，舒尼替尼，adavosertib，拉帕替尼及其组合，并且其中另外的抗癌剂被配置用于在施用NK细胞群体之前，同时或之后对患有原发性肝肿瘤的受试者施用。
另外，提供了根据本文所述实施方案中任一项的组合物或治疗方法。
另外，提供了根据本文所述实施方案中任一项的组合物或其在治疗肝脏或其他器官中的肿瘤中的用途。
另外，提供了根据本文所述的实施方案中任一项的组合物或治疗方法，其中与天然NK细胞相比，工程化的NK细胞表现出至少3倍的细胞毒性增加。
另外，提供了根据本文所述的实施方案中任一项的组合物或其在治疗肝脏或其他器官中的肿瘤中的用途，其中与天然NK细胞相比，工程化的NK细胞显示出至少3倍的细胞毒性增加。
另外，提供了一种用于治疗肿瘤的方法，该方法包括进入患有肿瘤的患者的供血血管，其中肿瘤通过供血血管接收其血液供应的至少一部分，并施用工程化改造以表达细胞毒性受体复合物的天然杀伤(NK)细胞群体，其中细胞毒性受体复合物包含C型凝集素样受体的功能性片段，以及包含跨膜域，共刺激域和信号传导域的细胞毒性信号传导复合物，其中C型凝集素样受体包括天然杀伤组2D(NKG2D)受体，其中C型凝集素样受体的功能性片段包括SEQ ID NO.24，其中与非工程化的NK细胞相比，工程化的NK细胞对肿瘤细胞表现出至少3倍的效力增加；并且在施用NK细胞群体之前，同时或之后，施用至少一种另外的抗癌剂。在几个实施方案中，另外的抗癌剂是酪氨酸激酶抑制剂。在几个实施方案中，另外的抗癌剂是索拉非尼，尼洛替尼，伊马替尼，吉非替尼，厄洛替尼，舒尼替尼，adavosertib，拉帕替尼及其组合。在几个实施方案中，细胞毒性信号传导复合物的信号传导域包含OX40域。
实施例
下文描述的方法和材料是可根据本文公开的实施方案使用的方法和材料的非限制性实例。
肝细胞癌
背景：
在几个实施方案中，天然杀伤(NK)细胞为用于细胞免疫疗法的T细胞提供了替代或补充，因为它们不受HLA限制，因此适合于同种异体的现成使用。扩增的NK细胞可以工程化改造以表达嵌合受体，以进一步改善其对造血肿瘤和实体瘤两者的细胞毒性。在健康的人类中，肝内淋巴细胞的大部分是NK细胞，并且对于肝细胞癌(HCC)的情况，CD56+NK细胞的浸润与细胞凋亡和患者存活率呈正相关。天然杀伤组2D(NKG2D)受体的多个配体在HCC组织中高度表达，但在健康组织上以较低水平，这使得NKG2D成为靶向HCC的NK细胞工程的有吸引力的候选物。将根据本文公开的几个实施方案的工程化的NK细胞(统称为NKX101)工程化以表达NKG2D嵌合受体，可以改善它们对HCC细胞的细胞毒性，增强促炎性细胞因子应答，并控制肿瘤负荷。进行了与根据结肠直肠癌的原发性肝转移有关的其他实验。
材料和方法：
使用与经辐照的K562-mbIL15-41BBL刺激细胞共培养，扩增来自外周血单个核细胞的NK细胞。此类细胞的非限制性示例在美国专利号7435596或8026097中提供，其每篇均通过引用整体并入本文。在几个实施方案中，使用进一步的修改，例如在PCT申请No.PCT/SG2018/050138(通过引用整体并入本文)中公开的修改。通过用编码NKG2D，细胞内OX40共刺激域，CD3ζ信号传导域和膜结合的IL-15的双顺反子病毒(其支持延长的细胞存活和增殖)转导产生NKX101细胞。如本文所讨论，NKX101不仅指在该非限制性实例中使用的特定构建体，而且指本文所公开的其他细胞毒性受体构建体。通过Luminex分析响应与HCC细胞系以1:1比率共培养24小时的NKX101 NK细胞促炎性细胞因子的释放。使用经过工程化改造以表达萤光素酶的一组HCC细胞系测量了NKX101 NK细胞在4、24和48小时终点时的体外细胞毒性。使用NSG小鼠异种移植肿瘤模型评估NKX101 NK细胞的体内活性，其中腹膜内(IP)注射4x106个表达萤光素酶的SNU449 HCC细胞，然后在1周后IP施用3x106个NKX101 NK细胞或未修饰的NK细胞(NT NK)，并使用IVIS生物发光成像测量肿瘤的生长。测试与亚EC50浓度的激酶抑制剂索拉非尼(此处用作另外的抗癌剂的非限制性实例)(HCC的批准药剂)的组合在低E:T比率的NKX101 NK细胞下在体外48小时时的累加的细胞毒性效应。通过流式细胞术评估NKG2D配体的表达，并在一组HCC细胞系中分析与NKX101 NK细胞细胞毒性的线性相关性。
结果：
简而言之，结果表明，与NT NK细胞(NT NK)相比，NKX101 NK细胞在体外对一组HCC细胞系具有显著改善的细胞毒性。显示NKX101 NK细胞与HCC细胞系的共培养增强促炎性细胞因子的释放。在体内NSG小鼠异种移植HCC模型中，与NT NK的稳定控制相反，NKX101 NK细胞在4/5小鼠中提供完整的肿瘤清除。与激酶抑制剂索拉非尼联合在体外提供与NKX101 NK细胞的累加效应。通过流式细胞术观察到NKG2D配体的高表达，并且虽然没有个别配体表现出与NKX101 NK细胞细胞毒性的显著相关性，但在几个实施方案中，开发了一种药剂，其可以鉴定NKG2D配体的表达并将该表达与对来自NKX101 NK细胞的细胞毒性效应的易感性关联。
更详细地，为了评估如本文公开的各种工程化NK细胞的能力，在体内动物模型中，进行了几项实验以评估细胞在体外环境中对肝癌细胞系的功效。另外的实验涉及当与另一种抗癌剂组合使用时评估如本文公开的工程化NK细胞的功效，其中TKI抑制剂索拉非尼是此类试剂的非限制性实例。图3A-3B描绘了在将HCC细胞暴露于天然NK细胞或根据本文公开的实施方案的工程化NK细胞之后与细胞毒性的各种指示剂的表达有关的数据。在下文讨论的非限制性实例中，NKX101的名称是指工程化NK细胞，其表达能够结合NKG2D受体的配体的截短的NKG2D胞外域。在几个实施方案中，截短的NKG2D域与CD8alpha铰链和CD8alpha TM域偶联。在几个实施方案中，截短的NKG2D域与OX40共刺激域和CD3zeta信号传导域偶联。在几个实施方案中，构建体还包含膜结合的IL15。在几个实施方案中，NKX101具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列或在SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列。但是，在几个实施方案中，如本文公开的其他NKG2D构建体(所有NKG2D构建体统称为NKX101 NK细胞)以类似的方式运行，并产生与以下讨论的结果相似的结果。如本文在几个实施方案中所公开的，与SEQ ID 7或8具有约85％，90％，95％或更高的序列同源性的核苷酸或氨基酸序列(或本文公开的任何其他构建体)对HCC细胞具有细胞毒性。
返回图3，图3A-3C描绘了来自1:1效应子:靶物比率的指定HCC细胞系与非转导的NK细胞(NT NK)或NKX101的共培养物上清液中的各种细胞因子的浓度。如所示，HCC细胞与NKX101的共培养诱导各种细胞因子的更大表达，其指示来自NKX101 NK细胞的细胞毒性信号传导。例如，在Hep3b细胞与NKX101 NK细胞共培养中，与NT NK细胞相比，上清液中的IFNg浓度大得多。这表明NKX101 NK细胞具有增强的免疫刺激细胞因子和趋化因子的分泌。在几个实施方案中，以更大水平分泌除了本文测量的细胞因子和趋化因子以外的细胞因子和趋化因子(例如，IL-22，CCL3，CCL4和/或CCL5)。
图4A-4J描绘了与由如本文公开的工程化NK细胞(NKX101 NK细胞)在指定的效应子:靶物比率对9种不同的HCC细胞系诱导的细胞毒性程度相关的数据。图4A-4I描绘了每个HCC系的数据，以％细胞毒性计。举例而言，图4A指示，在2:1效应子:靶物比率时，NKX101 NK细胞在共培养中的近100％的Hep3b细胞中诱导细胞毒性。当E:T比率降至1:1时，效应降低到约90％的细胞毒性，并且在1:2E:T时，NKX101仍然能够杀死约75％的靶细胞。在每个E:T比率下，NKX101 NK细胞比NT NK细胞多得多地杀伤，所述NT NK细胞在共培养中的约20％的Hep3b细胞中诱导细胞毒性。在几乎所有E:T比率时，与NT NK细胞相比，其他每个HCC细胞系对NKX101细胞表现出更高的敏感性。在1:2E:T时，HuH-7细胞与NKX101 NK细胞和NT NK细胞大致等同起反应。但是，在几个实施方案中，可以使用辅助剂来增强NKX101的效应(下文描述)。图4J描绘了HCC细胞对NKX101的抗性(缺乏敏感性)的概述。这些数据表明，在测试的降低的E:T时，大多数HCC细胞仍在一定程度上受到NKX101诱导的细胞毒性。
图4K-4S描绘了与来自两个另外的供体的工程化NK细胞对9种不同的肝细胞癌细胞系的细胞毒性程度有关的其他数据。显示了表达如本文所公开的NKG2D嵌合受体的工程化NK细胞(标记为NKX101加上供体号)以及来自相应供体的非转导的NK细胞的数据。如图4K所示，即使效应子:靶物比率为1:2时，经工程化改造以表达NKX101的NK细胞也表现出对Hep3b细胞的实质性细胞毒性效应。在此比率时，两组细胞均达到约70-75％的细胞毒性。随着效应细胞与靶细胞的比率增加，观察到细胞毒性的相应增加，在1:1比率时约80％-90％，在2:1比率时近100％的细胞毒性。尽管其他8种肝细胞癌细胞系中每个效应子:靶物比率时的细胞毒性百分比各不相同，但数据的总体模式指示，随着效应子:靶物比率的增加，工程化的NK细胞表现出越来越高的细胞毒性程度。此外，这些数据指示，根据一些实施方案，使用如本文公开的工程化的NK细胞可以实现针对靶细胞系的100％细胞毒性。在图4T-4BB中以不同的方式显示，工程化NK细胞(以及相应的来自相同供体的转导NK细胞)的细胞毒性效应表示为检测到的对照萤光素酶信号的百分比，萤光素酶检测的降低对应于对指定细胞系的细胞毒性效应的增加。这些图中的数据是图4K-4S中显示的两个供体的平均值。这些总结数据进一步支持以下结论：根据本文公开的实施方案的工程化NK细胞可以产生针对多种癌细胞系的细胞毒性效应的实质性增加。因此，根据几个实施方案，如本文公开的工程化的NK细胞提供了有效的抗癌疗法。在几个实施方案中，如本文中更详细地公开的，与另外的抗癌剂结合使用工程化的NK细胞导致对靶细胞的协同细胞毒性作用，并且出乎意料地进一步增强了治疗肿瘤，特别是实体瘤，例如由于肝细胞癌(或另一种肝癌)所致或甚至在肝中具有原发性转移的远端肿瘤类型(诸如例如结肠直肠癌)的肝中的实体瘤的能力。
图5描绘了体内肿瘤建模实验的示意性时间表。小鼠接受4x106个HCC细胞(特别是表达萤火虫萤光素酶的SNU449细胞)的注射。8天后，通过IP注射递送3x106个NK细胞(NT NK细胞或NKX101 NK细胞)。此后每7天进行生物发光成像以评估肿瘤负荷。图6A-6F显示了体内肿瘤负荷实验的结果。图6A显示了接受PBS对照的小鼠的生物发光成像。如描绘，在7天后存在显著的肿瘤负荷，所有动物中肿瘤的生长几乎一致。图6D随时间描绘了生物发光成像信号的强度。图6B显示了接受未修饰NK的动物的相同数据。与PBS相比，未修饰的NK似乎使肿瘤负荷随着时间相对稳定——避免了在PBS治疗的动物中看到的增加，但没有明显减少(另请参见6E)。图6F显示了用NKX101 NK细胞治疗的动物的相同数据。与甚至天然NK细胞形成鲜明对比的是，早在NKX101递送后14天，肿瘤负荷就急剧减少。在6C所示的5只小鼠中的4只中，肿瘤负荷接近零。这些数据也反映在图6F中。这些结果证明了由NKX101 NK细胞诱导的显著的抗肿瘤效应。
如本文所讨论，根据几个实施方案，可以与本文所公开的工程化NK细胞联合施用一种或多种另外的抗癌剂。在几个实施方案中，起作用的多种作用机制导致协同作用(例如，肿瘤负荷，肿瘤生长速率，肿瘤细胞持久性减少等)。换言之，在几个实施方案中，工程化NK细胞与另外的抗癌剂一起使用产生了意想不到地增强的抗癌效应。作为非限制性实例，可以与工程化NK细胞联合使用的一种此类另外的抗癌剂是酪氨酸激酶抑制剂。索拉非尼是一种抑制Raf-1，B-Raf和VEGFR-2信号传导途径的小分子，并且目前广泛用作肝细胞癌的一线疗法。图7A显示了与剂量响应曲线有关的数据，以计算索拉非尼对指定的肝细胞癌细胞系的EC50。在图7B中显示了EC50值。各种肝细胞癌细胞系对索拉非尼的敏感性各不相同，其中Huh-7最敏感，需要索拉非尼浓度为7.955微摩尔，才能达到50％的细胞毒性。在谱的另一端，SNU-387细胞需要29.45微摩尔的索拉非尼才能达到50％的细胞毒性。图7C-7E描绘了与索拉非尼与工程化NK细胞一起使用有关的数据。显示的是所指示的HCC细胞的数据，其中未使用NK细胞(索拉非尼对照)和用单独的NK细胞，NK细胞与TKI索拉非尼，NKX101 NK细胞或NKX101 NK细胞与索拉非尼处理它们。这些数据指示，尽管以上讨论的NKX101 NK细胞具有明显的细胞毒性效应，但与另外的抗癌剂(如TK抑制剂，如索拉非尼)一起施用仍可增加细胞毒性效应。如指示，与NKX101 NK细胞相比，NKX101与索拉非尼允许更大的细胞毒性，即使在较低的E:T比率时。细胞毒性效应大于单独的NK细胞(每幅图中最低的痕线)，甚至超过NK细胞加索拉非尼所见的那些细胞毒性效应。在几个实施方案中，此类联合疗法允许协同的抗癌效应和患者的改善的结果。
图8A-8a描述了各种NKG2D配体在指定的HCC细胞上的表达。图9涉及对于所测试的9个HCC系中的每个，指定的NKG2D配体的表达程度与相应的对照(未处理的HCC细胞)百分比之间的潜在相关性。图10A-10G涉及开发试剂的实验，该试剂发挥功能以鉴定何时NKG2D配体过表达。将NKG2D受体与IgG的Fc区融合。通过流式细胞术(图10A)并且还通过针对Fc区的抗体(10B)来测量该融合物与各种HCC细胞的结合。此方法将允许鉴定用NKG2D配体之一的升高表达给细胞加标签(融合物的NKG2D部分结合配体，并且Fc部分充当检测与融合物结合的细胞的标签)。图10C-G显示了NKG2D-FC与指示的NKG2D配体的结合/检测之间的相关性。
还产生数据以证明与天然NK细胞相比根据本文公开的实施方案的工程化NK细胞的增强的效力(例如，细胞毒性)。将Hep3b细胞和SNU449细胞(均为肿瘤细胞的非限制性实例)进行工程化改造以表达萤光素酶。使用两个单独的供体，并收集NK细胞。天然NK细胞未被遗传修饰，而NKX101细胞是通过修饰NK细胞，使得它们表达如本文所公开的CAR产生的。如几个实施方案中所公开的，在该实验中，通过用编码NKG2D，细胞内OX40共刺激域，CD3ζ信号传导域和膜结合的IL-15的双顺反子病毒转导来产生NKX101细胞，所述双顺反子病毒支持延长的细胞存活和增殖。应当理解，NK细胞可以用本文公开的其他构建体修饰。两组细胞(NKX101和未修饰的(NT NK)NK细胞)均用K562-mbIL15-41BBL刺激性细胞扩增。在各种效应子:靶物比率下，对每种NK细胞类型针对Hep3b或SNU449细胞的细胞毒性进行评估。计算NTNK细胞和NKX101中每种的EC50值(使用Prism 4参数非线性回归分析计算EC50值)。
图11A描绘了NT NK细胞和NKX101对Hep3b细胞的EC50数据。这些数据证实，与未修饰的NK细胞相比，NKX101细胞具有增强的细胞毒性，如由获得50％的针对Hep3b靶细胞的细胞毒性所需的较小NKX101细胞数量从此测定法证明。实际上，在此测定法中，NKX101细胞比NT NK细胞具有多超过3.5倍的细胞毒性。图11B显示了相似的数据，其描绘了与NT NK细胞相比NKX101的细胞毒性显著增强。针对SNU449细胞起作用，NKX101具有多超过4.5倍的效力。这些数据证明，如本文根据一些实施方案所公开的，与非工程化的NK细胞相比，工程化的NK细胞具有增强的细胞毒性。取决于实施方案，相对于天然NK细胞，工程化的NK细胞增强(例如，显示出增加的细胞毒性)约2倍至约20倍，包括约2倍，约3倍，约5倍，约8倍，约10倍，约15倍，约20倍或它们之间的任何量，包括所列范围的终点。
图12A-12I描绘了与9种肝细胞癌细胞系的每种上的各种NKG2D配体表达相关的流式细胞术数据，如通过PE缀合的抗体(R&D Systems,Minneapolis Minnesota,USA)测量。NKG2D配体表达如虚线框围绕显示，相应的同种型对照如实线框围绕显示。图13A-13I显示了与用于产生图8中所示数据的那些抗体相比，用于产生图12中所示数据的抗体之间的比较数据。数据显示为平均荧光强度的delta(dMFI，计算为指定靶物的荧光信号减去来自相应同种型对照抗体的背景荧光)。尽管强度变化的绝对值随所使用的抗体类型而略有不同，但是在9种肝细胞癌系中，无论使用哪种抗体，NKG2D配体的一般表达模式都是一致的。虽然某些细胞系(例如SNU-182和HuH-7)显示了几种NKG2D配体的显著表达，但其他细胞系(例如He3B和HepG2)显示了除MICA/MICB之外的NKG2D配体的有限表达。在所有细胞系中，最大的表达似乎与ULBP2/5/6和MICA/MICB有关。
为了确定任何特定的NKG2D配体的表达是否占优势，进行了实验以鉴定与所有NKG2D配体作为整体相比，每个单独的NKG2D配体的表达之间的相关性。这通过评估能够结合任何NKG2D配体的NKG2D-Fc融合抗体与肝细胞癌细胞的结合并将其与NKG2D-配体-特异性抗体与9种肝细胞癌细胞类型中每种的结合进行比较来实现。然后将这些数据相互作图，并进行回归分析以鉴定相关性和表达。这些数据显示在图14A-14F中，Y轴上为总NKG2D配体表达，X轴上为特定的指定NKG2D配体表达。与总NKG2D配体表达相比，在6种特定的NKG2D配体的每种中，未鉴定明显的相关性。这似乎与图12和13中的dMFI值一致，并且似乎指示各种肿瘤细胞类型之间的异质性的相对较高程度。然而，有利地，如本文公开的工程化NK细胞利用能够结合任何NKG2D配体的NKG2D配体结合域。因此，与配体特异性方法相反，基于更广泛的方法使得使用本文公开的工程化NK细胞的疗法能够成功靶向和消除肿瘤细胞，即使当仅一种特定的标志物以稳健的方式表达时，或者甚至当没有单一高度表达的标志物，而是几种NKG2D配体的低水平表达时。
图15A-15C显示了与工程化的NK细胞对三种肝细胞癌细胞系(Hep3B-luc，Huh-7-luc和SNU-449-luc)的细胞毒性有关的数据。如上文讨论，这些细胞系中的每种表达各种量的NKG2D配体，但是没有强烈的相关性指示这些细胞系中的任何一种表达“显性”标志物。图15A-15C的数据(使用来自指定供体的工程化NK细胞或来自相应供体的非转导NK细胞。供体1667和1668具有来自早先图中显示的其他先前实验的数据)。图15A-15C显示了来自在E:T比率为1:1和1:2时的4小时细胞毒性终点测定法的结果。如图15A-15C中的每个中显示，测试了在这两个效应子:靶物比率时与相应的非转导的NK细胞相比来自每个供体的工程化NK细胞表现出增强的细胞毒性。例如，如图15A中显示，在E:T为1:2时，来自所有三个供体的非转导的NK细胞对Hep3B细胞显示基本上无细胞毒性效应。来自一个供体的工程化NK细胞显示出高达约20％的细胞毒性(NKX101 1668)，而来自其他两个供体的工程化NK细胞表现出约50％和约80％的细胞毒性(分别为NKX101 1669和NKX101 1667)。在E:T比率为1:1时，非转导的NK细胞表现出各种程度的细胞毒性，其中最有效的细胞达到约25％的细胞毒性。使用工程化NK细胞，细胞毒性为至少50％(NKX101 1668)，来自剩余供体之一的细胞表现出超过85％的细胞毒性(NKX101 1169)，而其它显示近100％的细胞毒性(NKX 1667)。对于相应的NK细胞对Huh-7细胞系的细胞毒性显示了相似的数据模式(图15B)，只是在此种情况下，每个工程化的NK细胞均对肝细胞癌细胞表现出近100％的细胞毒性。同样，在图15C中显示了相似的数据。综合考虑并结合显示肝细胞癌细胞系中的可变NKG2D配体表达的表达数据考虑，这些数据指示，尽管靶细胞中的配体表达具有可变性，但是根据本文公开的实施方案的工程化NK细胞仍表现出显著的细胞毒性程度。因此，这些数据表明，根据本文公开的几个实施方案的工程化NK细胞应有效抵抗肝细胞癌患者群体间所经历的预期的异质性肿瘤概况。
图16A-16G涉及当将指定的肝细胞癌系工程化改造以表达萤光素酶(如收集先前附图中的数据所使用)时所收集的数据。用编码萤火虫萤光素酶基因和可用于选择有效转导的细胞的CD19标志物的载体转导每个指示的细胞系。图16A-16F显示了流式细胞术数据，所述流式细胞术数据与在使用磁性活化细胞分选选择转导的细胞之后每个工程化细胞系的CD19的表达程度相关。图16G描绘了与对工程化改造以表达萤火虫萤光素酶的每种细胞系检测的相对光单位信号相关的数据。
为了研究关于肝癌细胞对索拉非尼敏感性的可能的作用机制，响应于各种剂量的索拉非尼，测量了每种细胞系上NKG2D配体总群体的表达。通过使用NKG2D——Fc嵌合抗体检测NKG2D配体的总群体。图17A-17F显示了涉及NKG2D配体表达的流式细胞术数据。图17G-17L显示了由指示的肝细胞癌细胞表达程序性死亡配体1(PD-L1)的相应流式细胞术数据。图17M和17N是线图，其显示了在所测试的每种细胞系中对指示剂量的索拉非尼的剂量响应。图17M中显示的数据指示，至少在所测试的剂量和总的NKG2D表达水平时，索拉非尼似乎对NKG2D配体表达没有实质性影响。个别NKG2D配体对索拉非尼治疗可以具有更大或更小的响应性程度，其根据此特定测定法不一定能鉴定。类似地，图17N未揭示对索拉非尼响应的PD-L1表达变化的清晰模式，尽管数据似乎表明在某些浓度(例如10微摩尔索拉非尼)下，许多细胞系显示出PD-L1表达的增加。
关于确定干扰素gamma对NKG2D配体以及PD-L1总合并物表达的影响进行了类似的研究。干扰素gamma是活化后NK细胞分泌的炎性细胞因子之一，因此在NK细胞对靶物的细胞毒性作用中起作用。图18A-18I显示了当暴露于指定浓度的干扰素gamma时与9种肝细胞癌细胞系中的NKG2D配体表达相关的流式细胞术数据。图18J-18R显示了相同浓度的干扰素gamma的相应流式细胞术数据及其对PD-L1表达的影响。图18S和18T是线图，其总结了NKG2D配体表达(18S)和PD-L1表达(18T)的流式细胞术数据。与索拉非尼施用后的先前图中显示的那些结果相似，干扰素gamma对NKG2D配体总合并物的表达似乎没有明显影响。然而，如上文提及，响应于干扰素gamma的暴露，可以上调(或下调)个别特异性的NKG2D配体。尽管图18T未显示出对增加剂量的干扰素gamma的均匀表达响应模式，但几种细胞系似乎显示出随更高剂量的干扰素gamma增加PD-L1表达的趋势。尽管缺乏索拉非尼或干扰素gamma对NKG2D配体或PD-L1表达的明确诱导，但是在几个实施方案中，根据本文公开的几个实施方案的工程化NK细胞(例如，NKX101细胞)联合另外的抗癌剂如索拉非尼或其他药物的联合疗法方案产生协同增强的细胞毒性效应。在几个实施方案中，索拉非尼和/或IFNg可以在上调本文研究的受体以外的其他NK活化受体(或下调抑制性受体)，这部分造成各种实施方案中看到的协同活性。
图19A-19D显示了与来自4个供体的非转导的NK细胞、来自那些供体的根据本文中公开的实施方案的工程化NK细胞、或同种型对照信号的PD-1表达相关的流式细胞术数据。程序性死亡受体1(PD-1)在活化的T细胞表面上表达，并且它与靶细胞上它的配体(PD-L1或PD-L2)相互作用。图19A-19D的数据指示未转导的NK细胞表达与对照基本上不能区别的PD-1水平，并且还指示NK细胞工程化改造为表达如本文公开的嵌合受体(例如，NKX101)基本上没有改变PD-1的表达。由于PD-1信号传导本质上通常是抑制性的，因此数据表明，PD-L1表达的诱导(上文讨论)对表达本文所公开的嵌合构建体的工程化NK细胞的活性不太可能有害，因为PD-1表达未改变。在一个实施方案中，PD-L1诱导可以抑制内源性T细胞应答，因此，与PD-L1/PD-1途径的抑制剂联合施用表达本文公开的嵌合受体的工程化NK细胞。
结肠直肠癌
背景：
在美国，结肠直肠癌是在男性和女性中诊断出的第三大最常见的癌症。美国癌症协会估计，2019年美国新结肠直肠癌病例数包括超过100,000例结肠癌病例和超过40000例直肠癌病例。肝是结肠直肠癌患者最常见的原发性转移部位之一。这主要由于肿瘤通过门静脉循环的扩散。尽管手术可以成功治疗原发性肝转移，但许多患者并不是理想的候选者。因此，如本文所公开的，在几个实施方案中，可以施用工程化的NK细胞，在几个实施方案中区域性/局部施用以有效治疗肝转移。
就针对人结肠直肠癌(CRC)细胞系模型的细胞毒性活性而言，以下实验涉及研究如本文公开的工程化NK细胞，例如表达NKX101的那些。这包括测量和分析从NKX101体外细胞毒性和响应与靶CRC细胞系共培养的细胞因子释放获得的数据。它还包括对HCC细胞系上NKG2D配体表达的染色，以分析与NKX101细胞毒性的相关性。NKG2D受体的多个配体在CRC中高度表达。
方法：
通过转染293T细胞制备瞬时逆转录病毒上清液。用逆转录病毒载体(编码NKX101构建体或带有CD19标签的萤光素酶(effluc.CD19))共转染293T细胞。后者的载体允许通过筛选CD19表达来选择表达萤光素酶的细胞。
对于NK细胞的扩增、转导和表征，从斯坦福血液中心获得健康的供体血沉棕黄层血液样品。将PBMC纯化并储存。通过与K562-mbIL15-41BBL饲养细胞以1:1的饲养细胞：PBMC比率共培养，从储存的PBMC中扩增NK细胞。
对于EC50细胞毒性测定法和细胞因子分析，使用抗CD3 MACS珠对第5天扩增物消减T细胞。
使用上文讨论的经修饰的K562细胞扩增NK细胞。在第5天给培养基补充400IU/mLIL2达24小时，并在第6天转导NK细胞。在另外的实施方案中，使用其他浓度或时机来扩增NK细胞。在几个实施方案中，不使用IL2，而使用其他细胞因子。
在转导后4天，使用抗人NKG2D抗体(R&D System)通过流式细胞术分析NKG2D在转导的NK细胞(CD3-CD56+)上的表面表达，并且NK细胞培养以40IU/mL IL2继续。在几个实施方案中，使用其他浓度的IL2(包括无IL2)。
为了转导CRC细胞系，用逆转录病毒载体effluc.CD19转染293FT细胞，并产生病毒上清液。用effluc.CD19病毒上清液通过旋转接种(spinoculation)转导来自ATCC的人HCC细胞系(HepG2,SNU182,SNU387,SNU398,SNU423,SNU475)，并以2.5x104个细胞/ml(4ml，1e5/孔)的密度在6孔板中接种细胞。使用MACS抗CD19珠阳性选择转导细胞的CD19细胞表面表达，并通过流式细胞术分析CD19+纯度。
针对如上所述工程化改造的一组表达萤光素酶的CRC细胞系测量NKX101细胞的体外细胞毒性。使用胰蛋白酶-EDTA(0.25％)从细胞培养瓶中取出粘附的CRC靶细胞，进行计数，以2x105个细胞/ml重悬，并将100ul(2x104个细胞/孔)接种在透明的96孔U-底组织培养板中。对NK效应细胞进行计数并连续两倍稀释(从最大值E:T为16:1)以进行EC50实验。将NK细胞加入具有CRC细胞的孔中，并将板在37℃温育4小时。温育后，将100ul的每种细胞悬液转移到含有100ul/孔Bright-Glo试剂(1:1细胞培养体积)的黑壁透明底板。使用SoftMax6.2.2CellTiter-Glo发光测定方案在SpectraMax读板器上读出相对发光单位(RLU)。
对于NK细胞因子释放测定法，在总共200uL培养基在96孔U底板中于37℃将NT NK(非转导的NK)或NKX101细胞与CRC靶细胞以1:1的比率共培养(每孔每种细胞类型1x105个)24小时。在24小时时，将板在300g下离心5分钟，收集上清液并在-80℃下冷冻直至可通过Luminex分析细胞因子水平。使用xPONENT软件在Luminex MAGPIX仪器上按照制造商方案(Invitrogen)运行ProcartaPlex定制的5重测定法。
结果：
图20A-20E显示与工程化改造各种结肠直肠癌(CRC)细胞系以表达萤光素酶相关的流式细胞术数据。如上所述，编码萤火虫萤光素酶的载体还包括CD19标志物，其允许对已转导的细胞进行MACS选择。这些数据显示了进行CD19选择后所得的CRC细胞的染色。数据显示与所用抗体的同种型对照(左侧曲线)相比的CD19染色(右移曲线)。
图21A-21E显示了与针对NKG2D配体或同种型对照的工程化结肠直肠癌细胞的染色相关的数据。NKG2D配体显示在虚线框中，而对照显示在实线框中。用NKG2D-Fc标记的行指示使用NKG2D-Fc嵌合抗体，该嵌合抗体应结合存在的所有NKG2D配体，从而代表NKG2D配体的总群体。随后的各行是针对与特异性抗体结合的每个特定指示的NKG2D配体的染色。总之，这些数据证实CRC细胞表达多种NKG2D配体。根据几个实施方案，CRC细胞表达各种NKG2D配体允许根据本文公开工程化改造的NK细胞靶向并杀死CRC细胞，特别是已经转移至肝脏的CRC细胞。
如上所述扩增来自4个供体(224、692、699、650)的NK细胞。在扩增第5天通过CD3MACS分离来消耗T细胞，并在CD3消耗前(图22A-22C)和在CD3消耗后(图22D-22F)针对CD3和CD56对细胞进行染色。如上文讨论，CD56是人NK细胞的标志物。因此，图22D-22F中的数据指示CD3消耗后所得的NK细胞群体是高纯度的NK细胞群体。在第6天用编码如本文公开的嵌合受体构建体的多核苷酸转导扩增的NK细胞。举例而言，本实验利用NKG2D/OX40/CD3z细胞毒性受体复合物(见图1D)，尽管应当理解，也可以使用本文公开的其他构建体。在转导后第4天，对表达NKX101的工程化NK细胞的NKG2D表达进行染色(图23A-23C)。可以看出，与对照NTNK细胞相比，经过工程化改造以表达靶向NKG2D的嵌合受体的NK细胞表现出显著更高的NKG2D受体表达信号。这些数据证实了工程化的NK细胞正在表达嵌合受体。如上所述，在扩增后14天-21天，在范围为16:1降低至1:16的E:T比率间，针对CRC细胞系HCT15，HCT116和HT29进行了细胞毒性测定法。在4小时终点读取RLU信号，并在GraphPad Prism 7中使用4参数非线性回归分析使用细胞毒性百分比计算EC50值(图24A-24C)。如所示，针对在该实验中测试的每个CRC细胞，表达NKX101嵌合受体构建体的NK细胞表现出比NTNK细胞更高的细胞毒性。实际上，NKX101细胞在所有E:T比率下在所有三种细胞系间均表现出增强的细胞毒性(但在HCT15细胞中最高E:T时具有相似的作用(图24A)。NKX101的计算EC50比NT NK的计算EC50低3-4倍，从而增强表达NKG2D定向嵌合受体的工程化NK细胞的几种实施方案对多种类型的肿瘤高度有效。
如所述扩增来自两个供体(091、140)的NK细胞。在扩增第5天通过CD3MACS分离来消耗T细胞，并在CD3消耗前(图25A，25D)和在CD3消耗后(图25B，25D)针对CD3和CD56对细胞进行染色。在第6天用编码如本文中公开的嵌合受体构建体的多核苷酸转导扩增的NK细胞。举例而言，本实验利用NKG2D/OX40/CD3z细胞毒性受体复合物(见图1D)，尽管应当理解，也可以使用本文公开的其他构建体。在转导后第4天将所得细胞的NKG2D表达染色(图25C，25F)。这些数据显示，与NTNK细胞相比，从两个供体扩增的NK细胞显示出NKG2D的稳健表达。将扩增第21天时来自两个供体的NKX101或NT NK细胞与CRC靶细胞以1:1比率体外共培养24小时，并通过Luminex测定法分析上清液中分泌的细胞因子水平。三种细胞系中每种的细胞因子释放概况的数据示于图26A-26C(每种分析物的标准曲线示于图27A-27E)。对于每种测试的细胞系，CRC与表达NKX101的NK细胞共培养诱导从表达NKX101的NK细胞相对于NT NK的促炎性细胞因子释放增强。例如，在HCT15组中，表达NKX101的NK细胞的IFNg释放几乎是倍增的，而在HCT116和HT29组中诱导NK细胞的细胞因子释放甚至更为明显。对于某些实施方案，促炎性细胞因子的这些增加的分泌至少部分解释如本文所公开的工程化NK细胞的增强的细胞毒性。
工程化NK细胞的某些特征
背景：
为了进一步评估如本文公开的工程化NK细胞的特征，进行了另外的实验以评估例如NK细胞的标志物概况，工程化NK细胞表达本文公开的嵌合受体的实施方案的能力，此类工程化NK细胞的细胞毒性和工程化NK细胞的其他特征。
结果：
如本文所讨论，在几个实施方案中，扩增供体NK细胞群，任选地与饲养细胞或刺激性细胞系结合。在几个实施方案中，使用修饰的K562细胞。此类细胞的实例在美国专利号7435596或8026097中提供，其每篇通过引用整体并入本文。在几个实施方案中，使用进一步的修改，例如在PCT申请No.PCT/SG2018/050138(通过引用整体并入本文)中公开的修改。在几个实施方案中，将扩增的NK细胞工程化改造以表达嵌合受体和/或促进NK细胞持久性的分子(例如膜结合的IL15)，然后任选地进一步扩增。根据几个实施方案，然后可以将细胞冷冻保存，并准备用于解冻后施用于患者。取决于实施方案，可以进行各种程度的扩增。例如，在几个实施方案中，可从单个供体产生用于多达约50名患者的NK细胞。在几个实施方案中，可从单个供体产生用于多达约100名患者的NK细胞。在几个实施方案中，扩增允许更大数量的扩增，例如，来自单个供体的多达约200，约300，约400，约500或更多的患者剂量。
进行实验以确定根据本文公开的实施方案的工程化NK细胞的特征。根据几个实施方案，本文公开的NK细胞表现出广泛活化的表型。图28A显示了在扩增期间三个时间点(第0天，圆圈；第7天，正方形和第12天，三角形)的NK细胞的流式细胞术表达数据。Y轴代表活NK细胞(扩增培养物中的CD56pos/CD3neg细胞)总数的百分比。x轴涉及表达NKG2D(左组)，NKp30(中央组)或NKp44(右组)的NK细胞(CD56pos)的检测。如上文讨论，NKG2D，NKp30和NKp44中的每个都是由NK细胞表达的活化性受体。在第0天，仅少量NK细胞表达NKG2D(少于约25％)或NKp44(很少表达至无表达)。相反，NKp30表达相当高(约85％)。但是，扩增7天后，NKG2D的表达显著上调，平均近80％的NK细胞表达NKG2D。同样，NKp44也是上调的，平均几乎50％的细胞表达它。尽管其较高的初始表达水平，但甚至NKp30表达也是增加的，现在存在于近100％的NK细胞上。在培养第12天。NKG2D表达平均下降(仍超过60％)，但仍然在来自两个供体的80％NK细胞上表达。NKp44表达持续增加，平均60％的NK细胞表达NKp44。NKp30在第12天没有变化，仍然存在于近100％的NK细胞上。图28B显示了表达NKp46，2B4，CD69 CD25和DNAM-1的相应数据，以NK细胞总数的百分比计。NK细胞在第0天以及开始扩增后7和12天后通过流式细胞术进行表征。NKp46，CD69和CD25表达在第0天都相对较低(分别为约40％，约10％和约5％)。相反，第0天2B4和DNAM-1各自由NK细胞高度表达(分别为约100％和90％)。在扩增的第7天，NKp46，CD69和CD25中的每个在NK细胞上均表现出相当大的流行，现在各自由约90％的NK细胞表达。在约100％的NK细胞上2B4表达保持恒定，而DNAM-1的表达增加到约95％的NK细胞。在扩增的第12天，NKp46水平平均下降至约75％表达，而CD25表达下降至约50％。CD69的表达仍然较高，平均近85％的NK细胞表达它。几乎所有的NK细胞均表达2B4和DNAM-1两者。综上所述，这些数据显示了，NK细胞活化的某些标志物和各种活化受体在扩增的NK细胞中被广泛且相对稳定地上调。根据几个实施方案，可以在一定时间内进行扩增以最大化特定标志物的表达。在几个实施方案中，几种不同活化标志物的广泛表达代表根据本文公开的几个实施方案的工程化NK细胞表现出如此明显的细胞毒性效应的至少一个原因。
如上文讨论，在几个实施方案中，工程化改造细胞以表达NKG2D(或其结合配体的部分)以及IL15，例如以IL-15的膜结合形式(mbIL-15)表达以增强NK细胞的扩增和持续时间。关于膜结合的IL-15的非限制性信息可以在美国专利申请号15/309362中找到，其通过引用整体并入本文。在几个实施方案中，mbIL15的表达增强工程化NK细胞的持久性。尽管这在体外环境中可能是有利的，但是根据本文公开的实施方案，mbIL15还增强了体内的持久性。图29A显示了mbIL15表达增强工程化NK细胞的持久性。流式细胞仪用于测量血液样品中的NKG2Dpos/CD56pos/CD3neg细胞，结果以检测到的总细胞的百分比表示。如与一段时间内循环的NK细胞总数相比测量，仅表达mbIL15的NK细胞由于表达嵌合受体构建体的非限制性实施方案(而非GFP或非修饰的NK细胞)在7天后在循环中仍存在。尽管两个对照组从未显示其数量的任何增加，但直到施用后至少28天，循环中仍存在表达mbIL15的NK细胞。这些数据指示，根据几个实施方案，本文公开的工程化NK细胞甚至在体内也表现出长期持续时间，这允许在需要癌症免疫疗法治疗的受试者中延长的细胞毒性效应。
进一步支持本文公开的工程化NK细胞的优点，它不仅是随时间改善的NK细胞的存在，而且也是其活性。图29B显示了与NSG小鼠中在对它们腹膜内注射2x105个U2OS骨肉瘤细胞后检测到的荧光信号有关的汇总数据。小鼠接受PBS、表达GFP的NK细胞、表达本文公开的NKG2D嵌合受体(无mbIL15)的NK细胞或表达本文公开的NKG2D嵌合受体，配置为也表达mbIL15的NK细胞的IP输注(每次NK细胞输注为3x106个细胞，在第7天施用)。施用三剂IL2，并在第14、21、28、35、49和63天收集成像数据并且在图29C中显示。如显示，接受表达NKG2D嵌合受体的NK细胞或表达NKG2D嵌合受体以及mbIL15的NK细胞的小鼠显示出明显更少的肿瘤负荷，甚至长达63天。这与两个对照组(PBS和表达GFP的NK细胞)中每个随时间迅速增加的肿瘤负荷形成对比。
尽管来自以上讨论的实验的数据涉及各种肝肿瘤类型或骨肉瘤细胞，但是根据本文公开的几个实施方案的工程化NK细胞也对其他肿瘤类型有效。例如。表达如本文所公开的NKG2D CAR的NK细胞在AML模型THP-1异种移植模型中表现出剂量依赖性肿瘤活性。在该模型中，在肿瘤注射后2天，用单剂量的表达NKG2D-OX40-CD3Z-mbIL15 CAR的NK细胞治疗大鼠。成像数据显示在图30A中，并且汇总数据显示在图30B中。与上述的U2OS异种移植模型一样，施用表达NKG2D CAR的NK细胞，肿瘤负荷显著较低。另外，细胞毒性效应表现出明显的剂量依赖性响应(肿瘤负荷随着细胞剂量的增加而降低)。
进一步研究如本文所公开的NKG2D CAR的有效性，测试另外的AML系。如图31所示，在8种不同的AML细胞系中，表达如本文公开的嵌合受体构建体的工程化NK细胞比未修饰的NK细胞产生增加的细胞毒性效应。在一些测试的细胞系中，增强的效应产生对肿瘤细胞的近90-95％的细胞毒性，但不靶向静止的PBMC。如提及，取决于实施方案，可以使用多种工程化受体。例如，在几个实施方案中，活化受体可以包含NKG2D胞外域，跨膜域和信号传导域。每个域任选地由多个亚域组成。例如，在几个实施方案中，活化受体包含NKG2D胞外域，CD8alpha铰链区，CD8 alpha跨膜域，OX40共刺激域，CD3z信号传导域。在几个实施方案中，将编码此类受体的多核苷酸工程化改造以还表达mbIL15。可以使用其他刺激域，例如CD28，4-1BB，CD16，NKp80，2B4，DAP10，DAP12及其组合。在几个实施方案中，使用各种间隔物，例如甘氨酸-丝氨酸间隔物分离各个域。
有利地，特别是对于同种异体施用，可以以高存活力将NK细胞冷冻保存，活细胞回收和细胞毒性活性在融化后得到保留。使用图32A中示意性描绘的实验方案对此进行评估。
在冷冻保存之后，将表达根据本文公开的实施方案的NKG2D CAR的NK细胞的存活力与培养14和27天后的新鲜(未冷冻)细胞的存活力进行比较。图32B显示融化后存活力没有实质性变化——换言之，冷冻保存后，工程化NK细胞仍然是存活的。重要的是，融化后活细胞的百分比非常高，指示在给定的冷冻-融化循环中活细胞的损失有限，这意味着可以在融化后施用更大百分比的给定批次的扩增细胞。图32C显示了来自3个样品的75％以上的存活力。即使在冷冻保存和融化之后，工程化的NK细胞的细胞毒性也被保留到与新鲜细胞无明显差异的程度(参见图32D)。这是重要的，因为保留了工程化细胞表现出抗肿瘤活性的能力，根据一些实施方案，其增强有效使用冷冻保存的细胞的能力。
在扩增期间评估了各种其他标志物的表达水平(在低IL2培养基中，在第0、7和12天通过流式细胞术表征)。图32E显示了在扩增过程中NK细胞上抑制性受体CD158b的表达没有显著改变。相反，表达抑制性NKG2A受体的NK细胞百分比在7天时确实增加，但在培养12天时显示小幅下降。在扩增过程中，ILT2抑制性受体的表达基本没有变化。PD-1是NK细胞耗竭的潜在标志物，在扩增过程中没有改变表达，基本上不表达。随着扩增的进行，作为NK细胞成熟的标志物的TIGIT和Tim3在NK细胞上适度更普遍。有利地，如本文所讨论的，尽管某些抑制性受体的变化上调，但是在几个实施方案中，活化性受体也被上调并且平衡地允许增强的NK细胞活性。
图32G显示了与第0天培养的活NK细胞上CD56和CD16表达的基线表征有关的数据。NK细胞的两个主要亚群是CD56high/CD16dim和CD56dim/CD16high。CD56的存在/强度与NK细胞的增殖潜能直接相关，也就是说，稳健的CD56表达意味着NK细胞可以配置为增殖。此CD56表达与较低的CD16表达相关，如下讨论，其与细胞毒性活性有关。因此认为CD56high/CD16dim增殖和分化，从而产生更多的细胞毒性CD56dim/CD16high NK细胞。图32G显示，在培养的第0天大多数活NK细胞是CD56dim/CD16high细胞毒性上更有效力的NK细胞。图32H显示NK细胞的CD16和CD57表达的扩增时间有通量，其中CD16在第7天暂时减少，然后在第12天恢复到起始水平。CD57表达在整个扩增过程中下降。图32I显示与培养的第7天和第12天的标志物强度有关的数据，以第0天的比率表示。这些数据指示CD56表达强度增加，而CD16和CD57表达强度不变。这些数据表明，根据本文公开的实施方案的扩增触发工程化的NK细胞“回复”或采用促增殖表型。图32J和32K涉及扩增期间记忆NK细胞样表达概况的形成，当工程化NK细胞用饲养细胞和其他细胞因子扩增时，某些记忆样标志物的表达增加。关于NK细胞扩增方法的更多信息可以参见美国专利号7,435,596(2008年10月14日公告)，8,026,097(2011年9月27日公告)，国际专利申请No.PCT/SG2018/050138(2018年3月27日提交)以及美国临时专利申请No.62/881,311(2019年7月21日提交)，每篇通过引用完整并入本文。
联合疗法
背景：
不受理论的束缚，本文公开的几个实施方案中的工程化NK细胞的细胞毒性可以通过触发抗体依赖性细胞毒性(ADCC)来增强。一方面，抗体通过干扰肿瘤细胞生长以直接的方式介导其抗肿瘤作用。抗体还可以通过诱导免疫介导的补体依赖性细胞毒性(CDC)或ADCC间接作用于肿瘤。ADCC以特异性免疫球蛋白识别靶细胞表面上表达的抗原开始。然后，这些抗体的Fc域由免疫效应细胞(例如本文公开的工程NK细胞)上表达的Fcγ受体(FcγR)结合，然后触发向靶细胞释放细胞毒性颗粒或上调细胞表面上的死亡受体表达。
结果：
根据几个实施方案，工程化的NK细胞不仅可以结合肿瘤细胞表面上的配体并通过表达的CAR诱导细胞毒性，而且它们还可以通过被募集入ADCC而被募集以诱导进一步的细胞毒性效应。根据几个实施方案，在发挥作用的两种不同机理的情况下，本文公开的工程化NK细胞与可以启动ADCC级联的抗体的结合使用导致协同的抗肿瘤效应。图33A显示了根据本文公开的非限制性实施方案的表达NKG2D CAR的NK细胞对CD16的表达(此处采用的CAR为NKG2D-OX40-CD3z-mbIL15)。CD16(FcγRIIIA)在很大程度上参与将NK细胞募集到ADCC中。令人感兴趣的是，如图33A中显示，90％的表达NKG2D CAR的工程化NK细胞也表达CD16，这表明引发这些工程化细胞以参与ADCC。图33B和33C分别显示与Raji和Nalm6细胞上的CD19和CD20表达(分别)有关的数据。Raji细胞是B淋巴细胞细胞系，并且Nalm6细胞是从青春期男性开始的B细胞前体白血病细胞系。如图33B所示，Raji和Nalm6细胞均表达CD19。如图33C所示，Raji细胞富含CD20表达，而Nalm6细胞不然。
根据几个实施方案，联合疗法，诸如用于靶向癌症的抗体加上根据本文公开的实施方案的工程化细胞导致协同的细胞毒性。例如，在几个实施方案中，将表达NKG2D CAR的NK细胞与抗CD20抗体(作为非限制性实例，例如利妥昔单抗)共施用。其他实施方案采用针对其他流行肿瘤标志物，例如CD19，CD123，NY-ESO，MAGEA4，MAGEA1，PRAME，存活蛋白(surviving)等的其他抗体。图34显示了与在单独的共培养物中、与表达NKG2D CAR的NK细胞加上对照IgG1抗体一起、或与表达NKG2D CAR的NK细胞加上抗CD20抗体一起的Raji细胞的扩增相关的数据。作为非限制性实例，在该实施例中使用的NKG2D CAR是NKG2D-OX40-CD3z-mbIL15。靶细胞:效应细胞比率为2:1，并且NK细胞在用NKG2D CAR构建体转导它们后14天添加到肿瘤细胞。如所示，单独的Raji细胞随时间数量增加(顶部“单独靶物”痕线)。当将Raji细胞暴露于表达根据本文公开的实施方案的NKG2D CAR的NK细胞和IgG1时，存在对Raji细胞生长的显著禁止。尽管在4.5天时有数量增加的趋势，但与对照组相比，肿瘤的生长明显受阻。表达根据本文公开的实施方案的NKG2D CAR的NK细胞与抗CD20抗体的组合似乎禁止所有Raji细胞生长。如上文讨论，本文公开的工程化NK细胞的表型指示它们可能参与ADCC。如在该实验中看到的，并且根据几个实施方案，NKG2D配体结合以及NKG2DCAR信号传导域和ADCC的激发的组合导致出乎意料地增强的细胞毒性。
如上文讨论，可以将另外的试剂与本文公开的工程化的NK细胞共施用。例如，在几个实施方案中，将组蛋白脱乙酰基酶抑制剂与靶向NKG2D配体(或其他肿瘤标志物，例如CD123或CD19)的工程化NK细胞一起施用。将白血病细胞系单独培养作为对照，与表达GFP的NK细胞共培养，或与表达如本文所公开的NKG2D CAR的NK细胞共培养。作为非限制性实例，在该实施例中使用的NKG2D CAR是NKG2D-OX40-CD3z-mbIL15。图35A显示了HL60细胞数目增加和NK GFP细胞情况下该速率的适度降低。当用表达NKG2D CAR的NK细胞处理HL60细胞时，细胞生长进一步降低。图35B显示了相同的处理组，向培养物添加HDAC抑制剂丙戊酸。如看出，丙戊酸的添加与表达NKG2DCAR的NK细胞协同相互作用，大大抑制HL-60细胞生长。根据另外的实施方案，使用其他HDAC抑制剂，例如罗米地辛(romidepsin)(例如FR901228)，恩替诺特(entinostat)(例如MS-275)，丁酸苯酯，贝利司他(PDX101)，丙戊酸钠，辛二酰苯胺异羟肟酸或其组合。
如上文提及，在几个实施方案中，使用NK细胞。在几个实施方案中，使用T细胞。在另外的实施方案中，使用NK细胞和T细胞的组合。在几个实施方案中，将NK和T细胞工程化改造以表达NKG2D活化受体的此类组合导致协同的细胞毒性。
用表达根据本文公开的实施方案的NKG2D CAR的NK细胞转导NK，T或NK+T细胞。作为非限制性实例，在该实施例中使用的NKG2D CAR是NKG2D-OX40-CD3z-mbIL15。以1:4的E:T比率(NK:T＝1:1比率)评估针对HL60 AML系的各种构建体的细胞毒性活性。图36显示了结果数据。如预期，单独培养时，HL60细胞的数量增加。表达NKG2D CAR的NK细胞显著降低HL60细胞的生长。同样，T细胞也降低HL60细胞的生长。鉴于NK NKGD CAR细胞和T NKG2D CAR细胞的情况下显著减少，出乎意料的是，NK+TNKG2D CAR细胞的组合仍可进一步降低HL60细胞的生长，有效地降低至零。NK细胞以快速的动力学杀死肿瘤细胞，但在高E:T比率时，肿瘤细胞仍增殖。T细胞以较慢的动力学杀死，但在培养中扩增以提供更持久的控制。根据几个实施方案，NK+T细胞的组合表明细胞毒性活性的快速发作和延长的动力学，鉴于单独的细胞类型的已有的高的细胞毒性效应，这是令人惊讶地有利的。根据几个实施方案，使用混合的NK+T细胞群体来治疗肿瘤。在另外的实施方案中，当NK+T细胞群体与另外的药剂例如抗癌抗体，激酶抑制剂和/或HDAC抑制剂一起使用时，观察到更快作用和/或更长的持续效应。
预期可以对以上公开的实施方案的特定特征和方面进行各种组合或子组合，并且仍然落入本发明的一个或多个内。此外，与实施方案有关的任何特定特征，方面，方法，特性，特点，质量，属性，要素等的本文公开内容可以在本文阐述的所有其他实施方案中使用。因此，应当理解，所公开的实施方案的各种特征和方面可以彼此组合或替代，以便形成所公开的发明的各种模式。因此，意图是本文所公开的本发明的范围不应受到上述特定公开的实施方案的限制。此外，尽管本发明易于进行各种修改和替代形式，但是其具体示例已经在附图中示出并且在本文中进行了详细描述。然而，应该理解，本发明不限于所公开的特定形式或方法，但是相反，本发明将覆盖落入描述的各种实施方案和所附权利要求书的精神和范围内的所有修改，等同方案和替代。本文公开的任何方法不必以所叙述的顺序进行。本文所公开的方法包括从业者采取的某些动作；但是，它们也可以包含那些操作的任何第三方说明，无论是明示还是暗示。例如，诸如“向肝脏局部施用工程化NK细胞群体”的动作包括“指示向肝脏局部施用工程化NK细胞群体”。另外，在根据马库什组描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，由此也根据马库什组的任何单个成员或成员的子组描述本公开。
本文公开的范围还涵盖任何和所有重叠，子范围及其组合。诸如“多达”，“至少”，“大于”，“小于”，“在...之间”等的语言包括所列举的数字。前面为诸如“约”或“大约”的术语的数字包括所叙述的数字。例如，“约90％”包括“90％”。在几个实施方案中，至少95％的同源性包括与参考序列96％，97％，98％，99％和100％同源。另外，当公开序列为“包含”核苷酸或氨基酸序列时，除非另外指出，否则该参考还应包括该序列“包含”所列举的序列，“由所列举的序列组成”或“基本上由所列举的序列组成”。
本文使用的任何标题或副标题是出于组织目的，并且不应被用来限制本文公开的实施方案的范围。
序列表
<110> 恩卡尔塔公司
<120> 天然杀伤细胞组合物和治疗肝细胞癌的免疫疗法方法
<130> NKT.025WO
<150> 62/730939
<151> 2018-09-13
<150> 62/821360
<151> 2019-03-20
<150> 62/841768
<151> 2019-05-01
<150> 62/875893
<151> 2019-07-18
<160> 44
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1714
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> NK45-1 DNA
<400> 1
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<210> 2
<211> 571
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> NK45-1氨基酸
<400> 2
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr
20 25 30
Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
50 55 60
Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly
85 90 95
Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser
100 105 110
Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp
115 120 125
Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser
130 135 140
Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Glu Ser Lys Tyr
145 150 155 160
Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
165 170 175
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
180 185 190
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
195 200 205
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
210 215 220
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
225 230 235 240
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
245 250 255
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
260 265 270
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
275 280 285
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
290 295 300
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
305 310 315 320
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
325 330 335
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Glu Gly Arg
340 345 350
Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met
355 360 365
Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His
370 375 380
Ala Ala Arg Pro Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile
385 390 395 400
Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu
405 410 415
Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu
420 425 430
Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His
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Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser
450 455 460
Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu
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Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
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Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
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Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val
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Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
565 570
<210> 3
<211> 1818
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> NK45-2 DNA
<400> 3
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgttattca accaagaagt tcaaattccc ttgaccgaaa gttactgtgg cccatgtcct 120
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Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
565 570 575
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
580 585 590
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
595 600
<210> 17
<211> 1818
<212> DNA
<213> 智人
<400> 17
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cctacaaacg gctcttggca gtgggaggac ggctccatcc tgtctccaaa tctgctgacc 360
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<211> 606
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> NK39-5氨基酸
<400> 18
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1 5 10 15
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Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
50 55 60
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65 70 75 80
Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly
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Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
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Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
260 265 270
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
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Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
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Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
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Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
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Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
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Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
355 360 365
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly
370 375 380
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
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Gly Pro Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu
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Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu
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Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu
435 440 445
Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys
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Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala
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Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser
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Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu
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Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His
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Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
545 550 555 560
Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly
565 570 575
Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr
580 585 590
Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
595 600 605
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<211> 1641
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> NK39-6 DNA
<400> 19
atggctctgc ccgtcaccgc actgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgcacga 60
ccactgttca atcaggaagt ccagatcccc ctgacagagt cttactgcgg cccatgtccc 120
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<210> 20
<211> 547
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> NK39-6氨基酸
<400> 20
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr
20 25 30
Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
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Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys
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Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly
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Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
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Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala Leu Phe Leu
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Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
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Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
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Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly
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Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
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545
<210> 21
<211> 1548
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> NK39-10 DNA
<400> 21
atggctctgc ccgtcaccgc actgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgcacga 60
ccactgttca atcaggaagt ccagatcccc ctgacagagt cttactgcgg cccatgtccc 120
aagaactgga tctgctacaa gaacaattgt tatcagttct ttgacgagag caagaactgg 180
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gccttgttcc tgaagacaaa tatcaggtct agcacccgcg actggaagga tcacaagttt 720
aagtggcgga aggaccctca ggataagaag cggggcagaa agaagctgct gtatatcttc 780
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<210> 22
<211> 516
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> NK39-109氨基酸
<400> 22
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
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His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr
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Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
50 55 60
Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly
85 90 95
Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser
100 105 110
Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp
115 120 125
Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser
130 135 140
Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro
145 150 155 160
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
165 170 175
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
180 185 190
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu
195 200 205
Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala Leu Phe Leu
210 215 220
Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp Lys Asp His Lys Phe
225 230 235 240
Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu
245 250 255
Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln
260 265 270
Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly
275 280 285
Cys Glu Leu Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly
290 295 300
Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu
305 310 315 320
Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Asn Trp Val
325 330 335
Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met
340 345 350
His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys
355 360 365
Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser
370 375 380
Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile
385 390 395 400
Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser
405 410 415
Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe
420 425 430
Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Thr
435 440 445
Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser
450 455 460
Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly
465 470 475 480
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485 490 495
Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile
500 505 510
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515
<210> 23
<211> 645
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> 全长人NKG2D
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ttattcaacc aagaagttca aattcccttg accgaaagtt actgtggccc atgtcctaaa 300
aactggatat gttacaaaaa taactgctac caattttttg atgagagtaa aaactggtat 360
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<211> 405
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> 截短的人NKG2D DNA
<400> 24
ttattcaacc aagaagttca aattcccttg accgaaagtt actgtggccc atgtcctaaa 60
aactggatat gttacaaaaa taactgctac caattttttg atgagagtaa aaactggtat 120
gagagccagg cttcttgtat gtctcaaaat gccagccttc tgaaagtata cagcaaagag 180
gaccaggatt tacttaaact ggtgaagtca tatcattgga tgggactagt acacattcca 240
acaaatggat cttggcagtg ggaagatggc tccattctct cacccaacct actaacaata 300
attgaaatgc agaagggaga ctgtgcactc tatgcctcga gctttaaagg ctatatagaa 360
aactgttcaa ctccaaatac gtacatctgc atgcaaagga ctgtg 405
<210> 25
<211> 405
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> 密码子优化的截短的人NKG2D DNA
<400> 25
ctgttcaatc aggaagtcca gatccccctg acagagtctt actgcggccc atgtcccaag 60
aactggatct gctacaagaa caattgttat cagttctttg acgagagcaa gaactggtat 120
gagtcccagg cctcttgcat gagccagaat gcctctctgc tgaaggtgta cagcaaggag 180
gaccaggatc tgctgaagct ggtgaagtcc tatcactgga tgggcctggt gcacatccct 240
acaaacggct cttggcagtg ggaggacggc tccatcctgt ctccaaatct gctgaccatc 300
atcgagatgc agaagggcga ttgcgccctg tacgccagct ccttcaaggg ctatatcgag 360
aactgctcca cacccaatac ctacatctgt atgcagagga ccgtg 405
<210> 26
<211> 135
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> CD8a铰链
<400> 26
accacaaccc ctgcaccacg cccccctaca ccagcaccta ccatcgcaag ccagcctctg 60
tccctgcggc cagaggcatg tagaccagca gcaggaggag cagtgcacac aagaggcctg 120
gacttcgcct gcgat 135
<210> 27
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> CD8a TM域
<400> 27
atatacatct gggcacctct tgccggcacc tgcggagtgc tgcttctctc actcgttatt 60
acgctgtact gc 72
<210> 28
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Ig4短铰链蛋白
<400> 28
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
1 5 10
<210> 29
<211> 87
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> CD28 TM域
<400> 29
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt gaggagt 87
<210> 30
<211> 69
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> CD3 TM域
<400> 30
cccaaactct gctacctgct ggatggaatc ctcttcatct atggtgtcat tctcactgcc 60
ttgttcctg 69
<210> 31
<211> 126
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> 4-1BB域
<400> 31
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 32
<211> 336
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> CD3zeta ITAM
<400> 32
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 33
<211> 336
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> CD3z无ITAM
<400> 33
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 34
<211> 117
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> CD29信号传导域
<400> 34
aagaggagca ggctcctgca cagtgactac atgaacatga ctccccgccg ccccgggccc 60
acccgcaagc attaccagcc ctatgcccca ccacgcgact tcgcagccta tcgctcc 117
<210> 35
<211> 111
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> OX-40域
<400> 35
cggagggacc agaggctgcc ccccgatgcc cacaagcccc ctgggggagg cagtttccgg 60
acccccatcc aagaggagca ggccgacgcc cactccaccc tggccaagat c 111
<210> 36
<211> 114
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> NKp80域
<400> 36
atgcaggatg aggacggcta catgaccctg aacgtgcaga gcaagaagag gagcagcgcc 60
cagaccagcc agctgacctt caaggactac agcgtgaccc tgcactggta caag 114
<210> 37
<211> 75
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> CD16 IC域
<400> 37
aagacaaata tcaggtctag cacccgcgac tggaaggatc acaagtttaa gtggcggaag 60
gaccctcagg ataag 75
<210> 38
<211> 63
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> 2A Stop
<400> 38
ggctctggcg agggaagggg ttccctgctt acttgcggcg acgtcgaaga gaatcccggt 60
ccg 63
<210> 39
<211> 614
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> mbIL-15
<400> 39
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgaactggg tgaatgtaat aagtgatttg aaaaaaattg aagatcttat tcaatctatg 120
catattgatg ctactttata tacggaaagt gatgttcacc ccagttgcaa agtaacagca 180
atgaagtgct ttctcttgga gttacaagtt atttcacttg agtccggaga tgcaagtatt 240
catgatacag tagaaaatct gatcatccta gcaaacaaca gtttgtcttc taatgggaat 300
gtaacagaat ctggatgcaa agaatgtgag gaactggagg aaaaaaatat taaagaattt 360
ttgcagagtt ttgtacatat tgtccaaatg ttcatcaaca cttctaccac gacgccagcg 420
ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag 480
gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat 540
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggtatca 600
ccctttactg ctaa 614
<210> 40
<211> 117
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> CD28信号传导域
<400> 40
aagaggagca ggctcctgca cagtgactac atgaacatga ctccccgccg ccccgggccc 60
acccgcaagc attaccagcc ctatgcccca ccacgcgact tcgcagccta tcgctcc 117
<210> 41
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> GS3接头
<400> 41
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 42
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> FLAG标签
<400> 42
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 43
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> HIS标签
<400> 43
His His His His His His
1 5
<210> 44
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Myc标签
<400> 44
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10

Claims (60)

1.一种用于治疗肝肿瘤的联合疗法方案，所述疗法方案包括：
(i)工程化改造为表达细胞毒性受体复合物的天然杀伤(NK)细胞群体，
其中所述细胞毒性受体复合物包含：
a)C型凝集素样受体的功能性片段，其中所述C型凝集素样受体包含天然杀伤组2D(NKG2D)受体，
其中所述C型凝集素样受体的功能性片段包含SEQ ID NO.24；和
b)细胞毒性信号传导复合物，其包含跨膜域、共刺激域和信号传导域，和
其中所述疗法方案被配置为将NK细胞群体局部施用于所述肝肿瘤；
(ii)至少一种另外的抗癌剂。
2.权利要求1的联合疗法，其中所述肝肿瘤源自肝细胞癌。
3.权利要求1的联合疗法，其中所述肝肿瘤是结肠直肠癌的原发性转移。
4.权利要求1的联合疗法，其中所述细胞毒性信号传导复合物的信号传导域包含OX40域。
5.权利要求4的联合疗法，其中所述OX40域与具有SEQ ID NO.35的序列的OX40域至少95％同源。
6.权利要求1的联合疗法，其中所述细胞毒性信号传导复合物的信号传导域还包含CD3zeta域。
7.权利要求4的联合疗法，其中所述CD3zeta域与具有SEQ ID NO.32的序列的CD3zeta域至少95％同源。
8.权利要求1的联合疗法，其中所述细胞毒性受体复合物还包含IL15。
9.权利要求8的联合疗法，其中所述IL15包括膜结合的IL15(mbIL15)。
10.权利要求9的联合疗法，其中所述mbIL15与具有SEQ ID NO.39的序列的mbIL15至少95％同源。
11.权利要求10的联合疗法，其中所述mbIL15由多核苷酸编码，所述多核苷酸也编码所述细胞毒性受体复合物的剩余部分。
12.权利要求11的联合疗法，其中所述细胞毒性受体复合物由SEQ ID NO:7的核酸序列编码。
13.权利要求12的联合疗法，其中所述细胞毒性受体复合物包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
14.权利要求1的联合疗法，其中所述方案被配置为在施用所述NK细胞群体之前，同时或之后施用所述至少一种另外的抗癌剂。
15.权利要求1至14中任一项的联合疗法，其中所述另外的抗癌剂是酪氨酸激酶抑制剂。
16.权利要求15的联合疗法，其中所述另外的抗癌剂是索拉非尼(sorafenib)、尼洛替尼(nilotinib)、伊马替尼(imantinib)、吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、舒尼替尼(sunitinib)、adavosertib、拉帕替尼(lapatinib)或其组合。
17.权利要求1至14中任一项的联合疗法，其中所述另外的抗癌剂是抗体。
18.权利要求17的联合疗法，其中所述另外的抗癌剂是西妥昔单抗、达雷木单抗、利妥昔单抗、阿托珠单抗、曲妥珠单抗或其组合。
19.权利要求1至14中任一项的联合疗法，其中所述另外的抗癌剂是组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂。
20.权利要求19的联合疗法，其中所述HDAC抑制剂是丙戊酸、FR901228、MS-275、丁酸苯酯、PDX101、丙戊酸钠、辛二酰苯胺异羟肟酸或其组合。
21.权利要求1至14中任一项的联合疗法，其中所述另外的抗癌剂是化学治疗剂。
22.权利要求21的联合疗法，其中所述化学治疗剂是顺铂、羟基脲、5-氟尿嘧啶、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、依托泊苷或其组合。
23.权利要求1至14中任一项的联合疗法，其中所述另外的抗癌剂是高剂量电离辐射。
24.权利要求1至14中任一项的联合疗法，其中所述另外的抗癌剂是蛋白酶体抑制剂。
25.权利要求24的联合疗法，其中所述蛋白酶体抑制剂是硼替佐米。
26.权利要求1至14中任一项的联合疗法，其中所述另外的抗癌剂是全反式维甲酸、丁酸钠或其组合。
27.权利要求1至14中任一项的联合疗法，其中所述另外的抗癌剂是NK检查点途径抑制剂。
28.权利要求27的联合疗法，其中所述NK检查点抑制剂是CD73拮抗剂、CD39拮抗剂、腺苷免疫抑制信号传导途径拮抗剂或其组合。
29.权利要求1至14中任一项的联合疗法，其中所述另外的抗癌剂是针对TIM3和/或TGFbeta受体的抗体。
30.权利要求1至14中任一项的联合疗法，其中所述另外的抗癌剂是吲哚胺2,3-加双氧酶抑制剂。
31.权利要求1至30中任一项的联合疗法用于治疗肝癌的用途。
32.权利要求1至30中任一项的联合疗法在制备用于治疗肝癌的药物中的用途。
33.用于治疗原发性肝肿瘤的方法，所述方法包括：
进入患有原发性肝肿瘤的患者的肝内动脉，并且
施用工程化改造为表达细胞毒性受体复合物的天然杀伤(NK)细胞群体，
其中所述细胞毒性受体复合物包含：
C型凝集素样受体的功能性片段，以及
细胞毒性信号传导复合物，其包含跨膜域、共刺激域和信号传导域，且
其中所述C型凝集素样受体包括天然杀伤组2D(NKG2D)受体，且
其中所述C型凝集素样受体的功能性片段包含SEQ ID NO.24；并且
在施用所述NK细胞群体之前、同时或之后，施用至少一种另外的抗癌剂。
34.权利要求33的方法，其中所述另外的抗癌剂是酪氨酸激酶抑制剂。
35.权利要求33或34的方法，其中所述另外的抗癌剂是索拉非尼、尼洛替尼、伊马替尼、吉非替尼、厄洛替尼、舒尼替尼、adavosertib、拉帕替尼或其组合。
36.权利要求33至35中任一项的方法，其中所述细胞毒性信号传导复合物的信号传导域包含OX40域。
37.权利要求33至36中任一项的方法，其中所述细胞毒性信号传导复合物的信号传导域还包含CD3zeta域。
38.权利要求37的方法，其中所述CD3zeta域包含至少一个基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)基序。
39.权利要求33至38中任一项的方法，其中所述共刺激域包含IL-15。
40.权利要求39的方法，其中所述IL-15由NK细胞以结合膜的IL-15表达。
41.权利要求33至40中任一项的方法，其中所述细胞毒性信号传导复合物的跨膜域源自CD8 alpha。
42.权利要求41的方法，其中所述跨膜域包含第一和第二亚域。
43.权利要求42的方法，其中所述第一亚域包含CD8 alpha跨膜域。
44.权利要求42的方法，其中所述第二亚域包含CD8 alpha铰链。
45.权利要求33至44中任一项的方法，其中所述细胞毒性受体复合物与由SEQ ID NO.7的多核苷酸编码的细胞毒性受体复合物至少80％同源。
46.权利要求33至44中任一项的方法，其中所述细胞毒性受体复合物与由SEQ ID NO.7的多核苷酸编码的细胞毒性受体复合物至少85％同源。
47.权利要求33至44中任一项的方法，其中所述细胞毒性受体复合物与由SEQ ID NO.7的多核苷酸编码的细胞毒性受体复合物至少90％同源。
48.权利要求33至44中任一项的方法，其中所述细胞毒性受体复合物与由SEQ ID NO.7的多核苷酸编码的细胞毒性受体复合物至少95％同源。
49.权利要求33至44中任一项的方法，其中所述细胞毒性受体复合物与具有SEQ IDNO.8的氨基酸序列的细胞毒性受体复合物至少80％同源。
50.权利要求33至44中任一项的方法，其中所述细胞毒性受体复合物与具有SEQ IDNO.8的氨基酸序列的细胞毒性受体复合物至少90％同源。
51.权利要求33的方法，其中所述细胞毒性受体复合物与由选自下组的多核苷酸编码的细胞毒性受体复合物至少80％同源：SEQ ID NO.1、3、5、9、11、13、15、17、19和21。
52.权利要求33至51中任一项的方法，其中经皮进入所述肝内动脉，并且其中通过输注施用所述细胞群体。
53.权利要求33至52中任一项的方法，其中所述NK细胞的施用群体就所述患者而言是自体的。
54.权利要求33至52中任一项的方法，其中所述NK细胞的施用群体就所述患者而言是同种异体的。
55.权利要求33至54中任一项的方法，其还包括向所述患者施用IL-2。
56.权利要求33至55中任一项的方法，其还包括在进入所述肝内动脉之前定位所述肝内动脉的位置。
57.权利要求33至56中任一项的方法，其还包括阻塞不向肝供应血液的血管。
58.权利要求33至57中任一项的方法，其中每1周、每2周一次、每3周一次或每4周一次重复所述NK细胞群体的施用。
59.权利要求33至58中任一项的方法，其中所述组合物的输注导致原发性肝肿瘤负荷的至少25％降低。
60.权利要求33至59中任一项的方法，其中所述原发性肝肿瘤是肝细胞癌。
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