CN112601758A - 特异性刺激经基因修饰免疫细胞的存活和扩增的方法 - Google Patents

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A·杨
D·坎帕纳
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Abstract

本发明涉及编码野生型或截短形式的促红细胞生成素受体(EpoR)以促进T细胞存活和增殖的载体。特别地，本发明举例说明了表达具有抗CD19‑41BB‑003ζ嵌合抗原受体(CAR)的截短的EpoR的双顺反子载体，该双顺反子载体比CAR‑T细胞具有更大的离体扩增，并且证明了显著更高的体内抗白血病活性。本发明还描述了产生表达所述载体的细胞的方法以及这些细胞杀死CD 19+肿瘤细胞的用途。

Description

特异性刺激经基因修饰免疫细胞的存活和扩增的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年8月29日提交的美国临时申请号62/724,488的权益。将上述申请的全部传授的内容通过引用并入本文。
ASCII文本文件中的材料通过引用并入
本申请将包含在以下ASCII文本文件中的序列表通过引用并入，该序列表与本申请一并提交：
a)文件名称：4459_1151-001_PCT_SL.txt；创建于2019年8月26日，大小为54,419字节。
背景技术
对于癌症患者，免疫细胞的过继转移是一种有前途且日益可用的治疗选择，即使所有标准治疗均无效，它也可导致临床反应。对肿瘤浸润淋巴细胞和重新定向到具有T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的肿瘤相关分子的T淋巴细胞的临床研究提供了这些方法在白血病和实体瘤患者中的潜力的令人信服的证据。1例如，用抗CD19 CAR-T细胞治疗B细胞白血病和淋巴瘤可导致患有对常规疗法有抗性的疾病的患者的耐久缓解。2-10
几个因素共同影响输注的T淋巴细胞的增殖和寿命，包括输注前的淋巴清除疗法的强度以及输注的T细胞的增殖潜力和衰竭倾向。1,9对于CAR工程化的T细胞，该CAR的质量是一个重要特征，并且该CAR可以递送的共刺激的类型显现起着重要作用。11-13
白细胞介素-2(IL-2)促进体内T细胞的扩增和持久性，并为此目的在一些细胞疗法试验中使用。14,15然而，IL-2的施用可具有相当大的毒性。16,17此外，不论其抗肿瘤能力如何，由于其与所有表达IL-2受体的T细胞反应，故缺乏特异性。有鉴于此，IL-2刺激抑制免疫反应的调节性T细胞。18
发明内容
本文描述了载体、核酸和转基因细胞，其可用于通过改善所输注的细胞的扩增和/或持久性来改善过继细胞疗法的临床功效。
本文描述了一种载体，其包括核酸。该核酸编码促红细胞生成素(Epo)受体；自裂解肽或内部核糖体进入位点；以及细胞表面蛋白。
该Epo受体可与SEQ ID NOS:2、4、6和8中任一项具有至少90％序列同一性。在一些实施例中，该Epo受体可与SEQ ID NO:2具有至少90％序列同一性。在一些实施例中，该Epo受体可与SEQ ID NO:4具有至少90％序列同一性。在一些实施例中，该Epo受体可与SEQ IDNO:6具有至少90％序列同一性。在一些实施例中，该Epo受体可与SEQ ID NO:8具有至少90％序列同一性。在一些实施例中，该Epo受体是突变型Epo受体。在一些实施例中，该核酸具有编码该Epo受体的第8外显子内的终止密码子的突变。
该核苷酸可进一步编码Flag标签(DYKDDDDK(SEQ ID NO:23))，该Flag标签是该Epo受体的C末端。该核酸可包括自裂解肽，诸如2A肽(例如，T2A、P2A、E2A、F2A)。在一些情况下，该2A肽可以是T2A肽。
该信号肽可以是表面蛋白的信号肽，诸如CD8α信号肽。
该细胞表面受体可包括结合靶细胞抗原的胞外受体结构域。
该细胞表面受体可以是嵌合抗原受体(CAR)。该CAR可包括信号肽；结合靶细胞抗原的胞外受体结构域；将该胞外受体结构域锚定在细胞表面上的铰链和跨膜结构域；以及效应子结构域。当该细胞表面受体是嵌合抗原受体时，该胞外结构域典型地是单链可变片段(scFv)。
该胞外受体结构域可包括通过接头结构域连接的可变免疫球蛋白轻链结构域和可变免疫球蛋白重链结构域。该接头结构域可以是(G4S)x(SEQ ID NO:24)，其中x是从1至100的整数。该接头结构域可以是(G4S)3(SEQ ID NO:25)。
该细胞表面受体可以是T细胞受体。
该胞外结构域可包括单克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、单链可变片段(scFv)、微抗体、双抗体、单结构域抗体或其功能性衍生物或变体或片段。
该胞外受体结构域可包括免疫球蛋白Fc受体，诸如CD16、CD32或CD64。该胞外受体结构域可包括细胞因子，诸如IL-13、IL-4、IL-7或IL-3。
该细胞表面受体可激活免疫细胞。例如，该细胞表面受体可包括NKG2D、NKG2C、NCR1、NCR2、NCR3、CD137、CD28或ICOS。该细胞表面受体可包括NKG2D、NKG2C、NCR1、NCR2、NCR3、CD137、CD28或ICOS的片段。该细胞表面受体可包括NKG2D、NKG2C、NCR1、NCR2、NCR3、CD137、CD28或ICOS的配体。
该细胞表面受体可抑制免疫细胞。例如，该细胞表面受体可包括NKG2A、PD-1或CTLA-4。该细胞表面受体可包括NKG2A、PD-1或CTLA-4的片段。该细胞表面受体可包括NKG2A、PD-1或CTLA-4的配体。
该细胞表面受体可以是细胞因子的受体。例如，该细胞表面受体可以是IL-6、IL-1或TNFα的受体。
该靶细胞抗原可以是肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。该靶细胞抗原可以是病毒、细菌、真菌或寄生虫相关抗原。
该靶细胞抗原是CD19、CD20、CD22、CD123、CD33、B细胞成熟抗原(BCMA)、间皮素、人表皮生长因子受体2(Her2)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)或双唾液酸神经节苷脂(GD)-2。
该靶细胞抗原可以是CD19。
该胞外结构域可以是抗CD19单链可变片段(scFv)。该铰链和跨膜结构域可以是CD8α铰链和跨膜结构域。该铰链可包括多个氨基酸残基。该跨膜结构域可以是来自CD4、CD8β、CD16、CD28、CD32、CD34、CD64、CD137、FcεRIγ、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、VEGFR2、FAS、或FGFR2B的跨膜结构域。
该效应子结构域可包括4-1BB和CD3ζ。该CAR可以是抗CD19-41BB-CD3ζ。
该载体可以是逆转录病毒，诸如鼠干细胞病毒(MSCV)逆转录病毒载体。该载体可进一步编码荧光蛋白。该载体可编码内部核糖体进入位点(IRES)。该载体可进一步编码用于表达该核酸的至少一种调控元件。
本文描述了一种制备转基因哺乳动物宿主细胞的方法。该方法可包括将本文所述的任何载体引入哺乳动物宿主细胞中。该哺乳动物宿主细胞可以是免疫细胞，诸如自然杀伤(NK)细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞、或T细胞。该T细胞可以是人外周血T淋巴细胞。该T细胞可以是CD4+T细胞。该T细胞可以是CD8+T细胞。该T细胞可进一步表达结合肿瘤抗原或病毒抗原的T细胞受体(TCR)。该TCR是内源的。例如，该T细胞可以是肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，并且该方法可进一步包括从肿瘤中提取该肿瘤浸润淋巴细胞并且离体扩增该TIL。该TCR可以是外源的。例如，该方法可进一步包括将表达该外源TCR的载体引入该T细胞中。
本文描述了包含本文所述的任何载体的哺乳动物免疫细胞。该哺乳动物免疫细胞可以是自然杀伤(NK)细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞、或T细胞。该T细胞可以是人T细胞。该T细胞可以是人外周血T淋巴细胞。该T细胞可以如前段所述或如本文另外所述。
本文描述了一种减少哺乳动物中CD19+细胞的数量的方法。该方法可包括将哺乳动物T细胞引入该受试者中。该哺乳动物T细胞可包括本文所述的任何载体。该哺乳动物可以是人类。该哺乳动物T细胞可以是从该哺乳动物分离的自体细胞。该哺乳动物T细胞可以是从供体分离的同种异体细胞。该方法可进一步包括向该受试者施用Epo。该方法可进一步包括向该受试者施用IL-2。减少该哺乳动物中CD19+细胞的数量可以治疗急性淋巴母细胞白血病(ALL)。
本文描述了本文所述的任何载体在制备用于治疗或预防有需要的哺乳动物中的癌症、病毒感染、细菌感染、真菌感染、或寄生虫的药物中的用途。
本文描述了本文所述的任何哺乳动物免疫细胞用于减少哺乳动物中CD19+细胞的数量的用途。
本文描述了用于在减少哺乳动物中CD19+细胞的数量的方法中使用的载体。该载体可以是本文所述的任何载体。
本文描述了用于在减少哺乳动物中CD19+细胞的数量的方法中使用的哺乳动物免疫细胞。该哺乳动物免疫细胞可以是本文所述的任何哺乳动物免疫细胞。
本文描述了一种载体，其包含编码突变型促红细胞生成素(Epo)受体的核酸。例如，该突变型Epo受体可与SEQ ID NO:6具有至少90％序列同一性。本文还描述了一种通过将包含编码突变型促红细胞生成素(Epo)受体的核酸的载体引入哺乳动物宿主细胞中来制备转基因哺乳动物宿主细胞的方法。本文还描述了一种哺乳动物免疫细胞，其包含含有编码突变型促红细胞生成素(Epo)受体的核酸的载体。该哺乳动物免疫细胞可以是T细胞、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞/巨噬细胞、或树突细胞。
Epo受体可以在T细胞中表达并递送信号。
EpoRm的表达水平高于EpoR。
EpoRm诱导更强和更耐久的信号。
Epo可支持EpoRm-CAR-T细胞的增殖。
EpoRm的表达和暴露于Epo不会干扰CAR-T细胞的细胞毒性。
EpoRm-CAR-T细胞可在体内扩增并发挥细胞毒性。
附图说明
根据示例实施例的以下更具体的说明，上述内容将是清楚的，如在这些附图中展示的，其中贯穿这些不同的视图，相同的附图标记是指相同的部分。这些图不一定是按比例绘出，而是着重展示实施例。
图1A-E显示人外周血T细胞中EpoR的表达赋予存活信号。图1A是流式细胞术点图，其说明了如通过PE缀合的抗EpoR抗体(R&D系统公司(R·&D Systems))所检测到的Jurkat细胞中的表面EpoR表达；仅用GFP转导的细胞显示为对照。显示了每个象限中的细胞百分比。图1B是流式细胞术直方图，其说明了Epo与Jurkat细胞的结合。将细胞用生物素缀合的Epo(R&D系统公司)和链霉亲和素-PE(杰克逊免疫研究公司)标记。图1C是流式细胞术点图，其说明了仅用GFP或GFP加EpoR转导的T淋巴细胞中的表面EpoR表达。图1D是代表性流式细胞术点图，其说明了在用10IU/mL Epo刺激15分钟后，用AF647缀合的抗体(BD生物科学公司(BD Biosciences))检测到的STAT5 Y647的磷酸化；还显示了在Epo刺激之前用10μM鲁索替尼处理1小时的细胞的结果。图1E是显示在不存在外源细胞因子(无Epo)或存在Epo(4IU/mL)的情况下培养的用EpoR转导的T细胞和仅用GFP转导的T细胞的存活率的图像。符号表示细胞回收率相对于输入细胞的数量的百分比。
图2A-F显示EpoRm比EpoR具有更高和更稳定的表达。图2A是293T细胞中EpoR表达的western印迹分析。在10％聚丙烯酰胺凝胶上在还原条件下分离用EpoR、EpoRm或仅GFP转导的293T细胞的细胞裂解物。将印迹的膜先用小鼠抗Flag抗体(9A3；细胞信号传导技术公司(Cell Signaling Technology))探测，随后用缀合至辣根过氧化物酶(HRP，R&D系统公司)的山羊抗小鼠IgG探测；将兔抗人GAPDH(EPR16891；艾博抗公司(Abcam))随后缀合至HRP的山羊抗兔IgG(艾博抗公司)用于检测GAPDH(加样对照)。通过Clarity Western ECL底物(伯乐公司(Bio-Rad))揭示并通过ChemiDoc Touch成像仪(伯乐公司)可视化抗体结合。图2B是用EpoR、EpoRm或仅GFP转导的T淋巴细胞的流式细胞术分析。流式细胞术点图说明了如通过PE缀合的抗EpoR抗体(R&D系统公司)所检测到的EpoR表达。显示了每个象限中的细胞百分比。图2C是显示表达EpoR的GFP+T细胞的百分比(左)或用EpoR或EpoRm转导的T细胞的EpoR的平均荧光强度(MFI)(右)的图表。****,P<0.0001。图2D是显示来自6个表达EpoR的供体的CD4+(左)或CD8+(右)T细胞的百分比的图表。****,P<0.0001。图2E是显示来自用EpoR或EpoRm转导的3个供体的T细胞中GFP的MFI和EpoR的MFI之间的关系的图像。每个面板显示1个供体的T细胞的结果。****,P<0.0001。图2F是显示来自3个供体的T淋巴细胞的图像，该T淋巴细胞用EpoR或EpoRm转导，然后用10IU/mL Epo刺激。在刺激后的指示的时间点通过流式细胞术评估表面EpoR的表达。每个面板显示1个供体的T细胞的结果。
图3A-E显示EpoRm增强Epo信号传导。图3A是代表性流式细胞术等高线图，其说明了在用Epo(10IU/mL)刺激15分钟之后用EpoR、EpoRm或仅GFP转导的T细胞中STAT5的磷酸化。图3B是显示来自用EpoR或EpoRm转导的3个供体的T细胞中GFP的MFI和pSTAT5的MFI之间的关系的图像。每个面板显示1个供体的T细胞的结果。****,P<0.0001。图3C是显示在用10IU/mL Epo刺激后或在Epo刺激之前用10μM鲁索替尼处理的用EpoR、EpoRm或仅GFP转导的T细胞中表达pSTAT5的GFP+细胞的百分比的图。每个符号代表一个实验的结果。****，P<0.0001；**，P<0.01。图3D是显示在用不同浓度的Epo刺激15分钟后表达pSTAT5的GFP+细胞的百分比的图像。每个符号表示2次实验的平均值。图3E是如下的图像，其显示用10IU/mLEpo刺激的用EpoR、EpoRm或仅GFP转导的T细胞，并且在指示的时间点通过流式细胞术评估pSTAT5。每个符号表示2次实验的平均值。
图4A-D显示EpoRm在T细胞中诱导的增殖和存活信号。图4A是流式细胞术点图，其说明了在无细胞因子培养基中培养3天后，用EpoR、EpoRm或仅GFP转导，未刺激(上排)或用10IU/mL Epo(下排)刺激的T淋巴细胞的细胞周期分析。通过FxCycle染色检测的DNA含量显示在x轴上；通过Edu掺入显示的DNA合成显示在y轴上。Edu+细胞及其百分比显示在框中。图4B是显示在不存在外源细胞因子(无Epo)或存在Epo(10IU/mL)的情况下培养3周的用EpoR、EpoRm或仅GFP转导的T淋巴细胞的存活率的图像。符号表示在三次重复测量中细胞回收率相对于输入细胞的数量的平均(±SD)百分比。****P<0.0001；**P<0.01。图4C是显示在有或没有100IU/mL IL-2和/或10IU/mL Epo的情况下培养6-8天后T细胞回收率相对于输入细胞的百分比的图像。每个符号表示对4个供体中的1个的T细胞进行的测量(对3个供体的3次测量的均值，以及对1个供体的1次测量的均值)。*P＝0.02。图4D是显示在不存在或存在Epo(10IU/mL)的情况下用100IU/mL IL-2培养的用EpoR、EpoRm或仅GFP转导的T淋巴细胞的存活率的图像。显示了在指示的日期T细胞的回收率相对于输入细胞的百分比。
图5A-F显示EpoRm-CAR T细胞的表达和功能。图5A是EpoRm-CAR构建体的示意图。图5B是流式细胞术点图，其说明了在用EpoRm-CAR转导的T细胞中CAR和EpoR的表面表达；将仅用GFP转导的细胞用作对照。显示了每个象限中的细胞百分比。将细胞用EpoR-PE抗体染色以检测EpoR表达；用山羊抗小鼠F(ab’)2抗体和链霉亲和素-APC(杰克逊免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch))检测CAR表达。图5C是显示在用CAR、EpoRm-CAR或仅GFP转导的T淋巴细胞中表达CAR(左)和EpoR(右)的GFP+细胞的百分比的图。每个符号对应一个转导的测量。水平条表示中值。图5D是显示在用10IU/mL Epo刺激15分钟后或在Epo刺激之前用10μM鲁索替尼预处理1小时后，用CAR、EpoRm-CAR或仅GFP转导的T淋巴细胞中表达pSTAT5的GFP+细胞的百分比的图。每个符号对应一个转导的测量。水平条表示中值。图5E是显示用CAR、EpoRm-CAR或仅GFP转导的T淋巴细胞对CD19+细胞系OP-1、RS4；11和Nalm6的细胞毒性的图表。条代表在1:1E:T比率的4小时细胞毒性测定中三次重复实验的均值(±SD)。图5F是显示在存在10IU/mL Epo的情况下在指示的E:T比率用CAR、EpoRm-CAR或仅GFP转导的T淋巴细胞对OP-1mCherry细胞的长期细胞毒性的图像。符号代表在指示的时间点测得的平均(±SD)细胞毒性百分比。*P＝0.03；**P<0.01。
图6A-F显示Epo支持EpoRm-CAR T细胞的增殖。图6A是显示在不存在或存在10IU/mL Epo的情况下，与经施特雷克(Streck)处理的或经辐照的OP-1细胞以1:1比率共培养的用CAR、EpoRm-CAR或仅GFP转导的来自3个供体的T淋巴细胞的存活率和扩增的图表。每个符号表示细胞回收率与输入细胞的数量相比的百分比。显示了三次重复培养的均值(±SD)，除了1个供体的第14天测量外，其中仅显示了2次测量的均值。图6B是显示在存在10IU/mLEpo且有或没有1μM鲁索替尼的情况下培养7天后EpoRm-CAR转导的T细胞相对于输入细胞的回收率的图。***P<0.001。图6C是显示在存在具有10IU/mL或100IU/mL IL-2的10IU/mL Epo的情况下，以1:1比率与经辐照的CD19+OP-1共培养7天后回收的用CAR、EpoRm-CAR或仅GFP转导的T淋巴细胞的百分比的图表。每个符号表示三次重复培养的均值。图6D是显示在指示的时间点用10IU/mL Epo和/或100IU/mL IL-2刺激后在EpoRm-CAR转导的T细胞中pSTAT5的MFI的图。图6E是显示用指示的浓度的Epo和IL-2刺激的、表达pSTAT5的、GFP+EpoRm-CAR转导的T细胞的百分比的图。*P＝0.045；**P<0.01。图6F是显示在用10IU/mL Epo或100IU/mLIL-2刺激之前，以指示的剂量用托法替尼(n＝2)或鲁索替尼(n＝1)处理EpoRm-CAR转导的T细胞1小时的图表。条代表托法替尼两次测量和鲁索替尼单次测量的均值。
图7A-E显示免疫缺陷小鼠中体内肿瘤杀伤和EpoRm-CAR T细胞的扩增。图7A是静脉内输注5x105个Nalm6-萤光素酶细胞的NSG小鼠的代表性图像。两天后，向4只小鼠静脉内注射2x107个EpoRm-CAR T细胞；它们中的2只接受腹膜内注射100IU Epo，每周3次，持续2周；1只小鼠没有接受T细胞。第2天的生物发光腹侧图像显示对记录Nalm6植入具有增强的敏感性。图7B是显示面板7A中所示的小鼠中以光子/秒表示的白血病细胞生长的图。符号对应于通过腹侧和背侧成像的总生物发光。当总的腹侧和背侧生物发光信号达到每秒1x1010光子时，对小鼠实施安乐死。图7C是显示在静脉内注射用CAR、EpoRm-CAR或仅GFP转导的T细胞的小鼠的外周血中人CD45+细胞的绝对数量的图；如所示，一些小鼠接受腹膜内100IUEpo，每周3次，持续2周。T细胞输注后13天，通过颊取血获得血液。*P＝0.02；**P<0.01。图7D是代表性流式细胞术等高线图，其说明了小鼠外周血中人CD45+GFP+(顶部)和人CD45+(底部)T细胞的存在。图7E是显示在用80ng/mL的小鼠或人Epo刺激15分钟后用CAR、EpoRm-CAR或仅GFP转导的T细胞中pSTAT5 MFI的图表。
图8A-C显示EpoRm-CAR T细胞的脱粒和细胞因子释放特征曲线。图8A是显示在与OP-1细胞以1:1E:T比率共培养4小时后，用CAR、EpoRm-CAR或仅GFP转导的T细胞中表达CD107a的GFP+细胞的百分比的图表。条代表来自3个供体的细胞的三次重复测量的均值(±SD)。图8B是显示在与OP-1细胞以1:1E:T比率共培养6小时后如图8A中转导的T细胞中表达IFNγ(左)和TNFα(右)的GFP+细胞的百分比的图像。显示了来自3个IFNγ供体和1个TNFα供体的细胞的三次重复测量的均值(±SD)。***P<0.001。图8C是在不存在或存在10IU/mL Epo的情况下以1:4E:T比率与OP-1细胞共培养24小时后，EpoRm-CAR转导的T细胞的细胞因子产生的Luminex分析的图。
图9A-F显示异种移植模型中EpoRm-CAR-T细胞的抗白血病活性。图9A是静脉内注射用CAR、EpoRm-CAR或仅GFP转导的1x107个T细胞的NOD/scid IL2RGnull小鼠的图像；一组小鼠没有接受T细胞。两周后，向小鼠静脉注射2.5x105个表达萤光素酶的Nalm6细胞。腹腔图像说明了在腹膜内注射D-萤光素钾盐水溶液(150μg/g体重)后通过发光测量的Nalm6细胞植入。图9B是显示图9A所示的小鼠组中的发光测量的图表。显示了在第59天每组中信号低于108光子/秒的小鼠的数量。图9C是显示在图9A中所示的小鼠中输注的T细胞的持久性的图表。通过颊刺采集小鼠血液，并用APC(2D1；百进公司(Biolegend百进公司))或PE/Cy7缀合的抗人CD45(HI30；BD制药公司(BD Pharmingen))和PE缀合的抗小鼠CD45(30-F11；BD制药公司)对细胞进行染色。显示所有CD45+(人类和小鼠)淋巴细胞中hCD45+GFP+细胞的百分比。图9D是其中在NOD/scid IL2RGnull小鼠中静脉内注射用萤光素酶转导的Nalm6细胞(每只小鼠5x105个细胞)的图像。四天后，评估肿瘤植入并静脉内注射1-2x107个T细胞。腹腔图像说明了在腹膜内注射D-萤光素钾盐水溶液(150μg/g体重)后通过发光测量的Nalm6细胞植入。图9E是显示图9D所示的小鼠组中的发光测量的图。显示了在第55天每组中信号低于108光子/秒的小鼠的数量。图9F是显示两组实验中所包括的小鼠的总计长期存活率的图表。
图10是显示用Epo受体或仅GFP转导的Jurkat细胞的生长曲线的图表。每个符号代表三次测量的均值。
具体实施方式
示例实施例的描述如下。
本文描述了关于野生型促红细胞生成素(Epo)受体和与红细胞增多症相关的天然存在的截短形式的异位表达是否可以赋予Epo对人外周血淋巴细胞的反应性的实验。使用用编码该受体和CAR的单一构建体转导的T细胞，评估了Epo在体外和体内特异性扩增CAR-T细胞的潜力。
Epo受体可以在免疫细胞(例如，T细胞)中表达并发挥功能。与正常的Epo受体相比，突变型Epo受体表现出更高和更耐久的表达、更高的信号强度、以及对T细胞活性的更大刺激。Epo受体在T细胞中的表达和功能是出乎意料的，该突变型EpoR的优越性也是如此。
急性淋巴母细胞白血病和CD19
急性淋巴母细胞白血病(ALL)是淋巴血细胞的癌症。ALL进展迅速，如果不治疗，将会致命。标准治疗包括化疗和造血干细胞移植。CD19是一种B细胞特异性抗原，其在ALL的大多数病例中都在所有白血病细胞上表达。
本文所述的载体可用于产生修饰的T细胞，其继而可用于ALL的靶向治疗。本文所述的过程可用于产生可靶向CD19+B细胞进行破坏的转基因T细胞，从而降低ALL的风险和/或严重性。
尽管作为范例，本文所述的特定实例靶向CD19+B细胞，但该方法也适用于靶向其他抗原，这些抗原是癌症和其他疾病发病机理中细胞的标志物。
核酸
如本文所用，术语“核酸”是指包含多个核苷酸单体(例如，核糖核苷酸单体或脱氧核糖核苷酸单体)的聚合物。“核酸”包括例如DNA(例如，基因组DNA和cDNA)、RNA和DNA-RNA杂合分子。核酸分子可以是天然存在的、重组的或合成的。另外，核酸分子可以是单链的、双链的或三链的。在某些实施例中，核酸分子可以被修饰。在双链聚合物的情况下，“核酸”可以指分子的任一条链或两条链。
术语“核苷酸”和“核苷酸单体”是指天然存在的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸单体，以及其非天然存在的衍生物和类似物。相应地，核苷酸可包括例如包含天然存在的碱基(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、肌苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷、或脱氧胞苷)的核苷酸和包含本领域已知的经修饰的碱基的核苷酸。
如本文所用，术语“序列同一性”是指当比对序列以实现最大同一性水平时，两个核苷酸序列或两个氨基酸序列在相同位置处具有相同残基的程度，将该程度表示为百分比。对于序列比对和比较，典型地将一个序列指定为参考序列，将其与测试序列进行比较。参考序列和测试序列之间的序列同一性表示为跨参考序列整个长度的位置的百分比，其中当比对参考序列和测试序列以实现最大同一性水平时，参考序列和测试序列共享相同的核苷酸或氨基酸。作为实例，当进行比对以实现最大同一性水平时，两个序列被认为具有70％序列同一性，测试序列在参考序列整个长度的70％相同位置上具有相同的核苷酸或氨基酸残基。
本领域普通技术人员可以使用适当的比对方法或算法来容易地进行用于比较的序列比对，以实现最大同一性水平。在某些情况下，比对可包括引入的空位以提供最大同一性水平。实例包括Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482(1981)的局部同源性算法，Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443(1970)的同源性比对算法，Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:2444(1988)的相似性方法研究，这些算法(威斯康星州麦迪逊的科学大道575号遗传学计算机小组(Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.)的威斯康星遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA)的计算机实现，或目测检查(一般参见，Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学实验指南])。
当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，指定子序列坐标，如果需要，并且指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法基于指定的程序参数计算一个或多个测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。用于确定序列同一性百分比的常用工具是蛋白质基本局部比对搜索工具(BLASTP)，其可通过美国国立卫生研究院(UnitedStates National Institutes of Health)的国家医学图书馆(National Library ofMedicine)的美国国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)获得。(Altschul等人,J Mol Biol.[分子生物学杂志]215(3):403-10(1990))。
在不同实施例中，两个核苷酸序列或两个氨基酸序列可具有至少例如70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更高的序列同一性。当确定与本文所述的一个或多个序列的序列同一性百分比时，本文所述的序列是参考序列。
载体
术语“载体”、“载体构建体”和“表达载体”意指可以将DNA或RNA序列(例如，外源基因)引入宿主细胞中，从而转化宿主并促进所引入的序列的表达(例如，转录和翻译)的媒介物。载体典型地包含可传播药剂的DNA，通过限制酶技术将编码蛋白质的外源DNA插入其中。载体的常见类型是“质粒”，其通常是双链DNA的自包含(self-contained)分子，该双链DNA可以容易地接受其他(外源)DNA并且可以容易地引入合适的宿主细胞中。已经描述了用于在多种真核和原核宿主中复制和/或表达的大量载体，包括质粒和真菌载体。
术语“表达(express和expression)”意指允许或使基因或DNA序列中的信息得以表现，例如通过活化与相应基因或DNA序列的转录和翻译有关的细胞功能来产生蛋白质。DNA序列在细胞中表达或由细胞表达以形成“表达产物”如蛋白质。表达产物本身，例如所得蛋白质，也可以说成是由细胞“表达”的。例如，当多核苷酸或多肽在外源或天然启动子的控制下在外源宿主细胞中表达或产生时，或者在外源启动子的控制下在天然宿主细胞中表达或产生时，该多核苷酸或多肽重组表达。基因递送载体通常包括与启动子可操作地连接的转基因(例如，编码酶的核酸)和在引入载体的宿主细胞中表达该转基因所需的其他核酸元件。用于基因表达的合适的启动子和递送构建体是本领域已知的。重组质粒还可以包含可诱导的或可调节的启动子，用于在细胞中表达酶。
多种基因递送媒介物是本领域已知的，并且包括病毒和非病毒(例如裸DNA、质粒)载体两者。适用于基因递送的病毒载体是本领域技术人员已知的。此类病毒载体包括例如源自疱疹病毒的载体、杆状病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)、和鼠干细胞病毒(MSCV)。该病毒载体可以是复制性的或非复制性的。可以使用本文披露或引用的方法或者相关领域技术人员已知的其他方法将此类载体引入许多适当的宿主细胞中。
用于基因递送的非病毒载体包括裸DNA、质粒、转座子和mRNA等等。非限制性实例包括pKK质粒(克泰科公司(Clonetech))、pUC质粒、pET质粒(Novagen公司，麦迪逊，威斯康星州)、pRSET或pREP质粒(英杰公司(Invitrogen)，圣地亚哥，加利福尼亚州)、pMAL质粒(新英格兰生物实验室(New England Biolabs)，贝弗利，马萨诸塞州)。可以使用本文披露或引用的方法或者相关领域技术人员已知的其他方法将此类载体引入许多适当的宿主细胞中。
在某些实施例中，该载体包含内部核糖体进入位点(IRES)。在一些实施例中，该载体包括选择标记，如氨苄青霉素抗性基因(Amp)。在一些实施例中，该核酸编码荧光蛋白，诸如绿色荧光蛋白(GFP)或mCherry。在一些实施例中，该核酸适合于亚克隆到EcoRI和XhoI之间的pMSCV-IRES-GFP中。在一些实施例中，该载体含有用于插入所需基因的多克隆位点(MCS)。
尽管遗传密码是简并的，因为大多数氨基酸由多个密码子(称为“同义”或“同义的”密码子)表示，但是在本领域中应理解，特定生物体的密码子使用是非随机的，并且偏向于特定的密码子三联体。相应地，在一些实施例中，载体包括已经针对在特定类型的宿主细胞中表达而优化(例如，通过密码子优化)的核苷酸序列。密码子优化是指如下过程，在该过程中，对编码目的蛋白的多核苷酸进行修饰，以用编码相同的一个或多个氨基酸但在表达核酸的宿主细胞中更普遍使用/识别的密码子替换该多核苷酸中的特定密码子。在一些方面，本文所述的多核苷酸经密码子优化以在T细胞中表达。
促红细胞生成素(Epo)受体及其突变体
如本文所用，术语“Epo受体”是指结合促红细胞生成素的蛋白，其是糖蛋白细胞因子。范例中描述了特定的Epo受体及其突变体。
突变型Epo受体的实例包括截短的Epo受体，其可以由几种不同类型的突变形成，包括移码、插入和缺失。缺乏C末端负调控结构域的那些对红细胞中的Epo刺激表现出超敏性。一个实例由编码Epo受体的核酸代表，该核酸在编码过早终止密码子的Epo受体基因的第8外显子内具有无义突变。此类突变体可以在红细胞祖细胞中产生具有增强的Epo信号传导的截短形式的EpoR。EpoR突变体的一个特定实例在核苷酸6002处具有突变，使得密码子439编码终止密码子(TAG)而不是色氨酸(TGG)。
嵌合抗原受体(CAR)构建体
图5A说明了特定的构建体，其是与铰链和跨膜结构域偶联的抗CD19单链可变片段(抗CD19 scFv)。在图5A的特定实例中，该铰链和跨膜结构域是CD8α铰链和跨膜结构域。该抗CD19 scFv包括抗CD19可变轻链结构域、抗CD19可变重链结构域、以及连接该可变轻链结构域和该可变重链结构域的接头结构域。该可变轻链结构域和可变重链结构域的相对位置可以颠倒，但它们均在跨膜结构域的N'末端，在图5A中示为CD8α铰链和跨膜结构域。该构建体还可包括N末端信号肽，诸如CD8α信号肽(参见SEQ ID NOS:21和22)。表面蛋白的信号肽通常是合适的。
多种接头结构域是合适的。在一些实施例中，该接头结构域可以是(G4S)x(SEQ IDNO:24)，其中x是从1至100的整数；优选地，x是从1至10的一个整数；甚至更优选地，x是从2至5的一个整数。在一些实施例中，该接头结构域可以是(G4S)3(SEQ ID NO:25)。在其他实施例中，该接头结构域可以是一个或多个甘氨酸残基(例如，(G)y(SEQ ID NO:26)，其中y是从2至100的一个整数。在其他实施例中，该接头结构域可以是(EAAAK)3(SEQ ID NO:27)。(G4S)x(SEQ ID NO:24)、(G4S)3(SEQ ID NO:25)、和(G)y(SEQ ID NO:26)是柔性接头的实例，而(EAAAK)3(SEQ ID NO:27)是更加刚性的接头的实例。
多种铰链和跨膜结构域是合适的。在一些实施例中，该铰链结构域可以是CD8α铰链结构域。在一些实施例中，该跨膜结构域可以是CD8α跨膜结构域。在一些实施例中，该铰链和跨膜结构域可以是CD8α铰链和跨膜结构域。在一些实施例中，该铰链可以是多个氨基酸残基。在一些实施例中，该跨膜结构域可以是来自CD4、CD8β、CD16、CD28、CD32、CD34、CD64、CD137、FcεRIγ、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、VEGFR2、FAS、或FGFR2B的跨膜结构域。
虽然图5A的实施例是抗CD19构建体，可采用类似方法生成针对其他靶抗原的构建体，诸如CD20、CD22、CD123、CD33、B细胞成熟抗原(BCMA)、间皮素、人表皮生长因子受体2(Her2)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、或双唾液酸神经节苷脂(GD)-2。例如，基于图5A中的模式，可以用特异性结合不同靶抗原的不同scFv代替该抗CD19 scFv部分。
该构建体还编码Epo受体。在图5A的构建体中，该Epo受体是突变体(EpoRm)，其是使用定点诱变聚合酶链反应(PCR)产生的，以将氨基酸439的密码子从TGG(Trp)改变为TAG(终止)。Epo受体的其他突变体是本领域已知的，并且可以产生自然界中不存在的其他Epo受体变体。一个实例是如下Epo受体，其缺乏在该受体的胞内部分中存在的基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)，该Epo受体可能具有增强的信号传导特性并且可能是合适的。另一个实例是在该胞内部分具有多个JAK2结合结构域的Epo受体。
在该构建体中，该Epo受体通过2A肽与该嵌合抗原受体(CAR)连接，该2A肽是自裂解肽。通过将该Epo受体与该CAR连接，可以由单个载体实现两种蛋白的共表达。2A肽的实例是P2A(SEQ ID NOS:13和14)、T2A(SEQ ID NOS:15和16)、E2A(SEQ ID NOS:17和18)、和F2A(SEQ ID NOS:19和20)，尽管其他2A肽是本领域已知的。
制备转基因宿主细胞的方法
本文描述了制备转基因宿主细胞(如转基因T细胞)的方法。转基因宿主细胞可以例如通过将本文所述的载体实施例中的一种或多种引入宿主细胞中来制备。
在一个实施例中，该方法包括将包含编码Epo受体和嵌合抗原受体(CAR)(诸如抗CD19-41BB-CD3ζ)的核酸的载体引入宿主细胞。在一些实施例中，核酸，诸如双顺反子载体，表达Epo受体和该CAR。在一些实施例中，两种单独的载体可用于产生表达Epo受体和该CAR的转基因细胞，诸如转基因T细胞。
在一些实施例中，一种或多种核酸被整合到宿主细胞的基因组中。在一些实施例中，可以使用本领域已知的多种合适方法中的任一种(包括例如同源重组、基于CRISPR的系统(例如CRISPR/Cas9；CRISPR/Cpf1)、和TALEN系统)将待整合到宿主基因组中的核酸引入宿主细胞中。
多种宿主细胞是合适的，最典型地是免疫细胞。除T细胞(T淋巴细胞)外，EpoR的表达有望激活自然杀伤(NK)细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞、和其他免疫细胞。在一些情况下，该T细胞可以是人外周血T淋巴细胞。在一些情况下，该T细胞可以是CD4+T细胞。在一些情况下，该T细胞可以是CD8+T细胞。
在一些情况下，该T细胞还可以表达结合肿瘤抗原或病毒抗原的T细胞受体(TCR)。在一些情况下，该TCR可以是内源的。例如，该T细胞可以是从肿瘤提取并离体扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。在一些情况下，该TCR可以是外源的。例如，该TCR可以通过病毒转导或其他方式在该T细胞中表达。该TCR可对如下病毒肽具有特异性，该病毒肽诸如源自乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、EB病毒、巨细胞病毒的肽或源自肿瘤细胞(诸如黑色素瘤相关抗原(MAGE)、NY-ESO-1、端粒酶逆转录酶(TERT))的肽。
值和范围
除非另作说明或另外从上下文和本领域的普通技术人员所理解的明显可见，在不同实施例中表示为范围的值可以采取所陈述的范围内的任何具体值或子范围，除非上下文另作清楚规定。关于数值的“约”通常是指落入±8％的值，在一些实施例中±6％，在一些实施例中±4％，在一些实施例中±2％，在一些实施例中±1％，在一些实施例中±0.5％的值的范围，除非另作说明或另外从上下文明显可见。
范例
材料与方法
细胞
白血病细胞系Jurkat、Nalm6和RS4；11获自美国典型培养物保藏中心(ATCC；洛克维尔，马里兰州)。CD19+B谱系ALL细胞系OP-1是在我们的实验室中开发的。19使用包含绿色荧光蛋白(GFP)或mCherry和内部核糖体进入位点(IRES)的鼠干细胞病毒(MSCV)逆转录病毒载体分别在Nalm6中表达萤火虫萤光素酶基因和在OP-1中表达mCherry。细胞系维持在补充有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素的RPMI-1640(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)中。将人胚肾成纤维细胞293T(HEK 293T)细胞培养在补充有10％FBS和1％青霉素-链霉素的DMEM(HyClone，通用电气生命科学公司(GELife Sciences)，洛根市，犹他州)中。
外周血样品获自新加坡国立大学医院血库(National University HospitalBlood Bank)或健康科学管理局(Health Science Authority Blood Bank)的健康成年供体的血小板捐献的废弃匿名副产物。通过在Lymphoprep密度步骤(奈科明公司(Nycomed)，奥斯陆，挪威)上离心分离单核细胞，并在RPMI-1640中洗涤两次。T细胞用Dynabeads人T激活剂CD3/CD28(英杰公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)富集并培养在RPMI-1640、10％FBS、1％青霉素-链霉素、和白细胞介素-2(IL-2；120IU/mL；阿地白介素(Proleukin)，诺华公司(Novartis)，巴塞尔，瑞士)中。
基因克隆和逆转录病毒转导
Epo受体(EpoR)cDNA获自复能基因公司(GeneCopoeia)(洛克维尔，马里兰州)。使用定点诱变聚合酶链反应(PCR)，将439位氨基酸的密码子从TGG(Trp)更改为TAG(终止)，生成突变型EpoR(EpoRm)。20在一些实验中，将Flag标签(DYKDDDDK(SEQ ID NO:23))添加到EpoR和EpoRm的C末端。抗CD19-41BB-CD3ζCAR以前是在我们的实验室中制造。21EpoRm-2A-CAR是通过融合PCR产生的，通过2A肽序列将EpoRm与抗CD19-41BB-CD3ζ组合在一起。22将该构建体和表达盒亚克隆到pMSCV-IRES-GFP载体的EcoRI和XhoI位点。
如前所述，进行逆转录病毒上清液的制备和转导。23简而言之，将pMSCV逆转录病毒载体条件培养基添加到RetroNectin(宝生物公司(Takara)，大津，日本)包被的聚丙烯试管中；离心并去除该上清液后，将T细胞(5x105个)加入该试管中，在37℃下放置12小时；在其他连续两天添加新鲜的病毒上清液。然后将T淋巴细胞维持在具有FBS、抗生素和200IU/mLIL-2的RPMI-1640中，直到实验时间，即转导后7-21天。
EpoR和CAR表达的检测
用藻红蛋白(PE)缀合的抗人EpoR抗体(38409；R&D系统公司，明尼阿波利斯，明尼苏达州)检测EpoR的表面表达。在一些实验中，对已在无细胞因子培养基中培养2小时的细胞进行EpoR表面染色，随后在37℃与10IU/mL重组人Epo(赛默飞世尔科技公司)一起孵育15-60分钟。先使用生物素缀合的山羊抗小鼠F(ab')2抗体(杰克逊免疫研究公司，西格罗夫，宾夕法尼亚州)随后用缀合至别藻蓝蛋白的链霉亲和素(APC；杰克逊免疫研究公司)检测CAR表达。PE/Cy7缀合的抗CD4(SK3)抗体来自BD生物科学公司(圣何塞，加利福尼亚州)；APC缀合的抗CD8(BW135/80)抗体来自美天旎公司(Miltenyl Biotec)(贝尔吉施格拉德巴赫(Bergisch Gladbach)，德国)。在所有测试中，将非反应性同种型匹配的抗体用作对照。使用Accuri C6或Fortessa流式细胞仪(BD生物科学公司)、Diva(BD生物科学公司)或FlowJo软件(FlowJo，阿什兰，俄勒冈州)分析细胞染色。
如前所述，对293T细胞中的EpoR表达进行Western印迹分析。24简而言之，在使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒(赛默飞世尔科技公司)进行蛋白定量之前，使用CelLytic M细胞裂解试剂(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，圣路易斯，密苏里州)提取细胞裂解液。将细胞裂解物用4x Laemmli样品缓冲液(伯乐公司，赫尔克里斯，加利福尼亚州)稀释，然后在还原条件下通过电泳在10％聚丙烯酰胺凝胶上分离。将印迹的膜先用小鼠抗Flag(9A3；细胞信号传导技术公司，丹弗斯，马萨诸塞州)探测，随后用缀合至辣根过氧化物酶(HRP)(R&D系统公司)的山羊抗小鼠IgG探测；将兔抗人甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(EPR16891；艾博抗公司，剑桥，英国)随后HRP缀合的山羊抗兔IgG抗体(艾博抗公司)作为加样对照。通过Clarity Western ECL底物(伯乐公司)揭示并通过ChemiDoc Touch成像仪(伯乐公司)可视化抗体结合。
Epo结合和信号传导的检测
为了确定Epo与EpoR的结合，将细胞与生物素化的Epo(R&D系统公司)在室温下孵育2小时。用链霉亲和素-PE(杰克逊免疫研究公司)可视化生物素化的Epo。
为了检测Epo信号传导，将细胞在无细胞因子的培养基中孵育2小时，然后在37℃用Epo(0.01-10IU/mL)刺激15分钟至24小时。在一些实验中，在Epo刺激之前，将细胞用0.1-10μM鲁索替尼(赛力克化学公司(Selleckchem))或0.5-5nM托法替尼(圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology)，圣克鲁斯，加利福尼亚州)处理1小时。然后将细胞用1x裂解/固定缓冲液(BD生物科学公司)固定，用Perm Buffer III(BD生物科学公司)透化，并用与Alexa Fluor 647(AF647)缀合的抗STAT5(pY694)染色(47；BD生物科学公司)。在一些实验中，将人Epo的作用与鼠Epo的作用进行了比较(百进公司，圣地亚哥，加利福尼亚州)。
细胞增殖测定
为了确定Epo对细胞周期的影响，将细胞在无细胞因子的培养基中培养3天，随后用10IU/mL Epo刺激1天。通过Click-iT EdU AF647流式细胞术测定试剂盒(赛默飞世尔科技公司)测量DNA合成，并通过FxCycle紫染色剂(赛默飞世尔科技公司)测量DNA含量。
为了评估细胞存活率，在不存在外源的细胞因子、有或没有Epo(4-10IU/mL)的情况下，在平底96孔板或24孔板(施乐事达公司(Cellstar))中培养T细胞。为了细胞增殖，将T细胞与靶细胞(OP-1细胞)以1:1的效应子与靶(E:T)比率在平底96孔板中共培养；每两天添加一次Epo(10IU/mL)。在培养开始时以及之后每7天添加靶细胞，这些细胞经过辐照(100Gy)或用施特雷克细胞防腐剂(施特雷克实验室(Streck Laboratories)，奥马哈，内布拉斯加州)处理以抑制生长。在一些实验中，低剂量(10IU/mL)或高剂量(100IU/mL)IL-2也被添加到培养物中。通过流式细胞术测量GFP+T细胞的数量。
细胞毒性和细胞因子产生
为了测试细胞毒性，将CD19+靶细胞(OP-1、RS4；11、和Nalm6)用钙黄绿素红-橙AM(赛默飞世尔科技公司)标记，并置于96孔圆形底板(康宁公司(Corning Costar)，科宁，纽约州)中。将T细胞以1:1的E:T比率添加，并与靶细胞在37℃和5％CO2培养箱中共培养4小时。通过流式细胞术对存活的靶细胞进行计数。25针对长期的细胞毒性，将OP-1mCherry细胞置于96孔平底板中，按不同的E:T比率添加T细胞，并在10IU/mL的Epo的情况下培养3天。将板置于IncuCyte Zoom系统(埃森生物科学公司(Essen BioScience))中，每4小时进行一次数据收集(全孔成像)。
为了测量裂解颗粒的胞吐作用，将T细胞在96孔圆形底板中与OP-1细胞以1:1E:T比率共培养4小时。在培养开始时添加PE缀合的抗人CD107a抗体(H4A3；BD生物科学公司)，并在1小时后加入莫能菌素(BD GolgiStop)。
要测量干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的产生，在1:1E:T比率下如上铺板靶细胞和效应细胞。1小时后，将布雷菲德菌素A(BD GolgiPlug)添加到培养物中，并再孵育5小时。随后，在通过流式细胞术进行分析之前，先用PE缀合的抗IFN-γ(克隆25723.11；BD生物科学公司)或抗TNF-α(克隆6401.1111；BD生物科学公司)进行胞内染色。为了评估细胞因子特征曲线，将靶细胞和效应细胞在不存在或存在10IU/mL Epo的情况下在1:4E:T比率下共培养24小时。收集培养物上清液以通过Luminex Multiplex测定(伯乐公司)进行分析。
异种移植实验
为了确定T细胞在体内的存活率，向NOD.Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl/SzJ(NOD/scid IL2RGnull)小鼠(杰克逊实验室(The Jackson Laboratory)，巴尔港，缅因州)静脉内注射(iv)用单独的GFP、CAR、或EpoRm-CAR转导的1x107个T细胞。在一些小鼠中，每两天腹膜内(i.p)注射100IU的Epo，持续两周。在第13天，用细胞计数器(贝克曼库尔特公司(BeckmanCoulter)，迈阿密，佛罗里达州)对血细胞进行计数。用红细胞裂解液(西格玛奥德里奇公司)处理后，将细胞用APC缀合的抗人CD45(2D1；百进公司)和PE缀合的抗小鼠CD45(30-F11；BD制药公司)染色。
为了评估抗白血病活性，先向NOD-scid-IL2RGnull小鼠静脉内注射1x107个T细胞，随后在2周后静脉内注射2.5x105个表达萤光素酶的Nalm6细胞。在腹膜内注射D-萤光素钾盐水溶液(150μg/g体重，珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))后通过用Xenogen IVIS-200系统(珀金埃尔默公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)测量发光信号来确定ALL细胞植入；使用Living Image 3.0软件分析信号。在另一种模型中，静脉内注射5x105个Nalm6-萤光素酶细胞。随后4天后，静脉内注射1-2x107个T细胞。当发光达到1x1010光子/秒时，对小鼠实施安乐死，或者如果有体征表明需要安乐死，则可以更早进行安乐死。
在另一种测试T细胞的抗白血病活性的模型中，静脉内注射萤光素酶转导的Nalm6细胞(每只小鼠5x105个细胞)，随后两天后是表达EpoRm-CAR的T细胞(每只小鼠2x107个细胞，静脉内)，而对照小鼠则没有接受T细胞；一些小鼠每周腹膜内接受3次Epo(100IU)。腹膜内注射D-萤光素钾盐水溶液(150μg/g体重)后，用Xenogen IVIS-200系统(珀金埃尔默公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)测定肿瘤细胞负荷。用Living Image 3.0软件分析发光。当发光达到1x1010光子/秒时，对小鼠实施安乐死，或者如果有体征表明需要实施安乐死，则对小鼠实施安乐死。
Jurkat细胞生长曲线
为了确定EpoR和EpoRm表达对细胞生长的影响，定期计数用仅GFP、EpoR和EpoRm转导并维持在相同培养条件下的Jurkat细胞的数量。
结果
EpoR可以在T细胞中表达并介导Epo存活信号
用EpoR基因对Jurkat细胞进行逆转录病毒转导导致该受体的高表达(图1A)。表达EpoR的细胞可以结合Epo，而在用单独的GFP转导的细胞中没有可检测到的结合(图1B)。接下来，我们确定EpoR是否也可以在外周血T淋巴细胞中表达。为此，我们用抗CD3和CD28抗体以及IL-2刺激外周血单核细胞，并用该EpoR基因或单独的GFP转导它们。在用来自4个供体的T细胞进行的5个实验中，表达EpoR的经转导的T淋巴细胞(GFP+)的百分比为74.9％±4.8％；在仅用GFP转导的细胞中无法检测到EpoR(图1C)。
为了测试EpoR是否发挥功能，我们将EpoR转导的T淋巴细胞暴露于Epo(10IU/mL)15分钟，并测量STAT5 Y647的磷酸化，这是在红细胞中EpoR连接触发的下游激活信号之一。26,27在用来自3个供体的T细胞进行的实验中，Epo暴露后，GFP+EpoR转导的T淋巴细胞中pSTAT5阳性细胞的百分比从1.0％±0.9％增加到85.9％±5.1％；在仅用GFP转导的T淋巴细胞中，其基本保持不变(1.3％±0.4％至1.5％±0.7％)(图1D)。在红细胞中EpoR连接后，JAK2激酶使STAT5磷酸化。28将EpoR T淋巴细胞暴露于JAK1/2抑制剂鲁索替尼后29，由Epo诱导的STAT5磷酸化被消除(图1D)。最后，在不存在外源的IL-2的情况下，向EpoR转导的T细胞中添加Epo(4IU/mL)支持其在培养中的存活(图1E)。总之，这些结果显示EpoR可以在T淋巴细胞中表达，并且暴露于Epo可以转导表达EpoR的T淋巴细胞中的存活信号。
EpoR突变体增强T细胞中EpoR表达
以前有报道说该EpoR第8外显子的无意义突变在红细胞祖细胞中产生了带有增强的Epo信号传导的截短形式的EpoR，导致红细胞产出增加。20,30我们生成了编码EpoR突变体的cDNA，其中插入了编码色氨酸的密码子439(TGG)的突变，其被更改为终止密码子TAG(“EpoRm”)。在293T细胞中表达该cDNA后，我们发现，通过western印迹，所编码的蛋白具有54kDa的预测大小，而对于EpoR则为62kDa(图2A)。我们在活化的外周血T淋巴细胞中表达了EpoR和EpoRm，并且观察到EpoRm的表达水平始终高于在相同的T细胞中针对野生型EpoR构建体所测量的水平(图2B)。因此，在用来自7个供体的T淋巴细胞进行的18个实验中，表达EpoR的GFP+T细胞的百分比为71.9％±14.1％，而EpoRm为93.1％±6.1％(配对t检验，P<0.0001)；平均荧光强度(MFI)分别为3,620±2,449和8,773±5,851(P<0.0001)(图2C)。无论细胞是CD4+还是CD8+，EpoRm表达都较高(图2D)。
用EpoR或EpoRm转导的T细胞中的总体GFP表达没有显著差异：GFP+T细胞的百分比在EpoR情况下为75.2％±8.4％，而在EpoRm情况下为80.4％±7.5％；MFI分别为7,003±2,820和8,331±3,343(对于两个比较，P>0.05)。因此，该2种受体之间的表达差异仅仅由不同的转导效率而引起是不可能的。然而，我们解决了这种可能性，并在3个实验中对与给定GFP表达水平相关的受体表达水平进行了详细分析。通过这些测量，EpoRm表达高于EpoR(图2E；对于所有3个比较，P<0.0001)。
EpoRm的高表达与暴露于Epo后的更长持续时间有关。在用来自3个供体的T细胞进行的实验中，用EpoR转导的细胞中EpoR阳性细胞的百分比的降低明显高于用EpoRm转导的细胞(图2F)。
EpoRm的信号传导特性
与EpoRm的更高和更持续的表达相一致，如果这些细胞表达EpoRm，则T细胞暴露于Epo会导致更剧烈的活化。EpoRm T细胞比EpoR T细胞具有更高的pSTAT5Y647磷酸化，这被暴露于该JAK1/2抑制剂鲁索替尼(10μM)抑制(图3A、3B、3C)。通过根据GFP的水平对pSTAT5Y647 MFI的分析，证实了EpoRm引起的较高的STAT5磷酸化。在通过GFP测量的任何给定的逆转录病毒转导水平下，EpoRm情况下的pSTAT5 MFI更高，在较低的转导水平下，pSTAT5信号传导达到了平稳状态(图3B)。Epo触发的STAT5磷酸化是剂量依赖性的，并且EpoRm需要较低的Epo水平才能诱导STAT5磷酸化。因此，在2个实验中，EpoR情况下剂量为0.1IU/mL的平均pSTAT5 Y647为8.9％，相对于EpoRm情况下的29.1％；Epo为1IU/mL时其为66.1％相对于88.6％(图3D)。在表达EpoRm的细胞中的STAT5磷酸化也比在表达EpoR的细胞中更耐久(图3E)。
暴露于Epo 24小时引起携带Epo受体的T细胞中的DNA合成，并且在表达EpoRm的T细胞中刺激更高(图4A)。在不存在IL-2的情况下，无论Epo受体表达如何，T细胞都会迅速死亡。然而，当将Epo添加到培养中时，表达Epo受体的那些持续至少2周，而表达EpoRm的T细胞的培养产生更高的细胞数量(图4B)。
我们确定了如果在100IU/mL IL-2存在下培养细胞，Epo刺激是否会进一步改善T细胞回收率。在用来自4个供体的细胞进行的实验中，在将Epo(10IU/mL)添加到IL-2(100IU/mL)时，培养7天后，用EpoRm转导的T细胞的回收率显著更高(P＝0.020)；在这些条件下，细胞回收率优于用EpoR转导的细胞(P＝0.019)(图4C)。在延长14天的单独培养中，表达Epo受体的T细胞显示比仅用GFP转导的细胞更高和更耐久的扩增；再次，EpoRm细胞比EpoR细胞表现更好(图4D)。
同时表达的EpoRm和CAR的功能活性
这些先前的实验表明，在T细胞中EpoRm比野生型Epo受体具有更高的表达，并产生更强和更耐久的信号。因此，我们将编码EpoRm的基因掺入双顺反子载体中，该双顺反子载体也包含我们实验室中开发的编码抗CD19-41BB-CD3ζCAR的基因(图5A)。21在T淋巴细胞中转导此构建体导致EpoRm和CAR表达(图5B)，并且任一基因的表达水平与用单个基因载体转导的细胞的表达水平相似(图5C)。EpoRm的功能得以维持，无论它是单独表达还是与CAR组合表达(图5D)。
CAR-T细胞功能也保留在表达EpoRm的细胞中。因此，与CD19+ALL细胞系OP-1细胞共培养4小时后，如通过CD107a表达所测量的，细胞毒性颗粒的胞吐作用没有差异，无论CAR-T细胞是否表达EpoRm或在培养中是否存在Epo(图8A)。在相同培养条件下，CAR刺激触发的IFNγ的分泌也不受Epo信号传导的影响，但我们观察到EpoRm-CAR-T细胞在存在Epo的情况下比缺乏EpoRm的CAR-T细胞分泌更多的TNFα(P<0.001)(图8B)。尽管我们注意到在用Epo培养的细胞中IL-6和IL-4的水平较高，而IL-2的水平较低，在有和没有Epo的情况下与OP-1细胞共培养的EpoRm-CAR T细胞的细胞因子特征曲线通常相似(图8C)。
我们确定了EpoRm-CAR T细胞杀死CD19+靶细胞的能力。在用3种ALL细胞系(OP-1、RS4；11和Nalm6)进行的实验中，无论是否将Epo(10IU/mL)添加到培养中，在1:1E:T下这些T细胞的4小时细胞毒性与用单独的CAR转导的T细胞无法区分(图5E)。但是，当在存在Epo的情况下测试72小时内的细胞毒性时，在低(1:4、1:8)E:T比率下EpoRm-CAR T细胞的杀伤显著高于CAR-T细胞的杀伤(图5F)。
EpoRm-CAR T细胞中Epo和IL-2的增殖信号
EpoRm-CAR T细胞在长期培养中发挥更高的杀伤可通过这些细胞的增殖速率更高从而产生了更高的E:T比率来解释。为了验证这一观点，我们将用EpoRm-CAR、单独的CAR或GFP转导的T细胞与经施特雷克处理的或经辐照的OP-1细胞共培养，并监测2周内T细胞的生长。我们向培养中添加Epo(10IU/mL)，但没有添加外源的IL-2。如图6A所示，当CAR-T细胞表达EpoRm时，来自3个供体的T细胞的扩增更高，表明EpoRm信号传导增强了CAR驱动的细胞增殖。鲁索替尼(1μM)取消了EpoRm-CAR T细胞增殖(图6B)。为了确定Epo刺激是否可以增加外源的IL-2的刺激，我们评估了在存在10IU/mL(4个供体)或100IU/mL的IL-2(3个供体)的情况下与经辐照的OP-1共培养7天后的T细胞回收率。与用单独的IL-2培养的细胞相比，用IL-2和Epo两者培养的CAR刺激的EpoRm-CAR T细胞具有明显更高的扩增(图6C)。
为了进一步确定IL-2和Epo触发的信号传导之间的关系，我们测量了STAT5Y647磷酸化。如图6D中所示，暴露于Epo和IL-2的细胞比暴露于任一生长因子的细胞具有更高的pSTAT5 MFI。在并列比较中，由1IU/mL的Epo诱导的pSTAT5水平显著高于由50IU/mL的IL-2诱导的pSTAT5水平(P＝0.0019)，并超过了由100IU/mL的IL-2诱导的水平(图6E)。最后，我们确定了暴露于Epo(10IU/mL)或IL-2(100IU/mL)的EpoRm-CAR T细胞对JAK抑制剂的相对敏感性。我们使用了主要抑制JAK3的托法替尼和主要抑制JAK1和JAK2信号传导的鲁索替尼。29,31在完全消除由IL-2引起的STAT5 Y647磷酸化的浓度下，这些抑制剂不具有Epo信号传导的影响(图6F)。因此，CAR-T细胞中的EpoRm信号传导触发了不同于IL-2的信号传导级联，并增强了IL-2的增殖刺激。
异种移植模型
为了开始评估EpoRm-CAR-T细胞的体内抗白血病活性，我们向5只NSG小鼠静脉内输注萤光素酶标记的CD19+Nalm6 ALL细胞。2天后确认植入后，使4只小鼠静脉内接受EpoRm-CAR-T细胞，并且1只不处理。如图7A和7B中所示，在未经处理的小鼠中ALL细胞迅速扩增，而经处理的小鼠在输注白血病细胞后2个月处于缓解状态。值得注意的是，这些小鼠中的2只每周3次腹膜内注射100IU Epo共2周不影响该EpoR-CAR-T细胞的抗白血病活性(图7A)。
在第二组实验中，将CAR或EpoRm-CAR或单独的GFP转导的T淋巴细胞静脉内注射入NSG小鼠。注射后第13天，检查外周血中是否存在表达GFP和人CD45的细胞。如图7C和D中所示，注射EpoRm-CAR-T细胞的小鼠中GFP+/hCD45+细胞的水平高于注射用仅GFP或缺乏EpoRm的CAR转导的细胞的小鼠中测量的水平；在后一组中每周3次腹膜内注射100IU Epo持续2次并没有显著增加细胞数量。在接受Epo腹膜内注射的注射了EpoRm-CAR-T细胞的小鼠中，GFP+/hCD45+细胞的水平最高。然而，值得注意的是，虽然未接受Epo注射的那些的水平低于补充Epo的那些，但GFP+/hCD45+细胞的显著增加却是明显可见的。该结果表明内源的鼠Epo可能刺激表达人EpoRm的细胞。确实，鼠和人Epo基因之间存在相当的同源性。32为了确定鼠Epo是否可以通过T细胞中的人EpoRm诱导信号，我们在鼠和人Epo刺激后检查pSTAT5 Y647。如图7E中所示，两者中任一种产生相似的pSTAT5增加，这提供了对当在不补充人Epo的情况下输注EpoRm-CAR-T细胞时观察到的GFP+/hCD45+细胞的相对增加的解释。
为了评估体内EpoRm-CAR-T细胞的数量的增加是否可提供针对ALL植入的卓越保护，我们向NOD-scid-IL2RGnull小鼠静脉内注射T细胞，随后在14天后静脉内注射Nalm6细胞。ALL细胞的植入仅被CAR-T细胞延迟，而被EpoRm-CAR-T细胞完全消除(图9A和9B)。输注ALL细胞后两个月，所有注射CAR-T细胞的5只小鼠均存在ALL植入，而注射EpoRm-CAR-T细胞的5只小鼠中均没有ALL(通过Fisher精确检验，P＝0.0079)。在第13天，接种ALL细胞的前1天，并且在没有外源Epo的情况下，外周血淋巴细胞中CAR-T细胞的百分比为18.8％±6.7％，相对于EpoRm-CAR-T细胞的48.9％±17.0％(P＝0.0062)(图9C)。在后续时间点，EpoRm-CAR-T细胞的水平仍然高于CAR-T细胞的水平。
在另一种模型中，首先通过静脉内注射将Nalm6细胞植入NOD-scid-IL2RGnull小鼠中。在第4天，将小鼠分成具有相似肿瘤负荷的4组；三组接受通过静脉内注射的CAR-T细胞、EpoRm-CAR-T细胞或仅用GFP转导的T细胞；第四组仅接受组织培养基。在未经处理的小鼠中以及在接受无CAR的对照T细胞的小鼠中ALL细胞迅速扩增。CAR-和EpoRm-CAR-T细胞均显著降低白血病信号(图9D和9E)。但是，在输注后第55天，用CAR-T细胞处理的10只小鼠中有5只复发，相对于接受EpoRm-CAR-T细胞的9只小鼠中没有一只复发(通过Fisher精确检验，P＝0.0325)。图9F显示了这两个群组的组合长期存活率；EpoRm-CAR-T细胞产生比CAR-T细胞显著更高的总体抗白血病作用(通过对数秩检验，P＝0.0076)。
Jurkat细胞生长曲线
EpoR或EpoRm的表达均没有不利地影响Jurkat细胞的长期细胞生长(图10)。
实施例
实施例1.一种载体，其包含编码以下的核酸：a)促红细胞生成素(Epo)受体；b)自裂解肽或内部核糖体进入位点；以及c)细胞表面受体。
实施例2.如实施例1所述的载体，其中该Epo受体与SEQ ID NO:2具有至少90％序列同一性。
实施例3.如实施例1所述的载体，其中该Epo受体是突变型Epo受体。
实施例4.如实施例3所述的载体，其中该核酸具有编码该Epo受体的第8外显子内的终止密码子的突变。
实施例5.如实施例3所述的载体，其中该Epo受体与SEQ ID NO:6具有至少90％序列同一性。
实施例6.如实施例1至5中任一项所述的载体，其中该核酸进一步编码Flag标签(DYKDDDDK(SEQ ID NO:23))，该Flag标签是该Epo受体的C末端。
实施例7.如实施例1至6中任一项所述的载体，其中该核酸包含自裂解肽。
实施例8.如实施例7所述的载体，其中该自裂解肽是2A肽。
实施例9.如实施例8所述的载体，其中该2A肽是T2A肽。
实施例10.如实施例1至9中任一项所述的载体，其中该信号肽是CD8α信号肽。
实施例11.如实施例10所述的载体，其中该细胞表面受体包含结合靶细胞抗原的胞外受体结构域。
实施例12.如实施例1至10中任一项所述的载体，其中该细胞表面受体是嵌合抗原受体，其包含：i)信号肽；ii)结合靶细胞抗原的胞外受体结构域；iii)将该胞外受体结构域锚定在细胞表面上的铰链和跨膜结构域；以及iv)效应子结构域。
实施例13.如实施例11或12所述的载体，其中该胞外受体结构域包含通过接头结构域连接的可变免疫球蛋白轻链结构域和可变免疫球蛋白重链结构域。
实施例14.如实施例13所述的载体，其中该接头结构域是(G4S)x(SEQ ID NO:24)，其中x是从1至100的整数。
实施例15.如实施例13所述的载体，其中该接头结构域是(G4S)3(SEQ ID NO:25)。
实施例16.如实施例12所述的载体，其中该胞外受体结构域是单链可变片段(scFv)。
实施例17.如实施例1至10中任一项所述的载体，其中该细胞表面受体是T细胞受体。
实施例18.如实施例11所述的载体，其中该胞外受体结构域包含单克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、单链可变片段(scFv)、微抗体、双抗体、单结构域抗体或其功能性衍生物或变体或片段。
实施例19.如实施例11所述的载体，其中该胞外受体结构域包含免疫球蛋白Fc受体。
实施例20.如实施例19所述的载体，其中该免疫球蛋白Fc受体是CD16、CD32或CD64。
实施例21.如实施例11所述的载体，其中该胞外受体结构域包含细胞因子。
实施例22.如实施例21所述的载体，其中该细胞因子是IL-13、IL-4、IL-7、或IL-3。
实施例23.如实施例11所述的载体，其中该细胞表面受体激活免疫细胞。
实施例24.如实施例23所述的载体，其中该细胞表面受体包含NKG2D、NKG2C、NCR1、NCR2、NCR3、CD137、CD28、或ICOS、或其片段或配体。
实施例25.如实施例11所述的载体，其中该细胞表面受体抑制免疫细胞。
实施例26.如实施例25所述的载体，其中该细胞表面受体包含NKG2A、PD-1、或CTLA-4、或其片段或配体。
实施例27.如实施例11所述的载体，其中该细胞表面受体是细胞因子的受体。
实施例28.如实施例27所述的载体，其中该细胞表面受体是IL-6、IL-1、或TNFα的受体。
实施例29.如实施例1至28中任一项所述的载体，其中该靶细胞抗原是肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。
实施例30.如实施例1至28中任一项所述的载体，其中该靶细胞抗原是病毒、细菌、真菌、或寄生虫相关抗原或病毒、细菌、真菌、或寄生虫特异性抗原。
实施例31.如实施例1至28中任一项所述的载体，其中该靶细胞抗原是CD19、CD20、CD22、CD123、CD33、B细胞成熟抗原(BCMA)、间皮素、人表皮生长因子受体2(Her2)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)或双唾液酸神经节苷脂(GD2)。
实施例32.如实施例1至28中任一项所述的载体，其中该靶细胞抗原是CD19。
实施例33.如实施例1至32中任一项所述的载体，其中该胞外结构域是抗CD19单链可变片段(scFv)。
实施例34.如实施例1至33中任一项所述的载体，其中该铰链和跨膜结构域是CD8α铰链和跨膜结构域。
实施例35.如实施例1至34中任一项所述的载体，其中该铰链包含多个氨基酸残基。
实施例36.如实施例1至35中任一项所述的载体，其中该跨膜结构域是来自CD4、CD8β、CD16、CD28、CD32、CD34、CD64、CD137、FcεRIγ、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、VEGFR2、FAS、或FGFR2B的跨膜结构域。
实施例37.如实施例1至36中任一项所述的载体，其中该效应子结构域包含4-1BB和CD3ζ。
实施例38.如实施例1至37中任一项所述的载体，其中该CAR是抗CD19-41BB-CD3ζ。
实施例39.一种载体，其包含编码突变型促红细胞生成素(Epo)受体的核酸。
实施例40.如实施例39所述的载体，其中该核酸具有编码该Epo受体的第8外显子内的终止密码子的突变。
实施例41.如实施例39所述的载体，其中该突变型Epo受体与SEQ ID NO:6具有至少90％序列同一性。
实施例42.如实施例1至41中任一项所述的载体，其中该载体是逆转录病毒。
实施例43.如实施例1至42中任一项所述的载体，其中该载体是鼠干细胞病毒(MSCV)逆转录病毒载体。
实施例44.如实施例1至43中任一项所述的载体，其中该载体进一步编码荧光蛋白。
实施例45.如实施例1至44中任一项所述的载体，其中该载体编码内部核糖体进入位点(IRES)。
实施例46.如实施例1至45中任一项所述的载体，其中该载体进一步编码至少一种用于表达该核酸的调控元件。
实施例47.一种制备转基因哺乳动物宿主细胞的方法，该方法包括将如实施例1至46中任一项所述的载体引入哺乳动物宿主细胞中。
实施例48.如实施例47所述的方法，其中该哺乳动物宿主细胞是免疫细胞。
实施例49.如实施例48所述的方法，其中该免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞、单核细胞/巨噬细胞或树突细胞。
实施例50.如实施例48所述的方法，其中该免疫细胞是T细胞。
实施例51.如实施例50所述的方法，其中该T细胞是人外周血T淋巴细胞。
实施例52.如实施例50所述的方法，其中该T细胞是CD4+T细胞。
实施例53.如实施例50所述的方法，其中该T细胞是CD8+T细胞。
实施例54.如实施例50所述的方法，其中该T细胞进一步表达结合肿瘤抗原或病毒抗原的T细胞受体(TCR)。
实施例55.如实施例54所述的方法，其中该TCR是内源的。
实施例56.如实施例55所述的方法，其中该T细胞是肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，并且其中该方法进一步包括从肿瘤中提取该肿瘤浸润淋巴细胞并离体扩增该TIL。
实施例57.如实施例54所述的方法，其中该TCR是外源的。
实施例58.如实施例57所述的方法，其中该方法进一步包括将表达该外源TCR的载体引入该T细胞中。
实施例59.一种哺乳动物免疫细胞，其包含如实施例1至46中任一项所述的载体。
实施例60.如实施例59所述的哺乳动物免疫细胞，其中该哺乳动物免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞、单核细胞/巨噬细胞、或树突细胞。
实施例61.如实施例59所述的哺乳动物免疫细胞，其中该哺乳动物免疫细胞是T细胞。
实施例62.如实施例61所述的哺乳动物免疫细胞，其中该T细胞是人T细胞。
实施例63.如实施例61所述的哺乳动物免疫细胞，其中该T细胞是人外周血T淋巴细胞。
实施例64.一种减少哺乳动物中CD19+细胞的数量的方法，该方法包括将哺乳动物T细胞引入该受试者中，其中该哺乳动物T细胞包含如实施例1至46中任一项所述的载体。
实施例65.如实施例64所述的方法，其中该哺乳动物是人类。
实施例66.如实施例64至65中任一项所述的方法，其中该哺乳动物T细胞是从该哺乳动物分离的自体细胞。
实施例67.如实施例64至65中任一项所述的方法，其中该哺乳动物T细胞是从供体分离的同种异体细胞。
实施例68.如实施例64至67中任一项所述的方法，其进一步包括向该受试者施用Epo。
实施例69.如实施例64至68中任一项所述的方法，其进一步包括向该受试者施用IL-2。
实施例70.如实施例64至69中任一项所述的方法，其中减少该哺乳动物中CD19+细胞的数量治疗急性淋巴母细胞白血病(ALL)。
实施例71.如实施例1-46中任一项所述的载体在制备用于治疗或预防有需要的哺乳动物中的癌症、病毒感染、细菌感染、真菌感染、或寄生虫的药物中的用途。
实施例72.如实施例59至63中任一项所述的哺乳动物免疫细胞用于减少哺乳动物中CD19+细胞的数量的用途。
实施例73.一种如实施例1至46中任一项所述的载体，其用于在减少哺乳动物中CD19+细胞的数量的方法中使用。
实施例74.一种如实施例59至63中任一项所述的哺乳动物免疫细胞，其用于在减少哺乳动物中CD19+细胞的数量的方法中使用。
实施例75.一种制备转基因哺乳动物宿主细胞的方法，该方法包括将如实施例39至46中任一项所述的载体引入哺乳动物宿主细胞中。
实施例76.如实施例75所述的方法，其中该哺乳动物宿主细胞是免疫细胞。
实施例77.如实施例76所述的方法，其中该免疫细胞是T细胞。
实施例78.如实施例77所述的方法，其中该T细胞是肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
实施例79.如实施例76所述的方法，其中该免疫细胞是自然杀伤细胞。
实施例80.一种哺乳动物免疫细胞，其包含如实施例39至46中任一项所述的载体。
实施例81.如实施例80所述的哺乳动物免疫细胞，其中该哺乳动物免疫细胞是T细胞、自然杀伤(NK)细胞、单核/巨噬细胞、或树突细胞。
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序列
SEQ ID NO:1：Epo受体(EpoR)cDNA：
Figure BDA0002948424530000351
Figure BDA0002948424530000361
SEQ ID NO:2：Epo受体(EpoR)氨基酸：
Figure BDA0002948424530000362
SEQ ID NO:3：带有Flag标签cDNA的EpoR：
Figure BDA0002948424530000371
SEQ ID NO:4：带有Flag标签氨基酸的EpoR：
Figure BDA0002948424530000381
SEQ ID NO:5：突变型EpoR(EpoRm)cDNA：
Figure BDA0002948424530000382
Figure BDA0002948424530000391
SEQ ID NO:6：突变型EpoR(EpoRm)氨基酸：
Figure BDA0002948424530000392
SEQ ID NO:7：具有Flag标签cDNA的EpoRm：
Figure BDA0002948424530000393
Figure BDA0002948424530000401
SEQ ID NO:8：带有Flag标签氨基酸的EpoRm：
Figure BDA0002948424530000402
SEQ ID NO:9：抗CD19-41BB-CD3ζCAR cDNA：
Figure BDA0002948424530000403
Figure BDA0002948424530000411
SEQ ID NO:10：抗CD19-41BB-CD3ζCAR氨基酸：
Figure BDA0002948424530000412
SEQ ID NO:11：EpoRm-2A-CAR cDNA：
Figure BDA0002948424530000421
Figure BDA0002948424530000431
SEQ ID NO:12：EpoRm-2A-CAR氨基酸：
Figure BDA0002948424530000432
Figure BDA0002948424530000441
SEQ ID NO:13：P2A cDNA：
Figure BDA0002948424530000442
SEQ ID NO:14：P2A氨基酸：GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
SEQ ID NO:15：T2AcDNA：
Figure BDA0002948424530000443
SEQ ID NO:16：T2A氨基酸：GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP
SEQ ID NO:17：E2AcDNA：
Figure BDA0002948424530000444
SEQ ID NO:18：E2A氨基酸：GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO:19：F2AcDNA：
Figure BDA0002948424530000445
SEQ ID NO:20：F2A氨基酸：GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO:21：CD8α信号肽cDNA：
Figure BDA0002948424530000446
SEQ ID NO:22：CD8α信号肽氨基酸：
MALPVTALLLPLALLLHAARP
通过引用并入；等同形式
所有专利、公开的申请以及本文引用的参考文献的传授内容都通过引用以其全文并入。
虽然已经具体显示和描述了示例实施例，但是本领域技术人员将理解，可在不脱离由所附权利要求涵盖的实施例的范围的情况下在其中做出在形式和细节方面的各种改变。
序列表
<110> 新加坡国立大学（NATIONAL UNIVERSITY OF SINGAPORE）
<120> 特异性刺激经基因修饰免疫细胞的存活和扩增的方法
<130> 4459.1151-001 PCT
<140>
<141>
<150> 62/724,488
<151> 2018-08-29
<160> 27
<170> PatentIn 3.5 版
<210> 1
<211> 1551
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成Epo受体（EpoR）cDNA序列
<400> 1
ccggaattcg ccaccatgga ccacctcggg gcgtccctct ggccccaggt cggctccctt 60
tgtctcctgc tcgctggggc cgcctgggcg cccccgccta acctcccgga ccccaagttc 120
gagagcaaag cggccttgct ggcggcccgg gggcccgaag agcttctgtg cttcaccgag 180
cggttggagg acttggtgtg tttctgggag gaagcggcga gcgctggggt gggcccgggc 240
aactacagct tctcctacca gttagaagat gagccatgga agctgtgtcg cctgcaccag 300
gctcccacgg ctcgtggtgc ggtgcgcttc tggtgttcgc tgcctacagc cgacacgtcg 360
agcttcgtgc ccctagagtt gcgcgtcaca gcagcctccg gcgctccgcg atatcaccgt 420
gtcatccaca tcaatgaagt agtgctccta gacgcccccg tggggctggt ggcgcggttg 480
gctgacgaga gcggccacgt agtgttgcgc tggctcccgc cgcctgagac acccatgacg 540
tctcacatcc gctacgaggt ggacgtctcg gccggcaacg gcgcagggag cgtacagagg 600
gtggagatcc tggagggccg caccgagtgt gtgctgagca acctgcgggg ccggacgcgc 660
tacaccttcg ccgtccgcgc gcgtatggct gagccgagct tcggcggctt ctggagcgcc 720
tggtcggagc ctgtgtcgct gctgacgcct agcgacctgg accccctcat cctgacgctc 780
tccctcatcc tcgtggtcat cctggtgctg ctgaccgtgc tcgcgctgct ctcccaccgc 840
cgggctctga agcagaagat ctggcctggc atcccgagcc cagagagcga gtttgaaggc 900
ctcttcacca cccacaaggg taacttccag ctgtggctgt accagaatga tggctgcctg 960
tggtggagcc cctgcacccc cttcacggag gacccacctg cttccctgga agtcctctca 1020
gagcgctgct gggggacgat gcaggcagtg gagccgggga cagatgatga gggccccctg 1080
ctggagccag tgggcagtga gcatgcccag gatacctatc tggtgctgga caaatggttg 1140
ctgccccgga acccgcccag tgaggacctc ccagggcctg gtggcagtgt ggacatagtg 1200
gccatggatg aaggctcaga agcatcctcc tgctcatctg ctttggcctc gaagcccagc 1260
ccagagggag cctctgctgc cagctttgag tacactatcc tggaccccag ctcccagctc 1320
ttgcgtccat ggacactgtg ccctgagctg ccccctaccc caccccacct aaagtacctg 1380
taccttgtgg tatctgactc tggcatctca actgactaca gctcagggga ctcccaggga 1440
gcccaagggg gcttatccga tggcccctac tccaaccctt atgagaacag ccttatccca 1500
gccgctgagc ctctgccccc cagctatgtg gcttgctctt agctcgagcg g 1551
<210> 2
<211> 508
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成Epo受体（EpoR）氨基酸序列
<400> 2
Met Asp His Leu Gly Ala Ser Leu Trp Pro Gln Val Gly Ser Leu Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Gly Ala Ala Trp Ala Pro Pro Pro Asn Leu Pro Asp
20 25 30
Pro Lys Phe Glu Ser Lys Ala Ala Leu Leu Ala Ala Arg Gly Pro Glu
35 40 45
Glu Leu Leu Cys Phe Thr Glu Arg Leu Glu Asp Leu Val Cys Phe Trp
50 55 60
Glu Glu Ala Ala Ser Ala Gly Val Gly Pro Gly Asn Tyr Ser Phe Ser
65 70 75 80
Tyr Gln Leu Glu Asp Glu Pro Trp Lys Leu Cys Arg Leu His Gln Ala
85 90 95
Pro Thr Ala Arg Gly Ala Val Arg Phe Trp Cys Ser Leu Pro Thr Ala
100 105 110
Asp Thr Ser Ser Phe Val Pro Leu Glu Leu Arg Val Thr Ala Ala Ser
115 120 125
Gly Ala Pro Arg Tyr His Arg Val Ile His Ile Asn Glu Val Val Leu
130 135 140
Leu Asp Ala Pro Val Gly Leu Val Ala Arg Leu Ala Asp Glu Ser Gly
145 150 155 160
His Val Val Leu Arg Trp Leu Pro Pro Pro Glu Thr Pro Met Thr Ser
165 170 175
His Ile Arg Tyr Glu Val Asp Val Ser Ala Gly Asn Gly Ala Gly Ser
180 185 190
Val Gln Arg Val Glu Ile Leu Glu Gly Arg Thr Glu Cys Val Leu Ser
195 200 205
Asn Leu Arg Gly Arg Thr Arg Tyr Thr Phe Ala Val Arg Ala Arg Met
210 215 220
Ala Glu Pro Ser Phe Gly Gly Phe Trp Ser Ala Trp Ser Glu Pro Val
225 230 235 240
Ser Leu Leu Thr Pro Ser Asp Leu Asp Pro Leu Ile Leu Thr Leu Ser
245 250 255
Leu Ile Leu Val Val Ile Leu Val Leu Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu
260 265 270
Ser His Arg Arg Ala Leu Lys Gln Lys Ile Trp Pro Gly Ile Pro Ser
275 280 285
Pro Glu Ser Glu Phe Glu Gly Leu Phe Thr Thr His Lys Gly Asn Phe
290 295 300
Gln Leu Trp Leu Tyr Gln Asn Asp Gly Cys Leu Trp Trp Ser Pro Cys
305 310 315 320
Thr Pro Phe Thr Glu Asp Pro Pro Ala Ser Leu Glu Val Leu Ser Glu
325 330 335
Arg Cys Trp Gly Thr Met Gln Ala Val Glu Pro Gly Thr Asp Asp Glu
340 345 350
Gly Pro Leu Leu Glu Pro Val Gly Ser Glu His Ala Gln Asp Thr Tyr
355 360 365
Leu Val Leu Asp Lys Trp Leu Leu Pro Arg Asn Pro Pro Ser Glu Asp
370 375 380
Leu Pro Gly Pro Gly Gly Ser Val Asp Ile Val Ala Met Asp Glu Gly
385 390 395 400
Ser Glu Ala Ser Ser Cys Ser Ser Ala Leu Ala Ser Lys Pro Ser Pro
405 410 415
Glu Gly Ala Ser Ala Ala Ser Phe Glu Tyr Thr Ile Leu Asp Pro Ser
420 425 430
Ser Gln Leu Leu Arg Pro Trp Thr Leu Cys Pro Glu Leu Pro Pro Thr
435 440 445
Pro Pro His Leu Lys Tyr Leu Tyr Leu Val Val Ser Asp Ser Gly Ile
450 455 460
Ser Thr Asp Tyr Ser Ser Gly Asp Ser Gln Gly Ala Gln Gly Gly Leu
465 470 475 480
Ser Asp Gly Pro Tyr Ser Asn Pro Tyr Glu Asn Ser Leu Ile Pro Ala
485 490 495
Ala Glu Pro Leu Pro Pro Ser Tyr Val Ala Cys Ser
500 505
<210> 3
<211> 1581
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：带有Flag标签cDNA序列的合成EpoR
<400> 3
atatatgaat tcgccaccat ggaccacctc ggggcgtccc tctggcccca ggtcggctcc 60
ctttgtctcc tgctcgctgg ggccgcctgg gcgcccccgc ctaacctccc ggaccccaag 120
ttcgagagca aagcggcctt gctggcggcc cgggggcccg aagagcttct gtgcttcacc 180
gagcggttgg aggacttggt gtgtttctgg gaggaagcgg cgagcgctgg ggtgggcccg 240
ggcaactaca gcttctccta ccagttagaa gatgagccat ggaagctgtg tcgcctgcac 300
caggctccca cggctcgtgg tgcggtgcgc ttctggtgtt cgctgcctac agccgacacg 360
tcgagcttcg tgcccctaga gttgcgcgtc acagcagcct ccggcgctcc gcgatatcac 420
cgtgtcatcc acatcaatga agtagtgctc ctagacgccc ccgtggggct ggtggcgcgg 480
ttggctgacg agagcggcca cgtagtgttg cgctggctcc cgccgcctga gacacccatg 540
acgtctcaca tccgctacga ggtggacgtc tcggccggca acggcgcagg gagcgtacag 600
agggtggaga tcctggaggg ccgcaccgag tgtgtgctga gcaacctgcg gggccggacg 660
cgctacacct tcgccgtccg cgcgcgtatg gctgagccga gcttcggcgg cttctggagc 720
gcctggtcgg agcctgtgtc gctgctgacg cctagcgacc tggaccccct catcctgacg 780
ctctccctca tcctcgtggt catcctggtg ctgctgaccg tgctcgcgct gctctcccac 840
cgccgggctc tgaagcagaa gatctggcct ggcatcccga gcccagagag cgagtttgaa 900
ggcctcttca ccacccacaa gggtaacttc cagctgtggc tgtaccagaa tgatggctgc 960
ctgtggtgga gcccctgcac ccccttcacg gaggacccac ctgcttccct ggaagtcctc 1020
tcagagcgct gctgggggac gatgcaggca gtggagccgg ggacagatga tgagggcccc 1080
ctgctggagc cagtgggcag tgagcatgcc caggatacct atctggtgct ggacaaatgg 1140
ttgctgcccc ggaacccgcc cagtgaggac ctcccagggc ctggtggcag tgtggacata 1200
gtggccatgg atgaaggctc agaagcatcc tcctgctcat ctgctttggc ctcgaagccc 1260
agcccagagg gagcctctgc tgccagcttt gagtacacta tcctggaccc cagctcccag 1320
ctcttgcgtc catggacact gtgccctgag ctgcccccta ccccacccca cctaaagtac 1380
ctgtaccttg tggtatctga ctctggcatc tcaactgact acagctcagg ggactcccag 1440
ggagcccaag ggggcttatc cgatggcccc tactccaacc cttatgagaa cagccttatc 1500
ccagccgctg agcctctgcc ccccagctat gtggcttgct ctgactacaa agacgatgac 1560
gacaagtagc tcgagtatat a 1581
<210> 4
<211> 516
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：带有Flag标签氨基酸序列的合成EpoR
<400> 4
Met Asp His Leu Gly Ala Ser Leu Trp Pro Gln Val Gly Ser Leu Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Gly Ala Ala Trp Ala Pro Pro Pro Asn Leu Pro Asp
20 25 30
Pro Lys Phe Glu Ser Lys Ala Ala Leu Leu Ala Ala Arg Gly Pro Glu
35 40 45
Glu Leu Leu Cys Phe Thr Glu Arg Leu Glu Asp Leu Val Cys Phe Trp
50 55 60
Glu Glu Ala Ala Ser Ala Gly Val Gly Pro Gly Asn Tyr Ser Phe Ser
65 70 75 80
Tyr Gln Leu Glu Asp Glu Pro Trp Lys Leu Cys Arg Leu His Gln Ala
85 90 95
Pro Thr Ala Arg Gly Ala Val Arg Phe Trp Cys Ser Leu Pro Thr Ala
100 105 110
Asp Thr Ser Ser Phe Val Pro Leu Glu Leu Arg Val Thr Ala Ala Ser
115 120 125
Gly Ala Pro Arg Tyr His Arg Val Ile His Ile Asn Glu Val Val Leu
130 135 140
Leu Asp Ala Pro Val Gly Leu Val Ala Arg Leu Ala Asp Glu Ser Gly
145 150 155 160
His Val Val Leu Arg Trp Leu Pro Pro Pro Glu Thr Pro Met Thr Ser
165 170 175
His Ile Arg Tyr Glu Val Asp Val Ser Ala Gly Asn Gly Ala Gly Ser
180 185 190
Val Gln Arg Val Glu Ile Leu Glu Gly Arg Thr Glu Cys Val Leu Ser
195 200 205
Asn Leu Arg Gly Arg Thr Arg Tyr Thr Phe Ala Val Arg Ala Arg Met
210 215 220
Ala Glu Pro Ser Phe Gly Gly Phe Trp Ser Ala Trp Ser Glu Pro Val
225 230 235 240
Ser Leu Leu Thr Pro Ser Asp Leu Asp Pro Leu Ile Leu Thr Leu Ser
245 250 255
Leu Ile Leu Val Val Ile Leu Val Leu Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu
260 265 270
Ser His Arg Arg Ala Leu Lys Gln Lys Ile Trp Pro Gly Ile Pro Ser
275 280 285
Pro Glu Ser Glu Phe Glu Gly Leu Phe Thr Thr His Lys Gly Asn Phe
290 295 300
Gln Leu Trp Leu Tyr Gln Asn Asp Gly Cys Leu Trp Trp Ser Pro Cys
305 310 315 320
Thr Pro Phe Thr Glu Asp Pro Pro Ala Ser Leu Glu Val Leu Ser Glu
325 330 335
Arg Cys Trp Gly Thr Met Gln Ala Val Glu Pro Gly Thr Asp Asp Glu
340 345 350
Gly Pro Leu Leu Glu Pro Val Gly Ser Glu His Ala Gln Asp Thr Tyr
355 360 365
Leu Val Leu Asp Lys Trp Leu Leu Pro Arg Asn Pro Pro Ser Glu Asp
370 375 380
Leu Pro Gly Pro Gly Gly Ser Val Asp Ile Val Ala Met Asp Glu Gly
385 390 395 400
Ser Glu Ala Ser Ser Cys Ser Ser Ala Leu Ala Ser Lys Pro Ser Pro
405 410 415
Glu Gly Ala Ser Ala Ala Ser Phe Glu Tyr Thr Ile Leu Asp Pro Ser
420 425 430
Ser Gln Leu Leu Arg Pro Trp Thr Leu Cys Pro Glu Leu Pro Pro Thr
435 440 445
Pro Pro His Leu Lys Tyr Leu Tyr Leu Val Val Ser Asp Ser Gly Ile
450 455 460
Ser Thr Asp Tyr Ser Ser Gly Asp Ser Gln Gly Ala Gln Gly Gly Leu
465 470 475 480
Ser Asp Gly Pro Tyr Ser Asn Pro Tyr Glu Asn Ser Leu Ile Pro Ala
485 490 495
Ala Glu Pro Leu Pro Pro Ser Tyr Val Ala Cys Ser Asp Tyr Lys Asp
500 505 510
Asp Asp Asp Lys
515
<210> 5
<211> 1551
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成突变型EpoR（EpoRm）cDNA序列
<400> 5
ccggaattcg ccaccatgga ccacctcggg gcgtccctct ggccccaggt cggctccctt 60
tgtctcctgc tcgctggggc cgcctgggcg cccccgccta acctcccgga ccccaagttc 120
gagagcaaag cggccttgct ggcggcccgg gggcccgaag agcttctgtg cttcaccgag 180
cggttggagg acttggtgtg tttctgggag gaagcggcga gcgctggggt gggcccgggc 240
aactacagct tctcctacca gttagaagat gagccatgga agctgtgtcg cctgcaccag 300
gctcccacgg ctcgtggtgc ggtgcgcttc tggtgttcgc tgcctacagc cgacacgtcg 360
agcttcgtgc ccctagagtt gcgcgtcaca gcagcctccg gcgctccgcg atatcaccgt 420
gtcatccaca tcaatgaagt agtgctccta gacgcccccg tggggctggt ggcgcggttg 480
gctgacgaga gcggccacgt agtgttgcgc tggctcccgc cgcctgagac acccatgacg 540
tctcacatcc gctacgaggt ggacgtctcg gccggcaacg gcgcagggag cgtacagagg 600
gtggagatcc tggagggccg caccgagtgt gtgctgagca acctgcgggg ccggacgcgc 660
tacaccttcg ccgtccgcgc gcgtatggct gagccgagct tcggcggctt ctggagcgcc 720
tggtcggagc ctgtgtcgct gctgacgcct agcgacctgg accccctcat cctgacgctc 780
tccctcatcc tcgtggtcat cctggtgctg ctgaccgtgc tcgcgctgct ctcccaccgc 840
cgggctctga agcagaagat ctggcctggc atcccgagcc cagagagcga gtttgaaggc 900
ctcttcacca cccacaaggg taacttccag ctgtggctgt accagaatga tggctgcctg 960
tggtggagcc cctgcacccc cttcacggag gacccacctg cttccctgga agtcctctca 1020
gagcgctgct gggggacgat gcaggcagtg gagccgggga cagatgatga gggccccctg 1080
ctggagccag tgggcagtga gcatgcccag gatacctatc tggtgctgga caaatggttg 1140
ctgccccgga acccgcccag tgaggacctc ccagggcctg gtggcagtgt ggacatagtg 1200
gccatggatg aaggctcaga agcatcctcc tgctcatctg ctttggcctc gaagcccagc 1260
ccagagggag cctctgctgc cagctttgag tacactatcc tggaccccag ctcccagctc 1320
ttgcgtccat agacactgtg ccctgagctg ccccctaccc caccccacct aaagtacctg 1380
taccttgtgg tatctgactc tggcatctca actgactaca gctcagggga ctcccaggga 1440
gcccaagggg gcttatccga tggcccctac tccaaccctt atgagaacag ccttatccca 1500
gccgctgagc ctctgccccc cagctatgtg gcttgctctt agctcgagcg g 1551
<210> 6
<211> 438
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成突变型EpoR（EpoRm）氨基酸序列
<400> 6
Met Asp His Leu Gly Ala Ser Leu Trp Pro Gln Val Gly Ser Leu Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Gly Ala Ala Trp Ala Pro Pro Pro Asn Leu Pro Asp
20 25 30
Pro Lys Phe Glu Ser Lys Ala Ala Leu Leu Ala Ala Arg Gly Pro Glu
35 40 45
Glu Leu Leu Cys Phe Thr Glu Arg Leu Glu Asp Leu Val Cys Phe Trp
50 55 60
Glu Glu Ala Ala Ser Ala Gly Val Gly Pro Gly Asn Tyr Ser Phe Ser
65 70 75 80
Tyr Gln Leu Glu Asp Glu Pro Trp Lys Leu Cys Arg Leu His Gln Ala
85 90 95
Pro Thr Ala Arg Gly Ala Val Arg Phe Trp Cys Ser Leu Pro Thr Ala
100 105 110
Asp Thr Ser Ser Phe Val Pro Leu Glu Leu Arg Val Thr Ala Ala Ser
115 120 125
Gly Ala Pro Arg Tyr His Arg Val Ile His Ile Asn Glu Val Val Leu
130 135 140
Leu Asp Ala Pro Val Gly Leu Val Ala Arg Leu Ala Asp Glu Ser Gly
145 150 155 160
His Val Val Leu Arg Trp Leu Pro Pro Pro Glu Thr Pro Met Thr Ser
165 170 175
His Ile Arg Tyr Glu Val Asp Val Ser Ala Gly Asn Gly Ala Gly Ser
180 185 190
Val Gln Arg Val Glu Ile Leu Glu Gly Arg Thr Glu Cys Val Leu Ser
195 200 205
Asn Leu Arg Gly Arg Thr Arg Tyr Thr Phe Ala Val Arg Ala Arg Met
210 215 220
Ala Glu Pro Ser Phe Gly Gly Phe Trp Ser Ala Trp Ser Glu Pro Val
225 230 235 240
Ser Leu Leu Thr Pro Ser Asp Leu Asp Pro Leu Ile Leu Thr Leu Ser
245 250 255
Leu Ile Leu Val Val Ile Leu Val Leu Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu
260 265 270
Ser His Arg Arg Ala Leu Lys Gln Lys Ile Trp Pro Gly Ile Pro Ser
275 280 285
Pro Glu Ser Glu Phe Glu Gly Leu Phe Thr Thr His Lys Gly Asn Phe
290 295 300
Gln Leu Trp Leu Tyr Gln Asn Asp Gly Cys Leu Trp Trp Ser Pro Cys
305 310 315 320
Thr Pro Phe Thr Glu Asp Pro Pro Ala Ser Leu Glu Val Leu Ser Glu
325 330 335
Arg Cys Trp Gly Thr Met Gln Ala Val Glu Pro Gly Thr Asp Asp Glu
340 345 350
Gly Pro Leu Leu Glu Pro Val Gly Ser Glu His Ala Gln Asp Thr Tyr
355 360 365
Leu Val Leu Asp Lys Trp Leu Leu Pro Arg Asn Pro Pro Ser Glu Asp
370 375 380
Leu Pro Gly Pro Gly Gly Ser Val Asp Ile Val Ala Met Asp Glu Gly
385 390 395 400
Ser Glu Ala Ser Ser Cys Ser Ser Ala Leu Ala Ser Lys Pro Ser Pro
405 410 415
Glu Gly Ala Ser Ala Ala Ser Phe Glu Tyr Thr Ile Leu Asp Pro Ser
420 425 430
Ser Gln Leu Leu Arg Pro
435
<210> 7
<211> 1371
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：带有Flag标签cDNA序列的合成EpoRm
<400> 7
atatatgaat tcgccaccat ggaccacctc ggggcgtccc tctggcccca ggtcggctcc 60
ctttgtctcc tgctcgctgg ggccgcctgg gcgcccccgc ctaacctccc ggaccccaag 120
ttcgagagca aagcggcctt gctggcggcc cgggggcccg aagagcttct gtgcttcacc 180
gagcggttgg aggacttggt gtgtttctgg gaggaagcgg cgagcgctgg ggtgggcccg 240
ggcaactaca gcttctccta ccagttagaa gatgagccat ggaagctgtg tcgcctgcac 300
caggctccca cggctcgtgg tgcggtgcgc ttctggtgtt cgctgcctac agccgacacg 360
tcgagcttcg tgcccctaga gttgcgcgtc acagcagcct ccggcgctcc gcgatatcac 420
cgtgtcatcc acatcaatga agtagtgctc ctagacgccc ccgtggggct ggtggcgcgg 480
ttggctgacg agagcggcca cgtagtgttg cgctggctcc cgccgcctga gacacccatg 540
acgtctcaca tccgctacga ggtggacgtc tcggccggca acggcgcagg gagcgtacag 600
agggtggaga tcctggaggg ccgcaccgag tgtgtgctga gcaacctgcg gggccggacg 660
cgctacacct tcgccgtccg cgcgcgtatg gctgagccga gcttcggcgg cttctggagc 720
gcctggtcgg agcctgtgtc gctgctgacg cctagcgacc tggaccccct catcctgacg 780
ctctccctca tcctcgtggt catcctggtg ctgctgaccg tgctcgcgct gctctcccac 840
cgccgggctc tgaagcagaa gatctggcct ggcatcccga gcccagagag cgagtttgaa 900
ggcctcttca ccacccacaa gggtaacttc cagctgtggc tgtaccagaa tgatggctgc 960
ctgtggtgga gcccctgcac ccccttcacg gaggacccac ctgcttccct ggaagtcctc 1020
tcagagcgct gctgggggac gatgcaggca gtggagccgg ggacagatga tgagggcccc 1080
ctgctggagc cagtgggcag tgagcatgcc caggatacct atctggtgct ggacaaatgg 1140
ttgctgcccc ggaacccgcc cagtgaggac ctcccagggc ctggtggcag tgtggacata 1200
gtggccatgg atgaaggctc agaagcatcc tcctgctcat ctgctttggc ctcgaagccc 1260
agcccagagg gagcctctgc tgccagcttt gagtacacta tcctggaccc cagctcccag 1320
ctcttgcgtc cagactacaa agacgatgac gacaagtagc tcgagtatat a 1371
<210> 8
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：带有Flag标签氨基酸序列的合成EpoRm
<400> 8
Met Asp His Leu Gly Ala Ser Leu Trp Pro Gln Val Gly Ser Leu Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Gly Ala Ala Trp Ala Pro Pro Pro Asn Leu Pro Asp
20 25 30
Pro Lys Phe Glu Ser Lys Ala Ala Leu Leu Ala Ala Arg Gly Pro Glu
35 40 45
Glu Leu Leu Cys Phe Thr Glu Arg Leu Glu Asp Leu Val Cys Phe Trp
50 55 60
Glu Glu Ala Ala Ser Ala Gly Val Gly Pro Gly Asn Tyr Ser Phe Ser
65 70 75 80
Tyr Gln Leu Glu Asp Glu Pro Trp Lys Leu Cys Arg Leu His Gln Ala
85 90 95
Pro Thr Ala Arg Gly Ala Val Arg Phe Trp Cys Ser Leu Pro Thr Ala
100 105 110
Asp Thr Ser Ser Phe Val Pro Leu Glu Leu Arg Val Thr Ala Ala Ser
115 120 125
Gly Ala Pro Arg Tyr His Arg Val Ile His Ile Asn Glu Val Val Leu
130 135 140
Leu Asp Ala Pro Val Gly Leu Val Ala Arg Leu Ala Asp Glu Ser Gly
145 150 155 160
His Val Val Leu Arg Trp Leu Pro Pro Pro Glu Thr Pro Met Thr Ser
165 170 175
His Ile Arg Tyr Glu Val Asp Val Ser Ala Gly Asn Gly Ala Gly Ser
180 185 190
Val Gln Arg Val Glu Ile Leu Glu Gly Arg Thr Glu Cys Val Leu Ser
195 200 205
Asn Leu Arg Gly Arg Thr Arg Tyr Thr Phe Ala Val Arg Ala Arg Met
210 215 220
Ala Glu Pro Ser Phe Gly Gly Phe Trp Ser Ala Trp Ser Glu Pro Val
225 230 235 240
Ser Leu Leu Thr Pro Ser Asp Leu Asp Pro Leu Ile Leu Thr Leu Ser
245 250 255
Leu Ile Leu Val Val Ile Leu Val Leu Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu
260 265 270
Ser His Arg Arg Ala Leu Lys Gln Lys Ile Trp Pro Gly Ile Pro Ser
275 280 285
Pro Glu Ser Glu Phe Glu Gly Leu Phe Thr Thr His Lys Gly Asn Phe
290 295 300
Gln Leu Trp Leu Tyr Gln Asn Asp Gly Cys Leu Trp Trp Ser Pro Cys
305 310 315 320
Thr Pro Phe Thr Glu Asp Pro Pro Ala Ser Leu Glu Val Leu Ser Glu
325 330 335
Arg Cys Trp Gly Thr Met Gln Ala Val Glu Pro Gly Thr Asp Asp Glu
340 345 350
Gly Pro Leu Leu Glu Pro Val Gly Ser Glu His Ala Gln Asp Thr Tyr
355 360 365
Leu Val Leu Asp Lys Trp Leu Leu Pro Arg Asn Pro Pro Ser Glu Asp
370 375 380
Leu Pro Gly Pro Gly Gly Ser Val Asp Ile Val Ala Met Asp Glu Gly
385 390 395 400
Ser Glu Ala Ser Ser Cys Ser Ser Ala Leu Ala Ser Lys Pro Ser Pro
405 410 415
Glu Gly Ala Ser Ala Ala Ser Phe Glu Tyr Thr Ile Leu Asp Pro Ser
420 425 430
Ser Gln Leu Leu Arg Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
435 440 445
<210> 9
<211> 1545
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成抗CD19-41BB-CD3-ζ CAR cDNA序列
<400> 9
gaattcggct tccaccatgg ccttaccagt gaccgccttg ctcctgccgc tggccttgct 60
gctccacgcc gccaggccgg acatccagat gacacagact acatcctccc tgtctgcctc 120
tctgggagac agagtcacca tcagttgcag ggcaagtcag gacattagta aatatttaaa 180
ttggtatcag cagaaaccag atggaactgt taaactcctg atctaccata catcaagatt 240
acactcagga gtcccatcaa ggttcagtgg cagtgggtct ggaacagatt attctctcac 300
cattagcaac ctggagcaag aagatattgc cacttacttt tgccaacagg gtaatacgct 360
tccgtacacg ttcggagggg ggaccaagct ggagatcaca ggtggcggtg gctcgggcgg 420
tggtgggtcg ggtggcggcg gatctgaggt gaaactgcag gagtcaggac ctggcctggt 480
ggcgccctca cagagcctgt ccgtcacatg cactgtctca ggggtctcat tacccgacta 540
tggtgtaagc tggattcgcc agcctccacg aaagggtctg gagtggctgg gagtaatatg 600
gggtagtgaa accacatact ataattcagc tctcaaatcc agactgacca tcatcaagga 660
caactccaag agccaagttt tcttaaaaat gaacagtctg caaactgatg acacagccat 720
ttactactgt gccaaacatt attactacgg tggtagctat gctatggact actggggcca 780
aggaacctca gtcaccgtct cctcaaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc 840
gcccaccatc gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg 900
gggcgcagtg cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat atctacatct gggcgccctt 960
ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc accctttact gcaaacgggg 1020
cagaaagaaa ctcctgtata tattcaaaca accatttatg agaccagtac aaactactca 1080
agaggaagat ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa gaaggaggat gtgaactgag 1140
agtgaagttc agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag cagggccaga accagctcta 1200
taacgagctc aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg 1260
ggaccctgag atggggggaa agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga 1320
actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg 1380
gaggggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta 1440
cgacgccctt cacatgcagg ccctgccccc tcgctaacag ccaggggatt tcaccactca 1500
aaggccagac ctgcagacgc ccagattatg agacacactc gagcc 1545
<210> 10
<211> 486
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成抗CD19-41BB-CD3-ζ CAR氨基酸序列
<400> 10
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr
50 55 60
Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly
100 105 110
Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
130 135 140
Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser
145 150 155 160
Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly
165 170 175
Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly
180 185 190
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
195 200 205
Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys
210 215 220
Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys
225 230 235 240
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
275 280 285
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
290 295 300
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
305 310 315 320
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg
325 330 335
Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
340 345 350
Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
355 360 365
Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
370 375 380
Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
385 390 395 400
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
405 410 415
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
420 425 430
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
435 440 445
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
450 455 460
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
465 470 475 480
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 11
<211> 2844
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成EpoRm-2A-CAR cDNA序列
<400> 11
gccaccatgg accacctcgg ggcgtccctc tggccccagg tcggctccct ttgtctcctg 60
ctcgctgggg ccgcctgggc gcccccgcct aacctcccgg accccaagtt cgagagcaaa 120
gcggccttgc tggcggcccg ggggcccgaa gagcttctgt gcttcaccga gcggttggag 180
gacttggtgt gtttctggga ggaagcggcg agcgctgggg tgggcccggg caactacagc 240
ttctcctacc agttagaaga tgagccatgg aagctgtgtc gcctgcacca ggctcccacg 300
gctcgtggtg cggtgcgctt ctggtgttcg ctgcctacag ccgacacgtc gagcttcgtg 360
cccctagagt tgcgcgtcac agcagcctcc ggcgctccgc gatatcaccg tgtcatccac 420
atcaatgaag tagtgctcct agacgccccc gtggggctgg tggcgcggtt ggctgacgag 480
agcggccacg tagtgttgcg ctggctcccg ccgcctgaga cacccatgac gtctcacatc 540
cgctacgagg tggacgtctc ggccggcaac ggcgcaggga gcgtacagag ggtggagatc 600
ctggagggcc gcaccgagtg tgtgctgagc aacctgcggg gccggacgcg ctacaccttc 660
gccgtccgcg cgcgtatggc tgagccgagc ttcggcggct tctggagcgc ctggtcggag 720
cctgtgtcgc tgctgacgcc tagcgacctg gaccccctca tcctgacgct ctccctcatc 780
ctcgtggtca tcctggtgct gctgaccgtg ctcgcgctgc tctcccaccg ccgggctctg 840
aagcagaaga tctggcctgg catcccgagc ccagagagcg agtttgaagg cctcttcacc 900
acccacaagg gtaacttcca gctgtggctg taccagaatg atggctgcct gtggtggagc 960
ccctgcaccc ccttcacgga ggacccacct gcttccctgg aagtcctctc agagcgctgc 1020
tgggggacga tgcaggcagt ggagccgggg acagatgatg agggccccct gctggagcca 1080
gtgggcagtg agcatgccca ggatacctat ctggtgctgg acaaatggtt gctgccccgg 1140
aacccgccca gtgaggacct cccagggcct ggtggcagtg tggacatagt ggccatggat 1200
gaaggctcag aagcatcctc ctgctcatct gctttggcct cgaagcccag cccagaggga 1260
gcctctgctg ccagctttga gtacactatc ctggacccca gctcccagct cttgcgtcca 1320
ggatcaggcg agggcagagg aagtctgcta acatgcggtg acgtcgagga gaatcctggc 1380
ccaatggcct taccagtgac cgccttgctc ctgccgctgg ccttgctgct ccacgccgcc 1440
aggccggaca tccagatgac acagactaca tcctccctgt ctgcctctct gggagacaga 1500
gtcaccatca gttgcagggc aagtcaggac attagtaaat atttaaattg gtatcagcag 1560
aaaccagatg gaactgttaa actcctgatc taccatacat caagattaca ctcaggagtc 1620
ccatcaaggt tcagtggcag tgggtctgga acagattatt ctctcaccat tagcaacctg 1680
gagcaagaag atattgccac ttacttttgc caacagggta atacgcttcc gtacacgttc 1740
ggagggggga ccaagctgga gatcacaggt ggcggtggct cgggcggtgg tgggtcgggt 1800
ggcggcggat ctgaggtgaa actgcaggag tcaggacctg gcctggtggc gccctcacag 1860
agcctgtccg tcacatgcac tgtctcaggg gtctcattac ccgactatgg tgtaagctgg 1920
attcgccagc ctccacgaaa gggtctggag tggctgggag taatatgggg tagtgaaacc 1980
acatactata attcagctct caaatccaga ctgaccatca tcaaggacaa ctccaagagc 2040
caagttttct taaaaatgaa cagtctgcaa actgatgaca cagccattta ctactgtgcc 2100
aaacattatt actacggtgg tagctatgct atggactact ggggccaagg aacctcagtc 2160
accgtctcct caaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg 2220
tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac 2280
acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt 2340
ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc ctttactgca aacggggcag aaagaaactc 2400
ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc 2460
tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc 2520
aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat 2580
ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 2640
gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat 2700
aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg 2760
cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 2820
atgcaggccc tgccccctcg ctaa 2844
<210> 12
<211> 945
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成EpoRm-2A-CAR氨基酸序列
<400> 12
Met Asp His Leu Gly Ala Ser Leu Trp Pro Gln Val Gly Ser Leu Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Gly Ala Ala Trp Ala Pro Pro Pro Asn Leu Pro Asp
20 25 30
Pro Lys Phe Glu Ser Lys Ala Ala Leu Leu Ala Ala Arg Gly Pro Glu
35 40 45
Glu Leu Leu Cys Phe Thr Glu Arg Leu Glu Asp Leu Val Cys Phe Trp
50 55 60
Glu Glu Ala Ala Ser Ala Gly Val Gly Pro Gly Asn Tyr Ser Phe Ser
65 70 75 80
Tyr Gln Leu Glu Asp Glu Pro Trp Lys Leu Cys Arg Leu His Gln Ala
85 90 95
Pro Thr Ala Arg Gly Ala Val Arg Phe Trp Cys Ser Leu Pro Thr Ala
100 105 110
Asp Thr Ser Ser Phe Val Pro Leu Glu Leu Arg Val Thr Ala Ala Ser
115 120 125
Gly Ala Pro Arg Tyr His Arg Val Ile His Ile Asn Glu Val Val Leu
130 135 140
Leu Asp Ala Pro Val Gly Leu Val Ala Arg Leu Ala Asp Glu Ser Gly
145 150 155 160
His Val Val Leu Arg Trp Leu Pro Pro Pro Glu Thr Pro Met Thr Ser
165 170 175
His Ile Arg Tyr Glu Val Asp Val Ser Ala Gly Asn Gly Ala Gly Ser
180 185 190
Val Gln Arg Val Glu Ile Leu Glu Gly Arg Thr Glu Cys Val Leu Ser
195 200 205
Asn Leu Arg Gly Arg Thr Arg Tyr Thr Phe Ala Val Arg Ala Arg Met
210 215 220
Ala Glu Pro Ser Phe Gly Gly Phe Trp Ser Ala Trp Ser Glu Pro Val
225 230 235 240
Ser Leu Leu Thr Pro Ser Asp Leu Asp Pro Leu Ile Leu Thr Leu Ser
245 250 255
Leu Ile Leu Val Val Ile Leu Val Leu Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu
260 265 270
Ser His Arg Arg Ala Leu Lys Gln Lys Ile Trp Pro Gly Ile Pro Ser
275 280 285
Pro Glu Ser Glu Phe Glu Gly Leu Phe Thr Thr His Lys Gly Asn Phe
290 295 300
Gln Leu Trp Leu Tyr Gln Asn Asp Gly Cys Leu Trp Trp Ser Pro Cys
305 310 315 320
Thr Pro Phe Thr Glu Asp Pro Pro Ala Ser Leu Glu Val Leu Ser Glu
325 330 335
Arg Cys Trp Gly Thr Met Gln Ala Val Glu Pro Gly Thr Asp Asp Glu
340 345 350
Gly Pro Leu Leu Glu Pro Val Gly Ser Glu His Ala Gln Asp Thr Tyr
355 360 365
Leu Val Leu Asp Lys Trp Leu Leu Pro Arg Asn Pro Pro Ser Glu Asp
370 375 380
Leu Pro Gly Pro Gly Gly Ser Val Asp Ile Val Ala Met Asp Glu Gly
385 390 395 400
Ser Glu Ala Ser Ser Cys Ser Ser Ala Leu Ala Ser Lys Pro Ser Pro
405 410 415
Glu Gly Ala Ser Ala Ala Ser Phe Glu Tyr Thr Ile Leu Asp Pro Ser
420 425 430
Ser Gln Leu Leu Arg Pro Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu
435 440 445
Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Pro Val
450 455 460
Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro
465 470 475 480
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
485 490 495
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
500 505 510
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
515 520 525
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
530 535 540
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
545 550 555 560
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
565 570 575
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser
580 585 590
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu
595 600 605
Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys
610 615 620
Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg
625 630 635 640
Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser
645 650 655
Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile
660 665 670
Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln
675 680 685
Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly
690 695 700
Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val
705 710 715 720
Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
725 730 735
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
740 745 750
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
755 760 765
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
770 775 780
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr
785 790 795 800
Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu
805 810 815
Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
820 825 830
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
835 840 845
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
850 855 860
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
865 870 875 880
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
885 890 895
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
900 905 910
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
915 920 925
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
930 935 940
Arg
945
<210> 13
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成P2A cDNA序列
<400> 13
ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60
ggacct 66
<210> 14
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成P2A氨基酸序列
<400> 14
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 15
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成T2A cDNA序列
<400> 15
ggaagcggag agggcagagg aagtctgcta acatgcggtg acgtcgagga gaatcctgga 60
cct 63
<210> 16
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成T2A氨基酸序列
<400> 16
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 17
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成E2A cDNA序列
<400> 17
ggaagcggac agtgtactaa ttatgctctc ttgaaattgg ctggagatgt tgagagcaac 60
cctggacct 69
<210> 18
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成E2A氨基酸序列
<400> 18
Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 19
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成F2A cDNA序列
<400> 19
ggaagcggag tgaaacagac tttgaatttt gaccttctca agttggcggg agacgtggag 60
tccaaccctg gacct 75
<210> 20
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成F2A氨基酸序列
<400> 20
Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 21
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成CD8-α信号肽cDNA序列
<400> 21
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccg 63
<210> 22
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成CD8-α信号肽氨基酸序列
<400> 22
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 23
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 24
<211> 500
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(500)
<223> 该序列可涵盖1-100个"Gly Gly Gly Gly Ser"重复单元
<400> 24
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
180 185 190
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
195 200 205
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
245 250 255
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
260 265 270
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
275 280 285
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
290 295 300
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
305 310 315 320
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
325 330 335
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
340 345 350
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
355 360 365
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
370 375 380
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
385 390 395 400
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
405 410 415
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
420 425 430
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
435 440 445
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
465 470 475 480
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
485 490 495
Gly Gly Gly Ser
500
<210> 25
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述:合成肽
<400> 25
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 26
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述:合成多肽
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(100)
<223> 该序列可涵盖2-100个残基
<400> 26
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Gly
100
<210> 27
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述:合成肽
<400> 27
Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10 15

Claims (29)

1.一种载体，其包含编码以下的核酸：
a)促红细胞生成素(Epo)受体；
b)自裂解肽或内部核糖体进入位点；和
c)细胞表面受体。
2.如权利要求1所述的载体，其中该Epo受体与SEQ ID NO:2具有至少90％序列同一性。
3.如权利要求1所述的载体，其中该Epo受体是突变型Epo受体。
4.如权利要求3所述的载体，其中该核酸具有编码该Epo受体的第8外显子内的终止密码子的突变。
5.如权利要求3所述的载体，其中该Epo受体与SEQ ID NO:6具有至少90％序列同一性。
6.如权利要求1所述的载体，其中该核酸进一步编码Flag标签(DYKDDDDK(SEQ ID NO:23))，该Flag标签是该Epo受体的C末端。
7.如权利要求1所述的载体，其中该核酸包含自裂解肽。
8.如权利要求7所述的载体，其中该自裂解肽是2A肽。
9.如权利要求1所述的载体，其中该细胞表面受体包含结合靶细胞抗原的胞外受体结构域。
10.如权利要求1至8中任一项所述的载体，其中该细胞表面受体是嵌合抗原受体，其包含：
i)信号肽；
ii)结合靶细胞抗原的胞外受体结构域；
iii)将该胞外受体结构域锚定在细胞表面上的铰链和跨膜结构域；和
iv)效应子结构域。
11.如权利要求10所述的载体，其中该胞外受体结构域包含通过接头结构域连接的可变免疫球蛋白轻链结构域和可变免疫球蛋白重链结构域。
12.如权利要求11所述的载体，其中该接头结构域是(G4S)x(SEQ ID NO:24)，其中x是从1至100的整数。
13.如权利要求10所述的载体，其中该胞外受体结构域是单链可变片段(scFv)。
14.如权利要求1至8中任一项所述的载体，其中该细胞表面受体是T细胞受体。
15.如权利要求10所述的载体，其中该胞外受体结构域是抗CD19单链可变片段(scFv)。
16.如权利要求10所述的载体，其中该嵌合抗原受体是抗CD19-41BB-CD3ζ。
17.一种制备转基因哺乳动物宿主细胞的方法，该方法包括将如权利要求1至16中任一项所述的载体引入哺乳动物宿主细胞中。
18.如权利要求17所述的方法，其中该哺乳动物宿主细胞是免疫细胞。
19.如权利要求18所述的方法，其中该免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞、单核细胞/巨噬细胞或树突细胞。
20.如权利要求18所述的方法，其中该免疫细胞是T细胞。
21.如权利要求20所述的方法，其中该T细胞进一步表达结合肿瘤抗原或病毒抗原的T细胞受体(TCR)。
22.如权利要求21所述的方法，其中该TCR是内源的。
23.如权利要求22所述的方法，其中该T细胞是肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，并且其中该方法进一步包括从肿瘤中提取该肿瘤浸润淋巴细胞并离体扩增该TIL。
24.一种哺乳动物免疫细胞，其包含如权利要求1至16中任一项所述的载体。
25.如权利要求24所述的哺乳动物免疫细胞，其中该哺乳动物免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞、单核细胞/巨噬细胞或树突细胞。
26.如权利要求24所述的哺乳动物免疫细胞，其中该哺乳动物免疫细胞是T细胞。
27.如权利要求26所述的哺乳动物免疫细胞，其中该T细胞是人T细胞。
28.如权利要求26所述的哺乳动物免疫细胞，其中该T细胞是人外周血T淋巴细胞。
29.一种减少哺乳动物中CD19+细胞的数量的方法，该方法包括将哺乳动物T细胞引入该受试者中，其中该哺乳动物T细胞包含如权利要求1至16中任一项所述的载体。
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