KR20220041643A - 조류인플루엔자 뉴라미니다아제를 포함하는 바이러스-유사입자 및 이를 이용한 범용 백신 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 조류인플루엔자에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자, 이를 포함하는 백신 조성물, 발현 벡터, 숙주세포 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 조류인플루엔자에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자, 이를 포함하는 백신 조성물, 발현 벡터, 숙주세포 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
인플루엔자는 인플루엔자 바이러스(Influenza virus)에 의해 사람 및 동물(조류, 돼지, 개, 말 등)의 호흡기를 통해 전파되는 호흡기성 질병이다. 사람 인플루엔자(Human influenza)의 경우 감염에 의한 매년 전 세계 10 - 20% 인구에서 발생한다. 또한 조류인플루엔자(Avian influenza)는 닭, 칠면조, 오리 및 야생 조류 등 여러 종류의 조류에 감염되며, 주로 닭과 칠면조의 가금류에 상당히 많은 피해를 주는 급성 바이러스성 전염병이다.
조류인플루엔자는 전파가 빠르고 병원성이 다양한 질병으로 세계동물보건기구(OIE)에서 병원성에 따라 저병원성(H1N1 등)과 고병원성(H5N1, H5N8, H5N6 등) 조류인플루엔자로 분류하고 있으며, 고병원성 조류인플루엔자에 감염된 가금류는 급성 호흡기 증상을 보이며 100%에 가까운 폐사를 나태는 것이 특징이다.
매년 국내에서 발생하는 조류 독감으로 인하여 해마다 1000만 마리 이상의 가금류가 살처분되고 특히, 2016~2017년에는 2000만 마리 이상 살처분되는 역사 이래 최악의 피해가 발생하였다.
조류인플루엔자 바이러스는 혈청아형(subtype)이 다양하고 변이가 쉽게 일어나며, 자연생태계의 야생조류에도 다양한 종류의 바이러스가 분포되어 있다. 현재까지 국내에 유행된 조류인플루엔자 바이러스는 H5N1형, H5N8형, H5N6형이고, 독감 바이러스의 특성상 빈번한 변이로 인하여 새로운 바이러스의 유행에 대처가 어려운 상황이다.
따라서, 기존의 백신에 비해 면역력이 높고 또한 예측하지 못한 인플루엔자 바이러스의 발생에 효과적으로 대처할 수 있는 광범위 교차 방어능력을 갖는 백신의 개발이 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(Influenza virus matrix protein, M1); 헤마글루티닌(Hemagglutinin, HA) 단백질; 및 뉴라미니다아제(Neuraminidase, NA) 1, 뉴라미니다아제 6 및 뉴라미니다아제 8로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 뉴라미니다아제를 포함하는, 조류인플루엔자에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 바이러스-유사입자를 포함하는 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조류인플루엔자에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자 제조용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조류인플루엔자에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자 제조용 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조류인플루엔자에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 측면은, 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(Influenza virus matrix protein, M1); 헤마글루티닌(Hemagglutinin, HA) 단백질; 및 뉴라미니다아제(Neuraminidase NA) 1, 뉴라미니다아제 6 및 뉴라미니다아제 8로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 뉴라미니다아제를 포함하는, 조류인플루엔자에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자(Virus-like particles, VLPs)에 관한 것이다.
본 발명에서 “인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(Influenza virus matrix protein, M1)”은 인플루엔자 바이러스의 구조 단백질로서, 인플루엔자 바이러스의 외피(envelop)인 지방층 안쪽에 코트(coat)를 형성하는 기질단백질(matrix protein)을 의미한다. 상기 인플루엔자 바이러스는 8개의 분절된 음성가닥 RNA, 표면 단백질인 헤마글루티닌(hemagglutinin, H), 뉴라미다제(neuraminidase, N), 뉴클레오프로테인(neucleoprotein, NP) 매트릭스(matrix, M1), 프로톤 이온-채널 단백질(proton ion-channel protein, M2), 중합효소 염기 단백질 1(polymerase acidic protein, PA), 중합효소 염기 단백질 2(PB2, polyMerase basic protein 2), 중합효소 산성 단백질(PA, polymerase acidic protein) 및 비구조 단백질 2(NS2, nonstructural protein 2)와 같은 단백질을 포함하는데, 이때 매트릭스 단백질 1은 외형을 층으로 둘러 쌓고 있음으로써 코어와 외피 간의 연결체로 작용한다. 상기 매트릭스 단백질 1은 바이러스-유사입자 생성에 있어, 바이러스-유사입자를 안정한 형태로 조립하는데 중요한 역할을 한다.
상기 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1은 A/Puerto Rico/8/34, A/Bangkok/163/2000, A/AA/Huston/1945, A/Berlin/6/2006, A/Brandenburg/1/2006, A/Brevig Mission/1/1918, A/Chile/8885/2001, A/DaNang/DN311/2008, A/FLW/1951, A/FW/1/1950, A/Fiji/15899/83, A/Fort Monmouth/1-MA/1947, A/HaNoi/TX233/2008, A/Iowa/CEID23/2005, A/Malaysia/35164/2006, A/Managua/4086.04/2008, A/Texas/VR06-0502/2007, A/WSN/1933, A/Colorado/18/2011, A/Kentucky/04/2010, A/Maryland/28/2009, A/New Mexico/05/2012, A/Philippines/TMC10-135/2010, A/Singapore/GP4307/2010, A/Singapore/GP489/2010, A/Boston/14/2007, A/Brisbane/09/2006, A/Hong Kong/CUH34175/2002, A/Kyrgyzstan/WRAIR1256P/2008, A/Malaysia/12550/1997, A/Nanjing/1663/2010, A/Wyoming/08/2010, A/Berkeley/1/1968, A/Korea/426/1968 등으로부터 유래한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 A/Puerto Rico/8/34 유래 M1 단백질일 수 있다.
본 발명에서 “헤마글루티닌(Hemagglutinin, HA)”은 적혈구의 응집을 불러 일으키는 물질을 의미하며, 인플루엔자 증식 과정에서 바이러스 표면에 존재한다. 상기 헤마글루티닌은 바이러스가 체세포에 부착하는데 중요한 역할을 하며 18가지 아형이 있다. 상기 헤마글루티닌은 바큘로바이러스에서 발현되어 인플루엔자 바이러스에 대한 면역력을 생성 또는 증가시키는 항원으로서 사용될 수 있다.
상기 헤마글루티닌 단백질은 다양한 아형을 가진 인플루엔자 바이러스로부터 유래한 것일 수 있으며, A형 인플루엔자 유래일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 H5N1 바이러스의 헤마글루티닌 전장 단백질, 이의 단편, 이의 아미노산 서열 변이체 또는 이들의 다수 연결된 다량체 형태가 될 수 있다.
본 발명에서 “뉴라미니다아제(Neuraminidase)”는 뉴라민산을 가수분해하는 효소로서, 인플루엔자 바이러스 증식 과정에서 바이러스 표면에 존재한다. 상기 뉴라미니다아제는 감염된 세포로부터 증식된 바이러스가 빠져나와 새로운 체세포를 감염시킬 수 있도록 기존의 감염된 세포와 바이러스 입자 간의 결합을 끊어주는 역할을 하며 9가지 아형으로 분류된다.
상기 뉴라미니다아제 단백질은 다양한 아형을 가진 인플루엔자 바이러스로부터 유래한 것일 수 있으며, A형 인플루엔자 유래일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 H5N1, H5N6 및 H5N8로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 바이러스의 뉴라미니다아제 전장 단백질, 이의 단편, 이의 아미노산 서열 변이체 또는 이들의 다수 연결된 다량체 형태가 될 수 있다.
본 발명에서 “아미노산 서열 변이체”란, 단백질의 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 본 발명에서 상기 아미노산 서열 변이체는 헤마글루티닌 단백질 또는 뉴라미니다아제의 아미노산 서열 변이체를 의미하며, 상기 단백질의 글리코실화된 형태, 리피드화된 형태, 항원 제시(presentation)를 증진시키고 항원의 항원 제시 세포에의 표적을 향상시키는 분자를 포함하도록 유도체화된 형태 등이 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 “바이러스-유사입자(Virus-Like Particles, VLPs)”는 바이러스성 단백질을 수반하거나 수반하지 않는 비감염성 바이러스성 소단위체를 의미한다. 예컨대, 상기 바이러스-유사입자는 DNA 또는 RNA 게놈이 완전히 결여되어 있거나, 바이러스성 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자의 경우 자발적 자가 어셈블리를 진행할 수도 있다.
본 발명에서 “조류인플루엔자에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자”는 조류인플루엔자에 대한 특이적인 면역 반응을 유도하며, 바이러스와 유사한 형태를 가진 단백질 구조체(입자)를 의미한다. 한편, 본 발명에서 상기 “조류인플루엔자에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자”라는 용어는 조류인플루엔자에 의한 질병임을 의미하는 것은 아니나, 그 형태 및 활용에 있어서 바이러스와 유사하다는 의미로 사용된 것으로서, 필요에 따라 적절히 변경하여 적용될 수 있다.
상기 바이러스-유사입자는 바이러스에서 유래한 구조 단백질이 조립되어 바이러스와 유사한 형태의 입자를 생성함과 동시에 조류인플루엔자로부터 유래한 항원 결정 부위를 포함함으로써, 상기 바이러스-유사입자를 특정 개체에 접종하였을 때 조류인플루엔자에 대한 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있는 것을 특징으로 한다.
상기 조류인플루엔자에 대한 면역반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자는 조류인플루엔자에서 유래한 항원 결정 부위로서 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다아제를 포함하고 있으나, 그 외에 유전 물질은 포함하지 않으므로 증식이 불가능하고 독성이 없어 안전하므로 백신으로 사용할 수 있다. 상기 바이러스-유사입자의 표면에 도입된 항원 결정 부위는 순수하게 분리된 재조합 단백질에 비해 높은 항원성을 가지며 효과적인 중화항체를 형성할 수 있다.
한편, 기존 조류인플루엔자에 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자의 경우 단일 항원 유전자를 포함함으로써 다양한 아형을 가지는 조류인플루엔자에 대한 활용도가 낮은 한계점이 있다. 이에 본 발명자는 조류인플루자에 대한 범용 백신을 개발하고자 하였으며, 2 이상의 뉴라미니다아제를 조합한 바이러스-유사입자를 제조하였다. 따라서 상기 바이러스-유사입자는 조류인플루엔자 감염 예방에 대한 범용적인 사용이 가능할 뿐 아니라, 기존 조류인플루엔자에 대한 바이러스-유사입자에 비해 우수한 면역원성을 가지는 범용 백신 조성물을 제공할 수 있다.
상기 조류인플루엔자에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자는 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(Influenza virus matrix protein, M1); 헤마글루티닌(Hemagglutinin, HA) 단백질; 및 뉴라미니다아제(Neuraminidase NA) 1, 뉴라미니다아제 6 및 뉴라미니다아제 8로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 뉴라미니다아제를 포함할 수 있다.
구체적으로 상기 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열로 이루어진 단백질의 기능적 동등물로 이루어질 수 있다.
또한 구체적으로, 상기 헤마글루티닌은 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열로 이루어진 단백질의 기능적 동등물로 이루어질 수 있다.
또한 구체적으로, 상기 뉴라미니다아제는 서열번호 3의 아미노산 서열, 서열번호 4의 아미노산 서열, 서열번호 5의 아미노산 서열 및/또는 상기 아미노산 서열로 이루어진 단백질의 기능적 동등물로 이루어질 수 있다. 보다 더 구체적으로, 서열번호 3의 아미노산 서열, 서열번호 4의 아미노산 서열 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 뉴라미니다아제를 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 2 이상의 뉴라미니다아제는 각각 서열번호 3의 아미노산 서열 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
다른 예로, 상기 2 이상의 뉴라미니다아제는 각각 서열번호 3의 아미노산 서열 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
또 다른 예로, 상기 2 이상의 뉴라미니다아제는 각각 서열번호 4의 아미노산 서열 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
또 다른 예로, 상기 2 이상의 뉴라미니다아제는 각각 서열번호 3의 아미노산 서열, 서열번호 4의 아미노산 서열 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명에서 용어 “기능적 동등물"은 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1 내지 5의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상, 가장 구체적으로는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 것으로, 서열번호 1 내지 5의 아미노산 서열과 실질적으로 동질의 생리활성을 가지는 단백질을 의미한다.
본 발명에서 용어 "실질적으로 동등한 생리활성"은 상기 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1, 헤마글루티닌 또는 뉴라미니다아제 단백질과의 구조적, 기능적 상동성으로 인해 조류인플루엔자에 대한 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자로서의 활성을 의미한다.
보다 구체적으로, 상기 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1은 Genebank Accession No. ABO21712 또는 Genebank Accession No. EF467824 로 표현되는 유전자일 수 있다.
상기 헤마글루티닌 단백질은 Genebank Accession No. EU118132.1로 표현되는 유전자일 수 있다.
상기 뉴라미니다아제 단백질은 Genebank Accession No. EU118141.1, Genebank Accession No. KY273008.1 및/또는 Genebank Accession No. KJ508934.1로 표현되는 유전자일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1, 헤마글루티닌 및 뉴라미니다아제를 포함하는 바이러스-유사입자를 항-M1 항체, 항-HA 항체 및 항-NA 항체를 이용한 단백질 발현량 측정을 통해 확인하였다(도 1).
상기 바이러스-유사입자는 개체 내에서 항원으로 작용하며 수상돌기세포(dendritic cells)와 같은 항원 표지 세포와의 반응을 통해 T 또는 B 면역 세포에 항원을 표지할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 바이러스-유사입자를 접종하여 IgG 항체가 형성됨을 확인하였으며(도 2), CD4+, CD8+ T 세포, GC(Germinal center) B 세포 및 B 세포의 수가 유의적으로 증가됨을 확인하였다(도 3).
본 발명의 일 실시예에서는 상기 백신 조성물의 폐 조직에서의 염증반응 변화를 확인한 결과, INF-γ 및 IL-6의 염증 반응이 낮은 수준으로 나타남을 확인하였다(도 5).
또한 본 발명의 일 실시예에서 상기 바이러스-유사입자 접종에 따라 마우스 생존율을 확인한 결과, 마우스의 체중변화율이 감소하고, 마우스의 생존율은 바이러스-유사입자 미접종 대조군과 비교하여 현저히 증가함을 확인하였다(도 6)
상기와 같은 결과는 본 발명의 바이러스-유사입자가 조류인플루엔자에 대한 높은 수준의 면역성을 제공할 수 있으며, 조류인플루엔자 감염에 대한 백신으로 활용할 수 있음을 시사한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 바이러스-유사입자를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.
상기 바이러스-유사입자에 관한 설명은 전술한 바와 동일하다.
본 발명에서 “백신 조성물”은 백신 효과를 가지는 단백질 항원을 투여함으로써 이후의 병원균 감염을 예방할 수 있는 조성물을 의미한다. 상기 백신 조성물은 조류인플루엔자에 대한 항원성을 나타내는 바이러스-유사입자를 포함하는 조성물일 수 있다.
구체적으로, 상기 백신 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 보조제, 면역 자극제 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 포함하는 것일 수 있다.
상기 약학적으로 허용되는 담체는 당업계에 공지되어있으며, 단백질, 설탕 등을 포함한다. 상기 담체는 수용액 또는 비-수용액, 현탁액 및 에멀전일 수 있다. 비-수용액 담체는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식용유 예컨대 올리브 오일 및 주사 가능한 유기 에스테르 예컨대 에틸 올리에이트를 포함한다. 수용액 담체는 식용수 및 완충배지를 포함하는 물, 알코올/수용액, 에멀전 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 담체는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로오스, 덱스트로오스 및 염화나트륨, 유산처리 링거 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥주사용 담체는 링거 덱스트로오스를 기본으로 하는 것과 같은 전해질 보충제, 액체 및 영양 보충제 등을 포함한다. 방부제 및 기타 첨가제로서 항미생물제제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 가스 등과 같은 것을 추가로 포함할 수 있다. 방부제로는 포르말린 티메로살, 네오마이신, 폴리믹신 B 및 암포테리신 B를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 백신 조성물은 보조제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 면역반응의 향상 및/또는 접종 후 흡수 속도를 촉진하는 화합물 또는 혼합물을 칭하는 것으로 임의의 흡수-촉진제를 포함한다. 허용가능한 보조제는 프로인트 완전보존제, 프로인트 불완전보존제, 사포닌, 미네랄 젤 예컨대 수산화 알루미늄, 계면활성제 예컨대 리소레시틴, 플투론 폴리올, 다가음이온, 펩타이드, 오일 또는 탄화수소 에멀전, 키홀림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 백신 조성물은 면역 자극제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 면역 자극제는 인공적으로 합성된 레바미솔, 이소프레노신 및 사이토카인을 포함할 수 있다. 사이토카인의 일 예로서 인터페론-α, 인터류킨-2, GM-CSF, G-CSF 등이 있다.
상기 백신 조성물은 상기 바이러스-유사입자 또는 이의 농축액을 포함하는 형태이거나, 형질전환 숙주 세포 자체 또는 형질전환 세포의 건조 분말 형태로 사용할 수 있다. 또한, 상기 백신 조성물은 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있으며 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
상기 백신 조성물은 안정제, 유화제, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, pH 조정제, 계면활성제, 리포솜, 이스콤(iscom) 보조제, 합성 글리코펩티드, 증량제, 카복시폴리메틸렌, 세균 세포벽, 세균 세포벽의 유도체, 세균백신, 동물 폭스바이러스 단백질, 바이러스 일부(subviral) 입자 보조제, 콜레라 독소, N, N-디옥타데실-N', N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 모노포스포릴 지질 A, 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 제2보조제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1; 헤마글루티닌; 및 뉴라미니다아제를 포함하는 바이러스-유사입자를 이용한 백신 조성물을 제조하여 조류인플루엔자에 감염된 마우스에 투여한 결과, 항체 형성, T 세포 증식에 따른 면역성이 증가함을 확인하였으며(도 2 및 도 3), 염증반응 및 폐 바이러스 역가가 현저히 감소하였고(도 4 및 도 5), 나아가 백신 조성물 투여 결과 조류인플루엔자 감염에 대한 생존율이 증가함을 확인하였다(도 6).
상기 결과는 본 발명의 바이러스-유사입자를 포함하는 백신 조성물이 항체 형성 및 T 세포 증식을 통해 면역체계를 강화시킴으로써 조류인플루엔자 감염 예방에 활용할 수 있음을 시사한다.
상기 백신 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 제제화할 경우에는 통상적으로 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제가 함께 사용될 수 있다.
경구투여를 위한 고형제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예컨대, 전분, 칼슘카보네이트calcium carbonate), 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등이 함께 사용될 수 있다. 또한 상기 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제가 사용될 수도 있다.
경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 사용될 수 있으며, 통상적으로 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 다양한 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 사용될 수 있다.
비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 사용될 수 있다. 비수용성제제, 현탁제는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 서열번호 6의 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터; 서열번호 7의 헤마글루티닌 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터; 및 서열번호 8의 뉴라미니다아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터, 서열번호 9의 뉴라미니다아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터 및 서열번호 10의 뉴라미니다아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 발현 벡터;를 포함하는 조류인플루엔자에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자 제조용 조성물에 관한 것이다.
구체적으로, 상기 바이러스-유사입자 제조용 조성물은 서열번호 6의 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터; 서열번호 7의 헤마글루티닌 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터; 및 서열번호 8의 뉴라미니다아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터, 서열번호 9의 뉴라미니다아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터 및 서열번호 10의 뉴라미니다아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 발현 벡터를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 “벡터”는 연결되어 있는 핵산 단편을 운반하는데 이용되는 핵산 분자를 의미한다. 상기 벡터는 박테리아, 플라스미드, 파지, 코스미드, 에피솜, 바이러스 및 삽입가능한 DNA 단편(즉, 상동재조합에 의해 숙주 세포 게놈 안으로 삽입 가능한 단편)이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 플라스미드는 벡터의 일종으로서 내부에 추가적으로 DNA 단편을 연결시킬 수 있는 고리형의 이중 가닥 DNA 루프를 의미한다. 또한, 바이러스 벡터는 추가적인 DNA를 바이러스 게놈 안에 연결시킬 수 있다.
본 발명에서 용어 “발현 벡터”는 작동 가능하도록 연결된 목적 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 지시할 수 있는 벡터를 의미한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술의 사용에서 발현 벡터는 플라스미드 형태이므로, 용어 플라스미드 및 벡터가 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 바이러스 벡터와 같이 동일한 기능을 수행하는 다른 형태의 발현 벡터들도 포함할 수 있다.
상기 발현 벡터는 pET-3a-d, pET-9a-d, pET-11a-d, pET-12a-c, pET-14b, pET-15b, pET-16b, pET-17b, pET-17xb, pET-19b, pET-20b(+), pET-21a-d(+), pET-22b(+), pET-23a-d(+), pET-24a-d(+), pET-25b(+), pET-26b(+), pET-27b(+), pET-28a-c(+), pET-29a-c(+), pET-30a-c(+), pET-30 Ek/LIC, pET-30 Xa/LIC, pET-31b(+), pET-32a-c(+), pET-32 Ek/LIC, pET-32 Xa/LIC, pET-33b(+), pET-34b(+), pET-35b(+), pET-36b(+), pET-37b(+), pET-38b(+), pET-39b(+), pET-40b(+), pET-41a-c(+), pET-41 Ek/LIC, pET-42a-c(+), pET-43.1a-c(+), pET-43.1 Ek/LIC, pET-44a-c(+), pFastBac, pRSETA, pRSETB, pRSETC, pESC-HIS, pESC-LEU, pESC-TRP, pESC-URA, Gateway pYES-DEST52, pAO815, pGAPZ A, pGAPZ B, pGAPZ C, pGAPα A, pGAPα B, pGAPα C, pPIC3.5K, pPIC6 A, pPIC6 B, pPIC6 C, pPIC6α A, pPIC6α B, pPIC6α C, pPIC9K, pYC2/CT, pYD1 Yeast Display Vector, pYES2, pYES2/CT, pYES2/NT A, pYES2/NT B, pYES2/NT C, pYES2/CT, pYES2.1, pYES-DEST52, pTEF1/Zeo, pFLD1, PichiaPinkTM , p427-TEF, p417-CYC, pGAL-MF, p427-TEF, p417-CYC, PTEF-MF, pBY011, pSGP47, pSGP46, pSGP36, pSGP40, ZM552, pAG303GAL-ccdB, pAG414GAL-ccdB, pAS404, pBridge, pGAD-GH, pGAD T7, pGBK T7, pHIS-2, pOBD2, pRS408, pRS410, pRS418, pRS420, pRS428, yeast micron A form, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pYJ403, pYJ404, pYJ405 또는 pYJ406일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 벡터는 바큘로바이러스(Baculovirus) 벡터일 수 있다. 상기 바큘로바이러스(Baculovirus)는 사람이나 척추동물에는 병원성이 없으며, 곤충에 대해서만 병원성을 가지고 있는 병원성 바이러스를 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서는 바큘로바이러스 벡터 중 하나인 pFastBac vector에 인플루엔자바이러스 매트릭스 단백질 1; 헤마글루티닌; 및 2 이상의 뉴라미니다아제를 암호화하는 핵산 서열을 각각 클로닝하여 조류인플루엔자에 대한 면역반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자 제조용 발현 벡터를 제조하였다.
상기 발현 벡터는 숙주 세포 내로 도입되고, 상기 도입된 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포는 상기 조류인플루엔자의 바이러스-유사입자를 생산할 수 있다. 이 때, 상기 벡터는 숙주 생물체에 의해 인지되는 프로모터를 포함할 수 있다.
상기 프로모터는 SBE4, 3TP, PAI-1, p15, p21, CAGA12, hINS, A3, NFAT, NFKB, AP1, IFNG, IL4, IL17A, IL10, GPD, TEF, ADH, CYC, INU1, PGK1, PHO5, TRP1, GAL1, GAL10, GUT2, tac, T7, T5, nmt, fbp1, AOX1, AOX2, MOX1 및 FMD1 프로모터로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 숙주 세포 또는 발현 조건 등 다양한 변수를 고려하여 달리할 수 있다.
상기 바이러스-유사입자를 암호화하는 핵산 서열은 상기 프로모터 서열과 작동 가능하게 연결될(operably linked) 수 있다. 상기 "작동 가능하게 연결된(operably linked)"은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 의미한다. 즉, 상기 조류인플루엔자의 바이러스-유사입자를 암호화하는 유전자는 벡터 내에 있는 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 발현이 조절될 수 있다.
상기 발현 벡터는 추가적인 조절 서열을 더 포함할 수 있다. 상기 조절 서열은 파지 MS-2의 레플리카아제 유전자의 샤인-달가노 서열 및 박테리오파지 람다의 cⅡ의 샤인-달가노 서열일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 발현 벡터는 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는데 필요한 적절한 마커 유전자를 포함할 수 있다. 상기 마커 유전자는 항생제 저항성 유전자 또는 형광 단백질 유전자일 수 있으며, 상기 항생제 저항성 유전자는 히그로마이신 저항성 유전자, 카나마이신 저항성 유전자, 클로람페니콜 저항성 유전자 및 테트라사이클린 저항성 유전자로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 형광 단백질 유전자는 효모-강화 녹색 형광 단백질(yeast-enhanced green fluorescent protein, yEGFP) 유전자, 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP) 유전자, 청색 형광 단백질(blue fluorescent protein, BFP) 유전자 및 적색 형광 단백질(red fluorescent protein, RFP) 유전자로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 바이러스-유사입자 제조용 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 “숙주 세포(host cell)”는 바이러스에 의해 감염될 수 있고 바이러스 유사 입자에 의해 면역될 수 있는 모든 유기체를 의미한다. 상기 숙주 세포는 형질 전환에 의해 대사 조작될 수 있다.
상기 숙주 세포는 미생물, 동물세포, 식물세포, 동물에서 유래한 배양세포, 또는 식물에서 유래한 배양세포일 수 있다. 상기 적합한 숙주 세포는 자연적으로 발생하거나 또는 야생형 숙주 세포일 수 있고, 또는 변화된 숙주 세포일 수 있다. 상기 야생형 숙주 세포(wide-type host cell)는 재조합 방법에 의해 유전적으로 변화되지 않은 숙주 세포일 수 있다.
본 발명에서 “형질 전환”은 상기 벡터를 미생물 또는 특정 세포 내로 운반하는 방법을 의미하며, 형질 전환 대상 세포가 원핵세포인 경우에는, CaCl2 방법, 하나한 방법 및 전기 천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 형질 전환 대상 세포가 진핵세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법 및 유전자 밤바드먼트 등을 이용하여 실시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 효모와 같은 진균의 형질 전환의 경우에는, 일반적으로 리튬 아세테이트 및 열 충격을 이용한 형질 전환법과 전기천공법에 의해 실시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 “대사 조작된(metabolically engineered)" 또는 "대사 조작(metabolic engineering)"은 미생물에서 단백질 또는 알코올과 같은 원하는 대사산물의 생산을 위하여 생합성 유전자, 오페론과 연관된 유전자, 그리고 이들 핵산 서열의 제어 요소(control elements)를 조작하거나 적절한 배양 조건을 이용함으로써, 전사(transcription), 번역(translation), 단백질 안정성(protein stability)과 단백질 기능성(protein functionality)의 조절과 최적화에 의한 대사 흐름(metabolic flux)의 최적화를 유도하는 것을 의미한다.
예컨대, 대사 조작된 숙주세포는 유전적으로 설계된 숙주 세포를 의미하며, 여기서 목적 단백질은 발현의 수준으로 생성되거나 발현의 수준보다 더 큰 수준으로 생성되거나 본질적으로 동일한 성장 조건 하에서 성장하는 야생형 숙주 세포 내에서의 목적 단백질의 발현의 수준보다 큰 발현의 수준으로 발현될 수 있다.
상기 숙주세포는 공학적 방법에 의해 형질 전환되어 특정의 유전자를 효율적으로 발현할 수 있으면 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로 상기 숙주세포는 곤충 세포일 수 있다.
상기 곤충 세포는 유전자 발현을 위한 숙주 시스템으로서 개발되거나 시판되는 모든 세포가 사용될 수 있으며, 예컨대 스포도프테라 프루지페르다 곤충세포(Spodoptera frugiperda) SF21, SF9, 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni), 안티카르사 겜미탈리스(Anticarsa gemmitalis), 봄빅스 모리(Bombyx mori), 에스티그멘 아크레아(Estigmene acrea), 헬리오티스 비레쎈스(Heliothis virescens), 류카니아 세파라타(Leucania separata), 리만트리아 디스파(Lymantria dispar), 말라카소마 디스스트리아(Malacasoma disstria), 맘메스트라 브라씨카에(Mammestra brassicae), 만두카 섹스타(Manduca sexta), 플루텔라 질로스텔라(Plutella zylostella), 스토도프테라 엑시구아(Spodoptera exigua) 및 스포도프테라 리톨리스(Spodoptera littorlis)으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 곤충세포는 가을 거염벌레(Spodoptera frugiperda) 유래의 SF9 세포일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 조류인플루엔자에 대한 면역반응을 유도할 수 있는바이러스-유사입자 제조용 재조합 바큘로바이러스를 SF9 곤충 세포에 형질전환시켜, 형질전환된 숙주세포를 획득하였다.
본 발명의 또 다른 측면은 (a) 서열번호 6의 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1을 암호화하는 핵산 서열; 서열번호 7의 헤마글루티닌 단백질을 암호화하는 핵산 서열; 및 서열번호 8의 뉴라미니다아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열, 서열번호 9의 뉴라미니다아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및 서열번호 10의 뉴라미니다아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 핵산 서열을 각각 포함하는 발현 벡터를 제작하는 단계; (b) 상기 발현 벡터를 이용하여 숙주세포에 형질감염(transfection)시키는 단계; (c) 상기 형질감염된 숙주세포를 배양하고, 그 배양물을 수득하는 단계; 및 (d) 상기 배양물로부터 바이러스 유사입자를 수득하는 단계;를 포함하는 조류인플루엔자에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자 제조방법에 관한 것이다.
상기 바이러스-유사입자는 유전 공학적인 방법에 의해 제조될 수 있으며, 별도의 원인 감염체, 즉 본 발명에서는 조류인플루엔자 없이도 유전 공학적인 방법에 의해 제조될 수 있으므로 높은 생산성 및 경제성이 구현될 수 있다.
상기 바이러스-유사입자는 당해 기술 분야에 널리 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다. 예컨대, 상기 바이러스-유사입자는 상기 구조 단백질 및 항원 인식 부위를 암호화하는 재조합 DNA 분자를 이용하여 소정의 숙주 세포를 형질 전환시킨 후 배양하여 제조될 수 있으며, 세포 안에서 발현된 단백질이 세포 표면에서 조립된 후 배양 상층액으로 배출될 수 있다. 이 때, 상기 바이러스-유사입자에 포함된 표면단백질은 고정화 과정을 거치지 않고 자연 그대로의 형태를 유지하고 있으므로 개체 내에서 특정 병원체에 대한 목적하는 면역반응을 유도할 수 있다.
상기 (a) 단계의 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 11의 핵산 서열로 이루어진 제1 프라이머 및 서열번호 12의 핵산 서열로 이루어진 제2 프라이머를 포함하는 프라이머쌍에 의해 증폭될 수 있다.
상기 (a) 단계의 헤마글루티닌 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 13의 핵산 서열로 이루어진 제3 프라이머 및 서열번호 14의 핵산 서열로 이루어진 제4 프라이머를 포함하는 프라이머쌍에 의해 증폭될 수 있다.
상기 (a) 단계의 뉴라미니다아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 15의 핵산 서열로 이루어진 제5 프라이머 및 서열번호 16의 핵산 서열로 이루어진 제6 프라이머를 포함하는 프라이머쌍, 서열번호 17의 핵산 서열로 이루어진 제7 프라이머 및 서열번호 18의 핵산 서열로 이루어진 제8 프라이머를 포함하는 프라이머쌍 및 서열번호 19의 핵산 서열로 이루어진 제9 프라이머 및 서열번호 20의 핵산 서열로 이루어진 제10 프라이머를 포함하는 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머쌍에 의해 증폭될 수 있다.
구체적으로, 상기 뉴라미니다아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 15의 핵산 서열로 이루어진 제5 프라이머 및 서열번호 16의 핵산 서열로 이루어진 제6 프라이머를 포함하는 프라이머쌍, 서열번호 17의 핵산 서열로 이루어진 제7 프라이머 및 서열번호 18의 핵산 서열로 이루어진 제8 프라이머를 포함하는 프라이머쌍 및 서열번호 19의 핵산 서열로 이루어진 제9 프라이머 및 서열번호 20의 핵산 서열로 이루어진 제10 프라이머를 포함하는 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 프라이머쌍에 의해 증폭될 수 있다.
일 예로, 상기 뉴리미니다아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 15의 핵산 서열로 이루어진 제5 프라이머 및 16의 핵산 서열로 이루어진 제6 프라이머를 포함하는 프라이머쌍 및 서열번호 17의 핵산 서열로 이루어진 제7 프라이머 및 서열번호 18의 핵산 서열로 이루어진 제8 프라이머를 포함하는 프라이머쌍에 의해 증폭될 수 있다.
다른 예로, 상기 뉴리미니다아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 15의 핵산 서열로 이루어진 제5 프라이머 및 서열번호 16의 핵산 서열로 이루어진 제6 프라이머를 포함하는 프라이머쌍 및 서열번호 19의 핵산 서열로 이루어진 제9 프라이머 및 서열번호 20의 핵산 서열로 이루어진 제10 프라이머를 포함하는 프라이머쌍에 의해 증폭될 수 있다.
또 다른 예로, 상기 뉴라미니다아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 17의 핵산 서열로 이루어진 제7 프라이머 및 서열번호 18의 핵산 서열로 이루어진 제8 프라이머를 포함하는 프라이머쌍 및 서열번호 19의 핵산 서열로 이루어진 제9 프라이머 및 서열번호 20의 핵산 서열로 이루어진 제10 프라이머를 포함하는 프라이머쌍에 의해 증폭될 수 있다.
또 다른 예로, 상기 뉴라미니다아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 15의 핵산 서열로 이루어진 제5 프라이머 및 서열번호 16의 핵산 서열로 이루어진 제6 프라이머를 포함하는 프라이머쌍, 서열번호 17의 핵산 서열로 이루어진 제7 프라이머 및 서열번호 18의 핵산 서열로 이루어진 제8 프라이머를 포함하는 프라이머쌍 및 서열번호 19의 핵산 서열로 이루어진 제9 프라이머 및 서열번호 20의 핵산 서열로 이루어진 제10 프라이머를 포함하는 프라이머쌍에 의해 증폭될 수 있다.
상기 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있으며, 표적 물질에 존재하는 핵산과 혼성화 되어 상기 표적 물질의 특정 유전자를 증폭하는데 사용될 수 있다.
상기 프라이머는 증폭의 효율을 고려하여 구체적으로는 단일쇄일 수 있으며, 디옥시리보뉴클레오타이드(deoxyribonucleotide)일 수 있고, 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.
상기 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.
상기 프라이머들은 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang)등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth, Enzymol. 68:90-99), 보카지(Beaucage)등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862) 및 미국 특허 제 4458066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
상기 형질 전환된 숙주 세포는 배치, 공급-배치 또는 연속 발효 조건 하에서 배양될 수 있으며, 상기 숙주 세포는 형질 전환에 의해 상기 바이러스-유사입자를 발현할 수 있으므로 상기 배양된 숙주 세포로부터 상기 바이러스-유사입자 단백질을 수득할 수 있다.
이 때, 배치 발효 방법은 폐쇄적인 시스템을 사용할 수 있고, 상기 배양 매질은 발효가 실행되기 전에 제조되며, 상기 매질에 유기체를 접종하고, 상기 매질에 어떠한 성분의 첨가도 없이 발효가 일어날 수 있다. 특정한 경우에서, 성장 매질의 상기 탄소원 내용물이 아닌, 상기 pH 및 산소 함량은 배치 방법 동안 변화될 수 있다. 배치 시스템의 상기 대사물 및 세포 바이오매스는 끊임없이 발효가 정지될 때까지 변화할 수 있다. 배치 시스템에서, 세포는 정지된 지체 상에서 고도성장 로그 상에 걸쳐 진척하고, 성장율이 감소되거나 멈춘 최종적으로 정지 상에 이를 수 있다. 일반적인 기간에서, 로그 상의 상기 세포는 대부분의 단백질을 만들 수 있다.
배치 시스템은 "공급-배치 발효" 시스템으로 변형할 수 있다. 상기 시스템에서, 영양(예를 들면, 탄소원, 질소원, O2 및 통상적으로, 다른 영양)은 이들의 배양물의 농도가 한계치 미만으로 떨어질 때 첨가될 수 있다. 공급-배치 시스템은 이화 생성물 억제가 세포의 대사를 억제하고, 매질이 매질 내에서 영양소를 제한된 양으로 갖는 것이 바람직할 때 유용할 수 있다, 공급-배치 시스템에서의 실제 영양 농도의 측정은 pH, 용존 산소 및 CO2와 같은 폐기가스의 부분압과 같은 측정 가능한 인자의 변화에 기초하여 예측될 수 있다. 배치 및 공급-배치 발효는 일반적인 시스템으로서 당업계에 널리 알려져 있다.
계속적 발효는 정의된 배양 매질이 계속해서 생반응기(bioreactor)에 첨가되고, 조건화된 매질의 동일한 양이 과정 동안 동시에 제거되는 개방 시스템이다. 계속적 발효는 일반적으로 세포가 처음에는 로그 상 성장에 있는 일정한 고 밀도의 배양물을 유지할 수 있다. 계속적 발효는 세포 성장 또는 마지막 생성물 농도에 영향을 미치는 하나의 인자 또는 임의의 수의 인자의 조작이 가능할 수 있다.
예를 들어, 탄소원 또는 질소원과 같은 제한 영양소는 고정된 속도로, 모든 다른 파라미터는 적당하게 유지될 수 있다. 다른 시스템에서, 많은 성장에 영향을 주는 인자는 배지 탁도에 의해 측정되는 세포 농도가 일정하게 유지되는 동안, 계속해서 변화할 수 있다. 계속적 시스템은 일정한 상태의 성장 조건을 유지하려고 한다. 따라서, 매질이 빠져나가는 것에 의한 세포 손실은 발효에서의 세포 성장 속도에 대항하여 균형이 맞을 수 있다.
본 발명의 바이러스-유사입자는 전통적인 백신과 달리 원인 감염체 없이 개발할 수 있으며, 비선택적인 항체 생성을 유도하지 않는다. 또한, 체내 면역 체계를 활성화시켜 조류인플루엔자에 대한 면역 및 예방 효과를 제공할 수 있으므로, 내성을 유발하지 않고 안전하며 부작용이 최소화될 수 있다.
아울러, 헤마글루티닌 및 2 이상의 뉴라미니다아제 항원을 포함하고 있어 조류인플루엔자 바이러스에 대한 범용적인 적용이 가능하다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 HA VLPs, H5N1 VLPs, H5N6 VLPs, H5N8 VLPs, H5N1N6 VLPs, H5N1N8 VLPs, H5N6N8 VLPs 및 H5N1N6N8 VLPs에 대한 HA, NA 및 M1 단백질의 웨스턴 블랏 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 HA VLPs, H5N1 VLPs, H5N6 VLPs, H5N8 VLPs, H5N1N6 VLPs, H5N1N8 VLPs, H5N6N8 VLPs 및 H5N1N6N8 VLPs 접종 후 ELISA 분석을 통해 시간에 따른 H5N1-특이적 IgG, IgG1 및 IgG2a 항체 반응 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 HA VLPs, H5N1 VLPs, H5N6 VLPs, H5N8 VLPs, H5N1N6 VLPs, H5N1N8 VLPs, H5N6N8 VLPs 및 H5N1N6N8 VLPs 접종에 의한 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, GC B 세포 및 B 세포의 폐에서의 면역반응 결과를 유세포 분석법을 통해 나타낸 것이다(A: CD4+ T 세포의 수준 비교, B: CD8+ T 세포의 수준 비교, C: GC B 세포의 수준 비교, D: B세포의 수준 비교).
도 4는 HA VLPs, H5N1 VLPs, H5N6 VLPs, H5N8 VLPs, H5N1N6 VLPs, H5N1N8 VLPs, H5N6N8 VLPs 및 H5N1N6N8 VLPs의 폐 바이러스 역가 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 HA VLPs, H5N1 VLPs, H5N6 VLPs, H5N8 VLPs, H5N1N6 VLPs, H5N1N8 VLPs, H5N6N8 VLPs 및 H5N1N6N8 VLPs 접종에 의한 염증성 사이토카인 방출량 측정 결과를 나타낸 것이다(A: IFN-γ측정 결과 B: IL-6 측정 결과).
도 6은 HA VLPs, H5N1 VLPs, H5N6 VLPs, H5N8 VLPs, H5N1N6 VLPs, H5N1N8 VLPs, H5N6N8 VLPs 및 H5N1N6N8 VLPs 접종에 의한 마우스의 몸무게 변화율 및 생존율 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 HA VLPs, H5N1 VLPs, H5N6 VLPs, H5N8 VLPs, H5N1N6 VLPs, H5N1N8 VLPs, H5N6N8 VLPs 및 H5N1N6N8 VLPs 접종 후 ELISA 분석을 통해 시간에 따른 H5N1-특이적 IgG, IgG1 및 IgG2a 항체 반응 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 HA VLPs, H5N1 VLPs, H5N6 VLPs, H5N8 VLPs, H5N1N6 VLPs, H5N1N8 VLPs, H5N6N8 VLPs 및 H5N1N6N8 VLPs 접종에 의한 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, GC B 세포 및 B 세포의 폐에서의 면역반응 결과를 유세포 분석법을 통해 나타낸 것이다(A: CD4+ T 세포의 수준 비교, B: CD8+ T 세포의 수준 비교, C: GC B 세포의 수준 비교, D: B세포의 수준 비교).
도 4는 HA VLPs, H5N1 VLPs, H5N6 VLPs, H5N8 VLPs, H5N1N6 VLPs, H5N1N8 VLPs, H5N6N8 VLPs 및 H5N1N6N8 VLPs의 폐 바이러스 역가 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 HA VLPs, H5N1 VLPs, H5N6 VLPs, H5N8 VLPs, H5N1N6 VLPs, H5N1N8 VLPs, H5N6N8 VLPs 및 H5N1N6N8 VLPs 접종에 의한 염증성 사이토카인 방출량 측정 결과를 나타낸 것이다(A: IFN-γ측정 결과 B: IL-6 측정 결과).
도 6은 HA VLPs, H5N1 VLPs, H5N6 VLPs, H5N8 VLPs, H5N1N6 VLPs, H5N1N8 VLPs, H5N6N8 VLPs 및 H5N1N6N8 VLPs 접종에 의한 마우스의 몸무게 변화율 및 생존율 측정 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 2 이상의 뉴라미니다아제를 포함하는 조류인플루엔자에 대한 범용 바이러스-유사입자(Virus-Like Particles, VLPs)의 제조
1-1. H5N1N6N8 바이러스-유사입자
인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(Matrix protein 1, M1), 헤마글루티닌5(Hemagglutinin 5, HA5), 뉴라미니다아제 1(Neuraminidase 1, NA1), 뉴라미니다아제 6(NA6) 및 뉴라미니다아제 8(NA8)을 포함하는 바이러스-유사입자를 제조하기 위한 벡터를 준비하였다.
상기 인플루엔자 A 바이러스 (A/chicken/Vietnam/G04/2004(H5N1)), 인플루엔자 A 바이러스 (A/environment/Korea/W544/2016(H5N6)) 및 인플루엔자 A 바이러스 (A/Baikal teal/Korea/H41/2014(H5N8))로부터 바이러스 게놈 RNA는 Trizol LS 시약을 사용하여 산성 페놀 RNA 추출 방법으로 분리하고, HA, N1, N6 및 N8 특이적 프라이머쌍을 이용하여 RT-PCR을 통해 증폭시켰다. 상기 프라이머는 밑줄로 표시된 부분에 제한 효소 부위(EcoRI 및 HindIII)를 도입하였다.
한편, 인플루엔자 매트릭스 단백질 1(M1) 유전자는 인플루엔자 A/PR/8/34 바이러스에서 유래한 것으로서, M1 특이적 프라이머쌍을 이용하여 RT-PCR을 통해 증폭하였다. 상기 프라이머는 밑줄로 표시된 부분에 제한 효소 부위(SmaI 및 XbaI)를 각각 도입하였다. 상기 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타내었다.
서열번호 | 프라이머 종류 | 서열 |
11 | M1_Forward | 5'-TCCCCCGGGCCACCATGAGCCTTCTGACCGAGGTC-3' |
12 | M1_Reverse | 5'-TTACTTCTAGATTACTTGAACCGTTGCATCTG-3' |
13 | HA5_Forward | 5'-GAATTCATGGAAAAGATCGTGCTGCTGTTCG-3' |
14 | HA5_Reverse | 5'-AAGCTTTTAGATGCAGATACGGCACTGCAGT-3' |
15 | NA1_Forward | 5'-GAATTCATGAACCCAAACCAGAAGATCATCA-3' |
16 | NA1_Reverse | 5'-AAGCTTTTACTTGTCGATAGTGAATGGCAGTT-3' |
17 | NA6_Forward | 5'-GAATTCATGAACCCCAACCAGAAGATCACTTG-3' |
18 | NA6_Reverse | 5'-AAGCTTTTACTTGAAGTAGATGATTTCAGCACCG-3' |
19 | NA8_Forward | 5'-GAATTCATGAACCCAAACCAGAAGATCGTGACC-3' |
20 | NA8_Reverse | 5'-AAGCTTTTACATCTTGTCGATGTCGAAAGGCAGG-3' |
상기 프라이머를 이용하여 증폭시킨 M1(GeneBank accession number: EF467824, 1027bp), HA5(GeneBank accession number: EU118132.1, 1707bp), NA1(GeneBank accession number: EU118141.1, 1350bp), NA6(GeneBank accession number: KY273008.1, 1380bp) 및 NA8(GeneBank accession number: KJ508934.1, 1413bp) 암호화 서열을 pFastBac 벡터에 도입하여, pFastBac-M1, pFastBac-HA5, pFastBac-NA1, pFastBac-NA6 및 pFastBac-NA8를 제조하였다. 이때, 상기 pFastBac에 도입된 유전자는 DNA 염기서열 분석법으로 확인하였다.
M1, HA5, NA1, NA6, NA8을 발현하는 재조합 바큘로바이러스(rBVs)를 제조하기 위하여, cellfectin Ⅱ(Invitrogen) 및 SF9 세포를 이용하여 DNA 형질 감염을 수행하였다. 상기 pFastBac 벡터를 이용한 형질 전환은 white/blue 스크리닝에 의해 수행되었다. 재조합 바큘로바이러스는 Bac-to-Bac 발현 시스템(Invitrogen)를 통해 제조사의 매뉴얼에 따라 제조되었다.
상기 H5N1N6N8 바이러스-유사입자는 M1, HA5, NA1, NA6 및 NA8을 발현하는 재조합 rBVs에 의해 공동-감염된 SF9 곤충 세포에서 생산되었다. 상청액 내의 바이러스-유사입자는 고속원심분리(30분, 45,000ⅹg)를 사용해 펠렛화 하였다.
바이러스-유사입자를 4℃에서 인산완충식염수(PBS)에 하룻밤 동안 재현탁하였고, 불연속 수크로오스 구배(20-30-60%)를 통해 4℃, 45,000ⅹg에서 1 시간 동안 수확하고 정제하였다. 단백질 농도는 QuantiPro BCA Assay Kit(Sigma-Aldrich)에 의해 결정하였다.
1-2. H5N1N6 바이러스-유사입자
상기 실시예 1-1의 H5N1N6N8 바이러스-유사입자와 제조방법과 동일하다.
H5N1N6 바이러스-유사입자는 인플루엔자 A/PR/8/34 바이러스의 M1 rBVs, 인플루엔자 A 바이러스 (A/chicken/Vietnam/G04/2004(H5N1))의 HA5 및 NA1 rBVs, 인플루엔자 A 바이러스 (A/environment/Korea/W544/2016(H5N6))의 NA6 rBVs를 SF9 곤충 세포가 있는 배양액에 함께 넣어 H5N1N6 바이러스-유사입자를 제조하였다.
1-3. H5N1N8 바이러스-유사입자
상기 실시예 1-1의 H5N1N6N8 바이러스-유사입자와 제조방법과 동일하다.
H5N1N8 바이러스-유사입자는 인플루엔자 A/PR/8/34 바이러스의 M1 rBVs, 인플루엔자 A 바이러스 (A/chicken/Vietnam/G04/2004(H5N1))의 HA5 및 NA1 rBVs, 인플루엔자 A 바이러스 (A/Baikal teal/Korea/H41/2014(H5N8))의 NA8 rBVs를 SF9 곤충 세포가 있는 배양액에 함께 넣어 H5N1N8 바이러스-유사입자를 제조하였다.
1-4. H5N6N8 바이러스-유사입자
상기 실시예 1-1의 H5N1N6N8 바이러스-유사입자와 제조방법과 동일하다.
H5N6N8 바이러스-유사입자는 인플루엔자 A/PR/8/34 바이러스의 M1 rBVs, 인플루엔자 A 바이러스 (A/chicken/Vietnam/G04/2004(H5N1))의 HA5 rBVs, 인플루엔자 A 바이러스 (A/environment/Korea/W544/2016(H5N6))의 NA6 rBVs, 인플루엔자 A 바이러스 (A/Baikal teal/Korea/H41/2014(H5N8))의 NA8 rBVs를 SF9 곤충 세포가 있는 배양액에 함께 넣어 H5N6N8 바이러스-유사입자를 제조하였다.
비교예 1. 조류인플루엔자에 대한 바이러스-유사입자(Virus-Like Particles, VLPs)의 제조
1-1. HA 바이러스-유사입자
인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(Matrix protein 1, M1) 및 헤마글루티닌5(Hemagglutinin 5, HA5)를 포함하는 바이러스-유사입자를 제조하기 위한 벡터를 준비하였다.
상기 인플루엔자 A 바이러스 (A/chicken/Vietnam/G04/2004(H5N1))로부터 바이러스 게놈 RNA는 Trizol LS 시약을 사용하여 산성 페놀 RNA 추출 방법으로 분리하고, 상기 표 1의 HA 특이적 프라이머쌍을 이용하여 RT-PCR을 통해 증폭하였다.
한편, 인플루엔자 매트릭스 단백질 1(M1) 유전자는 인플루엔자 A/PR/8/34 바이러스에서 유래한 것으로서, M1 특이적 프라이머쌍을 이용하여 RT-PCR을 통해 증폭하였다.
1-2. H5N1 바이러스-유사입자
상기 바교예 1-1의 HA 바이러스-유사입자와 제조방법이 동일하다.
H5N1 바이러스-유사입자는 인플루엔자 A/PR/8/34 바이러스의 M1 rBVs 및 인플루엔자 A 바이러스 (A/chicken/Vietnam/G04/2004(H5N1))의 HA5 및 NA1 rBVs를 SF9 곤충 세포가 있는 배양액에 함께 넣어 H5N1 바이러스-유사입자를 제조하였다.
1-3. H5N6 바이러스-유사입자
상기 비교예 1-1의 HA 바이러스-유사입자와 제조방법이 동일하다.
H5N6 바이러스-유사입자는 인플루엔자 A/PR/8/34 바이러스의 M1 rBVs, 인플루엔자 A 바이러스 (A/chicken/Vietnam/G04/2004(H5N1))의 HA5 rBVs 및 인플루엔자 A 바이러스 (A/environment/Korea/W544/2016(H5N6))의 NA6 rBVs를 SF9 곤충 세포가 있는 배양액에 함께 넣어 H5N6 바이러스-유사입자를 제조하였다.
1-4. H5N8 바이러스-유사입자
상기 비교예 1-1의 HA 바이러스-유사입자와 제조방법이 동일하다.
H5N8 바이러스-유사입자는 인플루엔자 A/PR/8/34 바이러스의 M1 rBVs, 인플루엔자 A 바이러스 (A/chicken/Vietnam/G04/2004(H5N1))의 HA5 rBVs 및 인플루엔자 A 바이러스 (A/Baikal teal/Korea/H41/2014(H5N8))의 NA8 rBVs를 SF9 곤충 세포가 있는 배양액에 함께 넣어 H5N8 바이러스-유사입자를 제조하였다.
실험예 1. 조류인플루엔자의 바이러스-유사입자 확인
상기 실시예 및 비교예에서 제작한 바이러스-유사입자를 전자현미경법 및 웨스턴 블랏을 이용하여 확인하였다.
먼저, 혈청은 인플루엔자 H5N1으로 감염된 4주 후 BALB/c 마우스로부터 수집하였다. 웨스턴 블랏 분석에서, 마우스 혈청을 이용하여 M1, HA 및 NA를 탐침하였다. 구체적으로, SDS-PAGE를 위해 5 μg의 조류인플루엔자의 바이러스-유사입자를 각각 로딩하였으며, 프로브(probe)로서 항-HA 다클론항체, 항-NA 단일클론항체 및 항-M1 단일클론 항체를 사용하였다. 항체 정보는 다음과 같다: HCA-2 (“ILRTQESEC” 포함, Abcam, USA), 항-M1 단일클론 항체(GA2B)(Abcam, USA). 항-HA 다클론항체는 마우스에 H5N1 인플루엔자 바이러스를 한달 간격으로 2번 감염시킨 뒤 혈청을 수득하였다.
그 결과, HA VLPs, H5N1 VLPs, H5N6 VLPs, H5N8 VLPs, H5N1N6 VLPs, H5N1N8 VLPs, H5N6N8 VLPs 및 H5N1N6N8 VLPs가 제대로 도입되었음을 확인하였다 (도 1).
실험예 2. 동물모델에서의 면역 유도 활성 시험
본 발명의 바이러스-유사입자를 마우스에 접종 후 유도되는 면역 반응을 확인하였다.
먼저, 7주령의 암컷 BALB/c 마우스를 이용하여 5 μg 바이러스-유사입자를 2번 근육접종(Intramuscular route) 시켰다. 2차 면역화(boost immunization)한 지 4주 후에 치사량의 H5N1 인플루엔자 바이러스를 비강 경로로 마우스에 감염시켰다. H5N1을 감염시킨(challenge infection) 마우스를 희생시킨 후, 마우스의 혈액을 안와채혈로 수득하였다. 수득한 혈청은 ELISA법을 통해 H5N1 특이적 IgG, IgG1 및 IgG2a의 항체 형성 정도를 측정하였다.
구체적으로, H5N1 특이적 항체를 측정하기 위해, 96 웰 면역 플레이트(SPL Life Science, Korea)에 불활성화된 H5N1 항원을 웰당 최종 농도 4 μg/mL인 0.05 M, pH 9.6의 카르보네이트 바이카르보네이트 완충제(carbonate bicarbonate buffer)와 함께 4℃에서 밤새 코팅하였다. H5N1 특이적 IgG 항체 반응은 100 mL의 실시예 및 비교예의 바이러스-유사입자로 각각 면역화된 마우스의 혈청 샘플(PBST에 1 : 100의 비율로 희석)을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. PBS(100 μL/well)로 희석된 HRP-접합된 염소 항 마우스 IgG 항체를 37℃에서 2차 항체로 추가하였다.
그 결과, 상기 바이러스-유사입자의 접종에 의해 면역성이 형성된 마우스의 총 IgG 반응은 1차 접종 후 현저히 상승하였으며, 특히 2차 접종 후에 증가량이 뛰어난 것을 확인하였다(도 2). 특히 뉴라미니다아제 항원을 둘 이상 포함하고 있는 H5N1N6, H5N1N8, H5N6N8 및 H5N1N6N8 VLPs를 접종한 마우스에서 H5N1 특이적 항체가 효과적으로 성숙된다는 사실을 확인하였다.
상기 실험 결과는 본 발명의 바이러스-유사입자가 조류인플루엔자에 대한 높은 면역성을 제공하고, 조류인플루엔자의 감염에 반응하여 조직 계통의 항체 반응을 효과적으로 유도할 수 있음을 시사한다.
실험예 3. 항체-분비 세포(B 세포) 반응, T 세포 반응 시험
본 발명의 바이러스-유사입자 처리에 따른, 마우스의 폐 세포로부터 T 세포(CD4+, CCD8+) 및 B세포 (배아중심)의 비율을 유세포분석법으로 분석하였다.
구체적으로, 염색 완충액(0.1 M PBS 중 2% 소혈청알부민 및 0.1% 소듐아자이드)에서 폐 세포(1 X 106 cell/mL)를 Fc 블록(BD Biosciences, CA, USA)과 함께 4℃에서 15분 동안 배양하였다. 표면 항원 염색을 위해, 세포를 4℃에서 30분 동안 형광 단-공액항체(CD3e, CD4, CD8, B220, GL7; BD Biosciences)와 함께 배양하였다. 폐 세포를 염색 완충액으로 세척하고 BD Accuri C6 유세포 분석기(BD Biosciences)를 사용하여 획득하기 전에 4℃에서 30분 동안 4% 파라포름알데하이드로 고정시켰다. 이후 C6 분석 소프트웨어(BD Biosciences)를 사용하여 데이터를 분석하였다.
그 결과, 바이러스-유사입자의 접종에 의해 면역력이 형성된 마우스의 경우, 바이러스-유사입자를 처리하지 않은 마우스(Nave) 대비 현저히 증가한 CD4+ T세포 수준 및 CD8+ T세포 수준을 보였으며(도 3A, B), GC B 세포 및 B 세포 반응 수준이 증가함을 확인하였다(도 3C, D). 상기 결과는 2 이상의 뉴라미니다아제를 포함하는 바이러스-유사입자를 처리한 마우스에서 높은 수준으로 면역세포 반응들을 유도할 수 있음을 보여준다.
실험예 4. 바이러스-유사입자 접종에 의한 폐 염증 반응 확인
폐 추출물(lung extracts)에서의 바이러스 역가(viral titers)는 MDCK 세포를 이용하여 측정하였다. 폐 추출물은 마우스에서 폐를 분리하고 폐 1 개당 1 ml의 PBS를 넣은 후 주사기를 이용하여 갈아준 뒤, 2000 rpm에서 10 분 동안 원심분리하여 상층액을 수득하여 제조하였다.
또한, 폐 추출물로부터 사이토카인 인터페론 감마(INF-γ) 및 인터류킨-6(IL-6)의 방출양은 H5N1 인플루엔자 바이러스로 감염시키고 4일 후 수득한 폐 추출물로부터 ELISA kit를 이용하여 측정하였다. BD OptEIA Set(BD Biosciences)를 이용하여, 폐 추출물에서 사이토카인 수준을 검출하였다.
그 결과, 상기 바이러스-유사입자의 접종에 의해 현저히 낮은 수준의 폐 바이러스 로드(lung virus loads)가 발견되었다(도 4). 또한, 염증성 사이토카인의 일종인 IFN-γ 및 IL-6의 방출량이 바이러스-유사입자 미처리한 대조군에 비해 감소되었으며,
특히 H5N1N6N8 VLPs를 접종한 마우스에서 염증성 반응이 가장 적게 유도됨을 확인하였다(도 5).
실험예 5. 바이러스-유사입자 접종에 의한 마우스의 생존율 및 몸무게 변화율 확인
면역화를 위하여 7주령의 암컷 BALB/c 마우스를 이용하여 바이러스-유사입자 백신을 근육경로로 2번 접종시켰다. 2차 접종 4주 후 H5N1 인플루엔자 치사량을 감염시켰다. 희생하지 않은 마우스의 생존율 및 몸무게 변화율을 확인하기 위해 10일 동안 매일 몸무게를 측정하고 관찰하였다.
그 결과, 조류인플루엔자를 감염시킨 마우스에 바이러스-유사입자를 처리한 경우 면역성이 형성되어 바이러스-유사입자를 처리하지 않은 마우스와 비교하여 마우스의 체중 감소가 거의 나타나지 않으며, 인플루엔자 바이러스를 효과적으로 방어하여 100% 생존함을 확인하였다(도 6).
상기와 같은 결과는 본 발명의 바이러스-유사입자가 조류인플루엔자 감염에 대한 방어적 면역 효과를 유도함으로써, 조류인플루엔자 감염 예방 및 치료를 위한 백신에 활용할 수 있음을 시사한다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University
Myongji university industry and academia cooperation foundation
<120> VIRUS-LIKE PARTICLES COMPRISING AVIAN INFLUENZA NEURAMINIDASE AND
UNIVERSAL VACCINE COMPOSITIONS USING THE SAME
<130> 20PP30692
<160> 20
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 252
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M1-amino acid
<400> 1
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Tyr Val Leu Ser Ile Ile Pro
1 5 10 15
Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu Ile Ala Gln Arg Leu Glu Asp Val Phe
20 25 30
Ala Gly Lys Asn Thr Asp Leu Glu Val Leu Met Glu Trp Leu Lys Thr
35 40 45
Arg Pro Ile Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe
50 55 60
Thr Leu Thr Val Pro Ser Glu Arg Gly Leu Gln Arg Arg Arg Phe Val
65 70 75 80
Gln Asn Ala Leu Asn Gly Asn Gly Asp Pro Asn Asn Met Asp Lys Ala
85 90 95
Val Lys Leu Tyr Arg Lys Leu Lys Arg Glu Ile Thr Phe His Gly Ala
100 105 110
Lys Glu Ile Ser Leu Ser Tyr Ser Ala Gly Ala Leu Ala Ser Cys Met
115 120 125
Gly Leu Ile Tyr Asn Arg Met Gly Ala Val Thr Thr Glu Val Ala Phe
130 135 140
Gly Leu Val Cys Ala Thr Cys Glu Gln Ile Ala Asp Ser Gln His Arg
145 150 155 160
Ser His Arg Gln Met Val Thr Thr Thr Asn Pro Leu Ile Arg His Glu
165 170 175
Asn Arg Met Val Leu Ala Ser Thr Thr Ala Lys Ala Met Glu Gln Met
180 185 190
Ala Gly Ser Ser Glu Gln Ala Ala Glu Ala Met Glu Val Ala Ser Gln
195 200 205
Ala Arg Gln Met Val Gln Ala Met Arg Thr Ile Gly Thr His Pro Ser
210 215 220
Ser Ser Ala Gly Leu Lys Asn Asp Leu Leu Glu Asn Leu Gln Ala Tyr
225 230 235 240
Gln Lys Arg Met Gly Val Gln Met Gln Arg Phe Lys
245 250
<210> 2
<211> 568
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HA5-amino acid
<400> 2
Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Phe Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser
1 5 10 15
Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val
20 25 30
Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile
35 40 45
Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys
50 55 60
Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn
65 70 75 80
Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val
85 90 95
Glu Lys Ala Asn Pro Val Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn
100 105 110
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu
115 120 125
Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Ser His Glu Ala Ser
130 135 140
Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Arg Ser Ser Phe Phe
145 150 155 160
Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile
165 170 175
Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp
180 185 190
Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln
195 200 205
Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg
210 215 220
Leu Val Pro Arg Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly
225 230 235 240
Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn
245 250 255
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile
260 265 270
Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly
275 280 285
Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser
290 295 300
Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys
305 310 315 320
Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser
325 330 335
Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile
340 345 350
Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr
355 360 365
Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys
370 375 380
Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser
385 390 395 400
Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe
405 410 415
Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp
420 425 430
Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met
435 440 445
Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu
450 455 460
Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly
465 470 475 480
Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu
485 490 495
Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala
500 505 510
Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly
515 520 525
Ile Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala
530 535 540
Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly
545 550 555 560
Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile
565
<210> 3
<211> 449
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NA1-amino acid
<400> 3
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Thr Ile Gly Ser Ile Cys Met Val
1 5 10 15
Thr Gly Ile Val Ser Leu Met Leu Gln Ile Gly Asn Met Ile Ser Ile
20 25 30
Trp Val Ser His Ser Ile His Thr Gly Asn Gln His Gln Ala Glu Pro
35 40 45
Ile Ser Asn Thr Asn Phe Leu Thr Glu Lys Ala Val Ala Ser Val Lys
50 55 60
Leu Ala Gly Asn Ser Ser Leu Cys Pro Ile Asn Gly Trp Ala Val Tyr
65 70 75 80
Ser Lys Asp Asn Ser Ile Arg Ile Gly Ser Lys Gly Asp Val Phe Val
85 90 95
Ile Arg Glu Pro Phe Ile Ser Cys Ser His Leu Glu Cys Arg Thr Phe
100 105 110
Phe Leu Thr Gln Gly Ala Leu Leu Asn Asp Lys His Ser Asn Gly Thr
115 120 125
Val Lys Asp Arg Ser Pro His Arg Thr Leu Met Ser Cys Pro Val Gly
130 135 140
Glu Ala Pro Ser Pro Tyr Asn Ser Arg Phe Glu Ser Val Ala Trp Ser
145 150 155 160
Ala Ser Ala Cys His Asp Gly Thr Ser Trp Leu Thr Ile Gly Ile Ser
165 170 175
Gly Pro Asp Asn Gly Ala Val Ala Val Leu Lys Tyr Asn Gly Ile Ile
180 185 190
Thr Asp Thr Ile Lys Ser Trp Arg Asn Asn Ile Leu Arg Thr Gln Glu
195 200 205
Ser Glu Cys Ala Cys Val Asn Gly Ser Cys Phe Thr Val Met Thr Asp
210 215 220
Gly Pro Ser Asn Gly Gln Ala Ser His Lys Ile Phe Lys Met Glu Lys
225 230 235 240
Gly Lys Val Val Lys Ser Val Glu Leu Asp Ala Pro Asn Tyr His Tyr
245 250 255
Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Asp Ala Gly Glu Ile Thr Cys Val Cys
260 265 270
Arg Asp Asn Trp His Gly Ser Asn Arg Pro Trp Val Ser Phe Asn Gln
275 280 285
Asn Leu Glu Tyr Gln Ile Gly Tyr Ile Cys Ser Gly Val Phe Gly Asp
290 295 300
Asn Pro Arg Pro Asn Asp Gly Thr Gly Ser Cys Gly Pro Val Ser Ser
305 310 315 320
Asn Gly Ala Tyr Gly Val Lys Gly Phe Ser Phe Lys Tyr Gly Asn Gly
325 330 335
Val Trp Ile Gly Arg Thr Lys Ser Thr Asn Ser Arg Ser Gly Phe Glu
340 345 350
Met Ile Trp Asp Pro Asn Gly Trp Thr Glu Thr Asp Ser Ser Phe Ser
355 360 365
Val Lys Gln Asp Ile Val Ala Ile Thr Asp Trp Ser Gly Tyr Ser Gly
370 375 380
Ser Phe Val Gln His Pro Glu Leu Thr Gly Leu Asp Cys Ile Arg Pro
385 390 395 400
Cys Phe Trp Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Pro Lys Glu Ser Thr Ile
405 410 415
Trp Thr Ser Gly Ser Ser Ile Ser Phe Cys Gly Val Asn Ser Asp Thr
420 425 430
Val Gly Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu Pro Phe Thr Ile Asp
435 440 445
Lys
<210> 4
<211> 459
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NA6-amino acid
<400> 4
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Thr Cys Ile Ser Ala Thr Gly Val Thr
1 5 10 15
Leu Ser Val Val Ser Leu Leu Ile Gly Ile Thr Asn Leu Gly Leu Asn
20 25 30
Ile Gly Leu His Tyr Lys Val Ser Asp Ser Thr Thr Met Asn Ile Pro
35 40 45
Asn Met Asn Glu Thr Asn Pro Thr Thr Thr Asn Ile Thr Asn Ile Ile
50 55 60
Met Asn Lys Asn Glu Glu Arg Thr Phe Leu Lys Leu Thr Lys Pro Leu
65 70 75 80
Cys Glu Val Asn Ser Trp His Ile Leu Ser Lys Asp Asn Ala Ile Arg
85 90 95
Ile Gly Glu Asp Ala His Ile Leu Val Thr Arg Glu Pro Tyr Leu Ser
100 105 110
Cys Asp Pro Gln Gly Cys Arg Met Phe Ala Leu Ser Gln Gly Thr Thr
115 120 125
Leu Arg Gly Gln His Ala Asn Gly Thr Ile His Asp Arg Ser Pro Phe
130 135 140
Arg Ala Leu Ile Ser Trp Glu Met Gly Gln Ala Pro Ser Pro Tyr Asn
145 150 155 160
Thr Arg Val Glu Cys Ile Gly Trp Ser Ser Thr Ser Cys His Asp Gly
165 170 175
Ile Ser Arg Met Ser Ile Cys Ile Ser Gly Pro Asn Asn Asn Ala Ser
180 185 190
Ala Val Val Trp Tyr Arg Gly Arg Pro Val Thr Glu Ile Pro Ser Trp
195 200 205
Ala Gly Asn Ile Leu Arg Thr Gln Glu Ser Glu Cys Val Cys His Lys
210 215 220
Gly Ile Cys Pro Val Val Met Thr Asp Gly Pro Ala Asn Ser Lys Ala
225 230 235 240
Ala Thr Lys Ile Ile Tyr Phe Lys Glu Gly Lys Ile Gln Lys Thr Glu
245 250 255
Glu Leu Gln Gly Asn Ala Gln His Ile Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Gly
260 265 270
Ala Ala Gly Met Ile Lys Cys Val Cys Arg Asp Asn Trp Lys Gly Ala
275 280 285
Asn Arg Pro Ile Ile Thr Ile Asp Pro Glu Met Met Thr His Thr Ser
290 295 300
Lys Tyr Leu Cys Ser Lys Ile Leu Thr Asp Thr Ser Arg Pro Asn Asp
305 310 315 320
Pro Thr Asn Gly Asn Cys Asp Ala Pro Ile Thr Gly Gly Ser Pro Asp
325 330 335
Pro Gly Val Lys Gly Phe Ala Phe Leu Asp Gly Glu Asn Ser Trp Leu
340 345 350
Gly Arg Thr Ile Ser Lys Asp Ser Arg Ser Gly Tyr Glu Met Leu Lys
355 360 365
Val Pro Asn Ala Glu Ile Asp Thr Gln Ser Gly Pro Ile Ser Tyr Gln
370 375 380
Leu Ile Val Asn Asn Gln Asn Trp Ser Gly Tyr Ser Gly Ala Phe Ile
385 390 395 400
Asp Tyr Trp Ala Asn Lys Glu Cys Phe Asn Pro Cys Phe Tyr Val Glu
405 410 415
Leu Ile Arg Gly Arg Pro Lys Glu Ser Gly Val Leu Trp Thr Ser Asn
420 425 430
Ser Met Val Ala Leu Cys Gly Ser Arg Glu Arg Leu Gly Ser Trp Ser
435 440 445
Trp His Asp Gly Ala Glu Ile Ile Tyr Phe Lys
450 455
<210> 5
<211> 470
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NA8-amino acid
<400> 5
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Val Thr Ile Gly Ser Ile Ser Leu Gly
1 5 10 15
Leu Val Val Phe Asn Val Leu Leu His Ala Val Ser Ile Ile Leu Thr
20 25 30
Val Leu Ala Leu Gly Lys Ser Glu Asn Asn Gly Ile Cys Asn Gly Thr
35 40 45
Val Val Arg Glu Tyr Asn Glu Thr Val Arg Ile Glu Lys Val Thr Gln
50 55 60
Trp Tyr Asn Thr Ser Val Val Glu Tyr Val Pro His Trp Asn Glu Gly
65 70 75 80
Thr Tyr Ile Asn Asn Thr Glu Pro Ile Cys Asp Val Lys Gly Phe Ala
85 90 95
Pro Phe Ser Lys Asp Asn Gly Ile Arg Val Gly Ser Arg Gly His Ile
100 105 110
Phe Val Ile Arg Glu Pro Phe Val Ser Cys Ser Pro Val Glu Cys Arg
115 120 125
Thr Phe Phe Leu Thr Gln Gly Ser Leu Leu Asn Asp Lys His Ser Asn
130 135 140
Gly Thr Val Lys Asp Arg Ser Pro Phe Arg Thr Leu Met Ser Val Glu
145 150 155 160
Val Gly Gln Ser Pro Asn Val Tyr Gln Ala Arg Phe Glu Ala Val Ala
165 170 175
Trp Ser Ala Thr Ala Cys His Asp Gly Lys Lys Trp Met Ala Ile Gly
180 185 190
Val Thr Gly Pro Asp Ser Lys Ala Val Ala Val Val His Tyr Gly Gly
195 200 205
Val Pro Thr Asp Val Val Asn Ser Trp Ala Gly Asp Ile Leu Arg Thr
210 215 220
Gln Glu Ser Ser Cys Thr Cys Ile Gln Gly Asn Cys Tyr Trp Val Met
225 230 235 240
Thr Asp Gly Pro Ala Asn Arg Gln Ala Gln Tyr Arg Ile Tyr Lys Ala
245 250 255
Asn Gln Gly Lys Ile Ile Gly Arg Thr Asp Val Ser Phe Ser Gly Gly
260 265 270
His Ile Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Asn Asp Gly Lys Val Glu Cys
275 280 285
Val Cys Arg Asp Asn Trp Thr Gly Thr Asn Arg Pro Val Leu Ile Ile
290 295 300
Ser Pro Asp Leu Ser Tyr Arg Val Gly Tyr Leu Cys Ala Gly Leu Pro
305 310 315 320
Ser Asp Thr Pro Arg Gly Glu Asp Thr Gln Phe Val Gly Ser Cys Thr
325 330 335
Ser Pro Met Gly Asn Gln Gly Tyr Gly Val Lys Gly Phe Gly Phe Arg
340 345 350
Gln Gly Thr Asp Val Trp Val Gly Arg Thr Ile Ser Arg Thr Ser Arg
355 360 365
Ser Gly Phe Glu Ile Ile Arg Ile Lys Asn Gly Trp Thr Gln Thr Ser
370 375 380
Lys Glu Gln Ile Arg Arg Gln Val Val Val Asp Asn Ser Asn Trp Ser
385 390 395 400
Gly Tyr Ser Gly Ser Phe Thr Leu Pro Val Glu Leu Ser Gly Arg Glu
405 410 415
Cys Leu Val Pro Cys Phe Trp Val Glu Met Ile Arg Gly Arg Pro Glu
420 425 430
Glu Arg Thr Ile Trp Thr Ser Ser Ser Ser Ile Val Met Cys Gly Val
435 440 445
Asp Tyr Glu Ile Ala Asp Trp Ser Trp His Asp Gly Ala Ile Leu Pro
450 455 460
Phe Asp Ile Asp Lys Met
465 470
<210> 6
<211> 1027
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M1-nucleic acid
<400> 6
agcgaaagca ggtagatatt gaaagatgag tcttctaacc gaggtcgaaa cgtacgtact 60
ctctatcatc ccgtcaggcc ccctcaaagc cgagatcgca cagagacttg aagatgtctt 120
tgcagggaag aacaccgatc ttgaggttct catggaatgg ctaaagacaa gaccaatcct 180
gtcacctctg actaagggga ttttaggatt tgtgttcacg ctcaccgtgc ccagtgagcg 240
aggactgcag cgtagacgct ttgtccaaaa tgcccttaat gggaacgggg atccaaataa 300
catggacaaa gcagttaaac tgtataggaa gctcaagagg gagataacat tccatggggc 360
caaagaaatc tcactcagtt attctgctgg tgcacttgcc agttgtatgg gcctcatata 420
caacaggatg ggggctgtga ccactgaagt ggcatttggc ctggtatgtg caacctgtga 480
acagattgct gactcccagc atcggtctca taggcaaatg gtgacaacaa ccaatccact 540
aatcagacat gagaacagaa tggttttagc cagcactaca gctaaggcta tggagcaaat 600
ggctggatcg agtgagcaag cagcagaggc catggaggtt gctagtcagg ctagacaaat 660
ggtgcaagcg atgagaacca ttggaactca tcctagctcc agtgctggtc tgaaaaatga 720
tcttcttgaa aatttgcagg cctatcagaa acgaatgggg gtgcagatgc aacggttcaa 780
gtgatcctct cactattgcc gcaaatatca ttgggatctt gcacttgaca ttgtggattc 840
ttgatcgtct ttttttcaaa tgcatttacc gtcgctttaa atacggactg aaaggagggc 900
cttctacgga aggagtgcca aagtctatga gggaagaata tcgaaaggaa cagcagagtg 960
ctgtggatgc tgacgatggt cattttgtca gcatagagct ggagtaaaaa actaccttgt 1020
ttctact 1027
<210> 7
<211> 1707
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HA5-nucleic acid
<400> 7
atggaaaaga tcgtgctgct gttcgctatc gtgtccctgg tcaagagcga ccagatctgc 60
atcggatacc acgccaacaa ctccaccgaa caggtcgaca ctatcatgga gaagaacgtg 120
accgtcactc acgctcagga catcctggag aagacccaca acggaaagct gtgcgacctg 180
gacggtgtga agcctctgat cctgcgcgac tgctccgtcg ctggttggct gctgggcaac 240
cccatgtgcg acgagttcat caacgtgcca gaatggagct acatcgtgga gaaggccaac 300
ccagtcaacg acctgtgcta ccctggtgac ttcaacgact acgaggaact gaagcacctg 360
ctgtctcgta tcaaccactt cgaaaagatc cagatcatcc ccaagtccag ctggtcttca 420
cacgaggctt cactgggagt ctccagcgcc tgcccatacc agggtcgctc ttcattcttc 480
cgtaacgtgg tctggctgat caagaagaac tccacctacc caactatcaa gaggagctac 540
aacaacacca accaggaaga cctgctggtg ctgtggggta tccaccaccc taacgacgct 600
gccgagcaga ctaagctgta ccagaacccc accacttaca tctctgtcgg cacctcaact 660
ctgaaccaga gactggtgcc tcgcatcgct acccgttcca aggtcaacgg tcagagcggc 720
cgcatggagt tcttctggac tatcctgaag ccaaacgacg ccatcaactt cgaatccaac 780
ggaaacttca tcgctcctga gtacgcctac aagatcgtga agaagggtga ctccaccatc 840
atgaagagcg agctggaata cggtaactgc aacaccaagt gccagactcc catgggcgct 900
atcaactcca gcatgccttt ccacaacatc caccccctga ccatcggcga gtgccctaag 960
tacgtgaagt ctaaccgcct ggtcctggcc actggactga ggaactcacc ccagagagaa 1020
cgccgtagga agaagcgtgg actgttcggt gctatcgccg gtttcatcga gggtggctgg 1080
cagggaatgg tggacggatg gtacggatac caccactcta acgaacaggg atcaggttac 1140
gctgccgaca aggagtctac ccagaaggct atcgacggtg tgactaacaa ggtcaactca 1200
atcatcgaca agatgaacac tcagttcgag gccgtcggca gggagttcaa caacctggag 1260
agacgcatcg aaaacctgaa caagaagatg gaagacggat tcctggacgt gtggacctac 1320
aacgctgagc tgctggtcct gatggagaac gaaagaactc tggacttcca cgactccaac 1380
gtgaagaacc tgtacgacaa ggtcaggctg cagctgagag acaacgccaa ggaactgggc 1440
aacggatgct tcgagttcta ccacaagtgc gacaacgagt gcatggaatc cgtgcgcaac 1500
ggcacctacg actacccaca gtacagcgag gaagctcgtc tgaagaggga ggaaatctct 1560
ggcgtcaagc tggagtcaat cggaatctac cagatcctgt ccatctacag cactgtggct 1620
tcttcactgg ctctggccat catggtcgcc ggcctgagcc tgtggatgtg ctctaacgga 1680
tcactgcagt gccgtatctg catctaa 1707
<210> 8
<211> 1350
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NA1-nucleic acid
<400> 8
atgaacccaa accagaagat catcaccatc ggctctatct gcatggtgac tggaatcgtc 60
tcactgatgc tgcagatcgg taacatgatc agcatctggg tctcccacag catccacacc 120
ggcaaccagc accaggctga gcctatctcc aacaccaact tcctgactga aaaggctgtg 180
gccagcgtca agctggctgg aaactccagc ctgtgcccca tcaacggttg ggccgtgtac 240
tctaaggaca actcaatcag gatcggctct aagggagacg tgttcgtcat cagagagcct 300
ttcatctctt gctcacacct ggaatgccgc accttcttcc tgactcaggg agccctgctg 360
aacgacaagc actccaacgg taccgtgaag gacaggtccc ctcacagaac tctgatgtct 420
tgccctgtgg gagaggctcc ttccccctac aacagccgtt tcgaatcagt ggcttggtct 480
gcttctgctt gccacgacgg cacctcttgg ctgactatcg gtatctctgg acctgacaac 540
ggtgctgtgg ctgtcctgaa gtacaacgga atcatcaccg acactatcaa gtcctggcgc 600
aacaacatcc tgcgtaccca ggagtccgaa tgcgcttgcg tgaacggaag ctgcttcacc 660
gtcatgactg acggtccatc aaacggccag gcctcccaca agatcttcaa gatggagaag 720
ggcaaggtgg tcaagtccgt ggaactggac gctcccaact accactacga ggaatgcagc 780
tgctacccag acgctggtga aatcacctgc gtgtgcaggg acaactggca cggatccaac 840
cgtccatggg tcagcttcaa ccagaacctg gaataccaga tcggctacat ctgctccgga 900
gtcttcggtg acaacccaag gcctaacgac ggtactggca gctgcggacc tgtgtcttca 960
aacggcgctt acggagtcaa gggtttctct ttcaagtacg gaaacggtgt gtggatcggc 1020
aggaccaagt caactaactc tagatcaggt ttcgagatga tctgggaccc taacggctgg 1080
accgaaactg actccagctt ctctgtgaag caggacatcg tcgccatcac cgactggtca 1140
ggctactccg gttccttcgt ccagcaccca gagctgactg gactggactg catccgccct 1200
tgcttctggg tggagctgat ccgcggtcgt cccaaggaaa gcaccatctg gacttctggt 1260
tcttcaatct cattctgcgg cgtgaactct gacaccgtcg gatggtcatg gcccgacggt 1320
gctgaactgc cattcactat cgacaagtaa 1350
<210> 9
<211> 1380
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NA6-nucleic acid
<400> 9
atgaacccca accagaagat cacttgcatc agcgctactg gcgtgaccct gtctgtggtc 60
tcactgctga tcggaatcac caacctggga ctgaacatcg gtctgcacta caaggtctct 120
gactcaacca ctatgaacat ccctaacatg aacgagacta accccaccac taccaacatc 180
accaacatca tcatgaacaa gaacgaggaa cgcactttcc tgaagctgac caagccactg 240
tgcgaagtga actcttggca catcctgtca aaggacaacg ctatccgcat cggcgaggac 300
gcccacatcc tggtcactcg tgaaccatac ctgtcttgcg accctcaggg atgcaggatg 360
ttcgctctgt cacagggcac taccctgaga ggacagcacg ccaacggtac catccacgac 420
aggtctccat tcagagctct gatctcatgg gagatgggtc aggccccttc cccctacaac 480
actcgcgtgg aatgcatcgg atggtccagc accagctgcc acgacggaat ctcccgtatg 540
agcatctgca tctccggccc taacaacaac gcttctgctg tggtctggta caggggtagg 600
cctgtgactg agatcccctc ctgggccggc aacatcctga ggacccagga gagcgaatgc 660
gtctgccaca agggtatctg cccagtggtc atgactgacg gccctgctaa ctctaaggct 720
gccaccaaga tcatctactt caaggaagga aagatccaga agactgagga actgcagggt 780
aacgcccagc acatcgagga atgctcctgc tacggagctg ccggtatgat caagtgcgtg 840
tgcagggaca actggaaggg agctaacaga cccatcatca ccatcgaccc agagatgatg 900
actcacacct ccaagtacct gtgcagcaag atcctgactg acacctcccg tcccaacgac 960
ccaactaacg gtaactgcga cgctcctatc accggtggca gcccagaccc tggtgtcaag 1020
ggattcgcct tcctggacgg cgaaaactct tggctgggac gcactatctc aaaggactcc 1080
cgtagcggat acgagatgct gaaggtgccc aacgctgaaa tcgacaccca gtccggtcca 1140
atcagctacc agctgatcgt caacaaccag aactggtctg gttactcagg cgctttcatc 1200
gactactggg ccaacaagga gtgcttcaac ccttgcttct acgtcgagct gatcaggggt 1260
agacccaagg aatctggcgt gctgtggacc tctaactcaa tggtcgctct gtgcggatca 1320
cgcgagcgtc tgggttcctg gagctggcac gacggtgctg aaatcatcta cttcaagtaa 1380
1380
<210> 10
<211> 1413
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NA8-nucleic acid
<400> 10
atgaacccaa accagaagat cgtgaccatc ggttctatct cactgggcct ggtggtcttc 60
aacgtcctgc tgcacgctgt gtccatcatc ctgactgtcc tggccctggg caagagcgag 120
aacaacggaa tctgcaacgg taccgtggtc cgcgagtaca acgaaactgt ccgtatcgaa 180
aaggtgaccc agtggtacaa cactagcgtg gtcgagtacg tgcctcactg gaacgaaggt 240
acctacatca acaacactga gcctatctgc gacgtcaagg gtttcgctcc cttctctaag 300
gacaacggca tcagggtcgg atcaagaggt cacatcttcg tgatcaggga gccattcgtc 360
tcctgcagcc ctgtggaatg cagaaccttc ttcctgactc agggttccct gctgaacgac 420
aagcacagca acggcaccgt gaaggaccgc tctccattcc gtactctgat gtctgtcgaa 480
gtgggacagt cacctaacgt ctaccaggct aggttcgaag ctgtggcttg gtcagctact 540
gcttgccacg acggcaagaa gtggatggcc atcggcgtca ctggacccga ctctaaggct 600
gtggccgtgg tccactacgg tggcgtccca accgacgtgg tcaactcatg ggctggcgac 660
atcctgcgca cccaggagtc cagctgcact tgcatccagg gaaactgcta ctgggtcatg 720
accgacggtc ctgctaacag gcaggcccag tacagaatct acaaggccaa ccagggcaag 780
atcatcggac gtactgacgt gtctttctca ggaggtcaca tcgaggaatg ctcctgctac 840
cccaacgacg gaaaggtcga gtgcgtgtgc agggacaact ggaccggtac taacagaccc 900
gtgctgatca tctccccaga cctgagctac agggtgggat acctctgcgc tggtctgcct 960
tctgacaccc ctcgcggtga ggacactcag ttcgtgggct cctgcaccag ccccatggga 1020
aaccagggct acggagtcaa gggtttcggc ttcaggcagg gaactgacgt ctgggtggga 1080
cgtaccatct cccgcacttc ccgtagcggc ttcgagatca tccgcatcaa gaacggatgg 1140
acccagacta gcaaggaaca gatccgccgt caggtggtcg tggacaactc taactggtca 1200
ggttactctg gctcattcac cctgccagtg gagctgtctg gtagggaatg cctggtccct 1260
tgcttctggg tggagatgat caggggcaga cccgaggaaa gaaccatctg gacttcttca 1320
tccagcatcg tcatgtgcgg cgtggactac gaaatcgctg actggtcctg gcacgacgga 1380
gccatcctgc ctttcgacat cgacaagatg taa 1413
<210> 11
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M1_Forward
<400> 11
tcccccgggc caccatgagc cttctgaccg aggtc 35
<210> 12
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M1_Reverse
<400> 12
ttacttctag attacttgaa ccgttgcatc tg 32
<210> 13
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HA5_Forward
<400> 13
gaattcatgg aaaagatcgt gctgctgttc g 31
<210> 14
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HA5_Reverse
<400> 14
aagcttttag atgcagatac ggcactgcag t 31
<210> 15
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NA1_Forward
<400> 15
gaattcatga acccaaacca gaagatcatc a 31
<210> 16
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NA1_Reverse
<400> 16
aagcttttac ttgtcgatag tgaatggcag tt 32
<210> 17
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NA6_Forward
<400> 17
gaattcatga accccaacca gaagatcact tg 32
<210> 18
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NA6_Reverse
<400> 18
aagcttttac ttgaagtaga tgatttcagc accg 34
<210> 19
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NA8_Forward
<400> 19
gaattcatga acccaaacca gaagatcgtg acc 33
<210> 20
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NA8_Reverse
<400> 20
aagcttttac atcttgtcga tgtcgaaagg cagg 34
Claims (15)
- 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1(Influenza virus matrix protein, M1);
헤마글루티닌(Hemagglutinin, HA) 단백질; 및
뉴라미니다아제(Neuraminidase, NA) 1, 뉴라미니다아제 6 및 뉴라미니다아제 8로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 뉴라미니다아제를 포함하는, 조류인플루엔자에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자. - 제1항에 있어서,
상기 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진, 조류인플루엔자에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자. - 제1항에 있어서,
상기 헤마글루티닌은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 조류인플루엔자에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자. - 제1항에 있어서,
상기 뉴라미니다아제는 서열번호 3의 아미노산 서열, 서열번호 4의 아미노산 서열 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진, 조류인플루엔자에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조류인플루엔자에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자를 포함하는, 백신 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 백신 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 보조제, 면역 자극제 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 포함하는 것인, 백신 조성물. - 서열번호 6의 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터;
서열번호 7의 헤마글루티닌 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터; 및
서열번호 8의 뉴라미니다아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터, 서열번호 9의 뉴라미니다아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터 및 서열번호 10의 뉴라미니다아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 발현 벡터;를
포함하는 조류인플루엔자에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자 제조용 조성물. - 제7에 있어서,
상기 발현 벡터는 바큘로바이러스(Baculovirus) 벡터인, 조류인플루엔자에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자 제조용 조성물. - 제7항 또는 제8항의 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포.
- 제9항에 있어서,
상기 숙주 세포는 미생물, 동물세포, 식물세포, 동물에서 유래한 배양세포, 또는 식물에서 유래한 배양세포인, 형질 전환된 숙주 세포. - 제9항에 있어서,
상기 숙주 세포는 곤충 유래의 SF9세포인, 형질 전환된 숙주 세포. - (a) 서열번호 6의 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1을 암호화하는 핵산 서열; 서열번호 7의 헤마글루티닌 단백질을 암호화하는 핵산 서열; 및 서열번호 8의 뉴라미니다아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열, 서열번호 9의 뉴라미니다아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및 서열번호 10의 뉴라미니다아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 핵산 서열을 각각 포함하는 발현 벡터를 제작하는 단계;
(b) 상기 발현 벡터를 이용하여 숙주세포에 형질감염(transfection)시키는 단계;
(c) 상기 형질감염된 숙주세포를 배양하고, 그 배양물을 수득하는 단계; 및
(d) 상기 배양물로부터 바이러스 유사입자를 수득하는 단계;를
포함하는 조류인플루엔자에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자 제조방법. - 제12항에 있어서,
상기 (a) 단계의 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 1을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 11의 핵산 서열로 이루어진 제1 프라이머 및 서열번호 12의 핵산 서열로 이루어진 제2 프라이머를 포함하는 프라이머쌍에 의해 증폭되는 것인, 조류인플루엔자에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자 제조방법. - 제12항에 있어서,
상기 (a) 단계의 헤마글루티닌 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 13의 핵산 서열로 이루어진 제3 프라이머 및 서열번호 14의 핵산서열로 이루어진 제4 프라이머를 포함하는 프라이머쌍에 의해 증폭되는 것인, 조류인플루엔자에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자 제조방법. - 제12항에 있어서,
상기 (a) 단계의 뉴라미니다아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 15의 핵산 서열로 이루어진 제5 프라이머 및 서열번호 16의 핵산 서열로 이루어진 제6 프라이머를 포함하는 프라이머쌍;
서열번호 17의 핵산 서열로 이루어진 제7 프라이머 및 서열번호 18의 핵산 서열로 이루어진 제8 프라이머를 포함하는 프라이머쌍; 및
서열번호 19의 핵산 서열로 이루어진 제9 프라이머 및 서열번호 20의 핵산 서열로 이루어진 제10 프라이머를 포함하는 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머쌍에 의해 증폭되는 것인, 조류인플루엔자에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스-유사입자 제조방법.
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KR20180046968A (ko) * | 2016-10-28 | 2018-05-10 | 성신여자대학교 산학협력단 | H5 조류 인플루엔자 바이러스 유사입자 백신 및 그 제조방법 |
Non-Patent Citations (4)
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GenBank: AAT73328.1, 2016.07.26. * |
GenBank: EF467824.1, 2008.05.01. * |
GenBank: EU118132.1, 2008.05.01. * |
PLOS ONE. 2019, 14(6): e0216871. * |
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