KR101183251B1 - Ａ／Ｋｏｒｅａ／ＣＪ01／09 및 Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｋｏｒｅａ／ＣＡＮ01／04의 유전자를 포함하는 재조합 돼지 신종인플루엔자 Ａ 바이러스 및 이를 포함하는 돼지 인플루엔자 바이러스 백신 - Google Patents

Ａ／Ｋｏｒｅａ／ＣＪ01／09 및 Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｋｏｒｅａ／ＣＡＮ01／04의 유전자를 포함하는 재조합 돼지 신종인플루엔자 Ａ 바이러스 및 이를 포함하는 돼지 인플루엔자 바이러스 백신 Download PDF

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Abstract

본 발명은 재조합 돼지 신종인플루엔자 A 바이러스 및 이를 포함하는 돼지 신종인플루엔자 A 바이러스 백신에 관한 것으로, 보다 상세하게는 돼지 인플루엔자 A 바이러스를 백본으로 하고 여기에 국내 사람 신종인플루엔자 바이러스 A/Korea/CJ01/09의 HA 및 NA 유전자를 포함시켜 제조한 재조합 돼지 신종인플루엔자 A 바이러스 및 이를 포함하는 돼지 신종인플루엔자 A 바이러스 백신에 관한 것이다.

Description

Ａ／Ｋｏｒｅａ／ＣＪ01／09 및 Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｋｏｒｅａ／ＣＡＮ01／04의 유전자를 포함하는 재조합 돼지 신종인플루엔자 Ａ 바이러스 및 이를 포함하는 돼지 인플루엔자 바이러스 백신{Recombinant swine influenza A virus comprising the gene of A/Korea/CJ01/09 and A/swine/Korea/CAN01/04, and the swine influenza A virus vaccine comprising the same}
본 발명은 재조합 돼지 신종인플루엔자 A 바이러스 및 이를 포함하는 돼지 신종인플루엔자 A 바이러스 백신에 관한 것으로, 보다 상세하게는 돼지 인플루엔자 A 바이러스를 백본(backbone)으로 하고 여기에 국내 사람 신종인플루엔자 바이러스 A/Korea/CJ01/09의 HA 및 NA 유전자를 포함시켜 제조한 재조합 돼지 신종인플루엔자 A 바이러스 및 이를 포함하는 돼지 신종인플루엔자 A 바이러스 백신에 관한 것이다.
신종인플루엔자 A(H1N1) 바이러스는 돼지에서 발생하는 호흡기 질환으로 현재 전 세계적으로 사람에게 감염을 일으키고 있는 호흡기 질환의 원인 바이러스이며, “돼지독감(SI: Swine Influenza)” 또는 “돼지인플루엔자” 등으로 불리고 있다. 최근에 미국, 캐나다, 일본 및 호주 등 많은 국가에서 신종인플루엔자 A (H1N1) 바이러스에 의한 돼지의 감염이 보고되었고, 국내 양돈장에서도 2009년 12월부터 발생이 보고되었다.
한편, 돼지는 사람, 조류 및 돼지 바이러스의 혼합 감염에 의하여 새로운 재조합 바이러스를 만들어 내는 혼합 용기(mixing vessel)로도 널리 알려져 있다.
이에 본 발명에서는 돼지에서 분리된 돼지 인플루엔자 A 바이러스의 유전자를 백본으로 하고, 여기에 국내 사람에서 분리한 신종인플루엔자 A 바이러스의 표면단백질을 포함시켜 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스를 제조할 경우 돼지에서 변종 바이러스의 출현을 예방할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 양돈장에 돼지인플루엔자 A(H1N1) 바이러스 유입 시 돼지의 감염 및 바이러스 배출을 억제하고 돼지에서 새로운 재조합 인플루엔자 바이러스의 출현을 억제할 수 있는 돼지용 인플루엔자 A(H1N1) 바이러스 및 이를 포함하는 백신을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 기탁번호 KCTC 11165BP의 A/swine/Korea/CAN01/04 (H1N1) 바이러스의 내부 유전자 중 서열번호 1～6의 유전자 및 기탁번호 KCTC 11690BP의 표면 단백질 유전자를 포함하는 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스를 제공한다.
또한 본 발명에서는 상기 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스를 포함하는 돼지 인플루엔자 A 바이러스 백신을 제공한다.
본 발명에 의한 재조합 바이러스 백신으로 마우스와 미니 돼지를 면역(immunization)한 후 돼지 인플루엔자 A (H1N1) 바이러스를 공격접종하여 효능을 평가한 결과, 돼지 인플루엔자 A (H1N1) 바이러스에 대하여 방어효능과 증식억제 능력이 탁월함을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 의한 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스를 활용한다면, 국내 양돈장을 돼지 인플루엔자 A(H1N1) 바이러스로부터 보호할 수 있을 뿐만 아니라, 돼지에서 출현 가능한 변종 바이러스의 출현도 막을 수 있다.
도 1은 본 발명에 의한 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스의 개열지도이다.
도 2는 고전적인 방법을 이용하여 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스 CL A/Korea/CJ01/09 x CAN01을 제조하는 과정을 보여주는 모식도이다.
도 3은 역유전자기법(Reverse Genetics)을 이용하여 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스 CL A/Korea/CJ01/09 x CAN01을 제조하는 과정을 보여주는 모식도이다.
본 발명은 돼지에서 분리한 돼지 인플루엔자 A(H1N1) 바이러스의 서열번호 1～6의 내부 유전자를 백본으로 하고, 여기에 국내 사람에서 분리한 신종인플루엔자 A(H1N1) 바이러스의 표면 단백질을 포함시켜 제조한 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스에 관한 것이다.
본 발명에서 사용하는 돼지 인플루엔자 A(H1N1) 바이러스는 기탁번호 KCTC 11165BP의 A/swine/Korea/CAN01/04 (H1N1)이며, 보다 상세하게는 상기 A/swine/Korea/CAN01/04 (H1N1) 바이러스의 내부 유전자 중 M, NP, NS, PA, PB1 및 PB2 단백질을 인코딩하는 서열번호 1～6의 유전자를 사용한다.
또한 본 발명에서 분리한 국내 사람 신종인플루엔자 A(H1N1) 바이러스를 “A/Korea/CJ01/09 (H1N1)”으로 명명하였고, 이를 국제기탁기관인 한국생명공학연구소 유전자은행(Korean Collection for Type Cultures)에 2010년 4월 27일자로 기탁하였으며, 그로부터 기탁번호 KCTC 11690BP를 부여받았다. 본 발명에서는 상기 바이러스의 표면 단백질인 HA 및 NA 단백질을 각각 인코딩하는 서열번호 7 및 8의 유전자를 사용한다. 상기 HA 및 NA 유전자는 최근 판데믹(pandemic) A/H1N1/2009의 바이러스의 유전자와 99.9%의 상동성을 보이며, 기존의 돼지 바이러스와는 약 90% 정도의 상동성으로 비교적 상이하다.
본 발명에 의한 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스는 도 1에 도시된 바와 같이, 서열번호 1～6의 M, NP, NS, PA, PB1 및 PB2 유전자를 골격으로 하고, 여기에 서열번호 7의 HA 및 서열번호 8의 NA 유전자를 포함하여 구성된다(CL A/Korea/CJ01/09 x CAN01).
본 발명에 의한 재조합 돼지 신종인플루엔자 A 바이러스는 그 제조방법에 있어 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 잘 알려진 통상적인 방법으로 당업자가 용이하게 제조할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 도 2에 도시된 바와 같이 고전적인 재조합 바이러스 제조방법인 세포내(유정란) 복합 감염 및 프라그 시험법(plaque assay)을 이용하여 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스 CL A/Korea/CJ01/09 x CAN01 만을 순수 분리할 수 있다. 또한 본 발명의 다른 일 실시예에서는 도 3에 도시된 바와 같이 역유전자기법(Reverse Genetics)을 통한 시험관법(in vitro)으로 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스를 제조할 수 있으나, 이에만 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 의한 돼지 인플루엔자 A 바이러스 백신은 상기 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스 자체를 사용할 수도 있고, 상기 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스에 통상적으로 사용가능한 첨가물, 보조제(adjuvant) 또는 담체 등과 함께 사용할 수 있다.
이하, 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니고, 당업계에서 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며, 이에 대한 것도 본 발명의 범위에 포함된다.
[실시예 1] A/Korea/CJ01/09 (H1N1) 바이러스 분리
충북대학교 병원에 신종플루 증상으로 입원한 환자에서 채취한 비후두 분비물을 항생제가 포함된 세포배양 배지에 넣고 혼탁액을 제조한 다음 원심분법을 이용하여, 비분비물을 제거한 후 상층액을 MDCK 세포에 감염시킨 다음 48시간동안 CO2 세포배양기에서 배양하여 바이러스를 분리하였다. 분리된 바이러스는 RT-PCR과 유전자 분석을 통해 신종 인플루엔자 바이러스임을 확인하였다.
상기에서 분리한 국내 사람 신종인플루엔자 바이러스를 “A/Korea/CJ01/09 (H1N1)”라 명명하였고, 이를 국제기탁기관인 한국생명공학연구소 유전자은행(Korean Collection for Type Cultures)에 2010년 4월 27일자로 기탁하였으며, 그로부터 기탁번호 KCTC 11690 BP를 부여받았다.
[실시예 2] 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스의 제조(1)
상기 실시예 1에서 분리한 A/Korea/CJ01/09 (H1N1) 바이러스와 국내 돼지에서 분리한 A/swine/Korea/CAN01/04 (H1N1)를 MDCK 세포에 동시에 감염시킨 후 A/swine/Korea/CAN01/04 바이러스에 대한 항체를 넣어주었다.
세포변성효과(CPE)가 관찰되면 배양 상층액을 시간별로 미리 준비한 MDCK 세포(6웰 플레이트에 미리 배양시킨 상태)에 계단희석한 다음 감염시켜 프라그 시험법을 실시하였다. 한천(Agarose) 0.7% 배지 혼합액으로 세포를 덮고 48시간 동안 37℃ CO2 항온배양기에서 배양하였다. 48시간 후 프라그가 관찰되면 프라그를 수거해 각각 10일령 유정란에 접종하였다.
48시간 후 계란에서 분리된 바이러스의 유전자 분석을 통해 A/swine/Korea/CAN01/04 바이러스 6개의 내부 유전자를 함유하고, 국내 사람에서 분리된 신종인플루엔자 A(H1N1) 분리주인 A/Korea/CJ01/09 바이러스의 표면 단백질인 HA 및 NA 유전자를 함유한 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스를 선별한 후 이렇게 만들어진 바이러스를 CL A/Korea/CJ01/09 x CAN01로 명명하였다. 백신 제조를 위하여 바이러스를 유정란에서 배양한 다음, 바이러스가 포함된 요막액(allantoic fluid)을 0.025%의 포르말린에 처리하여 불활화하였다.
[실시예 3] 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스의 제조(2)
상기 실시예 1에서 분리한 A/Korea/CJ01/09 (H1N1)의 HA(서열번호 7)와 NA(서열번호 8) 유전자를 각각 발현벡터 pHW2000에 삽입하여 준비하였다. 한편 A/Swine/Korea/CAN01/04의 M(서열번호 1), NP(서열번호 2), NS(서열번호 3), PA(서열번호 4), PB1(서열번호 5) 및 PB2(서열번호 6) 유전자를 각각 발현벡터 pHW2000에 삽입하여 준비하였다. 상기 서열번호 1～8의 유전자가 각각 삽입되어 있는 발현벡터들을 형질감염 시약(Mirus)과 함께 모두 혼합한 후 40분간 실온에 놓아두었다.
24시간 전에 준비해 둔 Vero 세포에 벡터 혼합액을 조심스럽게 넣은 다음 6시간 후에 배양액을 무혈청 배양액으로 교체해 주었다. 형질감염 후 36시간이 지나면 TPCK-트립신을 넣어준 배양액을 첨가해 주고 48시간이 지난 후부터 10일령 유정란을 이용하여 상층액을 접종하였다.
48시간 후 계란에서 분리된 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스를 실시예 2와 동일한 방법으로 불활화시켰다.
[시험예 1] 동물실험을 통한 항원성 평가
< 마우스 모델 >
본 발명에서 개발된 재조합 백신 후보주 바이러스 CL A/Korea/CJ01/09 x CAN01 의 항원성을 평가하기 위하여, 실시예 3에서 제조한 재조합 바이러스와 국내 돼지에서 분리된 돼지인플루엔자 바이러스인 A/swine/Korea/CAN01/04 분리주를 10일령 유정란에 각각 10개씩 접종하고 48시간 후에 요수를 검출하여 0.5% 칠면조 RBC로 헤마글루티닌 테스트(Hemagglutinin test)를 통해 역가를 확인하였다.
분리된 요수를 0.025% 농도로 포르말린을 처리하고 72시간동안 4℃에서 보관한 후 완전히 불활화되어 증식 가능한 바이러스가 없는 것을 10일령 유정란에 접종하여 확인하였다.
20% 수크로오스 쿠션을 넣은 SW28 스윙로터 버켓(Beckman, USA)에 불활화된 바이러스 요수를 넣고 25,000 rpm에서 3시간동안 침강시켜 바이러스만 순수하게 분리하였다. 분리된 바이러스의 단백질량을 측정한 후 HA 단백질이 3.5 ㎍/100 ㎕가 되도록 만들었다.
원하는 농도의 바이러스 용액에 2%의 명반(alum)을 섞어주고 24시간 후에 마우스에 근육접종(3.5 ㎍/100 ㎕; 1차 접종) 함으로써 항원성을 평가하였다. 바이러스 접종 2주 후에 위와 동일한 방법으로 2차 접종을 실시하였다.
백신 후 보주 바이러스 접종에 의한 항체형성 유무를 확인하기 위하여, 마우스 안와에서 혈청을 분리하여 RDE를 처리하고 신종인플루엔자 바이러스인 A/Korea/CJ01/09와 돼지인플루엔자 바이러스인 A/swine/Korea/CAN01/04 바이러스를 사용하여 혈구응집억제반응 검사(Hemagglutinin inhibition (HI) test)를 수행하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
접종 바이러스 백신 처방 항체가 변화
HA 함량(3.5 ㎍) A/swine/Korea/CAN01/04 A/Korea/CJ01/09
A/swine/Korea/CAN01/04 1차 접종 20-40 <20
2차 접종 80-320 20
CL A/Korea/CJ01/09 x CAN01 1차 접종 <20 40-80
2차 접종 20-40 160-320
상기 표 1의 결과에서, 1차 바이러스 접종하고 2주 후에 분리한 혈청의 경우 이종(heterologous) 바이러스와는 전혀 반응하지 않았으며, 2차 접종하고 2주 후에 이종 바이러스와 20-40 정도의 역가가 나와 항원성이 낮은 것으로 판단하였다. 그러나 동종(homologous) 바이러스의 경우 2차 접종하고 2주 후에 2개의 백신 후보주 바이러스로 접종한 마우스의 혈청에서 매우 높은 항체가(160-320)를 나타내 높은 항원성이 있는 것으로 확인되었다.
< 미니돼지 모델 >
마우스 모델에서와 동일한 방법으로 실시예 3에서 제조한 CL A/Korea/CJ01/09 x CAN01 바이러스와 돼지인플루엔자 바이러스인 A/swine/Korea/CAN01/04를 불활화하여 준비하고 1 마리당 1회 접종량이 7.5 ㎍/ml의 HA 단백질 양이 되도록 만든 후 2% 명반과 섞어주고 24시간 동안 4℃에 보관하였다.
준비된 백신을 마리당 1 ml 씩 근육으로 주사하고 2주 후에 혈청을 채취한 다음 2차 접종을 실시하였다. 분리된 혈청은 마우스 실험에서와 동일한 방법으로 혈구응집억제반응검사를 실시하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
접종 바이러스 백신 처방 항체가 변화
HA 함량(7.5 ㎍) A/swine/Korea/CAN01/04 A/Korea/CJ01/09
A/swine/Korea/CAN01/04 1차 접종 40-80 <20
2차 접종 160-320 20
CL A/Korea/CJ01/09 x CAN01 1차 접종 <20 40-80
2차 접종 20-40 320
상기 표 2의 결과에서, 1차 백신 접종 2주 후에 채취한 혈청의 경우 각각의 바이러스에 대한 동종 시험(homologous test)에서는 40-80 사이의 항체가를 보인 반면 이종 시험(heterologous test)에서는 마우스의 결과와 마찬가지로 전혀 교차반응이 일어나지 않았다.
또한 2차 백신 접종 2주 후의 결과에서는 역시 마우스 결과와 유사하게 이종 시험에서도 20-40 정도의 교차반응이 있었지만 동종 시험에서는 높은 항체가(320)를 나타내어 높은 면역원성을 가지는 것을 확인하였다.
[시험예 2] 공격접종에 의한 방어능
본 발명에 의한 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스 접종에 의한 방어능을 확인하기 위하여, i) 돼지 인플루엔자 A/swine/Korea/CAN01/04 바이러스, 또는 ii) 실시예 3에서 제조한 CL A/Korea/CJ01/09 x CAN01 바이러스를 2주 간격으로 2차 접종하고 2주 후에 돼지인플루엔자 바이러스 A/Korea/CJ01/09 및 돼지인플루엔자 A/swine/Korea/CAN01/04 바이러스 105TCID50/ml를 각각 비강으로 공격 접종하였다. 공격접종 2, 4, 5, 6, 7 및 8일 후에 비즙 시료를 채취하여 바이러스 배출 여부를 확인하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 또한 공기전파에 의한 감염여부도 동거군을 포함시켜 확인하였고, 바이러스 역가는 종란접종으로 확인하였으며(log10EID50/ml), 검출 민감도는 0.7log10EID50/ml 이었다(“-”는 바이러스가 검출되지 않았음을 의미하며 “*”는 표준편차이다).
일
(day)		 바이러스 역가(log10EID50/ml)
A/Korea/CJ01/09 챌린지(Challenge) A/swine/Korea/CAN01/04 챌린지
A/swine/Korea/CAN01/04 CL A/Korea/CJ01/09 x CAN01 A/swine/Korea/CAN01/04 CL A/Korea/CJ01/09 x CAN01
감염 공기전파 감염 공기전파 감염 공기전파 감염 공기전파
-1 -　 -　 -　 -　 -　 -　 -　 -　
0 - - - - - - - -
2 5 (0.3)* - 2.5 (0.3) - 4.7(0.3) - 2.3 (0.3) -
4 5 (0.5) 2 (0.3) 1.7 (0.2) - 5 (0.5) 2 (0.3) 1.7 (0.2) -
5 3 (0.3) 2 (0.3) - - 2.3 (0.3) 2.5 (0.3) - -
6 - 1 (0.3) - - - 1 (0.3) - -
7 - - - - - - - -
8 -　 -　 -　 -　 -　 -　 -　 -　
상기 표 3의 결과에서, 실시예 3에서 제조한 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스를 불활화하여 백신 접종한 돼지는 신종인플루엔자 공격접종에 대해 바이러스 배출도 짧게 이루어지고 공기전파에 의한 감염도 일어나지 않았다.
하지만 돼지인플루엔자 A/swine/Korea/CAN01/04로 면역한 돼지는 신종인플루엔자 공격접종에 대해 바이러스도 더 오래 배출되고 공기전파를 통해 동거군 돼지로의 감염도 이루어지는 것을 확인하였다. 즉, 본 발명에 의한 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스를 불활화하여 백신 접종한 돼지에 A/swine/Korea/CAN01/04 돼지인플루엔자 바이러스로 공격 접종한 경우에도 동종 바이러스로 면역한 경우는 방어가 되었으나 본 발명에 의한 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스로 면역한 경우에는 방어가 되지 않음을 확인하였다.
한국생명공학연구원 KCTC11690BP 20100427
서열목록 전자파일 첨부

Claims (4)

  1. 기탁번호 KCTC 11165BP의 A/swine/Korea/CAN01/04 (H1N1) 바이러스의 내부 유전자 중 서열번호 1～6의 유전자 및
    기탁번호 KCTC 11690BP의 바이러스 표면 단백질 유전자를 포함하는 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 기탁번호 KCTC 11690BP의 바이러스 표면 단백질 유전자는 서열번호 7의 HA 및 서열번호 8의 NA 유전자로 구성된 것임을 특징으로 하는 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 의한 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스를 포함하는 돼지 인플루엔자 바이러스 백신.
  4. 제 3항에 의한 돼지 인플루엔자 바이러스 백신을 돼지에 접종하여 돼지 인플루엔자 A 바이러스에 의한 발병을 예방하는 방법.
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