KR101177350B1 - Ａ／ＳＷ／Ｋｏｒｅａ／ＳＣＪ01／09 및 Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／08／34의 유전자를 포함하는 재조합 돼지 신종인플루엔자 Ａ 바이러스 및 이를 포함하는 돼지 인플루엔자 바이러스 백신 - Google Patents

Ａ／ＳＷ／Ｋｏｒｅａ／ＳＣＪ01／09 및 Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／08／34의 유전자를 포함하는 재조합 돼지 신종인플루엔자 Ａ 바이러스 및 이를 포함하는 돼지 인플루엔자 바이러스 백신 Download PDF

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Abstract

본 발명은 재조합 돼지 신종인플루엔자 A 바이러스 및 이를 포함하는 돼지 신종인플루엔자 A 바이러스 백신에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인간 인플루엔자 바이러스 A/Puerto Rico/08/34를 백본으로 하고 여기에 국내 신규 돼지 인플루엔자 바이러스 A/SW/Korea/SCJ01/09의 HA 및 NA 유전자를 포함시켜 제조한 재조합 돼지 신종인플루엔자 A 바이러스 및 이를 포함하는 돼지 신종인플루엔자 A 바이러스 백신에 관한 것이다.

Description

Ａ／ＳＷ／Ｋｏｒｅａ／ＳＣＪ01／09 및 Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／08／34의 유전자를 포함하는 재조합 돼지 신종인플루엔자 Ａ 바이러스 및 이를 포함하는 돼지 인플루엔자 바이러스 백신{Recombinant swine influenza A virus comprising the gene of A/SW/Korea/SCJ01/09 and A/Puerto Rico/08/34, and the swine influenza A virus vaccine comprising the same}
본 발명은 재조합 돼지 신종인플루엔자 A 바이러스 및 이를 포함하는 돼지 신종인플루엔자 A 바이러스 백신에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인간 인플루엔자 바이러스 A/Puerto Rico/08/34를 백본(backbone)으로 하고 여기에 국내 신규 돼지 인플루엔자 바이러스 A/SW/Korea/SCJ01/09의 HA 및 NA 유전자를 포함시켜 제조한 재조합 돼지 신종인플루엔자 A 바이러스 및 이를 포함하는 돼지 신종인플루엔자 A 바이러스 백신에 관한 것이다.
신종인플루엔자 A(H1N1) 바이러스는 돼지에서 발생하는 호흡기 질환으로 현재 전 세계적으로 사람에게 감염을 일으키고 있는 호흡기 질환의 원인 바이러스이며, “돼지독감(SI: Swine Influenza)” 또는 “돼지인플루엔자” 등으로 불리고 있다. 최근에 미국, 캐나다, 일본 및 호주 등 많은 국가에서 신종인플루엔자 A (H1N1) 바이러스에 의한 돼지의 감염이 보고되었고, 국내 양돈장에서도 2009년 12월부터 발생이 보고되었다.
한편, 돼지는 사람, 조류 및 돼지 바이러스의 혼합 감염에 의하여 새로운 재조합 바이러스를 만들어 내는 혼합 용기(mixing vessel)로도 널리 알려져 있다.
이에 본 발명에서는 인간 인플루엔자 바이러스 A/Puerto Rico/08/34를 백본으로 하고, 여기에 국내 신규 돼지 인플루엔자 바이러스 A/SW/Korea/SCJ01/09의 표면단백질을 포함시켜 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스를 제조할 경우 돼지에서 출현가능한 변종 바이러스의 출현을 예방할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 양돈장에 돼지인플루엔자 A(H1N1) 바이러스 유입 시 돼지의 감염 및 바이러스 배출을 억제하고 돼지에서 새로운 재조합 인플루엔자 바이러스의 출현을 억제할 수 있는 돼지용 인플루엔자 A(H1N1) 바이러스 및 이를 포함하는 백신을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 A/PR/08/34 (H1N1) 바이러스의 내부 유전자 중 서열번호 1～6의 유전자 및 기탁번호 KCTC 1169 BP의 표면 단백질 유전자를 포함하는 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스를 제공한다.
또한 본 발명에서는 상기 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스를 포함하는 돼지 인플루엔자 A 바이러스 백신을 제공한다.
본 발명에 의한 재조합 바이러스 백신으로 마우스와 미니 돼지를 면역(immunization)한 후 돼지 인플루엔자 A (H1N1) 바이러스를 공격접종하여 효능을 평가한 결과, 돼지 인플루엔자 A (H1N1) 바이러스에 대하여 방어효능과 증식억제 능력이 탁월함을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 의한 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스를 활용한다면, 국내 양돈장을 돼지 인플루엔자 A(H1N1) 바이러스로부터 보호할 수 있을 뿐만 아니라, 돼지에서 출현 가능한 변종 바이러스의 출현도 막을 수 있다.
도 1은 본 발명에 의한 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스의 개열지도이다.
도 2는 고전적인 방법을 이용하여 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스 CL A/SW/Korea/SCJ01/09 x PR8을 제조하는 과정을 보여주는 모식도이다.
도 3은 역유전자기법(Reverse Genetics)을 이용하여 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스 CL A/SW/Korea/SCJ01/09 x PR8을 제조하는 과정을 보여주는 모식도이다.
도 4는 돼지 인플루엔자 A 바이러스 접종 후 미니 돼지의 체온 변화를 관찰한 그래프이다.
본 발명은 인간 인플루엔자 바이러스 A/Puerto Rico/08/34(이하, “A/PR/08/34”라 함)의 서열번호 1～6의 내부 유전자를 백본으로 하고, 여기에 국내 사람에서 분리한 신종인플루엔자 A(H1N1) 바이러스의 표면 단백질 유전자를 포함시켜 제조한 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스에 관한 것이다.
본 발명에서는 상기 인간 인플루엔자 바이러스 A/Puerto Rico/08/34의 내부 유전자 중 M, NP, NS, PA, PB1 및 PB2 단백질을 인코딩하는 서열번호 1～6의 유전자를 사용한다.
또한 본 발명에서 분리에 성공한 신규 돼지 인플루엔자 A(H1N1) 바이러스를 “A/SW/Korea/SCJ01/09 (H1N1)”로 명명하였고, 이를 국제기탁기관인 한국생명공학연구소 유전자은행(Korean Collection for Type Cultures)에 2010년 4월 27일자로 기탁하였으며, 그로부터 기탁번호 KCTC 11691BP를 부여받았다. 본 발명에서는 상기 바이러스의 표면 단백질인 HA 및 NA 단백질을 각각 인코딩하는 서열번호 7 및 8의 유전자 (첨부 2)를 사용한다. 상기 HA 및 NA 유전자는 최근 판데믹(pandemic) A/H1N1/2009의 바이러스의 유전자와 99.9%의 상동성을 보이며, 기존의 돼지 바이러스와는 약 90% 정도의 상동성으로 비교적 상이하다.
본 발명에 의한 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스는 도 1에 도시된 바와 같이, 서열번호 1～6의 M, NP, NS, PA, PB1 및 PB2 유전자를 골격으로 하고, 여기에 서열번호 7의 HA 및 서열번호 8의 NA 유전자를 포함하여 구성된다(CL A/SW/Korea/SCJ01/09 x PR8).
본 발명에 의한 재조합 돼지 신종인플루엔자 A 바이러스는 그 제조방법에 있어 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 잘 알려진 통상적인 방법으로 당업자가 용이하게 제조할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 도 2에 도시된 바와 같이 고전적인 재조합 바이러스 제조방법인 세포내(유정란) 복합 감염 및 프라그 시험법(plaque assay)을 이용하여 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스 CL A/SW/Korea/SCJ01/09 x PR8 만을 순수 분리할 수 있다. 또한 본 발명의 다른 일 실시예에서는 도 3에 도시된 바와 같이 역유전자기법(Reverse Genetics)을 통한 시험관법(in vitro)으로 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스를 제조할 수 있으나, 이에만 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 의한 돼지 인플루엔자 A 바이러스 백신은 상기 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스 자체를 사용할 수도 있고, 상기 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스에 통상적으로 사용가능한 첨가물, 보조제(adjuvant) 또는 담체 등과 함께 사용할 수 있다.
이하, 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니고, 당업계에서 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며, 이에 대한 것도 본 발명의 범위에 포함된다.
[실시예 1] A/SW/Korea/SCJ01/09 (H1N1) 바이러스 분리
국내의 도축장에서 수거한 돼지의 폐에서 바이러스 감염 의심 부위를 절제하여, 항생제가 포함된 세포배양 배지에 넣고 혼탁액을 제조한 다음 원심분법을 이용하여, 비분비물을 제거한 후 상층액을 MDCK 세포에 감염시킨 다음 48시간동안 CO2 세포배양기에서 배양하여 바이러스를 분리하였다. 분리된 바이러스는 RT-PCR과 유전자 분석을 통해 신종 인플루엔자 바이러스임을 확인하였다.
상기에서 분리한 국내 사람 신종인플루엔자 바이러스를 “A/SW/Korea/SCJ01/09 (H1N1)”라 명명하였고, 이를 국제기탁기관인 한국생명공학연구소 유전자은행(Korean Collection for Type Cultures)에 2010년 4월 27일자로 기탁하였으며, 그로부터 기탁번호 KCTC 11691BP를 부여받았다.
[실시예 2] 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스의 제조(1)
상기 실시예 1에서 분리한 A/SW/Korea/SCJ01/09 (H1N1) 바이러스와 인간 인플루엔자 바이러스 A/PR/08/34 (H1N1)를 MDCK 세포에 동시에 감염시킨 후 A/PR/08/34 바이러스에 대한 항체를 넣어주었다.
세포변성효과(CPE)가 관찰되면 배양 상층액을 시간별로 미리 준비한 MDCK 세포(6웰 플레이트에 미리 배양시킨 상태)에 계단희석한 다음 감염시켜 프라그 시험법을 실시하였다. 한천(Agarose) 0.7% 배지 혼합액으로 세포를 덮고 48시간 동안 37℃ CO2 항온배양기에서 배양하였다. 48시간 후 프라그가 관찰되면 프라그를 수거해 각각 10일령 유정란에 접종하였다.
48시간 후 계란에서 분리된 바이러스의 유전자 분석을 통해 A/PR/08/34 바이러스 6개의 내부 유전자를 함유하고, 국내 사람에서 분리된 신종인플루엔자 A(H1N1) 분리주인 A/SW/Korea/SCJ01/09 바이러스의 표면 단백질인 HA 및 NA 유전자를 함유한 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스를 선별한 후 이렇게 만들어진 바이러스를 CL A/SW/Korea/SCJ01/09 x PR8로 명명하였다. 백신 제조를 위하여 바이러스를 유정란에서 배양한 다음, 바이러스가 포함된 요막액(allantoic fluid)을 0.025%의 포르말린에 처리하여 불활화하였다.
[실시예 3] 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스의 제조(2)
상기 실시예 1에서 분리한 A/SW/Korea/SCJ01/09 (H1N1)의 HA(서열번호 7)와 NA(서열번호 8) 유전자를 각각 발현벡터 pHW2000에 삽입하여 준비하였다. 한편 A/PR/08/34의 M(서열번호 1), NP(서열번호 2), NS(서열번호 3), PA(서열번호 4), PB1(서열번호 5) 및 PB2(서열번호 6) 유전자를 각각 발현벡터 pHW2000에 삽입하여 준비하였다. 상기 서열번호 1～8의 유전자가 각각 삽입되어 있는 발현벡터들을 형질감염 시약(Mirus)과 함께 모두 혼합한 후 40분간 실온에 놓아두었다.
24시간 전에 준비해 둔 Vero 세포에 벡터 혼합액을 조심스럽게 넣은 다음 6시간 후에 배양액을 무혈청 배양액으로 교체해 주었다. 형질감염 후 36시간이 지나면 TPCK-트립신을 넣어준 배양액을 첨가해 주고 48시간이 지난 후부터 10일령 유정란을 이용하여 상층액을 접종하였다.
48시간 후 계란에서 분리된 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스를 실시예 2와 동일한 방법으로 불활화시켰다.
[시험예 1] 동물실험을 통한 항원성 평가
< 마우스 모델 >
본 발명에서 개발된 재조합 백신 후보주 바이러스 CL A/SW/Korea/SCJ01/09 x PR8 의 항원성을 평가하기 위하여, 실시예 3에서 제조한 재조합 바이러스와 A/swine/Korea/CAN01/04를 10일령 유정란에 각각 10개씩 접종하고 48시간 후에 요수를 검출하여 0.5% 칠면조 RBC로 헤마글루티닌 테스트(Hemagglutinin test)를 통해 역가를 확인하였다.
분리된 요수를 0.025% 농도로 포르말린을 처리하고 72시간 동안 4℃에서 보관한 후 완전히 불활화되어 증식 가능한 바이러스가 없는 것을 10일령 유정란에 접종하여 확인하였다.
20% 수크로오스 쿠션을 넣은 SW28 스윙로터 버켓(Beckman, USA)에 불활화된 바이러스 요수를 넣고 25,000 rpm에서 3시간동안 침강시켜 바이러스만 순수하게 분리하였다. 분리된 바이러스의 단백질량을 측정한 후 HA 단백질이 3.5 ㎍/100 ㎕가 되도록 만들었다.
원하는 농도의 바이러스 용액에 2%의 명반(alum)을 섞어주고 24시간 후에 마우스에 근육접종(3.5 ㎍/100 ㎕; 1차 접종) 함으로써 항원성을 평가하였다. 바이러스 접종 2주 후에 위와 동일한 방법으로 2차 접종을 실시하였다.
백신 후 보주 바이러스 접종에 의한 항체형성 유무를 확인하기 위하여, 마우스 안와에서 혈청을 분리하여 RDE를 처리하고 신종인플루엔자 바이러스인 A/SW/Korea/SCJ01/09와 A/swine/Korea/CAN01/04를 사용하여 혈구응집억제반응 검사(Hemagglutinin inhibition (HI) test)를 수행하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
접종 바이러스 백신 처방 항체가 변화
HA 함량(3.5 ㎍) A/swine/Korea/CAN01/04 A/SW/Korea/SCJ01/09
A/swine/Korea/CAN01/04 1차 접종 20-40 20
2차 접종 80-320 20-40
CL A/SW/Korea/SCJ01/09 x PR8 1차 접종 <10 80
2차 접종 20-40 320
상기 표 1의 결과에서, 1차 바이러스 접종하고 2주 후에 분리한 혈청의 경우 이종(heterologous) 바이러스와는 전혀 반응하지 않았으며, 2차 접종하고 2주 후에 이종 바이러스와 20-40 정도의 역가가 나와 항원성이 낮은 것으로 판단하였다. 그러나 동종(homologous) 바이러스의 경우 2차 접종하고 2주 후에 2개의 백신 후보주 바이러스로 접종한 마우스의 혈청에서 매우 높은 항체가(320)를 나타내 높은 항원성이 있는 것으로 확인되었다.
< 미니돼지 모델 >
마우스 모델에서와 동일한 방법으로 실시예 3에서 제조한 CL A/SW/Korea/SCJ01/09 x PR8 바이러스와 A/swine/Korea/CAN01/04를 불활화하여 준비하고 1 마리당 1회 접종량이 7.5 ㎍/ml의 HA 단백질 양이 되도록 만든 후 2% 명반과 섞어주고 24시간 동안 4℃에 보관하였다.
준비된 백신을 마리당 1 ml 씩 근육으로 주사하고 2주 후에 혈청을 채취한 다음 2차 접종을 실시하였다. 분리된 혈청은 마우스 실험에서와 동일한 방법으로 혈구응집억제반응검사를 실시하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
접종 바이러스 백신 처방 항체가 변화
HA 함량(7.5 ㎍) A/swine/Korea/CAN01/04 A/SW/Korea/SCJ01/09
A/swine/Korea/CAN01/04 1차 접종 40-80 20
2차 접종 160-320 40
CL A/SW/Korea/SCJ01/09
x PR8		 1차 접종 <20 160
2차 접종 20 320
상기 표 2의 결과에서, 1차 백신 접종 2주 후에 채취한 혈청의 경우 각각의 바이러스에 대한 동종 시험(homologous test)에서는 40-80 사이의 항체가를 보인 반면 이종 시험(heterologous test)에서는 마우스의 결과와 마찬가지로 전혀 교차반응이 일어나지 않았다.
또한 2차 백신 접종 2주 후의 결과에서는 역시 마우스 결과와 유사하게 이종 시험에서도 20 정도의 교차반응이 있었지만 동종 시험에서는 높은 항체가(320)를 나타내어 높은 면역원성을 가지는 것을 확인하였다.
[시험예 2] 공격접종에 의한 방어능
본 발명에 의한 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스 접종에 의한 방어능을 확인하기 위하여, i) A/swine/Korea/CAN01/04 바이러스, 또는 ii) 실시예 3에서 제조한 CL A/SW/Korea/SCJ01/09 x PR8 바이러스를 2주 간격으로 2차 접종하고 2주 후에 돼지인플루엔자 바이러스 A/SW/Korea/SCJ01/09 및 A/swine/Korea/CAN01/04 바이러스 105TCID50/ml를 각각 비강으로 공격 접종하였다. 공격접종 2, 4, 5, 6, 7 및 8일 후에 비즙 시료를 채취하여 바이러스 배출 여부를 확인하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 또한 공기전파에 의한 감염여부도 동거군을 포함시켜 확인하였고, 바이러스 역가는 종란접종으로 확인하였으며(log10EID50/ml), 검출 민감도는 0.7log10EID50/ml 이었다(“-”는 바이러스가 검출되지 않았음을 의미하며 “*”는 표준편차이다).
일
(day)		 바이러스 역가(log10EID50/ml)
A/SW/Korea/SCJ01/09 챌린지(Challenge) A/swine/Korea/CAN01/04 챌린지
A/swine/Korea/CAN01/04 CL A/SW/Korea/SCJ01/09 x PR8 A/swine/Korea/CAN01/04 CL A/SW/Korea/SCJ01/09 x PR8
감염 공기전파 감염 공기전파 감염 공기전파 감염 공기전파
-1 -　 -　 -　 -　 -　 -　 -　 -　
0 - - - - - - - -
2 5(0.3)* - 3(0.3) - 2(0.3) - 4(0.5) -
4 5(0.5) 2(0.3) 1.5(0.5) - 1(0.2) - 3.5(0.2) 3(0.3)
5 3(0.3) 2(0.3) - - - - 2(0.3) 2.5(0.3)
6 - 1(0.3) - - - - - 1(0.2)
7 - - - - - - - -
8 -　 -　 -　 -　 -　 -　 -　 -　
상기 표 3의 결과에서, 실시예 3에서 제조한 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스를 불활화하여 백신 접종한 돼지는 신종인플루엔자 공격접종에 대해 바이러스 배출도 짧게 이루어지고 공기전파에 의한 감염도 일어나지 않았다.
하지만 A/swine/Korea/CAN01/04로 면역한 돼지는 신종인플루엔자 공격접종에 대해 바이러스도 더 오래 배출되고 공기전파를 통해 동거군 돼지로의 감염도 이루어지는 것을 확인하였다. 즉, 본 발명에 의한 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스를 불활화하여 백신 접종한 돼지에 A/swine/Korea/CAN01/04 바이러스로 공격 접종한 경우에도 동종 바이러스로 면역한 경우는 방어가 되었으나, 본 발명에 의한 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스로 면역한 경우에는 방어되지 않음을 확인하였다.
< 바이러스 공격접종 후 돼지의 체온 변화 관찰 >
상기 백신효능 실험의 보조결과로서 각기 다른 바이러스로 공격접종한 후 각 그룹의 돼지에서 체온을 측정하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4의 결과에서, 기존 A/swine/Korea/CAN01/04 불활화 백신을 접종한 돼지에서는 신종인플루엔자 바이러스 공격접종 시 감염 후 2일부터 5일까지 체온이 매우 상승하여 상기 비강의 바이러스 역가치와 연관성 있게 공격 접종한 바이러스에 대한 감염이 이루어졌음을 확인할 수 있었으며, 이들 군에 대한 동거군의 돼지에서는 접촉 후 5일째부터 체온상승이 관찰되어 감염군에서 동거군으로 전파가 일어났음을 확인할 수 있었다.
반면에 본 발명에 의한 CL A/SW/Korea/SCJ01/09 x PR8를 접종한 돼지에서는 감염 후 2일째에만 체온이 약간 상승하다가 정상범위로 내려오는 것을 확인하였다. 따라서, CL A/SW/Korea/SCJ01/09 x PR8 그룹과의 동거군 돼지에는 아무런 체온의 변화가 관찰되지 않았으며, 백신군으로부터 전파가 일어나지 않았음을 확인할 수 있었다.
한국생명공학연구원 KCTC11691BP 20100427
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Claims (4)

  1. A/PR/08/34 (H1N1) 바이러스의 내부 유전자 중 서열번호 1～6의 유전자 및
    기탁번호 KCTC 11691BP의 바이러스 표면 단백질 유전자를 포함하는 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 기탁번호 KCTC 11691BP의 바이러스 표면 단백질 유전자는 서열번호 7의 HA 및 서열번호 8의 NA 유전자로 구성된 것임을 특징으로 하는 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 의한 재조합 돼지 인플루엔자 A 바이러스를 포함하는 돼지 인플루엔자 바이러스 백신.
  4. 제 3항에 의한 돼지 인플루엔자 바이러스 백신을 돼지에 접종하여 돼지 인플루엔자 A 바이러스에 의한 발병을 예방하는 방법.
KR1020100051322A 2010-05-31 2010-05-31 Ａ／ＳＷ／Ｋｏｒｅａ／ＳＣＪ01／09 및 Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／08／34의 유전자를 포함하는 재조합 돼지 신종인플루엔자 Ａ 바이러스 및 이를 포함하는 돼지 인플루엔자 바이러스 백신 KR101177350B1 (ko)

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