CN109863169A - 具有连接至不变链(cd74)的短片段的抗原的融合肽 - Google Patents
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Abstract
本申请尤其提供了包含多肽的融合蛋白，其中所述多肽由与抗原序列可操作连接的不变链的片段组成，且其中所述不变链的片段由SEQ ID NO:1的残基17‑97的部分组成，其中所述部分包含来自SEQ ID NO:1的残基77‑92的至少5个连续残基。
Description
本申请涉及编码抗原序列和不变链的片段的多核苷酸。本申请还涉及由所述多核苷酸编码的融合蛋白和包含所述多核苷酸的病毒载体。
发明背景
感染性疾病仍然是对人类的主要威胁。预防或治疗感染性疾病的一种方式是通过疫苗接种人工诱导免疫应答，所述疫苗接种是将抗原物质施用给个体，使得产生针对相应抗原的适应性免疫应答。抗原物质可以是病原体(例如微生物或病毒)，其为结构上完整的但灭活的(即非感染性的)或者其为减毒的(即具有降低的感染性)，或者是已被发现为高免疫原性的病原体纯化组分。诱导针对病原体的免疫应答的另一种方法是提供包含一种或多种载体的表达系统，所述载体编码病原体的免疫原性蛋白。此类载体可以是裸质粒DNA的形式，或者免疫原性蛋白可以通过使用病毒载体而递送，例如基于修饰的痘苗病毒(例如修饰的安卡拉痘苗病毒(Vaccinia Ankara)；MVA)或腺病毒载体。此类表达系统具有的优点在于包含完全表征的组分，其具有针对环境条件的低敏感性。
当开发基于载体的表达系统时，具体的目标是这些表达系统应用于患者引发针对相应病原体感染保护性的免疫应答。然而，尽管诱导针对病原体的免疫原性应答，但一些表达系统不能引发强免疫应答(例如，其强得足以完全针对病原体感染保护)。因此，仍然需要能够诱导针对病原体的强免疫应答的改进的表达系统。
抗原是在体内诱导免疫应答、尤其是抗体的产生的物质。抗原可以通过MHC分子呈递在抗原呈递细胞表面上。抗原可以是外来的(即病原性)、起源于或来源于生物体本身，后者称为自身或自体抗原。存在两类MHC分子，I类MHC (MHC-I)和II类MHC (MHC-II)。MHC-I分子呈递在相应细胞内合成的肽的片段。MHC-II分子呈递肽的片段，所述肽通过吞噬作用被摄取，且随后在核内体中消化。通常，MHC-II分子仅由“专门”抗原呈递细胞诸如巨噬细胞或树突细胞表达。与MHC-II分子结合的抗原被T辅助细胞识别。T辅助细胞的T细胞受体与由MHC-II分子呈递的抗原的结合，连同由抗原提呈细胞分泌的细胞因子，诱导TH0表型的未成熟T辅助细胞成熟为各种类型的效应细胞。
MHC-I分子结合主要由蛋白酶体降解胞质蛋白产生的肽。然后将MHC I:肽复合物经由内质网插入细胞的外部质膜中。表位肽结合在I类MHC分子的细胞外部分上。因此，I类MHC的功能是将细胞内蛋白展示给细胞毒性T细胞(CTL)。然而，I类MHC也可以在称为交叉呈递的过程中呈递由外源蛋白产生的肽。正常细胞将在其I类MHC上展示来自正常细胞蛋白周转的肽，并且由于中枢和外周耐受机制，CTL将不响应于它们而被活化。当细胞表达外来蛋白时，诸如在病毒感染后，一部分I类MHC将在细胞表面上展示这些肽。因此，对MHC:肽复合物特异性的CTL将识别并杀死呈递细胞。
MHC-II分子是膜结合的受体，其在内质网中合成并在II类MHC区室中离开内质网。为了阻止内源肽(即自身抗原)结合MHC-II分子，新生的MHC-II分子与阻断MHC-II分子的肽结合裂缝的另一蛋白(即不变链)组合。当MHC II类区室融合至含有吞噬并降解的蛋白的晚期核内体时，不变链被切割以仅留下与MHC-II分子结合的CLIP区域。在第二步中，CLIP被HLA-DM分子移除，留下MHC-II分子自由结合外来抗原的片段。一旦II类MHC区室与质膜融合，所述片段就呈递在抗原呈递细胞的表面上，因此将外来抗原呈递给其他细胞，主要是T辅助细胞。
已知当编码不变链和所述抗原的融合体的腺病毒表达系统用于疫苗接种时，针对抗原的免疫应答增加(参见WO2007/062656，其也公开为US2011/0293704，并且出于公开不变链序列的目的而通过引用并入)，即不变链增强抗原的免疫原性。此外，已经证明所述腺病毒构建体可用于在引发-加强免疫接种方案的情况下引发免疫应答(参见WO2014/141176，其也公开为US2016/0000904；和WO2010/057501，其也公开为US2010/0278904并且为了公开不变链序列和编码不变链序列的腺病毒载体的目的而通过引用并入)。
发明概述
本发明人已令人惊讶地发现，不变链的某些微小片段也能够增强抗原的免疫原性。在具体实施方案中，已发现不变链的某些片段提供与全长不变链的效果基本上相同的免疫原性增强效果。在进一步具体实施方案中，已发现不变链的某些片段提供比全长不变链的效果更高的免疫原性增强效果。
这些片段，在提供免疫原性增强水平，维持与全长不变链的效果相比基本上相同的免疫原性增强效果或甚至提供与全长不变链相比增强的免疫原性增强效果的同时，与全长不变链相比具有各种优势。例如，所述片段可具有较低的非预期免疫后果的风险，诸如可能过敏性休克或抗原模拟，这可能触发抗自身免疫应答。此外，许多其他方便的宿主载体可能具有有限的插入空间，因此本发明的片段代表较小的不变链衍生的插入物，其允许宿主载体中用于抗原或其他组分的额外空间。
与现有技术中公开的相关方法相比，本发明的实施方案可以具有以下一种或多种优点：
(i) 增加的免疫应答(诸如CD4 T-细胞和/或CD8 T-细胞和/或抗体应答)，
(ii) 更宽广的免疫应答，
(iii) 更持久的免疫应答，
(iv) 降低的有害和/或非预期免疫应答的风险，
(v) 增加的可用于进一步核酸整合至载体中的空间。
在本发明的一个方面，提供了包含多肽的融合蛋白，其中所述多肽由与抗原序列可操作连接的不变链的片段组成，且其中所述不变链的片段由以下组成：
(a) SEQ ID NO:1的残基17-97的部分，其中所述部分包含来自SEQ ID NO:1的残基77-92的至少5个连续残基；
(b) 80个或更少的残基且包含至少5个连续残基的序列，其中所述序列与来自SEQ IDNO:1的残基77-92的至少5个连续残基共有至少80%同一性；
(c) SEQ ID NO:1的残基1-97；
(d) 91至103个残基且与SEQ ID NO:1的残基1-97共有至少95%同一性；
(e) SEQ ID NO:1的残基17-97；
(f) 76至84个残基且与SEQ ID NO:1的残基17-97共有至少95%同一性；
(g) SEQ ID NO:1的残基1-92；
(h) 88至96个残基且与SEQ ID NO:1的残基1-92共有至少95%同一性；
(i) SEQ ID NO:1的残基17-92；或
(j) 71至79个残基且与SEQ ID NO:1的残基17-92共有至少95%同一性。
在本发明的进一步方面，提供了编码包含多肽的融合蛋白的多核苷酸，其中所述多肽由与抗原序列可操作连接的不变链的片段组成，且其中所述不变链的片段由以下组成：
(a) SEQ ID NO:1的残基17-97的部分，其中所述部分包含来自SEQ ID NO:1的残基77-92的至少5个连续残基；
(b) 80个或更少的残基且包含至少5个连续残基的序列，其中所述序列与来自SEQ IDNO:1的残基77-92的至少5个连续残基共有至少80%同一性；
(c) SEQ ID NO:1的残基1-97；
(d) 91至103个残基且与SEQ ID NO:1的残基1-97共有至少95%同一性；
(e) SEQ ID NO:1的残基17-97；
(f) 76至84个残基且与SEQ ID NO:1的残基17-97共有至少95%同一性；
(g) SEQ ID NO:1的残基1-92；
(h) 88至96个残基且与SEQ ID NO:1的残基1-92共有至少95%同一性；
(i) SEQ ID NO:1的残基17-92；或
(j) 71至79个残基且与SEQ ID NO:1的残基17-92共有至少95%同一性。
在本发明的进一步方面，提供了包含多核苷酸的病毒载体，所述多核苷酸编码包含多肽的融合蛋白，其中所述多肽由与抗原序列可操作连接的不变链的片段组成，且其中所述不变链的片段由以下组成：
(a) SEQ ID NO:1的残基17-97的部分，其中所述部分包含来自SEQ ID NO:1的残基77-92的至少5个连续残基；
(b) 80个或更少的残基且包含至少5个连续残基的序列，其中所述序列与来自SEQ IDNO:1的残基77-92的至少5个连续残基共有至少80%同一性；
(c) SEQ ID NO:1的残基1-97；
(d) 91至103个残基且与SEQ ID NO:1的残基1-97共有至少95%同一性；
(e) SEQ ID NO:1的残基17-97；
(f) 76至84个残基且与SEQ ID NO:1的残基17-97共有至少95%同一性；
(g) SEQ ID NO:1的残基1-92；
(h) 88至96个残基且与SEQ ID NO:1的残基1-92共有至少95%同一性；
(i) SEQ ID NO:1的残基17-92；或
(j) 71至79个残基且与SEQ ID NO:1的残基17-92共有至少95%同一性。
附图简述
图1：鼠Ii和人Ii同种型的示意图。
图2：包含在Ad5构建体中的与OVA (卵清蛋白)融合的鼠Ii片段的示意图。
图3：由包含在Ad5构建体中的与OVA融合的鼠Ii片段在小鼠中引发的免疫应答(产生IFN-γ的T细胞的数目/百万个脾细胞)。
图4：在用Ad5载体感染BMDC后24小时，I类MHC的卵清蛋白肽SIINFEKL的抗原呈递，所述Ad5编码与OVA连接的mIi全长或短序列1-50、1-75和50-215。抗原呈递表示为Ad5-mIi和mIi变体感染后CD11+/SIINFEKL+细胞的%相对于Ad5-Ova对照的比率。
图5：包含在Ad5构建体中的与OVA融合的mIi(1-75)和mIi(50-75)的示意图。
图6：由包含在Ad5构建体中的与OVA融合的鼠Ii片段1-75和50-75引发的免疫应答(产生IFN-γ的T细胞的数目/百万个脾细胞)。
图7：在用Ad5载体感染BMDC后24小时，I类MHC的卵清蛋白肽SIINFEKL的抗原呈递，所述Ad5编码与OVA连接的mIi短序列1-75和50-75。抗原呈递表示为Ad5-mIi和mIi变体感染后CD11+/SIINFEKL+细胞的%相对于Ad5-Ova对照的比率。
图8：由包含单独的MAGE A3和包含hIi(全长)-MAGE A3、hIi(1-97)-MAGE A3和hIi(17-97)-MAGE A3的融合体的PanAd3构建体引发的免疫应答(产生IFN-γ的T细胞的数目/百万个脾细胞)。
图9：由包含单独的HCV-NS和包含hIi(全长)-HCV-NS、hIi(1-97)-HCV-NS和hIi(17-97)-HCV-NS的融合体的ChAd3构建体引发的免疫应答(产生IFN-γ的T细胞的数目/百万个脾细胞)。
图10A-10B：Western印迹，其显示使用包含在Ad5构建体中的与OVA连接的mIi序列1-75和1-50经由泛素信号将Ii-抗原靶向至蛋白酶体。
图11：Western印迹，其显示使用包含在Ad5构建体中的与OVA连接的mIi全长或短序列1-75和50-75经由泛素信号将Ii-抗原靶向至蛋白酶体。
图12A-12J：源自各种生物体的不变链的多肽序列的比对。
图13：对应于人p35不变链的残基1-97的源自各种生物体的不变链的片段的比对。
图14：对应于人p35不变链的残基67-92的源自各种生物体的不变链的片段的比对。
图15：包含在Ad5构建体中的与OVA融合的mIi(50-75)、mIi(28-75)、mIi(55-75)和mIi(60-75)的示意图。
图16：由包含在Ad5构建体中的与OVA融合的mIi(50-75)、mIi(28-75)、mIi(55-75)和mIi(60-75)引发的免疫应答(产生IFN-γ的T细胞的数目/百万个脾细胞)。
图17：由包含在Ad5构建体中的与OVA融合的不变链的突变全长和突变片段引发的免疫应答(产生IFN-γ的T细胞的数目/百万个脾细胞)。
序列标识符的简述
SEQ ID NO:1：人不变链同种型p35的氨基酸序列
SEQ ID NO:2：编码人不变链同种型p35的核苷酸序列
SEQ ID NO:3：人不变链同种型p33的氨基酸序列
SEQ ID NO:4：编码MAGE抗原的核苷酸序列
SEQ ID NO:5：人不变链同种型p43的氨基酸序列
SEQ ID NO:6：编码人不变链同种型p43的核苷酸序列
SEQ ID NO:7：人不变链同种型p41的氨基酸序列
SEQ ID NO:8：编码OVA抗原的核苷酸序列
SEQ ID NO:9：人不变链同种型c的氨基酸序列
SEQ ID NO:10：编码人不变链同种型c的核苷酸序列
SEQ ID NO:11：鼠不变链p31的氨基酸序列
SEQ ID NO:12：编码鼠不变链p31的核苷酸序列
SEQ ID NO:13：鼠不变链p41的氨基酸序列
SEQ ID NO:14：编码鼠不变链p41的核苷酸序列
SEQ ID NO:15：豚鼠(Cavia porcellus)不变链的氨基酸序列(UniProt登录号H0UZ94)
SEQ ID NO:16：裸鼹鼠(Heterocephalus glaber)不变链的氨基酸序列(UniProt登录号G5C391)
SEQ ID NO:17：达马拉鼹鼠(Fukomys damarensis)不变链的氨基酸序列(UniProt登录号A0A091E9W3)
SEQ ID NO:18：褐家鼠(Rattus norvegicus)第二同种型不变链的氨基酸序列(UniProt登录号P10247-2)
SEQ ID NO:19：褐家鼠(Rattus norvegicus)第一同种型不变链的氨基酸序列(UniProt登录号P10247)
SEQ ID NO:20：莹鼠耳蝠(Myotis lucifugus)不变链的氨基酸序列(UniProt登录号G1QEN4)
SEQ ID NO:21：大卫鼠耳蝠(Myotis davidii)不变链的氨基酸序列(UniProt登录号L5LQM9)
SEQ ID NO:22：布氏鼠耳蝠(Myotis brandtii)不变链的氨基酸序列(UniProt登录号S7N2W2)
SEQ ID NO:23：黑狐蝠 (Pteropus alecto)不变链的氨基酸序列(UniProt登录号L5L1G3)
SEQ ID NO:24：西部黑猩猩(Pan troglodytes verus)不变链的氨基酸序列(UniProt登录号A5A6L4)
SEQ ID NO:25：苏门答腊猩猩(Pongo abelii)不变链的氨基酸序列(UniProt登录号Q5RFJ4)
SEQ ID NO:26：黑猩猩(Pan troglodytes)不变链的氨基酸序列(UniProt登录号H2QRT2)
SEQ ID NO:27：大猩猩(Gorilla gorilla gorilla)不变链的氨基酸序列(UniProt登录号G3R7S6)
SEQ ID NO:28：白颊长臂猿(Nomascus leucogenys)不变链的氨基酸序列(UniProt登录号G1RHB8)
SEQ ID NO:29：猕猴(Macaca mulatta)不变链的氨基酸序列(UniProt登录号I0FWR3)
SEQ ID NO:30：食蟹猴(Macaca fascicularis)不变链的氨基酸序列(UniProt登录号G7P8P8)
SEQ ID NO:31：猕猴(Macaca mulatta)不变链的氨基酸序列(UniProt登录号G7MVM5)
SEQ ID NO:32：猕猴(Macaca mulatta)不变链的氨基酸序列(UniProt登录号I0FWR4)
SEQ ID NO:33：猕猴(Macaca mulatta)不变链的氨基酸序列(UniProt登录号F7E9S4)
SEQ ID NO:34：东非狒狒(Papio anubis)不变链的氨基酸序列(UniProt登录号A0A096MM48)
SEQ ID NO:35：绿猴(Chlorocebus sabaeus)不变链的氨基酸序列(UniProt登录号A0A0D9RGK4)
SEQ ID NO:36：普通狨(Callithrix jacchus)不变链的氨基酸序列(UniProt登录号F7ENM4)
SEQ ID NO:37：家猫(Felis catus)不变链的氨基酸序列(UniProt登录号M3VXS2)
SEQ ID NO:38：普通雪貂(Mustela putorius furo)不变链的氨基酸序列(UniProt登录号M3YQS4)
SEQ ID NO:39：非洲象(Loxodonta africana)不变链的氨基酸序列(UniProt登录号G3TJE1)
SEQ ID NO:40：非洲象(Loxodonta africana)不变链的氨基酸序列(UniProt登录号G3U7Y6)
SEQ ID NO:41：野猪(Sus scrofa)不变链的氨基酸序列(UniProt登录号Q764N1)
SEQ ID NO:42：野骆驼(Camelus ferus)不变链的氨基酸序列(UniProt登录号S9XLT6)
SEQ ID NO:43：野牦牛(Bos mutus)不变链的氨基酸序列(UniProt登录号L8I7V9)
SEQ ID NO:44：家牛(Bos taurus)不变链的氨基酸序列(UniProt登录号Q7JFY1)
SEQ ID NO:45：家牛(Bos taurus)不变链的氨基酸序列(UniProt登录号Q29630)
SEQ ID NO:46：家马(Equus caballus)不变链的氨基酸序列(UniProt登录号F6TGS3)
SEQ ID NO:47：家马(Equus caballus)不变链的氨基酸序列(UniProt登录号Q9MXD5)
SEQ ID NO:48：穴兔(Oryctolagus cuniculus)不变链的氨基酸序列(UniProt登录号G1SKK3)
SEQ ID NO:49：小耳大婴猴(Otolemur garnettii)不变链的氨基酸序列(UniProt登录号H0WQB3)
SEQ ID NO:50：中国树鼩(Tupaia chinensis)不变链的氨基酸序列(UniProt登录号L9KN01)
SEQ ID NO:51：十三条纹地松鼠(Ictidomys tridecemlineatus)不变链的氨基酸序列(UniProt登录号I3MCR9)
SEQ ID NO:52：袋獾(Sarcophilus harrisii)不变链的氨基酸序列(UniProt登录号G3X0Q6)
SEQ ID NO:53：人p35不变链的残基17-97的氨基酸序列
SEQ ID NO:54：对应于人p35不变链的残基17-97的小鼠p31不变链的区域的氨基酸序列
SEQ ID NO:55：对应于人p35不变链的残基17-97的非洲象(Loxodonta africana)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号G3TJE1)
SEQ ID NO:56：对应于人p35不变链的残基17-97的家猫(Felis catus)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号M3VXS2)
SEQ ID NO:57：对应于人p35不变链的残基17-97的家马(Equus caballus)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号F6TGS3)
SEQ ID NO:58：对应于人p35不变链的残基17-97的野骆驼(Camelus ferus)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号S9XLT6)
SEQ ID NO:59：对应于人p35不变链的残基17-97的野猪(Sus scrofa)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号Q764N1)
SEQ ID NO:60：对应于人p35不变链的残基17-97的普通雪貂(Mustela putorius furo)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号M3YQS4)
SEQ ID NO:61：对应于人p35不变链的残基17-97的猕猴(Macaca mulatta)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号I0FWR3)
SEQ ID NO:62：对应于人p35不变链的残基17-97的食蟹猴(Macaca fascicularis)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号G7P8P8)
SEQ ID NO:63：对应于人p35不变链的残基17-97的绿猴(Chlorocebus sabaeus)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号A0A0D9RGK4)
SEQ ID NO:64：对应于人p35不变链的残基17-97的东非狒狒(Papio anubis)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号A0A096MM48)
SEQ ID NO:65：对应于人p35不变链的残基17-97的西部黑猩猩(Pan troglodytes verus)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号A5A6L4)
SEQ ID NO:66：对应于人p35不变链的残基17-97的大猩猩(Gorilla gorilla gorilla)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号G3R7S6)
SEQ ID NO:67：对应于人p35不变链的残基17-97的白颊长臂猿(Nomascus leucogenys)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号G1RHB8)
SEQ ID NO:68：对应于人p35不变链的残基17-97的苏门答腊猩猩(Pongo abelii)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号Q5RFJ4)
SEQ ID NO:69：对应于人p35不变链的残基17-97的普通狨(Callithrix jacchus)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号F7ENE8)
SEQ ID NO:70：对应于人p35不变链的残基17-97的莹鼠耳蝠(Myotis lucifugus)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号G1QEN4)
SEQ ID NO:71：对应于人p35不变链的残基17-97的大卫鼠耳蝠(Myotis davidii)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号L5LQM9)
SEQ ID NO:72：对应于人p35不变链的残基17-97的野牦牛(Bos mutus)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号L8I7V9)
SEQ ID NO:73：对应于人p35不变链的残基17-97的家牛(Bos taurus)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号Q29630)
SEQ ID NO:74：对应于人p35不变链的残基17-97的布氏鼠耳蝠(Myotis brandtii)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号S7N2W2)
SEQ ID NO:75：对应于人p35不变链的残基17-97的裸鼹鼠(Heterocephalus glaber)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号G5C391)
SEQ ID NO:76：对应于人p35不变链的残基17-97的达马拉鼹鼠(Fukomys damarensis)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号A0A091E9W3)
SEQ ID NO:77：对应于人p35不变链的残基17-97的豚鼠(Cavia porcellus)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号H0UZ94)
SEQ ID NO:78：对应于人p35不变链的残基17-97的穴兔(Oryctolagus cuniculus)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号G1SKK3)
SEQ ID NO:79：对应于人p35不变链的残基17-97的黑狐蝠 (Pteropus alecto)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号L5L1G3)
SEQ ID NO:80：对应于人p35不变链的残基17-97的褐家鼠(Rattus norvegicus)第二同种型不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号P10247-2)
SEQ ID NO:81：对应于人p35不变链的残基17-97的中国树鼩(Tupaia chinensis)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号L9KN01)
SEQ ID NO:82：对应于人p35不变链的残基17-97的十三条纹地松鼠(Ictidomys tridecemlineatus)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号I3MCR9)
SEQ ID NO:83：对应于人p35不变链的残基17-97的小耳大婴猴(Otolemur garnettii)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号H0WQB3)
SEQ ID NO:84：对应于人p35不变链的残基17-97的袋獾(Sarcophilus harrisii)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号G3X0Q6)
SEQ ID NO:85：人p35不变链的残基67-92的氨基酸序列
SEQ ID NO:86：对应于人p35不变链的残基67-92的小鼠p31不变链的区域的氨基酸序列
SEQ ID NO:87：对应于人p35不变链的残基67-92的普通雪貂(Mustela putorius furo)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号M3YQS4)
SEQ ID NO:88：对应于人p35不变链的残基67-92的布氏鼠耳蝠(Myotis brandtii)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号S7N2W2)
SEQ ID NO:89：对应于人p35不变链的残基67-92的黑狐蝠 (Pteropus alecto)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号L5L1G3)
SEQ ID NO:90：对应于人p35不变链的残基67-92的达马拉鼹鼠(Fukomys damarensis)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号A0A091E9W3)
SEQ ID NO:91：对应于人p35不变链的残基67-92的十三条纹地松鼠(Ictidomys tridecemlineatus)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号I3MCR9)
SEQ ID NO:92：对应于人p35不变链的残基67-92的野牦牛(Bos mutus)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号L8I7V9)
SEQ ID NO:93：对应于人p35不变链的残基67-92的裸鼹鼠(Heterocephalus glaber)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号G5C391)
SEQ ID NO:94：对应于人p35不变链的残基67-92的大卫鼠耳蝠(Myotis davidii)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号L5LQM9)
SEQ ID NO:95：对应于人p35不变链的残基67-92的中国树鼩(Tupaia chinensis)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号L9KN01)
SEQ ID NO:96：对应于人p35不变链的残基67-92的莹鼠耳蝠(Myotis lucifugus)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号G1QEN4)
SEQ ID NO:97：对应于人p35不变链的残基67-92的褐家鼠(Rattus norvegicus)第二同种型不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号P10247-2)
SEQ ID NO:98：对应于人p35不变链的残基67-92的家牛(Bos taurus)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号Q29630)
SEQ ID NO:99：对应于人p35不变链的残基67-92的小耳大婴猴(Otolemur garnettii)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号H0WQB3)
SEQ ID NO:100：对应于人p35不变链的残基67-92的豚鼠(Cavia porcellus)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号H0UZ94)
SEQ ID NO:101：对应于人p35不变链的残基67-92的普通狨(Callithrix jacchus)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号F7ENE8)
SEQ ID NO:102：对应于人p35不变链的残基67-92的白颊长臂猿(Nomascus leucogenys)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号G1RHB8)
SEQ ID NO:103：对应于人p35不变链的残基67-92的大猩猩(Gorilla gorilla gorilla)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号G3R7S6)
SEQ ID NO:104：对应于人p35不变链的残基67-92的苏门答腊猩猩(Pongo abelii)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号Q5RFJ4)
SEQ ID NO:105：对应于人p35不变链的残基67-92的西部黑猩猩(Pan troglodytes verus)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号A5A6L4)
SEQ ID NO:106：对应于人p35不变链的残基67-92的猕猴(Macaca mulatta)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号I0FWR3)
SEQ ID NO:107：对应于人p35不变链的残基67-92的食蟹猴(Macaca fascicularis)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号G7P8P8)
SEQ ID NO:108：对应于人p35不变链的残基67-92的绿猴(Chlorocebus sabaeus)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号A0A0D9RGK4)
SEQ ID NO:109：对应于人p35不变链的残基67-92的东非狒狒(Papio anubis)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号A0A096MM48)
SEQ ID NO:110：对应于人p35不变链的残基67-92的非洲象(Loxodonta africana)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号G3TJE1)
SEQ ID NO:111：对应于人p35不变链的残基67-92的家猫(Felis catus)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号M3VXS2)
SEQ ID NO:112：对应于人p35不变链的残基67-92的家马(Equus caballus)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号F6TGS3)
SEQ ID NO:113：对应于人p35不变链的残基67-92的野猪(Sus scrofa)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号Q764N1)
SEQ ID NO:114：对应于人p35不变链的残基67-92的穴兔(Oryctolagus cuniculus)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号G1SKK3)
SEQ ID NO:115：对应于人p35不变链的残基67-92的袋獾(Sarcophilus harrisii)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号G3X0Q6)
SEQ ID NO:116：对应于人p35不变链的残基67-92的野骆驼(Camelus ferus)不变链的区域的氨基酸序列(UniProt登录号S9XLT6)
SEQ ID NO:117：编码HCV-NS抗原的核苷酸序列
SEQ ID NO:118：OVA257-264 (SIINFEKL)肽序列
SEQ ID NO:119：'res'接头的氨基酸序列
SEQ ID NO:120：编码'res'接头的核苷酸序列
SEQ ID NO:121：HA标签的氨基酸序列
SEQ ID NO:122：编码HA标签的核苷酸序列
SEQ ID NO:123：人Ad5六邻体蛋白序列
SEQ ID NO:124：人Ad5五邻体蛋白序列
SEQ ID NO:125：人Ad5纤维蛋白序列
SEQ ID NO:126：黑猩猩腺病毒- ChAd 3六邻体蛋白序列
SEQ ID NO:127：黑猩猩腺病毒- ChAd 3纤维蛋白序列
SEQ ID NO:128：黑猩猩腺病毒- ChAd 19六邻体蛋白序列
SEQ ID NO:129：黑猩猩腺病毒- ChAd 19纤维蛋白序列
SEQ ID NO:130：黑猩猩腺病毒- ChAd 63六邻体蛋白序列
SEQ ID NO:131：黑猩猩腺病毒- ChAd 63纤维蛋白序列
SEQ ID NO:132：ChAd155六邻体的多肽序列
SEQ ID NO:133：ChAd155五邻体的多肽序列
SEQ ID NO:134：ChAd155纤维的多肽序列
SEQ ID NO:135：mIi(全长)LLLmut的多肽序列
SEQ ID NO:136：mIi(全长)K63R的多肽序列
SEQ ID NO:137：mIi(1-75)K63R的多肽序列
SEQ ID NO:138：mIi(D+ER)的多肽序列
SEQ ID NO:139：mIi(D-17)的多肽序列(即N-末端Met加上p31 mIi的残基18-215)
SEQ ID NO:140：mIi(50-215)的多肽序列(即N-末端Met加上p31 mIi的残基51-215)。
发明详述
如上所讨论，本发明人已令人惊讶地发现，不变链的某些微小片段能够增强抗原的免疫原性。本文公开的不变链片段尤其缺乏不变链的KEY、CLIP和三聚化区域。此外，在一些实施方案中，本文公开的不变链片段也缺乏内溶酶体分选序列(“ESS”)。
现有技术公开了关于全长不变链的免疫原性增强作用的信息，所述全长不变链包括不变链的KEY、CLIP、三聚化和ESS区域(参见，例如，Holst等人，2008)。现有技术还公开了关于不变链KEY区域本身的免疫原性增强作用的信息(参见，例如，(a)Holmes等人，2008，其公开了KEY区域的LRMK氨基酸与HER-2/neu肽的融合体的的I期试验，和(b) Kallinteris等人，2006，其涉及特异性利用KEY区域来增强疫苗效力)。关于三聚化区域，已知该区域对于其作为MHC-II伴侣蛋白和MIF信号传导受体的作用是重要的。最后，关于ESS区域，Wälchli等人2014年公开了不变链经由核内体途径中的共定位来介导其作用。因此，可预期由于它们不能定位于核内体，缺乏ESS的不变链片段不能利用该途径。
在WO2010057501 (上文提及)中，公开了编码与淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒糖蛋白(GP)抗原融合的残基51-118的小鼠不变链片段的腺病毒相对于编码与GP抗原融合的全长不变链的腺病毒具有降低的免疫原性(参见WO2010057501，图7和第81页，第33-34行，其中陈述“因此当我们测试51-118变体(Ad-Ii51-118GP)时，观察到CD8+ T细胞刺激能力的显著降低...”)。
因此，鉴于现有技术，令人惊讶的是，如本文提供的实施例中所证实，mIi1-80、mIi1-75和mIi50-75片段(其缺乏KEY、CLIP和三聚化区域(并且在mIi50-75的情况下，缺乏ESS)仍然能够将免疫原性和/或抗原呈递增加至与全长mIi基本上相同或更高的水平。
此外，令人惊讶的是，如本文提供的实施例中所证实，缺乏任何已知功能结构域的mIi55-75和mIi60-75片段仍然能够将免疫原性和/或抗原呈递增加至全长mIi基本上相同或更高的水平。
具体而言，令人惊讶的是，小鼠Ii的残基55-75和60-75 (其包含在上文WO2010057501中公开的51-118片段内)(和小鼠Ii的残基50-75，其除了一个氨基酸之外，包含在上文WO2010057501中公开的51-118片段内)提供了与全长不变链的效果基本上相同的免疫原性增强效果。
可以预期mIi1-80、mIi1-75、mIi50-75、mIi55-75和mIi60-75片段的变体将共有相同的有利和令人惊讶的特性。
除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有如本领域普通技术人员所通常理解的相同含义。例如，本文所使用的术语是按照"A multilingual glossary ofbiotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel,B. and Klbl, 1995中所描述的进行定义。
在本说明书和随后的权利要求书全文中，除非上下文另有要求，词语“包含("comprise"和变体诸如"comprises"和"comprising")”都将被理解为意味着包括所述整数或步骤，或整数或步骤的组，但不排除任何其他的整数或步骤，或整数或步骤的组。除非上下文另有要求，词语“由……组成("consists of"和变体诸如"consisting of")”将被理解为意味着包括所述整数或步骤，或整数或步骤的组，并且排除任何进一步相同或不同的整数或步骤，或相同或不同的整数或步骤的组，即“仅由……组成”。除非上下文另有要求，词语“至少由……组成("consists of at least"和变体诸如"consisting of at least")”将被理解为意味着包括所述整数或步骤，或整数或步骤的组作为最小值以及还包括相同整数或步骤，或整数或步骤的组的另外实例，但排除任何其他不同的整数或步骤，或不同的整数或步骤的组。
在本说明书的文本全文中引用了几篇文献。每篇本文所引用的文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指示等)，无论在上文或下文，都在此通过引用以其整体并入。本文没有任何内容被解释为承认本发明无权由于在先发明而先于此类公开内容。在本发明的一个方面的上下文中提供的所有定义也适用于本发明的其他方面。
蛋白、融合蛋白和多核苷酸
术语“蛋白”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用，并且是指氨基酸的任何肽连接的链，无论长度、共翻译或翻译后修饰。融合蛋白(或“嵌合蛋白”)是包含两个或更多个肽连接蛋白的重组蛋白。通过连接最初编码分离蛋白的两个或更多个基因来产生融合蛋白。该融合基因的翻译产生单一融合蛋白。
术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用，并且是指由核苷酸单体制成的聚合物大分子。合适地，本发明的多核苷酸是重组的。重组意味着，所述多核苷酸是克隆、限制性酶切或连接步骤，或其他程序中的至少一种的产物，所述其他程序产生不同于在自然界中发现的多核苷酸的多核苷酸。
异源序列是指并非分离自、源自或基于宿主生物体中发现的天然存在的核酸序列的任何序列。“天然存在的”意指在自然界中发现的且不是合成地制备或修饰的序列。当一个序列分离自一个来源、但合适地修饰(例如，通过缺失、取代(突变)、插入或其他修饰)从而不破坏来源基因的正常功能时，所述序列“源自”所述来源。
合适地，本发明中使用的多核苷酸和多肽是分离的。“分离的”多核苷酸(或多肽)是从其原始环境取出的多核苷酸(或多肽)。例如，如果其与天然系统中的一些或全部共存物质分开，则天然存在的多核苷酸是分离的。例如，如果将其克隆进不是其天然环境的一部分的载体中，或如果将其包含在cDNA内，则认为多核苷酸是分离的。
多肽和多核苷酸序列比较
为了比较两个密切相关的多肽或多核苷酸序列的目的，可以计算第一序列和第二序列之间的“%序列同一性”。如果多肽或多核苷酸序列与其他多肽或多核苷酸序列在它们的整个长度上共有100%序列同一性，就说它们是相同的或同一的。序列中的残基从左到右，即从多肽的N-至C-末端进行编号；多核苷酸的5'至3'末端进行编号。术语“同一”或百分比“同一性”在两个或更多个多肽序列的上下文中是指两个或更多个序列或子序列，当在比较窗口或指定区域上就最大对应进行比较并比对时，如使用以下序列比较算法之一或通过手动比对和目检来测量的，其是相同的或具有相同氨基酸残基的特定百分比(即，对于特定区域为70%同一性，任选75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%同一性)。该定义还指测试序列的互补序列(compliment)。任选地，同一性在长度为至少约250个氨基酸、诸如300个氨基酸或350个氨基酸的区域上存在。合适地，在对应于参考序列(与衍生序列相对)的整个长度的窗口上进行比较。
对于序列比较，一个序列作为参考序列，测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列登入计算机中，指定子序列坐标(如果需要的话)，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定可选参数。序列比较算法随后基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。
如本文所用的“比较窗口”是指这样的区段，其中在两条序列最优比对后，序列可以与相同数目的连续位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对的方法是本领域所众所周知的。用于比较的序列最优比对可以如下进行，例如通过Smith & Waterman 1981的局部同源性算法，通过Needleman & Wunsch 1970的同源性比对算法，通过Pearson & Lipman1988的搜索相似性方法，通过这些算法的计算机化实现(GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA，于Wisconsin Genetics Software Package中, Genetics Computer Group, 575 ScienceDr., Madison, WI)，或通过手动比对和目检(例如参见，Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel等人. 1995)。
有用的算法的一个实例是PILEUP。PILEUP使用渐进式成对比对(pairwisealignment)从一组相关序列中产生多序列比对来显示相关性和百分比序列同一性。它还绘制显示用于产生比对的成簇关系的树或系统树图(dendogram)。PILEUP使用Feng &Doolittle 1987的渐进式比对方法的简化方式。所用的方法与Higgins & Sharp 1989所述的方法相似。程序可以比对多至300个序列，其各自最大长度为5,000核苷酸或氨基酸。多重比对程序起始于两个最相似序列的成对比对，产生两个比对的序列的簇。该簇随后比对至所比对序列的下一最相关序列或簇。通过两个单独序列的成对比对的简单延伸(simpleextension)来比对两簇序列。最终比对通过一系列渐进式成对比对来实现。程序通过指定具体序列及其对于序列比对区域的氨基酸坐标并通过指定程序参数来运行。使用PILEUP，使用以下参数将参考序列与其他测试序列比较来确定百分比序列同一性关系：默认缺口权重(gap weight)(3.00)、默认缺口长度权重(0.10)和加权的末端缺口(weighted endgaps)。PILEUP可以获自GCG序列分析软件包，例如7.0版本(Devereaux等人1984)。
适合于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的另一实例是BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul等人 1977和Altschul等人 1990。进行BLAST分析的软件通过National Center for Biotechnology Information (网址为www.ncbi.nlm.nih.gov/)是公众可获得的。该算法首先涉及通过鉴定查询序列中长度W的短字符来鉴定高评分序列对(HSPs)，当与数据库序列中相同长度的字符比对时，其匹配或满足某些正值的阈值分值T。T称为邻近字符分值阈值(Altschul等, 见上文)。这些初始的邻近字符命中(hits)充当种子用于开始检索以发现包含它们的更长HSPs。字符命中沿每一序列在两个方向上延伸，远至累积比对分值能够增加。对于核苷酸序列，使用参数M (对匹配残基对的奖励分值；始终>0)和N(对错配残基的惩罚分值；始终<0)计算累积分值。对于氨基酸序列，使用评分矩阵计算累积分值。当出现以下情况时，在每一方向上字符命中的延伸停止：累积比对分值以数目X从它的最大实现值中掉落；由于积累了一个或多个负评分残基比对，累积分值变为零或低于零；或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用字符长(W)为11、期望值(E)为10、M=5、N=-4和两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字符长为3、和期望值(E)为10、和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff & Henikoff 1989)比对值(B)为50、期望值(E)为10、M=5、N=-4和两条链的比较作为默认值。
BLAST算法还进行两条序列之间的相似性的统计分析(参见例如, Karlin &Altschul 1993)。由BLAST算法提供的相似性的一种量度是最小和概率(P(N))，其提供两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果测试核酸与参考核酸的比较中的最小和概率小于约0.2，更优选小于约0.01且最优选小于约0.001，则认为核酸与参考序列相似。
序列之间的“差异”是指与第一序列相比，在第二序列的位置中的单个残基的插入、缺失或取代。两个序列可以含有1个、2个或更多个此类差异。在否则与第一序列同一(100%序列同一性)的第二序列中的插入、缺失或取代导致降低的序列同一性百分比。例如，如果同一序列是9个残基长，则第二序列中的一个取代导致88.9%的序列同一性。如果同一序列是17个氨基酸残基长，则第二序列中的两个取代导致88.2%的序列同一性。
或者，为了将第一参考序列与第二比较序列进行比较的目的，可以确定为了产生第二序列向第一序列做出的添加、取代和/或缺失的数目。添加是将一个残基添加至第一序列中(包括在第一序列的任一个末端处的添加)。取代是用一个不同残基取代第一序列中的一个残基。缺失是从第一序列缺失一个残基(包括在第一序列的任一个末端处的缺失)。
合适地，取代可以是保守的。‘保守’取代是氨基酸取代，其中氨基酸残基被化学结构相似的另一个氨基酸残基替代，并且预期其对多肽的功能、活性或其他生物学特性几乎没有影响。此类保守取代合适地是这样的取代，其中以下组中的一个氨基酸被来自同一组内的另一个氨基酸残基取代：
不变链和不变链的片段
术语“不变链”，也称为“li”或“CD74”，是指非多态的II型整合膜蛋白。该蛋白在淋巴细胞成熟和适应性免疫应答中具有多种功能；具体地，li确保新合成的MCH II靶向至内吞作用途径，其中该复合物可以遇到抗原肽。(Pieters J. 1997)。另外，已显示li作为I类MHC分子伴侣发挥作用(Morris等人 2004)且通过其核内体靶向性序列，促进针对共价连接的抗原的CD4+而非CD8+ T细胞的刺激(Diebold等人 2001)。
对于人不变链，已知4种不同的同种型，通常称为p33、p35、p41 和p43(Strubin等人 1986)。SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2分别对应于人不变链p35同种型的氨基酸序列和核酸序列。对于人不变链，已知四种不同的同种型，通常称为p33、p35、p41和p43 (Strubin等人，1986)。SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2分别对应于人不变链p35同种型的氨基酸序列和核酸序列。SEQ ID NO:3对应于人不变链p33同种型的氨基酸序列。SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6分别对应于人不变链p43同种型的氨基酸序列和核酸序列。SEQ ID NO:7对应于人不变链p41同种型的氨基酸序列。相对于人p33 和p41，人p35和p43同种型由于翻译的可变起始而在N-末端含有额外的16个残基。相比于人p33和p35，人p41和p43同种型包含框内插入不变链的C末端中的额外的结构域(外显子6b的可变剪接)。相对于人p33和p35缺乏两个外显子的额外的人同种型c的序列可在Genbank (登录号BC024272)得到。SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10分别对应于人不变链c同种型的氨基酸序列和核酸序列。合适地，所述不变链的片段源自不变链的人p33、p35、p41、p43或c同种型。
不同同种型的示意性概述显示于图1。
所述不变链包含几个结构域：人不变链p35和p43变体中前面为内质网保留信号(“ERR”或“ER”)(人不变链SEQ ID NO:1中的位置1至16)的包括分选(靶向)肽(也称为“溶酶体靶向序列”或“内溶酶体分选序列”(“ESS”))的胞质结构域(人不变链SEQ ID NO:1中的位置17至46，鼠不变链SEQ ID NO:11中的位置1至29)、跨膜结构域(“TM”，人不变链SEQ IDNO:1中的位置47至72，鼠不变链SEQ ID NO:11中的位置30至55)、和自身包含KEY区域(人不变链SEQ ID NO:1中的位置93至96，鼠不变链SEQID NO:11中的位置76至79)、邻近的CLIP区域(人不变链SEQ ID NO 1中的位置97至120，鼠不变链SEQ ID NO:11中的位置80至103)的腔结构域。CLIP区域包含核心CLIP肽(人不变链SEQ ID NO:1中的位置103至117，鼠不变链SEQ ID NO:11中的位置86至100)和三聚化结构域(人不变链SEQ ID NO:1中的位置134至208，鼠不变链SEQ IDNO:11中的位置117至191；Mittendorf等人 2009; Strumptner-Cuvelette和Benaroch 2002。腔结构域的剩余部分包含位于跨膜和KEY区域之间(人不变链SEQ ID NO:1中的位置73至92，鼠不变链SEQ ID NO:11中的位置56至75)或三聚化结构域下游(人不变链SEQ ID NO:1中的位置209至232，鼠不变链SEQ ID NO:11中的位置192至215)的两个高度柔性的区域。
合适地，所述融合蛋白不包含全长不变链。
已在几种生物体诸如鸡、牛、犬、小鼠、大鼠和人中表征了不变链。源自各种生物体的不变链的多肽序列提供于图12中，其相对于人p35不变链(SEQ ID NO:1)比对。该图还包括人p43和c同种型以及鼠p31和p41同种型。每个不变链序列用其相应的UniProt登录号和SEQ ID NO标记。这些不变链序列的序列标识号是SEQ ID NO:1、5、9、11、13和15-52。对应于人p35不变链的残基17-97的源自各种生物体的不变链的片段的实例显示于图13中，其中所述序列相对于人p35不变链(SEQ ID NO:1)的残基17-97比对。这些不变链片段序列的序列标识号是SEQ ID NO:53-84。对应于人p35不变链的残基67-92的源自各种生物体的不变链的部分的实例显示于图14中，其中所述序列相对于人p35不变链的残基67-92比对。这些不变链片段序列的序列标识号是SEQ ID NO:85-116。
包含来自SEQ ID NO:1的残基77-92的连续残基的不变链的片段的部分
在一个实施方案中，不变链的片段由SEQ ID NO:1的残基17-97的部分组成，其中所述部分包含来自SEQ ID NO:1的残基17-97的至少5个，更合适地至少6个，更合适地至少7个，更合适地至少8个，更合适地至少9个，更合适地至少10个，更合适地至少11个，更合适地至少12个，更合适地至少13个，更合适地至少14个，更合适地至少15个连续残基。在进一步的实施方案中，所述部分包含SEQ ID NO:1的残基77-92或更合适地由SEQ ID NO:1的残基77-92组成。
在进一步的实施方案中，不变链的片段由80个或更少的残基组成且包含至少5个连续残基的序列，其中所述序列与来自SEQ ID NO:1的残基77-92的至少5个，更合适地至少6个，更合适地至少7个，更合适地至少8个，更合适地至少9个，更合适地至少10个，更合适地至少11个，更合适地至少12个，更合适地至少13个，更合适地至少14个，更合适地至少15个连续残基共有至少80%，更合适地至少90%同一性。更合适地，不变链的片段由80个或更少的残基组成，且包含来自SEQ ID NO:1的残基77-92的至少5个，更合适地至少6个，更合适地至少7个，更合适地至少8个，更合适地至少9个，更合适地至少10个，更合适地至少11个，更合适地至少12个，更合适地至少13个，更合适地至少14个，更合适地至少15个连续残基。
或者，不变链的片段由80个或更少的残基组成且包含至少5个连续残基的序列，其中相对于来自SEQ ID NO:1的残基77-92的至少5个，更合适地至少6个，更合适地至少7个，更合适地至少8个，更合适地至少9个，更合适地至少10个，更合适地至少11个，更合适地至少12个，更合适地至少13个，更合适地至少14个，更合适地至少15个连续残基，所述序列包含不超过4个，更合适地不超过3个，更合适地不超过2个，更合适地不超过1个取代、缺失或添加。
合适地，不变链的片段包含SEQ ID NO:1的残基77-81、78-82、79-83、80-84、81-85、82-86、83-87、84-88、85-89、86-90或87-91或由其组成。
合适地，不变链的片段包含SEQ ID NO:1的残基77-84、78-85、79-86、80-87、81-88、82-89或83-90或由其组成。
包含来自SEQ ID NO:1的残基72-92的连续残基的不变链的片段的部分
在一个实施方案中，不变链的片段由SEQ ID NO:1的残基17-97的部分组成，其中所述部分包含来自SEQ ID NO:1的残基72-92的至少5个，更合适地至少6个，更合适地至少7个，更合适地至少8个，更合适地至少9个，更合适地至少10个，更合适地至少11个，更合适地至少12个，更合适地至少13个，更合适地至少14个，更合适地至少15个，更合适地至少16个，更合适地至少17个，更合适地至少18个，更合适地至少19个，更合适地至少20个连续残基。在进一步的实施方案中，所述部分包含SEQ ID NO:1的残基72-92或更合适地由SEQ ID NO:1的残基72-92组成。
在进一步的实施方案中，不变链的片段由80个或更少的残基组成且包含至少5个连续残基的序列，其中所述序列与来自SEQ ID NO:1的残基72-92的至少5个，更合适地至少6个，更合适地至少7个，更合适地至少8个，更合适地至少9个，更合适地至少10个，更合适地至少11个，更合适地至少12个，更合适地至少13个，更合适地至少14个，更合适地至少15个，更合适地至少16个，更合适地至少17个，更合适地至少18个，更合适地至少19个，更合适地至少20个连续残基共有至少80%，更合适地至少90%同一性。
更合适地，不变链的片段由80个或更少的残基组成且包含来自SEQ ID NO:1的残基72-92的至少5个，更合适地至少6个，更合适地至少7个，更合适地至少8个，更合适地至少9个，更合适地至少10个，更合适地至少11个，更合适地至少12个，更合适地至少13个，更合适地至少14个，更合适地至少15个，更合适地至少16个，更合适地至少17个，更合适地至少18个，更合适地至少19个，更合适地至少20个连续残基的序列。
或者，不变链的片段由80个或更少的残基组成且包含至少5个连续残基的序列，其中相对于来自SEQ ID NO:1的残基72-92的至少5个，更合适地至少6个，更合适地至少7个，更合适地至少8个，更合适地至少9个，更合适地至少10个，更合适地至少11个，更合适地至少12个，更合适地至少13个，更合适地至少14个，更合适地至少15个，更合适地至少16个，更合适地至少17个，更合适地至少18个，更合适地至少19个，更合适地至少20个连续残基，所述序列包含不超过7个，更合适地不超过6个，更合适地不超过5个，更合适地不超过4个，更合适地不超过3个，更合适地不超过2个，更合适地不超过1个取代、缺失或添加。
包含来自SEQ ID NO:1的残基67-92的连续残基的不变链的片段的部分
在一个实施方案中，不变链的片段由SEQ ID NO:1的残基17-97的部分组成，其中所述部分包含来自SEQ ID NO:1的残基67-92的至少10个，更合适地至少15个，更合适地至少20个连续残基。在进一步的实施方案中，所述部分包含SEQ ID NO:1的残基67-92或更合适地由SEQ ID NO:1的残基67-92组成。
在进一步的实施方案中，不变链的片段由80个或更少的残基组成且包含至少10个连续残基的序列，其中所述序列与来自SEQ ID NO:1的残基67-92的至少10个连续残基共有至少80%，更合适地至少90%同一性。更合适地，不变链的片段由80个或更少的残基组成且包含至少10个连续残基的序列，其中所述序列包含来自SEQ ID NO:1的残基67-92的至少10个连续残基。合适地，不变链的片段包含SEQ ID NO:1的残基67-76、68-77、69-78、70-79、71-80、72-81、73-82、74-83、75-84、76-85、77-86、78-87、79-88、80-89、81-90、82-91或83-92或由其组成。
合适地，不变链的片段包含至少15个连续残基，其中所述至少15个连续残基与来自SEQ ID NO:1的残基67-92的至少15个连续残基共有至少80%，更合适地至少90%同一性。更合适地，不变链的片段包含至少15个连续残基，其中所述至少15个连续残基包含来自SEQID NO:1的残基67-92的至少15个连续残基。合适地，不变链的片段包含SEQ ID NO:1的残基67-81、68-82、69-83、70-84、71-85、72-86、73-87、74-88、75-89、76-90、77-91或78-92或由其组成。
合适地，不变链的片段包含至少20个连续残基，其中所述至少20个连续残基与来自SEQ ID NO:1的残基67-92的至少20个连续残基共有至少80%，更合适地至少90%同一性。合适地，不变链的片段包含至少20个连续残基，其中所述至少20个连续残基包含来自SEQID NO:1的残基67-92的至少20个连续残基。合适地，不变链的片段包含SEQ ID NO:1的残基67-86、68-87、69-88、70-89、71-90、72-91或73-92或由其组成。
合适地，不变链的片段包含至少25个连续残基，其中所述至少25个连续残基与来自SEQ ID NO:1的残基67-92的至少25个连续残基共有至少80%，更合适地至少90%同一性。合适地，不变链的片段包含至少25个连续残基，其中所述至少25个连续残基包含来自SEQID NO:1的残基67-92的至少25个连续残基。合适地，不变链的片段包含SEQ ID NO:1的残基67-91或68-92或由其组成。
合适地，不变链的片段包含SEQ ID NO:1的残基70-92、72-92、73-92、77-92、79-92或85-92或更合适地由其组成。或者，不变链的片段包含SEQ ID NO:1的残基67-90、67-87或67-82或更合适地由其组成。更合适地，不变链的片段包含SEQ ID NO:1的残基72-92或77-92或更合适地由其组成。
合适地，不变链的片段包含选自SEQ ID NO:85-116的序列或更合适地由其组成。
合适地，所述融合蛋白不包含与抗原序列可操作连接的不变链的片段，其中不变链的片段包含比SEQ ID NO:1的残基67-92更大数目的SEQ ID NO:1的连续残基。
由人p35不变链的残基1-97和相关序列组成的不变链的片段
在一个实施方案中，不变链的片段由SEQ ID NO:1的残基1-97组成。在进一步的实施方案中，不变链的片段由SEQ ID NO:1的91至103，更合适地93至101，更合适地95至99，更合适地97个残基组成，和/或与SEQ ID NO:1的残基1-97共有至少95%，更合适地97%同一性。合适地，不变链的片段由SEQ ID NO:1的残基1-97或SEQ ID NO:5、9、11、13和15-52的对应于SEQID NO:1的残基1-97的残基组成。更合适地，不变链的片段由SEQ ID NO:1的残基1-97组成。
合适地，所述融合蛋白不包含与抗原序列可操作连接的不变链的片段，其中不变链的片段包含比SEQ ID NO:1的残基1-97更大数目的SEQ ID NO:1的连续残基。
由人p35不变链的残基17-97和相关序列组成的不变链的片段
在一个实施方案中，不变链的片段由SEQ ID NO:17的残基1-97组成。在进一步的实施方案中，不变链的片段由SEQ ID NO:1的76至84，更合适地78至82，更合适地80至82，更合适地81个残基组成，和/或与SEQ ID NO:1的残基17-97共有至少95%，更合适地97%同一性。合适地，不变链的片段由SEQ ID NO:53-84中的任何一个或多个组成。更合适地，不变链的片段由SEQ ID NO:53组成。
合适地，所述融合蛋白不包含与抗原序列可操作连接的不变链的片段，其中不变链的片段包含比SEQ ID NO:1的残基17-97更大数目的SEQ ID NO:1的连续残基。
由人p35不变链的残基1-92和相关序列组成的不变链的片段
在一个实施方案中，不变链的片段由SEQ ID NO:1的残基1-92组成。在进一步的实施方案中，不变链的片段由SEQ ID NO:1的88至96，更合适地90至95，更合适地91至93，更合适地92个残基组成，和/或与SEQ ID NO:1的残基1-92共有至少95%，更合适地97%同一性。合适地，不变链的片段由SEQ ID NO:1的残基1-92或SEQ ID NO:5、9、11、13和15-52的对应于SEQID NO:1的残基1-92的残基组成。更合适地，不变链的片段由SEQ ID NO:1的残基1-92组成。
合适地，所述融合蛋白不包含与抗原序列可操作连接的不变链的片段，其中不变链的片段包含比SEQ ID NO:1的残基1-92更大数目的SEQ ID NO:1的连续残基。
由人p35不变链的残基17-92和相关序列组成的不变链的片段
在一个实施方案中，不变链的片段由SEQ ID NO:17的残基1-92组成。在进一步的实施方案中，不变链的片段由SEQ ID NO:1的71至79，更合适地74至78，更合适地75至77，更合适地76个残基组成，和/或与SEQ ID NO:1的残基17-92或SEQ ID NO:5、9、11、13和15-52的对应于SEQ ID NO:1的残基17-92的残基共有至少95%，更合适地97%同一性。更合适地，不变链的片段由SEQ ID NO:1的残基17-92组成。
合适地，所述融合蛋白不包含与抗原序列可操作连接的不变链的片段，其中不变链的片段包含比SEQ ID NO:1的残基17-92更大数目的SEQ ID NO:1的连续残基。
片段大小、片段位置和片段数目
合适地，不变链的片段由少于30个，更合适地少于25个，更合适地少于20个，更合适地少于15个，更合适地少于10个，更合适地少于7个残基组成。合适地，不变链的片段由至少25个，更合适地至少35个，更合适地至少45个，更合适地至少55个残基，更合适地至少75个残基组成。
合适地，不变链的片段通过不变链的片段的N-末端或C-末端与抗原序列连接。最合适地，不变链的片段通过不变链的片段的C-末端与抗原序列连接。
合适地，不变链的片段在融合蛋白的N-末端或C-末端。最合适地，不变链的片段在融合蛋白的N-末端。
合适地，融合蛋白包含多个不变链的片段。例如，两个、三个、四个或更多个不变链的片段。合适地，不变链的片段在抗原内部编码。
根据本发明的融合蛋白包含多肽，其中所述多肽由与抗原序列可操作连接的不变链的片段组成，其中所述不变链的片段由某些定义的序列组成。‘由……组成’意味着尽管在不变链片段的任一末端可存在另外残基，但在不变链的任一末端的额外的另外残基不导致不变链的片段成为比定义的片段更大的不变链的片段(并且不导致不变链的片段成为全长不变链)。
合适地，根据本发明的融合蛋白不是WO2010057501 (其通过引用并入本文，特别是为了放弃其中公开的融合体的目的)中公开的融合蛋白。
源自不同物种的不变链
合适地，不变链的片段是指源自动物(诸如脊椎动物、诸如鱼、鸟或哺乳动物)的不变链的截短形式。更合适地，不变链的片段是指源自哺乳动物的不变链的截短形式。更合适地，不变链的片段是指源自哺乳动物的不变链的截短形式，所述哺乳动物选自由鸡、牛、狗、小鼠、大鼠、非人灵长类动物或人组成的列表。更合适地，不变链的片段是指源自人或小鼠的不变链的截短形式。更合适地，不变链的片段是指源自人的不变链的截短形式。
来自各种物种的不同不变链序列提供于SEQ ID NO:1、5、9、11、13和15-52。
源自不同物种的不变链：鼠不变链
对于鼠不变链，仅已知分别对应于人不变链同种型p33和p41的两个同种型(p31和p41)。SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12分别对应于鼠不变链p31同种型的氨基酸序列和核酸序列。SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14分别对应于鼠不变链p41同种型的氨基酸序列和核酸序列。合适地，不变链的片段源自不变链的小鼠p31或p41同种型。
可以使用鼠不变链的片段实施本发明。因此，提供了以下方面。
包含多肽的融合蛋白，其中所述多肽由与抗原序列可操作连接的不变链的片段组成，且其中所述不变链的片段由以下组成：
(a) SEQ ID NO:11的残基1-80的部分，其中所述部分包含来自SEQ ID NO:1的残基60-75的至少5个连续残基；
(b) 80个或更少的残基且包含至少5个连续残基的序列，其中所述序列与来自SEQ IDNO:11的残基60-75的至少5个连续残基共有至少80%同一性；
(c) SEQ ID NO:11的残基1-80；
(d) 91至103个残基且与SEQ ID NO:11的残基1-80共有至少95%同一性；或
(e) SEQ ID NO:11的残基1-75；
(f) 88至96个残基且与SEQ ID NO:11的残基1-75共有至少95%同一性。
编码包含多肽的融合蛋白的多核苷酸，其中所述多肽由与抗原序列可操作连接的不变链的片段组成，且其中所述不变链的片段由以下组成：
(a) SEQ ID NO:11的残基1-80的部分，其中所述部分包含来自SEQ ID NO:1的残基60-75的至少5个连续残基；
(b) 80个或更少的残基且包含至少5个连续残基的序列，其中所述序列与来自SEQ IDNO:11的残基60-75的至少5个连续残基共有至少80%同一性；
(c) SEQ ID NO:11的残基1-80；
(d) 91至103个残基且与SEQ ID NO:11的残基1-80共有至少95%同一性；或
(e) SEQ ID NO:11的残基1-75；
(f) 88至96个残基且与SEQ ID NO:11的残基1-75共有至少95%同一性。
包含多核苷酸的病毒载体，所述多核苷酸编码包含多肽的融合蛋白，其中所述多肽由与抗原序列可操作连接的不变链的片段组成，且其中所述不变链的片段由以下组成：
(a) SEQ ID NO:11的残基1-80的部分，其中所述部分包含来自SEQ ID NO:1的残基60-75的至少5个连续残基；
(b) 80个或更少的残基且包含至少5个连续残基的序列，其中所述序列与来自SEQ IDNO:11的残基60-75的至少5个连续残基共有至少80%同一性；
(c) SEQ ID NO:11的残基1-80；
(d) 91至103个残基且与SEQ ID NO:11的残基1-80共有至少95%同一性；或
(e) SEQ ID NO:11的残基1-75；
(f) 88至96个残基且与SEQ ID NO:11的残基1-75共有至少95%同一性。
包含多肽的融合蛋白，其中所述多肽由与抗原序列可操作连接的不变链的片段组成，且其中所述不变链的片段由以下组成：
(a) SEQ ID NO:11的残基1-80的部分，其中所述部分包含来自SEQ ID NO:1的残基50-75的至少10个连续残基；
(b) 80个或更少的残基且包含至少10个连续残基的序列，其中所述序列与来自SEQ IDNO:11的残基50-75的至少10个连续残基共有至少80%同一性；
(c) SEQ ID NO:11的残基1-80；
(d) 91至103个残基且与SEQ ID NO:11的残基1-80共有至少95%同一性；或
(e) SEQ ID NO:11的残基1-75；
(f) 88至96个残基且与SEQ ID NO:11的残基1-75共有至少95%同一性。
编码包含多肽的融合蛋白的多核苷酸，其中所述多肽由与抗原序列可操作连接的不变链的片段组成，且其中所述不变链的片段由以下组成：
(a) SEQ ID NO:11的残基1-80的部分，其中所述部分包含来自SEQ ID NO:1的残基50-75的至少10个连续残基；
(b) 80个或更少的残基且包含至少10个连续残基的序列，其中所述序列与来自SEQ IDNO:11的残基50-75的至少10个连续残基共有至少80%同一性；
(c) SEQ ID NO:11的残基1-80；
(d) 91至103个残基且与SEQ ID NO:11的残基1-80共有至少95%同一性；或
(e) SEQ ID NO:11的残基1-75；
(f) 88至96个残基且与SEQ ID NO:11的残基1-75共有至少95%同一性。
包含多核苷酸的病毒载体，所述多核苷酸编码包含多肽的融合蛋白，其中所述多肽由与抗原序列可操作连接的不变链的片段组成，且其中所述不变链的片段由以下组成：
(a) SEQ ID NO:11的残基1-80的部分，其中所述部分包含来自SEQ ID NO:1的残基50-75的至少10个连续残基；
(b) 80个或更少的残基且包含至少10个连续残基的序列，其中所述序列与来自SEQ IDNO:11的残基50-75的至少10个连续残基共有至少80%同一性；
(c) SEQ ID NO:11的残基1-80；
(d) 91至103个残基且与SEQ ID NO:11的残基1-80共有至少95%同一性；或
(e) SEQ ID NO:11的残基1-75；
(f) 88至96个残基且与SEQ ID NO:11的残基1-75共有至少95%同一性。
具体而言，上述部分可以包含SEQ ID NO:11的残基53-75、55-75、56-75、60-75、62-75或68-75或更合适地由其组成。或者，上述部分可以包含SEQ ID NO:11的残基50-73、50-70或50-65或更合适地由其组成。更合适地，上述部分可以包含SEQ ID NO:11的残基55-75或60-75或更合适地由其组成。
可操作连接
根据本发明，不变链的片段与抗原序列可操作连接。可操作连接是指直接连接或这样的氨基酸残基或核苷酸序列：其将不变链片段和抗原序列或编码的不变链片段和抗原序列结合在一起，使得在施用融合蛋白后，不变链片段使对抗原序列的免疫应答基本上增加至与抗原序列直接连接的不变链片段的免疫应答相同的程度。当第一多核苷酸的3'末端与第二序列的5'末端直接相邻而没有间插核酸时，为直接连接。或者，ORF可以间接连接，使得存在间插核酸。例如，间插核酸可以是非编码的或可以编码氨基酸序列，例如肽接头。可操作连接的核酸可以编码直接连接的多肽，即一个编码多肽的羧基末端(“C-末端”)与第二编码多肽的氨基末端(“N-末端”)直接相邻。或者，可操作连接的核酸可以编码间接连接的多肽，使得在编码的多肽之间存在间插氨基酸。此类间插氨基酸在本文中被称为肽序列或接头。
在一个实施方案中，不变链的片段与抗原序列直接连接。在一个替代实施方案中，不变链的片段与抗原序列间接连接。合适地，不变链的片段通过肽序列与抗原序列间接连接。合适地，所述肽序列包含甘氨酸和丝氨酸或更合适地由甘氨酸和丝氨酸组成，更合适地，所述肽序列包含序列GlySer或更合适地由序列GlySer组成。或者，所述肽序列包含'AscI'接头或由'AscI'接头组成，所述'AscI'接头是具有由多核苷酸序列AGGCGCGCC编码的多肽序列ArgArgAla的接头。或者，所述肽序列包含‘res’接头或更合适地由‘res’接头组成，所述‘res’接头是具有由多核苷酸序列AGCGATCGCTATTTAAATAGGCGCGCC (SEQ ID NO:120)编码的多肽序列SerAspArgTyrLeuAsnArgArgAla (SEQ ID NO:119)的接头。或者，所述肽序列包含人流感血凝素(HA)标签(多肽SEQ ID NO:121，多核苷酸SEQ ID NO:122)或更合适地由其组成。
合适地，所述肽序列不包含SEQ ID NO:1的残基98-100，更合适地残基98-105，更合适地残基98-110，更合适地残基98-125，更合适地残基98-150的连续序列。合适地，所述肽序列不包含来自SEQ ID NO:1的残基98-232的多于10个，更合适地多于7个，更合适地多于5个，更合适地多于3个连续残基的连续序列。
合适地，所述肽序列不包含SEQ ID NO:1的残基93-100，更合适地残基93-105，更合适地残基93-110，更合适地残基93-125，更合适地残基93-150的连续序列。
合适地，所述肽序列不包含来自SEQ ID NO:1的残基93-232的多于10个，更合适地多于7个，更合适地多于5个，更合适地多于3个连续残基的连续序列。
在整个说明书中，短语‘不包含……的连续序列’意味着所讨论的序列不包含所提及的整个连续序列。
合适地，所述肽序列由50个或更少，更合适地30个或更少，更合适地10个或更少，更合适地5个或更少的残基组成。
抗原序列
抗原序列是含有至少一个能够引发免疫应答的表位的多肽。术语抗原序列、抗原蛋白、抗原片段、抗原和免疫原在本文中可互换使用。表位(也称为抗原决定簇)是被免疫系统识别的抗原序列的部分。合适地，该识别由抗体、B细胞或T细胞与所讨论的表位的结合介导。被抗体或B细胞结合的表位称为B细胞表位，而被T细胞结合的表位称为T细胞表位。合适地，结合被定义为抗体或T细胞受体(TCR)和相应表位之间的结合常数为1x105 M-1或更高，或1x106 M-1，1x107 M-1，1x108 M-1或更高的结合。术语“表位”是指构象以及非构象表位。构象和非构象表位的区别在于，在变性溶剂存在的情况下，与前者的结合丧失而与后者的结合没有丧失。T细胞表位是非构象性的，即它们是线性的，而B细胞表位可以是构象或非构象性的。线性B细胞表位通常长度在5至20个氨基酸之间变化。
合适地，所述融合蛋白包含多个抗原序列。合适地，所述抗原序列源自病原体。抗原序列合适地源自选自以下的病原体：病毒、细菌、原生生物和多细胞寄生虫。在一个替代实施方案中，合适地，所述抗原序列源自癌细胞。
抗原序列诱导B细胞应答或T细胞应答，或者B细胞应答和T细胞应答。因此，抗原蛋白或抗原片段包含至少一个T细胞表位和/或至少一个B细胞表位。
合适地，编码抗原序列的多核苷酸序列包含选自以下组成的列表的序列：SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:117。
以下关于鼠不变链片段的实施例证实当配置在腺病毒5型(Ad5)载体中时，此类片段对卵清蛋白(OVA)抗原免疫原性和OVA抗原呈递的影响。OVA是一种糖蛋白，其足够大且复杂以具有轻度免疫原性。由于该原因，OVA是频繁用于疫苗接种实验中的众所周知的模型抗原，可预期关于它的发现同样适用于其他抗原。
载体
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸包含在载体中。
合适地，所述载体选自由病毒载体、细菌载体(诸如沙门氏菌或李斯特氏菌)和合成脂质纳米颗粒(LNP)(诸如SAM® - 由LNP递送的合成的、自我扩增的mRNA)组成的列表中的一种或多种。
病毒载体是包含异源核酸的病毒，其能够将异源核酸引入生物体的细胞中。在本发明的上下文中，考虑在通过病毒载体引入后，在所述细胞内表达由异源核酸编码的抗原和不变链片段。
重组病毒载体是包含重组多核苷酸的病毒载体，其包含原始重组病毒载体的复制品。合适地，所述病毒载体选自：腺病毒载体(本文中也称为“腺病毒载体”或简单地“腺病毒”)、腺相关病毒(AAV)载体(例如，AAV 5型和AAV 2型)、甲病毒载体(例如，委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)、辛德毕斯(sindbis)病毒(SIN)、塞姆利基森林病毒(semliki forest virus，SFV)和VEE-SIN嵌合体)、疱疹病毒载体(例如，源自巨细胞病毒例如恒河猴巨细胞病毒(RhCMV)的载体)、沙粒病毒载体(例如，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)载体)、麻疹病毒载体、牛痘病毒载体、副粘病毒载体、杆状病毒载体、水泡性口炎病毒载体、逆转录病毒、慢病毒和病毒样颗粒(VLP)。
在一个具体实施方案中，所述病毒载体是腺病毒载体。腺病毒已经由于它在多种靶组织中实现高效基因转移的能力和大转基因容量而被广泛地用于基因转移应用。用于本发明中的腺病毒载体可以源自一系列的哺乳动物宿主。已经分离超过100种不同的腺病毒血清型，其感染各种哺乳动物物种。根据序列同源性和它们凝集红血细胞的能力，已将这些腺病毒血清型分为6个亚属(A-F；B细分为B1和B2)(Tatsis和Ertl 2004)。
合适地，用于本发明中的腺病毒载体源自人腺病毒。人来源的腺病毒的实例是Ad1、Ad2、Ad4、Ad5、Ad6、Ad11、Ad19、Ad24、Ad34和Ad35。尽管基于Ad5的载体已广泛用于许多基因疗法试验中，但由于因天然感染在一般群体中存在先前存在的免疫力，所以Ad5和其他人C组腺病毒载体的使用可能存在限制。Ad5和其他人类C组成员倾向于是最血清阳性的血清型。另外，由于在治疗期间暴露于载体，可发展对现有载体的免疫力。这些类型的预先存在或发展的对血清阳性载体的免疫力可限制基因疗法或疫苗接种努力的有效性。因此，替代的腺病毒血清型构成了追求能够逃避宿主免疫应答的基因递送系统中非常重要的靶标。
合适地，腺病毒包含六邻体、五邻体和/或纤维蛋白，其中六邻体、五邻体和纤维蛋白中的一种或多种与SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124或SEQ ID NO:125共有至少95%同一性，或更合适地至少98%同一性，或更合适地与之相同。这些是Ad5的六邻体、五邻体和纤维蛋白序列。
或者，用于本发明中的腺病毒载体源自非人类猿猴腺病毒。许多腺病毒已分离自非人类猿猴诸如黑猩猩、倭黑猩猩、恒河猴和大猩猩，并且源自这些腺病毒的载体诱导对由这些载体编码的转基因的强烈免疫应答(Colloca等人 2012; Roy等人 2004; Roy等人2010)。基于非人类猿猴腺病毒的载体的某些优点包括在靶群体中相对缺乏针对这些腺病毒的交叉中和抗体。例如，某些黑猩猩腺病毒与预先存在的中和抗体应答的交叉反应仅存在于2%的靶群体中，相比之下，在某些候选人类腺病毒载体的情况下为35%。
合适地，腺病毒载体源自非人类猿猴腺病毒，其为黑猩猩腺病毒，例诸如ChAd3、ChAd63、ChAd83、ChAd155、Pan5、Pan6、Pan7 (也称为C7)或Pan9。此类毒株的实例描述于WO03/000283、WO2005/071093、WO2010/086189和GB1510357.5中，并且还可得自美国典型培养物保藏中心，10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209和其他来源。或者，腺病毒载体可以源自从倭黑猩猩分离的非人类猿猴腺病毒，诸如PanAd1、PanAd2或PanAd3。本文描述的此类载体的实例可见于例如WO2005/071093和WO2010/086189中。腺病毒载体也可以源自从大猩猩分离的腺病毒，如WO2013/52799、WO2013/52811和WO2013/52832中所述。
合适地，腺病毒包含六邻体和/或纤维蛋白，其中六邻体和纤维蛋白中的一种或多种分别与SEQ ID NO:126或SEQ ID NO:127共有至少95%同一性，或更合适地至少98%同一性，或更合适地与之相同。这些是ChAd3的六邻体和纤维蛋白序列。
合适地，腺病毒包含六邻体和/或纤维蛋白，其中六邻体和纤维蛋白中的一种或多种分别与SEQ ID NO:128或SEQ ID NO:129共有至少95%同一性，或更合适地至少98%同一性，或更合适地与之相同。这些是ChAd19的六邻体和纤维蛋白序列。
合适地，腺病毒包含六邻体和/或纤维蛋白，其中六邻体和纤维蛋白中的一种或多种分别与SEQ ID NO:130或SEQ ID NO:131共有至少95%同一性，或更合适地至少98%同一性，或更合适地与之相同。这些是ChAd63的六邻体和纤维蛋白序列。
合适地，腺病毒包含六邻体、五邻体和/或纤维蛋白，其中六邻体、五邻体和纤维蛋白中的一种或多种分别与SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133或SEQ ID NO:134共有至少95%同一性，或更合适地至少98%同一性，或更合适地与之相同。这些是ChAd155的六邻体、五邻体和纤维蛋白序列。
腺病毒具有二十面体衣壳的特征性形态，所述二十面体衣壳包含三种主要蛋白六邻体(II)、五邻体基础(III)和多节纤突(IV)、以及许多其他次要蛋白VI、VIII、IX、IlIa和IVa2。该病毒基因组是直链双链DNA。该病毒DNA与高碱性蛋白VII和小肽pX (以前称作mu)密切结合。另一种蛋白V与该DNA-蛋白复合物一起包装，并提供通过蛋白VI与衣壳的结构连接。该病毒也含有病毒编码的蛋白酶，所述蛋白酶是加工一些结构蛋白以产生成熟的传染性病毒所必需的。
腺病毒基因组被充分地表征。就类似地定位(例如每种病毒的E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4和L5基因的位置)的特定开放读码框而言，在腺病毒基因组的总组构中存在普遍保守性。腺病毒基因组的每个端包含被称作反向末端重复(ITR)的序列，其是病毒复制所必需的。该病毒也包含病毒编码的蛋白酶，其是产生传染性病毒粒子所需的一些结构蛋白的加工所必需的。基于在宿主细胞转导以后表达病毒基因的次序，描述了腺病毒基因组的结构。更具体地，根据转录发生在DNA复制开始之前还是之后，将所述病毒基因称作早期(E)或晚期(L)基因。在转导的早期阶段，表达腺病毒的E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4基因以使宿主细胞准备用于病毒复制。在感染的晚期阶段，编码病毒颗粒的结构组分的晚期基因L1-L5的表达被活化。
能复制的腺病毒是在宿主细胞中没有包含任何重组辅助蛋白的情况下，可以在所述宿主细胞中复制的腺病毒。合适地，能复制的腺病毒包含下述完整的或功能性的必需早期基因：E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4。从特定动物分离的野生型腺病毒将是在该动物中能复制的。
不能复制的或复制缺陷的腺病毒是不能复制的腺病毒，因为它已经被工程改造成至少包含功能缺失(或“功能缺失”突变)，即在不将基因完全除去的情况下损害该基因的功能的缺失或突变，例如人工终止密码子的引入，活性位点或相互作用结构域的缺失或突变，基因等的调节序列的突变或缺失，或编码病毒复制所必需的基因产物的基因的完全除去，诸如选自E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4 (诸如E3 ORF1、E3 ORF2、E3 ORF3、E3 ORF4、E3 ORF5、E3 ORF6、E3 ORF7、E3 ORF8、E3 ORF9、E4 ORF7、E4 ORF6、E4 ORF5、E4 ORF4、E4 ORF3、E4ORF2和/或E4 ORF1)的腺病毒基因中的一个或多个。合适地，缺失E1和E3基因。更合适地，缺失E1、E3和E4基因。合适地，当使用Ad5载体时，缺失E1、E3和E4基因，其中重新插入Ad5 E4ORF6。合适地，当使用PanAd3载体时，缺失E1和E4基因，其中插入Ad5 E4 ORF6。合适地，当使用ChAd3载体时，缺失E1、E3和E4基因，其中插入Ad5 E4 ORF6。
在用于将基因递送至哺乳动物(诸如人)细胞的腺病毒载体的构建中，可以在所述载体中采用一系列经修饰的腺病毒核酸序列。例如，可以从形成重组病毒的部分的腺病毒序列中消除腺病毒延迟早期基因E3的全部或部分。认为E3的功能与重组病毒颗粒的功能和生产无关。也可以构建具有至少E4基因的ORF6区域的缺失的腺病毒载体，且更理想地因为该区域的功能的冗余，而缺失整个E4区域。本发明的仍另一种载体含有延迟早期基因E2A中的缺失。也可以在腺病毒基因组的晚期基因L1至L5中的任一种中造成缺失。类似地，中间基因IX和IVa2中的缺失可以用于一些目的。可以在其他结构或非结构腺病毒基因中造成其他缺失。上面讨论的缺失可以单个地使用，即，用于如本文中所述的用途的腺病毒序列可以含有在仅单个区域中的缺失。或者，可以以任意组合使用有效地破坏它们的生物活性的整个基因或其部分的缺失。
在存在所缺少的腺病毒颗粒的病毒感染性和繁殖所需的腺病毒基因产物的情况下，可以培养缺少一个或多个必需腺病毒序列(例如，E1A、E1B、E2A、E2B、E4 ORF6、L1、L2、L3、L4和L5)的腺病毒。这些辅助功能可以通过在一种或多种辅助构建体(例如，质粒或病毒)或包装宿主细胞存在的情况下培养腺病毒来提供。
合适地，所述病毒载体是痘病毒载体。痘病毒科的特征在于由双链DNA组成的基因组。合适地，所述痘病毒载体属于脊椎动物痘病毒亚科，更优选地属于所述亚科中选自正痘、副痘、亚塔痘、禽痘(优选地金丝雀痘(ALVAC)或鸡痘(FPV))和软疣痘的属。甚至更优选地，所述痘病毒载体属于正痘，且选自痘苗病毒、NYVAC (源自痘苗的哥本哈根毒株)、修饰的痘苗Ankara (MVA)、牛痘病毒和猴痘病毒。最优选地，所述痘病毒载体是MVA。
MVA的描述可见于Mayr A, Stickl H, Müller HK, Danner K, Singer H. 1978和Mayr, A., Hochstein-Mintzel, V. & Stickl, H. 1975。
MVA是痘苗病毒的高度减毒毒株，其在鸡胚胎成纤维细胞中的超过570次传代期间经历多次、完全表征的缺失。这些包括宿主范围基因和编码细胞因子受体的基因。该病毒不能在人和大多数其他哺乳动物细胞中有效复制，但复制缺陷发生在病毒粒子装配的晚期阶段，使得病毒和重组基因表达未受损，使得MVA成为不能在哺乳动物中引起感染的一种有效的单轮表达载体。在一个实施方案中，MVA源自从痘苗病毒在CEF细胞上的第571次传代获得的病毒种子批次460MG。在另一个实施方案中，MVA源自病毒种子批次MVA 476 MG/14/78。在进一步的实施方案中，MVA在1978年12月31前衍生或产生且没有朊病毒污染。
除了编码融合蛋白的多核苷酸以外，载体还可以包括常规的控制元件，其以允许其在用载体转染的细胞中转录、翻译和/或表达的方式与编码多核苷酸可操作连接。
表达控制序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号诸如剪接和聚腺苷酸化(聚腺苷酸)信号，包括兔β-珠蛋白聚腺苷酸；稳定胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(例如，Kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；和当期望时，增强编码的产物的分泌的序列。在其他序列中，可以使用嵌合的内含子。
启动子是允许RNA聚合酶的结合并指导基因的转录的核苷酸序列。通常，启动子位于基因的5'非编码区，接近所述基因的转录起始位点。在转录的起始中起作用的启动子内的序列元件经常特征在于共有核苷酸序列。启动子的实例包括、但不限于来自细菌、酵母、植物、病毒和哺乳动物(包括人类)的启动子。大量表达控制序列(包括内部的、天然的、组成性的、可诱导的和/或组织特异性的启动子)是本领域已知的且可以利用。
组成型启动子的实例包括TBG启动子、逆转录病毒劳氏肉瘤病毒(RSV) LTR启动子(任选地与RSV增强子一起)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地与CMV增强子一起，参见，例如，Boshart等人 1985)、CASI启动子、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1a启动子(Invitrogen)。合适地，所述启动子是HCV启动子或其变体，更合适地是人CMV (HCMV)启动子或其变体。
以下关于鼠不变链片段的实施例证实当配置在腺病毒5型(Ad5)载体中时，此类片段对OVA抗原免疫原性和OVA抗原呈递的影响。已显示Ad5是有效的疫苗载体(参见，例如，Tatsis和Hildegund 2004)。可以预期，本文实施例中提供的关于Ad5载体的发现将同样适用于其他载体，诸如细菌载体和合成脂质纳米颗粒。在细菌载体的情况下，可以预期本文公开的不变链片段有利地影响(具体而言)由此类载体驱动的CD8+ T细胞应答。
药物组合物和佐剂
本发明的融合蛋白、多核苷酸或载体可以包含在药物组合物内。合适地，药物组合物将包括药学上可接受的载体。疫苗是一种药物组合物，其提供针对特定疾病的获得性免疫。本发明提供了包含本发明的融合蛋白、多核苷酸或载体的疫苗。
可以如下制备用于施用的载体：悬浮或溶解于药学上或生理上可接受的载体诸如等渗盐水或其他等渗盐溶液中。适当的载体是本领域技术人员显而易见的，且主要取决于施用途径。合适地使用可生物降解的生物相容的聚合物，或通过使用胶束、凝胶和脂质体的现场递送，可以在持续释放制剂中施用本文描述的组合物。
如本文所用的术语“载体”是指药理学上无活性的物质，诸如但不限于与治疗性活性成分一起施用的稀释剂、赋形剂或媒介物。此类药学载体可以是液体或固体。液体载体包括但不限于无菌液体，诸如在水和油中的盐溶液，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。盐溶液以及含水右旋糖和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是用于可注射溶液。当药物组合物静脉内或通过喷雾器鼻内施用时，盐溶液是一种优选的载体。
合适的药学赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。合适的药物载体的实例描述于E. W. Martin的"Remington's Pharmaceutical Sciences"中。
术语“佐剂”是指在细胞或体液水平增加、刺激、活化、增强(potentiate)或调节对组合物活性成分的免疫应答的试剂，例如免疫佐剂刺激免疫系统对真实抗原的应答，但它们本身没有免疫效应。合适地，本发明的药物组合物包含佐剂。
此类佐剂的实例包括、但不限于：无机佐剂(例如无机金属盐诸如磷酸铝或氢氧化铝)、有机佐剂(例如皂苷，诸如QS21或角鲨烯)、基于油的佐剂(例如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂)、细胞因子(例如IL-1β、IL-2、IL-7、IL-12、IL-18、GM-CFS和INF-γ)、微粒佐剂(例如免疫刺激性复合物(ISCOMS)、脂质体或可生物降解的微球)、病毒体、细菌佐剂(例如单磷酰脂质A，诸如3-脱-O-酰化的单磷酰脂质A (3D-MPL)或胞壁酰基肽)、合成的佐剂(例如非离子的嵌段共聚物、胞壁酰基肽类似物或合成的脂质A)、合成的多核苷酸佐剂(例如聚精氨酸或聚赖氨酸)和含有未甲基化的CpG二核苷酸(“CpG”)的免疫刺激性寡核苷酸。
一种合适的佐剂是单磷酰脂质A (MPL)，尤其是3-脱-O-酰化的单磷酰脂质A (3D-MPL)。在化学上，它经常作为具有4、5或6个酰化链的3-脱-O-酰化的单磷酰脂质A的混合物供应。它可以通过在GB 2122204B中教导的方法纯化和制备，该参考文献也公开了二磷酰基脂质A及其3-O-脱酰化变体的制备。已经描述了其他纯化的和合成的脂多糖(美国专利号6,005,099和EP 0 729 473 B1; Hilgers等人 1986; Hilgers等人 1987; 和EP 0 549 074B1)。
皂苷也是合适的佐剂(参见Lacaille-Dubois, M和Wagner, H 1996)。例如，皂苷Quil A (源自南美洲皂树(Quillaja Saponaria Molina)的树皮)及其级分描述在美国专利号5,057,540和Kensil 1996; 和EP 0 362 279 B1中。Quil A的纯化级分也被称作免疫刺激剂，诸如QS21和QS17；它们的生产方法公开在美国专利号5,057,540和EP 0 362 279B1中。在这些参考文献中也描述了QS7 (Quil-A的非溶血级分)。QS21的应用进一步描述在Kensil等人1991)中。QS21和聚山梨酯或环糊精的组合也是已知的(WO 99/10008)。包含QuilA的级分(诸如QS21和QS7)的微粒佐剂系统描述在WO 96/33739和WO 96/11711中。
另一种佐剂是含有未甲基化的CpG二核苷酸(“CpG”)的免疫刺激性的寡核苷酸(Krieg 1995)。CpG是存在于DNA中的胞嘧啶-鸟苷二核苷酸基序的缩写。已知当通过全身和粘膜途径施用时，CpG作为佐剂(WO 96/02555, EP 468520, Davis等人 1998; McCluskie和Davis 1998)。当配制在疫苗中时，CpG可以与游离抗原一起在游离溶液中施用(WO 96/02555)，或共价地缀合至抗原(WO 98/16247)，或与载体诸如氢氧化铝一起配制(Brazolot-Millan等人1998)。
佐剂诸如上述的那些可以与载体诸如脂质体、水包油乳剂和/或金属性盐(包括铝盐诸如氢氧化铝)一起配制。例如，可以将3D-MPL与氢氧化铝(EP 0 689 454)或水包油乳剂(WO 95/17210)一起配制；可以将QS21与含有胆固醇的脂质体(WO 96/33739)、水包油乳剂(WO 95/17210)或明矾(WO 98/15287)一起配制；可以将CpG与明矾一起(Brazolot-Millan,出处同上)或与其他阳离子载体一起配制。
可以在本发明中利用佐剂的组合，尤其是单磷酰脂质A和皂苷衍生物的组合(参见，例如，WO 94/00153; WO 95/17210; WO 96/33739; WO 98/56414; WO 99/12565; WO99/11241)，更特别是在WO 94/00153中公开的QS21和3D-MPL的组合，或其中将QS21在含有胆固醇的脂质体(DQ)中淬灭的组合物(如在WO 96/33739中公开的)。或者，CpG加皂苷(诸如QS21)的组合是适合用在本发明中的佐剂。包含在水包油乳剂中的QS21、3D-MPL和生育酚的有效佐剂制剂描述在WO 95/17210中，且是用于用在本发明中的另一种制剂。可以将皂苷佐剂配制在脂质体中，并与免疫刺激性的寡核苷酸组合。因而，合适的佐剂系统包括，例如，单磷酰脂质A (优选3D-MPL)与铝盐一起的组合(例如如在WO00/23105中所述)。另一种示例性的佐剂包含QS21和/或MPL和/或CpG。可以将QS21在含有胆固醇的脂质体中淬灭，如在WO96/33739中公开的。
其他合适的佐剂包括烷基氨基葡萄糖苷磷酸酯(AGP)诸如在WO9850399或美国专利号6,303,347中公开的那些(也公开了AGP的制备方法)，或在美国专利号6,764,840中公开的AGP的药学上可接受的盐。一些AGP是TLR4激动剂，且一些是TLR4拮抗剂。认为两者作为佐剂都是有用的。
在一个实施方案中，提供了根据本发明的融合蛋白、多核苷酸、病毒载体或药物组合物，其用作药物。合适地，所述融合蛋白、多核苷酸、病毒载体或药物组合物用于治疗或预防乙型肝炎病毒感染或丙型肝炎病毒感染。还提供了根据本发明的融合蛋白、多核苷酸、病毒载体或药物组合物在制备用于预防或治疗乙型肝炎病毒感染或丙型肝炎病毒感染的药物中的用途。还提供了治疗或预防乙型肝炎病毒感染或丙型肝炎病毒感染的方法，其包括向有此需要的人施用有效量的根据本发明的融合蛋白、多核苷酸、病毒载体或药物组合物。
施用
在一个实施方案中，所述载体经由鼻内、肌肉内、皮下、皮内、胃内、口服、直肠或局部途径施用。
鼻内施用是将所述载体施用至全部呼吸道(包括肺)的粘膜。更具体地，将组合物施用至鼻粘膜。在一个实施方案中，鼻内施用通过喷雾或气溶胶实现。在进一步的实施方案中，所述施用不涉及通过机械手段(诸如针)对粘膜穿孔。肌肉内施用是指将载体注射至个体的任意肌肉中。示例性肌肉内注射剂被施用至三角肌、股外肌、侧臀和背臀区域中。皮下施用是指将载体注射至下皮中。皮内施用是指将载体注射至皮肤层之间的真皮中。胃内施用是指将载体直接施用于胃。口服施用是指经由嘴将载体施用于胃系统。局部施用是将载体施用于皮肤或粘膜的任何部分而不用针或相当装置穿透皮肤。载体可以局部施用于嘴、鼻子、生殖器区域和/或直肠的粘膜。局部施用包括施用方式，诸如舌下和/或经颊施用。舌下施用是在舌下施用载体(例如，使用口服薄膜(OTF))。经颊施用是经由脸颊的颊粘膜施用载体。
本发明的融合蛋白、多核苷酸或载体可用于引发免疫应答。术语“引发免疫应答”是指免疫系统第一次与抗原序列相遇和随后在限定的时间段内诱导抗原特异性的免疫应答。在一个实施方案中，个体的免疫系统与不诱导抗原特异性免疫应答的抗原序列的相遇不被视为“引发免疫应答”。例如，根据本发明，个体的免疫系统与不诱导免疫力的抗原序列的相遇不被视为“引发免疫应答”。在进一步的实施方案中，免疫的诱导由记忆B 细胞和/或记忆T细胞的生成介导。在癌症的情况下，例如，特定抗原可由癌细胞表达而不引发免疫应答。仅存在该抗原不是针对所述抗原“引发免疫应答”。在一个实施方案中，个体尚未有意用抗原序列或包含编码这种序列的多核苷酸的载体进行免疫以在前文给出的时间段内治疗或预防疾病。
待用根据本发明的多核苷酸免疫的个体是，例如哺乳动物或鸟类，更具体地灵长类动物、小鼠、大鼠、绵羊、山羊、牛、猪、马、鹅、鸡、鸭或火鸡，且最特别地，人类。合适地，所述融合蛋白、多核苷酸、病毒载体或药物组合物用于施用于哺乳动物，更合适地是人类。
本发明的多核苷酸可以在引发-加强疫苗接种方案中使用。在许多情况下，疫苗的单次施用不足以产生在所讨论病原体的将来感染的情况下有效保护所需的长效免疫细胞的数目，以针对疾病保护或者用于治疗性治疗疾病。因此，用对特定病原体或疾病特异性的生物制剂进行重复攻击可以是建立针对所述病原体或疾病的持久且保护性的免疫力或者治愈给定疾病所需的。包括重复施用针对相同病原体或疾病的疫苗的施用方案被称为“引发-加强疫苗接种方案”。在一个实施方案中，引发-加强疫苗接种方案涉及至少两次施用针对特定病原体、病原体组或疾病的疫苗。疫苗的第一次施用被称为“引发”，并且相同疫苗或者针对与第一次疫苗相同的病原体的疫苗的任何后续施用被称为“加强”。因此，在本发明的进一步实施方案中，引发-加强疫苗接种方案涉及一次施用疫苗用于引发免疫应答以及至少一次后续施用用于加强免疫应答。应该理解的是，还考虑2、3、4或甚至5次施用用于加强免疫应答。引发和加强之间的时间段任选为1周、2周、4周、6周或8周。更具体地，其为4周或8周。如果进行多于一次加强，则后续加强在前次加强之后1周、2周、4周、6周或8周施用。例如，任何两次加强之间的时间间隔为4周或8周。
引发-加强疫苗接种方案可以是同源或异源的。在同源引发-加强方案中，引发和至少一次加强两者使用抗原蛋白或其抗原片段的相同施用方式进行，即引发和加强使用多肽进行或引发和加强使用由相同载体包含的多核苷酸进行。在本发明的背景下，同源引发-加强疫苗接种方案将包括使用本发明的载体用于引发以及用于加强免疫应答两者。异源引发-加强 方案涉及使用不同方式用于引发和加强免疫应答。异源引发-加强方案将包括本发明的载体用于引发免疫应答，和不同的载体或肽疫苗用于加强免疫应答。
或者，异源引发-加强方案将包括不同的载体或肽疫苗用于引发免疫应答和本发明的载体用于加强免疫应答。在本发明的一个实施方案中，引发-加强免疫接种方案是同源的。在本发明的另一个实施方案中，引发-加强免疫接种方案是异源的。在一种异源引发加强方案中，载体用于免疫应答的加强，且不同的载体或肽疫苗用于免疫应答的引发。在另一个实施方案的异源引发加强方案中，载体用于免疫应答的引发，且不同的载体或肽疫苗用于免疫应答的加强。合适地，用于加强免疫应答的抗原序列在免疫学上与用于引发免疫应答的抗原序列相同。如果两个或更多个抗原序列被相同的抗体、T细胞或B细胞识别，则它们是“免疫学相同的”。由相同的抗体、T细胞或B细胞对两个或更多个免疫原性序列的识别也被称为所述抗体、T细胞或B细胞的“交叉反应”。在一个实施方案中，由相同的抗体、T细胞或B细胞对两个或更多个免疫学上相同的序列的识别是由于所有序列中相同或相似表位的存在。相似表位共有足够的结构和/或电荷特征以被相同抗体或B细胞受体的Fab区域或被相同T细胞受体的V区域结合。抗体、T细胞受体或B细胞受体的结合特征例如通过受体对所讨论表位的结合亲和力来定义。合适地，如果具有较低亲和力常数的多肽的亲和力常数是具有较高亲和力常数的多肽的亲和力常数的至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%，则这两个免疫原性多肽是免疫学相同的。合适地，两个或更多个免疫学相同的多肽包含至少一个相同的表位。如果免疫原性多肽包含相同的表位，或者如果它们具有相同的氨基酸序列，通常可以获得最强的疫苗接种效果。在一个实施方案中，使用所述载体用于引发或加强免疫应答将建立针对病原体或疾病的保护性免疫力或将导致疾病的根治。在一个实施方案中，与没有不变链片段的相同方案相比，使用载体用于引发或加强免疫应答将增加抗原特异性CD8+ T细胞应答。在一个实施方案中，与没有不变链片段的相同方案相比，使用载体用于引发或加强免疫应答将增加抗原特异性CD4+ T细胞应答。
在本发明的一个实施方案中，所述疫苗用于引发-加强免疫接种方案中。在该引发-加强免疫接种方案的第一个实施方案中，所述载体用于引发免疫应答。在引发-加强免疫接种方案的另一个实施方案中，所述载体用于加强免疫应答。
在本发明的一个实施方案中，免疫应答通过鼻内施用引发，且免疫应答通过至少一次肌肉内施用加强；免疫应答通过鼻内施用引发，且免疫应答通过至少一次皮下施用加强；免疫应答通过鼻内施用引发，且免疫应答通过至少一次皮内施用加强；免疫应答通过鼻内施用引发，且免疫应答通过至少一次胃内施用加强；免疫应答通过鼻内施用引发，且免疫应答通过至少一次口服施用加强；免疫应答通过鼻内施用引发，且免疫应答通过至少一次局部施用加强；免疫应答通过鼻内施用引发，且免疫应答通过至少一次鼻内施用加强；免疫应答通过肌肉内施用引发，且免疫应答通过至少一次肌肉内施用加强；免疫应答通过肌肉内施用引发，且免疫应答通过至少一次皮下施用加强；免疫应答通过肌肉内施用引发，且免疫应答通过至少一次皮内施用加强；免疫应答通过肌肉内施用引发，且免疫应答通过至少一次胃内施用加强；免疫应答通过肌肉内施用引发，且免疫应答通过至少一次口服施用加强；免疫应答通过肌肉内施用引发，且免疫应答通过至少一次局部施用加强；免疫应答通过肌肉内施用引发，且免疫应答通过至少一次鼻内施用加强；免疫应答通过皮下施用引发，且免疫应答通过至少一次肌肉内施用加强；免疫应答通过皮下施用引发，且免疫应答通过至少一次皮下施用加强；免疫应答通过皮下施用引发，且免疫应答通过至少一次皮内施用加强；免疫应答通过皮下施用引发，且免疫应答通过至少一次胃内施用加强；免疫应答通过皮下施用引发，且免疫应答通过至少一次口服施用加强；免疫应答通过皮下施用引发，且免疫应答通过至少一次局部施用加强；免疫应答通过皮下施用引发，且免疫应答通过至少一次鼻内施用加强；免疫应答通过皮内施用引发，且免疫应答通过至少一次肌肉内施用加强；免疫应答通过皮内施用引发，且免疫应答通过至少一次皮下施用加强；免疫应答通过皮内施用引发，且免疫应答通过至少一次皮内施用加强；免疫应答通过皮内施用引发，且免疫应答通过至少一次胃内施用加强；免疫应答通过皮内施用引发，且免疫应答通过至少一次口服施用加强；免疫应答通过皮内施用引发，且免疫应答通过至少一次局部施用加强；免疫应答通过皮内施用引发，且免疫应答通过至少一次鼻内施用加强；免疫应答通过胃内施用引发，且免疫应答通过至少一次肌肉内施用加强；免疫应答通过胃内施用引发，且免疫应答通过至少一次皮下施用加强；免疫应答通过胃内施用引发，且免疫应答通过至少一次皮内施用加强；免疫应答通过胃内施用引发，且免疫应答通过至少一次胃内施用加强；免疫应答通过胃内施用引发，且免疫应答通过至少一次口服施用加强；免疫应答通过胃内施用引发，且免疫应答通过至少一次局部施用加强；免疫应答通过胃内施用引发，且免疫应答通过至少一次鼻内施用加强；免疫应答通过口服施用引发，且免疫应答通过至少一次肌肉内施用加强；免疫应答通过口服施用引发，且免疫应答通过至少一次皮下施用加强；免疫应答通过口服施用引发，且免疫应答通过至少一次皮内施用加强；免疫应答通过口服施用引发，且免疫应答通过至少一次胃内施用加强；免疫应答通过口服施用引发，且免疫应答通过至少一次口服施用加强；免疫应答通过口服施用引发，且免疫应答通过至少一次局部施用加强；免疫应答通过口服施用引发，且免疫应答通过至少一次鼻内施用加强；免疫应答通过局部施用引发，且免疫应答通过至少一次肌肉内施用加强；免疫应答通过局部施用引发，且免疫应答通过至少一次皮下施用加强；免疫应答通过局部施用引发，且免疫应答通过至少一次皮内施用加强；免疫应答通过局部施用引发，且免疫应答通过至少一次胃内施用加强；免疫应答通过局部施用引发，且免疫应答通过至少一次口服施用加强；免疫应答通过局部施用引发，且免疫应答通过至少一次局部施用加强；免疫应答通过局部施用引发，且免疫应答通过至少一次鼻内施用加强。在一个实施方案中，免疫应答通过鼻内施用引发，且免疫应答通过至少一次肌肉内施用加强。在又另一个实施方案中，免疫应答通过鼻内施用引发，且免疫应答通过至少一次鼻内施用加强。在又另一个实施方案中，免疫应答通过肌肉内施用引发，且免疫应答通过至少一次肌肉内施用加强。
如果在涉及与另一种组分的共同施用的治疗方案中施用本发明的载体(各自配制在不同的组合物中)，它们有利地在相同部位处或附近共位置地施用。例如，可以将所述组分施用(例如经由选自肌肉内、透皮、真皮内、皮下的施用途径)至相同侧或肢体(“同侧”施用)或相对侧或肢体(“对侧”施用)。
剂量
载体的剂量主要取决于诸如以下因素：正在治疗的病症，患者的年龄、重量和健康，且因而可以在患者之间变化。例如，病毒载体的治疗上有效的成年人或兽医学剂量通常含有1x105至1x1015个病毒颗粒，诸如1x108至1x1012 (例如，1x108、5x108、1x109、5x109、1x1010、2.5x1010、5x1010、1x1011 5x1011或1x1012个颗粒)。或者，可以以通常为1x105至1x1010个噬斑形成单位(PFU)的剂量施用病毒载体，诸如1x105 PFU、5x105 PFU、1x106 PFU、5x106 PFU、1x107 PFU、5x107 PFU、1x108 PFU、5x108 PFU、1x109 PFU、5x109 PFU或1x1010 PFU。剂量将随动物的大小和施用途径而变化。例如，对于单个部位，用于肌肉内注射的合适人或兽医学剂量(对于约80 kg动物)是在约1 x 109至约5 x 1012个颗粒/mL的范围内。任选地，可以使用多个施用部位。在另一个实例中，对于口服制剂，合适的人或兽医学剂量可以是在约1 x1011至约1 x 1015个颗粒的范围内。
核酸的免疫学有效量可以合适地是在1 ng至100 mg。例如，合适的量可以是1µg至100 mg。本领域技术人员可以容易地确定特定核酸的适当量。核酸组分的示例性有效量可以是在1 ng至100µg之间，诸如在1 ng至1µg之间(例如，100 ng-1µg)之间，或在1µg至100µg之间，诸如10 ng、50 ng、100 ng、150 ng、200 ng、250 ng、500 ng、750 ng或1µg。核酸的有效量还可以包括1µg至500µg，诸如1µg至200µg之间，诸如10-100µg之间，例如1µg、2µg、5µg、10µg、20µg、50µg、75µg、100µg、150µg或200µg。或者，核酸的示例性有效量可以是在100µg至1 mg之间，诸如100µg至500µg，例如，100µg、150µg、200µg、250µg、300µg、400µg、500µg、600µg、700µg、800µg、900µg或1 mg。
通常，人剂量将是在0.5ml和2 ml之间的体积。因而，可以将本文描述的组合物配制在例如0.5、1.0、1.5或2.0 ml人剂量/单一或组合免疫原性组分的体积中。
本领域技术人员可以根据施用途径和采用重组载体的治疗或疫苗应用调整这些剂量。可以监测抗原序列的表达水平以确定剂量施用的频率。
实施例
实施例1：一系列的与OVA融合的鼠Ii片段的制备和体内免疫原性测试
产生包含卵清蛋白抗原(“OVA”，SEQ ID NO:8)的E1E3缺失的Ad5构建体，其中OVA经由人流感血凝素(HA)标签(SEQ ID NO:121)融合至鼠Ii序列(mIi)(同种型p31)的片段的C-末端。测试的mIi片段举例说明于图2中，其中编号表示就mIi p31(参见SEQ ID NO:11)而言片段中的氨基酸位置，“D+ER”表示添加内质网保留序列，且“D-17”表示去除内溶酶体分选序列(ESS)。产生包含以下的Ad5构建体：
1. 仅OVA (图2中未显示)
2. mIi(全长)-OVA
3. mIi(1-105)-OVA
4. mIi(1-80)-OVA
5. mIi(1-75)-OVA
6. mIi(1-70)-OVA
7. mIi(1-65)-OVA
8. mIi(1-60)-OVA
9. mIi(1-50)-OVA
10. mIi(D+ER)-OVA
11. mIi(D-17)-OVA
12. mIi(50-215)-OVA。
mIi(D+ER)的多肽序列在SEQ ID NO:138中给出。mIi(D-17)的多肽序列(N-末端Met加上p31 mIi的残基18-215)在SEQ ID NO:139中给出。mIi(50-215)的多肽序列(N-末端Met加上p31 mIi的残基51-215)在SEQ ID NO:140中给出。注意，与标记物相反，mIi(50-215)不包含p31的残基50-215，但包含p31的残基51-215。
用于本实施例中的所有构建体和下面提供的所有那些的mIi启动子是HCMV启动子或其变体(例如，pacCMV)。使用HCMV启动子、Sv40polyA序列和pJM17进行病毒的共转染，如Becker等人1994所述。通过用3x106个病毒颗粒(vp)的单次肌肉内剂量注射C57BL/6小鼠来评估不同构建体的免疫效力。脾细胞在注射后两周收集，并通过IFN-γ ELISpot使用OVA257-264显性CD8肽SIINFEKL (SEQ ID NO:118，先前在C57BL/6小鼠中鉴定和定位)作为抗原进行测试。结果显示于图3中，其中应答表示为产生IFNγ的T细胞数目/百万个脾细胞。应用的统计学检验是单因素ANOVA (Dunnett氏多重比较检验)，其中：*p<0,05；**p<0,01；***p<0,001；****p<0,0001。
如所预期，与仅OVA相比，mIi(全长)-OVA构建体提供了平均更高的应答(参见图3，分别为‘mIi-OVA’和‘OVA’)。类似地，与仅OVA相比，基于现有技术的构建体mIi(D+ER)-OVA、mIi(D-17)-OVA和mIi(50-215)-OVA提供了平均更高的应答。mIi(全长)-OVA和包含mIi片段的类似构建体之间的比较揭示，在测试的mIi片段中，mIi(1-75)序列是维持全长mIi的完全佐剂效应的最小序列。事实上，mIi(1-75)显示甚至比全长mIi更高的平均免疫原性增强水平。这些是令人惊讶的观察，因为mIi(1-75)不仅缺乏三聚化区域(这对于其作为MHC-II伴侣蛋白和MIF信号传导受体的作用是重要的)，而且还缺乏先前被认为对Ii的佐剂作用重要的KEY和CLIP区域。相反，进一步截短至mIi(1-70)片段导致免疫原性的显著损失。关于mIi(1-105)-OVA未显示数据。mIi(1-105)-OVA提供了与mIi(全长)-OVA类似的应答。
实施例2：用与OVA融合的鼠Ii1-50、Ii1-75、Ii1-80、Ii50-215或鼠Ii(全长)的抗原呈递的体外测试
还在对MHC-I抗原呈递的影响方面在体外评估截短的mIi的活性。体外测试由以下组成：用包含OVA和经由HA标签与OVA融合的单个mIi片段(mIi(1-50)-OVA、mIi(1-75)-OVA、mIi(1-80)-OVA、mIi(50-215)-OVA和mIi(全长)-OVA)(取向与实施例1中概述的相同)的Ad5感染骨髓来源的树突细胞(BMDC)。
感染后24小时，细胞用识别与MHC-I的H-2Kb结合的卵清蛋白衍生肽SIINFEKL(SEQ ID NO:118)的荧光单克隆抗体染色，并通过测量用Ad5-mIi(全长)-OVA和Ad5-mIi(截短的)-OVA感染后，相对于Ad5-OVA对照的CD11+/SIINFEKL+细胞的%来确定抗原呈递的水平，如图4中所示。所述抗体与和I类MHC的H-2Kb结合的OVA衍生的肽SIINFEKL特异性反应，但不与未结合的H-2Kb或与无关肽结合的H-2Kb特异性反应。因此，图4举例说明与OVA相比，mIi(全长)-OVA或变体的OVA呈递的倍数差异。通过双尾不成对参数Student氏t-检验确定统计学显著性(* p<0,05，** p<0,01，*** p<0,001，**** p<0,001)。发现mIi(1-75)和mIi(50-215)两者均将抗原呈递增加至与全长mIi的水平(在图4中标记为“mIi-OVA”)相似的水平。相反，mIi(1-50)导致较低水平的抗原呈递，类似于单独的OVA的水平(在图5中标记为“OVA”)。关于mIi(1-80)-OVA未显示数据。mIi(1-80)-OVA提供了与mIi(全长)-OVA类似的应答。
实施例3：与OVA融合的鼠Ii1-75或Ii50-75的制备、体内免疫原性和抗原呈递的体外测试
产生包含OVA的Ad5构建体，其中OVA经由HA标签与鼠p31 Ii序列的片段的C-末端融合。Ad5构建体是E1E3E4缺失的，其中重新插入Ad5 E4ORF6，并且包括HCMV启动子的变体和牛生长激素多腺苷酸化信号(BGHpolyA)。产生包含mIi(1-75)-OVA和mIi(50-75)-OVA的Ad5构建体(参见图5中的示意图)。
通过用106个vp的单次肌肉内剂量，注射雌性C57BL/6小鼠来评估不同构建体的免疫效力。脾细胞在注射后两周收集，并通过IFN-γ ELISpot使用SEQ ID NO:118(SIINFEKL，先前在C57BL/6小鼠中鉴定和定位)的OVA 257-264显性CD8肽作为抗原进行测试。结果显示于图6中，其中应答表示为产生IFN-γ的T细胞数目/百万个脾细胞。方框代表数据的分布(第一和第三四分位数)，方框内的线是中值，并且每个方框的两个须线是数据的最小值和最大值。
mIi全长序列和mIi1-75与OVA抗原的连接提供了与未连接的Ad5-OVA相比更高的应答，证实了实施例1的发现。这些数据显示mIi(50-75)能够将免疫应答增加至与全长mIi和mIi(1-75)的水平相似的水平。mIi(1-75)显示最高的平均应答水平。
还在对MHC-I抗原呈递的影响方面在体外评估截短的mIi 50-75的活性，如之前在实施例2中所述。骨髓来源的树突细胞(BMDC)用包含OVA和经由HA标签融合至OVA的单个mIi片段(mIi(1-75)-OVA和mIi(50-75)-OVA)的Ad5感染。感染后24小时，细胞用识别与MHC-I的H-2Kb结合的卵清蛋白衍生肽SIINFEKL (SEQ ID NO:118)的荧光单克隆抗体染色，并且抗原呈递水平在图7中显示为相对于Ad5-OVA对照的CD11+/SIINFEKL+的%。
因此，图7说明与OVA相比，mIi(1-75)-OVA或mIi(50-75)-OVA变体的OVA呈递的倍数差异。通过双尾不成对Student氏t-检验确定统计学显著性(* p<0,05, **** p<0,0001)。发现mIi(1-75)和mIi(50-75)相对于单独的OVA (标记为“OVA”)的抗原呈递增加抗原呈递。
在本实施例中通过体内和体外测试进行的关于mIi(50-75)的观察是令人惊讶的，因为mIi(50-75)(其对应于hIi(67-92))是不变链的特别短的片段，不仅缺乏Ii的三聚化区域，KEY和CLIP区域(如对于mIi(1-75)的情况)，而且还缺乏N-末端至残基50的所有残基，其包括内溶酶体分选序列(“ESS”)。
实施例4：一系列的与MAGE A3融合的人Ii片段的制备和体内免疫原性测试
产生PanAd3构建体，其包含单独的黑色素瘤相关抗原3(“MAGE A3”，SEQ ID NO:4)并且包含hIi(全长)-MAGE A3、hIi(1-97)-MAGE A3和hIi(17-97)-MAGE A3的融合体，其中MAGEA3与全长人p35 Ii (hIi)或其片段的C-末端融合。PanAd3构建体是E1E4缺失的，其中插入Ad5 E4ORF6。hIi(17-97)是hIi的区域，其类似于mIi(1-80)，而hIi(1-97)由于翻译的可变起始而在N-末端进一步包含额外的16个残基(ER保留序列) (参见图1和12)。
在以106个vp的剂量单次肌肉内免疫之后，在CB6F1小鼠中评估这些构建体的免疫原性。免疫之后两周收集脾细胞，并通过IFN-γ ELISpot使用MAGE A3显性CD8肽作为抗原进行测试。结果显示于图8中，其中用包含单独的MAGE A3的PanAd3免疫被标记为“MAGE”，用包含与MAGE A3融合的全长hIi的PanAd3免疫被标记为'hIi MAGE'，并且用包含与MAGE A3融合的hIi片段的PanAd3免疫被标记为“1-97 MAGE和17-97 MAGE”。应答表示为产生IFN-γ的T细胞的数目/百万个脾细胞。
从图8可以看出，hIi(1-97)(其含有ER保留序列)提供了比全长hIi的效应更低的佐剂效应，但hIi(17-97)诱导了与全长hIi相当的T细胞应答。关于hIi(17-97)的发现在独立的重复实验中进一步证实(未显示)。
实施例5：一系列的与HCV-NS融合的人Ii片段的制备和体内免疫原性测试
产生ChAd3构建体，其包含单独的丙型肝炎病毒非结构蛋白(“HCV-NS”，SEQ ID NO:117)并且包含hIi(全长)-HCV-NS、hIi(1-97)-HCV-NS和hIi(17-97)-HCV-NS的融合体，其中HCV-NS与全长人p35 Ii(hIi)或其片段的C-末端融合。ChAd3构建体是E1E3E4缺失的，其中插入Ad5 E4ORF6。
在以108个vp的剂量单次肌肉内免疫之后，在远交CD1小鼠中评估这些构建体的免疫原性。免疫之后两周收集脾细胞，并通过IFN-γ ELISpot使用覆盖整个NS序列的肽合并物作为抗原进行测试(图9)。
从图9可以看出，hIi(全长)-HCV-NS、hIi(1-97)-HCV-NS和hIi(17-97)-HCV-NS都产生比HCV-NS更高的平均应答。
实施例6：经由泛素信号将Ii-抗原靶向至蛋白酶体
为了表征负责增强抗原呈递的Ii的分子机制/途径，研究了在蛋白酶体抑制剂MG-132存在的情况下Ii连接对抗原加工的影响。通过蛋白酶体的蛋白降解(I类抗原加工的关键步骤)，是一种高度特异性的过程，其需要将一个或多个泛素分子共价连接至待降解的蛋白作为关键事件。
为了解决泛素化是否促进经由蛋白酶体的 Ii-OVA降解，实施两个实验。在第一个实验中，HeLa细胞用表达泛素的质粒瞬时转染，且然后在10 uM MG-132不存在或存在的情况下用50 MOI的Ad5-mIi(全长)-OVA、Ad5-mIi(1-75)-OVA和Ad5-mIi(1-50)-OVA感染。细胞提取物用抗Lys48抗体免疫沉淀，随后用抗HA标签抗体进行western印迹。对应于未感染细胞的模拟样品用作对照。在第二个实验中，实施相同的程序，但使用Ad5-OVA、Ad5-mIi(全长)-OVA、Ad5-mIi(1-75)-OVA和Ad5-mIi(50-75)-OVA。
第一个实验的结果显示于图10中，且第二个实验的结果显示于图11中。结果揭示，对于Ad5-mIi(全长)-OVA、Ad5-mIi(1-75)-OVA和Ad5-mIi(50-75)-OVA，蛋白酶体抑制后的多泛素化的Ii-OVA的存在和积累(图11)。因此，该抗原与全长mIi、mIi(1-75)和mIi(50-75)的连接引起抗原的多泛素化，其可通过阻断蛋白酶体来检测。对于mIi(1-50)没有发生这种多泛素化现象(图10)。
这些结果表明，在全长mIi、mIi(1-75)和mIi(50-75)存在的情况下，通过蛋白酶体更有效地处理抗原，产生更大量的抗原肽，其通过I类MHC熟练地呈递在树突状细胞上。这些相同的片段在增强体内抗原免疫原性中高度有效。然而，用mIi(1-50)片段(即在增强体内抗原免疫原性中无效的Ii片段)未观察到该效应。
实施例7：与OVA融合的较小鼠Ii片段的制备和体内免疫原性测试
在实施例3中确定mIi(50-75)片段(其对应于hIi(67-92))能够将免疫应答增加至与全长mIi和mIi(1-75)的水平相似的水平。在本实施例中，产生编码与卵清蛋白抗原(OVA)融合的鼠p31 Ii (mIi)的进一步修剪片段的Ad5载体，并在单次免疫之后在小鼠中测试它们的免疫原性。
产生包含以下的Ad5构建体：mIi(28-75)-OVA、mIi(55-75)-OVA和mIi(60-75)-OVA。包括mIi(28-75)-OVA构建体以研究包括跨膜结构域(TM)的效果。将这些新构建体与包含单独的OVA、mIi(全长)-OVA和mIi(50-75)-OVA的Ad5构建体进行比较(图15，单独的OVA和mIi(全长)-OVA未显示)。在本实施例中使用的Ad5构建体如实施例3中所述(E1E3E4缺失的，其中重新插入Ad5 E4ORF6，并且包括HCMV启动子的变体和牛生长激素多腺苷酸化信号(BGHpolyA))。
在单次肌肉内剂量的106个病毒颗粒(vp)之后在C57BL/6小鼠中评估不同构建体的免疫效力。脾细胞在注射后两周收集，并通过IFN-γ ELISpot使用OVA 257-264显性CD8肽SIINFEKL (SEQ ID NO:118，先前在C57BL/6小鼠中鉴定和定位)作为抗原进行测试。中值ELISpot应答显示于表2中。
表2：中值ELISpot应答
| OVA | mIi | mIi(50-75) | mIi(28-75) | mIi(55-75) | mIi(60-75) | |
| 中值 | 451 | 1379 | 1604 | 1938 | 1392 | 1898 |
发现这些mIi片段(28-75、55-75和60-75)与OVA抗原的连接提供了与未连接的OVA载体相比显著(p<0.05)更高的应答。具体而言，值得注意的是，甚至16个氨基酸长的片段mIi-60-75看起来也能够提供与mIi(全长)或mIi(50-75)相当或甚至更高的佐剂效应(图16)。方框代表数据的分布(第一和第三四分位数)，方框内的线是中值，并且每个方框的两个须线是数据的最小值和最大值。
mIi55-75对应于hIi(72-92)，且mIi60-75对应于hIi(77-92)。
还如实施例1和2中所讨论，鉴于这些不变链的短区域不含已知的功能结构域，由mIi(55-75)和mIi(60-75)提供的免疫原性增强是特别令人惊讶的(参见图15)。
实施例8：与OVA融合的突变鼠Ii和鼠Ii片段的制备和体内免疫原性测试
产生包含以下突变的鼠Ii和鼠Ii片段的Ad5构建体：mIi(全长)LLLmut-OVA、mIi(全长)K63R-OVA和mIi(1-75)K63R-OVA。
在mIi(全长)LLLmut (SEQ ID NO:135)中，全长p31 mIi的位置42、43和44的三个氨基酸LLL各自被突变为A，而在mIi(全长)K63R (SEQ ID NO:136)和mIi(1-75)K63R (SEQID NO:137)的每一个中，全长p31 mIi的位置63的K被突变为R。将这些新构建体与包含单独的OVA、mIi(全长)-OVA和mIi(1-75)-OVA的Ad5构建体进行比较。在本实施例中使用的Ad5构建体如实施例3中所述(E1E3E4缺失的，其中重新插入Ad5 E4ORF6，并且包括HCMV启动子的变体和牛生长激素多腺苷酸化信号(BGHpolyA))。
在单次肌肉内剂量的106个病毒颗粒之后在C57BL/6小鼠中评估不同Ad5-mIi突变的构建体的免疫效力。脾细胞在注射后两周收集，并通过IFN-γ ELISpot使用OVA 257-264显性CD8肽SIINFEKL (SEQ ID NO:118，先前在C57BL/6小鼠中鉴定和定位)作为抗原进行测试。
结果显示于图17中。方框代表数据的分布(第一和第三四分位数)，方框内的线是中值，并且每个方框的两个须线是数据的最小值和最大值。发现63K至63R的突变基本上不影响全长Ii和1-75 Ii片段的佐剂活性。类似地，没有看到由于位置42、43和44的LLL突变为AAA的影响。
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Claims (154)
1.包含多肽的融合蛋白，其中所述多肽由与抗原序列可操作连接的不变链的片段组成，且其中所述不变链的片段由以下组成：
(a) SEQ ID NO:1的残基17-97的部分，其中所述部分包含来自SEQ ID NO:1的残基77-92的至少5个连续残基；
(b) 80个或更少的残基且包含至少5个连续残基的序列，其中所述序列与来自SEQ IDNO:1的残基77-92的至少5个连续残基共有至少80%同一性；
(c) SEQ ID NO:1的残基1-97；
(d) 91至103个残基且与SEQ ID NO:1的残基1-97共有至少95%同一性；
(e) SEQ ID NO:1的残基17-97；
(f) 76至84个残基且与SEQ ID NO:1的残基17-97共有至少95%同一性；
(g) SEQ ID NO:1的残基1-92；
(h) 88至96个残基且与SEQ ID NO:1的残基1-92共有至少95%同一性；
(i) SEQ ID NO:1的残基17-92；或
(j) 71至79个残基且与SEQ ID NO:1的残基17-92共有至少95%同一性。
2.编码包含多肽的融合蛋白的多核苷酸，其中所述多肽由与抗原序列可操作连接的不变链的片段组成，且其中所述不变链的片段由以下组成：
(a) SEQ ID NO:1的残基17-97的部分，其中所述部分包含来自SEQ ID NO:1的残基77-92的至少5个连续残基；
(b) 80个或更少的残基且包含至少5个连续残基的序列，其中所述序列与来自SEQ IDNO:1的残基77-92的至少5个连续残基共有至少80%同一性；
(c) SEQ ID NO:1的残基1-97；
(d) 91至103个残基且与SEQ ID NO:1的残基1-97共有至少95%同一性；
(e) SEQ ID NO:1的残基17-97；
(f) 76至84个残基且与SEQ ID NO:1的残基17-97共有至少95%同一性；
(g) SEQ ID NO:1的残基1-92；
(h) 88至96个残基且与SEQ ID NO:1的残基1-92共有至少95%同一性；
(i) SEQ ID NO:1的残基17-92；或
(j) 71至79个残基且与SEQ ID NO:1的残基17-92共有至少95%同一性。
3.包含多核苷酸的病毒载体，所述多核苷酸编码包含多肽的融合蛋白，其中所述多肽由与抗原序列可操作连接的不变链的片段组成，且其中所述不变链的片段由以下组成：
(a) SEQ ID NO:1的残基17-97的部分，其中所述部分包含来自SEQ ID NO:1的残基77-92的至少5个连续残基；
(b) 80个或更少的残基且包含至少5个连续残基的序列，其中所述序列与来自SEQ IDNO:1的残基77-92的至少5个连续残基共有至少80%同一性；
(c) SEQ ID NO:1的残基1-97；
(d) 91至103个残基且与SEQ ID NO:1的残基1-97共有至少95%同一性；
(e) SEQ ID NO:1的残基17-97；
(f) 76至84个残基且与SEQ ID NO:1的残基17-97共有至少95%同一性；
(g) SEQ ID NO:1的残基1-92；
(h) 88至96个残基且与SEQ ID NO:1的残基1-92共有至少95%同一性；
(i) SEQ ID NO:1的残基17-92；或
(j) 71至79个残基且与SEQ ID NO:1的残基17-92共有至少95%同一性。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由SEQ ID NO:1的残基17-97的部分组成，其中所述部分包含来自SEQ ID NO:1的残基77-92的至少5个连续残基。
5.根据权利要求4所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述部分包含来自SEQID NO:1的残基77-92的至少8个连续残基。
6.根据权利要求5所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述部分包含来自SEQID NO:1的残基77-92的至少12个连续残基。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由80个或更少的残基组成且包含至少5个连续残基的序列，其中所述序列与来自SEQ ID NO:1的残基77-92的至少5个连续残基共有至少80%同一性。
8.根据权利要求7所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由80个或更少的残基组成且包含至少5个连续残基的序列，其中所述序列包含来自SEQ ID NO:1的残基77-92的至少5个连续残基。
9.根据权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段包含至少7个连续残基，其中至少7个连续残基与来自SEQ ID NO:1的残基77-92的至少7个连续残基共有至少80%同一性。
10.根据权利要求9所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段包含至少7个连续残基，其中至少7个连续残基与来自SEQ ID NO:1的残基77-92的至少7个连续残基共有至少90%同一性。
11.根据权利要求10所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段包含至少7个连续残基，其中至少7个连续残基包含来自SEQ ID NO:1的残基77-92的至少7个连续残基。
12.根据权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段包含至少9个连续残基，其中至少9个连续残基与来自SEQ ID NO:1的残基77-92的至少9个连续残基共有至少80%同一性。
13.根据权利要求12所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段包含至少9个连续残基，其中至少9个连续残基与来自SEQ ID NO:1的残基77-92的至少9个连续残基共有至少90%同一性。
14.根据权利要求13所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段包含至少9个连续残基，其中至少9个连续残基包含来自SEQ ID NO:1的残基77-92的至少9个连续残基。
15.根据权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述多肽由与抗原序列可操作连接的不变链的片段组成，且其中所述不变链的片段由以下组成：
(a) SEQ ID NO:1的残基17-97的部分，其中所述部分包含来自SEQ ID NO:1的残基67-92的至少10个连续残基；
(b) 80个或更少的残基且包含至少10个连续残基的序列，其中所述序列与来自SEQ IDNO:1的残基67-92的至少10个连续残基共有至少80%同一性；
(c) SEQ ID NO:1的残基1-97；
(d) 91至103个残基且与SEQ ID NO:1的残基1-97共有至少95%同一性；
(e) SEQ ID NO:1的残基17-97；
(f) 76至84个残基且与SEQ ID NO:1的残基17-97共有至少95%同一性；
(g) SEQ ID NO:1的残基1-92；
(h) 88至96个残基且与SEQ ID NO:1的残基1-92共有至少95%同一性；
(i) SEQ ID NO:1的残基17-92；或
(j) 71至79个残基且与SEQ ID NO:1的残基17-92共有至少95%同一性。
16.根据权利要求15所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由SEQ ID NO:1的残基17-97的部分组成，其中所述部分包含来自SEQ ID NO:1的残基67-92的至少10个连续残基。
17.根据权利要求16所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述部分包含来自SEQ ID NO:1的残基67-92的至少15个连续残基。
18.根据权利要求17所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述部分包含来自SEQ ID NO:1的残基67-92的至少20个连续残基。
19.根据权利要求18所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述部分包含SEQ IDNO:1的残基67-92。
20.根据权利要求8所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述部分由SEQ IDNO:1的残基67-92组成。
21.根据权利要求15所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由80个或更少的残基组成且包含至少10个连续残基的序列，其中所述序列与来自SEQ ID NO:1的残基67-92的至少10个连续残基共有至少80%同一性。
22.根据权利要求21所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由80个或更少的残基组成且包含至少10个连续残基的序列，其中所述序列与来自SEQ ID NO:1的残基67-92的至少10个连续残基共有至少90%同一性。
23.根据权利要求22所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由80个或更少的残基组成且包含至少10个连续残基的序列，其中所述序列包含来自SEQ IDNO:1的残基67-92的至少10个连续残基。
24.根据权利要求23所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段包含SEQ ID NO:1的残基67-76、68-77、69-78、70-79、71-80、72-81、73-82、74-83、75-84、76-85、77-86、78-87、79-88、80-89、81-90、82-91或83-92。
25.根据权利要求24所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由SEQ ID NO:1的残基67-76、68-77、69-78、70-79、71-80、72-81、73-82、74-83、75-84、76-85、77-86、78-87、79-88、80-89、81-90、82-91或83-92组成。
26.根据权利要求15所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段包含至少15个连续残基，其中至少15个连续残基与来自SEQ ID NO:1的残基67-92的至少15个连续残基共有至少80%同一性。
27.根据权利要求26所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段包含至少15个连续残基，其中至少15个连续残基与来自SEQ ID NO:1的残基67-92的至少15个连续残基共有至少90%同一性。
28.根据权利要求27所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段包含至少15个连续残基，其中至少15个连续残基包含来自SEQ ID NO:1的残基67-92的至少15个连续残基。
29.根据权利要求28所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段包含SEQ ID NO:1的残基67-81、68-82、69-83、70-84、71-85、72-86、73-87、74-88、75-89、76-90、77-91或78-92。
30.根据权利要求29所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由SEQ ID NO:1的残基67-81、68-82、69-83、70-84、71-85、72-86、73-87、74-88、75-89、76-90、77-91或78-92组成。
31.根据权利要求28所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段包含SEQ ID NO:1的残基77-92。
32.根据权利要求31所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由SEQ ID NO:1的残基77-92组成。
33.根据权利要求15所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段包含至少20个连续残基，其中至少20个连续残基与来自SEQ ID NO:1的残基67-92的至少20个连续残基共有至少80%同一性。
34.根据权利要求33所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段包含至少20个连续残基，其中至少20个连续残基与来自SEQ ID NO:1的残基67-92的至少20个连续残基共有至少90%同一性。
35.根据权利要求34所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段包含至少20个连续残基，其中至少20个连续残基包含来自SEQ ID NO:1的残基67-92的至少20个连续残基。
36.根据权利要求35所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段包含SEQ ID NO:1的残基67-86、68-87、69-88、70-89、71-90、72-91或73-92。
37.根据权利要求36所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由SEQ ID NO:1的残基67-86、68-87、69-88、70-89、71-90、72-91或73-92组成。
38.根据权利要求35所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段包含SEQ ID NO:1的残基72-92。
39.根据权利要求38所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由SEQ ID NO:1的残基72-92组成。
40.根据权利要求15所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段包含至少25个连续残基，其中至少25个连续残基与来自SEQ ID NO:1的残基67-92的至少25个连续残基共有至少80%同一性。
41.根据权利要求40所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段包含至少25个连续残基，其中至少25个连续残基与来自SEQ ID NO:1的残基67-92的至少25个连续残基共有至少90%同一性。
42.根据权利要求41所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，不变链的片段包含至少25个连续残基，其中至少25个连续残基包含来自SEQ ID NO:1的残基67-92的至少25个连续残基。
43.根据权利要求42所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段包含SEQ ID NO:1的残基67-91或68-92。
44.根据权利要求43所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由SEQ ID NO:1的残基67-91或68-92组成。
45.根据权利要求15所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由SEQ ID NO:1的残基1-97组成。
46.根据权利要求15所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由91至103个残基组成，且与SEQ ID NO:1的残基1-97共有至少95%同一性。
47.根据权利要求46所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由93至101个残基组成。
48.根据权利要求47所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由95至99个残基组成。
49.根据权利要求48所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由97个残基组成。
50.根据权利要求46至49中任一项所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段与SEQ ID NO:1的残基1-97共有至少97%同一性。
51.根据权利要求15所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由SEQ ID NO:1的残基1-97或SEQ ID NO:5、9、11、13和15-52的对应于SEQ ID NO:1的残基1-97的残基组成。
52.根据权利要求15所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由SEQ ID NO:1的残基17-97组成。
53.根据权利要求15所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由76至84个残基组成，且与SEQ ID NO:1的残基17-97共有至少95%同一性。
54.根据权利要求53所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由78至82个残基组成。
55.根据权利要求54所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由80至82个残基组成。
56.根据权利要求55所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由81个残基组成。
57.根据权利要求53至56中任一项所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段与SEQ ID NO:1的残基17-97共有至少97%同一性。
58.根据权利要求15所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由SEQ ID NO:53-84中的任何一个组成。
59.根据权利要求15所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由SEQ ID NO:1的残基1-92组成。
60.根据权利要求15所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由88至96个残基组成，且与SEQ ID NO:1的残基1-92共有至少95%同一性。
61.根据权利要求60所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由90至95个残基组成。
62.根据权利要求61所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由91至93个残基组成。
63.根据权利要求62所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由92个残基组成。
64.根据权利要求60至63中任一项所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段与SEQ ID NO:1的残基1-92共有至少97%同一性。
65.根据权利要求15所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由SEQ ID NO:1的残基1-92或SEQ ID NO:5、9、11、13和15-52的对应于SEQ ID NO:1的残基1-92的残基组成。
66.根据权利要求15所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由SEQ ID NO:1的残基17-92组成。
67.根据权利要求15所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由71至79个残基组成，且与SEQ ID NO:1的残基17-92共有至少95%同一性。
68.根据权利要求67所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由74至78个残基组成。
69.根据权利要求68所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由75至77个残基组成。
70.根据权利要求69所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由76个残基组成。
71.根据权利要求67至70中任一项所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段与SEQ ID NO:1的残基17-92共有至少97%同一性。
72.根据权利要求15所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段包含SEQ ID NO:53-84中的任何一个。
73.根据权利要求72所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段包含SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54。
74.根据权利要求73所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段包含SEQ ID NO:53。
75.根据权利要求72所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由SEQ ID NO:53-84中的任何一个组成。
76.根据权利要求75所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54组成。
77.根据权利要求76所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由SEQ ID NO:53组成。
78.根据权利要求15所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段包含选自SEQ ID NO:85-116中的任何一个的序列。
79.根据权利要求78所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段包含选自SEQ ID NO:85或SEQ ID NO:86的序列。
80.根据权利要求78所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由选自SEQ ID NO:85-116中的任何一个的序列组成。
81.根据权利要求80所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由选自SEQ ID NO:85或SEQ ID NO:86的序列组成。
82.根据权利要求1至81中任一项所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由少于30个残基组成。
83.根据权利要求82所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由少于25个残基组成。
84.根据权利要求83所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由少于20个残基组成。
85.根据权利要求84所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由少于15个残基组成。
86.根据权利要求1至81中任一项所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由至少25个残基组成。
87.根据权利要求86所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由至少35个残基组成。
88.根据权利要求87所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由至少45个残基组成。
89.根据权利要求88所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段由至少55个残基组成。
90.根据权利要求1至89中任一项所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段源自人不变链。
91.根据权利要求90所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段源自人p33、p35、p41、p43或c同种型的不变链。
92.根据权利要求1至89中任一项所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段源自小鼠不变链。
93.根据权利要求92所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段源自小鼠p31或p41同种型的不变链。
94.根据权利要求1至93中任一项所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段与所述抗原序列直接连接。
95.根据权利要求1至93中任一项所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段与所述抗原序列间接连接。
96.根据权利要求95所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段通过肽序列与抗原序列间接连接。
97.根据权利要求96所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述肽序列不包含SEQ ID NO:1的残基98-150的连续序列。
98.根据权利要求97所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述肽序列不包含SEQ ID NO:1的残基98-125的连续序列。
99.根据权利要求98所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述肽序列不包含SEQ ID NO:1的残基98-110的连续序列。
100.根据权利要求99所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述肽序列不包含SEQ ID NO:1的残基98-105的连续序列。
101.根据权利要求100所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述肽序列不包含SEQ ID NO:1的残基98-100的连续序列。
102.根据权利要求96所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述肽序列不包含来自SEQ ID NO:1的残基98-232的多于3个连续残基的连续序列。
103.根据权利要求102所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述肽序列不包含来自SEQ ID NO:1的残基98-232的多于5个连续残基的连续序列。
104.根据权利要求103所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述肽序列不包含来自SEQ ID NO:1的残基98-232的多于7个连续残基的连续序列。
105.根据权利要求104所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述肽序列不包含来自SEQ ID NO:1的残基98-232的多于10个连续残基的连续序列。
106.根据权利要求96所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述肽序列不包含SEQ ID NO:1的残基93-150的连续序列。
107.根据权利要求106所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述肽序列不包含SEQ ID NO:1的残基93-125的连续序列。
108.根据权利要求107所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述肽序列不包含SEQ ID NO:1的残基93-110的连续序列。
109.根据权利要求108所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述肽序列不包含SEQ ID NO:1的残基93-105的连续序列。
110.根据权利要求109所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述肽序列不包含SEQ ID NO:1的残基93-100的连续序列。
111.根据权利要求96所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述肽序列不包含来自SEQ ID NO:1的残基93-232的多于3个连续残基的连续序列。
112.根据权利要求111所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述肽序列不包含来自SEQ ID NO:1的残基93-232的多于5个连续残基的连续序列。
113.根据权利要求112所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述肽序列不包含来自SEQ ID NO:1的残基93-232的多于7个连续残基的连续序列。
114.根据权利要求114所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述肽序列不包含来自SEQ ID NO:1的残基93-232的多于10个连续残基的连续序列。
115.根据权利要求96至114中任一项所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述肽序列由50个或更少的残基组成。
116.根据权利要求115所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述肽序列由30个或更少的残基组成。
117.根据权利要求116所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述肽序列由10个或更少的残基组成。
118.根据权利要求117所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述肽序列由5个或更少的残基组成。
119.根据权利要求96至118中任一项所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述肽序列由甘氨酸和丝氨酸残基组成。
120.根据权利要求1至119中任一项所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段通过不变链的片段的N-末端与所述抗原序列连接。
121.根据权利要求1至119中任一项所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段通过不变链的片段的C-末端与所述抗原序列连接。
122.根据权利要求1至119中任一项所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段在所述融合蛋白的N-末端。
123.根据权利要求1至119中任一项所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段在所述融合蛋白的C-末端。
124.根据权利要求1至123中任一项所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述融合蛋白包含多个抗原序列。
125.根据权利要求1至124中任一项所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段不包含比SEQ ID NO:1的残基1-97更大数目的SEQ ID NO:1的连续残基。
126.根据权利要求1至124中任一项所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段不包含比SEQ ID NO:1的残基17-97更大数目的SEQ ID NO:1的连续残基。
127.根据权利要求1至124中任一项所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段不包含比SEQ ID NO:1的残基1-92更大数目的SEQ ID NO:1的连续残基。
128.根据权利要求1至124中任一项所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段不包含比SEQ ID NO:1的残基17-92更大数目的SEQ ID NO:1的连续残基。
129.根据权利要求1至124中任一项所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述不变链的片段不包含比SEQ ID NO:1的残基67-92更大数目的SEQ ID NO:1的连续残基。
130.根据权利要求1至129中任一项所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述融合蛋白不包含全长不变链。
131.根据权利要求1至130中任一项所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述抗原序列源自病原体。
132.根据权利要求131所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述抗原序列选自由MAGE抗原、OVA抗原和HCV-NS抗原组成的抗原中的一种或多种。
133.根据权利要求132所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述抗原序列包含选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:117组成的列表的序列或由其组成。
134.根据权利要求131所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述病原体选自病毒、细菌、原生动物和多细胞寄生虫。
135.根据权利要求1至130中任一项所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体，其中所述抗原序列源自癌细胞。
136.根据权利要求1至135中任一项所述的病毒载体，其中所述病毒载体是腺病毒。
137.根据权利要求136所述的病毒载体，其中所述腺病毒是人腺病毒。
138.根据权利要求137所述的病毒载体，其中所述腺病毒是选自Ad1、Ad2、Ad4、Ad5、Ad6、Ad11、Ad19、Ad24、Ad34和Ad35的腺病毒。
139.根据权利要求136所述的病毒载体，其中所述腺病毒是非人灵长类动物腺病毒。
140.根据权利要求139所述的病毒载体，其中所述腺病毒是选自ChAd3、ChAd63、ChAd83、ChAd155、PanAd1、PanAd2、PanAd3、Pan 5、Pan 6、Pan 7和Pan9的腺病毒。
141.根据权利要求136所述的病毒载体，其中所述腺病毒包含六邻体、五邻体和纤维蛋白，其中所述六邻体、五邻体和纤维蛋白与SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124或SEQ ID NO:125共有至少95%同一性。
142.根据权利要求136所述的病毒载体，其中所述腺病毒包含六邻体和纤维蛋白，其中所述六邻体和纤维蛋白两者分别与SEQ ID NO:126和SEQ ID NO:127共有至少95%同一性。
143.根据权利要求136所述的病毒载体，其中所述腺病毒包含六邻体和纤维蛋白，其中所述六邻体和纤维蛋白两者分别与SEQ ID NO:128和SEQ ID NO:129共有至少95%同一性。
144.根据权利要求136所述的病毒载体，其中所述腺病毒包含六邻体和纤维蛋白，其中所述六邻体和纤维蛋白两者分别与SEQ ID NO:130和SEQ ID NO:131共有至少95%同一性。
145.根据权利要求136所述的病毒载体，其中所述腺病毒包含六邻体、五邻体和纤维蛋白，其中所述六邻体、五邻体和纤维蛋白分别与SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133和SEQ IDNO:134共有至少95%同一性。
146.根据权利要求1至135中任一项所述的病毒载体，其中所述病毒载体是痘病毒。
147.根据权利要求146所述的病毒载体，其中所述痘病毒选自正痘病毒、副痘病毒、亚塔痘病毒、禽痘病毒和软疣痘病毒载体中的一种或多种。
148.根据权利要求146所述的病毒载体，其中所述痘病毒是MVA。
149.药物组合物，其包含根据权利要求1至148中任一项所述的融合蛋白、多核苷酸或病毒载体和药学上可接受的赋形剂。
150.根据权利要求149所述的药物组合物，其进一步包含佐剂。
151.根据权利要求1至150中任一项所述的融合蛋白、多核苷酸、病毒载体或药物组合物，其用作药物。
152.根据权利要求151所述的融合蛋白、多核苷酸、病毒载体或药物组合物，其用于治疗或预防乙型肝炎病毒感染或丙型肝炎病毒感染。
153.根据权利要求1至150中任一项所述的融合蛋白、多核苷酸、病毒载体或药物组合物在制备用于预防或治疗乙型肝炎病毒感染或丙型肝炎病毒感染的药物中的用途。
154.治疗或预防乙型肝炎病毒感染或丙型肝炎病毒感染的方法，其包括向有此需要的人施用有效量的根据权利要求1至150中任一项所述的融合蛋白、多核苷酸、病毒载体或药物组合物。
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