CN1518457A - 诱导细胞毒性免疫应答的方法和用于该方法的重组猿猴腺病毒组合物 - Google Patents

诱导细胞毒性免疫应答的方法和用于该方法的重组猿猴腺病毒组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN1518457A
CN1518457A CNA028124383A CN02812438A CN1518457A CN 1518457 A CN1518457 A CN 1518457A CN A028124383 A CNA028124383 A CN A028124383A CN 02812438 A CN02812438 A CN 02812438A CN 1518457 A CN1518457 A CN 1518457A
Authority
CN
China
Prior art keywords
virus
gly
adenovirus
thr
ala
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA028124383A
Other languages
English (en)
Inventor
H��C��J�����ض�
H·C·J·埃特尔
���˹���Ѷ���
J·M·威尔逊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Pennsylvania Penn
Wistar Institute of Anatomy and Biology
Original Assignee
University of Pennsylvania Penn
Wistar Institute of Anatomy and Biology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Pennsylvania Penn, Wistar Institute of Anatomy and Biology filed Critical University of Pennsylvania Penn
Publication of CN1518457A publication Critical patent/CN1518457A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/235—Adenoviridae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10361—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2710/10362—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
    • C12N2760/20122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
    • C12N2760/20134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/55—Vector systems having a special element relevant for transcription from bacteria
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种诱导抗所选分子的CD8+T细胞应答的方法，该方法是靠重组猿猴腺病毒来输送该分子。本发明还提供了诱导α干扰素和β干扰素的方法，该方法是将重组猿猴腺病毒输送给对象。本发明的方法和组合物特别适合用于预防和治疗人免疫缺陷病毒、人乳头瘤病毒感染和癌症治疗。

Description

诱导细胞毒性免疫应答的方法和用于该方法的重组猿猴腺病毒组合物
本项工作得到国家卫生研究院授予的P30 DK47757-08号和P01 HL 59407-02以及NIAID授予的AI 49766-01号基金的支持。美国政府享有本发明部分权利。
发明背景
现已测试了人血清型5型重组腺病毒作为衍生自病毒、寄生虫或肿瘤细胞的各种抗原的疫苗载体。结果是鼓舞人心的，因为E1缺失的腺病毒重组体引发了针对转基因产物的免疫反应。人血清型5型(Ad5)腺病毒是一种遍在的感冒病毒，它感染了生命第一年内的大多数人。发明者已经发现，已存在的对常见人血清型的免疫力降低了基于病毒同源血清型的腺病毒重组疫苗的效力。在一些情况下，这种效力降低可通过输送更高剂量的人重组腺病毒来克服。然而，更高的剂量可能伴有其它不希望的副作用。
因此，需要有一种用来诱导产生针对所选分子的免疫反应(免疫应答)的组合物，从而避免目前的输送方法所伴有的问题。
发明概述
本发明提供了一种方法，该方法通过靠重组猿猴腺病毒来向宿主输送分子，从而优先诱导针对异源分子的细胞毒性免疫反应。本发明者出人意料地发现，本发明所用的重组猿猴腺病毒呈递免疫原的方式与用相应的人5型病毒来输送免疫原相比，诱导出了明显更强效的CD8+T细胞应答。另外，本发明者发现，重组黑猩猩腺病毒诱导出的α干扰素和β干扰素水平比人腺病毒高约5倍。
因此，本发明一方面提供了一种方法，该方法通过向对象输送携带所述分子的重组猿猴腺病毒，从而在对象中优先诱导出针对异源分子的CD8+T细胞应答。在一个理想的方案中，重组猿猴腺病毒是重组黑猩猩腺病毒株。
本发明另一方面提供了一种在对象中诱导出α干扰素和/或β干扰素反应的方法，该方法是向该对象输送重组猿猴腺病毒。
本发明还有一方面提供了一种用于诱导针对人免疫缺陷病毒的CD8+T细胞应答的免疫原性组合物。该组合物含有重组猿猴腺病毒，该病毒包含编码人免疫缺陷病毒-1的经修饰的gag蛋白的最佳核酸序列以及生理上相容的载体。
本发明还有一方面提供了一种在哺乳动物体内诱导针对人免疫缺陷病毒的CD8+T细胞应答的方法，该方法是给予该哺乳动物本发明的免疫原性组合物。
本发明还有一方面提供了一种在哺乳动物体内诱导针对人乳头瘤病毒的CD8+T细胞应答的方法，该方法是给予该哺乳动物重组猿猴腺病毒，该病毒编码了衍生自人乳头瘤病毒的免疫原性蛋白。
本发明的其它优点可从下列发明详述中轻而易举地得知。
附图说明
图1总结了黑猩猩腺病毒C68基因组的基因组织结构。在图1A中，C68黑猩猩腺病毒的基因组用顶部的方框表示。反向末端重复序列用黑色阴影表示，早期区域用灰色阴影表示。方框上方的箭头表示早期基因的表达方向。方框下的线条表示基因组被分为100个图谱单位。线条下方的箭头表示5个晚期基因区域和每个区域中编码的蛋白。方框或箭头下的数字表示每个区域的开头(启动子或起始密码子)和末端(典型的PolyA信号)。*表示E2A晚期启动子。图1B描述了PstI克隆。图1C描述了BamHI克隆。图1D描述了HindIII克隆。对于1B-1D，无阴影的区域表示片段被克隆到质粒载体中(如表1所示)，而有阴影的区域表示限制性片段没有被克隆。对于每个部分，片段名称中大写字母A表示最大的片段，片段的大小列于方框上方，片段的末端点列于方框下。
图2提供了六邻体蛋白的多序列对比。用CLUSTAL X比较黑猩猩腺病毒与高度相似的人腺病毒六邻体的推导的氨基酸序列。左边的区域显示了血清型和亚型，其后是残基数。数字指相对于翻译起始点的氨基酸位置。与C68相似的氨基酸用灰色表示，相同的用黑色表示。环结构域DE1和FG1中的7个超变区沿底部标记，其对应于序列对比中的下列Ad2序列：HVR1，137-188；HVR2，194-204；HVR3，222-229；HVR4，258-271；HVR5，278-294；HVR6，316-327；和HVR7，433-465。这些序列的GenBank登录号如下所示：AAD03657(Ad4)，S37216(Ad16)，S39298(Ad3)，AAD03663(Ad7)和NP040525(Ad2)。
发明详述
将人重组腺病毒株5的免疫原性与黑猩猩腺病毒株68相比，两者均表达了截短的gag序列，而黑猩猩腺病毒表现更强效。用表达绿色荧光蛋白和狂犬病病毒糖蛋白的重组黑猩猩腺病毒观察到了类似的结果。重组黑猩猩腺病毒的这种较高能力很可能与较高的转基因表达没有关联，因为研究是用Ad和黑猩猩重组病毒进行的，这两者携带了类似的表达盒，其中转基因受早期巨细胞病毒启动子的控制。本文提供的数据也表明，这不可能反映嗜性的差别，因为黑猩猩和Ad5病毒均采用相同的细胞受体。然而，这些结果表明，本发明所用的重组黑猩猩腺病毒出入意料地具有与人腺病毒不同的佐剂活性。这一更佳的佐剂活性对于黑猩猩腺病毒诱导的转基因特异性免疫反应的程度和动力学具有深刻的影响。
较佳的是，这一较高的效力允许可以使用比人腺病毒输送系统所需剂量更低的黑猩猩腺病毒。另外，本发明者已经发现，重组黑猩猩腺病毒诱导了比人腺病毒高约5倍水平的α干扰素和β干扰素。
另外，发现重组黑猩猩腺病毒对树突细胞的能力与人5型腺病毒几乎相同。猿猴腺病毒的这种能力以及出人意料的效力在诱导针对所选抗原的细胞毒性免疫反应以及治疗需要增强α干扰素和/或β干扰素诱导的病症提供了显著的优点。
I.重组猿猴腺病毒
A.来源
各种黑猩猩腺病毒序列的来源可从美国典型培养物保藏中心(ATCC，10801University Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2209)和其它来源获得。理想的黑猩猩病毒株是Pan5[ATCC VR-591]、Pan6[ATCC VR-592]和Pan7[ATCC VR-593]。特别理想的黑猩猩腺病毒株是黑猩猩腺病毒株Bertha或C1[ATCC No.VR-20]和黑猩猩腺病毒株Pan9或CV68[ATCC VR-594]。为了方便起见，病毒CV68在本说明书全文中称为“C68”。该病毒最初分离自受感染的黑猩猩的粪便[C1，Rowe等人，Proc.Soc.Exp.Med.，91：260(1956)]或肠系膜淋巴结[C68，Basnight等人，Am.J.Epidemiol.，94：166(1971)]。这些病毒株的序列以及腺病毒基因E1a，E1b，E2a，E2b，E3，E4，L1，L2，L3，L4和L5提供在美国专利6,083,716中，该专利纳入本文作为参考。另外，非黑猩猩的猿猴腺病毒序列可用来制备本发明的重组载体。这些非黑猩猩的腺病毒包括从狒狒腺病毒株获得的腺病毒[例如ATCC VR-275]、从猕猴分离获得的腺病毒株[例如ATCC VR-209，ATCC VR-275，ATCC VR-353，ATCC VR-355]以及从非洲绿猴分离获得的腺病毒株[例如ATCC VR-541；ATCC VR-941；ATCC VR-942；ATCC VR-943]。
本文所述的重组黑猩猩(或其它猿猴)腺病毒可含有衍生自一种或多种猿猴腺病毒株的腺病毒序列。这些序列可得自天然来源，用重组方法、合成方法或其它基因工程方法或化学方法制得。
B.重组猿猴腺病毒
用于本发明的重组猿猴腺病毒是病毒颗粒，它由重组猿猴腺病毒序列以及其携带的异源分子和/或猿猴腺病毒衣壳蛋白组成。这些猿猴腺病毒，尤其是黑猩猩C68和C1序列，还可用来与其它猿猴以及非猿猴腺病毒一起形成杂交载体，以及形成假型重组病毒(即具有腺病毒载体的重组病毒，该载体携带了有包装在猿来源的异源衣壳蛋白中的异源分子)。
1.重组猿猴腺病毒
用于本发明的重组猿猴腺病毒至少含有用于复制和毒粒包壳所需的猿猴腺病毒顺式元件，该顺式元件侧接于异源基因。即，该载体含有腺病毒的顺式作用的5′反向末端重复序列(ITR)(其作为复制起点)，天然的5′包装/增强结构域(含有包装线性Ad基因组所需的序列和E1启动子所需的增强子元件)，异源分子和5′ITR序列。例如见美国专利6,023,975中关于制备“最少”的人腺病毒载体的技术(该专利纳入本文作为参考)，很容易对其加以变化来用于重组猿猴腺病毒。
用于本发明的重组猿猴腺病毒可任选地含有上述最少猿猴腺病毒序列以外的序列。其它腺病毒载体的特征是具有修饰，这些修饰破坏了腺病毒表达一个或多个所选基因产物的能力。本文所用的术语“功能性缺失”就是用来描述这些修饰。这些“功能性缺失”通常采用的是病毒基因全部或部分缺失的形式。然而，这些功能性缺失也可采用移码突变的形式。其它实现功能性缺失的合适操作对于本领域技术人员而言是显而易见的。
在特别佳的实施方案中，由于丧失表达腺病毒E1a和E1b的能力，猿猴腺病毒是复制缺陷型的(即E1a和E1b功能性缺失)。这些重组猿猴腺病毒也可在其它基因中具有功能性缺失。
例如，可从构成重组病毒一部分的猿猴腺病毒序列中除去腺病毒的延迟早期基因E3。E3的功能对于产生重组腺病毒颗粒不是必需的。因此，为了包装本发明所用的重组猿猴腺病毒，不必取代该基因产物的功能。
重组猿猴腺病毒也可构建成具有E4基因的功能性缺失，但是可能需要保留E4ORF6的功能。本发明的其它载体在延迟早期基因E2a中有缺失。缺失也可在猿猴腺病毒基因组的晚期基因L1至L5中的任何部位。类似地，出于某些目的，中期基因IX和IVa2中的缺失可能是有用的。在其它结构性或非结构性腺病毒基因中可有缺失。上述缺失可个别采用，即，本发明所用的腺病毒序列中仅有E1缺失。或者，可以任何组合方式使整个基因或其部分缺失以有效地破坏其生物活性。例如，在一个典型的载体中，腺病毒序列可以有E1基因和E4基因缺失，或E1、E2a和E3基因缺失，或E1和E3基因缺失，或E1、E2a和E4基因缺失，有或没有E3缺失等等。这些缺失可与其它突变(如温度敏感型突变)组合，以获得所需的结果。
转基因可插入猿猴腺病毒的任何缺失区域中。或者如需要，可将转基因插入已有的基因区域中，以破坏该区域的功能。
无论重组猿猴腺病毒是仅含最少的Ad序列还是含有整个Ad基因组而只有在E1和/或E3区域有功能性缺失，该重组病毒都含有猿猴腺病毒衣壳。或者，在其它方案中，可在本发明方法中采用重组假型腺病毒。该假型腺病毒采用了猿猴腺病毒衣壳蛋白，衣壳中包装了携带异源猿猴腺病毒序列或非猿猴腺病毒序列的核酸分子。本发明的这些重组猿猴腺病毒可用本领域技术人员已知的方法来制备。
C.重组病毒颗粒的制备
合适的重组猿猴腺病毒的制备方法采用的是本领域技术人员熟知的方法，例如美国专利6,083,716中描述的方法。在构建用于将异源分子输送给对象(例如人、犬、猫或其它哺乳动物)的重组猿猴腺病毒时，载体中采用腺病毒核酸序列可以从各种猿来源获得。
含有猿(例如黑猩猩)腺病毒序列而缺少产生感染性重组病毒颗粒所需的猿猴腺病毒序列的载体可与辅助病毒或载体结合使用。辅助病毒提供了猿猴腺病毒病毒感染力和繁殖所需的基因产物。当在功能性病毒载体中制作一个或多个猿猴腺病毒基因的选择性缺失时，这些缺失的基因产物可在病毒载体产生过程中通过在所选的包装细胞中繁殖该病毒来提供。
这样，这些功能可由永久性转化的细胞系来提供，这些细胞系提供了载体中缺少的而包装却需要的一些或全部腺病毒功能，例如E1a、E1b、E2a、E4 ORF6、VA RAN中的任一种。或者如果需要，可通过转染或感染具有这些功能的构建物来向包装细胞提供所需的其它腺病毒功能。或者，可以选择腺病毒功能，使其允许将携带最小基因的病毒载体包装入异源猿猴腺病毒衣壳蛋白中。在人假型腺病毒的技术已知的基础上，利用猿(如C68)衣壳蛋白进行“假型”的合适方法是不难明白的。例如见美国专利6,023,975。
将所选的腺病毒DNA序列、转基因和其它载体元件装配到各种中介质粒和穿梭质粒中，以及用质粒和载体来产生重组病毒颗粒均采用常规技术来实现。这些技术包括：常规的cDNA克隆技术(如课本[Sambrook等人，分子克隆实验指南，第二版，ColdSpring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY(1998)]中所述)，使用腺病毒基因组的重叠的寡核苷酸序列，聚合酶链反应以及提供所需核苷酸序列的任何合适的方法。可采用标准的转染和共转染技术，如CaPO4沉淀技术。其它常规方法包括病毒基因组的同源重组，在琼脂铺层上产生病毒噬斑，以及测定信号产生的方法等。
例如，在构建和装配所需的含转基因的穿梭质粒后，将穿梭质粒体外转染入用于装配的宿主细胞中。该宿主细胞具有任何缺少的腺病毒功能。辅助病毒和载体序列之间发生同源重组，使得载体中的腺病毒-转基因序列复制并包装到毒粒衣壳中，从而导致产生重组病毒颗粒。
较佳的是，本发明者已经发现人腺病毒E1蛋白与E1缺陷型猿猴腺病毒反式互补，从而允许其包装到猿猴腺病毒颗粒中。然而，由于人Ad E1和缺失的猿Ad E1序列的侧翼序列之间同源程度很低，因此猿Ad E1同源重组产生有复制能力的猿猴腺病毒的危险性很小。
如此制得的重组猿猴腺病毒颗粒可用本领域技术人员已知可用于本发明的各种方法来分离纯化。
II.用于输送给宿主的异源分子
A.免疫原
猿猴腺病毒携带的用于输送给宿主细胞的异源分子可以是任何所希望的物质，包括但不局限于，多肽、蛋白质、酶、碳水化合物、化学物质或核酸分子(包括寡核苷酸、RNA、DNA和/或RNA/DNA杂合体)。在一个较佳的方案中，猿猴腺病毒携带的分子是转基因。转基因是核酸分子，它包含的核酸序列与腺病毒序列异源，该序列编码感兴趣的蛋白质、肽、多肽、酶或其它产物。转基因还包含指导编码的产物在宿主细胞中转录和/或翻译的调控序列，该调控序列能使编码的产物在宿主细胞或对象中表达。转基因的组成取决于猿猴腺病毒的预计用途。
例如，一种转基因包含报道序列或标记序列，这些序列在表达后产生了可检测的信号。然而，特别佳的是能诱导产生抗体(最佳的是能诱导细胞介导的免疫反应)的基因产物或其它分子。
这些免疫原性基因产物和分子可来自各种病原微生物，包括但不局限于，感染人或非人脊椎动物的病毒、细菌、真菌或寄生性微生物，或来自癌细胞或肿瘤细胞。免疫原可包含衍生自蛋白质的肽或多肽。在一些情况下，组成中可包含多个免疫原。
含有这些基因产物和其它分子的理想的免疫原性组合物包括涉及预防和/或治疗由病毒所引起疾病的那些免疫原性组合物，其中所述病毒非限制性地是，例如人免疫缺陷病毒、猿猴免疫缺陷病毒、呼吸道合胞病毒、1-3型副流感病毒、流感病毒(例如A型和B型流感病毒)、单纯疱疹病毒、人巨细胞病毒、肝炎病毒(包括甲肝、乙肝和丙肝病毒)、人乳头瘤病毒、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒、杯状病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、腺病毒、狂犬病病毒、犬热病病毒、牛瘟病毒、冠状病毒、细小病毒、感染性鼻气管炎病毒、猫白血病病毒、猫传染性腹膜炎病毒、鸟传染性囊病病毒、新城疫病毒、Marek′s病病毒、猪呼吸道和生殖道综合征病毒、马动脉炎病毒和各种脑炎病毒。
还有其它免疫原涉及预防和/或治疗例如由细菌引起的疾病，这些细菌例如是流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)(典型性和非典型性)、睡眠嗜血菌(Haemophilussomnus)、粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)、淋病奈瑟氏球菌(Nesseria gonorrhoeae)、砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、鹦鹉热衣原体(Chamydia psittaci)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonellacholeraesuis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、志贺氏菌(Shigella)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、鸟分枝杆菌(Mycobaterium avium)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)复合物、奇异变形菌(Proteus mirabilis)、普通变形菌(Proteus vulgaris)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、溶血巴斯德氏菌(Pasteurella haemolytica)、多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、大叶性肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)和鸡败血支原体(Mycoplasma gallisepticum)。
还有其它免疫原涉及预防和/或治疗例如由真菌病原体引起的疾病，这些真菌病原体例如是曲霉(Aspergillis)、芽生菌(Blastomyces)、念珠菌(Candida)、Coccidiodes、隐球菌(Cryptococcus)和组织胞浆菌(Histoplasma)。
另外，其它合适的免疫原涉及预防和/或治疗例如由寄生虫引起的疾病，这些寄生虫例如是利什曼原虫(Leishmania major)，回虫(Ascaris)，鞭虫(Trichuris)，贾第虫(Giardia)，血吸虫(Schistosoma)，Cryptosporidium，毛滴虫(Trichomonas)，弓形虫(Toxoplasma gondii)和肺囊虫(Pneumocystis carinii)。
另外，希望的免疫原包括在脊椎动物宿主中引发治疗性或预防性抗癌效果的那些免疫原，例如但不局限于，利用癌抗原或肿瘤相关抗原(包括但不局限于前列腺特异性抗原、癌胚抗原、MUC-1、Her2、CA-125和MAGE-3)的那些免疫原。
下列例子具体描述了本发明方法和组合物的优点，其利用重组猿猴腺病毒载体来表达狂犬病的免疫原性肽(糖蛋白G)或人1型免疫缺陷病毒(修饰的gag蛋白)。另一理想的方案采用了携带人乳头瘤病毒的免疫原性肽的猿猴腺病毒。然而本发明并不局限于这些免疫原来源。
B.调控元件
需要转录、翻译和/或表达以便在细胞和宿主中获得所需基因产物的转基因或其它核酸序列的设计可包括与感兴趣的编码序列操作性相连的合适序列，以促进编码产物的表达。“操作性相连”的序列包括与感兴趣的核酸序列毗连的表达控制序列以及反式或隔一定距离起作用来控制感兴趣的核酸序列的表达控制序列。
表达控制序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号如剪接和聚腺苷酸化信号；使细胞质mRNA稳定的序列；增强翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及当需要时，增强蛋白质分泌的序列。众多表达控制序列(天然的、组成型的、可诱导的和/或组织特异性的)是本领域所已知的，它们可用来驱动基因的表达，这取决于所希望的表达类型。对于真核细胞，表达控制序列通常包括启动子、增强子，(如从免疫球蛋白基因、SV40、巨细胞病毒等获得的)，以及聚腺苷酸化序列(包括剪接供体和受体位点)。聚腺苷酸化(polyA)序列通常插在转基因序列之后和3′腺病毒ITR序列之前。在一个方案中，选用牛生长激素polyA。本发明的猿猴腺病毒还可含有内含子，其理想地是位于启动子/增强子序列与转基因之间。一种可能的内含子序列也可衍生自SV-40，称为SV-40 T内含子序列。另一可用于载体的元件是内部核糖体进入位点(IRES)。IRES序列用来从单个基因转录本产生多个多肽。IRES序列用来产生含有多个多肽链的蛋白质。这些元件以及其它常见载体元件的选择是常规的，许多这样的序列是可以获得的(例如见Sambrook等，及其中引用的参考文献，例如3.18-3.26页和16.17-16.27页，以及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，1989)。
在一个例子中，希望有高水平的组成型表达。有用的组成型启动子的例子包括，但不局限于，逆转录病毒Rous肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选的具有RSV增强子)，巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地具有CMV增强子)(例如见Boshart等人，Cell，41：521-530(1985)，SV40启动子，二氢叶酸还原酶启动子，β-肌动蛋白启动子，磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1α启动子(Invitrogen)。由外来提供的化合物所调控的可诱导的启动子也是有用的，其包括锌可诱导的羊金属硫蛋白(MT)启动子、地塞米松(Dex)-可诱导的小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、T7聚合酶启动子系统(WO98/10088)；蜕皮激素昆虫启动子(No等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 93：3346-3351(1996))、四环素可阻遏的系统(Gossen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，89：5547-5551(1992))、四环素可诱导的系统(Gossen等人，Science，268：1766-1769(1995))，另见Harvey等人，Curr.Opin.Chem.Biol.，2：512-518(1998))，RU486可诱导的系统(Wang等人，Nat.Biotech.，15：239-243(1997)和Wang等人，Gene Ther.，4：432-441(1997))以及雷帕霉素可诱导的系统(Magari等人，J.Clin.Invest.，100：2865-2872(1997))。可用于本文的其它类型的可诱导启动子是那些受特定生理状况(如温度、急性相(acute phase)、细胞的特定分化阶段(或仅在复制性细胞中)来调控的那些启动子。
在另一方案中，采用转基因的天然启动子。当希望转基因的表达模拟其天然表达时，天然启动子是较佳的。当暂时或发育时或以组织特异性方式或在对具体转录刺激反应时必须调节转基因表达时，可采用天然的启动子。在另一方案中，也可其它天然的表达控制元件如增强子元件、聚腺苷酸化位点或Kozak共有序列来模拟天然表达。
转基因的另一方案包括将转基因与组织特异性启动子操作性相连。例如，如果希望在骨骼肌中表达，则应使用在肌肉中有活性的启动子。这些包括来自编码骨骼α-肌动蛋白、肌球蛋白轻链2A、肌营养不良蛋白、肌肉肌酸激酶的基因的启动子，以及活性比天然存在的启动子更高的合成性肌肉启动子(见Li等人，Nat.Biotech.，17：241-245(1999))。对于肝(白蛋白，Miyatake等人，J.Virol.，71：5124-32(1997)；乙型肝炎病毒核心启动子，Sandig等人，Gene Ther.，3：1002-9(1996)；α-铁蛋白(AFP)，Arbuthnot等人，Hum.Gene Ther.，7：1503-14(1996))，骨钙蛋白(Stein等人，Mol.Biol.Rep.，24：185-96(1997))；骨唾液蛋白(Chen等人，J.Bone.Miner.Res.，11：654-64(1996))，淋巴细胞(CD2，Hansal等人.，J.Immunol.，161：1063-8(1998)；免疫球蛋白重链；T细胞受体α链)，神经元如神经元特异性烯醇酶(NSE)启动子(Andersen等人.Cell.Mol.Neurobiol.，13：503-15(1993))，神经丝轻链基因(Piccioli等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，88：5611-5(1991))，和神经元特异性vgf基因(Piccioli等人.，Neuron，15：373-84(1995))，其组织特异性启动子的例子是已知的。
当然，并非所有的表达控制序列对表达本发明所有的转基因将发挥相同的作用。然而，本领域技术人员可在不脱离本发明范围内在这些表达控制序列中进行选择。本领域技术人员可用本申请提供的指导来选择合适的启动子/增强子序列。这种选择是一种常规的方式，而非是对该分子或构建物的限制。例如，可选择一个或多个表达控制序列与感兴趣的编码序列操作性相连，将其插入转基因、小基因以及本发明的转移病毒中。在实施如本说明书或现有技术所述包装猿猴腺病毒方法之一后，可在体内或体外感染合适的细胞。细胞中的小基因拷贝数可用Southern印迹或定量PCR来监测。RNA表达的水平可用Northern印迹或定量RT-PCR监控。表达水平可用Western印迹、免疫组织化学、ELISA、RIA或通过基因产物生物活性试验来监控。因此，很容易确定具体的表达控制序列是否适合转基因所编码的特定产物并选择最适合的表达控制序列。或者，当输送的分子不需要表达时(如碳水化合物、多肽、肽等)，表达控制序列不必构成重组猿猴腺病毒或其它分子的一部分。
III.输送病毒的制剂
重组猿猴腺病毒宜悬浮于生理相容的载体中给予人或非人哺乳动物患者。根据转移的病毒所针对的适应症，本领域技术人员很容易选择合适的载体。例如，一种合适的载体是盐水，它可用各种缓冲液(如磷酸缓冲盐溶液)来配制。其它典型的载体包括无菌盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、葡聚糖、琼脂、果胶、花生油、芝麻油和水。
本发明不局限于载体的选择。
除重组猿猴腺病毒和载体外，本发明的组合物可任选地含有其它常规药用组分，如防腐剂、化学稳定剂或用于疫苗用途的佐剂。合适的典型防腐剂包括氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸、乙基香草醛、甘油、苯酚和对氯苯酚。合适的化学稳定剂包括明胶和白蛋白。合适的佐剂包括免疫刺激的复合物(ISCOMS)、LPS类似物(包括3-O-去酰基化的单磷脂A(Ribi Immunochem Research，Inc.；Hamilton，MT)，矿物油和水、氢氧化铝、Amphigen、Avirdine、L121/鲨烯、胞壁酰肽和皂苷如Quil A。
IV.输送重组病毒进行治疗和/或预防
将复制缺陷型重组腺病毒以药物有效量给予，即，该重组腺病毒用量使得在给药途径中能有效地转染目标细胞，并为所选基因提供了足够的表达水平，从而提供了治疗性或疫苗性免疫反应(例如有可测定水平的保护性免疫力)。
常规的和药学上可接受的给药途径包括，但不局限于，肌内、气管内、皮下、真皮内、直肠、口服和其它粘膜和肠胃外给药途径。本文所用的粘膜给药途径包括输送给粘膜组织的那些给药途径，包括但不局限于，吸入、口服、鼻内、阴道和直肠途径。如果需要，给药途径可以组合，或根据免疫原或疾病作调节。例如，在预防狂犬病时，皮下、气管内、鼻内和口服途径是较佳的。给药途径主要取决于待治疗的疾病性质。
复制缺陷型重组腺病毒的剂量或有效量主要取决于以下因素：病症、所选基因、动物的年龄、体重和健康程度，因此各动物之间可有不同。
病毒载体的剂量主要取决于以下因素：待治疗的病症，患者的年龄、体重和健康程度，因此各哺乳动物(包括人)患者之间可有不同。较佳的是，本发明的重组猿(例如黑猩猩)腺病毒的出人意料的效力使得其能以显著较低的重组黑猩猩腺病毒用量来提供诱导所需免疫原性效应的有效量(例如诱导预定水平的CD8+T细胞)。例如，104pfu和106pfu的黑猩猩腺病毒能提供有效剂量的重组猿猴腺病毒。然而，根据所选的输送途径，很容易选择更高的剂量。例如，病毒载体的输送量在大约100微升至100毫升(更佳的在大约1毫升至10毫升之间)的载体溶液，其浓度范围约为1×104噬斑形成单位(pfu)至1×1013pfu病毒/毫升，以及1×109至1×1011pfu/毫升病毒(以80千克成人体重计算)。较佳的剂量估计约为2×1010pfu/ml的50毫升盐水溶液。在上述浓度下，较佳的剂量约为1-10毫升载体(例如盐水溶液)。可对所选基因的治疗水平或免疫力水平进行监控，以确定是否需要加强。在测定CD8+T细胞应答或血清中的抗体滴度后，可能需要进行增强免疫。重组猿猴腺病毒可任选地用接触-强化方案来输送。各种此类方案已在现有技术中有所描述，很容易进行选择。一个特别希望的方法在2000年3月2日公开的WO00/11140中有所描述，该出版物纳入本文作为参考。
在一个较佳的方案中，本发明提供了一种在对象内优先诱导出针对人免疫缺陷病毒的CD8+T细胞应答的方法，该方法是输送含有修饰的gag蛋白的重组猿猴腺病毒。以下实施例中描述的经修饰的gag蛋白已如美国专利5,972,596中所述那样进行了优化。其编码序列和蛋白质序列在本文中表示为SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7。另见G.Meyers等编，Human retroviruses and AIDS.A compilation and analysis of nucleic acidand amino acid sequences(Los Alamos National Laboratory，Los Alamos，MN 1991)。然而，各种提高gag蛋白或本文所述的其它所选免疫原或抗原表达的方法，例如HIV-1gag密码子序列的人化、除去HIV-1 gag剪接位点、在HIV-1 gag编码序列上游插入额外的引导序列，在HIV-1 gag编码序列的上游插入Kozak序列是本领域技术人员已知的并可采用。本发明并不局限于优化方法的选择。或者，本发明的方法可用来将携带HIV包膜蛋白或HIV pol的重组猿猴腺病毒输送给对象。一种希望的HIV包膜蛋白是HIV糖蛋白120，其序列可从GenBank获得。然而，可用其它合适的病毒包膜蛋白。HIV-1 pol的序列以及各种修饰的pol序列是已知的。例如参见美国专利5,972,596和R.Scheider等人.，J.Virol，71(7)：4829-4903(1997年7月)。
在另一理想的方案中，本发明提供了一种优先诱导出针对所选恶性肿瘤的肿瘤相关蛋白的CD8+T细胞应答的方法，该方法是向对象输送包含肿瘤相关蛋白的重组猿猴腺病毒。该蛋白包括细胞致癌基因如突变的ras或p53。
在另一方案中，本发明提供了一种优先诱导出针对所选恶性肿瘤的特异性肿瘤相关蛋白的CD8+T细胞应答的方法，方法是将含有肿瘤相关蛋白的重组猿猴腺病毒输送给对象。
还有一个理想的方案涉及输送含有人乳头瘤病毒衍生蛋白的重组猿猴腺病毒，以防止人乳头瘤病毒感染并治疗和预防相关的病症。例如，蛋白可选自E6、E7和/或L1(Seedorf，K.等人，Virol，145：181-185(1985))。当病症是呼吸道合胞病毒感染时，蛋白选自糖蛋白(G)和融合蛋白(F)，它们的序列从GenBank获得。
提供下列实施例以便描述本发明，但本发明范围不局限于这些例子。本领域技术人员会认识到，尽管下列例子中列举了具体的试剂和条件，但是可在本发明的思路和范围内进行修改。
实施例1-基于黑猩猩腺病毒C68的E1缺失载体的制备
分离得到C68的复制缺陷型用于基因转移。获得E1缺失的重组体的典型策略是通过在E1表达的细胞系中进行同源重组。第一步是产生一个质粒，该质粒含有m.u.0至1.3，其后加入一最小基因，该基因表达CMV启动子下的增强绿色荧光蛋白(GFP)和跨接9-16.7m.u.的C68序列。该线性化质粒和SspI消化的C68质粒(SspI在3.6m.u处切割，留下4644bp进行同源重组)共转染入表达E1的细胞系中。实验开始时用携带人Ad5 E1的293细胞进行，希望这足以实现反式互补。事实上，形成的噬斑提供了所需的重组体。所得载体命名为C68-CMV-GFP。
改进重组体产生的策略，以便有效地迅速地分离重组体。首先，用由lacZ的原核启动子驱动的原核GFP基因代替最初穿梭载体中的碱性磷酸酶DNA。这可使在试图将所需的真核RNA pol II转录单元掺入穿梭载体中时能有效的筛选转化细菌。可通过GFP表达来筛选产生的转化菌。白色菌落是重组体，而绿色菌落是残余的亲代质粒。
绿色—白色选择已被用于筛选共转染产物来分离人Ad5重组体(A.R.Davis等人，Gene Thera，5：1148-1152(1998))。将其改用于C68系统。将最初的穿梭载体改为含有来自9至26MU的延伸的3’序列。将该载体与来自最初的C68-CMV-GFP分离物的病毒DNA共转染，该病毒DNA已经XbaI限制性酶切成MU16.5，使得有9.5Kb的重叠区进行同源重组。在相差荧光显微镜下筛选所得噬斑中不发荧光的分离物，其代表了所需的重组体。与基于结构或转基因表达的标准方法相比，这大大简化了筛选。
A穿梭质粒
为了构建产生重组C68病毒的质粒穿梭载体，对质粒pSP72(Promega，Madison，WI)进行变化，用BglII消化，然后用Klenow酶(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)填平末端，用合成的12bp PacI接头(New England Biolabs，Beverly，MA)连接，产生pSP72-Pac。从含有C68基因组的BamHI E片段的pNEB-BamE质粒中分离出跨越C68基因组的图谱单位(m.u.或MU)0-1.3的456bp的PacI/SnaBI片段，克隆到经PacI和EcoR V处理的pSP72-Pac中，产生pSP-C68-MU0-1.3。从pCMVβ(Clontech，Palo Alto，CA)分离出最小基因盒，该基因盒由驱动lacZ的巨细胞病毒早期启动子和SV40 poly A信号组成，它是4.5kb的EcoR I/Sal I片段，将其与经同样酶限制性消化的pSP-C68-MU0-1.3相连接，获得pSP-C68-MU0-1.3-CMVLacZ。
作为分离C68的9-16.7MU区域的初始步骤，用BamHI和SphI酶双消化pGEM-3Z(Promega，Madison，MI)和pB S-C68-BamF。然后，将来自pBS-C68-BamF的293bp片段与pGEM-3Z的主链相连接，形成pGEM-C68-MU 9-9.8。在XbaI消化、填平和BamHI处理后，从pBS-C68 BamHB克隆获得含有C68 MU 9.8-16.7的2.4kb片段，然后将其克隆到经BamHI/SmaI双消化的pGEM-C68-MU 9-9.8中，产生pGEM-C68-MU 9-16.7。通过EcoRI消化、用Klenow酶(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)填平末端，与合成的12bpHindIII接头(NEB)连接以及用HindIII消化，从pGEM-C68-MU 9-16.7分离得到C68 9-16.7m.u.区域。将跨越C68 MU9-16.7的2.7kb片段克隆到pSP-C68-MU 0-1.3-CMVLacZ的HindIII位点中，形成最终的穿梭质粒pC68-CMV-LacZ。另外，从pAdCMVALP(K.J.Fisher，等人，J.Virol.，70：520-532(1996))分离出820bp碱性磷酸酶(AP)cDNA片段，使其在pC68-CMV-LacZ的Not I位点与lacZ交换，获得pC68-CMV-AP。
B.重组病毒的构建
为了构建E1缺失的重组C68-CMVEGFP载体，首先构建pC68-CMV-EGFP穿梭质粒，用增强绿色荧光蛋白(GFP)基因代替pC68-CMV-LacZ中的lacZ转基因。替代克隆方法如下。通过BamHI消化，填平反应和连接8bp合成的NotI接头(NEB)，在pEGFP-1(Clontech，Palo Alto，CA)中的EGFP编码序列的5’端导入额外的NotI限制性位点。在对两个构建物进行NotI限制性消化后，从修饰的pEGFP-1中分离出EGFP序列，用来替换pC68-CMV-lacZ中的lacZ基因。将pC68-CMVEGFP构建物(3微克)与SspI消化的C68基因组DNA(1微克)共转染293细胞，如前所述(G.Gao，等人，J.Virol，70：8934-8943(1996))进行同源重组。分离荧光显微镜显示的绿色噬斑，进行2轮噬斑纯化，扩增并用CsCl梯度沉降纯化(G.Gao，等人，同上)。
在试图将方便的绿色/白色选择方法(A.R.Davis，等人，Gene Thera，5：1184-1152(1998))用于重组C68载体的构建时，通过AgeI和BsiwI限制性内切酶处理，从pBSC68-BamB质粒中分离出跨越9至36MU的7.2kb片段，将其克隆到pC68-CMV-AP穿梭质粒的Asp718和AgeI位点，获得新的质粒命名为pC68CMV-AP-MU36。通过Eco47III和NruI消化从pC68CMV-AP-MU36中除去26至36MU，进行进一步的修饰。新的穿梭质粒命名为pC68CMV-AP-MU26，它在最小基因的3’端具有更短的同源重组区域(即16.7-26MU)。为了制造重组C68载体，用感兴趣的基因代替碱性磷酸酶(AP)。所得pC68CMV-Nugene-MU26构建物和XbaI(16.5MU)限制性消化的C68-CMVGFP病毒DNA共转染入293细胞，然后进行顶部琼脂铺层。通过pC68CMV-Nugene构建物和C68病毒主链之间共有的16.7-26MU区域的同源重组，产生了重组病毒噬斑(白色)。从未切割的C68-CMVGFP病毒的绿色噬斑中选出形成白色噬斑的重组体。
白色/绿色选择机制也被引入将感兴趣基因克隆到pC68穿梭质粒的方法中。用分离自pGFPMU31(Clontech，Palo Alto，CA)的由lacZ启动子驱动的原核GFP基因表达盒代替pC68CMV-AP-MU36和pC68CMV-AP-MU26中的AP基因。这样，细菌转化体的白色菌落将含有该重组质粒。该白色/绿色选择细菌菌落的方法避免了制备和特征鉴定大量微量制备的DNA的需要，从而进一步增强了产生重组C68载体的效率。
实施例2-抗原在经猿猴腺病毒疫苗构建物感染的TK细胞中的表达(Gag分泌)
如实施例1和Z.Q.Xiang，等人，Virol.219，200(196)所述，构建重组黑猩猩腺病毒株68(Adchimp68)和人腺病毒株5(Adhu5)，两者携带了经修饰的HIV-1 clade B的截短型gag基因的核苷酸序列。HIV-1的结构蛋白(包括gag)的转录本含有遗传不稳定元件，需要rev蛋白的存在以便输出胞核和在细胞质中有效表达(S.Schwartz等人，J Virol 66，7176(1992)；S.Schwartz等人，J Virol 66，150-159(1992)；G.Nasioulas等人，J Virol 68，2986(1994))。腺病毒依靠核转录，因此需要rev来表达HIV-1蛋白。为了避免对Rev的依赖性，通过定点诱变除去了密码子修饰的gag序列中的遗传不稳定性元件(R.Schneider等人，J Virol 71，4892(1997)；S.Schwartz等人，J Virol 66，7176(1992)；S.Schwartz等人，J Virol 66，150(1992))，将其插入腺病毒载体中。该导入的基因编码截短的p37gag蛋白(p17和p24区域)。截短的gag蛋白不形成病毒颗粒，其部分分泌到转染的人细胞的上清液中(R.Schneider等人，J Virol 71，4892(1997))。突变的gag构建物已被用于疫苗实验，并在小鼠和灵长动物中产生了细胞和体液免疫反应(J.T.Qiu等人，J Virol 73，9145(1999))。
在用人腺病毒株5的E1转染的293细胞中产生并繁殖Adchimp68和Adhu5重组体。发明者已经发现，该异源E1适合补充E1缺失的Adchimp68重组病毒，从而减少了重组和回复成有复制能力的野生型病毒的危险性。
通过Western印迹，用针对gag的小鼠单克隆抗体分析了TK培养物上清中gag蛋白的存在。TK细胞(1×106)用Adhu5gag37或Adchimp68gag37病毒感染48小时(每细胞10pfu)。其它的TK细胞用表达狂犬病病毒糖蛋白的Adhu5或Adchimp68构建物感染。培养上清中的蛋白用12％变性聚丙烯酰胺凝胶分离，通过电印迹转移到PVDF膜上。印迹用针对HIV-1 p24的单克隆抗体183-H12-5C(B.Chelsebro，等人，J.Virol.66：6547(1992))染色。
如Western印迹分析所示，两个携带该gag修饰序列的重组腺病毒克隆(Adhu5gag37，Adchimp68gag37)表达了相当水平的转基因产物。在用10个噬斑形成单位(pfu)的腺病毒gag重组体之一感染的TK细胞上清液中，均检测到了预计大小(37kDa)的与抗HIV-1 gag单克隆抗体结合的蛋白。经表达狂犬病病毒糖蛋白的Adhu5或Adchimp68重组体(Adhu5rab.gp和Adchimp68.gp)感染的对照细胞没有产生该蛋白。
实施例3-用猿猴腺病毒在哺乳动物中诱导对gag的CD8+T细胞应答
下列实验证明，经肌内注射Adhu5gag37或Adchimp68gag37重组体的小鼠脾细胞通过细胞因子(即干扰素(IFN)-γ)释放以及靶细胞溶解而对gag蛋白的免疫优势表位(B.Doe和C.M.Walker，AIDS 10，793(1996))产生应答反应。
A.细胞因子释放试验
每组3只Balb/c小鼠用2×105、2×106或2×107pfu的Adchimp68gag37病毒，2×106pfu的Adhu5L1病毒(H.C.J.Ertl，等人，J Virol，63：2885(1989))，2×106pfu的Adhu5gag37病毒，或2×107pfu的VVgag病毒肌内免疫。10天后测试脾细胞对gag10的CD8+T细胞应答。为了测定细胞因子(IFN-γ)产生，在96孔圆底微量滴定板孔中，在补充了2％胎牛血清(FBS)和10-6M 2-巯基乙醇的Dulbeccos改进的Eagles培养基(DMEM)中，用3微克/毫升AMQMLKETI肽(SEQ ID NO：1，它携带了H-2d单体型(haplotype)的免疫优势CD8+T细胞表位)和1微克/毫升Brefeldin A(GolgiPlug，PharMingen，San Diego，CA)37℃培养脾细胞(1×106/样品)5小时。用PBS洗涤细胞，用FITC标记的抗小鼠CD8抗体于4℃培育30分钟。洗涤细胞，并以1XCytofix/Cytoperm(PharMingen)4℃渗透20分钟。用Perm/Wash(PharMingen)洗涤细胞3次，在同一缓冲液中与PE标记的抗鼠IFN-γ抗体一起于4℃下培育30分钟。洗涤后，用双色流式细胞计数仪检查细胞，用WinmDi软件分析数据。右手角落的数字表示在所有CD8+T细胞中IFN-γ染色呈阳性的CD8+T细胞的百分数。
单次免疫后7-10天，全部脾CD8+T细胞群中有相当大的部分在对gag肽的反应中产生了IFN-γ。未经体外扩增而测定的原代脾细胞溶解了预先用gag肽处理的H-2相容性靶细胞。在用Adchimp68构建物免疫后，gag特异性CD8+T细胞活性非常高，抗gag的CD8+T细胞的频率占整个脾CD8+T细胞群的16-19％。如Adchimp68gag37病毒所示，此反应是剂量依赖型的，2×105pfu的低剂量仍然诱导了接近10％的频率。Adhu5gag37重组体在2×106pfu下诱导出约为9％的最优频率。在增加该疫苗剂量后这些频率没有显著增加(数据未显示)。根据胞内细胞因子染色，表达全长gag(VVgag，称为VDK1，S.Chacrabarti等人，Mol.Cell.Biol.5，3403(1985))的重组疫苗病毒刺激的CD8+T细胞频率远远较低。
B.靶细胞的溶解
在5小时的51Cr释放试验中，以不同的效靶细胞比例下，在1×104 P815细胞上对小鼠脾细胞进行测试，小鼠在10天前用单剂重组腺病毒免疫(如A所述)，或用两剂VVgag重组体，在肌内给予第一次注射后2周腹膜内注射第二剂，其中P815细胞用对gag的肽(实心方块)或对照肽31D(X)(根据狂犬病病毒核蛋白的序列描绘(H.C.J.Ertl等人，J.Virol.63：2885(1989))室温处理16-24小时。需要VVgag疫苗两次免疫来诱导可检测的T细胞介导的gag-特异性原代细胞裂解。
C.CD8+T细胞对gag的应答反应动力学
用5×106pfu的Adhu5gag37或Adchimp68gag37病毒免疫每组4只Balb/c小鼠。6-12天后如上所述收获脾细胞，测试IFN-γ产生和靶细胞溶解。两种重组腺病毒诱导的CD8+T细胞对gag的反应动力学不同。Adhu5gag37病毒产生的对gag反应的峰值比CD8+T细胞对Adchimp68gag37重组体的反应早2-4天。
实施例4-先接触人腺病毒对猿猴腺病毒疫苗的影响
为了研究先前暴露于常见人5型腺病毒株的影响，用表达无关抗原(人乳头瘤病毒L1)的Adhu5重组体单剂免疫小鼠。两周后，用Adhu5gag37或Adchimp68gag37疫苗给小鼠接种。
更具体地说，给小鼠肌内免疫接种108pfu的Adhu5L1疫苗。两周后，给经Adhu5免疫的小鼠和原初小鼠注射2×106或2×107pfu的Adhu5gag37或Adchimp68gag37重组体(每组4-5只小鼠)。另外的Adhu5L1免疫或原初小鼠组用2×106pfu的Adhu5gag37或Adchimp68gag37病毒免疫。9天后，给小鼠腹膜内注射106pfu的表达全长gag的重组疫苗病毒。注射病毒疫苗后5天处死小鼠。
先经Adhu5病毒免疫的小鼠用Adhu5gag37疫苗接种后不能对gag产生反应。它们显示的CD8+gag特异性T细胞的频率与对照小鼠中所见相似，相应地，它们的脾细胞不能使表达gag的靶细胞溶解。相反，Adhu5免疫的小鼠接种Adchimp68gag37构建物疫苗后，CD8+T细胞对gag的反应只有稍稍地下降。比较不同的效靶细胞比，CD8+T细胞对gag反应的频率仅减少约30％，脾细胞的细胞溶解活性减少约50％。
因此，两种重组腺病毒诱导的CD8+T细胞对gag反应的频率超过了以前描述的疫苗(如裸DNA或痘病毒重组体(S.Schwartz，等人，J Virol 66，150-159(1992))所引发的频率。该频率也比通常在慢性感染个体中所见的频率高(D.H.Barouch等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 97，4192(2000)；T.U.Vogel等人，J.Immunol.164，4968(2000)；P.A.Goepfert等人，J.Virol.74，10249(2000)；C.R.Rinaldo Jr. AIDS Res & Hum.Retr..14：1423(1998))。这些结果强调了重组腺病毒疫苗的效力。
实施例5-引导和强化对CD8+T细胞对抗原的效应
将经2×107pfu的Adhu5gag37或Adchimp68gag37病毒免疫的原初或Adhu5免疫的小鼠原代脾细胞，与经2×106pfu Adhu5gag37或Adchimp68gag37病毒免疫然后用106pfu VVgag病毒加强注射的原初或Adhu5小鼠的原代脾细胞相比较。5天后分析脾细胞的CD8和胞内IFN-γ。这些试验基本上如上所述那样进行，只是在5小时51Cr释放试验中不进一步进行体外培养使经gag肽或对照肽31D处理的P815细胞溶解。
用异源疫苗构建物VVgag重组体进行初次或加强免疫没有使Adhu5重组疫苗产生的对gag的CD8+T细胞应答恢复。尽管用Adhu5疫苗接种的用Adhu5gagp37和Vvgag加强注射的动物表现出多达7.1％的脾CD8+T细胞在对gag反应中产生了IFN-γ，但这些CD8+T细胞缺乏对产生gag的靶细胞的溶细胞活性。这些结果表明，预先接触疫苗载体抗原对CD8+T细胞对重组腺病毒转基因产物的应答不仅有定性而且有定量的影响。用Adchimp68gag37疫苗接种的Adhu5免疫小鼠中CD8+T细胞对gag的反应表明了VVgag免疫后加强免疫的效果类似于原初小鼠中所见的效果。
CD8+T细胞对gag反应的频率以及原代靶细胞的溶解可通过异源疫苗载体(如VVgag重组体)来初免(未显示)或加强接种来提高。重组腺病毒肌内初次免疫9天后，用VVgag作腹膜内强化免疫，初免后5天后分析，CD8+gag特异性T细胞占全部脾CD8+T细胞群的大约40％。
已有的针对Adhu5的免疫力严重地降低了Adhu5gag37疫苗的效力，但仅稍稍损伤了CD8+T细胞对Adchimp68gag37病毒的反应。以前已经报道，经Adhu5病毒免疫的小鼠发生了经Adhu5疫苗接种对狂犬病病毒的B细胞应答降低。增加疫苗剂量或用表达相同狂犬病病毒抗原的DNA疫苗能很容易地避免预先接触Adhu5病毒的不利影响(Z.Q.Xiang，等人，J.Immunol.162，6716(1999))。
相反，在Adhu5免疫小鼠中，针对Adhu5重组疫苗所提供的gag的CD8+T细胞应答却消失了，而且用针对gag的异源疫苗再次免疫只能部分恢复。这可能表明，与刺激B细胞相比，CD8+T细胞的诱导更容易受循环性病毒中和性抗体的干扰。
实施例6-含有狂犬病病毒糖蛋白的重组腺病毒的产生
繁殖人血清型2、4、5、7、12型和黑猩猩血清型68型腺病毒，并在人293上滴定。基于表达狂犬病病毒ERA血清型的糖蛋白或人乳头瘤病毒(HPV)-16的L1蛋白的人血清型5型的重组腺病毒已有描述(Z.Q.Xiang，等人，Virology 219：220-227(1996)；D.W.Kowalcyk，等人，(2001)Vaccine regimen for prevention of sexuallytransmitted infections with human papillomativur type 16.Vaccine)。已开发了基于黑猩猩血清型68型腺病毒的表达系统，见实施例1所述。
使腺病毒在E1(从人血清型5型衍生获得)-转染的293细胞(F.L.Graham，等人，J.Gen.Virol.36：59-74(1977))上繁殖。通过冻融细胞收获病毒。对于一些实验，通过CsCl梯度纯化来纯化病毒。对于其它实验，采用经三轮冻融而坏死的受感染细胞的澄清上清。在293细胞上滴定病毒，以确定噬斑形成单位(pfu)。
如本实施例详细描述的那样，在经人血清型5型腺病毒的E1转染的293细胞中产生表达狂犬病病毒糖蛋白的黑猩猩血清型68型重组腺病毒(命名为Adchimp68rab.gp)。病毒克隆用间接免疫荧光和针对狂犬病病毒糖蛋白的构型依赖性表位的单克隆抗体509-6来进行初步筛选。在选出稳定的腺病毒亚克隆后，如下实施例所述，通过免疫沉淀确认Adchimp68rab.gp病毒在受感染TK细胞中表达了全长狂犬病病毒的糖蛋白。
实施例7-重组腺病毒表达转基因产物
本实施例表明，Adhu5病毒在TK-细胞中获得了比Adchimp68构建物水平高得多的狂犬病病毒糖蛋白表达。该转基因的转录本水平与蛋白表达水平相当，表明该差别与翻译后修饰的差别无关。TK-细胞是CAR阳性，因此，此血清型病毒的转导率应是相当的。
用于这些实验的哺乳动物细胞，即幼仓鼠肾(BHK)-21细胞、E1-转染的293细胞和TK-细胞，在补加了谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸、HEPES缓冲液、抗生素和10％胎牛血清(FBS)的Dulbeccos改进的Eagles培养基(DMEM)中繁殖。
A.免疫沉淀
用5pfu/细胞的表达狂犬病毒糖蛋白的重组腺病毒或表达不相关病毒抗原的对照构建物感染TK-细胞(106/样品)。48小时后，用无菌磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤细胞两次，然后在无血清培养基中培育90分钟，然后加入20微升35S标记的半胱氨酸和甲硫氨酸(Promix，NEN，Boston，MA)。培育4小时后，用PBS洗涤细胞，然后用1毫升含蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液处理20分钟。除去孔中的细胞和细胞碎片，稍稍漩涡振荡，12.000rpm离心2分钟。使上清和15微升/毫升含509-6单克隆抗体(针对狂犬病毒糖蛋白)的腹水4℃培育90分钟。每份样品加入75微升Protein Sepharose G，在轻微搅拌下4℃培育30分钟。通过离心使样品沉淀，用RIPA缓冲液洗涤4次。将沉淀重悬于80微升加样缓冲液中，使其沸腾4分钟。然后使样品在12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)上分离，并与分子量标准品比较。在滤纸上干燥凝胶，然后曝光到KodakScientific成象胶片(X-Omat Blue XB-1)48小时。
Adchimp68rab.gp重组体表达了预计大小的与509-6抗体结合的蛋白质。经Adhu5rab.gp病毒感染的TK-细胞的沉淀物显示出相同大小的条带，该条带在表达不相关转基因产物的重组腺病毒感染的细胞裂解液中没有出现。在经Adhu5rab.gp构建物感染的细胞中，狂犬病病毒糖蛋白的表达更为明显。转基因产物的表达的差异可能反映了翻译之前的活动，如病毒摄取、转录速度或转录本稳定性的差异。或者，翻译或翻译后差异(如不同的侧链修饰)可能导致血清学上可检测的蛋白质有定量的差别。
为了进一步区分这两个可能性，从分离感染的重组腺病毒之一的TK-细胞的总RNA。通过部分B所述的实时PCR扩增狂犬病病毒糖蛋白和管家基因的逆转录mRNA。
B.实时逆转录聚合酶链反应(PCR)
用10pfu的两种重组腺病毒之一感染一式两份样品中的铺满TK-细胞单层。24小时后分离细胞，根据生产商(Mol.Res.Center，Cincinnati，OH)说明书用TRI试剂提取RNA。用不含RNA酶的DNA酶处理RNA，用苯酚提取纯化，然后调节至每份样品含50毫微克RNA。用Light Cycler-RNA扩增试剂盒SYBR green(Roche，Mannheim，Germany；Z.He，等人，Virology 270：146-1617(2000))逆转录和扩增RNA，采用针对狂犬病病毒糖蛋白的引物、(SEQ ID NO：2 5’AAGCATTTCCGCCCAACAC；SEQ ID NO：3 3’GGTTAGTGGAGCAGTAGGTAGA)和针对管家基因戊二醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的引物(SEQ ID NO：4：5’GGTGAAGGTCGGTGTGAACGGATTT；SEQ IDNO：5：3’AATGCCAAAGTTGTCATGGATGACC)。
表1中的数据提供了结果。数据显示了一式两份测定值的平均值±SD。
表1
转录本的相对量
RNA来源
GAPDH rab.gp 比例(GAPDH/rab.gp)
TK-，Adu5rab.gp 3.2±0.2 3494±18 1082
TK-，Adchimp68rab.gp 0.52±0.1111 64±6 64
如上述数据所示，将转基因的转录物调整成管家基因的转录物显示了与血清学可检测的蛋白质相当的量的差异。
在本实施例未提供的数据中，将表达绿色荧光蛋白和密码子经修饰的截短的人免疫缺陷病毒-1的gag蛋白的其它两个Adchimp68重组体与表达相同转基因产物的Adhu5重组体(它们在TK-细胞中显示出相同的蛋白质表达水平)相比较。因此得出结论，Adchimp68病毒表达的狂犬病病毒糖蛋白减少反映了既非病毒摄取又非转录速度的差别(在两个构建物中病毒摄取和转录速度受相同的控制元件调控)。
实施例8-用狂犬病病毒抗原免疫小鼠
在近交和远交小鼠品系中比较了对Ad.chimp68rab.gp病毒和对Adhu5rab.gp病毒的狂犬病病毒特异性抗体反应。通过皮下或鼻内(i.n)给小鼠注射任一重组体的系列稀释液。14天后收获血清，用ELISA和病毒中和试验测定针对狂犬病病毒糖蛋白的抗体。用表达无关转基因(即HIV-1的gag)的重组腺病毒(在上述实施例中有所描述)作为对照。这些重组体均不能诱导可被二试验之一检测的针对狂犬病病毒的抗体应答。下面是关于该研究的更详细的讨论和结果。
从Jackson Laboratory，Bar Harbor Maine购入6-8周龄的C3H/He和C57B1/6雌鼠。远交的ICR小鼠购自Charles River(Wilmington，MA)。
用不同剂量的腺病毒或重组腺病毒皮下(s.c，在100微升盐水中)或鼻内(i.n.，在50微升盐水中)注射小鼠。用狂犬病病毒CVS-11株，以10倍的平均致死剂量(LD50)脑内给予小鼠进行攻击。
将Evelyn Rokitniki-Abelseth(ERA)的狂犬病病毒和标准的攻击病毒(ChanllengeVirus Standard)(CVS)-11株在BHK-21细胞上繁殖。用蔗糖梯度纯化ERA病毒，通过β丙酮酰内酯处理灭活，并调节至蛋白浓度为0.1毫克/毫升。CVS-11病毒在BHK-21细胞上滴定，然后通过脑内注射给予成年ICR小鼠(Z.Q.Xiang，Z.Q.& H.C.Ertl，J.Virol.Meth.47：103-16(1994))。在受攻击后，每隔24-48小时检查小鼠，至少21天。一旦它们产生了完全的后肢瘫痪(表明晚期狂犬病病毒脑炎)，使它们安乐死。
血清学试验包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、抗体的同种型分布测定和病毒中和试验。
A.ELISA
在免疫的不同时间间隔，通过后眼窝穿刺取血。制备血清，在包被有0.1微克/孔灭活狂犬病病毒的平板上测定抗狂犬病病毒的抗体。在包被了0.1微克/孔的纯化的E1缺失型针对人血清型5型或黑猩猩血清学68型的重组腺病毒的平板上，测试血清中的抗腺病毒抗体。ELISA基本上按照以前所述(Z.Q.Xiang，等人，Virology 219，220-227(1996))那样进行。包被平板过夜。然后用含3％牛血清白蛋白(BSA)的PBS封闭24小时。洗涤后，加入用PBS-3％BAS稀释的血清培育60分钟。洗涤后，加入1∶100稀释的碱性磷酸酶偶联山羊抗小鼠Ig(Cappel)，在冰上放置1小时。洗涤后，加入底物在室温下放置20-30分钟。读取405nm下的光密度。
B.抗体同种型
狂犬病病毒的抗体同种型的测定在包被灭活ERA病毒的平板上用ELISA法，采用Calbiochem Hybridoma Subisotyping(Lajolla，CA)试剂盒，并如前所述(Xiang，Virol，1996，同上)作一些小改进。
两种腺病毒疫苗皮下免疫时抗体同种型分布(profile)也不同，但是在鼻内免疫时相当。两种重组体在用这二种接种途径之一输送后均引发了抗狂犬病病毒抗原的IgG2a抗体。
两重组体在鼻内免疫后和Adhu5rab.gp疫苗皮下给药后诱导了显著的IgG1应答反应(表明为Th2辅助)，而对皮下给予Ad.Chimp68rab.gp构建物的应答反应中却没有该抗体。
C.中和性抗体
测试血清中抗CVS-11狂犬病病毒株(该病毒株在抗原性上与ERA病毒株密切相关(Z.Q.Xiang，等人，Virology.214：398-404(1996)))的中和性抗体。用WHO参照血清来进行比较。滴度以国际单位表示。
皮下给予Adchimp68rab.gp病毒诱导的B细胞对转基因产物的应答强度比Adhu5rab.gp构建物低。所有测试时间点观察到的抗体应答程度的差异取决于小鼠品系，远交ICR小鼠不如近交C3H/He小鼠明显。相反，在鼻内免疫后，经ELISA和病毒中和试验测定，两种疫苗均诱导了相当的抗体滴度。
皮下免疫后针对Adchimp68rab.gp重组体的Th1应答明显，此与注射Adhu5rab.gp后更为平衡的Th1/Th2反应相反，这支持了佐剂性能不同的观点。在通过气道施加后，Adhu5病毒以及假定Adchimp68病毒的天然感染途径诱导了针对转基因产物的抗体滴度，两者在幅度和同种型分布上相当。这提示假定的嗜性和/或佐剂性能的差异是组织依赖性的，即与皮下相比，气道给予没有差异或不明显。
实施例9-用黑猩猩重组腺病毒优先诱导细胞毒性T细胞应答反应
疫苗诱导的针对狂犬病毒的保护作用与病毒中和性抗体(VNAs，F.L.Graham，等人，J.Gen.Virol.36，59-74(1977))有关。因此，狂犬病蛋白的研究侧重于刺激免疫系统的这一免疫枝(arm)。在所有的实验中，小鼠用Adchimph68rab.gp病毒免疫，并平行地用以前描述的基于人血清型5型的Adrab.gp病毒免疫。在此项应用中，该重组体指Adhu5rab.gp病毒。
两种重组腺病毒均诱导出了对狂犬病病毒攻击的保护作用。当用10倍平均致死剂量(LD50)的CVS株狂犬病毒攻击3周后，经5×106pfu的两种重组腺病毒之一免疫(皮下给予)的C3H/He小鼠仍然没有患病。CVS株狂犬病病毒株抗原性与ERA病毒株密切相关，但在啮齿类动物中更具有毒力。在5×105pfu的较低疫苗剂量时，Adhu5rab.gp病毒仍然提供了完全的保护作用，而少数经Adchimp68rab.gp免疫的小鼠受到感染。进一步降低疫苗剂量，结果导致Adchimp68rab.gp疫苗丧失效力。在鼻内免疫后，两种疫苗均提供了完全的保护作用(如果给予5×105pfu)。在5×104pfu的较低剂量时，Adhu5rab.gp疫苗免疫的小鼠有50％产生了渐进性疾病，而用该剂量Adchimp68rab.gp重组体免疫的那些小鼠受到保护。经表达无关抗原的两种血清型重组腺病毒或5×103pfu的任一重组腺病毒(表达狂犬病病毒糖蛋白)免疫的所有小鼠均产生了致命的狂犬病脑炎。
实施例10-针对不同人腺病毒血清型的已有免疫力对于抗狂犬病病毒抗体应答反应的影响
为了测试以前接触任一种常见的人腺病毒血清型(例如人血清型2、3、4、7和12型)是否会抑制对Adchimp68rab.gp疫苗的抗体反应，用4×108pfu的有复制能力的人血清型2、4、5、7或12型腺病毒或黑猩猩血清型68型腺病毒(后一血清型是E1缺失的)免疫C3H/He小鼠组。两周后，用Adhu5rab.gp或Adchimp68rab.gp病毒疫苗皮下接种小鼠。Adhu5rab.gp重组体所用剂量为2×105pfu/小鼠，而Adchimp68rab.gp在该低剂量皮下给予后在C3H/He小鼠中仅诱导出少量抗体应答，因而以2×107pfu/小鼠的剂量注射。2周后收获血清，用ELISA测试抗狂犬病病毒糖蛋白的抗体。在原初小鼠中，对Adhu5rab.gp的狂犬病毒特异性反应稍稍高于针对Adchimp68病毒引发的反应。在经Adhu5预先免疫的小鼠中，针对Adhu5rab.gp病毒的反应完全被抑制。在经人血清型4、2、7和12型腺病毒预先免疫的小鼠，也见到了有一些下降。在先前接触过Adchimp68病毒的小鼠中，此反应未受影响。在经同源病毒预先免疫的小鼠中，对Adchimp68rab.gp病毒的反应受到强烈抑制。先前曾遭遇人血清型2型腺病毒的小鼠显示对Adchimp68疫苗提供的狂犬病病毒抗原的抗体反应稍有下降。经任一其它血清型人腺病毒接种的小鼠在经Adchimp68rab.gp病毒免疫后，产生的抗狂犬病病毒的抗体滴度与接种前的原初小鼠相似或数量级有所增加。具体地说，经Adhu5病毒预先免疫的小鼠在用Adchimp68rab.gp构建物接种后产生了更高的抗体滴度，这可能反映了存在交叉反应性T辅助细胞促进了对转基因产物的B细胞应答反应。
为了进一步确定在相同的疫苗剂量下，Adchimp68rab.gp疫苗是否能在经Adhu5病毒预先免疫的小鼠中诱导出比Adhu5rab.gp病毒更高的抗体滴度，进行疫苗滴度实验。用4×108pfu的E1缺失型重组腺病毒给C3H/He小鼠组皮下免疫HPV-16的L1抗原。接种2周后，以不同剂量皮下给予小鼠Adhu5rab.gp或Adchimp68rab.gp病毒。2周后取小鼠血，用ELISA(结果未显示)和病毒中和试验测定针对狂犬病病毒的血清抗体滴度。两个试验均未显示出Adhu5免疫小鼠中抗Adchimp68rab.gp构建物的抗体反应有明显降低。Adhu5构建物在经同源病毒预先免疫的小鼠中表现出的抗狂犬病病毒抗体滴度严重降低取决于疫苗的剂量。对低剂量疫苗的抗体反应比对于高剂量疫苗更受影响。VNA滴度下降比ELISA滴度下降大得多。在预先经Adhu5免疫的小鼠中，最高剂量疫苗的VNA滴度减半，而在两个较低剂量疫苗下，滴度降低超过20倍。在任一测试的剂量下，Adchimp68rab.gp重组体在经Adhu5预先免疫的小鼠中诱导出了比相同剂量的Adhu5rab.gp疫苗所得滴度更高的抗狂犬病的VNA滴度。在一个保护性实验中，进一步证明，预先存在的针对Adhu5的免疫力对Adhu5疫苗的效力有不利影响。经2×105pfu的Adhu5rab.gp或Adchimp68rab.gp病毒免疫的原初小鼠在经CVS-11病毒攻击时得到完全的保护。大多数(65％)经Adhu5预先免疫的小鼠经该剂量的Adhu5rab.gp疫苗免疫后受到狂犬病病毒感染，而经相同剂量Adchimp68rab.gp病毒接种的那些小鼠受到保护。使每只小鼠的Adhu5rab.gp病毒剂量增加至2×106pfu恢复了疫苗的效力。
对常见人腺病毒血清型的预先免疫力抑制了对相应的人血清型5型重组病毒的应答，但不影响对Adchimp68重组体表达的转基因产物的抗体应答。在用有复制能力的病毒预先免疫后，Adhu5预先免疫的小鼠中的针对Adhu5rab.gp疫苗的免疫应答受到破坏，而在经其它人血清型腺病毒(如2型和4型)预先免疫的小鼠中，该免疫反应有所减弱。在同源病毒预先免疫的小鼠中，针对Adchimp68重组体的反应如预计的那样被抑制。这不具有临床意义，因为Adchimp68病毒在人群中不循环，而常见的人血清型和Adchimp68病毒不共有中和性表位。
预先接触复制缺陷型Adhu5也降低了针对Adhu5重组体所提供的狂犬病病毒糖蛋白的抗体反应，但是，该影响不如预先感染了有复制能力病毒的小鼠那样严重。预先经复制缺陷型Adhu5病毒免疫的小鼠在用Adhu5rab.gp疫苗免疫后，其血清产生了减少的但容易检测的针对狂犬病病毒的抗体。增加Adhu5rab.gp构建物的剂量能部分防止预先存在的免疫力的影响。疫苗诱导的针对狂犬病病毒的保护作用需要VNA。Adhu5疫苗预先免疫小鼠不能有效地诱导出VNA，尤其当采用较低剂量时。在Adhu5预先免疫的小鼠中，针对Adchimp68rab.gp构建物的VNA反应在所有测试剂量下均高于Adhu5疫苗，因此，不是对该疫苗在皮下免疫时效力较低的补偿。
因此，Adchimp68重组体提供了一种有吸引力的人用疫苗载体替换物。如本文所示，甚至当通过非侵入性给药途径(如通过上气道)以2×105pfu的低剂量给予时，它们也是有效的。鼻内给予的粘膜免疫还有其它优点，它有利于诱导常见的粘膜免疫系统应答(与注射疫苗所靶向的中央免疫系统相关但又有区别)。
实施例11-黑猩猩C68病毒原种和复制
下列实施例11至15提供了黑猩猩C68的其它特征鉴定。本领域技术人员会认识到，该信息能很容易地用于构建新的重组黑猩猩腺病毒构建物。
C68病毒原种得自ATCC(Rockville，MD)，使其在用添加了10％胎牛血清(FCS；Sigma或Hyclone，Logan，UT)和1％青霉素-链霉素(Sigma)的DMEM(Sigma，St.Louis，MO)培养的293细胞(ATCC)中繁殖。在添加了2％FCS的DMEM中进行293细胞感染24小时，然后加入FCS使其最终浓度为10％。当100％的细胞表现出病毒诱导的细胞病变效应(CPE)后，收获感染的细胞，收集并离心浓缩。将细胞沉淀重悬于10mMTris(Ph8.0)中，通过3轮冻融裂解。在2次氯化铯密度梯度超离心后获得病毒制备物，将病毒原种以10mM Tris/100mM NaCl/50％甘油稀释至1×1012颗粒/毫升，储存于-70℃。
实施例12-病毒基因组DNA的克隆和测序
用标准方法分离纯化的病毒制备物的基因组DNA，根据生产商说明书用一组16个限制性酶消化。除非另有所述，所有限制性和修饰性酶均购自Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN。用BamHI，PstI，SalI，HindIII或XbaI消化基因组DNA，将片段亚克隆到质粒中(K.L.Berkner和P.A.Sharp，Nucl.Acids Res.，11：6003-20(1983))。除去蛋白质后，用PacI和BamHI或PstI双消化合成的10bp PacI接头(New England Biolabs，Beverly，MA)。
从C68产生的PstI，BamHI和HindIII克隆分别如图1、部分C、D和E所述。带阴影的方框表示的片段没有被克隆，但是通过对重叠的克隆和病毒DNA直接测序(无阴影的方框)，确定了整个基因组的序列。克隆的片段如表2所述。
表2.C68质粒克隆和插入物大小
构建物名称 插入物大小(碱基对) 5′端片段 3′端片段 5′端图谱单位   3′端图谱单位
Pst-I片段
C68-Pst-A     6768     24784     31551     67.9％     86.4％
pBS：C68-Pst-B     6713     4838     11550     13.2％     31.6％
pBS：C68-Pst-C     5228     14811     20038     40.6％     54.9％
pBS：C68-Pst-D     2739     12072     14810     33.1％     40.6％
pBS：C68-Pst-E     2647     20039     22685     54.9％     32.1％
pBS：C68-Pst-F     1951     32046     33996     87.8％     93.1％
pNEB：C68-Pst-G     1874     1     1874     0.0％     5.1％
pBS：C68-Pst-H     1690     23094     24783     63.2％     67.9％
pBS：C68-Pst-I     1343     33997     35339     93.1％     96.8％
pNEB：C68-Pst-J     1180     35340     36519     96.8％     100.0％
pBS：C68-Pst-K     1111     2763     3873     7.6％     10.6％
pBS：C68-Pst-L     964     3874     4837     10.6％     13.2％
pBS：C68-Pst-M     888     1875     2762     5.1％     7.6％
pBS：C68-Pst-N     408     22686     23093     62.1％     63.2％
C68-Pst-O     380     31666     32045     86.7％     87.7％
pBS：C68-Pst-P     285     11551     11835     31.6％     32.4％
C68-Pst-Q     236     11836     12071     32.4％     33.1％
pBS：C68-Pst-R     114     31552     31665     86.4％     86.7％
BamHI片段
C68-Bam-A     16684     19836     36519     54.3％     100.0％
pBS：C68-Bam-B     8858     3582     12439     9.8％     34.1％
pBS：C68-Bam-C     4410     12440     16849     34.1％     46.1％
pBS：C68-Bam-D     2986     16850     19835     46.1％     54.3％
pNEB：C68-Bam-E     2041     1     2041     0.0％     5.6％
pBS：C68-Bam-F     1540     2042     3581     5.6％     9.8％
HindIII片段
pBR：C68-Hind-B     9150     23471     32620     64.3％     89.3％
pBS＝pBluescript SK+克隆
pNEB＝pNEB193克隆
pBR＝pBR322克隆
没有前缀＝未克隆的片段
黑猩猩腺病毒C68得自ATCC并在人293细胞上繁殖。病毒基因组DNA用已建立的步骤(A.R.Davis，等人，Gene Thera，5：1148-1152(1998))从纯化的毒粒中分离得到，并用一组限制性酶消化；数据与以前的研究(数据未显示)(G.R.Kitchingman，Gene，20：205-210(1982)；Q.Li和G.Wadell，Arch Virol.101：65-77(1998)；R.Wigand，等人，Intervirology.30：1-9(1989))相符。将跨越C68整个基因组的限制性片段亚克隆到质粒中。C68基因组的示意图如图1A所示，克隆到质粒载体中的Pst-I、BamHI和HindIII片段用无阴影的方框分别表示在图1B，1C和1D中。克隆的片段、片段大小和基因组位置也列在表2中。两个质粒克隆和基因组DNA用作测序模板。通过在两个方向上的引物前进(primer walking)对基因组进行测序，每个碱基包括在平均约四个反应中。
C68基因组长度为36521bp(见美国专利6,083,716)。与GenBank序列的初步比较表明，其在病毒基因组的整个长度上与其它人和动物腺病毒有不同程度的相似性。在C68基因组中发现了与所有前述腺病毒遗传单位(早期区域1-4和主要晚期基因)同源的区域(图1A)。根据C68和人腺病毒(已经完成测序)、Ad2(NC001405)、Ad5(NC001405)、AD12(NC001460)、AD17(NC002067)和Ad40(NC01464)之间的DNA同源性来定制克隆。测定开放读框(ORF)，根据与其它人腺病毒的同源性来鉴定基因。C68中存在所有的主要腺病毒早期和晚期基因。末端反向重复序列(ITR)的长度为130bp。
实施例13-C68序列的分析
筛选GenBank登录的所有Mastadenovirus属的每个成员(包括不同种属的分离物)的全部核苷酸序列与C68的相同性。从下列GenBank序列装配出Ad4最小基因组：右手ITR(J01964)；E1A区域(M14918)；DNA pol和pTP(X74508，74672)；VA RNA-I，II(U10682)；52，55K(U52535)；pVII(U70921)；六邻体(X84646)；内切蛋白酶(M16692)；DNA-结合蛋白(M12407)；尾丝(X76547)；右手ITR(J01965)。从下列序列产生Ad7复合基因组：Mu 3-21(X03000)；VA RNA-I，II，pTP & 52，55K(U52574)；五邻体(AD001675)；pVI，六邻体和内切蛋白酶(AF065065)；DNA-结合蛋白(K02530)；E3和尾丝区域(AF104384)；右手ITR(V0037)。
氨基酸序列对比用Clustal X产生，用Jalview(http：//www.ebi.ac.uk/～michele/jalview/)编辑，用Boxshade(http：//www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html)分析。先对公众可获得的所有人腺病毒血清型的六邻体蛋白质序列进行对比，以鉴定显示与C68最高同源性的系列。
将C68基因组中的所有的明显的开放读框的核苷酸序列和预计的氨基酸序列与已知的DNA和蛋白质序列相比较。将C68的核苷酸序列与Ad2，4，5，7，12，17和40的序列相比较。与以前的限制性分析(Kitchingman，同上；Li和Wadell，同上)一样，C68与人Ad4(亚E型)最相似。
C68的E1A区域从nt480的TATA盒延伸到1521位的poly A。共有的剪接供体和受体位点在人Ad对应物的类似位置中，28.2K和24.8K的蛋白与人Ad蛋白的大小相似。C68的最小E1A蛋白的ORF预计编码101个残基(与其它腺病毒的约60个氨基酸不同)。C68的60位残基有TTA密码子，而其它腺病毒通常具有TGA终止密码子。C68 E1A 100R蛋白的前60个残基与AD4同源物有85％的相同性。
C68基因组编码了四个E1B蛋白(20.5K，54.7K，10.1K和18.5K)以及pIX的基因。这五个C68编码蛋白的大小与其它AdE1B和pIX蛋白相似。E1B 21K蛋白的Ad4同源物只有142个氨基酸，而C68具有186个残基，其它人腺病毒有163-178个残基。C68和Ad4蛋白质在前134个氨基酸中有95％的相同性，然后相似性终止，Ad4蛋白质终止于142个氨基酸处。
C68基因组编码E2A 55K DNA结合蛋白的同源物和Iva2成熟蛋白以及E2B末端蛋白和DNA聚合酶。所有的E2区域蛋白大小与其人Ad对应物相似，E2B蛋白是尤其保守的。预计C68 E2B 123.6K DNA聚合酶有1124个残基，而预计Ad4有1193个，而具它人腺病毒有更小的聚合酶。Ad4聚合酶的残基1-71与其它任何Ad聚合酶没有相似性，该蛋白实际上可能起始于内部的ATG密码子。从氨基酸72-1193，Ad4和C68聚合酶具有有96％的氨基酸相同性。
已测序的人腺病毒E3区域迄今表现出有相当大的序列和编码能力变异。Ad40有5个E3区域基因，Ad12有6个，C68和Ad5有7个，Ad38有8个，Ad3和Ad7(B亚型人腺病毒)有9个推定的E3区域基因。Ad4 E3区域至今还未测序。与Ad35的E3区域相比，在C68基因组中鉴定到所有7个E3基因同源物(C.F.Basler和M.S.Horwitz，Virology，215：165-177(1996))。
C68 E4区域有6个ORF，每一个均与人Ad5，12和40 E4区域中的蛋白质同源。E4的命名混乱，因为C68、Ad12和Ad40的ORF2同源物约为130个残基，而在Ad5中有两个ORF编码64和67个残基的蛋白质，它们分别与较大的ORF2蛋白的氨基端和羧基端同源。在我们的命名中，省略了ORF5，因为E4区域中的第五个ORF与广泛研究的人Ad5的ORF6蛋白同源。
对C68基因中的主要晚期启动子和三联引导序列进行定位。对可能编码15个主要晚期蛋白的ORF进行了定位。所有的C68晚期蛋白的大小与其人Ad对应物相似。黑猩猩和人Ad晚期蛋白之间的氨基酸相同性百分数变化很大。预计C68尾丝蛋白与Ad4蛋白有90％的氨基酸相同性，而与其它人Ad尾丝蛋白的相似性低得多。C68的尾丝节中存在CAR结合位点。
实施例14-病毒中和性抗体试验
进行几个研究以确定C68和人腺病毒的类型特异性抗血清之间是否有交叉反应性。血清的中和活性测试如下。用293细胞作为指示细胞系，评价从正常人对象(N＝52)、猕猴(N＝52)和黑猩猩(N＝20)获得的各组血清抗Ad5和C68为基础的载体的中和性抗体。将从人、猕猴或黑猩猩个体收集到的血清56℃灭活30分钟。将各样品的系列稀释液(1∶10，1∶20，1∶40，1∶80，1∶160，1∶320，在100微升含10％FCS的DMEM中)加入等量H5.010CMVEGFP(100PFU/孔)或C68CMVEGFP病毒中，4℃培育两小时。将150微升混合物转移到96孔平底版中的2×104 293细胞上。对照孔用等量病毒感染(不加入血清)。样品在5％CO2、37℃培育48小时，在荧光显微镜下检查。将与受感染对照相比绿色荧光聚焦减少50％以下的样品稀释度记录为中和性抗体阳性。
如所预计的那样，约35％正常人显示有抗Ad5中和性抗体，该频率比在猕猴和黑猩猩血清中所见的频率要高得多。在80％的黑猩猩中发现有抗C68中和性抗体，而在仅仅2％的正常人或猕猴中发现有该抗体。非靶种类动物中的中和性抗体滴度通常很低。
为了进一步评价C68和人腺病毒载体的交叉反应性，用2×107噬斑形成单位(pfu)的Ad2，4，5，7和12以及C68免疫小鼠。2周后收获血清，测试中和Ad5或C68载体的抗体。抗Ad5载体的中和抗体仅在经Ad5免疫的动物中被检测到。重要的是，具有抗C68载体的中和性抗体的动物仅仅是经C68载体免疫的那些动物；没有一种测试的人血清型(包括Ad4)在小鼠中产生体外中和C68的抗体。
对于C68载体在人试验中的用途，重要的是人群中缺乏中和性抗体。在我们的研究中，用显示50％以上黑猩猩有中和性抗体的相同试验对50个正常人进行筛选，结果没有检测到任何显著的中和性抗体(＞1∶10)。另外，经多种人Ad血清型(包括Ad4)免疫的小鼠血清不能中和C68感染。
在另一研究中，给一组10至20个ICR小鼠皮下(s.c.)、鼻内(i.n)或口服(os)接种不同剂量的Adhu5rab.gp或AdC68rab.gp疫苗。21天后取小鼠血，测定病毒中和性抗体(VNA)并表示成国际单位。接种4周后用10倍平均致死剂量的CVS-24病毒直接加入中枢神经系统来攻击小鼠。
                                 病毒中和抗体滴度(攻击后存活百分数)
疫苗剂量                5×107           5×106        5×105     5×104
Adhu5rab.gp，s.c.       972(100)          324(100)       108(100)     12(100)
AdC68rab.gp，s.c.       240(100)          36(100)        12(30)       8(80)
Adhu5rab.gp，i.n.       nt                162(100)       162(100)     18(50)
AdC68rab.gp，i.n.       nt                54(100)        162(100)     18(50)
                        2×107           2×106        2×105     2×104
Adhu5rab.gp，os         108(100)          54(88)         18(80)       4(30)
AdC68rab.gp，os         108(100)          36(78)         12(55)       0.2(0)
这些数据证明AdC68构建物在低剂量鼻内给药时出人意料地诱导了比人5型更好的保护性抗体应答。
实施例15-六邻体蛋白的结构分析
C68和人血清型之间缺少中和性抗体迫使我们更小心地评价推测携带类型特异性表位的六邻体区域的结构差异。以前的研究提示，这些表位位于Crawford-Miksza和Schnurr(J.Virol，70：1836-1844(1996))所测定的六邻体的7个超变区中。图2显示了C68以及几种人腺病毒之间的六邻体蛋白的氨基酸序列比较。实际上，C68在这些超变序列的显著区域中基本上是不相似的。进行了更详细的C68六邻体三维结构模型设计，以描绘其独特的序列。根据Ad2和Ad5的六邻体的x-射线晶体结构产生了C68和Ad4的六邻体结构模型。
对Ad5六邻体的X-射线晶体结构(Protein Data Bank identifier 1RUX)(J.J.Rux和R.M.Burnett，Mol.Ther.1：18-30(2000))以及Ad2的六邻体的X-射线晶体结构(F.K.Athappilly，等人，J.Mol.Biol.，242：430-455(1994))进一步精细化，产生得到目前的六邻体模型(Rux和Burnett，待发表)。先用Swiss-PdbViewer蛋白模型环境(N.Guez和M.C.Peitsch，Electrophoresis，18：2714-2723(1997))产生同源性C68和Ad4六邻体的模型。用自动化步骤将C68和Ad4六邻体氨基酸序列与Ad2和Ad5六邻体晶体结构进行对比。用序列对比来指导将模型序列穿在已知的分子结构上。从一个侧链启动子(side chainpromoter)文库中选出已知结构中未见的残基的侧链位置。然后，通过将空隙移到外露的可变区中和优化侧链的包装来人工调节这些初始分子模型，以改进自动化序列对比。从已知的环结构文库选出Ad2和Ad5模板结构中未观察到的外部环节段位置，或进行人工拟合。用分子机制程序CHARMM(B.R.Brooks，等人，J.Comp.Chem.，4：187-217(1983))通过能量最小化来进一步精细化各模型的构型。然后排列对比C68和Ad4六邻体模型的结构，计算新的序列排列对比。将两个经结构排列的对比六邻体序列之间的差异用于同源模型的彩色图象。输出Swiss-PdbViewer程序中形成的图象，并用Vision Ray Tracer程序(POV-Ray 2000，3.1g版)的Persistence值表示。
虽然整个C68序列与Ad4六邻体非常相似，但是此两个序列之间的差别主要集中在DE1和FG1环，而这些区域含有所有7个超变区。分别来自不同亚基的DE1、FG1和FG2环与在三聚物分子顶部形成塔形结构域(tower domain)密切相关。六邻体塔形成了病毒粒子外表面的大部分，并且是抗体的结合位点。由于六邻体的侧面和底部和衣壳包装在一起，这些区域被屏蔽而不和抗体结合，它们的序列是保守的。相反，C68和Ad4的序列在六邻体塔中有很大的不同。这直接解释了为何抗两种病毒之一的抗体不发生交叉反应的原因。
本说明书引述的所有出版物以及序列表均纳入本文作为参考。尽管本发明参照特别佳的方案进行了描述，但可以理解，可不脱离本发明精神而对本发明作改动。这些改变均被认为在所附权利要求的范围内。
                                       序列表
<110>威斯特解剖及生物研究所(The Wistar Institute of Anatomy and Biology)
     宾夕法尼亚州立大学托管会(The Trustees of The University of Pennsylvania)
     H.C.J.埃特尔(ERTL，Hildegund，C.，J.)
     J.M.威尔逊(WILSON，James，M.)
<120>诱导细胞毒性免疫应答的方法和用于该方法的重组猿猴腺病毒组合物
<130>WST104A/UPNN2628A
<150>US60/300,131
<151>2001-06-22
<150>US60/304,843
<151>2001-07-12
<160>13
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽，携带H-2d单体型免疫优势CD8+T细胞表位
<400>1
Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile
1               5
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>狂犬病病毒糖蛋白的5′引物
<400>2
aagcatttcc gcccaacac                                                   19
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>狂犬病病毒糖蛋白的3’引物
<400>3
ggttagtgga gcagtaggta ga                                                22
<210>4
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>戊二醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的5’引物
<400>4
ggtgaaggtc ggtgtgaacg gattt                                             25
<210>5
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>GAPDH的3’引物
<400>5
aatgccaaag ttgtcatgga tgacc                                             25
<210>6
<211>7228
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>修饰的HIV-1 gag序列
<220>
<221>CDS
<222>(729)..(1820)
<223>
<400>6
tggaagggct aatttggtcc caaaaaagac aagagatcct tgatctgtgg atctaccaca    60
cacaaggcta cttccctgat tggcagaact acacaccagg gccagggatc agatatccac    120
tgacctttgg atggtgcttc aagttagtac cagttgaacc agagcaagta gaagaggcca    180
aataaggaga gaagaacagc ttgttacacc ctatgagcca gcatgggatg gaggacccgg    240
agggagaagt attagtgtgg aagtttgaca gcctcctagc atttcgtcac atggcccgag    300
agctgcatcc ggagtactac aaagactgct gacatcgagc tttctacaag ggactttccg    360
ctggggactt tccagggagg tgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat    420
gctacatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga    480
gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct    540
tgagtgctca aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc    600
agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg cccgaacagg gacttgaaag    660
cgaaagtaaa gccagaggag atctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcgtcg    720
acagagag atg ggt gcg aga gcg tca gta tta agc ggg gga gaa tta gat     770
         Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp
         1               5                   10
cga tgg gaa aaa att cgg tta agg cca ggg gga aag aag aag tac aag      818
Arg Trp Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys
15                  20                  25                  30
cta aag cac atc gta tgg gca agc agg gag cta gaa cga ttc gca gtt      866
Leu Lys His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val
                35                  40                  45
aat cct ggc ctg tta gaa aca tca gaa ggc tgt aga caa ata ctg gga      914
Asn Pro Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gln Ile Leu Gly
            50                  55                  60
cag cta caa cca tcc ctt cag aca gga tca gag gag ctt cga tca cta      962
Gln Leu Gln Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu Arg Ser Leu
        65                  70                  75
tac aac aca gta gca acc ctc tat tgt gtg cac cag cgg atc gag atc      1010
Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Gln Arg Ile Glu Ile
    80                  85                  90
aag gac acc aag gaa gct tta gac aag ata gag gaa gag caa aac aag      1058
Lys Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu Glu Glu Gln Asn Lys
95                  100                 105                 110
tcc aag aag aag gcc cag cag gca gca gct gac aca gga cac agc aat      1106
Ser Lys Lys Lys Ala Gln Gln Ala Ala Ala Asp Thr Gly His Ser Asn
                115                 120                 125
cag gtc agc caa aat tac cct ata gtg cag aac atc cag ggg caa atg      1154
Gln Val Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val Gln Asn Ile Gln Gly Gln Met
            130                 135                 140
gta cat cag gcc ata tca cct aga act tta aat gca tgg gta aaa gta      1202
Val His Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val
        145                 150                 155
gta gaa gag aag gct ttc agc cca gaa gtg ata ccc atg ttt tca gca      1250
Val Glu Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala
    160                 165                 170
tta tca gaa gga gcc acc cca cag gac ctg aac acg atg ttg aac acc      1298
Leu Ser Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr
175                 180                 185                 190
gtg ggg gga cat caa gca gcc atg caa atg tta aaa gag acc atc aat      1346
Val Gly Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn
                195                 200                 205
gag gaa gct gca gaa tgg gat aga gtg cat cca gtg cat gca ggg cct      1394
Glu Glu Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro
            210                 215                 220
att gca cca ggc cag atg aga gaa cca agg gga agt gac ata gca gga      1442
Ile Ala Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly
        225                 230                 235
act act agt acc ctt cag gaa caa ata gga tgg atg aca aat aat cca      1490
Thr Thr Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro
    240                 245                 250
cct atc cca gta gga gag atc tac aag agg tgg ata atc ctg gga ttg      1538
Pro Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu
255                 260                 265                 270
aac aag atc gtg agg atg tat agc cct acc agc att ctg gac ata aga      1586
Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile Arg
                275                 280                 285
caa gga cca aag gaa ccc ttt aga gac tat gta gac cgg ttc tat aaa      1634
Gln Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys
            290                 295                 300
act cta aga gct gag caa gct tca cag gag gta aaa aat tgg atg aca      1682
Thr Leu Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr
        305                 310                 315
gaa acc ttg ttg gtc caa aat gcg aac cca gat tgt aag acc atc ctg      1730
Glu Thr Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu
    320                 325                 330
aag gct ctc ggc cca gcg gct aca cta gaa gaa atg atg aca gca tgt      1778
Lys Ala Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys
335                 340                 345                 350
cag gga gta gga gga ccc ggc cat aag gca aga gtt ttg tag              1820
Gln Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu
                355                 360
ggatccacta gttctagact cgaggggggg cccggtacct ttaagaccaa tgacttacaa    1880
ggcagctgta gatcttagcc actttttaaa agaaaagggg ggactggaag ggctaattca    1940
ctcccaaaga agacaagata tccttgatct gtggatctac cacacacaag gctacttccc    2000
tgattggcag aactacacac cagggccagg ggtcagatat ccactgacct ttggatggtg    2060
ctacaagcta gtaccagttg agccagataa ggtagaagag gccaataaag gagagaacac    2120
cagcttgtta caccctgtga gcctgcatgg aatggatgac cctgagagag aagtgttaga    2180
gtggaggttt gacagccgcc tagcatttca tcacgtggcc cgagagctgc atccggagta    2240
cttcaagaac tgctgacatc gagcttgcta caagggactt tccgctgggg actttccagg    2300
gaggcgtggc ctgggcggga ctggggagtg gcgagccctc agatgctgca tataagcagc    2360
tgctttttgc ctgtactggg tctctctggt tagaccagat ctgagcctgg gagctctctg    2420
gctaactagg gaacccactg cttaagcctc aataaagctt gccttgagtg cttcaagtag    2480
tgtgtgcccg tctgttgtgt gactctggta actagagatc cctcagaccc ttttagtcag    2540
tgtggaaaat ctctagcacc ccccaggagg tagaggttgc agtgagccaa gatcgcgcca    2600
ctgcattcca gcctgggcaa gaaaacaaga ctgtctaaaa taataataat aagttaaggg    2660
tattaaatat atttatacat ggaggtcata aaaatatata tatttgggct gggcgcagtg    2720
gctcacacct gcgcccggcc ctttgggagg ccgaggcagg tggatcacct gagtttggga    2780
gttccagacc agcctgacca acatggagaa accccttctc tgtgtatttt tagtagattt    2840
tattttatgt gtattttatt cacaggtatt tctggaaaac tgaaactgtt tttcctctac    2900
tctgatacca caagaatcat cagcacagag gaagacttct gtgatcaaat gtggtgggag    2960
agggaggttt tcaccagcac atgagcagtc agttctgccg cagactcggc gggtgtcctt    3020
cggttcagtt ccaacaccgc ctgcctggag agaggtcaga ccacagggtg agggctcagt    3080
ccccaagaca taaacaccca agacataaac acccaacagg tccaccccgc ctgctgccca    3140
ggcagagccg attcaccaag acgggaatta ggatagagaa agagtaagtc acacagagcc    3200
ggctgtgcgg gagaacggag ttctattatg actcaaatca gtctccccaa gcattcgggg    3260
atcagagttt ttaaggataa cttagtgtgt agggggccag tgagttggag atgaaagcgt    3320
agggagtcga aggtgtcctt ttgcgccgag tcagttcctg ggtgggggcc acaagatcgg    3380
atgagccagt ttatcaatcc gggggtgcca gctgatccat ggagtgcagg gtctgcaaaa    3440
tatctcaagc actgattgat cttaggtttt acaatagtga tgttacccca ggaacaattt    3500
ggggaaggtc agaatcttgt agcctgtagc tgcatgactc ctaaaccata atttcttttt    3560
tgtttttttt tttttatttt tgagacaggg tctcactctg tcacctaggc tggagtgcag    3620
tggtgcaatc acagctcact gcagccccta gagcggccgc caccgcggtg gagctccaat    3680
tcgccctata gtgagtcgta ttacaattca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg    3740
gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg    3800
cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc    3860
gaatggcgcg aaattgtaaa cgttaatatt ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa    3920
atcagctcat tttttaacca ataggccgaa atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa    3980
tagaccgaga tagggttgag tgttgttcca gtttggaaca agagtccact attaaagaac    4040
gtggactcca acgtcaaagg gcgaaaaace gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa    4100
ccatcaccct aatcaagttt tttggggtcg aggtgccgta aagcactaaa tcggaaccct    4160
aaagggagcc cccgatttag agcttgacgg ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaaggaa    4220
gggaagaaag cgaaaggagc gggcgctagg gcgctggcaa gtgtagcggt cacgctgcgc    4280
gtaaccacca cacccgccgc gcttaatgcg ccgctacagg gcgcgtccca ggtggcactt    4340
ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt    4400
atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta    4460
tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg    4520
tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac    4580
gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg    4640
aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc    4700
gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg    4760
ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat    4820
gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg    4880
gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg    4940
atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc    5000
ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt    5060
cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct    5120
cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc    5180
gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca    5240
cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct    5300
cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt    5360
taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga    5420
ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca    5480
aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac    5540
caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg    5600
taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag    5660
gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac    5720
cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt    5780
taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg    5840
agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc    5900
ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc    5960
gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc    6020
acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa    6080
acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt    6140
tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg    6200
ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag    6260
agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc    6320
acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc    6380
tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa    6440
ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagctcg    6500
gaattaaccc tcactaaagg gaacaaaagc tgctgcaggg tccctaactg ccaagcccca    6560
cagtgtgccc tgaggctgcc ccttccttct agcggctgcc cccactcggc tttgctttcc  6620
ctagtttcag ttacttgcgt tcagccaagg tctgaaacta ggtgcgcaca gagcggtaag  6680
actgcgagag aaagagacca gctttacagg gggtttatca cagtgcaccc tgacagtcgt  6740
cagcctcaca gggggtttat cacattgcac cctgacagtc gtcagcctca cagggggttt  6800
atcacagtgc acccttacaa tcattccatt tgattcacaa tttttttagt ctctactgtg  6860
cctaacttgt aagttaaatt tgatcagagg tgtgttccca gaggggaaaa cagtatatac  6920
agggttcagt actatcgcat ttcaggcctc cacctgggtc ttggaatgtg tcccccgagg  6980
ggtgatgact acctcagttg gatctccaca ggtcacagtg acacaagata accaagacac  7040
ctcccaaggc taccacaatg ggccgccctc cacgtgcaca tggccggagg aactgccatg  7100
tcggaggtgc aagcacacct gcgcatcaga gtccttggtg tggagggagg gaccagcgca  7160
gcttccagcc atccacctga tgaacagaac ctagggaaag ccccagttct acttacacca  7220
ggaaaggc                                                           7228
<210>7
<211>363
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>修饰的HIV-1 gag序列
<400>7
Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp
1               5                   10                  15
Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys
            20                  25                  30
His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro
        35                  40                  45
Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gln Ile Leu Gly Gln Leu
    50                  55                  60
Gln Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu Arg Ser Leu Tyr Asn
65                  70                  75                  80
Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Gln Arg Ile Glu Ile Lys Asp
                85                  90                  95
Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu Glu Glu Gln Asn Lys Ser Lys
            100                 105                 110
Lys Lys Ala Gln Gln Ala Ala Ala Asp Thr Gly His Ser Asn Gln Val
        115                 120                 125
Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val Gln Asn Ile Gln Gly Gln Met Val His
    130                 135                 140
Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu
145                 150                 155                 160
Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser
                165                 170                 175
Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly
            180                 185                 190
Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu
        195                 200                 205
Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala
    210                 215                 220
Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr
225                 230                 235                 240
Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro Ile
                245                 250                 255
Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys
            260                 265                 270
Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly
        275                 280                 285
Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu
    290                 295                 300
Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr
305                 310                 315                 320
Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala
                325                 330                 335
Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly
            340                 345                 350
Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu
        355                 360
<210>8
<211>311
<212>PRT
<213>黑猩猩型腺病毒
<400>8
Asn Thr Cys Gln Trp Thr Tyr Lys Ala Asp Gly Glu Thr Ala Thr Glu
1               5                   10                  15
Lys Thr Tyr Thr Tyr Gly Asn Ala Pro Val Gln Gly Ile Asn Ile Thr
            20                  25                  30
Lys Asp Gly Ile Gln Leu Gly Thr Asp Thr Asp Asp Gln Pro Ile Tyr
        35                  40                  45
Ala Asp Lys Thr Tyr Gln Pro Glu Pro Gln Val Gly Asp Ala Glu Trp
    50                  55                  60
His Asp Ile Thr Gly Thr Asp Glu Lys Tyr Gly Gly Arg Ala Leu Lys
65                  70                  75                  80
Pro Asp Thr Lys Met Lys Pro Cys Tyr Gly Ser Phe Ala Lys Pro Thr
                85                  90                  95
Asn Lys Glu Gly Gly Gln Ala Asn Val Lys Thr Gly Thr Gly Thr Thr
            100                 105                 110
Lys Glu Tyr Asp Ile Asp Met Ala Phe Phe Asp Asn Arg Ser Ala Ala
        115                 120                 125
Ala Ala Gly Leu Ala Pro Glu Ile Val Leu Tyr Thr Glu Asn Val Asp
    130                 135                 140
Leu Glu Thr Pro Asp Thr His Ile Val Tyr Lys Ala Gly Thr Asp Asp
145                 150                 155                 160
Ser Ser Ser Ser Ile Asn Leu Gly Gln Gln Ala Met Pro Asn Arg Pro
                165                 170                 175
Val Tyr Ile Gly Phe Arg Asp Asn Phe Ile Gly Leu Met Tyr Tyr Asn
            180                 185                 190
Ser Thr Gly Asn Met Gly Val Leu Ala Gly Gln Ala Ser Gln Leu Asn
        195                 200                 205
Ala Val Val Asp Leu Gln Asp Arg Asn Thr Glu Leu Ser Tyr Gln Leu
    210                 215                 220
Leu Leu Asp Ser Leu Gly Asp Arg Thr Arg Tyr Phe Ser Met Trp Asn
225                 230                 235                 240
Gln Ala Val Asp Ser Tyr Asp Pro Asp Val Arg Ile Ile Glu Asn His
                245                 250                 255
Gly Val Glu Asp Glu Leu Pro Asn Tyr Cys Phe Pro Leu Asp Ala Val
            260                 265                 270
Gly Arg Thr Asp Thr Tyr Gln Gly Ile Lys Ala Asn Gly Thr Asp Gln
        275                 280                 285
Thr Thr Trp Thr Lys Asp Asp Ser Val Asn Asp Ala Asn Glu Ile Gly
    290                 295                 300
Lys Gly Asn Pro Phe Ala Met
305                 310
<210>9
<211>314
<212>PRT
<213>人4型腺病毒
<400>9
Asn Thr Cys Gln Trp Lys Asp Ser Asp Ser Lys Met His Thr Phe Gly
1                5                  10                  15
Ala Ala Ala Met Pro Gly Val Thr Gly Lys Lys Ile Glu Ala Asp Gly
            20                  25                  30
Leu Pro Ile Arg Ile Asp Ser Thr Ser Gly Thr Asp Thr Val Ile Tyr
        35                  40                  45
Ala Asp Lys Thr Phe Gln Pro Glu Pro Gln Val Gly Asn Asp Ser Trp
    50                  55                  60
Val Asp Thr Asn Gly Ala Glu Glu Lys Tyr Gly Gly Arg Ala Leu Lys
65                  70                  75                  80
Asp Thr Thr Lys Met Asn Pro Cys Tyr Gly Ser Phe Ala Lys Pro Thr
                85                  90                  95
Asn Lys Glu Gly Gly Gln Ala Asn Leu Lys Asp Ser Glu Pro Ala Ala
            100                 105                 110
Thr Thr Pro Asn Tyr Asp Ile Asp Leu Ala Phe Phe Asp Ser Lys Thr
        115                 120                 125
Ile Val Ala Asn Tyr Asp Pro Asp Ile Val Met Tyr Thr Glu Asn Val
    130                 135                 140
Asp Leu Gln Thr Pro Asp Thr His Ile Val Tyr Lys Pro Gly Thr Glu
145                 150                 155                 160
Asp Thr Ser Ser Glu Ser Asn Leu Gly Gln Gln Ala Met Pro Asn Arg
                165                 170                 175
Pro Asn Tyr Ile Gly Phe Arg Asp Asn Phe Ile Gly Leu Met Tyr Tyr
            180                 185                 190
Asn Ser Thr Gly Asn Met Gly Val Leu Ala Gly Gln Ala Ser Gln Leu
        195                 200                 205
Asn Ala Val Val Asp Leu Gln Asp Arg Asn Thr Glu Leu Ser Tyr Gln
    210                 215                 220
Leu Leu Leu Asp Ser Leu Gly Asp Arg Thr Arg Tyr Phe Ser Met Trp
225                 230                 235                 240
Asn Gln Ala Val Asp Ser Tyr Asp Pro Asp Val Arg Ile Ile Glu Ash
                245                 250                 255
His Gly Val Glu Asp Glu Leu Pro Asn Tyr Cys Phe Pro Leu Asn Gly
            260                 265                 270
Val Gly Leu Thr Asp Thr Tyr Gln Gly Val Lys Val Lys Thr Asp Ala
        275                 280                 285
Glv Ser Glu Lys Trp Asp Lys Asp Asp Thr Thr Val Ser Asn Ala Asn
    290                 295                 300
Glu Ile His Val Gly Asn Pro Phe Ala Met
305                 310
<210>10
<211>318
<212>PRT
<213>人16型腺病毒
<400>10
Asn Thr Cys Gln Trp Lys Asp Ser Asp Ser Lys Met His Thr Phe Gly
1               5                   10                  15
Val Ala Ala Met Pro Gly Val Thr Gly Lys Lys Ile Glu Ala Asp Gly
            20                  25                  30
Leu Pro Ile Gly Ile Asp Ser Thr Ser Gly Thr Asp Thr Val Ile Tyr
        35                  40                  45
Ala Asp Lys Thr Phe Gln Pro Glu Pro Gln Val Gly Asn Ala Ser Trp
    50                  55                  60
Val Asp Ala Asn Gly Thr Glu Glu Lys Tyr Gly Gly Arg Ala Leu Lys
65                  70                  75                  80
Asp Thr Thr Lys Met Lys Pro Cys Tyr Gly Ser Phe Ala Lys Pro Thr
                85                  90                  95
Asn Lys Glu Gly Gly Gln Ala Asn Leu Lys Asp Ser Glu Thr Ala Ala
            100                 105                 110
Thr Thr Pro Asn Tyr Asp Ile Asp Leu Ala Phe Phe Asp Asn Lys Asn
        115                 120                 125
Ile Ala Ala Asn Tyr Asp Pro Asp Ile Val Met Tyr Thr Glu Asn Val
    130                 135                 140
Asp Leu Gln Thr Pro Asp Thr His Ile Val Tyr Lys Pro Gly Thr Glu
145                 150                 155                 160
Asp Thr Ser Ser Glu Ser Asn Leu Gly Gln Gln Ala Met Pro Asn Arg
                165                 170                 175
Pro Asn Tyr Ile Gly Phe Arg Asp Asn Phe Ile Gly Leu Met Tyr Tyr
            180                 185                 190
Asn Ser Thr Gly Ash Met Gly Val Leu Ala Gly Gln Ala Ser Gln Leu
        195                 200                 205
Asn Ala Val Val Asp Leu Gln Asp Arg Asn Thr Glu Leu Ser Tyr Gln
    210                 215                 220
Leu Leu Leu Asp Ser Leu Gly Asp Arg Thr Arg Tyr Phe Ser Met Trp
225                 230                 235                 240
Asn Gln Ala Val Asp Ser Tyr Asp Pro Asp Val Arg Ile Ile Glu Asn
                245                 250                 255
His Gly Val Glu Asp Glu Leu Pro Asn Tyr Cys Phe Pro Leu Asn Gly
            260                 265                 270
Val Gly Phe Thr Asp Thr Tyr Gln Gly Val Lys Val Lys Thr Asp Ala
        275                 280                 285
Val Ala Gly Thr Ser Gly Thr Gln Trp Asp Lys Asp Asp Thr Thr Val
    290                 295                 300
Ser Thr Ala Asn Glu Ile His Gly Gly Asn Pro Phe Ala Met
305                 310                 315
<210>11
<211>323
<212>PRT
<213>人3型腺病毒
<400>11
Asn Thr Ser Gln Trp Ile Val Thr Thr Asn Gly Asp Asn Ala Val Thr
1               5                   10                  15
Thr Thr Thr Asn Thr Phe Gly Ile Ala Ser Met Lys Gly Gly Asn Ile
            20                  25                  30
Thr Lys Glu Gly Leu Gln Ile Gly Lys Asp Ile Thr Thr Thr Glu Gly
        35                  40                  45
Glu Glu Lys Pro Ile Tyr Ala Asp Lys Thr Tyr Gln Pro Glu Pro Gln
    50                  55                  60
Val Gly Glu Glu Ser Trp Thr Asp Thr Asp Gly Thr Asn Glu Lys Phe
65                  70                  75                  80
Gly Gly Arg Ala Leu Lys Pro Ala Thr Asn Met Lys Pro Cys Tyr Gly
                85                  90                  95
Ser Phe Ala Arg Pro Thr Asn Ile Lys Gly Gly Gln Ala Lys Asn Arg
            100                 105                 110
Lys Val Lys Pro Thr Thr Glu Gly Gly Val Glu Thr Glu Glu Pro Asp
        115                 120                 125
Ile Asp Met Glu Phe Phe Asp Gly Arg Asp Ala Val Ala Gly Ala Leu
    130                 135                 140
Ala Pro Glu Ile Val Leu Tyr Thr Glu Asn Val Asn Leu Glu Thr Pro
145                 150                 155                 160
Asp Ser His Val Val Tyr Lys Pro Glu Thr Ser Asn Asn Ser His Ala
                165                 170                 175
Asn Leu Gly Gln Gln Ala Met Pro Asn Arg Pro Asn Tyr Ile Gly Phe
            180                 185                 190
Arg Asp Asn Phe Val Gly Leu Met Tyr Tyr Asn Ser Thr Gly Asn Met
        195                 200                 205
Gly Val Leu Ala Gly Gln Ala Ser Gln Leu Asn Ala Val Val Asp Leu
    210                 215                 220
Gln Asp Arg Asn Thr Glu Leu Ser Tyr Gln Leu Leu Leu Asp Ser Leu
225                 230                 235                 240
Gly Asp Arg Thr Arg Tyr Phe Ser Met Trp Asn Gln Ala Val Asp Ser
                245                 250                 255
Tyr Asp Pro Asp Val Arg Ile Ile Glu Asn His Gly Ile Glu Asp Glu
            260                 265                 270
Leu Pro Asn Tyr Cys Phe Pro Leu Asn Gly Ile Gly Pro Gly His Thr
        275                 280                 285
Tyr Gln Gly Ile Lys Lys Val Lys Thr Asp Asp Thr Asn Gly Trp Glu
    290                 295                 300
Lys Asp Ala Asn Val Ala Pro Ala Asn Glu Ile Thr Ile Gly Asn Asn
305                 310                 315                 320
Leu Ala Met
<210>12
<211>315
<212>PRT
<213>人7型腺病毒
<400>12
Asn Thr Ser Gln Trp Ile Val Thr Ala Gly Glu Glu Arg Ala Val Thr
1               5                   10                  15
Thr Thr Thr Asn Thr Phe Gly Ile Ala Ser Met Lys Gly Asp Asn Ile
            20                  25                  30
Thr Lys Glu Gly Leu Glu Ile Gly Lys Asp Ile Thr Ala Asp Asn Lys
        35                  40                  45
Pro Ile Tyr Ala Asp Lys Thr Tyr Gln Pro Glu Pro Gln Val Gly Glu
    50                  55                  60
Glu Ser Trp Thr Asp Thr Asp Gly Thr Asn Glu Lys Phe Gly Gly Arg
65                  70                  75              80
Ala Leu Lys Pro Ala Thr Lys Met Lys Pro Cys Tyr Gly Ser Phe Ala
                85                  90              95
Arg Pro Thr Asn Ile Lys Gly Gly Gln Ala Lys Ash Arg Lys Val Lys
            100                 105             110
Pro Thr Glu Gly Asp Val Glu Thr Glu Glu Pro Asp Ile Asp Met Glu
        115                 120             125
Phe Phe Asp Gly Arg Glu Ala Ala Asp Ala Phe Ser Pro Glu Ile Val
    130                 135             140
Leu Tyr Thr Glu Asn Val Asn Leu Glu Thr Pro Asp Ser His Val Val
145                 150             155                 160
Tyr Lys Pro Gly Thr Ser Asp Asp Asn Ser His Ala Asn Leu Gly Gln
                165             170                 175
Gln Ala Met Pro Asn Arg Pro Asn Tyr Ile Gly Phe Arg Asp Asn Phe
            180             185                 190
Val Gly Leu Met Tyr Tyr Asn Ser Thr Gly Asn Met Gly Val Leu Ala
        195             200                 205
Gly Gln Ala Ser Gln Leu Asn Ala Val Val Asp Leu Gln Asp Arg Asn
    210                 215                 220
Thr Glu Leu Ser Tyr Gln Leu Leu Leu Asp Ser Leu Gly Asp Arg Thr
225                 230                 235                 240
Arg Tyr Phe Ser Met Trp Asn Gln Ala Val Asp Ser Tyr Asp Pro Asp
                245                 250                 255
Val Arg Ile Ile Glu Asn His Gly Ile Glu Asp Glu Leu Pro Asn Tyr
            260                 265                 270
Cys Phe Pro Leu Asp Gly Ile Gly Pro Ala Lys Thr Tyr Gln Gly IIe
        275                 280                 285
Lys Ser Lys Asp Asn Gly Trp Glu Lys Asp Asp Asn Val Ser Lys Ser
    290                 295                 300
Asn Glu Ile Ala Ile Gly Asn Asn Gln Ala Met
305                 310                 315
<210>13
<211>345
<212>PRT
<213>人2型腺病毒
<400>13
Asn Ser Cys Glu Trp Glu Gln Thr Glu Asp Ser Gly Arg Ala Val Ala
1               5                   10                  15
Glu Asp Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
            20                  25                  30
Gln Asn Ala Arg Asp Gln Ala Thr Lys Lys Thr His Val Tyr Ala Gln
        35                  40                  45
Ala Pro Leu Ser Gly Glu Thr Leu Thr Lys Ser Gly Leu Gln Ile Gly
    50                  55                  60
Ser Lys Asn Ala Glu Thr Gln Ala Lys Pro Val Tyr Ala Asp Pro Ser
65                  70                  75                  80
Tyr Gln Pro Glu Pro Gln Ile Gly Glu Ser Gln Trp Asn Glu Ala Asp
                85                  90                  95
Ala Asn Ala Ala Gly Gly Arg Val Leu Lys Lys Thr Thr Pro Met Lys
            100                 105                 110
Pro Tyr Gly Ser Tyr Ala Arg Pro Thr Asn Pro Phe Gly Gly Gln Ser
        115                 120                 125
Val Leu Val Pro Asp Glu Lys Gly Val Pro Leu Pro Lys Val Asp Leu
    130                 135                 140
Gln Phe Phe Ser Asn Thr Thr Ser Leu Asn Asp Arg Gln Gly Asn Ala
145                 150                 155                 160
Thr Lys Pro Lys Val Val Leu Tyr Ser Glu Asp Val Asn Met Glu Thr
                165                 170                 175
Pro Asp Thr His Leu Ser Tyr Lys Pro Gly Lys Gly Asp Glu Asn Ser
            180                 185                 190
Lys Ala Met Leu Gly Gln Gln Ser Met Pro Asn Arg Pro Asn Tyr Ile
        195                 200                 205
Ala Phe Arg Asp Asn Phe Ile Gly Leu Met Tyr Tyr Asn Ser Thr Gly
    210                 215                 220
Asn Met Gly Val Leu Ala Gly Gln Ala Ser Gln Leu Asn Ala Val Val
225                 230                 235                 240
Asp Leu Gln Asp Arg Asn Thr Glu Leu Ser Tyr Gln Leu Leu Leu Asp
                245                 250                 255
Ser Ile Gly Asp Arg Thr Arg Tyr Phe Ser Met Trp Asn Gln Ala Val
            260                 265                 270
Asp Ser Tyr Asp Pro Asp Val Arg Ile Ile Glu Asn His Gly Thr Glu
        275                 280                 285
Asp Glu Leu Pro Asn Tyr Cys Phe Pro Leu Gly Gly Ile Gly Val Thr
    290                 295                 300
Asp Thr Tyr Gln Ala Ile Lys Ala Asn Gly Asn Gly Ser Gly Asp Asn
305                 310                 315                 320
Gly Asp Thr Thr Trp Thr Lys Asp Glu Thr Phe Ala Thr Arg Asn Glu
                325                 330                 335
Ile Gly Val Gly Asn Asn Phe Ala Met
            340                 345

Claims (21)

1.重组腺病毒在制备药物中的用途，该药物用来在对象中诱导对免疫原的T细胞应答，其特征在于，
在皮下输送时，所述重组猿猴腺病毒优先诱导对免疫原的CD8+T细胞应答，
其特征还在于，所述重组腺病毒包含编码免疫原的核酸分子，该核酸分子在指导免疫原在对象体内表达的调控序列的控制之下。
2.重组腺病毒在制备药物中的用途，该药物用来在对象中诱导对免疫原的抗体应答，其特征在于，
在低剂量输送给粘膜时，所述重组猿猴腺病毒优先诱导对免疫原的抗体应答，
其特征还在于，所述重组腺病毒包含编码免疫原的核酸分子，该核酸分子在指导免疫原在对象体内表达的调控序列的控制之下。
3.一种在对象中优先诱导对免疫原的CD8+T细胞应答的方法，所述方法包括向对象输送重组猿猴腺病毒的步骤，所述腺病毒包含编码免疫原的核酸分子，该核酸分子在指导免疫原在对象体内表达的调控序列的控制之下。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述重组猿猴腺病毒通过皮下输送。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述重组猿猴腺病毒以低剂量输送。
6.根据权利要求3-5任一所述的方法，其中所述重组猿猴腺病毒以104pfu至106pfu之间的有效剂量输送。
7.根据权利要求3-6任一所述的方法，其中所述重组猿猴腺病毒是重组C68黑猩猩腺病毒。
8.根据权利要求3-7任一所述的方法，其中免疫原选自病原性病毒衍生的肽、多肽或蛋白质，其中病毒选自人免疫缺陷病毒-1、人乳头瘤病毒和狂犬病病毒。
9.一种用于诱导针对人免疫缺陷病毒的细胞溶解性免疫应答的免疫原性组合物，该组合物包含：
(a)重组猿猴腺病毒，其含有编码经修饰的人免疫缺陷病毒-1的gag蛋白的优化的核酸序列；和
(b)生理上相容的载体。
10.一种在哺乳动物中诱导抗人免疫缺陷病毒的CD8+T细胞应答的方法，该方法包括将权利要求9的组合物给予哺乳动物。
11.权利要求9所述的免疫原性组合物在制备药物中的用途，该药物用于在哺乳动物中诱导抗人免疫缺陷病毒的CD8+T细胞应答。
12.一种在哺乳动物中诱导抗人乳头瘤病毒的CD8+T细胞应答的方法，该方法包括将重组猿猴腺病毒给予该哺乳动物，其中该重组腺病毒编码人乳头瘤病毒衍生的免疫原性蛋白。
13.编码人乳头瘤病毒衍生的免疫原性蛋白的重组猿猴腺病毒在制备药物中的用途，该药物用于在哺乳动物中诱导抗人乳头瘤病毒的CD8+T细胞应答。
14.编码狂犬病病毒衍生的免疫原性蛋白的重组猿猴腺病毒在制备药物中的用途，该药物用于在哺乳动物中诱导抗狂犬病中和性抗体应答。
15.一种人免疫缺陷病毒疫苗，它包含含有人免疫缺陷病毒-1的抗原的复制缺陷型重组猿猴腺病毒。
16.根据权利要求15所述的疫苗，其中抗原选自HIV-1的包膜、pol或gag区域。
17.根据权利要求16所述的疫苗，其中抗原包含遗传不稳定成分已被除去的天然抗原。
18.根据权利要求16所述的疫苗，其中抗原是含有SEQ ID NO：6序列的HIV-1gag cDNA。
19.根据权利要求15所述的疫苗，其中重组腺病毒是E1缺失的黑猩猩68型衍生的腺病毒。
20.一种狂犬病疫苗，它包含复制缺陷型重组猿猴腺病毒，该病毒包含编码狂犬病抗原的核酸分子，所述核酸分子在指导狂犬病抗原表达的调控序列的控制之下。
21.一种诱导CD8+T细胞应答和保护哺乳动物抵抗人免疫缺陷病毒的方法，该方法包括将权利要求15的疫苗给予哺乳动物。
CNA028124383A 2001-06-22 2002-05-13 诱导细胞毒性免疫应答的方法和用于该方法的重组猿猴腺病毒组合物 Pending CN1518457A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US30013101P 2001-06-22 2001-06-22
US60/300,131 2001-06-22
US30484301P 2001-07-12 2001-07-12
US60/304,843 2001-07-12

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1518457A true CN1518457A (zh) 2004-08-04

Family

ID=26971607

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA028124383A Pending CN1518457A (zh) 2001-06-22 2002-05-13 诱导细胞毒性免疫应答的方法和用于该方法的重组猿猴腺病毒组合物

Country Status (26)

Country Link
US (1) US20040241181A1 (zh)
EP (1) EP1409012B1 (zh)
JP (1) JP2005523233A (zh)
KR (1) KR20040043129A (zh)
CN (1) CN1518457A (zh)
AT (1) ATE422365T1 (zh)
AU (1) AU2002308713B2 (zh)
BR (1) BR0210586A (zh)
CA (1) CA2451864C (zh)
CY (1) CY1109059T1 (zh)
CZ (1) CZ304169B6 (zh)
DE (1) DE60231123D1 (zh)
DK (1) DK1409012T3 (zh)
ES (1) ES2322043T3 (zh)
HK (1) HK1061511A1 (zh)
HU (1) HU228327B1 (zh)
IL (2) IL159454A0 (zh)
MX (1) MXPA04000024A (zh)
NO (1) NO333252B1 (zh)
NZ (1) NZ530245A (zh)
PL (1) PL216200B1 (zh)
PT (1) PT1409012E (zh)
SG (1) SG153649A1 (zh)
SI (1) SI1409012T1 (zh)
WO (1) WO2003000283A1 (zh)
ZA (1) ZA200309360B (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103468743A (zh) * 2013-08-19 2013-12-25 中国科学院上海巴斯德研究所 一种新型狂犬病疫苗及其制备方法
CN103937835A (zh) * 2013-08-19 2014-07-23 中国科学院上海巴斯德研究所 一种基于腺病毒AdC68的表达载体及其构建方法
CN105112428A (zh) * 2009-02-02 2015-12-02 葛兰素史密斯克莱生物公司 猿腺病毒核酸和氨基酸序列，包含其的载体及其用途
CN105682679A (zh) * 2013-11-01 2016-06-15 辉瑞公司 用于表达前列腺相关抗原的载体
CN107723298A (zh) * 2004-01-23 2018-02-23 Msd意大利有限公司 黑猩猩腺病毒疫苗载运体
CN110036020A (zh) * 2016-12-09 2019-07-19 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 具有狂犬病病毒抗原的黑猩猩腺病毒构建体

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040136963A1 (en) * 2001-06-22 2004-07-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenovirus vectors and methods of use
NZ532383A (en) 2001-11-21 2007-03-30 Univ Pennsylvania Pan-7 simian adenovirus nucleic acid and amino acid sequences, vectors containing same, and methods of use
EP1636370B1 (en) 2003-06-20 2014-04-16 The Trustees of The University of Pennsylvania Methods of generating chimeric adenoviruses and uses for such chimeric adenoviruses
NZ553889A (en) 2004-10-13 2009-11-27 Crucell Holland Bv Replication-defective adenovirus comprising a chimeric hexon protein and replaced hypervariable ragions HVR1-7
TW200716750A (en) * 2005-05-12 2007-05-01 Glaxo Group Ltd Vaccine composition
SG173377A1 (en) 2006-07-18 2011-08-29 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccines for malaria
PL2137210T3 (pl) 2007-03-02 2017-06-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Nowy sposób i kompozycje
EP2129394B1 (en) * 2007-03-09 2012-06-20 Merck Sharp & Dohme Corp. Papillomavirus vaccine compositions
HUE031636T2 (en) * 2007-11-28 2017-07-28 Univ Pennsylvania SAdV-28,27, -29, -32, -33, and -34 simian B subgenus adenoviruses
WO2011057254A2 (en) * 2009-11-09 2011-05-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Simian adenoviral vector-based vaccines
WO2011133870A2 (en) * 2010-04-22 2011-10-27 Andrea Amalfitano Vaccines comprising adenovirus vectors and signaling lymphocyte activating molecule-associated protein (sap)
CN102060915A (zh) * 2010-10-29 2011-05-18 广州呼吸疾病研究所 人3型腺病毒六邻体的可修饰位点及其应用
EP3205353B1 (en) * 2011-03-21 2021-01-13 Altimmune Inc. Rapid and prolonged immunologic-therapeutic
TWI575070B (zh) 2011-07-12 2017-03-21 傳斯堅公司 Ｈｂｖ聚合酶突變體
TW201321016A (zh) 2011-09-29 2013-06-01 Transgene Sa 免疫療法組成物及用於治療ｃ型肝炎病毒感染之療程（二）
TW201318637A (zh) 2011-09-29 2013-05-16 Transgene Sa 免疫療法組成物及用於治療ｃ型肝炎病毒感染之療程（一）
RU2695375C2 (ru) * 2014-05-19 2019-07-23 Вало Терапьютикс Ой Покрытые онколитические аденовирусы для противораковых вакцин
US11571472B2 (en) 2014-06-13 2023-02-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic combinations
CN108025058B (zh) 2015-06-12 2022-12-16 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 腺病毒多核苷酸和多肽
CN109863169A (zh) 2016-08-23 2019-06-07 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 具有连接至不变链(cd74)的短片段的抗原的融合肽
WO2018060288A1 (en) 2016-09-29 2018-04-05 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Compositions and methods of treatment of persistent hpv infection
GB201616904D0 (en) 2016-10-05 2016-11-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine
GB201701239D0 (en) * 2017-01-25 2017-03-08 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel formulation
US11649467B2 (en) 2017-07-21 2023-05-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Chikungunya virus antigen constructs
JP7438943B2 (ja) 2017-10-31 2024-02-27 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー アデノウイルス及びその用途
MX2020004487A (es) 2017-10-31 2020-08-13 Janssen Vaccines & Prevention Bv Adenovirus y usos de estos.
AU2018357912B2 (en) 2017-10-31 2023-11-09 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Adenovirus and uses thereof
WO2019086461A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Adenovirus vectors and uses thereof
GB201721068D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis B immunisation regimen and compositions
GB201721069D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis B Immunisation regimen and compositions
AU2018392884B2 (en) 2017-12-20 2021-11-11 Glaxosmithkline Biologicals Sa Epstein-Barr Virus antigen constructs
EP3581201A1 (en) 2018-06-15 2019-12-18 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Escherichia coli o157:h7 proteins and uses thereof
EP3587581A1 (en) 2018-06-26 2020-01-01 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Formulations for simian adenoviral vectors having enhanced storage stability
JP2022524007A (ja) 2019-03-05 2022-04-27 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム Ｂ型肝炎免疫化レジメンおよび組成物
CA3189238A1 (en) 2020-07-13 2022-01-20 Transgene Treatment of immune depression
WO2023213764A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Transgene Fusion polypeptide comprising an anti-pd-l1 sdab and a member of the tnfsf
CN117089577B (zh) * 2023-08-21 2024-06-25 暨南大学 重组的猴腺病毒、病毒载体及构建方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6174666B1 (en) * 1992-03-27 2001-01-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of eliminating inhibitory/instability regions from mRNA
IL113817A (en) * 1994-06-30 2001-03-19 Merck & Co Inc Polynucleotide for vaccination against the umbilical cord virus
US5698202A (en) * 1995-06-05 1997-12-16 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Replication-defective adenovirus human type 5 recombinant as a rabies vaccine carrier
AU6261696A (en) * 1995-06-05 1996-12-24 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The A replication-defective adenovirus human type 5 recombinant as a vaccine carrier
US6083716A (en) * 1996-09-06 2000-07-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Chimpanzee adenovirus vectors
AU5677399A (en) * 1998-08-20 2000-03-14 Wistar Institute Of Anatomy And Biology, The Methods of augmenting mucosal immunity through systemic priming and mucosal boosting

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107723298A (zh) * 2004-01-23 2018-02-23 Msd意大利有限公司 黑猩猩腺病毒疫苗载运体
CN105112428A (zh) * 2009-02-02 2015-12-02 葛兰素史密斯克莱生物公司 猿腺病毒核酸和氨基酸序列，包含其的载体及其用途
CN105112428B (zh) * 2009-02-02 2021-04-20 葛兰素史密斯克莱生物公司 猿腺病毒核酸和氨基酸序列，包含其的载体及其用途
CN103468743A (zh) * 2013-08-19 2013-12-25 中国科学院上海巴斯德研究所 一种新型狂犬病疫苗及其制备方法
CN103937835A (zh) * 2013-08-19 2014-07-23 中国科学院上海巴斯德研究所 一种基于腺病毒AdC68的表达载体及其构建方法
CN105682679A (zh) * 2013-11-01 2016-06-15 辉瑞公司 用于表达前列腺相关抗原的载体
CN105682679B (zh) * 2013-11-01 2020-12-08 辉瑞公司 用于表达前列腺相关抗原的载体
CN110036020A (zh) * 2016-12-09 2019-07-19 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 具有狂犬病病毒抗原的黑猩猩腺病毒构建体

Also Published As

Publication number Publication date
IL159454A0 (en) 2004-06-01
MXPA04000024A (es) 2004-05-21
EP1409012A4 (en) 2005-08-03
CZ304169B6 (cs) 2013-12-04
PL372294A1 (en) 2005-07-11
DE60231123D1 (de) 2009-03-26
EP1409012B1 (en) 2009-02-11
PT1409012E (pt) 2009-05-11
BR0210586A (pt) 2005-07-12
HUP0400297A3 (en) 2010-08-30
IL159454A (en) 2009-09-01
AU2002308713A2 (en) 2003-01-08
CZ20033438A3 (cs) 2004-04-14
DK1409012T3 (da) 2009-05-18
ES2322043T3 (es) 2009-06-16
NO333252B1 (no) 2013-04-22
ATE422365T1 (de) 2009-02-15
SG153649A1 (en) 2009-07-29
NO20035740D0 (no) 2003-12-19
KR20040043129A (ko) 2004-05-22
HU228327B1 (en) 2013-03-28
ZA200309360B (en) 2005-07-27
PL216200B1 (pl) 2014-03-31
CA2451864C (en) 2013-01-15
JP2005523233A (ja) 2005-08-04
WO2003000283A1 (en) 2003-01-03
CY1109059T1 (el) 2014-07-02
CA2451864A1 (en) 2003-01-03
EP1409012A1 (en) 2004-04-21
HUP0400297A2 (en) 2007-05-02
AU2002308713B2 (en) 2008-05-15
US20040241181A1 (en) 2004-12-02
NO20035740L (no) 2004-02-16
HK1061511A1 (en) 2004-09-24
NZ530245A (en) 2007-04-27
SI1409012T1 (sl) 2009-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1518457A (zh) 诱导细胞毒性免疫应答的方法和用于该方法的重组猿猴腺病毒组合物
US11970709B2 (en) Adenoviral vector
US20240181078A1 (en) Simian Adenovirus and Hybrid Adenoviral Vectors
JP2004508064A (ja) コドン最適化ｈｉｖ１−ｇａｇ、ｐｏｌ、ｎｅｆおよび修飾体を発現する増強された第１世代アデノウイルスワクチン
CN1132791A (zh) 转染动物细胞的重组dna病毒载体
US20050070017A1 (en) Enhanced first generation adenovirus vaccines expressing codon optimized HIV1-Gag, Pol, Nef and modifications
JP2003530307A (ja) ｇａｇ遺伝子保有アデノウイルスＨＩＶワクチン
JP2014158467A (ja) チンパンジーアデノウイルスワクチン担体
CN1162338A (zh) 不含活污染颗粒的腺病毒、其制备方法和用途
US20070054395A1 (en) Enhanced first generation adenovirus vaccines expressing codon optimized HIV1-Gag, Pol, Nef and modifications
AU2017283118A1 (en) Potent and balanced bidirectional promoter
WO2022007800A1 (zh) 一种非洲猪瘟的重组腺病毒疫苗及其构建方法
AU2003262790A1 (en) Adenovirus serotype 24 vectors, nucleic acids and virus produced thereby
CA2519207A1 (en) Adenovirus serotype 34 vectors, nucleic acids and virus produced thereby
WO2008020331A2 (en) Polynucleotides allowing the expression and secretion of recombinant hepatitis b surface antigen (hbsag) virus-like particles containing a foreign peptide, their production and use
CA2495546A1 (en) Methods for propagating adenovirus and virus produced thereby
CN1236057C (zh) 表达人类激肽释放酶的重组腺相关病毒及其制法和用途
EP2234634A2 (en) Vaccine directed against adenovirus serotype 14
CN1886511A (zh) 用于防御人体免疫缺陷病毒感染的嵌合的5型/11型或35型腺病毒载体
CN1886509A (zh) Hiv药物疫苗

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication