HU228327B1 - Methods of inducing a cytotoxic immune response and recombinant simian adenovirus compositions useful therein - Google Patents

Methods of inducing a cytotoxic immune response and recombinant simian adenovirus compositions useful therein Download PDF

Info

Publication number
HU228327B1
HU228327B1 HU0400297A HUP0400297A HU228327B1 HU 228327 B1 HU228327 B1 HU 228327B1 HU 0400297 A HU0400297 A HU 0400297A HU P0400297 A HUP0400297 A HU P0400297A HU 228327 B1 HU228327 B1 HU 228327B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
virus
adenovirus
monkey
recombinant
human
Prior art date
Application number
HU0400297A
Other languages
English (en)
Inventor
Hildegund C J Ertl
James M Wilson
Original Assignee
Wistar Inst
Univ Pennsylvania
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wistar Inst, Univ Pennsylvania filed Critical Wistar Inst
Publication of HUP0400297A2 publication Critical patent/HUP0400297A2/hu
Publication of HUP0400297A3 publication Critical patent/HUP0400297A3/hu
Publication of HU228327B1 publication Critical patent/HU228327B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/235—Adenoviridae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10361—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2710/10362—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
    • C12N2760/20122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
    • C12N2760/20134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/55—Vector systems having a special element relevant for transcription from bacteria
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Description

Eljárások citotöxikas immunválasz índntólására és az azokban alkalmazható majom adenovirus készítmények
Ezt a munkái a National Institute of Health’ P3Ö DK. 47757-08 és P01 HL59407-02 5 számú, és a NI AID ÁI497Ő6-0I. számú pályázatának támogatásával végeztük. Az Amerikai
Egyesüli Államok kormányának lehetnek, jogai a találmány vonatkozásában.
A humán adenovíms 5-ős szerotlpasának rekombinánsaií tesztelték vírusokból, parazitákból és daganatsebekből származó különféle antigének, vakcinahordozójaként. Az eredmények biztatóak voltak, mivel az E l-deleiéit adenovirus rekombinánsok immunválaszt lö váltottak ki a transzgeníkns termék ellen. Az humán adexmvirus 5-ös szerotípusa (Á.d5) a közönséges megfázás mindenütt jelen lévő vírusa, amely a legtöbb embert megfertőzi az élete első évének folyamán. Azt találtuk, hogy a közönséges humán szerotlpusok elleni meglévő immunitás csökkenti a vírus homológ, szerotipnsán alapuló rekombináns adenovirus vakcina hatásosságát. Bizonyos esetekben a hatásosság ezen csökkenését elkerülhetjük a humán adenovirus rekombinánsofc magasabb dózisának a bejuttatásával. Azonban ezek a magasabb dózisok más nemkívánatos mellékhatásokkal járhatnak együtt.
Szükség van tehát kiválasztott molekulák elleni immunválasz kiváltására alkalmas készítményekre, amelyek nem járnak együtt a jelenlegi bejuttatás! módokkal kapcsolatos problémákkal
A találmány tárgya eljárás ciíoíoxikus immunválasz preferenciáiig kiváltására heterológ molekulával szemben, a molekulának rekombináns majom adenovirus útján a gazdába történő bejuttatásával. Váratlanul azt találtuk, hogy rekombináns majom adenovímsok találmány szerinti alkalmazása úgy prezentál antigéneket, hogy azok szignifikánsan hatásosabb CD8v T-sejtes választ váltanak ki, mint amikor az immunogént hasonló 5-ős típusú humán vírussal juttatjuk be. Ezenfelül azt találtuk, hogy a rekombináns csimpánz adenovirusck megközelítőleg ötször magasabb intereron-α és interferon-β szintet indukálnak, mint amit a normál humán adenovímsok.
Ily módon egy megvalósítási mód szerint a találmány tárgya eljárás CD8v T-sejtes válasz preferenciálís kiváltására hsterológ molekulával szemben alanyban, a molekulát hordozó rekombináns majom adenovirus bejuttatásával az alanyba. Egy előnyös megvalósítási mód szerint a rekombináns majom adenovirus rekombináns csimpánz adenovirus törzs.
Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány tárgya eljárás interfeon-α és/vagy interferon-B válasz indükálására alanyban, rekombináns majom adenovirus bejuttatásával az alanyba.
Aklaszámimk: 99826-6132-LT ~ ·>
Egy még másik megvalósítási mód szerint a találmány tárgya CD8+ T-séjtes válasz kiváltására alkalmas immunogén készítmény humán ímmundeflcíencia vírussal szemben. A készítmény I-es humán immundeftcíe-ncia vírus módosított gag tehénéjét kódoló optimalizált nuklemsav-szekvenmát tartalmazó- rekomfeináns majom -adenovírust és fiziológiailag elfogadható- hordozót tartalmaz.
Egy még másik megvalósítási mód szerint a találmány tárgya eljárás CD8+- T-sejtes válasz mdukálására humán irnrnnndeticiencia vírussal szemben emlősökben, a találmány szerinti ímmunogén készítmény emlősnek történő beadásával.
Egy további megvalósítást mód szerint a találmány tárgya eljárás CD8-r T-sejtes válasz, kiváltására humán papillőmavírussal szemben emlősökben, humán papillóm-avirushól származó- immunogén fehérjét kódoló refcombináns majom adenovírns beadásával
A találmány még további előnyei nyilvánvalóak a találmány alábbi részletes leírásából.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a leíráshoz tartozó ábrákat;
Az 1. ábrán a C68 csimpánz adenovírus genomjának genetikai szerveződését mutatjuk be. Az 1 A. ábrán a €Ő8 csimpánz adenovírus. genomját sematikusan ábrázoljuk az ábra felső részén található négyszöggel. Az ivertált terminális ismétlődéseket feketével jelöljük, és a korai régiókat szürkével jelöljük. A négyszög feletti nyilakkal jelöljük a korai gének expresszié) ának az irányát. A négyszög alatti vonal jelenti a: genom 100 térképegységre történő felosztását A vonal alatti nyilakkal jelöljük az ot. késői génrégíót, és az egyes régiók által kódok fehérjéket. A. négyszög, és a nyilak alatti számok jelentik az egyes régiók kezdetét (promőter vagy inieiőáclős kodon) és végét (kanonikus polí-A. szignál)-. A *-gal jelöljük az E2A késői promótert. Az 1B„ ábrán a PsíI klönokat mutatjuk be; az IC. ábrán a BamHÍ kiónokat mutatjuk be. Az 1D. ábrán a Hindin Hónokat mutatjuk be. Az IB-ID részek esetében a nem besötétitsrí részek olyan fragmsnseket jelölnek, amelyeket plazmidvektorba klónoztunk, amint az k táblázatban felsoroljuk, míg az árnyékolt régiók azt jelölik, hogy a restrikciós ífagmenst nem klónoztuk. Mínd-en. egyes szekció esetében a fragmens nevét, és a fragmens méretét — alfabetikus rendben, ahol A jelöli a legnagyobb tragmenst.......jelöljük a négyszög felett, és a végpontokat a négyszög alatt jelezzük.
A 2. ábrán bexon fehérjék szekvenciájának többszörös egymás alá rendezését .mutáljuk' be. Nagyon hasonló humán adenovírns hexono-k kikövetkezteted arainosav-szekvencíáít hasonlítottuk össze a csimpánz adenoviruséval a CLUSTAL X program alkalmazásával. A szerotípusokat és alcsoportokat a bal margón tüntetjük, fel, amit az oldallánc szórna követ, A *·«<· ♦*· számozás a transzláció startjához viszonyított aminosav-pozíciot jelesti. Az amínosavakat a Cő8 szekvenciájához képest jelöljük a szekvencia-hasonlóság (szürke) és azonosság (fekete) kiemelése végett. A DE1 és FG1 burokdomének hét hípervariábílis régióját az alsó szél menten jelöljük, és az alábbi Ád2 szekvenciáknak feleinek meg az egymás alá rendezésben:
HVK1,137-1 SS; HVR2, 194-204; HVR3, 222-220; HVR4, 258-271; HVK5, 278-294; HVR6, 316-327; és HVR7, 433-465. Á. bemutatott szekvenciák GenBank elérési számai az alábbiak: AAD03657 (Ad'4), S37216 (Aőló), S3929S (Ad3), ÁÁD03Ő63 (Ad7) és NPÖ40525 (Ad2).
Összehasonlítva a humán 5-ös adenovirus rekombináns törzs intraunogenitását a csimpánz őS-as adenovirus törzsével ....... amelyek egyaránt csonkolt gag-szekvenciát expresszáisak — kimutattok, hogy a csimpánz adenovirus hatásosabb. Hasonló eredményeket ügyeltünk meg rekombináns csimpánz adenovírosokkai, amelyek zöld fluoreszcens fehérjét és veszettség vírus glikoproteint expresszáltak A. rekombináns csimpánz adenovirus ezen magasabb hatásossága legvalószínűbb módon nem a magasabb szintű transzgén-expresszióval függ össze, mivel a vizsgálatokat hasonló expressziás kazettákat hordozó Ad és csimpánz rekombmánsokkal hajtottuk végre, amelyekben a íranszgént a korai cítoxnegalovlrus promóter irányította. A leírásban bemutatott adatok azt is mutatják, hogy nem valószínű, hogy a tropizmus különbözőséget tükrözik, mivel a csimpánz és az Ad5 ugyanazt a sejtheti receptort alkalmazza. Ezek az eredmények Inkább art demonstrálják, hogy a találmány szerinti alkalmazott rekombináns csimpánz adenovírusoknak meglepő módon a humán adenovímstól különböző adjuváns hatása van, Ennek a jobb adjuváns hatásnak mélyreható hatása van a csimpánz adenovirus által indukált transzgén-specifikns immunválasz nagyságára és kinetikájára.
Előnyösen ez a jobb hatásosság lehetővé teszi csimpánz adenovírusok alacsonyabb dózisának az alkalmazását, mint ami a humán adenovirus bejuttafásí rendszer esetében, szükséges. Ezenfelül azt találtuk, hogy a rekombináns csimpánz adenovírusok megközelítőleg ötször magasabb intemon-u és interteron-β· szintet indukálnak, mint amit a normál humán adenovírusok.
Ezenkívül a rekombináns csimpánz adenovímsokról azt találtuk, hogy megközelítőleg ugyanolyan hatásuk van a dendrikus sejtekre, mint az 5-ös típusú humán adenovírusoknak. Ez a képesség ....... együtt a majom .adenovírusok nem. várt hatásosságával — szignifikáns:
előnyöket biztosít citotoxíkus immunválasz kiváltásában kiválasztott antigénekkel szemben és olyan állapotok kezelésében, amelyekben interferon-α és/vagy interferon-β fokozott índukálására van szükség.
1. Rekombináns majom adenovírus A. Források
5- Csimpánz adenovírus szekvenciák, különböző forrásai az ’American Type Culture
Collectíon’ (10801 University Bonlevard, Manassas, Virginia 20110-22Ö9) és egyéb források. Előnyős csimpánz törzsek az alábbiak: Pan 5 [ATCC VR-591 j, Pan 6 [ATCC VR.-592} és Pás 7 [ATCC VR-5931 Különösen előnyös csimpánz adenovírus törzsek a Sortba vagy Cl csimpánz adenovírus törzsek [VR-20] és a Pan 9 vagy CV68 csimpánz adenovírus törzsek {ATCC VR-594] A kényelem kedvéért a CV6S vírust a leírás-szerint „C68”-nak nevezzük. A vírusokat eredetileg fertőzött csimpánzok ürülékéből [Cl, Rowe és mtsai., Proc,. S-oc. Exp. Med. 91, 2óö. old. (195ö)] vagy mezenterikus nyirokcsomójából {C68, Basnight és mtsai., Am. Epidemiol. 94, 16ö. old. (1971 í) izolálták. Ezeknek a törzseknek a szekvenciáját, és az El a,. Elb, E2a, £2b, E3, £4, Ll, L2, Ε3, L4 és L5 adenovírus gének elhelyezkedését a
6 083 716. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban tárják fék amely hivatkozás útján a kífanitás részét képezi Adott esetben nem; csimpánz majom adenovírus szekvenciákat is alkalmazhatunk találmány szerinti rekombináns vektorok előállítására, ilyen nem csimpánz adenovirusok közé tartoznak az alábbiak: pávián adenovírus törzsek [például ATCC VR275}., AEesw majmokból Izolált adenovírus törzsek [például ATCC VR-2Ö9,
ATCC VR-275, ATCC VR-353, ATCC VR-355], és afrikai zöldmajmokból izolált adenovírus törzsek [például ATCC VR-541; ATCC VR-941; ATCC VR-942; ATCC VR~ 943],
A leírásban ismertetett csimpánz (vagy másféle majom) adenovirusok olyan adenovírus szekvenciákat tartalmazhatnak, amelyek egy vagy egynél több majom adenovírus törzsből, származnak.. Ezeket a szekvenciákat természetes forrásokbói, rekombináns. úton, szintetikusan vagy más .génmanipulációs vagy kémiai eljárásokkal ál Irthatjuk elő
B. Rekombináns majom adenovirusok
A. találmány szerint alkalmazható rekombináns majom adenovirusok olyan virális részecskék, amelyek heterolög molekulát és/vagy majom adenovírus kapszidféhériét hordozó rekombináns majom adenovírus szekvenciákból állnak. Ezek a majom adenovirusok, és különösen a csimpánz CőS és Cl szekvenciák alkalmazhatók más majom és nem majom adenovírusokkal való hibrid vektorok kialakítására is, és pszeudotípusű rekombináns vírusok.
- 5 azaz olyan rekombináns vírusok. kialakítására, .amelyek heteroíóg molekulát hordozó, majomeredetű heteroíóg kapszídfohérjébe pakolt adenovírus vektorok.
I maipm.adenpvmu
Minimális követelményként a találmány szerinti alkalmazható refcombínáns majom adenovirus tartalmazza a repkkációhoz és a virio-n enkapszídációjához szükséges majom adenovirus cisz-elemeket, amely cisz-elemek szegélyezik a heteroíóg gént. Azaz a vektor tartalmazza az adenovírusok .5’ invertált terminális ismétlődő (ITR) szekvenciáit (amelyek a replíkáció origójaként fonkcionálnak)·, a natív 5* pakoló/enhanszer doméneket (amelyek a lineáris Ad genomok pakolásához szükséges szekvenciákat és az El promóter enhanszer elemeit tartalmazzák), a heteroíóg molekulát,, és az 5’ ITR -szekvenciákat Lásd például a “minimális” humán Ad vektor előállítására feltárt módszereket a 6 203 975. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban — amely hivatkozás útján a kitanhás részét képezi ......, amelyek könnyedén adaptálhatók a rekombináns majom adenovírus esetére.
Adott esetben a találmány szerint alkalmazható rekombináns majom adenovírusok a. fent definiált minimális majom adenovirus szekvenciáknál többet tartalmaznak. Ezeket az Ad vektorokat az. jellemzi, hogy olyan módosításokat tartalmaznak, amelyek tönkreteszik az adenovirus képességéi egy vagy több kiválasztott géntermék expresszálására. A „funkcionális deléeió” kifejezést alkalmazzuk a leírás szerinti értelemben ezeknek a módosításoknak, a leírására. Az ilyen .„funkcionális deléci-ö-k”' tipikusan a vírus egy génjének az. egészének vagy egy részének a. deléciójának formájában testesülnek meg. Azonban az ilyen funkcionális deléciók lehetnek fáziselfolási mutációk formájában Is. Még további, funkcionális deléeió létrehozására alkalmas manipulációk .nyilvánvalóak a szakember számára.
Egy különösen előnyös megvalósítási mód szerint a majom adenovírusok replíkációdetektívek. amiatt, hogy nem képesek adenovírus £ la és Elb expresszálására, azaz az Ela és Elb funkcionálisan deleiéit. Ezek a rekombináns majom adenovírusok hordozhatnak funkcionális dotációkat más génekben is.
Például ehmínál hatjuk az adenovírus késlelteted korai £3 génjét a rekombináns vírus részét képező majom .adenovirus szekvenciából. Az E3 funkciója nem szükséges a rekombináns adenovirus részecske előállításához. Ily módon szükségtelen ezen gén funkciójának a helyettesítése a találmány szerinti rekombináns majom adenovírus pakolásához
Rekombinán-s majom adenovírusokat előállíthatunk úgy is, hogy funkcionális deléciót tartalmazzanak az E4 génben, habár kívánatos lehet az £4 ORFŐ funkció megtartása. Egy még másik találmány szerinti vektor deléciót tartalmaz a késleltetett korai E2& génben.
$ * * * ί «β« ~ 6 ~
Deléciőt végrehajthatunk a majom adenovirus genom L1-L5 késői génjeinek bármelyikében is. Hasonlóképpen az IX és fVa2 közbülső génjeiben végrehajtott deiéciók is 'hasznosak lehetnek bizonyos célokra. Más deléeiókat végrehajthatunk más szerkezeti vagy nem szerkezeti adenovirus génekben. A feni tárgyalt deléeiókat egyedileg alkalmazhatjuk, azaz a találmány -szerint alkalmazható adenovirus szekvencia csak az El deléeiókat tartalmazhatja. Más megoldásképpen teljes gének vagy azok részleteinek a delécióí, amelyek a biológiai aktivitás tönkretételére szolgáinak, hatásosak lehetnek bármilyen kombinációban. Például egy szemléltető vektorban az adenovirus szekvenciák tartalmazhatnak deléeiókat az E1 génekben és az E4 génben, vagy az Bt, B2a és B3 génekben, vagy az El és E3 génekben, vagy az .El,
E2a és B4 génekben, az E3 deléciöjával vagy anélkül, és igy tovább. Az ilyen deléeiókat más mutációkkal, mint például hőmérséklet-érzékeny mutációkkal kombinálva alkalmazhatjuk a kívánt eredmény elérésére.
A íranszgéní a majom adenovirus bármelyik deletált régiójába beinzertálhatjuk. Más megoldásképpen kívánt esetben a transzgént egy létező génrégióba inzeríálhatjuk be, hogy .megzavarjuk annak a régiónak a működését.
Függetlenül attól, hogy a rekombináns majom adenovirus csak a minimális Ad szekvenciákat tartalmazza-e vagy a teljes Ad genomot csak funkcionális deléciőkkal az El és/vagy E3 régiókban, a rekombináns vírus majom adenovirus kapszidoi tartalmaz. Más megoldásképpen más megvalósítási módok szerint rekombináns pszeudotipusó adenovirusokat alkalmazhatunk. a találmány szerinti eljárásokban. Az ilyen, pszeudotipusú adenovirusok majom adenovirus kapszidfehérjéket. -alkalmaznak, amelyekbe· heterológ majom adenovirus szekvenciákat vagy nem majom adenovirus szekvenciákat hordozó nukléinsavmolekula lett bepakolva. Ezeket a találmány szerinti rekombináns majom adenovírusokat a szakember számára ismert eljárások alkalmazásával állíthatjuk elő.
C. A.rekgnmÍSÍnEViráfe részecske előállítása
Alkalmas majom adenovirusok előállítására szolgáló eljárásokban a szakember számára jól ismert módszereket alkalmazunk, mint például a 6 083 716. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban ismertetetteket. Heterológ molekula alanyba (például emberbe, kutyába, macskába vagy nm emlősbe) történő bejuttatására szolgáló rekombináns majom adenovirusok előállítása során a, vektorokban alkalmazott nukleiusav-szekvenciák különféle majom-forrásokból származhatnak.
Majom (például csimpánz) adenovirus szekvenciákat tartalmazó vektort, amely nem tartalmazza a fertőző rekombináns virasreszecske előállításához szükséges majom adenovirus szekvenciákat, segítővirussal vagy vektorral együtt alkalmazhatunk. A segitövirus biztosítja a #4 « «4 * «« ♦ '
_ 7 -.
virális- fertőző-képességhez és a majom adenovírns szaporodásához szükséges esszenciális géntermékeket. Amikor csak. egy vagy több kiválasztott deléciót hajtunk végre a majom adenovirus génekben egy egyébként működőképes vitális vektorban, a deletált géntermékekeí a vírusnak kiválasztott pakolösejfekben történő szaporításával biztosíthatjuk a vitális vektortermelés folyamán.
Ily módon ezeket a funkciókat permanensen transzformált sejtvonalban biztosíthatjuk, amely biztosítja a pakoláshoz szükséges adenovirus fonkciók némelyikét vagy mindegyikét, például az El a, Élb, E2a, E4 O.R.F6, VA RNS-ek bármelyikét, amelyek hiányoznak a vektorból. Szükség esetén vagy más megoldásképpen a pakoiósejtet elláthatjuk bármilyen szükséges további adenovirus fonkcióvaí, az ezeket a funkciókat tartalmazó konstrukció transzfektálásávai vagy fertőzésével. Adott esetben az adenovirus funkciókat úgy választhatjuk meg, hogy lehetővé tegyék a minigém hordozó vitális vektornak heteroíóg majom adenovirus kapsxidfenériéhe történő pakolását. A „pszeudotipizálás” alkalmas eljárásai, amelyek a majom (például C68) kapszídfehérjéket alkalmazzák, nyilvánvalóak azok alapján, ami a szakterületen a humán adenovirus pszeudotipizálásáról ismeri (lásd például a 6 203 -975. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot).
Az adenovirus. kiválasztott DNS-szekvenci álnak az -összeszerelése, és a transzgénnek és más vektorelemeknek különféle köztes plazmidókba és ingázó vektorokba történő beépítése, és a piazmidok és vektorok alkalmazása rekombináns virális részecske előállítására hagyományos módszerek alkalmazásával érhető el. Az ilyen módszerek közé tartoznak hagyományos klónozás! módszerek, mint például amelyeket különböző kézikönyvekben leírtak („Molecular Cloning;. A Laboraíory Manual”, szerkó Sambrook és mtsai,, 2. kiadás, kiad.: Cold Spríng Barbár Press, Cold Sprrng Markor, NY (1989)), adenovirus genomok átfedő oligonukleotid-szekvenciáinak az alkalmazása, polímerázdánereakcíó, és bármilyen alkalmas eljárás, amellyel a kívánt nukleoiki-szekvenciái előállíthatjuk. Szokásos transzfékcíós és együtt transzfekciőa módszereket alkalmazunk, például CaPCU kícsapásos módszereket. Az alkalmazott egyéb hagyományos eljárások közé tartozik a virális genomok homológ rekombinációja, vírusok szélesztése aganétegben, jelgenerálást mérő eljárások, és hasonlók.
Például a kívánt transzgént. tartalmazó Ingázó vektor előállítását és összeszerelését követően az ingázó vektort fe v?w a pakolásra szolgáló gazdasejtbe transzféktáljnk. A gazdagéit tartalmazza az esetleg hiányzó adenovirus funkciókat. Homológ rekombináció megy végbe a segítő és vektor szekvenciák között, ami lehetővé teszi a vektorban található ¥ x * * ♦ #Α
- S adenovírus-transzgén szekvenciák tephkációját és virion kapszidokba történő pakolását, ami rekombináns adenovirus részecskéket eredményez.
Azt találtuk, hogy a humán adenovirus El tehénéi előnyösen koraplementálják az Eldefektív majom adenovlrust, lehetővé téve annak pakolódását majom adenovirus részecskékbe, Azonban a humán Ad, El és a deletált majom. Ad El szekvenciákat szegélyező szekvenciák alacsony mértékű homolőgiája. miatt minimális a kockázata annak, hogy a majom Ad El homológ módon rekombinál replikádéra képes majom adenovírasí létrehozva.
Az ily módon előállított' rekombináns majom adenovirus· részecskéket izolálhatjuk és tisztíthatjuk a szakember számára ismert eljárások bármelyikével a találmány szerinti eljárásban történő alkalmazás végett.
II, Heterolőg molekulák gazdába történő bejuttatásra
A. bmmmpgének
A majom adenovlruson hordozott, gazdasejtbe juttatandó heterolőg molekula bármilyen kívánt anyag lehet, nem korlátozó példaként polipeptid, fehérje, enzim, szénhidrát, kémiai csoport vagy nuldeinsav-molekuls, amely lehet oligonukleotid, RNS, DNS és/vagy RNS/DNS hibrid. Egy előnyös megvalósítási mód szerint a majom adenovirus által hordozott molekula transzgén. A transzgén olyan nukíeinsav-molekuia, amely az adenovirus szekvenciához képest heterolőg nukieinsav-szekvenciát tartalmaz, amely fehérjét, pepiidet, polipeptidet, enzimet vagy más jelentőséggel bíró terméket, és a ködolt tennék gazdasejtben történő transzkripcióját és/vagy transzlációját irányító szabályozó szekvenciái kódol, ami lehetővé teszi a .kódolt termék expresszíöiát a gazdasejíben vagy alanyban. A transzgén összetétele függ a majom adenovirus tervezeti felhasználásától.
Például egyfajta transzgén jelző- vagy markerszekvenciát tartalmaz, amely az expressziója után detektálható jelet produkál. Azonban különösen előnyös géntermékek és molekulák azok, amelyekre ellenanyag, és legelőnyösebben sejt-közvetített immunválasz Indukálódik.
Ezek az rmmunogén géntermékek és molekulák patogén mikroorganizmusok széles köréből származhatnak, nem korlátozó példaként, vírusokból, baktériumokból, gombákból vagy parazita mikroorganizmusokból, amelyek embereket és nem ember gerinceseket fertőznek meg. Ezenkívül ráksejtekből vagy daganatsejtekből származhatnak. Az immunogén fehérjékből származó peptidekeí vagy polipeptídeket tartalmazhat. Bizonyos esetekben a készítmény több mint egy Immunogént tartalmaz.
- 9.Az ezeket a. géntermékeket és egyéb molekulákat tartalmazó előnyös imníunogén készítmények közé tartoznak azok, amelyek az alábbi nem korlátozó vírusok által okozott betegségek megelőzésére és/vagy kezelésére irányulnak; humán immuodeneiencia vírus, majom immuttdeficiencia vírus, respíratonkus szincfeiábs vírus, parainfluenza vírus 1-3 típusa, influenza vírus (például influenza A és B vírusok), //eípes· sá»/>/ar vírus, humán citomegabvíms, hepatitisz vírusok (beleértve a hepatitisz A, hepatitisz B és hepatitisz € vírusokat), humán papillómavírus, poíiovírus, roíavhus, kabeivímsok, kanyaró-vírus, mumpsz vírus, rubeóla vírus, adenovírus, veszettség vírus, kutya szopornyica vírus, marhavész vírus, koronavírus, parvovírus, .fertőző rínotracheitisz vírusok, macska leukémia vírus, macska tö fertőző perhonítisz vírus, madár fertőző hurzáüs betegség vírusa, Névmást íe-betegség vírusa, Marek-féíe betegség vírusa, sértés respiratoríkns és reproduktív szindróma vírus, ló arteriíisz vírus vagy különféle enkeféhtisz vírusok.
További immunogének közé tartoznak azok, amelyek az alábbi, nem korlátozó baktériumok, által okozott betegségek megelőzésére és/vagy kezelésére irányulnak;
./foemry?/rt/ízs urtTaenarte (mind tipizálható és nem tipizálható), ó/im.mop/u/ííS' sew/w', A/fézece/fe? oírtnvvAu/fs, ŐVreMíoooous· /wííiww«, Őám/.zk>ooeo?.i,s· povypmes. Αο·ο^??οοοοη«5 irguféertím, őrtep’féouueus jte/ir, .//e/íuo/vmíer /p-fézi, Ak/xmrtu Ak'A,s?.rt<:?
goucez/meoe, O/mv/yrtá? nz/fémmud.?, Öáwyrtfe CA/mnyr&r /xrtrtmfé
Burifém/k? parrrtmféy Ód/rmne/fe nyfe/, Óö/mumd/o gyAmn/zm/n, Ák?Anö??e//d c/íofénram/y, fésuAefertófe oo/?, ÓA/ge/fe, kférto c&rtferae, O^tegrism A/yoortuumrííím tuőer'rtíí/rtsfé, AA-rtrt&mmrfért? dvi«m-A-fxrt&?cfém#zw· wíme^/Za/ízre komplex, Akö&Vís rt/fért/v/A, /ó'rttuus va/gurrá, ÖWáfefevrtortíO' űs»re.«s, OosJörM»/» Aum?/, Zep&wpím «&/·«$«, ./írt?y<?/fe ő?u;gdrtr/m, ./fertenza/á? jwem&fy’í/ca, Povfönze/fe um/rtxmih, Ácfeoörtfé/fes p/ewmpneazraon/öe vagy AAcöprt?s???íí gu/Asepde?????.
Még további immunogének közé tartoznak azok, amelyek az alábbi, nem korlátozó gombás patogének által okozott betegségek megelőzésére és/vagy kezelésére irányulnak: .rt?g?e?g?//?s, Bfesrrtmyrtuy émuí/mh, CloocnAonks, vagy //Ampfaxmrt.
Ezenfelül egyéb előnyös immnnogének közé tartoznak azok, amelyek az alábbi, nem korlátozó paraziták által okozott betegségek megelőzésére és/vagy kezelésére irányulnak:
Leis&mama mu/rtz, AsonzA, féféfeím, Grtuzfe, öyyürtsprtz/rtrtm?, Aártóomrtmg
Jovopázmírt geefert vagy P«eöwocy?/Á ö$wi
Ezenfelül előnyös imraunogén közé tartoznak azok, amelyek teráápíás vagy profi taktikus rákellenes hatást váltanak ki gerinces gazdában, nem korlátozó példaként azok, amelyek rákantigént vagy daganattal kapcsolatos antigént alkalmaznak, nem korlátozó *χ
X ♦ * *« , »» ?·* «£« *Mt-« *«« *
- 10 példaként prosztata-specifikus antigént, karcino-embriönáíís antigént, MUÜ-l-eí, Eíer2-t, CA~ 125-öí és MÁGB-3-at.
Az alábbi példák specifikusan illusztrálják a találmány szerinti rekombsnáns majom adenovirust alkalmazó eljárások és készítmények előnyeit, amelyekben veszettség ímnrunogén pepíidjéí (glikoprotem-Gi vagy 1~es humán immundeficiencía vírus intmunogén peptidjét (módosított gag fehérje) expresszáltatjuk. Más előnyös megvalósítási módok szerint humán papiildmavírusból származó immunogén pepiidet hordozó majom adenovirust alkalmazunk. Azonban a találmány nem korlátozódik az immunogének ezen forrásaira.
B. Szabályozóelemek
Egy kívánt gén-termék expressziöja érdekében transzkripciót, transzlációt és/vagy expressziét igénylő transzgén és egyéb nuklemsav-szekvencla szerkezete tartalmazhat megfelelő szekvenciákat, amelyek működőképesen, kapcsolva vannak a jelentőséggel bíró kódoló szekvenciákhoz a kódolt termék expressziójának elősegítése érdekében. „Működőképesen kapcsolt” szekvenciák közé tartoznak olyan expresszibe szabályozó szekvenciák, amelyek egybeíüggőek a jelentőséggel bíró nukleinsav-szekvencíákkai, és olyan szabályozó kontroli szekvenciák, amelyek transz vagy távoli helyzetben hatnak a jelentőséggel bíró nukleinsav-szekvencia szabályozására,
Az expressziős szabályozó szekvenciák közé tartoznak azok, amelyek megfelelő transzkripciós inicíáciös, terminácíós, protnőter és enhanszer szekvenciákat tartalmaznak;
hatékony KNS-feldolgoző szignálokat, mint például splícing- és pohadeniláeiós szignálokat tartalmaznak; cítoplazmás RNS-í stabilizáló szekvenciákat tartalmaznak; a transzláció hatékonyságát fokozó szekvenciákat- (például Kozák konszenzus szekvenciát) tartalmaznak; a fehérje stabilitását fokozó szekvenciákat tartalmaznak; és kívánt esetben a fehérje szekrécióját fokozó szekvenciákat tartalmaznak. Nagyszámú, expressziős szabályozó szekvencia — natív, konstitutív, indukálható és/vagy szövet-specifikus.......ismert a szakterületen, és alkalmazható a gén expressziójának az irányítására, a kívánt expresszié típusától függően. Bukarióta sejtek esetében a szabályozó szekvenciák tipikusan promólert, enhanszert tartalmaznak, mint például amelyek immunglobulin génből, SV4ő-böh dfomegalovírusbői, stb. származnak, és poliadenílációs szekvenciát tartalmaznak, amely tartalmazhat splicin-g donor és akcepfor helyeket. A pohadeniláeiós .(poli-A) szekvenciát általában a transzgén szekvenciák után és a 3’ adenovirus ÍTR szekvencia elé inzertáljuk be. Egy megvalósítási mód szerint a szarvasmarha növekedési hormon poli-A szekvenciáját alkalmazzuk. A találmány szerinti majom adenovirus tartalmazhat ínírent is, előnyösen a promóter/enhanszer szekvencia és a íranszgén között Egy lehetséges húron szekvencia szintén az SV-40-bői származik, amit SV~ *· X
-ί * <*
- 11 40 T-intron szekvenciának neveznek. Egy másik, a vektorban alkalmazható elem a belső riboszéma-belépési hely (1RES). Az ÍRBS szekvenciát egyetlen gén-transzkipiumrói egynél több polipeptid termelésére alkalmazzuk. ÍRBS .szekvenciát alkalmazhatunk olyan, fehérje •előállítására, amely több mint egy polípeptidláncot tartalmaz. Ezek és más általános vektorelemek kiválasztása megszokott, és sok ilyen szekvencia áll rendelkezésre [lásd például Sambrook és mísai., és az abban idézett irodalmi helyek, például 3.18-3.26 és 16,17-16.27 oldalak; és Ausubeí és mísai., „CÜRRENT PROTOCOLS ÍN MOLECULAR BÍOLOGV”, kiad.: John Wiíey & Sons, New York, (1989)]..
Egy megvalósítási mód szerint magas· szintű konstitutív expressziót lehet előnyös. Az alkalmazható konstitutív promóterek nem korlátozó példái közé tartozik a rei.rovírus Rous szarkóma vinis· (RSV) L'TR promótere (adott, esetben az. RSV enhanszerrel), a citomegalovirus (CMV) promótere (adott esetben a CMV enhanszerrel) [lásd például Boshart és mísai., Cell 41, 52(-530. old. (I985)j, az SV4Ö promóter, a díhidrofolát-reduktáz promóter,. a β-aktin promóter, a tószföghcem-kináz (EGK) promóter és az EFla promóter (Invitrogen)
Az indukálható promóterek ....... amelyeket exogén vegyületek szabályoznak — szintén hasznosak, és nem korlátozó példáik közé tartozik az indukálható juh metallótíonm (MT) promóter, a dexametazonb(Dex)-índukált egér emlődaganat vírus ÍMMTY) promóter, a T? polimeráz promóter rendszer (WO 98/19088. számú nemzetközi közzétételi irat); az. ekdizon rovar-promóter (No és mísai, Froe. Natl. Acad. Sci, USA 93, 3346-3351. old. (1996)(, a tetracklinnel represszálható rendszer .[Gossen és mísai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547§551. old. (1992)], a tetracklinnel indukálható rendszer [Gossen és mísai., Science 268, 17661769. old. (1995), lásd még Harvey és mísai., Curr. Opin. Chem, Bioi. 2, 512-518. old. (1.998)( a Rü486~tól indukálható rendszer (W.ang és mísai., Nat, Biotech. 15, 23-243. old. (1997) és Wang és mísai., Gene Ther, 4, 432.-441,. old, (1997)] és a rapamiclnnel indukálható rendszer (Magad és mísai.» X din. lövést. 100, 2865-2872. old. (1997)). Az ebben a vonatkozásban hasznos más típusú Indukálható promóterek azok, amelyeket egy specifikus biológiai állapot szabályoz, mint például hőmérséklet, akut fázis, a sejt egy adott differeneiációs állapota, vagy amelyek csak repííkálédó sejtekben működnek.
Egy másik megvalósítási mód szerint a transzgén natív promóferét alkalmazhatjuk. A natív promóter előnyös, lehet, amikor' az kívánatos, hogy a transzgén expressziója utánozza a natív expressziét:. A natív promóterí akkor alkalmazhatjuk, amikor a transzgén expresszíőjáf időlegesen vagy íéjlödésileg keli szabályozni, vagy szövet-specifikus módon, vagy specifikus transzkripciós sltmuíusokra válaszul. Egy további megvalósítási mód szerint más natív expressziós szabályozó elemeket, mint például enhaaszet elemeket, pohadeniiáciös helyeket vagy Kozak-féle konszenzus szekvenciákat is alkalmazhatunk a natív expresszió utánzására.
A transzgén egy másik megvalósítási módja szerint, a transzgén működő képesen van kapcsolva szövet-specifikus promóíerhez, Például ka váxlzomban való expresszíó kívánatos, az izomban aktív promótert kell alkalmazni Ezek közé tartoznak azok a promóterek, amelyek az alábbiakat kódolják: vázízom α-aktin, miozin 2A-könsyűláoc, disztrophm, izom kreatbkináz, valamint szintetikus izom promóterek, amelyeknek, magasabb az aktivitása, mint a természetben előforduló promótereknek [lásd például Li és mtsai, (Nat. Biotech. 17, 241-245. old, 0999)} Szövet-specifikus promóterek példái ismertek — többek között....... a májban [aíbumin, Miyatake és mtsai. I. Virol 71, 5124-5132. old. (1997); hepatitisz B vírus magpromóter, Sandig és mtsai., Gene Ther 3, 1Ö02-1Ö09. old. (1996); aifa-fetoprotd-n (AFP), Árbutbnot és mtsai., H«m„ Gene Ther, 7, 1503-1514. old, (1996)), csont oszíeokalcm [Síéin és mtsai., Mól. Bioi. Kép. 24, 185-196. old, (1997)}, osont sziaioproteín [Chen és mtsai, J, Boné Miner. .Rés. ti, 654-664. old. (1996)}, limfocítákban (CD2, Hansaí és mtsai., J,
Immuno). 161, 1063-1068, old. (1998); immunglobulin nebézlánc; T-sejt-receptor a-láne), idegi, mint például ueuron-speeifikus enoiáz (MSE) promóter (Andersen és mtsai. , Célt Mól. Neurobioi, 13, 503-515. old. (1.993)}, neurofíiamentumkönnyőlánc gén [Pieeioli és mtsai., P'roc. Nad, Acad Scl. USA 88, 5611-5615. old. (1991)) és a neuron-speclfikus vgf gén [Ficcioh és mtsai,, Neuron 15, 373-384. old (1995)},
2Ö Természetesen nem minden expressziós szabályozó szekvencia működik egyformán jól az összes találmány szerinti transzgén expresszáltatására. Azonban a szakember választhat ezek közöl az expressziós szabályozó szekvenciák közül anélkül, hogy eltérne a találmány oltalmi körétől. A szakember alkalmas promőter/mhanszer szekvenciákat választhat ki a leírásban feltárt útmutatás alkalmazásával. Az Ilyen kiválasztás rutinfeladat, és nem korlátozó a molekula vagy konstrukció tekintetében. Például kiválaszthatunk egy vagy több expresszibe szabályozó szekvenciát, amely működőképesen kapcsolódhat a jelentőséggel bíró kódoló szekvenciához, és beínzertálhstjuk a találmány szerinti transzgénbe, nfimgénhe és transzfer vírusba. Miután követtük a leírásban vagy a szakirodalomban a majom adenovirus pakolására szolgáló eljárásra adod kitanitást, alkalmas sejteket fertőzhetünk meg m vzZro vagy m wvu. A minigén sejtben található kópiaszámát Souíhern-bloíia! vagy kvantitatív PCR-rel követhetjük. Az RNS-expresszió szintjét Northern-blottal vagy kvantitatív BT-PCR-rei követhetjük. Az expresszió szintjét Western-biottal, immunhiszíokémiávsl, ELÍSÁ-val, RIA-val vagy a géntermék, biológiai aktivitásának. a tesztelésével követhetjük. Ily módon könnyen megvizsgálhatjuk, hogy egy adott expressziós szabályozó szekvencia alkalmas-e egy, a transzgén által kódolt specifikus termék esetében, és kiválaszthatjuk a legmegfelelőbb expressziós szabályozó szekvenciát Más megoldásképpen, amikor a bejuttatandó molekula nem igényel expressziét, például szénhidrát, poíipeptid, peptid, stb., nincs szükség arra, hogy expressziós szabályozó szekvenciák részét képezzék a rekomhináns majom adenovírusnak vagy egyéb molekulának.
Hí, Vírus kiszerelése a bejuttatáshoz
Á rekomb-inán-s majom adenovírusokat, előnyösen fiziológiásán kompatibilis hordozóban feíszuszpendálva, beadhatjuk ember vagy nem ember emlős páciensnek. Alkalmas hordozókat a szakember könnyedén kiválaszthat azon indikáció- függvényében, amelyre a transzfer vírus irányul. Például egy alkalmas hordozó-a sóoldat, amelyet különféle pufiferelo oldatokkal (például fosxíat-puíferelí sóoldat) szerelhetünk ki. Más szemléltető hordozók közé tartozik a steril sóoldat, laktóz, szukróz, kalcium-foszfát, zselatin, dextrán, agar, pektin, föl di mogyoró-olaj, szezámolaj és víz. A hordozó megválasztása nem korlátozó a találmány szempontjából
Adott esetben a -találmány szerinti, készítmények tartalmazhatnak — a rekomhináns majom adenovirus és a hordozóik) mellett -— más hagyományos gyógyászati alkotóelemeket is, mint például tartósítószereket, kémiai stabilizáiőszereket, vagy — vakcinaként történő alkalmazás esetében — adjuvánso-kat Alkalmas szemléltető tartósítószerek közé tartozik a klórbutanel, kálium-szorbát, szorbinsav, kéa-dioxid, propií-galíát, parabének, etilvanííin, glicerin, fenol és paraklór-fenol. Alkalmas kémiai sfabíhzálószerek közé tartozik a zselatin és alhumin. Alkalmas szemléltető adjuvánsok köze tartoznak — többek között — immunsfímuláló komplexek (ÍSCOM), LPS-analógok, mint például 3-O-deacilált monofoszföHHhpid-A (Ribi Imm-unochem Research, Inc., Hantikon, MT), ásványi olaj és víz, alumínum-hídroxíd, Ampfegun, Avu-dfeo, L12Vszkvalén, muramil-peptldek és szaponinok, mint például Quil-A
IV. Rekomhináns vírus bejuttatása kezelés és/vagy profilaxis vegeit
A rekomhináns, repbkáció-defektiv adenovírusokat „gyógyászatilag hatásos mennyiségben” adjuk be, ami a rekomhináns adenovirus olyan mennyisége, amely egy beadási útvonalon hatásos a kívánt sejtek transzfekfáíására, és a gén elegendő expresszíós szintjét biztosítja a terápiás vagy vakcináíási immunválasz eléréséhez, például valamekkora mérhető védő immunitás eléréséhez.
A beadás hagyományos és gyógyászatilag elfogadható útjainak a nem korlátozó példái közé tartozik az intranazálrs, íntrarauszkulárís, míratracheális, szubkután, intradennálís, rekiális, orális és más mukőzábs és parenterálís beadási utak. A leírás szerinti -értelemben a mukőzábs beadási útvonalak közé tartoznak azok,, amelyek a nyáikahártyás szövetekre juttatnak be;, nem korlátozó példaként iühaiáclő, orális, intranazálís, vaginába és rekiális beadási utak. A beadási utakat kívánt esetben kombinálhatjuk vagy módosíthattuk az immunogéntol és a betegségtől függően. Például veszettség profilaxisa esetében a szubkután, infratracheális, intranazálrs és orális utak az előnyösek. A beadás útja elsődlegesen a kezelt betegség természetétől függ,
A rekomblnáns rephkáciő-detektív Ad vírus dózisa és hatásos mennyisége elsődlegesen olyan faktoroktól függ, mint. például az állat állapota, kiválasztott, génje, kora, tömege és egészsége, és ez Ily módon változhat az állatok között.
A vitális vektor adagolása elsődlegesen olyan fényezőktől függ, mint például a kezelt állapot, a páciens kora, tömege és egészsége, és ily módon változhat az emlős páciensek (beleértve az embert is) között, Előnyösen a találmány szerinti rekombináns majom (például csimpánz) aáenovírasok váratlan hatásossága lehetővé teszi szignifikánsan kisebb mennyiségű rekombináns csimpánz adenovirus alkalmazását hatásos mennyiség biztosítására a kívánt imrounogeníkus hatás indufcálásához (példán! CD8A- T-seifek előre meghatározott szintjének az indukálása). Például a rekombináns majom adenovirus hatásos dózisát csimpánz adenovirus lö* pfu és KE ptu mennyiségével biztosíthatjuk. Azonban magasabb dózisokat is választhatok, például a bejuttatás választott útjáról függően. Példán! a vitális vektort olyan mennyiségben, juttathatjuk be, amely körülbelül 100 tő és körülbelül 100 ml között változik, előnyösebben körülbelül 1 ml és körülbelül 10 ml közötti, olyan hordozóoidaíban, amelyben a koncentrációja körülbelül 1 x I04 tarlód alkotó egység (p&) és körülbelül 1 x 10B pfu vírus/ml kozott változik, és körülbelül I x 10^ és körülbelül ! x löi! pfu/ml vírus közötti, 80 kg-os felnőtt testtömeget alapul véve. Egy előnyös adagolás körülbelül 50 ml sóoldat 2 x 10iíJ pfu/ml koncentráció mellett. Egy előnyös dózis körülbelül 1 és körülbelül 10 ml hordozó (például sóoldat) a fenti koncentrációk mellett. Követhetjük a kiválasztott gén terápiás szintjét, vagy az immunitás· szintiét, hogy meghatározzuk a megerősítő oltások szükségességét. A CDKr T-sejles válasz ....... vagy adott esetben — az ellenanyag-íiterek szérumbdl meghatározását követően adott esetben megerősítő oltásokra lehet szükség. Adott esetben a rekombináns majom adenovirusokat hemditó-megerősitő oltási rendben adhatjuk be. Különféle ilyen adagolási rendeket léírtak a szakirodalomban, amelyek közül könnyen választhatónk. Egy különösen előnyős eljárás az, amelyet a WO 00/11140. számú nemzetközi:
«η közzétételi iratban (2000. március 2.) tártak fél, amely hivatkozás útján· a kitanítás részét képezi.
Egy előnyös megvalósítási mód szerint a találmány tárgya eljárás CD8* T-seltes válasz preferenciális Indukálására 'humán ímmundeftcíencia vírus ellen alanyban, módosított gag fehérjét tartalmazó rekombináns majom adenovirus bejuttatásával. Az alábbi példákban bemutatott módosított gag fehérjét optimalizáltok, amint az 5 972 596. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban feltárják. A fehérje kódoló szekvenciáját .reprodukáltuk, és a 6. és 7. azonosítószámú szekvencián mutatjuk. be (lásd még; „Humán retroviruses and AIDS. A conrpúatlon and anaiysis of nucleic acid and ami no acid sequences”, szerkó G. Meyers és mtsai., kiad.; .Los Álamos National Laboratory, Los Alamos, NM (1991)1. Azonban bármilyen szakember számára ismert eljárást alkalmazhatunk a gag fehérje, vagy bármely más kiválasztott találmány szerinti immunogén vagy antigén javítására, például HíV~l gag kodon szekvenciák humanizálása, HIV-l gag spllcing hely eltávolítása, további vezetöszekvenciák hozzáadása a HIV-1 gag kodon szekvenciáktól leolvasással ellentétes irányban, Rozak-fele szekvencia inzertálása a HIV-l gag kodon szekvenciáktól leolvasással ellentétes irányban. Az optimalizálási eljárás megválasztása nem korlátozó a találmány szempontjából. Más megoldásképpen a találmány szerinti eljárást alkalmazhatjuk HÍV burokfehérjét vagy HÍV pol-t hordozó rekombináns majom adenovirus alanyba történő bejuttatására. Egy előnyös HÍV burokfehérje a HÍV glikopmlein-120, amelynek a szekvenciáját beszerezhetjük a GenBank-böI. Azonban más alkalmas virálís bor okfehérjéket is alkalmazhatunk. A HIV-l pol szekvenciája ismert, csakúgy mist különféle módosított pol szekvenciák [lásd például 5 972 596. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat és R. Sebeider és mtsai.., 11. Véről. 71, 4392-4903. old, (1997)].
Egy másik előnyös megvdösítási mód szerint a találmány tárgya eljárás CD8+ T25 sejtes válasz prefértmoiáhs indukálására kiválasztott rosszindulatú humán elváltozásra specifikus daganattal kapcsolatos fehérje ellem daganattal kapcsolatos fehérjét tartalmazó rekombináns majom adenovirus alanynak történő bejuttatásával. Ilyen fehérjék közé tartoznak sejtes onkogének, mint például mutált ras vagy p53 .
Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány tárgya eljárás CD-8-6 T-sejtes válasz
3-Ö preferenciáim indukálására kiválasztod rosszindulatú humán elváltozásra specifikus daganattal kapcsolatos fehérje ellen, daganattal kapcsolatos fehérjét tartalmazó rekombináns majom adenovirus alanynak történő bejuttatásával.
Egy még másik előnyős megvalósítási mód szerint a találmány tárgya rekombináns majom adenovirus bejuttatása, amely humán papillömavírushól származó fehérjét tartalmaz.
,»»» »?.
- 16 az azzal való fertőzés megelőzésére,. és kapcsolódó állapotok kezelésére és profilaxisára. Például a fehérje lehet az E6, E7 és/vagy U bármelyike [Seedorg K. és mtsai., Viroi. 145, 181-185. old. (1985)]. Amikor az állapot respiratorikus szinciciálís vírusos fertőzés, a fehérje lehet a glífcoprotón (G) vagy a .fúziós: fehérje <F), amelyek szekvenciája hozzáférhető a
GenBank-bóI.
Az alábbi példákkal .szemléltetjük, a találmányt, azonban annak oltalmi körét nem kívánjuk korlátozni. A szakember számára nyilvánvaló, hogy habár specifikus reagenseket és állapotokat mutatunk be az alábbi példákban, végrehajthatók olyan módosítások, amelyek beletartoznak a találmány oltalmi körébe és szellemébe.
1. példa — El-deletált vektor előállítása €68 csimpánz adenovírus alapján
Izoláltuk a C68 repiikádo-deféktiv változatát géntranszferben történő alkalmazásra. Azt a klasszikus stratégiát követtük, amelyben homológ rekombinációval El-deleíák rekombinártsí állítanak elő El-et expresszáló sejtvonaiban. Az első lépés a 0 és 1,3 m.-u
1.5 közötti részt tartalmazó plazntid előállítása volt, majd a CMV prométerről zöld fluoreszcens fehérlét (GFP) expresszáló minigén és a 9-16,7 m.u. közötti €68 szekvenciát átívelő rész hozzáadása következett. Ezt a Kncarízált plazmldot együtt betranszformáltuk egy EI-et expresszáló seitvonalba Sspl enzimmel emésztett €68 plaz-tnidon (az Sspl a 3,6 m.u. helyen vág, 4644 bp-t hagyva a homológ rekombinációhoz). A kísérleteket kezdetben 293-as
2.0 sejtekkel végeztük, amelyek humán Ad5~ből származó El-et tartalmaztak, abban reménykedve, bogy ez elegendő lesz a transzkomplementáciohoz. Valóban, kaptunk tarfoltokat, amelyek a kívánt rékombínánst reprezentálták. A kapott vektort G68-CMV-GFPnek neveztük.
A rekombinánsok előállítására alkalmazott stratégiát módosítotok hogy lehetővé tegye a rekomblnánsok gyors, izolálását. Először a kiindulási ingázó vektorban az aikalíkus fbszfatáz DNS-ét helyettesítettük prokariófa GFP génnel, amelyet a íacZ-böl származó prokariófa promóter irányított. Eís lehetővé tette a bakteriális transzformáció hatékony szkríneléséí, amikor megkíséreltük beépíteni a kívánt eukaríóta RNS-pol~H transzkripciós egységet az ingázó vektorba A kapott transzformációt szkrínelbetjűk GFP expresszi óra, a fehér kolóniák rekombinánsok, míg a zöld kolóniák megmaradt szülői plazmidok,
Zöld-Fehér szelekciót alkalmaztak az együttes transztékció szkrinelésére, amikor a humán Ad5 rekömbinánsokaí izolálták (A. .R. Davis és mtsai., Gene Thera. 5, 1148-1152. old, (1998)]; ezt adaptáltuk a C68 rendszerre. A kiindulási ingázó vektort átalakítottuk, hogy kiterjesztett 3’ szekvenciát tartalmazzon a 9 és 26 m.u. között. Ezt a vektort együtt ♦ »
- 17transzfektáltuk az eredeti C68-€MV-GkP-bö! származó vitális DNS-seí, amelyet hasítottunk Xhaí enzimmel, amely a ló,.5 m.u. helyen vág, és 9,5 Kb átfedést tesz lehetővé a homológ rekombinációhoz. A kapott tartóitokat fáziskontraszt mikroszkóp alatt szkrmeltük nemfluoreszcens izoláíumokra, amelyek a kívánt rekombinánsokat reprezentálják. Ez nagymértékben egyszerűsítette a szkrinelést,. összehasonlítva a szerkezeten vagy íranszgénexpresszión alapuló eljárásokkal.
A. Ingázó plazmid
Á refcombínáns €68 vírus előállítására szolgáló ingázó plazmid megkonstruálásához a
10- pSP72 plazmidot (Promega, Madison, WI) módosítottuk Bgí ö enzimmel történő emésztéssel, majd betöltöttük a végeket Klenow enzimmel IBoehringer Mannheim, índianapoiís, ÍN), és szintetikus· 12 bp Pác 1 kapcsolömolekulával (New En-gland Biolabs, Beverty, MA) ligáhnk, előállítva a pSP72-Pac plazmidot.. A A 56 bp Pác I/SnaB I feagmenst, amely a €68 genom 013 térképegységét (m.u, vagy MU) íveli át, a pNBB-B&rnE plazmidból izoláltuk, amely a €68 genom BamHI E-feagmensét tartalmazza;, ezt Pae I és EceR V enzimekkel kezelt pSP72~
Pac plazmádba ligáitok, előállítva a pSP~C68~MU 0-1.3 plazmidot. A citomegalovírus korai promőtere által irányított lacZ-t és SV4Ö poii-A. szignált tartalmazó minigén kazettát választottunk el a pCMVp plazmidból (Clontecb, Palo Aíto, €A) egy 4,5 kb EcoRX/Salí fragmeosként, és azt beligáltuk a pSP-€68~MD 0-1.3 pbznüdba, amelyet ugyanezekkel az enzimekkel hasítottunk, így előállítva a p$P-C6S~Mü 0-1. 3-CMVLaeZ plazmidot
A €68 9-16,7 MU régiója izolálásának kiindulási lépéseként mind a pGEM-3-2 plazmidot (Promega, Madison, MI), mind a pBS-€68-Bam'F plazmidot kétszeresen emésztettük BamHI és SphJ enzimekkel. Azután a pBS-€68-BamF píazmidböl származó 293 bp tragmenst összeligáltuk pGEM-32 gerinccel, előállítva a pGEM-CŐ8-MU 9-9.8 plazmidot.
A €68 MU 9,8-16,7 részét tartalmazó 2,4 kb tragmenst a pBS-G68 BaniHB klánból állítottuk elő Xbal emésztés, betöltési reakció: és azt követő BamHI kezelés után, és BamHí/Smal kétszeresen emésztett pGEM-C68-MU 9-9.8 plaznudba klónoztuk, igy előállítva a pGEMCÖ8--MU 9-16.7 plazmidot. A C68 9-16,7 m.u. régiöt pGEM-C68-MU 9-16,7 plazmádból izoláltuk EcoRI enzimmel történő emésztéssel, a végek Klenow enzimmel (Boehri'nger
Mannheinx Indíanapolís, ÍN) történő betöltésével, és egy szintetikus 12 bp BindlIT kspesolómoleküla (NEB) ligálásával, majd Hindöl enzimes emésztéssel. A €68 MU 9-16,7 régióját átívelő ezen fragmenst a pSP-C68-MU 0-1.3-CMVlacZ Hindii! helyere klónoztuk, előállítva a végső pCő8-CMV-LacZ ingázó plazmidot. Ezenfelül egy 820 bp alkalikus foszfatáz (AP) cDNS-fragmenst. izoláltunk a pAdCMVALP plazmidból [K I Fisher és ♦ X
- 18ntisaf, I Virol, 70, 520-532. old. 0996)], és kicseréltük lacZ-re a. pCőS-CMV-lacZ. Notl heíveiné L igy előállítva a p€6S-CMV-AP plazmídot.
B, Rckembináns vírus előállítása
Az EWeletált rekombináns C68-CMVEGFP vektor előállításához először megkonstruáltuk, a p€68 CMV-EGFP ingázó piazmidot, helyettesítve a lacZ transzgént a pCöS-CM'V-lacZ plazmidban a fokozottan zöld fluoreszcens fehérje (EGFP) génjével.. A helyettesítési klónozást, az alábbiak szerint hajtottuk végre. Egy további Nőt I restrikciós helyet építettünk be az EGFP kódoló- szekvencia 5* végére a pEGFP-1 plazmidban (Clontech, Palo Alto, CA) BamHÍ emésztéssel, betöltési reakcióval és egy 8 bp szintetikus Női I kapcsoló molekula (NEB) bel-igálá-sával. Mindkét konstrukció Nőt I restrikció-s emésztését követően izoláltuk az EGFP szekvenciát a módosított pEGFP-I plazmádból, és ezt alkalmaztuk a lacZ gén helyettesítésére a pCóS-CMV-laeZ plazmidban. A pC68-CMVEGFP konstrukciót (3 pg) együtt íranszfékiáltuk Ssp I enzimmel emésztett <368 genomíális DNS-sel (1 pg) 293-as -sejtekbe homoőg rekombináció érdekében, amint korábban leírták [G. Gao és ratsaL 1 Virol. 7Ő, 8934-3943. old. (1996)]. A fluoreszcens mikroszkópiával' láthatóvá tett zöld tartóitokat izoláltuk í-artolt-tisztííás két menetével, felszaporitással és CsCl-gradienses ülepítéssel történő tisztítással (G\ Gao és mtsak, mint fent).
A kényelmes zöld/fehér szelekciós eljárás alkalmazásának megkísérlésére (A. R. Davis és mísai, Gene Thera. 5, 1148-1152. old. (1998)} a rekombináns CőS vektorok előállításánál, a 9 és 36 MU közötti régiót átívelő 7,2 kb íragmenst. izoláltunk a pBSC68 BaiftB plazmádból Age I és 'Rsiwí restrikciós endonukíeázokkal történő kezeléssel, és a p€68CMV-AP ingázó pbzroid Asp7f8 és Agel helyeire történő klónozással, így előállítva egy pC68CMV-AP-MU36~nak elnevezett új piazraldoí. Egy további módosítást is végrehajtottunk a 26 és 36 m.u. közötti régió p€ő8CMV~AP-MÜ3ő plazmádból történő eltávolítására Eco4'7111 és Nrul enzimes emésztéssel. Á. p€ő8CMY-AP-MG26~nak nevezett új ingázó plazmidban. rövídebb a homológ rekombinációra -szolgáló régió (azaz 16,7-26 MG közötti szakasz) a minigén 37 végénél. Rekombináns: C68 vektor előállításához az alkalikus foszfetází (AP) helyettesítjük a jelentőséggel bíró génnel, A kapott pC68(3MV-Nogene-MG26 'konstrukciót együtt transzfektáljuk Xba I (16,5 MU) enzimmel emésztett CőS-CMVGFP vírális DNS-sel 293-as sejtekbe, majd feiső-agar rétegezésí hajtunk végre. A rekombináns vírus rekombinánsokat (fehér) homológ rekombinációval állítjuk elő a 16,7-26 MG régióban, amely közös a pCöSCMV-Nugene konstrukció és a (768 vitális gerinc között; a fehér
- 19 tarlóitokat létrehozó rekombínánsokat kiszelektáltok a hasítotton -CőS-CMV-CiFP vírus zöld tarfeltjai közül.
A zöld/fehér szelekciós mechanizmust belefoglaltok a jelentőséggel híró gén pCő8 ingázó plazmidba történő klónozásának folyamatába is. Az AP gént a pC68CMV~AP-MU3ó és pC68€MV-AP-MU2ő plazmídok mindegyikében helyettesítettük a lacZ promőter által irányított prokarióta GÉP gént tartalmazó kazettával, amelyet pGFPMGSI plazmádból (Cíonfech, Palo Alto., CA> izoláltunk. Ily módon a bakteriális tramzformánsok fehér kolóniái tartalmazzák a rekombináns plazraidot. A bakteriális kolóniák ezen zöld/fehér szelekciójával elkerültük nagyszámú miniprep-DNS előállításának és jellemzésének a szükségességét, és ezenkívül tovább javítottuk a rekombináns €68 vektorok előállításának a hatékonyságát.
2. példa — Antigén expresszáltotasa. <Gag szekréciója) majom adenovírus konstrukciókkal fertőzött T& -sejtekben
A leírt módon előállítottuk a B osztályba tartozó HIV-1 gag génjének csonkolt 15 formájának, módosított nukleon d-szekvenciájú verzióját hordozó csimpánz 68~as törzs (Adchirnp68) és humán 5-ös törzs (Adbu5) rekombinánsait [1. példa és Z. Q. Xíang és mtsai., Viroí. 219, 200. old. (1996)]. A .HIV-1 szerkezeti fehérjéinek — köztük a gag is — transzkriptemai genetikailag instabil elemeket tartalmaznak, amelyek a rév fehérje jelenlétét igénylik a nukleáris transzporthoz és a hatékony expresszióhoz a cítopíazmában [S, Schwartz
2Ö és mtsai., X Viroí. 66, 7176, old. (1992); S. Schwartz és-mtsai., J. Vírot 66, 150-Í59. old. (1992); G. Nasionlas és mtsai, X Viroí. 68, 2986. old. (1994)], Az adenovirusok. a nukleáris transzkripciótól függenek, és ily módon szükségük van a rév fehérjére a. HIV-1 fehérjék expressziójához. A Rev-től való függőség elkerülésére a gag kodon-módosítoít szekvenciáját ......amelyből heiyspecífikus mutagenezissel eltávolítottak a genetikailag instabil elemeket.......
[R. Schneider -és mtsai,, J. Viroí. 71, 4892. old. (1997); S. Schwartz és mtsai., J. Viroí. 66,
7176. old. (1992); S. Schwartz és mtsai., I Vírel. 66, 150. old. (1992)] inzertálíuk az. adenovírus vektorba. A beépített gén a csonkolt p37gag fehérjét (pl 7 és p24 régiók) kódolja. A csonkolt gag fehérje nem hoz létre virális részecskéket, és részlegesen szekreíálődik a transzfektáit humán sejtek felülúszójáha [R. Schneider és mtsai., J. Viroí. 71, 4892. old.
(1997)1 A rautáltaíod gag .konstrukciókat alkalmazták vakemálásl kísérletekben, és eelluíáris és humorális immunválaszt eredményeznek egerekben és főemlősökben [X Ϊ. Qiu és mtsai.,
J. Viroí. 73, 9145. old. (1999)].
Előállítottuk az AdehimpőS és az Adhuó refcombinánsok mindegyikét, és azokat 293as sejtekben szaporítottuk, amelyek az 5-ös humán adenovírus törzs El-ével voltak
- 20 transzfeklálva. Azt találtuk, hogy ez a heterolog El alkalmas az E1 -ddeíáíi AdchimpóS vírus rekombinánsok komplementáiására, és Ily módon csökkenti a rekombináció és reverzió kockázatát repiikácíó-kompetens vad típusú vírussá.
A gag fehérje jelenlétét a ΪΚ’-tenyészetek felülúszójában Western-blotíal elemeztük, 5 amelyben gag elleni monoklonálís egér ellenanyagokat alkalmaztunk. TKA-sejteket (I x 10ó) fertőztünk 48 órán keresztül Adhn5gag37 vagy Adchím.pő8gag37 vírussal (10 pfu sejtenként). További TK'-sejteket fertőztünk olyan Adhu5 vagy AdchünpóS konstrukcióval, amely a veszettség vírusának glikoproteinjét expressxáiíák. A tenyésztő felül úszóban található fehérjéket 12%~os denaturáló poliakríiamidgélen választottuk el, és eiektroblottolással PVDF10 membránra vittük, át. A blotoí HÍV-1 p24 elleni I83-1T12-5C monoklonálís ellenanyaggal estettük meg ÍB. Chelsebro és ratsai., .1. Vírol. 66,6547. old. (1992)].
Az ezt a módosított szekvenciáin gag-ot hordozó két adenovirus rekombináns klón (Adhu5gag37:, Adchimp68gag37) a transzgén terméket összemérhető szinten espresszálta, amint azt Western-blot elemzéssel kimutattuk. A várt mérető (37 kDs) fehérjét ....... amely kötődött a gag elleni monoklonálís ellenanyaghoz.......detektáltuk bármelyik adenovirus gag rekombináns 10 tartölt-fermáló egységnyi (pfu) mennyiségével fertőzött TK'-sejtek felülúszölában. A kontroli sejtek, amelyeket Ad hu 5 vagy AdchimpóS rekombinánsokkal fertőztünk meg — amelyek a veszettség vírus ghkoprofeinjét expresszáhák (ÁdhuSrab.gp és Adch.imp68.gp).......nem termelték ezt a fehérjét.
3. példa — CÖ8+ T-sejtes válasz indukáláss emlősökben gag ellen majom adenovírusokkal
Az alábbi kísérletben azt mutatjuk be, hogy az Ádhu5gag37 vagy az Aáchimp6Sgag37 rekombinánsokkal mtramuszkulárisao (i.m.) oltott egerek lépsejtjel válaszoltak a gag fehérje egy ímmundomináns epitógjára [8 l)oe és C. M. Wálker, AIDS lö, 793. old. (1996)} citokin, azaz ínferferon-(IFN)-y termelésével, valamint a célsejtek hzisévei.
A. Cttokín-felszabadííási vizsgálati eljárás
Balb/c egerek hármas csoportjait i.m. immunizáltuk 2x10) 2 x 10° vagy 2 x 10’ pfu Adchimp68gag37 vírussal, 2 x 1(E pih AdhuSLl vírussal [H. C. I Érti és mtsai., X. Vlrol. 63,
2885. old. (1989)], 2x HÉ pfu Ádhu5gag37 vírussal vagy 2x 10'' pfu W.gag vírussal. A.
lépsejteket 10 nappal később teszteltük CD8r ϊ-sejtes válaszra. A citokin (íEN-y) termelés vizsgálatához a lépsejteket (1 x WVminta) 5 órán keresztül tenyésztettük 37 Tkon 3 ugZml
AMQMLKETi pepiiddel (I. azonosítószámú szekvencia) ...... amely H-2d haplotípus immundomináns CD8-r T-sejtes epitöpját hordozza.......és 1 ug/ml Brefeidin-A-val (GolgiPlug,
-2.1 PharMingen, San Diego, CA) 96-méróbelyes kerekiesmkü míkrotitertemezekben ZWóecms vmrn/YY AérgYs mxvnm íápközegben (DMEM), amely ki volt egészítve 2% magzati marhaszérommal (FBS) és ΚΓ M 2-merkaptoetanullal. A sejteket megmostuk PBS-sel, és 30 percen keresztül mkuWütufc 4 °C-on FÍTC-eel jelzett egér CDS ellem ellenanyaggal. A sejteket megmostuk, és permcabilizáltuk IX oldatban (PharMingen). 20 percen kérésziül 4 *C-on. A sejteket 3-szór megmostuk oldattal (PharMingen), és ugyanabban a pufferben inknbáhuk 30 percen keresztül 4 *€-o« PE~veí jelzett egér l'FN-γ elleni ellenanyaggal. A mosás, után a sejteket kétszínű áramlási citometriával vizsgáltuk, meg, és az adatokat JfbmD? szoftverrel elemeztük, A jobb oldalon látható szám mutatja azon CDS* iö sejtek százalékát az összes €D8* T-sejtre vonatkoztatva, amelyek pozitívnak fesíődtek IFX-yra.
Az egyetlen immunizálás után 7~1Ö nappal a teljes íépbell CD8'r T-sejt-populáció jókora részlete termelt IFN-γ-ί a gag pepiidre válaszul. Az elsődleges Iépseiteket további ín viiro szaporítás nélkül vizsgáltuk gag pepiiddel előkezelt, Η-2-vel kompatibilis lizált célsejtekkel. A gag-speci íikus CDIT T-sejt-akdvitás jobb volt az AdehimpöS konstrukcióval történő immunizálás után, amely -16-19%. gag elleni CD8 '' T~sejt gyakoriságot ért el az egész lépdeli CDF sejtpopulációra vonatkoztatva. A válasz dózisfüggő volt, amint art bemutatjuk, az Adcbimp6Sgag37 vírus esetében, ahol a 2 χ ICÓ ptu alacsony virusdózis még mindig közel lö% gyakoriságot váltott ki. Az Adhu5gag37 rekombináns -9% optimális gyakoriságot indukált 2xl(k pút-nál. Ezek a gyakoriságok nem. javultak szignifikánsan a vakcina dózisának az emelésével (adatokat nem köziünk), A teljes bosszúságé gag-ot expresszálö rekombináns ÍVYgag, amelyet vDRl-nek neveznek S Chacarabarti és mfsai. — Mól. Célt Bioi, 5, 3403.. old. (1985)] sokkal alacsonyabb CDS'1' T-sejt gyakoriságot stimulált intracelluláris díokm-festéssel meghatározva.
B. Célsejtek Ibise
Tíz nappal korábban az A pontban ismertetett rekombináns egyetlen dózisával vagy a VYgag rekombináns két dózisával — az első dózis i. m. adva, majd a második dózis két héttel később intraperitoneális injekcióval......Immunizált egerek lépsejtjeit teszteltük öt órás ;Cr felszabadulási vizsgálati eljárásban változó efiéktor: célsejt arány mellett I x KP PS I 5 sejten, amelyeket 16-24 órán keresztül kezeltünk szobahőmérsékleten vagy a gag pepiiddel (teli négyzetek) vagy a 31D kontrol pepiiddel (X), amely a veszettség vírus nukloproteinjenek a szekvenciájából származik )H. C, J, Érti és rutsal., 1 Virol, 63, 2885 old. (1989)1. A YVgag vakcinából két immunizálásra volt szükség detektálható T-sejá-közveíitett gag-speeifikas elsődleges oitolixis mtlukáíásához.
*« * * * * * * ** a * ♦ « **·* >*<♦
C, A gag elleni CDS' T-sejtes válasz kinetikája
Balb/c egerek négyes csoportjait immunizáltuk 5 χ ÍO° pfu Adhu5gag37 vagy
Adchimp68gag37 vírussal. A lépsejfekeí 6-12 nappal később begyűjtöttük, és teszteltük IFH-γ termelésre és célsejtek ilzisóre, amint fent ismertettük. A két adenovirus rekombináns által indukált gag elleni CD8'r T-sejtes válasz kinetikája .különbözött. Az Adbu5gag37 víras által prezentált választ 2-4 nappal korábban érte el a csúcsot, mint az Adchímp68gag37 rekombináns el leni CD8+ T-sejtes válasz.
4. példa....... Humán adenovlrusnak vagy majom adenovirus vakcinának való korábbi kitétel hatása
A. közönséges 5~os humán adenovirus törzsnek való korábbi kitettség vizsgálatához egereket immunizáltunk AdhuS rekombináns egyetlen dózisával, amely irreleváns antigént (humán papillömavlrus Cl) expresszált. Két héttel később az egereket az AdhuSgagS? vagy az Adchimp68gag37 vakcinával vakcinájuk,.
Közelebbről, az egereket I. m. immunizáltuk l'ö8 pfu AdhuSLl vakcinával. Két héttel később az Adhu5-tel immunizált, valamint naiv egereket beoltottunk 2 x iöü vagy 2 x 10' píú Adhu5gag37 vagy Adchhupő8gag'37 rekombinánssaí (csoportonként 4-5 egeret), AdhuSLlvel immunizált vagy naiv egerek további csoportjait 2xlö° pio Adhu5gag.37 vagy theAdc'himpő8gag37 vírussal immunizáltuk. Kilenc nappal később az egereket intraperítoneálisan -beoltottuk lő* plu teljes hosszúságú gag-ot expresszálö íb«w vírus rekombinánssaí. Az egereket a Vaccinia vírus beoltása után öt nappal feláldoztuk.
Az AdhuS vírusra korábbi immunitással rendelkező egerek nem reagáltak a gag-ra. az Aáhu5gag37 vakcinával történő vakcínálás után, A kontroli egerekben látott CD8' gagspeciftkus T-sejt-gyakori sápokat mutattak, és ennek megfelelően a lépsej tjeik nem lizáiták a gag-ot expresszálö célsejteket. Ezzel ellentétben a gag elleni CD-84' T-sejtes válasz csak kissé emelkedett az Adchimpő8gag37 konstrukcióval vakcináié, AdhuS-re immúnis egerekben. A gag elleni CD8T T-sejt-gyakori ságok csak -30%-kal csökkentek, és a lépsejtek citoiitíkus aktivitása '-5ö%-kal csökkent különböző effektorxébejt' arányok esetében, ily módon mindkét adenovirus rekombináns akkora gag elleni CDS' T-sejt30 gyakoriságot indukál, amely felülmúlja az olyan korábban leírt vakcinák által kiváltottak mint például a csupasz DNS vagy himlovirus rekombinánsok [S, Schwartz és mtsai., J. Viroi. 66, 150-152. old. (1992)], és szintén magasabbak voltak, mint a krónikusan fertőzött személyekben általában látottak (D. II Barouch és mtsai., Proc. Mail, Acad, Sci. USA 97, 4192. old. (200ö); T. U, Vogel és mtsai., .1. Immunoi 164. 4968 old. (2000); P. A.. Ooepfert
és mtsai., J. Virol. 74, 10249. old. (2000); C. R. Rinaido J-r; és mísai., AIDS Rés. & Hűm. Retr., 14, 1423. old. 11998)]. Ezek az ered?nenyek megerősítik .az .adenovirus rekombináns vakcinák hatásosságát.
5. példa — CDS’ í-sejtek antigénre történő beindításának és megerősítésének a hatása
2x10' pfu Ádhu5ga-g37 vagy Adcbimpő8gag37 vírussal immunizált naiv vagy Adhu5-re immúnis egerekből származó elsődleges lépsejteket hasonlítottunk össze 2 x 10ö pfu Adhu5gag37 vagy AdchimpöSgag37 vírussal immunizált, és azután 10?> pfu of VVgag vírussal megerősítést kapó naiv vagy Adhu5-re immúnis egerekből származó Iépsejíékkel. A lépsejteket öt nappal később elemeztük CD8~ra és míraeellulárís ΙΕΝ-γ-ra. Ezeket a. vizsgálatokat lényegében a fentebb leírt módon hajtottuk végre, azzal a kivétellel, hogy nemvolt további tenyésztés a gag. pepiiddel vagy a 31D kontroll pepiiddel kezelt P815 sejtek lizí-se végett az öt órás- >JCr vizsgálati eljárásban.
Heteroíóg vakcinakonstrukcióvai, a VVgag rekomhinánssal történő beindító vagy megerősítő immunizálás nem állította helyre az. AtlhuS rekombináns vakcina által prezentált gag elleni CDS' T-sejtes- választ. Habár az. Adhu5~t.el vakcináit és A.dhu5gagp37-tel és Wgag-gal megerősítést kapott állatok akár a lépbeii CDIT T-sejtek 7,1%-ában is előidézték IFN-γ termelését válaszul -a gag-m, ezek. a CD§+ T-sejteknek egyáltalán nem volt citolitikus aktivitása a gag~ot prezentáló célsejtekkel szemben. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a vakcináho-rdozó antigénéi elleni korábbi kitettségnek nemcsak kvantitatív, hanem kvalitatív hatása is volt a. CDS T-sejtes válaszra az adenovíms rekombináns transzgén termékével szemben Az AdchímpóSgag37-tel vakcináit Adhu$-re immúnis egerek gag elleni CD8 Tsejtes válasza megerősítési hatást mutatott VVgag immunizálás után, ahhoz hasonlóan, amit naiv egerekben is láttunk..
A gag elleni CDS T-sejt-gyakoriságok, valamint az -elsődleges célsejt-llzis tovább fokozható volt beindítással (adatokat nem közlőnk) vagy heteroíóg vakcin-ahordozőval, mint például a VVgag rekombináns-sal történő megerősítéssel. Az adenovirus rekombínánsokkal történő i. m. beindítás és 9 nappal azt követő Wgag-gal történő i. p. megerősítő- immunizálás után a CDIT gag-speciőkns T-sejiek 5 nappal a beindítás után a teljes lépheti CD8G sejtpopuláció -· 40%-át alkották
Az AdhuS elleni korábbi immunitás- erősen csökkentette az Adhu5gag37 vakcina hatékonyságát, de csak kissé rontották az Adehimp68gag37 vírus elleni CDS-v T-sejtes választ. Korábban beszámoltak .arról, hogy az Adh«5 vírussal Immunizált egerek csökkentett B-sejtes választ fejlesztettek ki veszettség elleni AdkuS vakcina hatására. A vakcina dózisának a növelése vagy olyan DNS-vakcína alkalmazása, amely a- veszettség vírusának ugyanazon antigénjei expresszit^, könnyedén megkerülheti az. Adhu5 vírus elleni korábbi kitettség csillapitó hatását [Z. Q. Xiang és mtsai., J. Immunoi. 162, 6716. old. (i999)1.
Ezzel ellentétben az Ádhu.5 rekombináns vakcina által prezentált gag elleni CD8+ Tsejtes válasz megszűnt az AdhuS-re immúnis- egerekben, és csak részlegesen lehetett helyreállítani további immunizácíókksl gag elleni heteroíóg immunizálásokkal. Ez azt jelezheti, hogy a CDSE T-sejtek indukálása érzékenyebb lehet a keringő vírussemiegesitö ellenanyagok általi zavarásra, összehasonlítva a R-sejtek stinmlálásával.
6. példa — Veszettség glitoprofemf tartalmazó rekombináns adenovírusok előállítása
2-es, 4-es, 5-ös, 7-es és 12-és humán adenovirus szerotipusokat és 68-as csimpánz szerotípust szaporítottunk és titráífnnk humán 293-as sejteken. A veszettség vírus ÉRA szerotípusának a glikoproteinjét vagy a 16-os humán papiUomavírus (HPV) ti fehérjéiét expresszálő humán 5-ös szerotipuson alapuló rekombináns adenovimsokat korábban leírták (2. Q. Xíang és mtsai.., Viroiogy 219, 220-227. old. (1996); D. W. Kowalcyk és .mtsai,, „Vaccine régimén fór prevention of sexual.lv transmitíed infections with: humán p-apillomavirus- type 16.’; Vaccine (2001.)]. A csimpánz 68-as szerotípusának adenovimsáin alapuló expresszié» rendszert fejlesztettünk ki, amint az; 1. példában bemutattuk.
Az El-en szaporított adenovimsokat (amelyek az 5-ös humán szerotípussal íransz&ktáit 293-as sejtekből származtak —F L. Graham és mtsai., .1. Gén. Virul. 36, 59-74. old. (1977)] gyűjtöttünk be a sejtek fagyasztásával és felolvasztásával. Bizonyos· kísérletek céljára a vírust -CsCÍ gradi-ensríszrítással megtisztítottuk. Más kísérletek esetében a fertőzött sejtek három rnenetnyí fagyasztás-olvasztással nekrotízálf foltisztitött relülúszóit alkalmaztuk. A. vírusokat 293-as sejteket bíráltuk a tarfoit-alkotó egység (ptu) meghatározására.
A veszettség glíkoproteint expresszálő rekombináns 68-as szerotípusú csimpánz adeno-vírust, amelyet Adcfómpő&rab.gp-nek neveztünk, 5-ös humán szerofípus El-ével transzfektált 293-as sejtekben állítottuk elő, amint részletesen leírjuk ebben a példában. A vitális kiónokat először indirekt ímmunfluoreszoenciával szkríneltük az 509-6 jelű monoklonális ellenanyaggal, amely a veszettség vírus glifcoprotein. konformáció-függő epítónia ellen irányul. Egy stabil adenovírus szubfclón kiszeíekíálásá után immunpreeipitáciőval igazoltuk a teljes hosszúságú vírus glikoprotein Ádchimpő8rah,gp vírus általi expresszióját fertőzött ϊΚ-sejtekben, amint a következő példában leírjuk.
7, példa — Transzgén termék expresszáltaiíba adenovírus rekonihiuánsokkak
-25Ebben a példában bemutatjuk, hogy az Adhn5 vírus kifejezetten magasabb színtű veszettség vírus glikoproteín-expresszíőt ért el TK-sejtekben, összehasonlítva az Ádchirnp68 konstrukcióval. A. transzgén íranszkrlptumának a koncentrációja párhuzamos volt a fehérje expresszióval, azt jelezve, hogy a különbség sem poszt-transzlációs módosítások miatt. volt. A TK'-sejtek CAR-pozitivok, ily módon a vitális szerotíposok általi transzdukciő arányának összehasonlíthatónak kell lesnie,
Ezekben a 'kísérletekben emlőssejteket, például bébi hörcsög vesesejteket (BEIK-21 sejtek), El-gyei transztéktált 203-as sejteket és TK’-sejíeket szaporítottunk öngfeceo k níOífeáen .Zfegfels wtWrw tápközegben (.DMEM), amely ki volt egészítve glutaminnal, Napíruváttal, nem-esszenciális arainosavakkaí, HEPES paíferrel, antibiotikummal és 10% magzati rearhaszérammaí (FOS),
Á. lmmuηpreeipitáeió
TK'-s&jteket (löc mintánként) fertőztünk 5 ptu/sejt veszettség vírus gfikoproteint expresszáló adenovirus rekombiuánsokkal vagy nem rokon vírális antigént expresszáló kontroli konstrukciókkal. 48 óra elteltével a sejteket kétszer megmostuk steril foszfátpulferek sóoldattai (FBS)., és azután 90 percen keresztül inkubáltuk szérummentes tápközegben, mielőtt hozzájuk adtunk 20 pl -S-jelölt ciszteint és metionint (Promix, NBN, Boston, MA)·. 4 óra iakubálás után a sejteket megmostuk PB.S-sek és 20 percen keresztül kezeltük 1 ml, proteáz-ínhlbitorokat tartalmazó PIPA puflérrel. A sejteket és a sejttörmelékeket eltávolitottuk a mérőhelyekből, röviden vortexeltük, és 3 perces keresztül centrifugáltuk I200Ö rptn-en. A felülúszöi 90 percen keresztül inkubáltuk 4 °C-on 15 ul/mi aszcítesz-felyadékkal, amely a veszettség vírus glikoprotein elleni 509-6 monokionáíis ellenanyagot tartalmazott. adtunk hozzá mintánként 75 pl mennyiségben, és 4 s'C-on gyenge rázatás mellett 30 percen keresztül inkubáltuk. A mintákat lecenírífugáltuk, és 4-szer megmostuk KIFA púderrel. A csapadékokat újra felszuszpendáltuk 80 ui mmtafelvívo-pnfferben, és 4 percen keresztül forraltuk. A. mintákat (20 gl) azután 1236 SDS-pohakrilamld (PAGE) gélen választottuk el, molekulatömeg-standarddal összehasonlítva. A géleket szűrőpapírokra szárítottuk, amelyeket 48 órán keresztül exponáltunk Efeáfe óetetkw Anpghtg Εϊ/m-re (X-Omat Blue XB-.1).
Az Adchi.mp68rab.gp rekombináns várt méretű fehérjét expresszált, amely kötődött az 509-Ö ellenanyaghoz. Az Adhuűrab.gp vírussal fertőzöd TK'-sejtek csapadéka azonos méretű csíkot mutatott, amely hiányzott a nem rokon transzgén termeket expresszáló -adenovirus rekomblnáusokkai fertőzött sejtek lizátumaiból. A veszettség vírus giíkoproíem expressziója kifejezettebb volt az AdhuSrah.gp konstrukcióval fertőzött sejtekben. A transzgén termék
- 26espresszíöján&k a .különbsége pre-transzíációs eseményeket tükrözhet, mint például különbségei a vírus felvételében, a transzkripció: sebességében vagy a transzkrioíum stabilitásában. Más megoldásképpen a transzlációs vagy poszt-transzlációs különbségek, mint például eltérő oldallánc-módositások is kvantitatív különbségeket eredményezhetnek a szerológiailag detektálható fehérjében.
Azért, hogy tovább megkülönböztessük, ezt a két lehetőséget izoláltuk az össz-RNS-t az adenovirus rekombinánsokkal fertőzött I’K-sejtekböl. A veszettség vírus glikoprotein és háztartási gén reverz-íranszkripcióval készített mRNS-ét áhítottak elő valósidejű FCR-rel, amint a B. részben leírjuk.
B, Valósidejű reverz-transzkripciós pofimérázd ánereakctö (FCR)
TK'-sejtek összefüggő egysejtes rétegeit fertőzőik két párhuzamos mintában 10 pfu adenovirus rekornbinánssal. 24 órával később sejteket izoláltunk, és kivontuk az RNS-t TR1 reagenssel a gyártó utasításai szerint. (Mól. Rés. Center, Cincinnati, OH}. Az RNS-t RNázmentes DNázzal kezeltük, fenolos extrakcíóvaí megrisztitottnk, és 50 ng RNS per minta koncentrációjúra állítottuk be. Az RNS-t reverz-transzkrípeióval átírtuk, és a £/gAr ó’ycferAAd rímpöjüeurttví árt ölztík grecu reagenskésziettei amplltíkáltuk ÍRocfie, Mannbeim, Germany; Z, He és mtsaL, Virology 27ö, 146-1617. old. (2000)], a veszettség vírus glikoprotein (2. azonosítószámú szekvencia: 5ΆΑ GCA TFT CCG CC-C AAC A.C, 3. azonos!tószámú szekvencia: 3’GGT TAG TGG AGG AGT AGG TAG A) , és a gfotáraídehid-3-foszíat-dehidrogenáz (GAPDH) háztartási gén (4. azonosítószámú, szekvencia: 5’GGT GAA. GGT CGG TGT GAA CGG ATT T; 5, azonosítószámú szekvencia: 3ΆΑΤ GCC AAA GTT GTC ÁTG GAT GAÜ €} iáneindltoínak az alkalmazásával.
Az t. táblázatban bemutatott adatok mutatják az eredményeket. Az adatok a két párhuzamos mérés átlagát mutatják szórással.
1. Táblázat
RNS forrása Relatív transzfóptum-mennyiség
GAPDH rab.gp Arány (GAPDH/rab. gp)
TK‘, Adhuárab.gp 3,2 ± 0,2 3494.-t-. 18 I0S2
TK', AdehimpóSrab.gp 0,52 * 0,01111 64 4; 6 04
Amint ezek. az adatok mutatják, a háztartási génre formalizált transzgén íranszkrípíuraok kvantitatív különbséget mutattak a szeröiögiaiíag detektálható fehérjével.
Ebben a példában nem bemutatott adatok alapján két másik AdchimpőS reko-mbináns
.......amelyek a zöld fluoreszcens fehérjét és a humán immuttdefícieneía vírus kodon-módoshott csonkolt gag-febégéjéí expresszálíák — is összehasonlítottunk az. ugyanezeket a transzgéu termékeket expresszié Adhu5 rekomblnánsokkah és ekvivalens fehérjeexpressziót mutattak
TK'-seítekben. Ebből azt a következtetést vontuk le, hogy a veszettség vírus .glikoprotein AdehimpóS vírus általi csökkent expresszíőja nem a vitális felvétel, sem a transzkripció sebességében lévő különbséget tükröz, amit mindkét konstrukcióban -ugyanazok a szabályozó elemek irányítanak.
8. példa — Egerek immunizálása veszettség vírus antigén allodnmzásával
Az AdchimpöSrab.gp vírus elleni veszettség-víras-specifikus ellenanyag-választ összehasonlítottuk az AdhuSrab.gp vírus ellenivel, egerek beltenyésztett és nem beltenyészfett törzseiben. Az egereket a rekombinán-sok sorozatbígításaíval oltottuk s,c. vagy i.u. Szérumokat gyűjtöttünk 14 nappal később, és teszteltük azokat a veszettség vírus gükoprotein elleni· ellenanyagokra ELISÁ-val és vírussemlegesftési vizsgálati eljárással. Nem rokon tran-szgé-n-í, azaz HÍV-1 .gag-féhérjéjét expresszáló adenovirus rekombinánsokat (aiuint a fenti példákban leírtuk) alkalmaztunk kontrollként. Ezek a rekombinánsok nem indukáltak egyik vizsgálati eljárás által detektálható ellenanyag-választ sem a veszettség vírus ellen. A vizsgálat részletesebb tárgyalását és az eredméttyeket alább mutatják be.
6-8 hetes nőstény €3H/He és C57BV6 egereket vásároltunk a. Jackson Laboratory cégtől (Bar Harbor Maine). Nem beltenyésztett ICR egereket vásároltunk a Charles Kiver cégtől (’WíImington. MA).
Az egereket az adenovírusok vagy adenovirus rekombinánsok különböző dózisaival oltottuk be 100 pl sóoldatban szubkuíán (s. e.j, vagy 50 μΙ-ben íntranazáhsan (i. n.). .Az egereket veszettség vírus CVS-ki törzsével fertőztük 10 átlagos, letáhs dózissal (LDw) iníracerebrálisan (í.c.). Az Evelyn-Rokitmkí-Abdseth (ERÁ) és a ’Challenge Vírus Standard’ (CVS)-11 veszettség vírus törzseket BHK-21 sejtekben szaporítottuk. Az ERÁ vírust szukrózgradiensen tisztítottuk, ínaktíváltuk héta-propíonolakton kezeléssel, és 0,1 mg/ml .fehérjekoncentrá-cióra állítottuk be. A CVS-11 vírust BHK-21 sejteken túráitok, felnőtt ICR egerek íntracerebrális oltásával (Z..Q. Xíang, Z. Q, és H. C, Érti, R. Virul Metb. 4-7, 103-116. old. (1994)j. A fertőzés után az egereket ellenőriztük minden 24-48 órában, legalább 21 napon keresztül Az egereket eutlrauizáítufc, miután kialakult a teljes hátsóláb paralízis, ami a veszeítség-vlrus általi végső enkefeihíszre utal.
«X ~ ··
A szeroíogiai vizsgalati eljárások, enzim-kapcsok iPmumadszorbens vizsgálati eljárás(EI.ISA), ellenanyagok izotípus-profdja és vírussemlegesifési vizsgálati eljárások voltak.
A. ELíSA
Az egereket különböző intervallumokban vérezteúük az immunizálás után retro5 orbkálls szúrással. A szérumokat előkészítettük és teszteltük veszettség vírus elten ellenanyagokra, 0,1 pg/mérőhely inaktivált veszettség vírussal bevont míkrötíterlernezen. A szérumokat teszteltük adenovirus elleni ellenanyagokra, 0,1 pg/mérőhely tisztított El-ddetált adenovirus GFP-rekombinánsokkal, 5-ös humán szcrotípusban vagy 68-as csimpánz szerotípusban. Az ELISA-kat alapvetően korábban leirí módon hajtottuk végre [2. Q. Xiang és mts-ai., Virology 219, 220-227. old. (1996)j. A lemezeket éjszakán keresztül vontuk be.. Azután blokkoltuk azokat 24 órán keresztül 3% marhaszérum-albumint (BSA) tartalmazó PBS-sel. Mosás után PBS-3%BSA pufierbe-n meghigitoít szérumokat adtunk 60 percen keresztül. Mosás után alkalikus fbszfatázzal konjugálí kecske anti-egér-Ig (Cappe-I) 1:100 hígítását adtuk l órán keresztül jégen.. Mosás után szubsztrátoí. adtunk 20-30 percen keresztül szobahőmérsékleten. Az optikai denzitást 405 rnn-en olvastuk le.
0. Az ellenanyagok izotípusa
A. veszettség vírus elleni ellenanyagok izotípusát. £IJSÁ.-val határoztuk meg inaktivált ÉRA vírussal bevont mikrotiterlemezeken a öM/öúxwzu Hybridowa Subisotyping (LaJoíla, CA) reagenskészlet alkalmazásával, néhány korábban teirt módosítással (Xiang, Vírok, 1996, mint fent).
Az ellenanyagok izoíípus-profiíja különbözött s. c. immunizálás után, de összehasonlítható volt a két adenovirus vakcina i. n. beadása után. Mindkét rekombináns — akármelyik oltási útvonalon adva ....... tgG2a ellenanyagokat indukált a veszettség vírus antigénje ellen.
Mindkét rekombináns i. n. immunizálás után és az Adh-u.5rab.gp- vakcina s. c. beadás után kifejezett IgGí választ indukált, ami a Th2 segítség jele, ami nem volt meg az s. c. adott Adchimp68rsb.gp konstrukció esetében.
C. Semlegesítő ellenanyagok
A. szérumokat teszteltük semlegesítő ellenanyagokra a veszettség vírus CVS-11 törzse ellen, amely -aittgemkusan közeli rokona az ÉRA törzsnek (Z. Q. Xiang és mtsai., Virology 214, 398-404. old. (1996)). Egy WHO reférenciaszémmoí alkalmaztunk összehasonlításképpen. A literekéi Nemzetközi Egységben fejezzük ki.
Az s, c. adott Ádehimpő-Srab.gp vírus kevésbé hatásos B-sejtes választ indukált a transzgén termék ellen, összehasonlítva az AdhuSrabgp konstrukcióval. Az összes tesztelt * »-* * * * < « Λ A XX ί» »«<»
- 29 időpontban megfigyelt, ellenanyagválasz nagyságának a különbsége az egértörzstől függött, és kevésbé kifejezett volt a nem betenyésztett ICR törzsben, mint a beltenyésztett C3HZHe egerekben. Ezzel ellentétben az i.n. immunizálás után mindkét vakcina összehasonlítható ellenanyag -litereket indukált, amint azt ELISA-vaí és vírnssemlegesítési vizsgálati eljárással meghatároztuk.
A kifejezett Thl-válasz az AdchimpőBrab.gp rekombináns ellen s.c. immunizálás után, ellentétben a kiegyensúlyozottabb Thl/Tb2 válasszal az A.dhu5rab.gp injekciója utánival, az adjuvánshatás különbözősége melletti érv. A légárakba történő beadás után, ami az AdhuS vírus és feltehetőleg az AddhmpbS vírusok természetes fertőzési útvonala, mindkét rekombináns olyan ellénanyag-titert indukált a transzgén termék ellen, amely összehasonlítható volt a nagyságában és izodpus-proftljában. Ez azt sugallja, hogy a -tropizmus és/vagy adjuvánshatás feltételezett különbségei szövet-specifikusak, azaz nem léteznek-vagy kevésbé kifejezettek a légníakban, mint. a bőr alatt.
9. példa — Citotoxíkus T-.sejtes választ preferendáiis indukáíása rekombináns csimpánz adenovÍFössal
A. veszettség vírus elleni vakcina-indukált, védelem korrelál a virussemíegesítő ellenanyagokkal [„VNA’k F. L. Graha-m és mísai,, í. Gén. Vúöl. 36, 59-74. old. (1977)1, A veszettség fehérjével végzett vizsgálatok ily módon az immunrendszer ezen ágának a
2(1 stimulánsára koncentráltak. Az összes kísérletben egereket immunizáltunk az AdchimpöSrab.gp vírussal, és — ezzel párhuzamosan — a korábban leírt Adrab.gp vírussal, amely az 5-ő-s humán szerotipuson alapszik. Ebben a bejelentésben ezt a rekombmánst Adhu5 rab. gp vbúsnak nevezzük.
Mindkét adenovirus rekombináns védettséget indukált veszettség vírussal történő fertőzés ellen. 5 x 10° píu s. c. adeno-vírus rekombinánssal immunizált C'IH/He egerek betegségmentesek maradtak, amikor 3 héttel később veszettség vírus CVS-törzsének lö átlagos halálos dózisával (l£M fertőztök azokat.. Ez a veszettség vírus törzs antigemkusan közeli rokonságban áll az ÉRA törzzsel, de vnulensehb rágcsálókban. Az alacsonyabb 5x10' ptu vakcinadózis mellett az AdhuSrab.gp vírus még mindig teljes védelmet biztosított, míg az
Ádchímp68rab.gp~ve.l immunizált egerek egy kis százaléka nem tudott ellenállni a fertőzésnek. A vakcinadózis további -csökkentése az Ad.chimp68rah.gp- vakcina hatékonyságának az elvesztését eredményezte. In. immunizálás esetén mindkét vakcina teljes védelmet biztosított 5x lö> pfe mennyiségben adva. Az alacsonyabb 5 x lő4 p& dózisban az ÁdhuSrab gp vakcinával vakcináit egerek. 5ő%~áhan progresszív betegség alakult ki, míg az « X
- 30 AdcbimpbSrab gp rekombináns esen dózisával ttnmtmizáiíak védettek voltak. A nem rokon antigént expresszáló akármelyik szerotípusú adenovírus rekombinánssal, vagy 5xI0s p& akármelyik veszettség vírus glikoproteln elleni adenovlrus rekombináussal immunizált összes egérben halálos veszettség enkettthrisz alakult ki..
lő. példa — A különböző szerotípusú barnán, adenovírusek elleni már meglévő immunitás hatása a veszettség vírus elleni ellenanyag-válaszra
Annak tesztelésére, hogy a humán aáenovímsok gyakori szerotipusai (például 2, 4., 5, 7 és 12 humán szerotípus) ellem már meglévő kitettség .meggátolja-e az AdchimpóSrab.gp vakcina elleni ellenanyag-választ. CSHZHe egerek, csoportjait immunizáltuk 4 x 10* pfu replíkáclö-kompetens adeaovimssal. a tornán 2, 4, 5, 7 vagy 12 humán szerotipusbók vagy a ö8--as csimpánz szeronpussal (ez utóbbi E1 -deleíáh volt). Két héttel később az egereket s. e, vakcináitok Adhuőrab.gp vagy AdchímpőSrab gp vírussal. Az Adhu5rab.gp rekombínánst egerenként 2x10' pld dózisban, alkalmaztuk, az AdchímpőSrab gp rekomhínánst — amely s.
c. adva csak csekély ellenanyag-választ indukál CSH/Ele egerekben ilyen alacsony dózisban
.......egerenként 2x 10-' pfe dózissal oltottuk... Két héttel később szérumokat gyűjtöttünk, és teszteltük azokat veszettség vírus glíkoprotein elleni ellenanyagokra ELISA-val Az AdbuSrab.gp. elleni veszettség-vkus-speeifikus válasz kissé jobb volt naiv egerekben, mint az AdchimpoS vírus állal kiváltott. AzAdhnőrab.gp vírus elleni válasz teljese» gátolt volt
Arihu5~re immúnis egerekben. Bizonyos csökkenést láttunk a 4, 2, 7 és 12 humán szeroripusú adenovirusokra immúnis egerekben. A választ nem változott olyan egerekben, amelyek immúnisak voltak az AdehimpőS vírusra. Az ÁdchimpőSrab.gp vírus elleni válasz erősen gátolt, volt olyan egerekben, amelyek immúnisak voltak a homológ vírusra. Azok az egerek, amelyek korábban találkoztak a 2-es humán szerotlpasú adenovirussal, kis csökkenést mutattak az ellenanyag-válaszban az. AdchimpőS vakcinával prezentált veszettség vírus antigén ellen. Bármelyik másik szerotípusú humán adenovirussal oltott egerekben veszettség elleni ellenanyag-liter alakult ki AdchimpöSrabgp vírus hatására, amely hasonló vagy emelkedett nagyságú volt azokkal az egerekkel összehasonlítva, amelyek naivak voltak a vakcináié» előtt. Közelebbről, az AdhuS vírusra immúnis egerekben magasabb ellenanyag30 iker alakult ki az Adehimpőkrafe.gp konstrukcióval történő vakeinálás hatására, ami keresztreakuv segítő T-sejtek jelenlétéi tükrözheti, amelyek elősegítették a B-sejtes választ a transzgén termék ellen.
Azért, hogy jobban megvizsgáljuk, hogy az Adchimp68rab.gp vakcina azonos dózisa Adhu.5 vírusra immúnis egerekben jobb ellenanyag-iítert indukál-e, mini az Adhuőrab.gp
· 31 vírus, vakcína-titrál-ási kísérletet végeztünk. C3B/8e egerek csoportjait immunizáltuk s. c. 4 x i€? pfu El-detetált .adenovirus rekombínánssal a HFV-lö 1,1 antigénje elten. Az egereket két héttel később Adbuárab.gp vagy Adchim.p6Srab.gp vírussal vakcináitok s. c. különböző dózisokban. Áz egereket kei héttel később verezteftúk, és meghatároztuk a veszettség vírus elleni szérum ehenanyag-tüereket ELISA-vsl (adatokat nem közlünk) és virnssemlegesítésí vizsgálati eljárással. Egyik vizsgálati eljárás sem mutatott szignifikáns csökkenést az AdchimpóSrab.gp konstrukció elleni ellenanyag-válaszban Adhn5~re immúnis egerekben. Az ÁdhuS konstrukció áitoi prezentált veszettség vírus elleni eílenanyag-tlterek csökkenésének komolysága a homológ vírusra immúnis egerekben a vakcínadózistói függött. Az ellenanyag10 válasz érzékenyebb volt a vakcina alacsonyabb dózisaira, mint a magasabb vakcinadózisok esetében. A VNA literek lényegesen jobban csökkentek, mint az ELISA literek. A VNA titerek a legmagasabb vakcinadózis esetében feleződtek az Adhu5 vírusra immúnis egerekben, míg a két alacsonyabb vakcínadózisná! a titerek több mint 20-szorosra csökkentek. Bármelyik tesztelt dózis esetében az ÁdchimpoSrah.gp rekombináns magasabb VNA litert indukált veszettség ellen Adbu5-re immúnis egerekben, összehasonlítva az AdhuSrab.gp vakcina azonos dózisával elértekkel. Az AdhiS elleni meglévő immunitás káros hatását az ÁdhuS vakcina hatékonyságára tovább demonstráltuk egy védettségi kísérletben. 2 x IQ5 pfu AdhuSrab.gp vagy Ááchimpöbrab.gp vírussal immunizált naiv egerek teljesen védettek voltak CVS-ll vírussal történő fertőzés elfen. Az AdhuSrab.gp vakcina ezen dózisával immunizált
AdhuS-re immúnis egerek többsége (65%) nem állt ellen a veszettség vírus fertőzésnek, míg az azonos dózisé Adchimpőhrab.gp vírussal vakcináltak védettek maradtak. Az Adlmorab.gp vírus dózisának egerenként 2 x KE pfo-ra történő növelése helyreállította a vakcina hatékonyságát.
Az AdchirnpőS rekombináns által expresszált transzgén termék elleni ellenanyag25 választ nem befolyásolta a meglévő immunitás a gyakori humán adenovirus szerotípusok ellen, ami gátolja a megfelelő humán 5-ös szeroupus rekombináns elleni választ. A replikáeió-fcompeíens vírusokkal történő előzetes immunizálás hatására az AdhuSrab.gp vakcinára adott immunválasz megszűnt az Adhu5~re Immúnis egerekben, és csökkent a többi adenovirus humán szerotipnsra, mint például 2-es és 4-es szerohpusra immúnis egerekben. Az
AdcbimpőS refeomfeinánsra. adott válasz a vári. módon gátolt volt a homológ vírusra Immunis egerekben. Ez nem gond a klinifcumban, mivel az AtfchimpóS vírus nem fordul elő a humán populációban, és a gyakori humán szerotipusöknak nincsenek közös semlegesítő epitőpiai az AdchirnpőS vírussal.
-32A korábbi kitettség a repűkáció-defektív Adhu'5 vírusnak szintén csökkentette az ellenanyag-választ az Ádhiri rekombinánsok által prezentált veszettség vírus glikoprotein ellen, habár a hatás nem volt olyan komoly, mini a replikáció-kompetens vírussal korábban fertőzött egerekben. A replikáció-defekfiv ÁdhuS vírusra Immúnis szérumokban csökkentett, de könnyen .detektálható ellenanyag-szint alakult ki a veszettség vírus ellen az Adhu5.rab.gp vakcinával történő immunizálás hatására Az AáhaSrab.gp konstrukció dózisának a növelése részben megkerülheti a .korábbi immunitás hatását.. A veszettség vírus elleni vakcina-indukált védettség VNA-kat igények amelyek nem Indukálódtak olyan hatékonyan az immunis egerekben az Ad.hu5 vakcina .hatására, különösen amikor alacsonyabb dózisokat alkalmaztunk. Az AdhuS-re immúnis egerekben a VNA-válzsz az AdehímpóSrab.gp konstrukcióra jobb volt az összes tesztelt dózisban, mint az Adhu5 vakcina esetében, több mint kompenzálva a vakcina kissé alacsonyabb hatékonyságát s. c. immunizálás esetén.
Az AdchimpőS rekombináns ily módon egy vonzó alternatíva vakcinahordozóként emberekben történő alkalmazásra. Amint bemutattuk, már akár olyan alacsony dózisban is hatásos, mint 2zlOJ pfe, nem invazív utakon beadva, mint például a felső légutakon keresztül, A muközális immunizálásnak i. n. beadással még az az előnye Is megvan, hogy favorizálja a közös mukózális Immunrendszer indukálását, amely különbözik, bár kapcsolatos a központi immunrendszerrel, amelyet az mjektáh vakcinák céloznak.
1L példa — A C6S csimpánz vírustörzs és repbkáeiója
Az alábbi 11-15. példákban tovább jellemezzük a C68 csimpánz törzsei. A szakember számára nyilvánvaló, hogy ezt az információt könnyen felhasználhatjuk új rekombináns csimpánz adenovirus konstrukciók előállítására.
A Gö8 vírustőrzset az ATCC-től (Rockvílle, MD) szereztük be, és 293-as sejtekben (ATCC) szaporitottuk, amelyeket DMEM-beh (Sígma, St. Louis, MO) tenyésztettünk, amely ki volt egészítve 10% magzati borjúszérummal (FCS; Sigma, vagy Hycione, Logan, UT) és 1% penicdlin-sztreptomícinnel (Sigma). A 293-as sejtek fertőzését DMEM-ben hajtottuk végre, amely ki volt egészítve 2% FCS-sel az első 24 órában, ami után FCS-t adtunk, hogy a végkoncemrációt 10%-ra állítsuk be. A fertőzött sejteket akkor gyűjtöttük be, amikor a sejtek
100%-a vírusindukált citopátiás hatást (CPE) mutatott, centrifugálással összegyűjtöttük és betőményítettük azokat. A sejtcsapadékot újra felszuszpéndáltuk 10 mM Trís (pH 8,0) pufferben, és üzálíuk 3 ciklus fagyasztással és felolvasztással A vímskészítményeket 2 ulíracentri&gás lépést követően, kaptuk meg cézium-klorid sűrűséggradiensen, és a vírus tőrzstenyészeteií 1 x K)!“ részecsk-e/ml-re hígítottuk 10 aiM Tris/íOO mM NaCI/50% glicerin oldatban,-és -70 °€-o« tároltuk.
12. példa — A virálís genomiális DNS klónozása és szekvenálása
A genomiális DNS-t a megtisztított vtruskészitméíwből izoláltuk szokásos eljárások alkalmazásával, és megemésztettük lő restrikciós enzim paneljával, a gyártók utasításait követve. Az -összes restrikciós és módosító enzimet — a kivételek, feltüntetése mellett.......a
Boehrínger Mannheím cégtől (Irtdianapolis, IN) szereztük be. A genomiális DNS-í BamHI, Pstí, Sáli, Hindii! vagy Xbal restrikciós enzimekkel emésztettük meg, és a fragmenseket plazmídokba szubklónozcuk [X, L, Berkner és P. A. Sharp, Noel Acids Rés. 11, 6003-0020. old. (1983)( A fehérj-ementesitést. kővetően szintetikus 10 bp Paci kapesolömoiékulákai (New Bngland Biolabs, Bev-erly, MA) kétszeresen emésztettünk Pad és BamHI vagy Pstí enzimekkel
A Cő8~bŐi előállított Pstí, BamHI és Hindii! Ilonokat sorrendben az 1. ábra C:. D és E részén mutatjuk be. Az árnyékolt téglalapokkal, jelzett fragmenseket nem klónoztuk meg, de a teljes genom szekvenciái meghatároztuk átfedő kiónok és a vitális DNS közvetlen szekvenálásával (üres téglalapok). A klónozott fragmenseket. a 2. táblázatban .mutatjuk be.
* ♦ · · ♦ ♦ X
.. 34 _
2. Táblázat. C6S plazmidok és inzert méretek
Konstrukció nova inzert mérete (bázis pár) Fragmens Xfée........... Fragmeus 3’ vége 5? vég térképegység 3’ vég terképegység
Fst-Ί iragmensek
CöS-Pst-A 6768 24784 31551 67,984 86.4%
pö8.C68-P$t--B 6713 4838 11550 13,250 31,6%
:pBS:ü68~Pst~C 5228 14811 20038 40.,6% 54,9%
pBS:C68~Pst-D 2739 12072 14810 33,1% 40,6%
pB$:C68~Psi-E 2647 20039 22685 54,9% 32,1%
pBS :C68~Pst-F 1951 32046 33996 87,8% 93,1%
pN EB:C68-Pst( ί 1874 1 1874 0,0% 5,1%
pBS'C68~Esí~H 1690 23094 24783 63,234 67,9%
pBS.CóS-Pst-í 1343 33997 35339 93,1% 96,884
pNEB.C68~Pst~.Í 1 180 35340 36519 96,8% 100,084
pBS.C68~Ps?-K 11Π 2763 3-873 7,654 10,6%
pBSC68-Psi-L 964 3874 4837 10,6% 13,2%
pBS.Cók-Pst-M 888 1875 2762 5,1% 7,644 i
pBS:C68-Pst-N 408 22686 23093 62,1% 63,2%
CóS-Psí-0 380 31666 32045 86,7% 87,7%
pBS.Cö8“Pst-P 285 11551 11835 31,654 32,4%
CőS-Psí-O 236 11836 12071 32,4% 33,154
pBS-.Cók-Pst-R 114 31552 31665 86,440 86,7%
BasniBI fragmensek
Cő8-Bam-A 16684 19836 36519 54,3% 100,0%
p B S. C68-B am-B 8858 3582 12439 9,8% 34,154
pBS:C68~Ba®~€ 4410 12440 16849 34,184 46,1%
pBS:C68-Bnra-D 2986 16850 19835 46 ,4 54,3%;
p N E B; C 6 S ~ B am~ E 2041 1 2041 0,0% 1 5,6%
pBS.Có8-Bam-F 1540 2042 3581 5 Ne 9,8%
Hindii t f'ragmensek
pBR :€6S~Hind~B 9150 23471 32620 64,3% 89,3% ;
pBS pBiueseript SK+ klón pNEB « pNEB 193 klón pBR - pBiR.322 klón
Előtag nélkül - a fragmensí nem klónoztuk meg +
- 35 A. CöS csimpánz adenovlmst az A'FCÜ-lől szereztük be és humán 293~a.s sejtekben szaporítottuk. A vitális genomiális· DNS-t tisztított viríonokból izoláltok ismert eljárások alkalmazásával (A. R. Davis és mtsai,, Gene Thera. 5, 1148-1152. old. (1998)}, és restrikciós enzimek paneljával emésztettük meg, amelynek adatai konzisztensek voltak a korábbi vizsgálatokkal (adatokat nem közlünk) [G. R, Kifofeingman, Gene '20, 205-210, old. (1982); Q. Li és G. Wadell, Aroh. Viroi. 101, 65-77. old. (1998); R. Wigand és mtsai., Irüervirologv 30, 1-9. old. (1989)}. Á €68 teljes genomláí átívelő restrikciós fragmensekef. plazmídokba szubklónozíúk. A C68 génomjának sematikus ábrázolását, az IÁ. ábrán mutatjuk be, és a plazmid vektorokba klónozott PstI, BamHl és Hindii! tragmenseket sorrendben az IB., IC. és
1D. ábrák üres téglalapjai jelzik. A klónozott íragrueuseket, a frágxnensek méreteit és a genomiális pozíciójukat a 2. táblázatban soroljuk fel. A plazmid kiónokat és a genomiális DNS-eket szekvenálás iemp latjaként alkalmaztuk. A genomot mindkét irányban megszekvenáltnk láncindhő-sétával, mindegyik bázist megközelítőleg négy reakcióba befoglalva.
A €68 genomja 36.521 bp hosszúságú (lásd a 6 083 716. számú amerikai -egyesült államokbeli szabadalmi iratot). Á. GenBank szekvenciákkal történő előzetes összehasonlítás különböző mértékű hasonlóságot mutatott más humán és állati adenovirusokkal a vitális genom teljes hosszúságában. Az összes korábban leirt adenovírus genetikai egységgel — az 1-4 korai régiók, és a fő késői gének — homológ régiót megtaláltuk a C68 genomban (IA.
ábra). A. C68 és a teljesen megszekvenált barnán adenovlrusok.......Ad2- (NC0Ö1405}, Ad5 (NC0014Ö5), A4I2 (NCőOl466), Ad 17 (NC062967) és Ad40 (NC01464) közötti DNShomológiát alkalmaztuk a klóitok sorba rendezésére. Meghatároztuk a nyílt leolvasási fázisokat (ORF), és azonosítottuk a géneket a többi humán adenovírussai való homológja alapján. Az összes tó korai és késői adenovirus gén jelen van a C68-ban. Az invertált terminális ismétlődések (1TR) 130 bp hosszúságúak.
13, példa — A €68 genom elemzése
A Aázsttoféí-mvó-íiS nemzetség minden a GenBank-ban hozzáférhető tagjának a teljes nukleotid-szekvenciáját, beleértve különböző falókból származó izolátumokét is, szkrmeltük a
C68-C&I való azonosságra. Az Add minigenomoí az alábbi GenBank szekvenciákból állítottuk össze: baloldali ITR (561964); El A régió Ml 14918); DNS pol és pTP (X745Ö8, 74672); VA RNS-1, II (U10682); 5.2,55K. (€52535); pVli (€79921); hexon (X84646); endoproteáz (Ml6692); DNS-köto fehérje (MI2407); rost (X76547); jobboldali ITR (561965). Az Ad7 kompozit genomot az alábbi szekvenciaadatokból hoztuk létre: Mu 3-21 (X03069); VA RNS- 36J, H, pTP és 52,55Κ (US2574), penton (AD001675); pVl, hexon és endoproteáz (AF06S065); DNS-köíő fehérje (02530): E3 és rost régié (AH 04384); jobboldali ITR (V00037),
Az aminosav-szekvencia egymás alá rendezését a cT/rxto/A programmal állítottuk elő-, -aJaAfew programmal szerkesztettük (http-;//www.ebi.ac.-uk/~michele/jalview7);! és a programmal elemeztük (hhp.7/wxvw,ch.embnet.orgZsofiware/BÖX Form. taxii). Először egymás- alá rendeztük az összes humán adenovírusből származó,, nyilvánosan hozzáférhető hexon fenéneszekvenciákat, hogy azonosítsuk, a €68~cal legnagyobb homológját mutató készletet
A €68 genom összes szignifikáns nyílt leolvasási, fázisának a nukleotid-szekveneiáját és megjósolt amínosav-szekvencíájat összehasonlítottuk ismert DNS- és fenétjeszekvenciákkal. A €68 nukleotid-szekvexicíáját összehasonlítottuk az Ad 2, 4, .5, 7, 12, 17 és 40 szekvenciájával. A korábbi restrikciós elemzéssel egybehangzóan (Kitchingman, mint fent; Lí és Wadelt mint fent) a €68 a humán Aá4~hez (E alcsoport) a leghasontóbb.
A €68 El A. régiója a 480. nukleoíidnál található TATA-boxtőI az 1521.-nel lévő pöliA-aödicíös helyig tan. A konszenzus splice donor és akceptor helyek a humán Ad társakéval analóg pozícióban találhatók, és a 28.2K és 24..8K fehérjék hasonló méretűek a humán Ad fehérjékkel. A. €68 legkisebb El A fehérjéjének az ÖRF-ja 101 oldailáncot kódol, ellentétben a többi adenovírus megközelítőleg 60 aminosavávsl. A 60. oidahánenái TTA kodon van a C68 esetében, míg a többi ad-enovímsaba gyakran TGA síopkodoo található. A. €68 El A 1Ö0R fehérje első 60 oldallánca 85%-ban azonos az Ad4 homológgal.
A C68 genom géneket tartalmaz a négy E1B fehérje, 20 5K, 54.7K, 10.1 K és I-8.SK, valamint a pfX részére. Mind az öt €68 által kódolt fehérje hasonló méretű a többi Ad El B és píX fehérjéhez. Az E1B 2FK fehérje Ad4 homológja csak 142 am'ino savat tartalmaz, míg a €68-ban 186 oldal lánc van, és a többi humán adeoovirusokhan 163-178 oldalíánc található A €68 és Á.d4 fehérjék 95%-ban azonosak az első 134 aminosa-vban, azután -a hasonlóság véget ér, és az Ad4 fehérje befejeződik 1.42 aminosavnál.
A €68 genom homológokat tartalmaz az E2A 55K DNS-kötő fehérjére és az lva2 érési fehérjére, valamint az E2B terminális fehérjére és a DNS-polímerázra. Az összes E2 régiós fehérje hasonló mérető az Ad társához, és- az E2B fehérjék különösen jól konzerváltak. A €68 E2B I23.6K ,D\\~poiimeráz 1124 oldallánc hosszúságúnak jósolható, míg az Ad4 esetében 1193 jósolható, habár más humán adenovím-soknak kisebb polímerázaik. vannak. Az Ad4 pohmeráz 1-71 oldatiáncai nem hasonlóak egyik másik Ad-poíimerázhoz sem, és lehetséges, hogy ez a fehérje valójában egy belső ATG kodonnál imeiahzáiöcbk. A 72-1193. aminosavak. esetében az Add és €68 polimerázok 9654-os aminosav-azonosságot mutatnak.
-37Az eddig ntegszekvénáit humán adenovírusok E3 régiói figyelemreméltó szekvenciaés kódolási kapacitási variabilitást mutatnak, Az Ad40-ben öt E3 régiós gén található., -az Adl'2-ben hat, a C68-ban és AdS-ben hét. az Ad38-ban nyolc, és az A.d3-baxt valamint az Ad7-ben (a humán adenovirusok B alcsoportja) kilenc feltételezett E3 régiós gén van. Az Add
E3 .régiót eddig még nem szekvenciák meg, Az Add5 E3 régiójával összehasonlítva mind a hét E3 génhomológot azonosították a €68 gettómban ÍC. F. Basler és M. S. Horwitz, Virolögy 215, 165-177. old. (1996)].
A €68 E4 régiójában 6 ORF található, és mindegyik homológ a humán Adó, 12 és 40 E4 régióban található fehérjékkel. Az E4 nómenklatúra zavaros, mivel a C68 ORF2 homológjai, az Adl2 és Aá4Ö megközelítőleg 130 oldaliánc hosszúságúak, míg az Ad5-hen két olyan.......64 és 67 oldalláncot kódoló -.....ORF van, amelyek homológok a nagyobb QRF.2 fehérjék amino- és karboxil-terminális· végeivel. Az ORF5-őí figyelmen kívül hagytuk a nómenklatúránkban, mert az 5. ORF az E4 régióban homológ a humán Adó alaposan tanulmányozott ORFő fehérjéjével.
1.5 Behatároltuk C68 genom ró késői promóter és háromrészes vezetőszekvenciáit.
Behatároltuk azokat a potenciális ORF-okat, amelyek a 15 tő késői fehérjét kódolják. Az összes €68 késői fehérje hasonló méretű a humán Ad társához. A százalékos amínosavazonosság a csimpánz és humán Ad késői fehérjék között jelentékenyen 'különbözik. A. €68 rostfehérje megjósolt, módon 90% aminosav-azonosságot mutat az Add fehérjével, de sokkal kevésbé hasonló a többi humán Ad rostfehérjékhez. A CÁR-kotohdy a rostosoméban jelen van a €68-bán.
14< példa.......Vírussemiegesitö ellenanyagos vizsgálati eljárások
Számos vizsgálatot végeztünk annak meghatározására, hogy van-e kereszíreakíivitás a típusspecifikus 068 és humán adenovírus amtszérumok között. A szérumok semlegesítő aktivitását az alábbiak szerint teszteltük. Normális humán alanyoktól (N::::5ö):, 7őré.wzv .majmoktól (N-52) és csimpánzoktól (N:::20) származó szérumok paneljait értékeltük semlegesítő ellenanyagokra Ad5 és €68 alapú vektorok ellen 293-as sejtek indikátorsejtvonalként történő alkalmazásával. A humán alanyoktól, Aőc.rus majmoktól és csimpánzoktól gyűjtött szérumokat 56 *C-oö inaktíváituk 30 percen keresztül. Az egyes minták sorozathigitását (1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320 100 p.l, 10% F€S-t tartalmazó DMEM) adtuk hozzá I15.Ö1ŐGMVBGFP (1000 pfb/méröfeeíy) vagy C68CMVEGFP vírus azonos mennyiségeihez, és 4 °C-on inkubáhuk 2 órán keresztül. A keverék 150 μΙ-ét átvittük 2 x 10 293-as sejtre 96-mérőhelyes lapos fenekű rnikrotiterlemezeken. Kontroll mérőhelyeket
- 38íértőztünk azonos mennyiségű vírussal (szérum hozzáadása nélkül). A mintákat 37 °C~on mkubáltuk 5% CCfo-ben 48 órán Keresztül, és megvizsgáltuk azokat fluoreszcens mikroszkóp alatt. A. .minták azon hígításaik amelyeknek 50%-nál jobban csökkent a zöld fluoreszcenciája fertőzött kontrollokhoz képest, pozití vnak értékeltük semlegesítő ellenanyagokra.
Amint vártuk, a normál humán alanyok megközelítőleg 35%~a semlegesítő -ellenanyagot mutatott Ad5 ellen, ami sokkul nagyobb gyakoriság, mint amit majmok és csimpánzok szérumai esetében megfigyeltünk. A €68 elleni semlegesítő ellenanyagokat figyeltünk meg a csimpánzok 80%-ában, és a normál humán- alanyok vagy ftfem majmok csak 2%-ában. A semlegesítő- ellenanyagok tiferei a nem célzott fajokban általában alacsonyak voltak.
Azért, hogy tovább értékeljük a €68 keresztreaktívitását humán adenovirus vektorokkal egereket immunizáltunk 2 x 10 tarfolt-alkotő egységnyi (pfu) Ad 2, 4, 5, 7 és 12, valamint €68 vírussal. A szérumok két héttel később gyűjtöttük be, és teszteltük olyan ellenanyagokra, amelyek Ad5 vagy €68 vektorokat semlegesítettek. Az Ad5 vektort -semlegesítő ellenanyagot csak az Ad5-tel immunizált állatokban detektáltunk. Fontos, hogy csak azok az .állatok termeltek C68 elleni semlegesítő ellenanyagot, amelyeket a €68 vektorral immunizáltunk; -egyik tesztelt humán szerotipus sem — beleértve az Ad4~et is.......
termeli ellenanyagokat olyan egerekben, amelyek semlegesítették a €68-af. m vrtro.
A €68 vektor humán vizsgálatokban való alkalmazásához fontos a semlegesítő ellenanyag hiánya a humán populációban. A mi vizsgálatunkban 50 normál humán alany szkrinelése nem talált semmilyen szignifikáns semlegesítő ellenanyagot (>1:10), ugyanazt a vizsgálati eljárást alkalmazva, amely semlegesítő ellenanyagokat mutatott ki a csimpánzok több mint 50%-ába-n. Ezenfelül a többi humán Ad szerotípussal — beleértve az A.d4-et is.......
immunizált egerek szérumai nem semlegesítették a €68-cal történő fertőzés.
Egy másik vizsgálatban: 1CR egerek 10-20 fős csoportjait vakcináitok az Adh.u5rah.gp vagy az Ad€68rab.gp vakcina különböző dózisaival szubkután (s. c.), inlranazáhsan (1. n.) vagy orálisan (per os) adva. Az egereket 21 nappal később vérezíettük, és meghatároztuk a vitális semlegesítő ellenanyagok (VNA) nemzetközi egységben megadott titerert. Az egereket 4 héttel azután megfertőztük, hogy vakcináitok azokat 10 átlagos halálos dózis CVS-24 vírussal közvetlenül a központi idegrendszerbe adva.
- 39VNA literek. (% túlélés fertőzés után)
Vakéin ad özis 5 x 10' 5 x 106 5 x 10' 5 x 104
Adhu5rab.gp, s. c. 972(100) 324 (100) 108(100) 12 (100)
AdCóSrab.gp, s. c. 240(100) 36 (100) 12 (80) 8 (80)
Adhu5rab..gp, 1. n. ni 162 (1.00) 162 (100) 18 (50)
AdCóSrab.gp, i. n. nt 54 (100) 162(100) 18 (50)
2 x 10' 2x1(0 2x 10' 2x 104
Ad hu 5 rab.gp. per os 108(100) 54 (88) 18 (80) 4 (30)
AdCödrab.gp, per os 108 (100) 36 (78) 12 (55) 0,2 (0)
Ezek az adatok azt demonstrálják, hogy az AdC68 konstrukció váratlanul jobb védő ellenanyag-választ indukál alacsony intranazáits dózisok .mellett, mint az 5~ös humán típus.
15. példa— A bexon fehérjék szerkezeti elemzése
A €'68 és humán szerotipusok közötti semlegesítő ellenanyagok hiánya arra kényszeritett, hogy gondosabban értékeljük a szerkezeti különbségeket a hexon régióiban, amelyekről azt tételezzük fel, hogy specifikus epitőpokaí hordoznak. Korábbi vizsgálatok azt sugallták, hogy ezek az epiíópok a hexon Crawfbrd-Miksza és Sehnurr által meghatározott 7 hipervariábilis régiójában helyezkednek el (J. Virul. '70, 1836-1844. old.. (1996)]. A bexon fehérjék ami no sav-szekvenciáinak az összehasonlítását a €68 és számos humán adenoviruskozott a 2. ábrán mutatjuk be. Valóban, a €68 lényegesen eltér ezeknek a hípervariábilis szekvenciáknak szignifikáns régióiban. Elvégeztük a (168 hexon háromdimenziós szerkezetének részletesebb modellezését az egyedi szekvenciák feltérképezésére. Előállítottuk a €ó8-ból és Ad4-böl származó hexon-szerkezetek modelljeit az Ad2 és Ad5 hexonj-aínak rőntgendiffrakcíó's kristályszerkezete alapján.
Tovább finomítottuk az Ád5 (Protein Data Bank. azonosító: IRIJX) [1 J. Rux és R. M. Burnett, Moí. TW2er, 1, 18-30, old. (200Ö)J és az AD2. [F. K. Athappílly és mísai., J. Mól. Bioi. 242, 430-455 old. (1994)] hexon. rőnigen-diíírakcíös kristály szerkezeiét, előállítva a jelenlegi hexon modelleket (Rux és Burnett, máshol fogjuk nyilvánosságra hozni)·. A homológ C6S és Ád4 bevonok modelljeit először a fertxfeWkfewr fehérje-modellező környezet alkalmazásával állítottuk elő (N. Gu-ez és M.. C. Pestseb, Eléctrophoresis 1.8, 2714-2723, old. (1997)]. Az automatikus eljárását alkalmaztuk a €68 és. Ad4 bexon amínosav-szekvenciák és az Ad2 és ÁdS hexon kristályszer kezeiének az egymás alá rendezéséhez. A szekvencia egymás alá rendezéseket alkalmaztuk a modell-szekvenciáknak ismert molekuláris
szerkezetekre történő felíekíetésére. Az oidalláncok ismert szerkezetekben nem megtalálható pozícióit oldalláne-protomerek könyvtárából választottuk ki. Ezeket a kezdeti molekuláris modelleket azután manuálisan utánállítottuk, hogy javítsuk az automatikus egymás alá rendezést, a variábilis régiók feltárására. szolgáló mozgó rések alkalmazásával és az oidalláncok pakolásának optimalizálásával. Az Ad2 és Ad5 templát szerkezetekben ttem megfigyelhető külső burokszegmensek· pozícióit Ismert hurokszerkezetek könyvtárából választottuk ki, vagy manuálisan illesztettük. Az egyes modellek konformációit tovább 'finomítottuk energia-minimalizálással a CHARbfM molekuláris mechanikai program alkalmazásával [B. R. Brooks és rntsafe 3. Comp. Chem. 4, 187-217. old. (1983)]. Ezeknek a 10 C68 és Ad4 hexon modelleknek a .szerkezeteit azután egymás alá rendeztük, és új szekvencia egymás alá rendezést számítottunk. A két szerkezetileg egymás alá rendezett hexon szekvenciakulonbségeii alkalmaztuk a homológía-modellek kiszínezésére. A ó’w-yysMFfew programban előállított grafikus képeket exportáltuk, és a Pemstee p/’ .Agy Tracer programmal rajzoltuk fel (FÖV-Rav 2000, Version 3.1 g).
Míg az általános €68 szekvencia nagyon hasonló az Ad4 hexonéhoz, a két szekvencia közötti különbségek elsősorban a DE.1 ésFGl hurkokra koncentrálódik, és ezek tartalmazzák mind a hét hípervanábilis régiót. Ezek a DEi, FG1 és FG2 hurkok.......mindegyik különböző alegységből — azok, amelyek szorosan kapcsolódnak a csúcsdoménekhez a tómét molekula tetején, A hexon csúcsok alkotják a várion külső felszínét, és az ellenanyag kapcsolódásának a helyeit. Mivel a hexonok oldalai és alapjai egymáshoz pakolődnak a kajszidon belük ezek a régiók el vannak zárva az elleaanyag-kőtéstök és a szekvenciájuk konzervált. Ezzel ellentétben a €68 és Ad4 szekvenciái eléggé különbözők a hexon-csúcsokban, Ez azonnal megmagyarázza, hogy az ezen vírusok bármelyike ellen termeltetett ellenanyagok nem kereszíreagálnak,
A leírásban és a szekvencialistában idézett minden publikáció hivatkozás ótján a kitanítás részét képezi. Mig a találmányt egy különösen előnyős megvalósítási módra történő hivatkozással írtuk le, nyilvánvaló, hogy abban végrehajthatók módosítások anélkül, hogy eltérnénk a találmány szellemétől Az ilyen módosítások szintén a mellékelt igénypontok oltalmi körébe esnek.

Claims (22)

1, Replíkáció-delekiiv- majom adettovíras vektor, amely — majom -adenovirus kapsztdhan ..... majom adenovirus eisz-elenreket és expresszíós szabályozó szekvestc iához működőképesen kapcsolt heterológ géni tartzhnaz, ahol a majom adejmvirus kupszid csimpánz adenovinisböl származik, amely a Pasi 5, Fan 6 vagy Fan? bármelyike.
2, Az 1. igénypont szerinti majom adenovkns vektor, amely az adenovirus Ela és Elb expresszálásártak képességének a hiánya miatt ríphkáciő-defektiv.
3, Az 1. vagy 2. igénypont szerinti -majom -admoviras, amelyből az £3 késleltetett korai gén el lett távolíi
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti majom adfenovíms vektor, amely olyan deléciót tartalmaz az E4 génben, amely tönkreteszi az adenovirus képességét a géntemiék expresszálására.
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti majom adeeováms vektor, amely deléciót. tartalmaz, az: £2a késleltetett korai génben.
6. Az. 1-5. igénypontok bármelyike szerinti majom adenovirus vektor, atneiv deléciót tartalmaz a majom adenovirus genom I..1-L5 késói géttek bármely ikébutu
7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti maion adenovirus vektor, amelyben a heterológ gén az alábbi vírsrsok bármelyikéből származó rmmtmogéa terméket kódol; humán Immu-adeSciescia sírás, majom untán ndetscieneia -várns, respitutorikns szincíciálís: vírus, parairdíaenza vírus 1-3 típusa, inílnenza vírus, .é/urper söjtptex vírus, humán citomegsíovírus, hepatitisz vírusok, humán papiilóiuavlras, poiíovkus, rotavíras, kaltelvirosok, kanyaróvírus, mumpsz vírus, rubeóla, vírus, adenovirus, veszettség vírus, kutya szopornyica -vírus, marhavész -vírus, koronavíms, parvovlrus, fertőző rfeotracbeítísz vírusok, macska leukémia vírus, macska fertőző peritonitisz vírus, madár fertőző burzális betegség vírusa, Nevvcastie-beiegség vírusa, Marek-íéle betegség vírusa, sertés respiratorikus és reproduktív szindróma vírus, íé arterihsz vírus vagy enkefalírisz vírusok.
8. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti majom sáenovírus, amelyben a heterológ gén az alábbi bakiérhsnofc bármelyikéből származó immtmogén terméket kódol; ^/kohzoc, Efoemopó/te somaws, xWraxe/íö .cntorráöífe, Áípptooocííís nnewö.we, Swpteeoccas nyognnes, Sít^pftjcoccus «götöchne, őfreptococeus ybeoniís, Hcí’íeoóncter pyiori, Afeisserie wningíddis, Aefeseriö go»orrhoe«e, CAfeustWfe p-seAomuós, C&&?sy<riö psewmontos?, CVtto.wsfe pstítocí, ih?rdateZ/o perterís, &?ó»o»e/Zo íypA;, őh/mow/űr/ypÁimmtoH, Sa/mofieÍ/ii c&oZenwwás, Escóeráttóíe coZí, SStge/Zö, kíőrto e&o/erae, Co/yneéscfmtöK djp&heriee, A/venhnctoí-íKffí nr&emdoszs, MvwteíKrita» ávtaw-AOtttohseímw íttíraee'flufare komplex, Pr»íei-is mirabtiri, .Erowv vulgáris, Ő'íopAjteocoMS «mtas, €/aririr&<·»! leiatti, leptospírn míemfgms, bk»ze.ön öurgdorferi, rini'.wreito kacmofetfeu, EösfenreZín mrifógdda, Ac/tee&xdí&ts p/mwp»e«Basöníöe vagy Afecep hm gníóbepóeíin?.
9. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti majom adenovirus, amelyben a heterológ gén az alábbi gombák ifertnelyikébői származó ammmogén terméket kódok .ispergíz/fe, ,5/a«nwyc<?s, Cma/tWa, Coceidtodris, Cí^ptococíw vagy lő. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti majom adenovirus, amelyben a heterológ gén az alábbi paraziták bármelyikéből származó ímmunogén terméket kódol; Eerséműnie me/or, Ascoris, Jnciáaras, Gtam&a, ^cóisíosonru, öypí<?sporidí«»í, írtoAomouőa, Tey^&tsw göarih vsgy Ppemocytó? cűzökí.
* * ♦*· * ♦ · W « » χ * * ♦ χ «
X* **af V «««
-4311. Az 1-δ. igénypontok bármelyike szerinti majom adenovirus, melyben a hetoroióg gén az alábbi ráwtiigenek vagy daganattal kapcsolatos antigéneket alkalmazó rákellenes hatás kiváltására irányúi; prosztataspeeitikus antigén, karcbo-e:-rd>rionáli» antigén, MUC-1, Her2, CA-125 vagy MAGE-3,
12. Eljárás aa 1-11.. igénypontok bármelyike szerinti vektor előállítására, íüszöZ jette/nezve, hogy egy heíerológ gént és a rnajom aáenovtes ITB-szeks'enda essz-elemet összeállítjuk.
13. Az 1-11. igénypontok bármelyike szeried rekomhmám-adcaovírus alkalmazása alanyban immunogén elleni T-sejtes válasz ísdnkáíására alkalmas, gyógyszer előállítására, amely rekombináns majom adenovirus immnnogént kódoló autóemsav-molekoíát tartalmaz -olyan ssabályozó szekvenciák szabályozása alatt, amelyek az itnmunogén expre,$szióját irányítják az. alanyba®.
14., A 13. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a rekombináns majom adenovirus szubkuíá® beadásra van íbramh&va.
1.5, A 5.3. vagy 14·. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a rekombináns majom aáeaovírus alacsony dózisban történő beadásra van íornwiáxya,
16, A 13-15. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a rekombrnáns majom adenovirus 10* pl® és íö p& közölri hatásos dózisban történő beadásra van foxmalázva.
17. A 13-56. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az: ímmunogén az í-es humán ántnurdeilcieneia vírus, feutnán paptilémavíras vagy veszettség vírus patogén vírusok bármely ikéből származó pepiid, polipepdd vagy fehérje.
18.. ímraunogés készítmény, amely humán immundeficiesoia vírus elleni citolitikns .immunválasz intiukáíására alkalmas, amely (a) 1-es hunnbs timsusdefeieoda vírus módosított gag fehérjéjét kódoló optimalizált nukleinsav-szekvsncíál tartalmazó, 1-7, igénypontok bármelyike szerinti tekombináns majom adenovirust és (b) tizioiógiaiísg elfogadható hordozót tartalmaz,
19. A 13, igénypont szerinti: tnnnunogé® fcészitinény alkalmazása emlősökben humán imtmmdeScienoia vírus «lkai CDS* T-sejtes válasz ísdnkáíására. alkalmas gyógyszer előállítására.
2ti. Humán papdlőmavirnshói származó mmmnogén fehérjét kódoló, 1 -7, igénypontok bármelyike szerinti rekontbináns majom adenovirus alkalmazása emlősökben humán papíliótnavirus elleni CDS·* T-sejtes válasz
21. Veszettség vírusból származó ímmunogén fehérjét kódoló, 1-7. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns majom adenovirus alkalmazása entiősökben veszettség vírus elleni semlegesítő ellenanyag-válasz iodukáíására alkalmas gyógyszer előállítására.
22. Vakcina humán ímrmmdeticimcía vfass ellen, amely 1-7, igénypontok bármelyike szerinti majom adenovirus vektort tartalmaz, amelyben a hefeológ gén 5-es humán immnadeficieneia vírusból (HÍV-1) származó antigént kódol.
23. A 22, igénypont szerinti vakcina, ameiybea az antigén a HÍV-1 enveiope, pol vagy gag régiójának bártuelyíke.
24. A 22. igénypont szerinti vakcina, amelyben genetikailag instabil elemeket eltávolították a heterológ génből,
25. A 22, igénypont szerinti vakéba, amelyben a heíerológ gén 6. szonosítés/tám szerinti szekvenciát tartalmasé HÍV-1 gagcDNS.
9 i *«** * « ♦ ♦ »
*. « * » ♦·.·«·<
# φ X Κ««Χ 4 «« *«« χ *«♦
-44 ·
26, Vakcina veszettség vírus ellen, amely 1-7, igénypontok bármelybe szerinti majom adenovírust tortái máz, amelyben a heteroíég gén veszettség-antigént ködei.
HU0400297A 2001-06-22 2002-05-13 Methods of inducing a cytotoxic immune response and recombinant simian adenovirus compositions useful therein HU228327B1 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US30013101P 2001-06-22 2001-06-22
US30484301P 2001-07-12 2001-07-12
PCT/US2002/015239 WO2003000283A1 (en) 2001-06-22 2002-05-13 Methods of inducing a cytotoxic immune response and recombinant simian adenovirus compositions useful therein

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0400297A2 HUP0400297A2 (en) 2007-05-02
HUP0400297A3 HUP0400297A3 (en) 2010-08-30
HU228327B1 true HU228327B1 (en) 2013-03-28

Family

ID=26971607

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0400297A HU228327B1 (en) 2001-06-22 2002-05-13 Methods of inducing a cytotoxic immune response and recombinant simian adenovirus compositions useful therein

Country Status (26)

Country Link
US (1) US20040241181A1 (hu)
EP (1) EP1409012B1 (hu)
JP (1) JP2005523233A (hu)
KR (1) KR20040043129A (hu)
CN (1) CN1518457A (hu)
AT (1) ATE422365T1 (hu)
AU (1) AU2002308713B2 (hu)
BR (1) BR0210586A (hu)
CA (1) CA2451864C (hu)
CY (1) CY1109059T1 (hu)
CZ (1) CZ304169B6 (hu)
DE (1) DE60231123D1 (hu)
DK (1) DK1409012T3 (hu)
ES (1) ES2322043T3 (hu)
HK (1) HK1061511A1 (hu)
HU (1) HU228327B1 (hu)
IL (2) IL159454A0 (hu)
MX (1) MXPA04000024A (hu)
NO (1) NO333252B1 (hu)
NZ (1) NZ530245A (hu)
PL (1) PL216200B1 (hu)
PT (1) PT1409012E (hu)
SG (1) SG153649A1 (hu)
SI (1) SI1409012T1 (hu)
WO (1) WO2003000283A1 (hu)
ZA (1) ZA200309360B (hu)

Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040136963A1 (en) * 2001-06-22 2004-07-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenovirus vectors and methods of use
CA2852277C (en) 2001-11-21 2018-02-20 Guangping Gao Simian adenovirus nucleic acid and amino acid sequences, vectors containing same, and methods of use
EP1636370B1 (en) 2003-06-20 2014-04-16 The Trustees of The University of Pennsylvania Methods of generating chimeric adenoviruses and uses for such chimeric adenoviruses
JP4814800B2 (ja) * 2004-01-23 2011-11-16 イステイチユート・デイ・リチエルケ・デイ・ビオロジア・モレコラーレ・ピ・アンジエレツテイ・エツセ・ピー・アー チンパンジーアデノウイルスワクチン担体
WO2006040330A2 (en) 2004-10-13 2006-04-20 Crucell Holland B.V. Improved adenoviral vectors and uses thereof
ES2546330T3 (es) * 2005-05-12 2015-09-22 Glaxo Group Limited Composición de vacuna
NZ574239A (en) 2006-07-18 2011-12-22 Glaxosmithkline Biolog Sa Hybrid fusion proteins for malaria vaccines
BRPI0808553A2 (pt) 2007-03-02 2014-08-19 Glaxosmithkline Biolog Sa Métodos para elevar uma resposta imune contra um patógeno, para estimar a produção de células t cd4+ e/ou cd8+ e/ou anticorpos específicos de patógeno em mamíferos e para estimular uma resposta imune em um mamífero, composição de vacina, uso da mesma, e, kit
US7709010B2 (en) * 2007-03-09 2010-05-04 Merck Sharp & Dohme Corp. Papillomavirus vaccine compositions
LT2220242T (lt) * 2007-11-28 2017-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian pošeimio b adenovirusai sadv-28,27,-29,-32,-33 ir -35 ir jų panaudojimas
WO2010085984A1 (en) * 2009-02-02 2010-08-05 Okairos Ag Simian adenovirus nucleic acid- and amino acid-sequences, vectors containing same, and uses thereof
WO2011057254A2 (en) * 2009-11-09 2011-05-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Simian adenoviral vector-based vaccines
WO2011133870A2 (en) * 2010-04-22 2011-10-27 Andrea Amalfitano Vaccines comprising adenovirus vectors and signaling lymphocyte activating molecule-associated protein (sap)
CN102060915A (zh) * 2010-10-29 2011-05-18 广州呼吸疾病研究所 人3型腺病毒六邻体的可修饰位点及其应用
MX348172B (es) * 2011-03-21 2017-06-02 Altimmune Inc Sustancia inmunologica terapeutica rapida y prolongada.
TWI623618B (zh) 2011-07-12 2018-05-11 傳斯堅公司 Ｈｂｖ聚合酶突變體
WO2013045668A2 (en) 2011-09-29 2013-04-04 Transgene Sa Immunotherapy composition and regimen for treating hepatitis c virus infection
WO2013045658A1 (en) 2011-09-29 2013-04-04 Transgene Sa Immunotherapy composition and regimen for treating hepatitis c virus infection
CN103468743B (zh) * 2013-08-19 2015-07-29 中国科学院上海巴斯德研究所 一种狂犬病疫苗及其制备方法
CN103937835A (zh) * 2013-08-19 2014-07-23 中国科学院上海巴斯德研究所 一种基于腺病毒AdC68的表达载体及其构建方法
CA2928908C (en) 2013-11-01 2021-01-12 Pfizer Inc. Vectors for expression of prostate-associated antigens
RU2695375C2 (ru) * 2014-05-19 2019-07-23 Вало Терапьютикс Ой Покрытые онколитические аденовирусы для противораковых вакцин
MX2016016533A (es) 2014-06-13 2017-05-01 Glaxosmithkline Biologicals Sa Combinaciones inmunogenas.
KR102535670B1 (ko) 2015-06-12 2023-05-22 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 아데노바이러스 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드
US11498956B2 (en) 2016-08-23 2022-11-15 Glaxosmithkline Biologicals Sa Fusion peptides with antigens linked to short fragments of invariant chain(CD74)
US11466292B2 (en) 2016-09-29 2022-10-11 Glaxosmithkline Biologicals Sa Compositions and methods of treatment
GB201616904D0 (en) 2016-10-05 2016-11-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine
CA3045976A1 (en) * 2016-12-09 2018-06-14 Glaxosmithkline Biologicals Sa Chimpanzee adenovirus constructs with lyssavirus antigens
GB201701239D0 (en) 2017-01-25 2017-03-08 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel formulation
EP3655539A1 (en) 2017-07-21 2020-05-27 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Chikungunya virus antigen constructs
KR20200074987A (ko) 2017-10-31 2020-06-25 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. 아데노바이러스 및 이의 용도
BR112020007695A2 (pt) 2017-10-31 2020-10-20 Janssen Vaccines & Prevention B.V. adenovírus e seus usos
SG11202003398SA (en) 2017-10-31 2020-05-28 Janssen Vaccines & Prevention Bv Adenovirus vectors and uses thereof
US11872281B2 (en) 2017-10-31 2024-01-16 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Adenovirus and uses thereof
GB201721068D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis B immunisation regimen and compositions
GB201721069D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis B Immunisation regimen and compositions
KR20200101394A (ko) 2017-12-20 2020-08-27 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 엡스타인-바 바이러스 항원 구축물
EP3581201A1 (en) 2018-06-15 2019-12-18 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Escherichia coli o157:h7 proteins and uses thereof
EP3587581A1 (en) 2018-06-26 2020-01-01 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Formulations for simian adenoviral vectors having enhanced storage stability
EP3934687A1 (en) 2019-03-05 2022-01-12 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Hepatitis b immunisation regimen and compositions
AU2021309007A1 (en) 2020-07-13 2023-02-16 Transgene Treatment of immune depression
WO2023213764A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Transgene Fusion polypeptide comprising an anti-pd-l1 sdab and a member of the tnfsf

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6174666B1 (en) * 1992-03-27 2001-01-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of eliminating inhibitory/instability regions from mRNA
IL113817A (en) * 1994-06-30 2001-03-19 Merck & Co Inc Polynucleotide for vaccination against the umbilical cord virus
US5698202A (en) * 1995-06-05 1997-12-16 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Replication-defective adenovirus human type 5 recombinant as a rabies vaccine carrier
AU6261696A (en) * 1995-06-05 1996-12-24 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The A replication-defective adenovirus human type 5 recombinant as a vaccine carrier
AU4255397A (en) * 1996-09-06 1998-03-26 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Chimpanzee adenovirus vectors
AU5677399A (en) * 1998-08-20 2000-03-14 Wistar Institute Of Anatomy And Biology, The Methods of augmenting mucosal immunity through systemic priming and mucosal boosting

Also Published As

Publication number Publication date
ATE422365T1 (de) 2009-02-15
ZA200309360B (en) 2005-07-27
HUP0400297A2 (en) 2007-05-02
NO20035740D0 (no) 2003-12-19
SG153649A1 (en) 2009-07-29
PL372294A1 (en) 2005-07-11
MXPA04000024A (es) 2004-05-21
NO20035740L (no) 2004-02-16
ES2322043T3 (es) 2009-06-16
AU2002308713A2 (en) 2003-01-08
HUP0400297A3 (en) 2010-08-30
CA2451864C (en) 2013-01-15
CZ304169B6 (cs) 2013-12-04
EP1409012B1 (en) 2009-02-11
KR20040043129A (ko) 2004-05-22
WO2003000283A1 (en) 2003-01-03
HK1061511A1 (en) 2004-09-24
CY1109059T1 (el) 2014-07-02
NZ530245A (en) 2007-04-27
US20040241181A1 (en) 2004-12-02
IL159454A (en) 2009-09-01
NO333252B1 (no) 2013-04-22
DE60231123D1 (de) 2009-03-26
EP1409012A1 (en) 2004-04-21
JP2005523233A (ja) 2005-08-04
PL216200B1 (pl) 2014-03-31
BR0210586A (pt) 2005-07-12
AU2002308713B2 (en) 2008-05-15
SI1409012T1 (sl) 2009-08-31
CA2451864A1 (en) 2003-01-03
EP1409012A4 (en) 2005-08-03
CZ20033438A3 (cs) 2004-04-14
DK1409012T3 (da) 2009-05-18
IL159454A0 (en) 2004-06-01
PT1409012E (pt) 2009-05-11
CN1518457A (zh) 2004-08-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU228327B1 (en) Methods of inducing a cytotoxic immune response and recombinant simian adenovirus compositions useful therein
US11214599B2 (en) Recombinant simian adenoviral vectors encoding a heterologous fiber protein and uses thereof
JP5753377B2 (ja) チンパンジーアデノウイルスワクチン担体
US5698202A (en) Replication-defective adenovirus human type 5 recombinant as a rabies vaccine carrier
AU2002308713A1 (en) Methods of inducing a cytotoxic immune response and recombinant simian adenovirus compositions useful therein
WO2022003083A1 (en) Gorilla adenovirus nucleic acid- and amino acid-sequences, vectors containing same, and uses thereof
US10517938B2 (en) Adenovirus based malaria vaccine encoding and displaying a malaria antigen
JP2018078894A (ja) サルアデノウイルスの核酸配列及びアミノ酸配列、それを含有するベクター、並びにその使用

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees