ES2546330T3 - Composición de vacuna - Google Patents

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Abstract

Un vector de adenovirus que comprende un polinucleótido o polinucleótidos que codifican al menos los antígenos de VIH RT, Nef y Gag o fragmentos inmunógenos de los mismos, dispuestos de forma que son transcritos en el orden Gag, RT, Nef, de modo que la porción Gag se encuentre en el extremo N terminal de la proteína de fusión resultante, caracterizado porque el virus es un adenovirus de primate no humano y el virus es un adenovirus de chimpancé seleccionado de Pan 5, Pan 6 y Pan 7.

Description

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los sitios EcoRI y SpeI. El fragmento Xhol de 10154 pb de Ad SV-25 (pb 2031 a 12185) se insertó seguidamente en el sitio SpeI. El plásmido resultante se digirió con HindIII y la construcción (pSV25) se completó insertando el fragmento de Ad SV-25 HindIII de 18344 pb (pb 11984 a 30328) para generar un clon molecular completo de adenovirus SV25 con una supresión E1 adecuado para la generación de adenovirus recombinantes. Opcionalmente, se inserta un gen transformado deseado en los sitios I-CeuI y PI-SceI del plásmido del vector pSV25 recién creado.
Para generar un AdSV25 que porte un gen marcador, se separó un casete de expresión GFP (proteína fluorescente verde) clonado previamente en el plásmido pShuttle (Clontech) con las enzimas de restricción I-CeuI y PI-SceI y se ligó en pSV25 (u otro de los plásmidos Ad de chimpancé descritos en el presente documento) digerido con las mismas enzimas. El plásmido resultante (pSV25GFP) se digirió con SwaI para separar la estructura plasmídica bacteriana y se transfectó a la línea de células complementaria de E1 HEK 293. Aproximadamente 10 días después, se observó un efecto citopático que indicaba la presencia de virus replicativo. La generación con éxito de un vector adenovírico a base de Ad SV25 que expresa GFP se confirmó aplicando el líquido sobrenadante del cultivo transfectado sobre cultivos celulares nuevos. La presencia de células infectadas secundariamente se determinó por observación de la fluorescencia verde en una población de las células.
2.Construcción de vectores Pan-6 y Pan-7 con supresión E3.
Con el fin de potenciar la capacidad de clonación de los vectores adenovíricos, se puede eliminar la región E3 debido a que esta región codifica genes que no son requeridos para la propagación del virus en cultivo. En este sentido, se han realizado versiones con supresión E3 de Pan-5, Pan-6, Pan-7 y C68 (se elimina un fragmento Nru-AvrII de 3,5 kb que contiene E31-9).
Deleción E3 en vector a base de Pan 6
Se digirió el clon molecular pPan6-pkGFP con supresión E1 con Sbf I y Not I para aislar el fragmento de 19,3 kb y volver a ligar en el sitio Sbf I. La construcción resultante pPan6-Sbf I-E3 se trató con Eco 47 III y Swa I, generando pPan6-E3. Finalmente, se subclonó el fragmento Sbf I de 21 kb de la digestión con Sbf I de pPan6-pkGFP en pPan6-E3 para crear pPan6-E3-pkGFP con una supresión de 4 kb en E3.
Vector Pan7 con supresión E3
Se usó la misma estrategia para conseguir supresiones E3 en Pan 7. Primero, un fragmento Avr II de 5,8 kb que abarca la región E3 se subclonó en pSL-1180, seguido por la supresión de E3 por digestión con Nru I. Los plásmidos resultantes se trataron con Spe I y Avr II para obtener fragmentos de 4,4 kb y se clonó en pPan7-pkGFP en los sitios Avr II para reemplazar el E3 original que contenía fragmentos Avr II, respectivamente. La construcción final pPan7-E3-pkGFP tenía una supresión E3 de 3,5 kb.
En el documento WO 03/0046124 se presenta una descripción detallada de la construcción de supresiones E1, E3 y E4 en estos y otros serotipos de adenovirus Pan. También hay disponible más información en Human Gene Therapy 15:519-530 (documento WO03/046124).
Ejemplo 2.
Construcción de la secuencia de Gag, RT, Nef.
Esto se describe con detalle en el documento WO03/025003
Plásmido p73i-Tgrn
1. Plásmido: p73i-GRN2 Clon No. 19 (p17/p24(opt)/RT(opt)trNef) -reparado
Gen de interés:
La porción p17/p24 de Gag de codón optimizado, RT de codón optimizado y gen Nef truncado de la cepa HXB2 de subtipo B de VIH-1 cadena abajo de un promotor HCMV de longitud Iowa + exon1, y cadena arriba de una señal de poliadenilación de β-globina de conejo.
Plásmidos que contienen el gen trNef derivado del plásmido p17/24trNef1 contienen un error en la PCR que origina un cambio de aminoácido R a H 19 aminoácidos desde el extremo de Nef. Esto se corrigió mediante mutagénesis por PCR, la PCR de Nef corregida se unió a RT de codón optimizado de p7077-RT3, y el fragmento unido se cortó con ApaI y BamHI, y se clonó en el corte con ApaI/BamHI, p73i-GRN.
Cebadores:
PCR coRT de p7077-RT3 usando cebadores:
(Polimerasa = PWO (Roche) en todo el proceso.
Codificante: U1
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GAATTCGCGGCCGCGATGGGCCCCATCAGTCCCATCGAGACCGTGCCGGTGAAGCTGAAACCCGGGAT AScoRT-Nef GGTGTGACTGGAAAACCCACCATCAGCACCTTTCTAATCCCCGC Ciclo: 95 °C (30 s) luego 20 ciclos 95 °C (30 s), 55 °C (30 s), 72 °C (180s), luego 72 °C (120 s) y manteniendo a 4 °C El producto de PCR de 1,7 kb se purificó en gel. PCR 5’ Nef de p17/24trNef1 usando cebadores:
Codificante: S-Nef ATGGTGGGTTTTCCAGTCACACC No codificante: ASNef-G: GATGAAATGCTAGGCGGCTGTCAAACCTC Ciclo: 95 °C (30 s) luego 15 ciclos 95 °C (30 s), 55 °C (30 s), 72 °C (60 s), luego 72 °C (120 s) y manteniendo a 4
°C
PCR 3’ Nef de p17/24trNef1 usando cebadores: Codificante: SNEF-G GAGGTTTGACAGCCGCCTAGCATTTCATC
No codificante: AStrNef (No codificante) CGCGGATCCTCAGCAGTTCTTGAAGTACTCC Ciclo: 95 °C (30 s) luego 15 ciclos 95 °C (30 s), 55 °C (30 s), 72 °C (60 s), luego 72 °C (120 s) y manteniendo a 4
°C
Los productos de la PCR se purificaron en gel. Inicialmente los dos productos Nef se unieron usando los cebadores 5’ (S-Nef) y 3’ (AstrNef). Ciclo: 95 °C (30 s) luego 15 ciclos 95 °C (30 s), 55 °C (30 s), 72 °C (60 s), luego 72 °C (180s) y manteniendo a 4 °C . El producto de la PCR se limpió por PCR y se unió al producto RT usando los cebadores U1 y AstrNef:
Ciclo: 95 °C (30 s) luego 20 ciclos 95 °C (30 s), 55 °C (30 s), 72 °C (180s), luego 72 °C (180s) y manteniendo a 4
°C. El producto de 2,1 kb se purificó en gel y se cortó con ApaI y BamHI. El plásmido p73I-GRN también se cortó con Apa1 y BamHI se purificó en gel y se ligó con ApaI-Bam RT3trNef para regenerar el gen p17/p24(opt)/RT(opt)trNef.
2. Plásmido: p73I-RT w229k (RT inactivada) Gen de Interés:
Generación de un gen RT inactivado cadena abajo de un promotor HCMV de longitud Iowa + exon 1, y cadena arriba de una señal de poliadenilación de -globina de conejo.
Debido a problemas con respecto al uso de una especie RT de VIH activa en una vacuna terapéutica era deseable la inactivación del gen. Esto se consiguió mediante mutagénesis por PCR en la posición aminoacídica 229 de RT (derivado de P73I-GRN2) desde Trp a Lys (R7271 p1-28).
Cebadores:
PCR 5’ RT + mutación usando cebadores:
(polimerasa = PWO (Roche) en todo el proceso) Codificante: RT3-u:1 GAATTCGCGGCCGCGATGGGCCCCATCAGTCCCATCGAGACCGTGCCGGTGAAGCTGAAACCCGGGAT
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p66 RT (opt) – trNef -p17, p24 (opt) Gag,
p17 , p24 (opt) Gag -trNef -p66 RT (opt).
Las secuencias completas para estas construcciones se presentan en las Figuras 8 a 12 respectivamente.
Ejemplo 3.
Inserción de la secuencia Gag, RT, Nef en Adenovirus.
Subclonación del casete de expresión GRN en plásmido pShuttle.
El casete de expresión completo consistente en promotor, ADNc y señal de poliadenilación se aisló de construcciones pT-GRN por digestión doble con Sph I y EcoR I. El extremo Sph I del fragmento Sph I/EcoR I se rellenó con Klenow y se clonó en el plásmido pShuttle en los sitios EcoR I y Mlu I en los que el extremo Mlu I era romo.
Durante el proceso de clonación quedó asociada con el casete de expresión del VIH una secuencia de flanqueo adicional. Esta secuencia se conoce como la secuencia Cer y no tiene función conocida.
Transferencia del casete de expresión GRN en clones moleculares con supresión de E1/E3 de vectores Pan6 y Pan7.
El casete de expresión se recuperó de digestiones de pShuttle por I-Ceu I y PI-Sce I y se clonó en los mismos sitios de los clones moleculares de vectores Pan6 y Pan7. Los clones recombinantes se identificaron por selección verde/blanco y se confirmó por análisis con enzimas de restricción extensivo.
Rescate y propagación de virus recombinantes.
Se trataron clones moleculares de vectores C6 y C7 con endonucleasas de restricción adecuadas (PmeI y PacI respectivamente) para liberar genomas de vectores lineales intactos y se transfectaron en células 293 usando el procedimiento de fosfato de calcio. Cuando se observó el efecto citopático completo en las células transfectadas, se recogieron los lisados víricos en bruto y se expandieron gradualmente hasta infecciones a gran escala en células 293 (1x109 células). Los virus de las infecciones a gran escala se purificaron por procedimiento de sedimentación con CsCl convencional.
Además, el plásmido pShuttle se puede recortar más cortando con EcoRI y XmnI para eliminar una secuencia enlazadora 3' y reducir el tamaño del plásmido para producir pShuttleGRNc. Este plásmido modificado se puede usar para generar un virus Pan7 adicional (C7-GRNc) usando el procedimiento que se ha descrito antes.
Se insertaron otras construcciones de forma similar tanto en el adenovirus Pan 6 como Pan 7. No obstante no se produjo con éxito Pan 6 con un inserto p66 RT (opt) – trNef -p17, p24 (opt) Gag.
Ejemplo 4.
Modelo de inmunogenicidad en el ratón
Se ensayaron una serie de vectores Pan6 y Pan7 que contenían insertos reordenados de los antígenos de VIH RT, Nef y Gag (RGN, NRG, NGR, GRN, y GNR) para determinar las respuestas inmunitarias in vivo. Se llevaron a cabo tres experimentos para probar los virus Pan6 y dos para Pan7. Cada adenovirus se administró intramuscularmente en un volumen de 50 l en una única pata trasera de ratones Balb/c (K2d) en una dosis de 1x108 partículas. Esta dosis se seleccionó puesto que había demostrado previamente inducir buenos niveles de respuestas inmunitarias celulares (no publicado).
La Tabla 1 muestra los adenovirus que se compararon en estos experimentos.
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