ES2659183T3 - Adenovirus símico y vectores adenovirales híbridos - Google Patents

Adenovirus símico y vectores adenovirales híbridos Download PDF

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Abstract

Un vector de adenovirus que comprende una cápside, en donde dicha cápside comprende las proteínas de la cápside del adenovirus AdY25 de chimpancé de tipo natural y encapsida una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos exógena de interés unida operativamente a secuencias de control de la expresión que dirigen la traducción, transcripción y/o expresión del mismo en una célula animal y una secuencia de señal de empaquetamiento de adenovirus, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica el adenovirus AdY25 de chimpancé de tipo natural es la SEQ ID NO: 1, en el que dicho vector carece de un locus E1 funcional, y en el que el vector comprende al menos un marco de lectura abierto de E4 heterólogo de otro serotipo adenovírico.

Description

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Descripción
Adenovirus símico y vectores adenovirales híbridos Campo de la invención
Se describen en este documento nuevos vectores adenovirales derivados de un adenovirus de chimpancé, composiciones inmunogénicas de los mismos y su uso en medicina.
Antecedentes
Tradicionalmente, las vacunas se han basado en patógenos inactivados o atenuados completos. Sin embargo, para muchas enfermedades infecciosas tales como la malaria, este enfoque no es práctico y el enfoque de la investigación ha cambiado al desarrollo de 'vacunas de subunidades' que expresan solo aquellos antígenos derivados de patógenos que inducen correlaciones inmunes de protección.
Las vacunas de subunidades presentan un antígeno para el sistema inmune sin introducir un organismo infeccioso completo. Uno de tales métodos implica la administración de una proteína aislada específica de un organismo infeccioso. Sin embargo, esta técnica a menudo solo induce una respuesta inmune débil y las proteínas aisladas pueden tener una estructura tridimensional diferente a la proteína en su contexto normal, lo que da como resultado la producción de anticuerpos que pueden no reconocer el organismo infeccioso.
Por lo tanto, se ha desarrollado un método alternativo que utiliza vectores virales para la administración de antígenos. Los virus son parásitos intracelulares obligados que se replican transfectando su ADN en una célula huésped e induciendo a la célula hospedadora a expresar el genoma viral. Esta estrategia reproductiva se ha aprovechado para crear vacunas vectorizadas mediante la creación de vectores virales recombinantes no replicantes que llevan uno o más transgenes heterólogos. La transfección o transducción del genoma viral recombinante en la célula huésped da como resultado la expresión del transgén heterólogo en la célula huésped. Cuando el transgén heterólogo codifica un antígeno, por ejemplo, la expresión del antígeno dentro de la célula huésped puede provocar una respuesta inmune protectora o terapéutica por parte del sistema inmune del huésped. Como tal, los vectores virales pueden funcionar como vacunas efectivas. Alternativamente, el transgén heterólogo puede codificar un alelo funcional de un gen, cuya expresión puede usarse para contrarrestar los efectos de un alelo mutante deletéreo del gen, en un proceso conocido como terapia génica.
Particularmente adecuados para su uso como vectores virales son los adenovirus. Los adenovirus son virus sin envoltura, de aproximadamente 90 - 100 nm de diámetro, que comprenden una nucleocápside y un genoma de ADN de doble cadena lineal. La nucleocápside viral comprende capsómeros pentón y hexón. Una fibra única se asocia con cada base de pentón y ayuda a la unión del virus a la célula huésped a través del receptor Coxsackie- adenovirus en la superficie de la célula huésped. Se han identificado más de 50 cepas de serotipos de adenovirus, la mayoría de las cuales causan infecciones del tracto respiratorio, conjuntivitis y gastroenteritis en seres humanos. En lugar de integrarse en el genoma del huésped, los adenovirus normalmente se replican como elementos episomales en el núcleo de la célula huésped. El genoma de los adenovirus comprende 4 unidades de transcripción temprana (E1, E2, E3 y E4), que tienen principalmente funciones reguladoras y preparan la célula huésped para la replicación viral. El genoma también comprende 5 unidades transcripcionales tardías (L1, L2, L3, l4 y L5), que codifican proteínas estructurales que incluyen el pentón (L2), el hexón (L3), la proteína estructural (L4) y la proteína de fibra (L5), que están bajo el control de un único promotor. Cada extremidad del genoma comprende una repetición terminal invertida (iTr) que es necesaria para la replicación viral.
Los adenovirus recombinantes se desarrollaron originalmente para la terapia génica, pero las respuestas inmunes específicas de transgenes fuertes y sostenidas provocadas por estos agentes de administración de genes provocaron su uso como vehículos de vacuna. Además de ser altamente inmunogénicos, los adenovirus ofrecen muchas otras ventajas para el desarrollo clínico de vacunas. El genoma adenoviral es relativamente pequeño (entre 26 y 45 kbp), está bien caracterizado y es fácil de manipular. La eliminación de una sola unidad transcripcional, E1, hace que la replicación del virus sea incompetente, lo que aumenta su predictibilidad y reduce los efectos secundarios en aplicaciones clínicas. Los adenovirus recombinantes pueden acomodar transgenes relativamente grandes, en algunos casos de hasta 8 kb, lo que permite flexibilidad en el diseño de las subunidades, y tienen un tropismo relativamente amplio que facilita la administración de transgenes a una amplia variedad de células y tejidos. Es importante destacar que para las aplicaciones clínicas, los métodos para la producción a mayor escala y la purificación de adenovirus recombinantes a títulos elevados están bien establecidos. Hasta ahora, los serotipos del subgrupo C AdHu2 o AdHu5 se han usado predominantemente como vectores.
Sin embargo, la primera generación de vectores de vacunas basados en el adenovirus humano arquetípico AdHu5 mostró poca eficacia en los ensayos clínicos, a pesar de los alentadores datos preclínicos1. Posteriormente se descubrió que una gran proporción de adultos humanos alberga títulos significativos de anticuerpos neutralizantes contra serotipos humanos comunes, tales como AdHu2 y AdHu5, como resultado de una infección natural. Los anticuerpos neutralizantes podrían reducir la potencia de las vacunas de vectores virales al bloquear la entrada viral en las células huésped y, por lo tanto, la administración del transgén objetivo.
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La aparición de inmunidad antivectorial preexistente se está abordando mediante el desarrollo de nuevos vectores adenovira|es basados en serotipos a los que3la población humana tiene menos probabilidades de haber estado expuestos, incluidos los de origen chimpancé ' . Sin embargo, algunos de tales vectores adenovirales de chimpancé tienen una eficacia limitada sobre la base de inmunidad inexplicada en poblaciones humanas, niveles variables de reactividad cruzada con adenovirus humanos y crecimiento subóptimo en líneas celulares transformadas. Además, es ventajoso disponer de una gama de diferentes vectores adenovirales para su uso en la inmunización frente a diferentes enfermedades, basándose en que la inducción de anticuerpos neutralizantes contra un vector puede evitar su re-administración para otra indicación.
El documento WO 2009/073104 describe vectores de adenovirus derivados de adenovirus de chimpancé, es decir, SAdV-25.2, que se usaron, entre otros, para la inducción de anticuerpos neutralizantes cruzados y se consideraron útiles como vacunas para presentar un antígeno seleccionado con el fin de provocar respuestas inmunes protectoras. Estos vectores SAdV-25.2 comprenden proteínas estructurales que tienen una identidad de secuencia de alto porcentaje con respecto a las descritas en este documento.
Por lo tanto, continúa existiendo una necesidad en la técnica de vectores adenovirales no humanos altamente inmunogénicos que entreguen eficazmente el transgén diana, minimicen el efecto de la inmunidad preexistente a serotipos de adenovirus y se repliquen de manera eficiente en líneas celulares transformadas.
Sumario de la invención
En un primer aspecto, la presente invención proporciona un vector de adenovirus que comprende una cápside, en donde dicha cápsida comprende las proteínas de la cápsida del adenovirus AdY25 de chimpancé de tipo natural y encapsida una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos exógena de interés unida operativamente a secuencias de control de la expresión que dirigen la traducción, transcripción y/o expresión de los mismos en una célula animal y una secuencia de señal de empaquetamiento adenovírico,
en el que la secuencia de nucleótidos que codifica el adenovirus AdY25 de chimpancé de tipo natural es la SEQ ID NO: 1,
en el que dicho vector carece de un locus E1 funcional, y
en donde el vector comprende al menos un marco de lectura abierto de E4 heterólogo de otro serotipo adenovírico.
Un segundo aspecto proporciona composiciones inmunogénicas que comprenden el vector adenoviral según el primer aspecto, opcionalmente en combinación con uno o más ingredientes activos adicionales, un vehículo, diluyente, excipiente o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
Un tercer aspecto proporciona el uso del vector adenovírico de acuerdo con el primer aspecto o la composición inmunogénica de acuerdo con el segundo aspecto en medicina. En particular, el vector adenovírico y las composiciones inmunogénicas se proporcionan para uso en terapia génica, o para uso en la prevención o tratamiento de al menos una infección o para uso en la prevención o tratamiento de al menos una enfermedad, o para uso en provocar o potenciar una respuesta inmunitaria protectora en un animal, o para usar en la inducción de una respuesta inmune protectora en un animal que romperá la tolerancia a un autoantígeno.
Un cuarto aspecto de la presente invención proporciona una secuencia de polinucleótidos que codifica el vector adenovírico de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención.
Un quinto aspecto de la presente invención proporciona una célula hospedadora transducida con el vector viral de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención.
Un sexto aspecto de la presente invención proporciona un método para producir el vector viral de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención, preferiblemente generando un clon molecular de AdY25 en un Cromosoma Artificial Bacteriano (BaC).
Un séptimo aspecto de la presente invención proporciona, por lo tanto, un clon del Cromosoma Artificial Bacteriano (BAC) que comprende la secuencia de polinucleótidos de acuerdo con el cuarto aspecto de la presente invención.
Un octavo aspecto de la presente invención proporciona una línea celular de empaquetamiento que produce el vector viral de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención.
También se describe en este documento un vector adenovírico distinto de AdHu5 que tiene una molécula de ácido nucleico que comprende las regiones codificantes E4Orf4, E4Orf6 y E4Orf6/7 de AdHu5.
Figuras
La presente invención se describe con referencia a las siguientes figuras en las que:
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La Figura 1 muestra una alineación de secuencia filogenética de las secuencias de aminoácidos de (A) la proteína hexón y (B) la proteína de fibra de diferentes serotipos de adenovirus. Las secuencias se agrupan en los seis grupos de adenovirus A-F.
La Figura 2 muestra una alineación de la secuencia filogenética basada en la secuencia de nucleótidos genómicos completa de adenovirus de tipo natural de diferentes especies. Las secuencias se agrupan en los seis grupos de adenovirus A-F.
La Figura 3A es un histograma del rendimiento viral (unidades infecciosas/ml) de AdHu5 y tres vectores basados en AdY25 que expresan proteína verde fluorescente (GFP): i) AdY25 E4 de tipo natural ("Y25E4wt"); ii) AdY25 E4 AdHu5 Orf6 ("Y25Ad5E4Orf6") y iii) AdY25 AdHu5 E4Orf4/6/7 ("AdChOX1").
La Figura 3B es un histograma de la relación de focos de GFP frente al título del anti-hexón para AdHu5, AdCh63, AdY25 E4 de tipo natural y las construcciones A-E, como se describe en la Figura 3C, todas expresan el antígeno TIPeGFP.
La Figura 3C es una tabla que detalla la construcción de las construcciones A, B, C, D y E del vector de AdY25 E4- modificado.
La figura 3D es un histograma de la relación del gen marcador: título del hexón para vectores basados en AdChOX1 que expresan TIPeGFP, que tiene transgenes fluorescentes GFP o mCherry. Todos los datos son representativos de al menos dos experimentos independientes. Las barras de error muestran la media y SEM.
La Figura 4 es una representación gráfica de la inmunogenicidad celular (células formadoras de manchas (SFC)/millón) de ChAdOX1 en comparación con AdCh63 y AdCh68.
La Figura 5 es una representación gráfica del efecto de la modificación de E4 en las respuestas ELISpot del bazo de IFN-y (SFC/millón) frente a dos epítopos, Pb9 y P15, dos semanas después de la inmunización intramuscular de ratones Balb/c (4/grupo) con tanto 108 como 106 unidades infecciosas (ifu) de vectores basados en AdY25 con las siguientes regiones E4: i) región E4 de tipo natural ("E4wt"); ii) E4Orf6 de AdHu5 ("E4Orf6"); o iii) E4Orf4, 6 y 7 de AdHu5 ("E4Orf4/6/7").
La Figura 6 es un histograma que muestra la prevalencia de anticuerpos neutralizadores de vector en sueros humanos de (A) el Reino Unido y (B) Gambia, frente a Y25Ad5E4Orf6 (referido en la Figura 6 como "ChAdOXI") y AdCh63.
La Figura 7 es una representación gráfica de la inmunogenicidad humoral de vectores basados en ChAdOXI y AdCh68 que llevan el antígeno TIPeGFP. Después de 56 días después del cebado, se reforzaron los ratones con 106 pfu de MVA - TIPeGFP. Se recogió el suero y se midieron las respuestas mediante ELISA de punto final a) 50 días después del cebado y b) 10 días después del refuerzo. Media y significancia indicados. Análisis estadísticos realizados por ANOVA de una vía. La línea punteada indica el límite de detección del ensayo.
La Figura 8A es una representación gráfica de la inmunogenicidad celular (células formadoras de manchas (SFC)/millón de esplenocitos) del vector ChAdOXI que lleva el antígeno Ag85A de Mycobacterium tuberculosis, en tres dosis diferentes. Las respuestas inmunes celulares frente a Ag85A se determinaron mediante ensayo de ELIspot con IFN-y utilizando esplenocitos estimulados con péptidos sintéticos correspondientes al epítopo restringido inmunodominante conocido de células T CD4+ H-2d en Ag85A (p15).
La Figura 8B es una representación gráfica de la inmunogenicidad celular (células formadoras de manchas (SFC)/millón de esplenocitos) de ChAdOXI que lleva el antígeno Ag85A de Mycobacterium tuberculosis, en tres dosis diferentes. Las respuestas inmunes celulares frente a Ag85A se determinaron mediante ensayo de ELIspot de IFN-y usando esplenocitos estimulados con péptidos sintéticos correspondientes al epítopo inmunodominante conocido de células T CD8+ H-2d restringido en Ag85A (p11).
La Figura 9 es una representación gráfica de la inmunogenicidad celular (células formadoras de manchas (SFC)/millón de esplenocitos) de ChAdOXI y HAdV-5 que porta la nucleoproteína (NP) y la proteína matricial 1 (M1) del virus de la Influenza A, en dos dosis diferentes. Las respuestas inmunes celulares a la nucleoproteína (NP) se determinaron mediante ensayo de IFN-y ELIspot usando esplenocitos estimulados con péptidos sintéticos correspondientes al epítopo inmunodominante conocido de células T CD8+ H-2d restringido en NP.
Descripción detallada
La presente invención se refiere a nuevos vectores adenovirales derivados de un adenovirus de chimpancé, AdY25, composiciones inmunogénicas de los mismos y su uso en medicina.
El AdY25 es un adenovirus de chimpancé que ha sido secuenciado por primera vez por los presentes inventores. La secuencia de nucleótidos se proporciona en SEQ ID NO. 1.
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Un primer aspecto de la presente invención proporciona, por lo tanto, un vector de adenovirus que comprende una cápside, en donde dicha cápsida comprende las proteínas de la cápside del adenovirus AdY25 de chimpancé de tipo natural y encapsida una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos exógena de interés unida operativamente a secuencias de control de la expresión que dirigen la traducción, transcripción y/o la expresión de los mismos en una célula animal y una secuencia de señal de empaquetamiento adenovírico,
en el que la secuencia de nucleótidos que codifica el adenovirus AdY25 de chimpancé de tipo salvaje es la SEQ ID NO: 1,
en el que dicho vector carece de un locus E1 funcional, y
en el que el vector comprende al menos un marco de lectura abierto de E4 heterólogo de otro serotipo adenovírico.
Las personas expertas en la técnica apreciarán que existen homólogos, equivalentes y derivados de todas las secuencias de ácido nucleico descritas en este documento. Por lo tanto, se describen moléculas de ácido nucleico que tienen una secuencia sustancialmente idéntica en toda su longitud respecto a las secuencias de ácido nucleico descritas en este documento.
Los expertos en la materia apreciarán que la presente descripción también puede incluir variantes de esas moléculas particulares de ácido nucleico que se ejemplifican en este documento. Esto puede ocurrir en la naturaleza, por ejemplo, debido a la variación de la cepa. Por ejemplo, adiciones, sustituciones y/o eliminaciones están incluidas. Los expertos en la técnica también apreciarán que la variación de las moléculas de ácido nucleico particulares ejemplificadas en la presente será posible en vista de la degeneración del código genético. Preferiblemente, las variantes tienen una identidad sustancial con las secuencias de ácido nucleico descritas en este documento en toda su longitud.
Como se usa en este documento, las secuencias de ácido nucleico que tienen "identidad sustancial" preferiblemente tienen al menos 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98,1%, 98,2 %, 98,3%, 98,4%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4% 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% o 99,9 % de identidad con dichas secuencias. Deseablemente, la expresión "identidad sustancial" indica que dicha secuencia tiene un mayor grado de identidad con cualquiera de las secuencias descritas en este documento que con las secuencias de ácido nucleico de la técnica anterior.
Cuando se comparan secuencias de ácidos nucleicos con el fin de determinar el grado de homología o identidad, se pueden usar programas tales como BESTFIT y GAP (ambos del paquete de software Wisconsin Genetics Computer Group (GCG)). BESTFIT, por ejemplo, compara dos secuencias y produce una alineación óptima de los segmentos más similares. GAP permite que las secuencias se alineen a lo largo de toda su longitud y encuentra la alineación óptima al insertar espacios en cualquier secuencia, según corresponda. Adecuadamente, en el contexto de la presente invención, cuando se habla de la identidad de las secuencias de ácidos nucleicos, la comparación se realiza por alineación de las secuencias en toda su longitud. Lo anterior se aplica mutatis mutandis a todas las secuencias de ácidos nucleicos descritas en la presente solicitud.
La molécula de ácido nucleico según el primer aspecto comprende la secuencia de nucleótidos de:
(a) nucleótidos 18302 a 21130 de SEQ ID NO. 1 o una secuencia sustancialmente idéntica a la misma;
(b) nucleótidos 13891 a 15486 de la SEQ ID NO. 1 o una secuencia sustancialmente idéntica a la misma; y
(c) nucleótidos 32290 a 33621 de SEQ ID NO. 1 o una secuencia sustancialmente idéntica a la misma.
Estas secuencias de nucleótidos codifican el (a) hexón, (b) pentón y (c) las proteínas de cápside de fibra de AdY25, cuyas regiones exteriores determinan las propiedades del vector viral, incluido el serotipo.
La molécula de ácido nucleico de acuerdo con el primer aspecto también puede comprender una o más secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína hexón que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 2, o una secuencia al menos 98,2% idéntica a la misma; o una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína hexón que tiene una secuencia al menos 98,2% idéntica a la proteína codificada por los nucleótidos 18302 a 21130 de SEQ ID NO. 1;
(b) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pentón que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 3, o una secuencia al menos 98,3% idéntica a la misma; o una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pentón que tiene una secuencia al menos un 98,3% idéntica respecto a la proteína codificada por los nucleótidos 13891 a 15486 de la SEQ ID NO. 1; y
(c) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fibra que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 4 o una secuencia al menos 99,1% idéntica a la misma; o una secuencia de nucleótidos que codifica
una proteína de fibra que tiene una secuencia al menos idéntica 99,1% respecto a la proteína codificada por los nucleótidos 32290 a 33621 de la SEQ. ID. 1.
Las moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia complementaria a la molécula de ácido nucleico de la presente descripción están dentro del alcance de la presente descripción. Las moléculas de ácido nucleico que se 5 hibridan solo con la molécula de ácido nucleico de la presente descripción también están abarcadas por la presente solicitud. Por lo tanto, las condiciones usadas para la hibridación son suficientemente estrictas para que solo tales secuencias de ácido nucleico permanezcan hibridadas. El experto en la materia podrá determinar fácilmente tales condiciones.
El ácido nucleico puede ser ADN, incluyendo ADNc, ARN que incluye ARNm o PNA (ácido nucleico peptídico) o una 10 mezcla de los mismos.
La Tabla 1 proporciona una descripción general de las secuencias de AdY25 de tipo natural descritas en este documento:
Tabla 1
SEQ ID NO.
Descripción Nucleótidos correspondientes en SEQ ID NO. 1
1
Genoma (secuencia de nucleótidos) N/A
2
Proteína de hexón Nucleótidos 18302 a 21130 (L3)
3
Proteína de pentón Nucleótidos 13891 a 15486 (L2)
4
Proteína de fibra Nucleótidos 32290 a 33621 (L5)
5
E1A Nucleótidos 577 a 1143 y 1237 a 1443
6
E1B 19KDa Nucleótidos 1602 a 2165
7
E1B55KDa Nucleótidos 1907 a 3406
8
pIX Nucleótidos 3491 a 3919
9
IVa2 Nucleótidos 5587 a 5602 y 3978 a 5311 (E2)
10
Polimerasa Nucleótidos 13838 a 13846 y 5081 a 8662 (E2)
11
pTP Nucleótidos 13838 a 13846 y 8463 a 10392 (E2)
12
52/55kDa Nucleótidos 10827 a 12017 (L1)
13
IIIa Nucleótidos 12041 a 13807 (L1)
14
VII Nucleótidos 15493 a 16074
15
V Nucleótidos 16119 a 17141
16
Mu Nucleótidos 17161 a 17394
17
VI Nucleótidos 17470 a 18201
18
Endoproteasa Nucleótidos 21146 a 21775
19
Proteína de unión de ADN Nucleótidos 21852 a 23390
20
100kDa Nucleótidos 23419 a 25827 (L4)
21
22KDa Nucleótidos 25544 a 26098
22
33KDa Nucleótidos 25544 a 25871 y 26041 a 26372 (L4)
23
pVIII Nucleótidos 25602 a 26285 (L4)
24
E3 12,5KDa Nucleótidos 27139 a 27459
25
E3 CRIaI Nucleótidos 27413 a 28051
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SEQ ID NO.
Descripción Nucleótidos correspondientes en SEQ ID NO. 1
26
E3gp19KDa Nucleótidos 28033 a 28563
27
E3 22,3KDa Nucleótidos 29350 a 29979
28
E331KDa Nucleótidos 29999 a 30907
29
E3 10,4KDa Nucleótidos 30916 a 31191
30
E3 15,2KDa Nucleótidos 31200 a 31643
31
E3 14,7KDa Nucleótidos 31636 a 32040
32
E4 Orf 6/7 Nucleótidos 34688 a 34861 y 33716 a 33965
33
E4 Orf 6 Nucleótidos 33965 a 34861
34
E4 Orf 4 Nucleótidos 34764 a 35132
35
E4 Orf 3 Nucleótidos 35141 a 35494
36
E4 Orf 2 Nucleótidos 35491 a 35880
37
E4 Orf 1 Nucleótidos 35930 a 36304
Los datos de la secuencia del genoma han confirmado estudios serológicos tempranos de que el AdY25 de simio está estrechamente relacionado con el adenovirus del grupo E humano, AdHu44 La alineación de las secuencias de aminoácidos de hexón y proteínas de fibra de diferentes serotipos adenovirales se han utilizado para crear los árboles filogenéticos en la Figura 1. Estos son los principales componentes de la cápside expuestos a la superficie y se cree que son los principales determinantes del tropismo vectorial. La alineación de secuencias genómicas completas de nucleótidos de diferentes especies de adenovirus se ha utilizado para crear el árbol filogenético en la Figura 2. El genoma y las proteínas de la fibra alinean AdY25 con los adenovirus del grupo E. Sin embargo, las proteínas hexón alinean AdY25 con los adenovirus del grupo D.
Simplemente para la conveniencia de los expertos en la técnica, se depositó una muestra de la cepa de E. coli DH10B que contiene cromosomas bacterianos artificiales (BAC) que contienen el genoma clonado del adenovirus Y25 del chimpancé (pBACe3.6 Y25, nombre de la línea celular "Y25") por Isis Innovation Limited el 24 de mayo de 2012 con la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC) en las Colecciones de Cultivos de la Agencia de Protección de la Salud, Agencia de Protección de la Salud, Porton Down, Salisbury SP4 0JG, Reino Unido en virtud del Tratado de Budapest y designada por la accesión provisional núm. 12052401.
La E. coli que contiene BAC es un organismo genéticamente modificado de clase I. El genotipo de la cepa DH10B de E. coli es: F-mcrA A(mrr-hsdRMS-mcrBC) 080dlacZAM15 AlacX74 endAl recA1 deoR A(ara, leu) 7697 araD139 galU GalK nupG rpsL A-. El adenovirus Y25 de chimpancé se clasifica provisionalmente dentro de la especie adenovirus E humano basado en la secuencia de nucleótidos de la ADN polimerasa viral.
El BAC se propaga dentro de la bacteria durante la replicación y puede mantenerse por selección con cloranfenicol. La cepa DH10B de E. coli que contiene el BAC en el que se clona el genoma se puede propagar en caldo Luria- Bertani o agar que contiene 12,5 pg/ml de cloranfenicol a 37°C.
La conversión de los clones de BAC de los genomas virales en virus ("rescate") se puede llevar a cabo mediante los siguientes pasos. El huésped de E. coli se propaga y el ADN de BAC se purifica de las bacterias de acuerdo con métodos estándar. El ADN se linealiza con la endonucleasa de restricción Pmel y se transfecta en cualquier línea celular que soporte el crecimiento de adenovirus humanos (p. ej. células A549). El adenovirus resultante puede luego propagarse y purificarse para usar como una vacuna, por ejemplo. Todos estos reactivos y células están a disposición del público. Si la deposición fuera rescatada, el virus resultante sería un adenovirus de tipo natural.
Además, simplemente para la conveniencia de los expertos en la técnica, una muestra de la cepa de E. coli DH10B que contiene cromosomas bacterianos artificiales (BAC) que contienen el genoma clonado del adenovirus Y25 del chimpancé con deleción de la región E1 (pBACe3.6 Y25delEl, nombre de la línea celular "Y25delE1") fue depositado por Isis Innovation Limited el 24 de mayo de 2012 con la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC) en la Agencia de Protección de la Salud, Colecciones de Cultivos, Agencia de Protección de la Salud, Porton Down, Salisbury SP4 0JG, Reino Unido bajo las regulaciones del Tratado de Budapest y designado por adhesión provisional no. 12052402.
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La E. coli que contiene BAC es un organismo genéticamente modificado de clase I. El genotipo de la cepa DH10B de E. coli es: F-mcrA A(mrr-hsdRMS-mcrBC) 080dlacZAM15 AlacX74 endAl recAl deoR A(ara, leu)7697 araD139 galU galK nupG rpsL A-. El adenovirus Y25 de chimpancé se clasifica provisionalmente dentro de la especie E de adenovirus humano basado en la secuencia de nucleótidos de la ADN polimerasa viral.
El BAC se propaga dentro de la bacteria durante la replicación y puede mantenerse por selección con cloranfenicol. La cepa DHlOB de E. coli que contiene los cromosomas artificiales bacterianos en los que se clonan los genomas se puede propagar en caldo Luria-Bertani o agar que contiene 12,5 pg/ml de cloranfenicol a 37°C.
La conversión de los clones de BAC de los genomas virales en virus ("rescate") se puede llevar a cabo mediante los siguientes pasos. El huésped de E. coli se propaga y el ADN de BAC se purifica de las bacterias de acuerdo con métodos estándar. El ADN se linealiza con la endonucleasa de restricción Pmel y se transfecta en células HEK293 (o una línea celular complementaria de E1 similar). El adenovirus resultante puede luego propagarse y purificarse para usarse como una vacuna, por ejemplo. Todos estos reactivos y células están a disposición del público. Si la deposición fuera rescatada, el virus resultante sería un organismo genéticamente modificado de clase I.
Con respecto a todos los estados designados a los que dicha acción es posible y en la medida en que sea legalmente permisible según la ley del estado designado, se solicita que una muestra del material depositado esté disponible solo mediante su emisión a un experto independiente, de conformidad con la legislación pertinente sobre patentes, p. ej. Regla 32 (1) EPC, Regla 13 (1) y Anexo 1 de las Reglas de Patentes del Reino Unido 2007, Regulación 3.25 (3) del Reglamento de Patentes de Australia y disposiciones generalmente similares mutatis mutandis para cualquier otro estado designado.
Una realización específica proporciona la secuencia genómica completa de un adenovirus de chimpancé al que se hace referencia en este documento como AdY25, en donde dicha secuencia genómica comprende o consiste en la secuencia genómica depositada en un BAC en la cepa DH10B de E. coli por Isis Innovation Limited el 24 de mayo de 2012 con la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC) en la Colección de Cultivos de la Agencia de Protección de la Salud, Agencia de Protección de la Salud, Porton Down, Salisbury SP4 0JG, Reino Unido en virtud del Tratado de Budapest y designada por la accesión provisional núm. 12052401, o la secuencia genómica depositada en un BAC en la cepa de E. coli DH10B por Isis Innovation Limited el 24 de mayo de 2012 con la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC) en las Colecciones de Cultivos de la Agencia de Protección de la Salud, Agencia de Protección de la Salud, Porton Down, Salisbury SP4 0JG, Reino Unido en virtud del Tratado de Budapest y designado por la adhesión provisional no. 12052402.
Los inventores han descubierto que los vectores virales basados en el AdY25 recientemente secuenciado pueden ser altamente efectivos. La presente invención proporciona, por lo tanto, un vector adenovírico que comprende una cápside, en el que dicha cápside comprende las proteínas de cápside del adenovirus AdY25 de chimpancé natural y encapsida una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos exógena de interés unida operativamente a secuencias control de la expresión que dirigen la traducción, transcripción y/o su expresión en una célula animal y una secuencia señal de empaquetamiento adenovírico,
en el que la secuencia de nucleótidos que codifica el adenovirus AdY25 de chimpancé de tipo natural es la SEQ ID NO: 1,
en el que dicho vector carece de un locus E1 funcional, y
en el que el vector comprende al menos un marco de lectura abierto de E4 heterólogo de otro serotipo adenovírico.
Como se usa en este documento, la frase "vector viral" se refiere a un virus recombinante o un derivado del mismo que es capaz de introducir material genético, incluyendo ADN recombinante, en una célula huésped u organismo huésped por medio de transducción o infección no productiva. Por ejemplo, el vector de la presente invención puede ser un vector de administración de genes, un vector de vacuna, un vector de administración antisentido o un vector de terapia génica.
Tal como se usa en la presente memoria, "AdY25" e "Y25" se refieren al adenovirus AdY25 de chimpancé o a vectores derivados del mismo o basados en el mismo. Los términos de abreviaturas se usan para indicar modificaciones hechas al virus de tipo natural. Por ejemplo, "AE1" o "delEl" indica la eliminación o la eliminación funcional del locus E1. La frase "Ad5E4Orf6" indica que el vector viral comprende el marco de lectura 6 abierto E4 heterólogo del virus Ad5.
El vector de la presente invención comprende una cápside derivada del adenovirus AdY25 de chimpancé, como se define por las reivindicaciones. La cápside comprende las proteínas de la cápside AdY25 naturales o de tipo natural, que incluyen proteínas pentónicas, proteínas hexónicas, proteínas de fibra y, opcionalmente proteínas estructurales. Sin embargo, los expertos en la materia apreciarán fácilmente que se pueden hacer pequeñas modificaciones a las proteínas de la cápside sin alterar negativamente el tropismo vectorial. En una realización particularmente preferida, la cápsida del vector comprende las proteínas de cápside:
(a) una proteína hexón que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 2;
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(b) una proteína pentón que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 3; y
(c) una proteína de fibra que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 4.
Cualquier experto en la materia apreciará que se describen también las variantes de esas secuencias de aminoácidos particulares que se ejemplifican en este documento. Particularmente preferidas son las variantes que tienen una secuencia de aminoácidos similar a la de la proteína original, en la que uno o más residuos de aminoácidos se sustituyen, eliminan o añaden en cualquier combinación. Son especialmente preferidas las sustituciones, adiciones y deleciones silenciosas, que no alteran las propiedades y actividades de la proteína de la presente invención. Diversos aminoácidos tienen propiedades similares, y uno o más de tales aminoácidos de una sustancia a menudo pueden estar sustituidos por uno o más de tales aminoácidos sin eliminar la actividad deseada de esa sustancia. Por lo tanto, los aminoácidos glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina a menudo se pueden sustituir entre sí (aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas). De estas posibles sustituciones, se prefiere que la glicina y la alanina se usen para sustituir a las demás (ya que tienen cadenas laterales relativamente cortas) y que la valina, la leucina y la isoleucina se usen para sustituir a las demás (ya que tienen cadenas laterales alifáticas más grandes que son hidrofóbicas). Otros aminoácidos que a menudo pueden sustituirse entre sí incluyen: fenilalanina, tirosina y triptófano (aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas); lisina, arginina e histidina (aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas); aspartato y glutamato (aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas); asparagina y glutamina (aminoácidos que tienen cadenas laterales de amida); y cisteína y metionina (aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre). Las variantes incluyen variantes naturales y artificiales. Se pueden generar variantes artificiales usando técnicas de mutagénesis, incluidas las aplicadas a moléculas de ácido nucleico, células u organismos. Preferiblemente, las variantes tienen una identidad sustancial con las secuencias de aminoácidos ejemplificadas en este documento.
Como se usa en este documento, las secuencias de aminoácidos que tienen "identidad sustancial" preferiblemente tienen al menos 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98,1%, 98,2 %, 98,3%, 98,4%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% o 99,9% de identidad con dichas secuencias. Deseablemente, la expresión "identidad sustancial" indica que dicha secuencia tiene un mayor grado de identidad con cualquiera de las secuencias descritas en este documento que con las secuencias de aminoácidos de la técnica anterior.
Se puede usar un programa tal como el programa CLUSTAL para comparar secuencias de aminoácidos. Este programa compara las secuencias de aminoácidos y encuentra la alineación óptima mediante la inserción de espacios en cualquier secuencia, según corresponda. Es posible calcular la identidad o similitud de aminoácidos (identidad más conservación del tipo de aminoácido) para una alineación óptima. Un programa como BLASTx alineará el tramo más largo de secuencias similares y asignará un valor al ajuste. De este modo, es posible obtener una comparación donde se encuentren varias regiones de similitud, cada una con una puntuación diferente. Lo anterior se aplica mutatis mutandis a todas las secuencias de aminoácidos descritas en la presente solicitud.
Preferiblemente, la proteína hexón comprende una secuencia de aminoácidos al menos 98,2% idéntica con respecto a SEQ ID NO. 2. Preferiblemente, la proteína pentón comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 98,3% idéntica con respecto a la SEQ ID NO. 3. Preferiblemente, la proteína de fibra comprende una secuencia de aminoácidos al menos 99,1% idéntica con respecto a SEQ ID NO. 4.
Las secuencias de nucleótidos para las proteínas de hexón, pentón y fibra de AdY25 se exponen en los nucleótidos 18302 a 21130 de la SEQ ID NO. 1 (proteína hexón), nucleótidos 13891 a 15486 de la SEQ ID NO. 1 (proteína pentón) y nucleótidos 32290 - 33621 de SEQ ID NO. 1 (proteína de fibra). La cápside del vector puede comprender una o más proteínas de la cápside AdY25 codificadas por estas secuencias de nucleótidos o secuencias sustancialmente idénticas a las mismas.
El vector de acuerdo con la presente invención comprende una de las proteínas de hexón, pentón y fibra como se define por las reivindicaciones.
El vector de la presente invención comprende una molécula de ácido nucleico como se define por las reivindicaciones. Como mínimo, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos exógena de interés, unida operativamente a secuencias de control de la expresión que dirigen la traducción, transcripción y/o expresión de las mismas en una célula animal y una secuencia señal de empaquetamiento adenovírico.
Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos exógena codifica una molécula de interés. La molécula de interés puede ser una molécula de proteína, polipéptido o ácido nucleico de interés. La secuencia de nucleótidos exógena puede codificar una o más, dos o más o tres o más moléculas de interés.
Las proteínas y polipéptidos de interés incluyen antígenos, adyuvantes moleculares, proteínas inmunoestimuladoras y recombinasas.
Preferiblemente, la proteína o polipéptido de interés es un antígeno. En una realización, el antígeno es un antígeno derivado de patógenos. Preferiblemente, el patógeno se selecciona del grupo que consiste en bacterias, virus, priones, hongos, protistas y helmintos. Preferiblemente, el antígeno se deriva del grupo que consiste en M.
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tuberculosis, Plasomodium sp, virus de la gripe, VIH, virus de la hepatitis C, citomegalovirus, virus del papiloma humano, parásitos de la malaria, parásitos de Leishmania o cualquier especie micobacteriana. Los antígenos preferidos incluyen TRAP, MSP-1, AMA-1 y CSP de Plasmodium, antígenos del virus de la gripe y antígenos ESAT6, TB10.4 85 A y 85B de Mycobacterium tuberculosis. Los antígenos particularmente preferidos incluyen Ag85A de Mycobacterium tuberculosis y nucleoproteína (NP) y proteína de matriz 1 (M1) del virus de influenza A, preferiblemente virus de Influenza A.
En una realización alternativa, el antígeno es un autoantígeno. Los autoantígenos adecuados incluyen antígenos expresados por células tumorales que permiten que el sistema inmune diferencie entre células tumorales y otros tipos de células. Los autoantígenos adecuados incluyen antígenos que son inapropiados para el tipo de célula y/o su entorno, o que solo están normalmente presentes durante el desarrollo de los organismos (por ejemplo, antígenos fetales). Por ejemplo, GD2 normalmente solo se expresa en un nivel significativo en las membranas de la superficie externa de las células neuronales, donde su exposición al sistema inmune está limitada por la barrera hematoencefálica. Sin embargo, GD2 se expresa en las superficies de una amplia gama de células tumorales, incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas, neuroblastoma, melanomas y osteosarcomas. Otros autoantígenos adecuados incluyen los receptores de superficie celular que se encuentran en las células tumorales pero que son raros o están ausentes en la superficie de las células sanas. Tales receptores pueden ser responsables de activar las vías de señalización celular que dan como resultado el crecimiento no regulado y la división de la célula tumoral. Por ejemplo, ErbB2 se produce a niveles anormalmente altos en la superficie de las células tumorales de cáncer de mama. Preferiblemente, el autoantígeno comprende un antígeno asociado a tumor (TAA).
Como se usa en este documento, el término "antígeno" abarca uno o más epítopos de un antígeno e incluye el antígeno original, y fragmentos y variantes del mismo. Estos fragmentos y variantes retienen esencialmente la misma actividad o función biológica que el antígeno original. Preferiblemente, retienen o mejoran la antigenicidad y/o inmunogenicidad del antígeno original. Generalmente, "antigénico" se entiende que significa que la proteína o polipéptido puede usarse para generar anticuerpos o células T o, de hecho, es capaz de inducir un anticuerpo o respuesta de células T en un sujeto. Se entiende que "inmunogénico" significa que la proteína o polipéptido es capaz de provocar una respuesta inmune potente, y preferiblemente protectora, en un sujeto. Por lo tanto, en el último caso, la proteína o polipéptido puede ser capaz de generar una respuesta de anticuerpos y una respuesta inmune no basada en anticuerpos.
Preferiblemente, los fragmentos de los antígenos comprenden al menos n aminoácidos consecutivos de la secuencia del antígeno original, en donde n es preferiblemente al menos, o más de, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 57, 58, 59, 60, 70, 80, 90 ó 100. Los fragmentos incluyen preferiblemente una o más regiones epitópicas del antígeno original. De hecho, el fragmento puede comprender o consistir en un epítopo del antígeno original. Alternativamente, el fragmento puede ser suficientemente similar a tales regiones para retener sus propiedades antigénicas/inmunogénicas.
Los antígenos de la presente descripción incluyen variantes tales como derivados, análogos, homólogos o equivalentes funcionales del antígeno original. Particularmente preferidos son los derivados, análogos, homólogos o equivalentes funcionales que tienen una secuencia de aminoácidos similar a la del antígeno original, en el que uno o más residuos de aminoácidos se sustituyen, eliminan o añaden en cualquier combinación. Preferiblemente, estas variantes retienen un determinante antigénico o epítopo en común con el antígeno original. Preferiblemente, los derivados, análogos, homólogos y equivalentes funcionales tienen una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos del antígeno original.
La secuencia de nucleótidos exógena puede codificar más de un antígeno. El vector viral puede diseñarse para expresar uno o más genes antigénicos como una cadena de epítopos. Preferiblemente, los epítopos en una cadena de múltiples epítopos están unidos entre sí sin secuencias intermedias, de modo que se evita el ácido nucleico y/o el material de aminoácidos innecesarios. La creación de la cadena de epítopos se logra preferiblemente usando una construcción de ADN recombinante que codifica la secuencia de aminoácidos de la cadena de epítopos, con el ADN que codifica uno o más epítopos en el mismo marco de lectura. Un antígeno ejemplar, TIPeGFP, comprende una cadena de epítopos que incluye los siguientes epítopos: E6FP, SIV-gag, PyCD4 y Py3. Alternativamente, los antígenos se pueden expresar como polipéptidos separados.
Uno o más de los antígenos o genes de antígenos pueden estar truncados en el extremo C y/o el extremo N- terminal. Esto puede facilitar la clonación y construcción de la vacuna vectorizada y/o potenciar la inmunogenicidad o antigenicidad del antígeno. Los métodos para el truncamiento serán conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se pueden usar diversas técnicas bien conocidas de ingeniería genética para eliminar selectivamente la secuencia de ácido nucleico que codifica en cualquier extremo del gen del antígeno, y luego insertar la secuencia codificante deseada en el vector viral. Por ejemplo, se crean truncamientos de la proteína candidata usando estrategias de exonucleasa 3' y/o 5' selectivamente para erosionar los extremos 3' y/o 5' del ácido nucleico codificante, respectivamente. Preferiblemente, la secuencia del gen de tipo natural se trunca de modo que el antígeno expresado se trunca por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20 o más aminoácidos con respecto al antígeno original. Preferiblemente, el gen del antígeno se trunca con 10-20
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aminoácidos en el extremo C con respecto al antígeno de tipo natural. Más preferiblemente, el gen del antígeno se trunca con 13 - 18 aminoácidos, lo más preferiblemente con 15 aminoácidos en el extremo C con respecto al antígeno de tipo natural. Preferiblemente, el antígeno Ag85A se trunca en el C-terminal de esta manera.
Uno o más de los genes de antígeno también pueden comprender una secuencia líder. La secuencia líder puede afectar al procesamiento del transcrito primario para ARNm, la eficacia de traducción, la estabilidad del ARNm, y puede potenciar la expresión y/o la inmunogenicidad del antígeno. Preferiblemente, la secuencia líder es el activador de plasminógeno tisular (tPA). Preferiblemente, la secuencia líder tPA se posiciona en el extremo N del uno o más antígenos.
La secuencia líder, tal como la secuencia de líderes tPA, puede estar unida a la secuencia del antígeno a través de un conector peptídico. Los enlazadores peptídicos generalmente tienen una longitud de 2 a aproximadamente 50 aminoácidos, y pueden tener cualquier secuencia, con la condición de que no formen una estructura secundaria que interfiera con el plegamiento de dominio de la proteína de fusión.
Uno o más de los genes de antígeno pueden comprender un marcador como el marcador de la proteína verde fluorescente (GFP) para facilitar la detección del producto expresado de la secuencia del gen insertado.
Uno o más de los genes de antígeno pueden comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido marcador que está unido covalentemente al antígeno tras la traducción. Preferiblemente, el polipéptido marcador se selecciona del grupo que consiste en un marcador PK, un marcador FLAG, un marcador MYC, un marcador de polihistidina o cualquier marcador que pueda detectarse mediante un anticuerpo monoclonal. La secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido marcador puede colocarse de manera que, después de la traducción, el marcador esté localizado en el extremo C o en el extremo N del antígeno expresado o pueda ser interno al antígeno expresado. Preferiblemente, el marcador está localizado en el extremo C del antígeno expresado. En una realización preferida, uno o más de los genes de antígeno codifican un marcador de PK. Un marcador de este tipo puede facilitar la detección de la expresión de antígeno y clones que expresan el antígeno, y/o potenciar la inmunogenicidad o antigenicidad del antígeno.
Si se usa un polipéptido marcador, los nucleótidos que codifican una secuencia enlazadora se insertan preferiblemente entre el ácido nucleico que codifica el polipéptido marcador y el ácido nucleico que codifica el antígeno expresado. Un enlazador ejemplar es IPNPLLGLD (SEQ ID NO. 49).
En una realización alternativa, la secuencia exógena de interés puede ser una codificación no proteica. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos exógena puede ser una secuencia de miARN o ARN inmunoestimuladora.
El vector adenovírico puede comprender una o más secuencias de nucleótidos exógenas, por ejemplo 1, 2 ó 3 o más secuencias de nucleótidos exógenas. Preferiblemente, cada secuencia de nucleótidos exógena incorpora un transgén. La secuencia de nucleótidos exógena que incorpora el transgén puede ser un gen o una parte funcional del gen. El vector adenovírico puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una única molécula de interés. Alternativamente, el vector adenovírico puede comprender una secuencia de nucleótidos o más de una secuencia de nucleótidos que codifica más de una molécula de interés.
Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos exógena se localiza en una molécula de ácido nucleico que contiene otras secuencias adenovirales. La secuencia de nucleótidos exógena puede insertarse en el sitio de un gen AdY25 parcial o totalmente eliminado, por ejemplo, en el sitio de una deleción de E1 o una deleción de E3. La secuencia de nucleótidos exógena puede insertarse en una región del gen AdY25 existente para interrumpir la función de esa región.
Alternativamente, la secuencia de nucleótidos exógena puede insertarse en una región del genoma de AdY25 sin alteración de la función o secuencia de los genes circundantes.
La secuencia de nucleótidos exógena o transgén está preferiblemente unida operativamente a las secuencias reguladoras necesarias para dirigir la traducción, transcripción y/o expresión de la secuencia de nucleótidos exógena/transgén en una célula hospedadora, por ejemplo, una célula de mamífero. Como se usa en el presente documento, la frase "unida operativamente" significa que las secuencias reguladoras son contiguas a las secuencias de ácido nucleico que regulan o que dichas secuencias reguladoras actúan en trans, o a distancia, para controlar la secuencia de ácido nucleico regulada. Dichas secuencias reguladoras incluyen secuencias de control de expresión apropiadas tales como secuencias de iniciación de la transcripción, terminación, potenciadoras y promotoras, señales de procesamiento de ARN eficaces, tales como señales de empalme y poliadenilación, secuencias que mejoran la eficacia de traducción y la estabilidad de proteínas y las secuencias que promueven la secreción de proteínas. Adicionalmente, pueden contener secuencias para la represión de la expresión transgénica, por ejemplo durante la producción en la expresión de líneas celulares de un receptor transactivador. Los promotores y otras secuencias reguladoras que controlan la expresión de un ácido nucleico se han identificado y se conocen en la técnica. Preferiblemente, el promotor se selecciona del grupo que consiste en promotores CMV humanos, promotores CMV simios, promotores CMV murinos, ubiquitina, el promotor EF1, promotor EF1 de rana, actina y otros promotores de mamífero. Los más preferidos son los promotores de CMV humanos y, en particular, el principal promotor temprano inmediato de CMV humano.
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La secuencia o secuencias de nucleótidos exógenas de interés se pueden introducir en el vector viral como parte de un casete. Como se usa en el presente documento, el término "casete" se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende al menos una secuencia de nucleótidos para expresarse, junto con sus secuencias de control transcripcional y traduccional, para permitir la expresión de la secuencia o secuencias de nucleótidos en una célula huésped, y opcionalmente sitios de restricción en los extremos 5' y 3' del casete. Debido a los sitios de endonucleasas de restricción, los casetes pueden insertarse, eliminarse o reemplazarse fácilmente con otro casete. Cambiar el casete dará como resultado la expresión de secuencias diferentes por el vector en el que se incorpora el casete. Alternativamente, cualquier método conocido por los expertos en la técnica podría usarse para construir, modificar o derivar dicho casete, por ejemplo, mutagénesis por PCR, In-Fusion®, recombinación, clonación Gateway®, recombinación específica de sitio o clonación de topoisomerasa.
Las secuencias de control de la expresión preferiblemente incluyen los elementos de adenovirus necesarios para la replicación y la encapsidación del virión. Preferiblemente, los elementos flanquean la secuencia de nucleótidos exógena. Preferiblemente, el vector Y25 comprende las secuencias 5' de repetición terminal invertida (ITR) de Y25, que funcionan como orígenes de replicación, y las secuencias 3' ITR.
La secuencia señal de empaquetado funciona para dirigir el ensamblaje del vector viral.
Como apreciará cualquier experto en la técnica, existen limitaciones mínimas y máximas sobre la longitud de la molécula de ácido nucleico que puede encapsularse en el vector viral. Por lo tanto, si es necesario, la molécula de ácido nucleico también puede comprender "relleno", es decir, secuencia de nucleótidos adicional para llevar el genoma final del vector hasta el tamaño requerido. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico comprende suficiente "relleno" para asegurar que la molécula de ácido nucleico sea de aproximadamente 80% a aproximadamente 108% de la longitud de la molécula de ácido nucleico natural.
La molécula de ácido nucleico también puede comprender uno o más genes o loci del genoma de AdY25. El genotipo AdY25 de tipo natural comprende 4 unidades de transcripción temprana (E1, E2, E3 y E4), que tienen principalmente funciones reguladoras y preparan la célula huésped para la replicación viral. El genoma también comprende 5 unidades transcripcionales tardías (L1, L2, L3, L4 y L5), que codifican proteínas estructurales que incluyen el pentón (L2), el hexón (L3), la proteína estructural (L4) y la proteína de fibra (L5), que están bajo el control de un único promotor. Cada extremidad del genoma comprende una repetición terminal invertida (ITR) que es necesaria para la replicación viral. El vector viral de la presente invención puede comprender el genoma AdY25 nativo completo, en el que se ha insertado la secuencia de nucleótidos exógena. Sin embargo, cualquier experto en la técnica apreciará que son posibles diversas modificaciones en el genoma de AdY25 nativo y que, de hecho, son deseables, cuando se crea un vector viral.
Uno o más genes AdY25 nativos pueden eliminarse, eliminarse funcionalmente o modificarse para optimizar el vector viral. Como se usa en este documento, la frase "delecionado" se refiere a la deleción total de un gen, mientras que "deleción funcional" se refiere a una deleción parcial de un gen/locus, o alguna otra modificación tal como una mutación de cambio de marco, que destruye la capacidad del adenovirus para expresar el gen/locus o hace que el producto del gen no sea funcional. El genoma de AdY25 puede modificarse para aumentar la capacidad de inserción o dificultar la replicación en células hospedadoras y/o aumentar el crecimiento y el rendimiento del vector viral en líneas celulares de empaquetamiento transformadas. Cualquier experto en la técnica apreciará que cualquier número de genes tempranos o tardíos puede eliminarse funcionalmente. La replicación de dichos vectores virales modificados seguirá siendo posible en las líneas celulares transformadas que comprenden un complemento de los genes delecionados. Por ejemplo, las proteínas virales necesarias para la replicación y el ensamblaje pueden proporcionarse en trans mediante líneas celulares de empaquetamiento modificadas o mediante un virus auxiliar.
Por lo tanto, además de la secuencia de nucleótidos exógena, el vector de la presente invención puede comprender las secuencias adenovirales mínimas, el genoma adenoviral con una o más deleciones o deleciones funcionales de genes particulares, o el genoma adenoviral nativo completo, en el que se ha insertado la secuencia de nucleótidos exógena.
Preferiblemente, el vector de la presente invención comprende las unidades transcripcionales tardías Y25 nativas (L1 - L5) y/o las repeticiones terminales invertidas Y25 (ITR) nativas o secuencias sustancialmente idénticas a las mismas. Las secuencias de aminoácidos de los loci L1, L2, L3, L4, L5 nativos y las secuencias nucleicas correspondientes se exponen en la Tabla 1 anterior.
Preferiblemente, una o más de las primeras unidades de transcripción se modifican, se eliminan o se eliminan funcionalmente.
En una realización, el vector viral no está replicando o está dañado para la replicación. Como se usa en el presente documento, la expresión "no replicante" o "alterado para la replicación" significa que no es capaz de replicarse en una extensión significativa en la mayoría de las células de mamífero normales, preferiblemente células humanas normales. Se prefiere que el vector viral sea incapaz de causar una infección o enfermedad productiva en el paciente humano. Sin embargo, el vector viral es preferiblemente capaz de estimular una respuesta inmune. Los virus que no se replican o que están alterados para la replicación pueden volverse así naturales, es decir, se pueden
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aislar como tales de la naturaleza. Alternativamente, los virus pueden hacerse no replicantes o estar alterados para la replicación artificialmente, p. ej. por reproducción in vitro o por manipulación genética. Por ejemplo, un gen que es crítico para la replicación puede ser funcionalmente eliminado. Preferiblemente, la replicación del vector adenovírico se vuelve incompetente por deleción funcional de una única unidad de transcripción que es esencial para la replicación viral. De acuerdo con la invención, el vector carece de un locus E1 funcional. El gen/locus E1 puede ser reemplazado por un transgén heterólogo, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos o casete de expresión que codifica una proteína o polipéptido de interés.
La secuencia de aminoácidos de AdY25 E1 tipo natural, y la secuencia de ácido nucleico correspondiente, se exponen en la Tabla 1 anterior.
Como se analiza en este documento, el adenovirus recombinante puede crearse generando un clon molecular de AdY25 en un Cromosoma Artificial Bacteriano (BAC), y el locus E1 se elimina preferiblemente incluyendo un flanco de homología extra aguas abajo de la región E1 del adenovirus para permitir la eliminación simultánea de E1 durante la recombinación homóloga entre el ADN viral AdY25 y un "vector de rescate" linealizado de BAC, como se describe en el Ejemplo 1.
Preferiblemente, el vector viral de acuerdo con la presente invención comprende uno o más sitios de recombinación para permitir la inserción de uno o más transgenes o casetes que comprenden la secuencia de nucleótidos exógena. Preferiblemente, los sitios de recombinación comprenden sitios de recombinación específicos del sitio del fago lambda. Estos sitios de recombinación pueden introducirse en cualquier locus adecuado, pero preferiblemente se introducen en el locus Ad E1. De este modo, el vector no replicante o alterado para la replicación puede prepararse reemplazando el gen E1 con una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína o el polipéptido de interés. Preferiblemente, los sitios de recombinación attR1 y attR2 se introducen en el locus Ad E1 como parte de un casete de destino Invitrogen Gateway®, como se describe en el Ejemplo 1.
Preferiblemente, el vector carece de un gen/locus E3 de adenovirus. La eliminación de la región E3 del adenovirus aumenta la capacidad de inserción del nuevo vector en aproximadamente 5 kb. La eliminación de E3 tiene pocas consecuencias para el rendimiento del vector viral ya que esta región no es necesaria para la replicación del virus y, por lo tanto, no es necesario proporcionarla en trans en la línea celular de empaquetamiento. El locus E3 puede eliminarse usando la recombinación de GalK, como se describe en el Ejemplo 2.
La secuencia de aminoácidos de AdY25 E3 de tipo natural y la correspondiente secuencia de ácidos nucleicos, se exponen en la Tabla 1 anterior.
En una realización particularmente preferida de la presente invención, tanto los loci de E1 como los de E3 se eliminan del genoma de AdY25.
Preferiblemente, el vector de la presente invención comprende el locus E2 nativo. E2 es una unidad transcripcional que comprende los marcos de lectura abiertos que codifican las proteínas de la polimerasa, PTP e IVa2. La secuencia de aminoácidos AdY25 E4 de tipo natural, y la secuencia de nucleótidos correspondiente, se exponen en la Tabla 1 anterior. Preferiblemente, el vector de la presente invención comprende una secuencia de nucleótidos que codifica E2 o una secuencia sustancialmente idéntica a la misma.
Como se indicó anteriormente, los vectores virales de la presente invención se pueden producir en líneas celulares modificadas genéticamente que contienen un complemento de cualquier gen delecionado requerido para la replicación viral. Sin embargo, la replicación de vectores virales según la presente invención puede ser subóptima en células diseñadas para facilitar la replicación de otros serotipos. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 3A, se encontró que la primera generación de vectores basados en AdY25 que comprende el locus E4 de tipo natural crecía ineficientemente en células HEK293 y el rendimiento era aproximadamente dos logs inferior que para los vectores comparables basados en AdHu5. Se tiene la hipótesis de que el bajo rendimiento resultaba de la interacción subóptima entre las proteínas E1 expresadas en células (diseñadas para soportar la propagación del virus AdHu5) y los productos del gen E4 codificado por el vector. Por lo tanto, los vectores adenovirales de acuerdo con la presente invención comprenden preferible y adicionalmente una o más modificaciones diseñadas para optimizar el crecimiento y el rendimiento del vector en líneas celulares transformadas, tales como HEK293, que expresan los genes funcionalmente delecionados en el vector adenovírico de acuerdo con la presente invención.
De acuerdo con la invención, el vector comprende al menos un marco de lectura abierto de E4 heterólogo de otro serotipo adenovírico.
En una realización, la región E4 nativa puede reemplazarse en su totalidad con una región E4 heteróloga de otro serotipo(s), región heteróloga E4 que preferiblemente aumenta el rendimiento y el crecimiento del vector en una línea celular transformada. Por ejemplo, la región E4 nativa puede reemplazarse con la región E4 de AdHu5 para aumentar el rendimiento y el crecimiento de vector en HEK293.
La región del adenovirus E4 comprende al menos 6 marcos de lectura abiertos (ORFs u Orfs). Por lo tanto, en una realización alternativa, uno o más de los ORF en la región E4 pueden reemplazarse con uno o más ORF heterólogos de la región E4 de otro serotipo(s) adenovírico(s), cuyo ORF(s) heterólogo(s) aumenta(n) preferentemente el
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rendimiento y crecimiento en una línea celular transformada. Preferiblemente, 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 ORF en la región E4 pueden reemplazarse 1,2, 3, 4, 5 ó 6 ORF heterólogos de la región E4 de otro serotipo(s), p.ej. AdHu5.
De particular importancia para la replicación viral en células HEK293 es el producto génico de E4Orf6, una proteína multifuncional implicada en el corte y empalme de ARNm viral tardío y la exportación selectiva del ARNm viral, síntesis de ADN vírico e inhibición de la apoptosis. Se cree que la interacción subóptima entre E4Orf6 y E1B-55K expresada en células reduce el rendimiento de vectores AdChOX1 en células HEK293. Por lo tanto, la región E4Orf6 nativa puede reemplazarse por una región E4Orf6 heteróloga. Por ejemplo, el locus E4 nativo completo puede reemplazarse por el gen E4Orf6 de AdHu5, como se describe en el Ejemplo 3. La secuencia de aminoácidos de E4Orf6 de AdHu5 se encuentra en la SEQ ID NO. 40. Se encuentra una secuencia de nucleótidos correspondiente en los nucleótidos 28248 a 29132 de SEQ ID NO. 38. En una realización, el vector de la presente invención comprende la secuencia de nucleótidos de AdHu5E4Orf6 o una secuencia sustancialmente idéntica a la misma. Como se describe en el Ejemplo 3 y se muestra en la Figura 3A, se encontró que esta modificación mejora el rendimiento viral y el crecimiento.
En una realización preferida, más de un ORF en la región E4 se reemplaza con más de un ORF heterólogo de la región E4 de otro(s) serotipo(s). Por ejemplo, los E4Orf4, E4Orf6 y E4Orf7 nativos pueden reemplazarse con las regiones de codificación E4Orf4, E4Orf6 y E4Orf6/7 de AdHu5. En una realización particularmente preferida, la región E4 recombinante comprende las regiones codificantes E4Orf1, E4Orf2 y E4Orf3 de AdY25 y las regiones codificantes E4Orf4, E4Orf6 y E4Orf6/7 de AdHu5. La secuencia de aminoácidos de E4Orf4 de AdHu5 se encuentra en SEQ ID NO. 41. Se encuentra una secuencia de nucleótidos correspondiente en los nucleótidos 29053 a 29397 de la SEQ ID NO. 38. La secuencia de aminoácidos del E4Orf6 de AdHu5 se encuentra en la SEQ ID NO. 40. Se encuentra una secuencia de nucleótidos correspondiente en los nucleótidos 28248 a 29132 de SEQ ID NO. 38. La secuencia de aminoácidos del E4Orf6/7 de AdHu5 se encuentra en la SEQ ID NO. 39. Se encuentra una secuencia de nucleótidos correspondiente en los nucleótidos 28959 a 29132 y 27969 a 28247 de la SEQ ID NO. 38. En una realización, el vector de la presente invención comprende las secuencias de nucleótidos de AdHu5 E4Orf4, E4Orf6 y E4Orf6/7 o secuencias sustancialmente idénticas a la misma.
En una realización particularmente preferida de la presente invención, el genoma del vector viral de acuerdo con la presente invención carece de las secuencias de nucleótidos que codifican las regiones de adenovirus E1 y E3, y tiene el locus E4 nativo reemplazado con las regiones de codificación E4Orf4, E4Orf6 y E4Orf6/7 de AdHu5, y las regiones de codificación E4Orf1, E4Orf2 y E4Orf3 de AdY25. Esta realización particularmente preferida se denomina en este documento indistintamente como "ChAdOX1" o "AdChOX1". Como se describe en el Ejemplo 3, y se muestra en la Figura 3A, se encontró sorprendentemente que la modificación del vector de este modo aumenta la tasa de producción de hexón y el crecimiento y la replicación del virus.
Una secuencia de nucleótidos ejemplar que codifica ChAdOX1 se expone en SEQ ID NO. 38. En esta realización, se eliminan E1A, E1B de 19 kDa y E1B de 55 kDa y se reemplazan con un casete de destino Gateway® (nucleótidos 592 a 2550 de SEQ ID NO. 38). E3 CR1a1, E3 gp19kDa, E3 22,3 kDa, E3 31 kDa, E3 10,4 kDa, E3 15,2 kDa y E3 14,7 kDa se eliminan y reemplazan con un sitio Pac1 (nucleótidos 26286 a 26293 de la SEQ ID NO 38). La región E4 nativa se elimina y se reemplaza con las regiones codificantes E4Orf4, E4Orf6 y E4Orf6/7 de AdHu5, y las regiones codificantes E4Orf1, E4Orf2 y E4Orf3 de AdY25, como se describió anteriormente. El vector viral codificado por SEQ ID NO. 38 también comprende varias proteínas AdY25 de tipo natural, cuyas secuencias de nucleótidos se exponen a continuación en la Tabla 2:
Tabla 2
Proteína
Nucleótidos correspondientes en SEQ ID NO. 38
pIX
2638 a 3066
IVa2
4734 a 4749 y 3125 a 4458
Polimerasa
12985 a 12993 y 4228 a 7809
pTP
12985 a 12993 y 7610 a 9539
52/55kD
9974 a 11164
IIIa
11188 a 12954
Pentón
13038 a 14633
VII
14640 a 15221
V
15266 a 16288
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Proteína
Nucleótidos correspondientes en SEQ ID NO. 38
Mu
16308 a 16541
VI
16617 a 17348
Hexón
17449 a 20277
Endoproteasa
20293 a 20922
Proteína de union de ADN
20999 a 22537
100kDa
22566 a 24974
22K
24691 a 25245
33K
24691 a 25018, 25188..25519
VIII
25602 a 26285
Fibra
26543 a 27874
E4Orf3
29406 a 29759
E4Orf2
29756 a 30145
E4Orf1
30195 a 30569
Preferiblemente, el genoma del vector viral descrito en este documento comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO. 38 o una secuencia sustancialmente idéntica a la misma, en la que se inserta la secuencia de nucleótidos exógena que codifica la proteína de interés.
Como se describe en el Ejemplo 5 y se muestra en la Figura 5, se encontró que la modificación de la región E4 tiene poco impacto sobre la inmunogenicidad del vector viral, pero mejora la tasa de crecimiento y replicación viral. Por lo tanto, tales modificaciones de E4 pueden usarse para mejorar la velocidad de producción de los vectores virales, pero no tendrán un impacto negativo sobre la inmunogenicidad de los vectores.
El Ejemplo 4 y la Figura 4 demuestran que las respuestas inmunes provocadas por el vector ChAdOX1 basado en AdY25 son robustas y comparables a las provocadas por AdCh63 (también conocido como ChAd63) y AdCh68 (también conocido como AdC68, ChAd68, C9 o SAdV-25). Sin embargo, se encontró que la inmunogenicidad humoral de ChAdOX1 era superior a la de AdCh68, como se describe en el Ejemplo 7 y la Figura 7. Cualquier experto en la materia esperaría que las respuestas de las células T y las respuestas de los anticuerpos se correlacionen completamente entre sí. La superioridad de las respuestas humorales frente a ChAdOX1 es, por lo tanto, sorprendente.
También se encontró sorprendentemente que la prevalencia de anticuerpos neutralizantes de vectores en sueros humanos del Reino Unido y Gambia era mucho más baja para los vectores basados en AdY25 que para otro vector adenovírico de chimpancé, AdCh63 (véanse el Ejemplo 6 y la Figura 6). Estos datos sugieren que los vectores basados en AdY25 pueden encontrar menos inmunidad preexistente dentro de la población humana, no solo en comparación con vectores basados en adenovirus humanos, sino también en comparación con otros vectores existentes basados en adenovirus de chimpancé.
El Ejemplo 8 y las Figuras 8A y 8B demuestran que ChAdOX1 es capaz de inducir respuestas inmunes contra Mycobacterium tuberculosis, mientras que el Ejemplo 9 y la Figura 9 demuestran que ChAdOX1 es capaz de inducir respuestas inmunitarias contra Influenza A.
Un tercer aspecto de la presente invención proporciona una composición farmacéutica o inmunogénica que comprende el vector viral de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención opcionalmente en combinación con uno o más ingredientes activos adicionales, un vehículo, diluyente, excipiente o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
Preferiblemente, la composición es una composición inmunogénica y/o antigénica. Las composiciones inmunogénicas y/o antigénicas, según la presente invención, pueden ser profilácticas (para prevenir la infección), posteriores a la exposición (para tratar después de la infección pero antes de la enfermedad) o terapéuticas (para tratar la enfermedad). Preferiblemente, la composición es profiláctica o posterior a la exposición. Preferiblemente, la composición es una vacuna.
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Cuando la composición inmunogénica es para uso profiláctico, el sujeto es preferiblemente un bebé, un niño pequeño, un niño mayor o un adolescente. Cuando la composición inmunogénica es para uso terapéutico, el sujeto es preferiblemente un adulto.
La composición puede comprender uno o más agentes activos adicionales, tales como un agente antiinflamatorio (por ejemplo, un inhibidor de p38, antagonista del receptor de glutamato o un antagonista de canales de calcio), antagonista del receptor de AMPA, un agente quimioterapéutico y/o un agente antiproliferativo. La composición también puede comprender uno o más compuestos antimicrobianos. Los ejemplos de compuestos antimicrobianos adecuados incluyen agentes quimioterapéuticos antituberculosos, tales como rifampicina, isoniazida, etambutol y pirizaninamida.
Los vehículos y/o diluyentes adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen almidón de calidad farmacéutica, manitol, lactosa, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sacarosa (u otro azúcar), carbonato de magnesio, gelatina, aceite, alcohol, detergentes, emulsionantes o agua (preferiblemente estéril). La composición puede ser una preparación mixta de una composición o puede ser una preparación combinada para uso simultáneo, separado o secuencial (incluida la administración).
Los adyuvantes adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen adyuvante de Freund incompleto, adyuvante de Freund completo, adyuvante de Freund con MDP (muramildipéptido), alumbre (hidróxido de aluminio), alumbre más Bordatella pertussis y complejos inmunoestimuladores (ISCOM, típicamente una matriz de Quil A que contiene proteínas virales).
La composición, según la invención, para uso en las indicaciones mencionadas anteriormente puede administrarse por cualquier método conveniente, por ejemplo, por administración oral (incluso por inhalación), parenteral, mucosal (p. ej., bucal, sublingual, nasal), rectal o transdérmica y las composiciones adaptadas en consecuencia.
Para la administración oral, la composición se puede formular como líquidos o sólidos, por ejemplo, soluciones, jarabes, suspensiones o emulsiones, tabletas, cápsulas y pastillas.
Una formulación líquida consistirá generalmente en una suspensión o solución del compuesto o sal fisiológicamente aceptable en un vehículo o vehículos líquidos acuosos o no acuosos adecuados, por ejemplo, agua, etanol, glicerol, polietilenglicol o aceite. La formulación también puede contener un agente de suspensión, conservante, aromatizante o colorante.
Se puede preparar una composición en forma de tableta usando cualquier vehículo o vehículos farmacéuticos adecuados rutinariamente usados para preparar formulaciones sólidas. Los ejemplos de tales vehículos incluyen estearato de magnesio, almidón, lactosa, sacarosa y celulosa microcristalina.
Se puede preparar una composición en forma de cápsula usando procedimientos de encapsulación de rutina. Por ejemplo, se pueden preparar polvos, gránulos o peletes que contienen el ingrediente activo usando vehículos estándar y luego introducirse en una cápsula de gelatina dura; alternativamente, se puede preparar una dispersión o suspensión usando cualquier vehículo o vehículos farmacéuticos adecuados, por ejemplo, gomas acuosas, celulosas, silicatos o aceites y luego la dispersión o suspensión se introduce en una cápsula de gelatina blanda.
Las composiciones para administración oral pueden diseñarse para proteger el ingrediente activo frente a la degradación a medida que pasa a través del tracto alimentario, por ejemplo, mediante un recubrimiento externo de la formulación en una tableta o cápsula.
Las composiciones parenterales típicas consisten en una solución o suspensión del compuesto o sal fisiológicamente aceptable en un vehículo acuoso o no acuoso estéril o aceite parenteralmente aceptable, por ejemplo, polietilenglicol, polivinilpirrolidona, lecitina, aceite de cacahuete o aceite de sésamo. Alternativamente, la solución puede liofilizarse y luego reconstituirse con un disolvente adecuado justo antes de la administración.
Las composiciones para la administración nasal u oral pueden formularse convenientemente como aerosoles, gotas, geles y polvos. Las formulaciones en aerosol comprenden típicamente una solución o suspensión fina de la sustancia activa en un disolvente acuoso o no acuoso fisiológicamente aceptable y se presentan generalmente en cantidades únicas o multidosis en forma estéril en un recipiente sellado, que puede tomar la forma de un cartucho o relleno para usar con un dispositivo atomizador. Alternativamente, el recipiente sellado puede ser un dispositivo dispensador unitario tal como un inhalador nasal de dosis única o un dispensador de aerosol equipado con una válvula dosificadora, que está destinado a su eliminación una vez que se ha agotado el contenido del recipiente. Cuando la forma de dosificación comprende un dispensador de aerosol, contendrá un propelente farmacéuticamente aceptable. Las formas de dosificación en aerosol también pueden tomar la forma de un atomizador de bomba.
Las composiciones adecuadas para la administración bucal o sublingual incluyen tabletas, comprimidos y pastillas, en las que el ingrediente activo se formula con un vehículo tal como azúcar y goma arábiga, tragacanto o gelatina y glicerina.
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Las composiciones para la administración rectal o vaginal se encuentran convenientemente en forma de supositorios (que contienen una base de supositorio convencional tal como manteca de cacao), pesarios, tabletas vaginales, espumas o enemas.
Las composiciones adecuadas para la administración transdérmica incluyen ungüentos, geles, parches e inyecciones que incluyen inyecciones de polvos.
Convenientemente, la composición está en forma de dosis unitaria tal como una tableta, cápsula o ampolla.
La composición farmacéutica es preferiblemente estéril. Está preferiblemente libre de pirógenos. Es preferiblemente tamponada, p. ej. a pH entre 6 y 8, generalmente alrededor de pH 7. Preferiblemente, la composición es sustancialmente isotónica con seres humanos.
Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas de la presente invención administran una cantidad inmunogénica o farmacéuticamente eficaz del vector viral a un paciente. Como se usa en la presente memoria, "cantidad inmunogénicamente o farmacéuticamente eficaz" significa que la administración de esa cantidad a un individuo, ya sea como una dosis única o como una serie de dosis, es efectiva para la prevención o el tratamiento de una enfermedad o afección. En particular, esta frase significa que se administra una cantidad suficiente del vector viral al paciente durante un intervalo de tiempo adecuado de modo que una cantidad suficiente del antígeno sea producida por las células del paciente para estimular una respuesta inmune que sea eficaz para la prevención o el tratamiento de una enfermedad o condición. Esta cantidad varía según la salud y la condición física del individuo a tratar, la edad, la capacidad del sistema inmune del individuo, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la evaluación del médico de la situación médica y otros factores relevantes.
En general, una dosis farmacéuticamente efectiva comprende de 1 x 107 a 1 x 1012 partículas virales, preferiblemente de 1 x 1010 a 1 x 1011 partículas.
La composición inmunogénica de la presente invención también puede comprender uno o más vectores víricos diferentes, preferiblemente otros vectores adenovirales.
Un tercer aspecto de la presente invención proporciona el uso del vector viral según el primer aspecto de la presente invención o la composición inmunogénica de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención. En particular, el tercer aspecto proporciona el vector viral o la composición inmunogénica de la presente invención para su uso en medicina.
Este aspecto también proporciona: i) el vector viral o la composición inmunogénica de acuerdo con la presente invención para su uso en medicina e ii) el vector viral o la composición inmunogénica de acuerdo con la presente invención para su uso en terapia génica o para su uso en la prevención o tratamiento de al menos una infección, como se define en las reivindicaciones. Algunos usos médicos a modo de ejemplo se describen con más detalle a continuación.
En una realización, el vector viral de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención o la composición inmunogénica de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención se pueden usar para administrar un transgén en una célula huésped.
Este método preferiblemente comprende la etapa de administrar a dicha célula huésped un vector viral de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención o la composición inmunogénica de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención.
Preferiblemente, la célula huésped es una célula animal, más preferiblemente una célula de mamífero. Los mamíferos preferidos incluyen pollos, otras aves de corral, vacas, ovejas, cabras, cerdos, jabalíes, búfalos, bisontes, caballos, camélidos, ciervos, elefantes, tejones, zarigüeyas, gatos, leones, monos y humanos. Preferiblemente, la célula huésped es una célula somática. La célula huésped puede seleccionarse del grupo que consiste en una célula dendrítica presentadora de antígeno, célula de Langerhans, macrófago, célula B, linfocito, leucocito, miocito y fibroblastos.
Este método puede llevarse a cabo in vitro o in vivo. Cuando el método se lleva a cabo in vitro, el vector viral o composición inmunogénica se pone en contacto con la célula huésped en condiciones adecuadas tales que se facilita la transducción o infección no productiva de la célula huésped con el vector viral. En esta realización, la célula huésped puede comprender una célula huésped aislada o una muestra de un sujeto animal. Cuando el método se lleva a cabo in vivo, el vector viral o la composición inmunogénica se administra preferiblemente al sujeto animal de manera que se facilita la transducción de una o más células del sujeto con el vector viral. Preferiblemente, el vector viral o composición inmunogénica se administra al sujeto mediante administración oral (incluso por inhalación), parenteral, mucosal (por ejemplo, bucal, sublingual, nasal), rectal o transdérmica.
Preferiblemente, la transducción de la célula huésped con el vector viral de la presente invención da como resultado el suministro estable de la secuencia de nucleótidos exógena de interés en la célula huésped.
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Por lo tanto, en otra realización, el vector viral de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención o la composición inmunogénica de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención se pueden usar para provocar una respuesta inmune en un animal. Este método preferiblemente comprende la etapa de administrar a dicho animal un vector viral de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención o la composición inmunogénica de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención.
Cuando la proteína o el polipéptido de interés es un antígeno, la expresión de la proteína o el polipéptido en un animal dará como resultado la obtención de una respuesta inmune primaria a ese antígeno, lo que conducirá al desarrollo de una memoria inmunológica que proporcionará una respuesta mejorada en el evento de un encuentro secundario, por ejemplo, tras la infección por el patógeno del que se deriva el antígeno.
Preferiblemente, el animal es un animal sin tratamiento previo, es decir, un animal que no ha sido previamente expuesto al patógeno o a los antígenos en cuestión.
Además de provocar una respuesta inmune en un animal, el vector viral de la presente invención o la composición inmunogénica del mismo se pueden usar para estimular la respuesta inmune de un animal previamente expuesto al antígeno.
Por lo tanto, en una realización adicional, el vector viral de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención o la composición inmunogénica de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención se pueden usar para estimular una respuesta inmune en un animal. Este método preferiblemente comprende la etapa de administrar a dicho animal un vector viral de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención o la composición inmunogénica de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención.
Preferiblemente, el sujeto animal ha sido expuesto previamente al antígeno en cuestión, o "cebado". Por ejemplo, el sujeto puede haberse inoculado o vacunado previamente con una composición que comprende el antígeno, o puede haberse infectado previamente con el patógeno del que se deriva el antígeno. El sujeto puede estar latentemente infectado con el patógeno del que se deriva el antígeno.
En otra realización, el vector de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención o la composición inmunogénica de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención se pueden usar para tratar o prevenir al menos una enfermedad en un paciente. Este método preferiblemente comprende la etapa de administrar a dicho paciente un vector viral de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención o la composición inmunogénica de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención.
Preferiblemente, la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en tuberculosis y otras infecciones por micobacterias, malaria, gripe, VIH/SIDA, hepatitis C, infección por citomegalovirus, infección por virus del papiloma humano, infección por adenovirus, leishmaniasis, infección por estreptococo spp., estafilococo spp., meningococo spp., fiebre del valle del rift, fiebre aftosa e infección por el virus chikungunya.
Además de inducir una respuesta inmune contra el organismo patógeno del que se deriva el antígeno heterólogo, el vector adenovírico de la presente invención también puede inducir una respuesta inmune contra el adenovirus del que se deriva el vector viral. Como tal, se puede provocar una respuesta inmune contra AdY25. La respuesta inmune inducida contra AdY25 también puede ser de reactividad cruzada con otros serotipos adenovirales y, como tal, puede provocarse una respuesta inmune contra más de un adenovirus. El vector viral de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención o la composición inmunogénica de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención también pueden usarse, por lo tanto, para tratar o prevenir una enfermedad adenoviral.
Por lo tanto, también se describe el tratamiento o la prevención de al menos una enfermedad adenoviral y al menos una enfermedad no adenoviral en un paciente.
En una realización adicional, el vector viral según el primer aspecto de la presente invención o la composición inmunogénica según el segundo aspecto de la presente invención se pueden usar para inducir una respuesta inmune en un animal que romperá la tolerancia a un autoantígeno. Este método preferiblemente comprende la etapa de administrar a dicho animal un vector viral de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención o la composición inmunogénica de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención.
Muchas células tumorales son toleradas por el sistema inmune del paciente, basándose en que las células tumorales son esencialmente las propias células del paciente que crecen, se dividen y se diseminan sin un control reglamentario adecuado. Por lo tanto, los tumores cancerosos pueden crecer sin control dentro del cuerpo del paciente. Sin embargo, el vector viral de la presente invención puede usarse para estimular el sistema inmune de un paciente para atacar las células tumorales en un proceso conocido como "inmunoterapia contra el cáncer". Específicamente, el vector de la presente invención se puede usar para "entrenar" el sistema inmune del paciente para reconocer las células tumorales como dianas a destruir. Esto se puede lograr incluyendo dentro del vector viral una secuencia de nucleótidos exógena que codifica un autoantígeno adecuado. Como se describió previamente, los autoantígenos adecuados incluyen antígenos expresados por células tumorales que permiten que el sistema inmune diferencie entre células tumorales y otros tipos de células. Los autoantígenos adecuados incluyen antígenos que son inapropiados para el tipo de célula y/o su entorno, o que solo están normalmente presentes durante el desarrollo de
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los organismos (por ejemplo, antígenos fetales). Por ejemplo, GD2 normalmente solo se expresa en un nivel significativo en las membranas de la superficie externa de las células neuronales, donde su exposición al sistema inmune está limitada por la barrera hematoencefálica. Sin embargo, GD2 se expresa en las superficies de una amplia gama de células tumorales, incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas, neuroblastoma, melanomas y osteosarcomas. Otros autoantígenos adecuados incluyen los receptores de superficie celular que se encuentran en las células tumorales pero que son raros o están ausentes en la superficie de las células sanas. Tales receptores pueden ser responsables de activar las vías de señalización celular que dan como resultado el crecimiento no regulado y la división de la célula tumoral. Por ejemplo, ErbB2 se produce a niveles anormalmente altos en la superficie de las células tumorales de cáncer de mama. De este modo, el vector adenoviral de la presente invención se puede usar para inducir una respuesta inmune contra una célula tumoral y, por lo tanto, se puede usar en el tratamiento del cáncer.
Los siguientes detalles se aplican mutatis mutandis a todos los usos anteriores del vector y la composición inmunogénica de la presente invención.
El tratamiento y la prevención de muchas enfermedades, incluido el estadio hepático de malaria, tuberculosis e influenza, están asociados con el mantenimiento de una fuerte respuesta mediada por células a las infecciones que involucran células T CD4+ y CD8+ y la capacidad de responder con citoquinas Th1, particularmente IFN-y, TNF-a, IL-2 e IL-17. Aunque muchas plataformas de vacunas de subunidades generan efectivamente inmunidad humana, la generación de respuestas inmunitarias robustas mediadas por células, particularmente las respuestas inmunitarias de células T CD4+ y CD8+, ha sido mucho más desafiante. El vector viral de la presente invención preferiblemente estimula respuestas inmunitarias, tanto celulares como humorales, contra el antígeno codificado.
También es deseable inducir una respuesta inmune de memoria. Las respuestas inmunes de memoria se atribuyen clásicamente a la reactivación de linfocitos T de larga duración y específicos de antígeno que surgen directamente de las células T efectoras diferenciadas y persisten en un estado uniformemente inactivo. Se ha demostrado que las células T de memoria son heterogéneas y comprenden al menos dos subconjuntos, dotados de diferente capacidad migratoria y función efectora; células T de memoria efectoras (TEM) y células T de memoria central (CTM). TEM se asemeja a las células efectoras generadas en la respuesta primaria en que carecen de los receptores constitutivos de ganglios linfáticos L-selectina y CCR7 y expresan receptores para la migración a tejidos inflamados. Tras el reencuentro con el antígeno, estos TEM pueden producir rápidamente IFN-y o IL-4 o liberar un rendimiento prealmacenado. TCM expresa L-selectina y CCR7 y carece de función efectora inmediata. Estas células tienen un umbral de activación bajo y, tras la reestimulación en órganos linfoides secundarios, proliferan y se diferencian en efectores.
Preferiblemente, el vector viral de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención o la composición inmunogénica de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención es capaz de provocar, inducir o potenciar una respuesta inmune específica de antígeno. Preferiblemente, la respuesta inmune es una fuerte respuesta inmune de células T, por ejemplo, una fuerte respuesta de células T CD8+ y CD4+. Preferiblemente, la respuesta inmune de células T es una respuesta inmune de células T protectora. Preferiblemente, la respuesta inmune de las células T es de larga duración y persiste durante al menos 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25 o más años. Preferiblemente, la respuesta inmune inducida es una respuesta inmune de células T de memoria.
El vector viral del primer aspecto de la presente invención o composición inmunogénica de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención puede ser administrado a la célula o sujeto hospedante como inmunización única o inmunizaciones múltiples. Preferiblemente, el vector viral o la composición inmunogénica del mismo se administran como parte de una estrategia de vacunación simple, doble o triple. También se pueden administrar como parte de un régimen de inmunización de refuerzo primario homólogo o heterólogo.
La estrategia de vacunación o régimen de inmunización puede incluir administraciones secundarias o posteriores del vector viral o composición inmunogénica de la presente invención. La segunda administración puede administrarse durante un período de tiempo corto o durante un período de tiempo prolongado. Las dosis pueden administrarse durante un período de horas, días, semanas, meses o años, por ejemplo hasta o al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 semanas o más o 0,25, 0,5, 0,75, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 ó 40 o más años después de la primera administración. Preferiblemente, la segunda administración ocurre al menos 2 meses después de la primera administración. Preferiblemente, la segunda administración ocurre hasta 10 años después de la primera administración. Estos intervalos de tiempo preferiblemente se aplican mutatis mutandis al período entre cualquier dosis posterior.
El vector viral y/o la composición inmunogénica se pueden administrar solos o en combinación con otras vacunas de ADN/proteína virales o no virales. Los ejemplos preferidos incluyen MVA, FP9 y otras vacunas de vectores adenovirales.
El vector viral y/o la composición inmunogénica se pueden administrar al sujeto por administración oral (incluso por inhalación), parenteral, mucosal (por ejemplo, bucal, sublingual, nasal), rectal o transdérmica. Alternativamente, el vector viral y/o la composición inmunogénica se pueden administrar a una célula huésped o muestra aislada de un
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sujeto poniendo en contacto la(s) célula(s) con el vector viral o la composición inmunogénica in vitro en condiciones que faciliten la transducción de la célula huésped con el vector viral.
El vector viral y la composición inmunogénica de la presente invención no están limitados a la administración de secuencias de ácido nucleico que codifican antígenos. Muchas enfermedades, incluido el cáncer, están asociadas con uno o más alelos mutantes deletéreos en el genoma del paciente. La terapia génica es un proceso que implica la inserción de genes en las células o tejidos del paciente para reemplazar el mutante deletéreo o el(los) alelo(s) no funcional(es) con alelo(s) "normal(es)" o funcional(es). Comúnmente, se inserta un alelo funcional en una ubicación no específica dentro del genoma para reemplazar el alelo no funcional. Alternativamente, el alelo no funcional puede intercambiarse por el alelo funcional mediante recombinación homóloga. La expresión posterior del alelo funcional dentro de la célula diana restaura la célula diana a un estado normal y, por lo tanto, proporciona un tratamiento para la enfermedad. El(los) alelo(s) "normal(es)" o funcional (es) se pueden insertar en el genoma de un paciente usando un vector viral. La presente invención, por lo tanto, también proporciona el vector viral de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención o la composición inmunogénica de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención para su uso en terapia génica.
Se proporciona la etapa de administrar a dicho animal un vector viral de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención o la composición inmunogénica de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención.
El vector de la presente invención puede comprender una secuencia de nucleótidos exógena que codifica la proteína funcional o "normal", cuya versión no funcional o "mutante" está asociada con una enfermedad o afección.
Preferiblemente, la célula diana es una célula somática. El sujeto a tratar es preferiblemente un mamífero. Los mamíferos preferidos incluyen pollos, otras aves de corral, vacas, ovejas, cabras, cerdos, jabalíes, búfalos, bisontes, caballos, camélidos, ciervos, elefantes, tejones, zarigüeyas, gatos, leones, monos y seres humanos.
Un cuarto aspecto de la presente invención proporciona una secuencia de polinucleótidos que codifica el vector viral según el primer aspecto de la presente invención. Preferiblemente, la secuencia de polinucleótidos comprende la secuencia de SEQ ID NO. 38 o una secuencia sustancialmente idéntica a la misma. El polinucleótido puede comprender adicionalmente la secuencia de nucleótidos exógena de interés.
Un quinto aspecto de la presente invención proporciona una célula huésped que comprende el vector viral de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención. Después de la transducción o infección, la célula huésped expresará la secuencia de nucleótidos exógena en la molécula de ácido nucleico para producir la molécula de interés, además de cualquier otra proteína adenovírica codificada por la molécula de ácido nucleico. Preferiblemente, la célula hospedadora se transduce de forma estable y es adecuada para la propagación viral.
La célula huésped puede ser una célula huésped aislada, parte de una muestra de tejido de un organismo, o parte de un organismo multicelular u órgano o tejido de la misma.
Preferiblemente, la célula huésped es una célula somática. Preferiblemente, la célula huésped no es una célula madre, más particularmente una célula madre embrionaria, más particularmente una célula madre embrionaria humana.
La célula huésped puede seleccionarse del grupo que consiste en una célula dendrítica presentadora de antígeno, célula de Langerhans, macrófago, célula B, linfocito, leucocito, miocito y fibroblastos.
Preferiblemente, la célula huésped es una célula animal, más preferiblemente una célula de mamífero. Los mamíferos preferidos incluyen pollos, otras aves de corral, vacas, ovejas, cabras, cerdos, jabalíes, búfalos, bisontes, caballos, camélidos, ciervos, elefantes, tejones, zarigüeyas, gatos, leones, monos y seres humanos.
También se describe un animal transducido o infectado con el vector viral de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención. Preferiblemente, el animal comprende una o más células transformadas o transfectadas con el vector viral de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención. Preferiblemente, el animal es un mamífero. Los mamíferos preferidos incluyen pollos, otras aves de corral, vacas, ovejas, cabras, cerdos, jabalíes, búfalos, bisontes, caballos, camélidos, ciervos, elefantes, tejones, zarigüeyas, gatos, leones, monos y seres humanos.
En un sexto aspecto, la presente invención proporciona un método para producir el vector viral de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención. Preferiblemente, el método comprende la etapa de incorporar una secuencia de nucleótidos derivada de AdY25 en un Cromosoma Artificial Bacteriano (BAC) para producir un vector Ad-BAC.
A diferencia de los vectores plasmídicos, los BAC están presentes en E. Coli en una sola copia que confiere una mayor estabilidad genética. Además, los vectores BAC de copia única permiten modificaciones muy precisas en el genoma viral mediante recombinación (ingeniería genética mediada por recombinación).
Preferiblemente, la incorporación de la secuencia de nucleótidos derivada de AdY25 en un Cromosoma Artificial Bacteriano (BAC) comprende las etapas de:
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i) construir un vector de rescate de BAC que comprende regiones de homología con los flancos izquierdo y derecho de la secuencia de nucleótidos virales;
ii) linealizar el vector de rescate BAC; y
iii) realizar la recombinación homóloga en una célula huésped entre la secuencia de nucleótidos viral y el vector de rescate de BAC linealizado para incorporar la secuencia de nucleótidos virales en el vector de rescate BAC.
Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos incorporada en el vector de rescate BAC comprende la secuencia de SEQ ID NO. 1 o SEQ ID NO. 38 o una secuencia sustancialmente idéntica a la misma.
Preferiblemente, el método comprende adicionalmente la etapa de modificar adicionalmente el genoma del vector Ad-BAC. Estas modificaciones adicionales pueden llevarse a cabo mediante recombinación de GalK. Esta técnica, iniciada por S0ren Warming y sus colegas, utiliza el gen GalK para la selección tanto positiva como negativa de clones recombinantes6. Las células SW102 E. Coli, en las que se puede realizar la recombinación, se han diseñado específicamente para carecer del gen GalK que se requiere para la utilización de galactosa como única fuente de carbono. La deleción del gen se lleva a cabo mediante recombinación entre el genoma del vector y un casete de GalK amplificado por PCR, flanqueado por regiones de homología de 50 pb a cada lado del gen seleccionado para su deleción. La selección en medios minimales que contienen solo galactosa debe garantizar que solo los recombinantes que contienen el gen GalK (en lugar del gen diana) crezcan. La sustitución de GalK con una secuencia de genes diferente puede realizarse de forma similar, esta vez utilizando GalK para la selección negativa. La adición de 2-desoxigalactosa (DOG) a los medios de selección seleccionará clones en los que GalK ha sido reemplazado ya que el producto de GalK, la galactoquinasa, metaboliza a DOG en un producto que es altamente tóxico para E. coli. Preferiblemente, la célula huésped es BJ5183 E. Coli para los pasos i) a iii) anteriores y SW102 para modificaciones adicionales.
Preferiblemente, se incluye un flanco de homología adicional cadena abajo de la región E1 del adenovirus para permitir la eliminación simultánea de E1, como se describe en el Ejemplo 1.
Preferiblemente, el método incluye además la eliminación de la región E3 del genoma del vector Ad-BAC. La deleción de la región E3 se puede llevar a cabo mediante recombinación de GalK, como se describe en el Ejemplo 2.
Preferiblemente, el método incluye además modificar la región E4 para optimizar el crecimiento y el rendimiento del vector. En una realización, el locus E4 nativo completo se reemplaza por el gen E4Orf6 de AdHu5. En una segunda realización, el locus E4 nativo se reemplaza con las regiones codificantes E4Orf4, E4Orf6 y E4Orf6/7 de AdHu5, y las regiones codificantes E4Orf1, E4Orf2 y E4Orf3 de AdY25, como se describe en el Ejemplo 3.
Preferiblemente, el método incluye además la introducción de sitios de recombinación específicos del sitio del fago lambda attRI y attR2 en el locus Ad E1 como parte de un casete de destino Invitrogen Gateway®. Dicha modificación permite la inserción direccional eficiente de transgenes de vacuna. Los transgenes también podrían insertarse mediante recombinación, In-Fusion®, ligadura convencional o reparación de huecos.
Un séptimo aspecto de la presente invención proporciona un clon de Cromosoma Artificial Bacteriano (BAC) que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica el vector viral de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención.
Preferiblemente, el clon BAC comprende:
(a) una cadena principal de BAC;
(b) la secuencia de polinucleótidos de acuerdo con el cuarto aspecto de la presente invención.
Como se describió anteriormente, el vector viral de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención se puede replicar en una línea celular transformada o virus auxiliar (sistema de vector sin intestino) que, si es necesario, comprende el complemento de cualquier gen eliminado del virus. Tales genes pueden eliminarse del virus para dificultar la replicación en células hospedadoras, pero, por supuesto, son necesarios para replicar el vector viral para producir composiciones inmunogénicas de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención. Se puede utilizar cualquier línea celular permisiva de replicación de adenovirus de tipo natural que se haya modificado para expresar los genes funcionalmente delecionados, o una línea celular que no sea permisiva para la replicación del virus de tipo natural que, adicional o alternativamente, se haya modificado para expresar CAR o integrinas además de los genes funcionalmente delecionados.
La presente invención proporciona células hospedadoras que comprenden un Cromosoma Artificial Bacteriano (BAC) de acuerdo con el séptimo aspecto de la presente invención, y adecuado para su propagación. Preferiblemente, tales células huésped son bacterias, más preferiblemente E. coli. Los ejemplos adecuados incluyen las cepas de E. coli DH10B y SW1029.
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Un octavo aspecto, por lo tanto, proporciona una célula de empaquetamiento o línea celular que produce o es capaz de producir el vector viral de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención. La línea de empaquetamiento o línea celular comprende las secuencias de nucleótidos que codifican el vector viral del primer aspecto de la presente invención. La expresión de estas secuencias da como resultado la producción del vector viral. Algunos de los genes requeridos pueden proporcionarse mediante la infección de la célula o línea celular con un vector viral de acuerdo con el primer aspecto. Preferiblemente, la célula comprende el complemento de cualquier gen eliminado o funcionalmente eliminado del vector viral. Preferiblemente, la célula comprende el complemento del gen AdY25 E1. Preferiblemente, la célula es una célula HEK293 o una célula PER.C6®.
Como se describió anteriormente, la modificación del locus E4 del vector adenoviral para incluir las regiones codificantes E4Orf4, E4Orf6 y E4Orf6/7 de AdHu5 aumentó la velocidad de producción de hexón, aumentando la sensibilidad del título anti-hexón para permitir la cuantificación del título infeccioso del vector viral, en particular, los vectores virales desarrollados para uso clínico que no contienen un gen marcador fluorescente. Además, se encontró sorprendentemente que esta modificación aumentaba el rendimiento y la tasa de crecimiento del vector. Cualquier experto en la materia apreciaría que se espera que tal modificación tenga un efecto beneficioso sobre una amplia variedad de adenovirus, y no simplemente sobre aquellos derivados de AdY25.
Como se describe en este documento, se proporciona un vector adenovírico distinto de AdHu5 que comprende una molécula de ácido nucleico, en donde dicha molécula de ácido nucleico comprende regiones codificantes E4Orf4, E4Orf6 y E4Orf6/7 heterólogas de AdHu5.
El locus E4 nativo se puede eliminar y reemplazar con las regiones codificantes E4Orf4, E4Orf6 y E4Orf6/7 heterólogas de AdHu5. Alternativamente, la molécula de ácido nucleico puede comprender las regiones codificantes nativas además de las regiones codificantes E4Orf4, E4Orf6 y E4Orf6/7 heterólogas de AdHu5. Preferiblemente, las regiones codificantes nativas son E4Orf1, E4Orf2 y E4Orf3.
Los vectores adenovirales preferidos se seleccionan del grupo que consiste en AdY25 y AdY68.
Preferiblemente, el vector adenovírico carece de E1 y un locus E3.
Simplemente para la conveniencia de los expertos en la técnica, una muestra de la cepa de E. coli SW1029 (un derivado de DH10B) que contiene cromosomas artificiales bacterianos (BAC) que contienen el genoma clonado de AdChOX1 (pBACe3.6 AdChOxl (E4 modificado) TIPeGFP, nombre de la línea celular "AdChOx1 (E4 modificado) TIPeGFP") fue depositado por Isis Innovation Limited el 24 de mayo de 2012 con la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC) en las Colecciones de Cultivos de la Agencia de Protección de la Salud, Agencia de Protección de la Salud, Porton Down, Salisbury SP4 0JG, Reino Unido en virtud del Tratado de Budapest y designado por la adhesión provisional no. 12052403.
Como se describe en este documento, el vector AdChOx1 se deriva del adenovirus Y25 de chimpancé, con deleción de la región E1, región E3, modificación de la región E4 e inserción del antígeno modelo TIPeGFP en el locus E1. La E. coli que contiene BAC es un organismo genéticamente modificado de clase I.
El BAC se propaga dentro de la bacteria durante la replicación y puede mantenerse por selección con cloranfenicol. La cepa SW102 de E. coli que contiene los cromosomas artificiales bacterianos en los que se clonan los genomas se puede propagar en caldo Luria-Bertani o agar que contiene 12,5 pg/ml de cloranfenicol a 32°C. El genoma puede modificarse mediante ingeniería genética en E. coli de acuerdo con métodos estándar, como se describe en la memoria descriptiva, p. ej. para insertar un antígeno recombinante alternativo en lugar de TIPeGFP.
La conversión de los clones de BAC de los genomas virales en virus ("rescate") se puede llevar a cabo mediante los siguientes pasos. El huésped de E. coli se propaga y el ADN de BAC se purifica de las bacterias de acuerdo con métodos estándar. El ADN se linealiza con la endonucleasa de restricción Pmel y se transfecta en células HEK293 (o una línea celular complementaria de E1 similar). El adenovirus resultante puede luego propagarse y purificarse para usar como una vacuna, por ejemplo. Todos estos reactivos y células están a disposición del público. Si la deposición fuera rescatada, el virus resultante sería un organismo genéticamente modificado de clase I.
Con respecto a todos los estados designados a los que dicha acción es posible y en la medida en que sea legalmente permisible según la ley del estado designado, se solicita que una muestra del material depositado se ponga a disposición únicamente mediante su emisión a un experto independiente, de conformidad con la legislación pertinente sobre patentes, por ejemplo Regla 32 (1) EPC, Regla 13 (1) y Anexo 1 de las Reglas de Patentes del Reino Unido 2007, Regulación 3.25 (3) del Reglamento de Patentes de Australia y disposiciones generalmente similares mutatis mutandis para cualquier otro estado designado.
Una realización específica del cuarto aspecto de la presente invención proporciona una secuencia de polinucleótidos que codifica un vector adenovírico de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención, en donde dicha secuencia de polinucleótidos comprende o consiste en la secuencia de polinucleótidos del vector viral AdChOX1, depositada en un BAC contenido en la cepa de E. coli SW1029 por Isis Innovation Limited el 24 de mayo de 2012 con la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC) en las Colecciones de Cultivos de la Agencia de Protección de la Salud, Agencia de Protección de la Salud, Porton Down, Salisbury SP4 0JG, Reino Unido bajo el
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Tratado de Budapest y designado por la adhesión provisional n. 12052403. El BAC depositado comprende adicionalmente un transgen que codifica el antígeno TIPeGFP. En este aspecto de la presente invención, la secuencia de polinucleótidos para AdChOX1 preferiblemente no incluye la secuencia que codifica el antígeno TIPeGFP.
Una realización adicional de la presente invención proporciona una célula hospedadora transducida con el vector viral de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención, en donde dicha célula hospedadora es preferiblemente una bacteria, más preferiblemente una cepa SW1029 de E. coli que contiene un cromosoma bacteriano artificial (BAC) que contiene el genoma clonado de AdChOX1 depositado por Isis Innovation Limited el 24 de mayo de 2012 con la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC) en las Colecciones de Cultivos de la Agencia de Protección de la Salud, Agencia de Protección de la Salud, Porton Down, Salisbury SP4 0JG, Reino Unido bajo el Tratado de Budapest y designado por la adhesión provisional n. 12052403. El BAC depositado comprende adicionalmente un transgen que codifica el antígeno TIPeGFP. En este aspecto de la presente invención, la secuencia de polinucleótidos para AdChOX1 preferiblemente no incluye la secuencia que codifica el antígeno TIPeGFP. Dicha célula huésped puede usarse para la propagación de BAC.
Una realización específica del sexto aspecto de la presente invención proporciona un método para producir el vector viral de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención generando un clon molecular de AdY25 en un Cromosoma Artificial Bacteriano (BAC), en el que dicho BAC es el BAC que contiene el genoma clonado de AdChOX1, depositado en la cepa SW1029 de E. coli por Isis Innovation Limited el 24 de mayo de 2012 con la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC) en las Colecciones de Cultivo de la Agencia de Protección de la Salud, Agencia de Protección de la Salud, Porton Down, Salisbury SP4 0JG, Reino Unido en virtud del Tratado de Budapest y designada por la accesión provisional no.12052403. El BAC depositado comprende adicionalmente un transgen que codifica el antígeno TIPeGFP. En este aspecto de la presente invención, la secuencia de polinucleótidos para AdChOX1 preferiblemente no incluye la secuencia que codifica el antígeno TIPeGFP.
Una realización específica del séptimo aspecto de la presente invención proporciona un clon de Cromosoma Artificial Bacteriano (BAC) que comprende la secuencia de polinucleótidos según el cuarto aspecto de la presente invención, en el que dicho BAC es el BAC que contiene el genoma clonado de AdChOX1, depositado en la cepa de E. coli SW1029 por Isis Innovation Limited el 24 de mayo de 2012 con la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC) en las Colecciones de Cultivos de la Agencia de Protección de la Salud, Agencia de Protección de la Salud, Porton Down, Salisbury SP4 0JG, Reino Unido en virtud del Tratado de Budapest y designado por el acceso provisional n. ° 12052403. El BAC depositado comprende adicionalmente un transgen que codifica el antígeno TIPeGFP. En este aspecto de la presente invención, la secuencia de polinucleótidos para AdChOX1 preferiblemente no incluye la secuencia que codifica el antígeno TIPeGFP.
Para evitar dudas, se declara expresamente que las características descritas en este documento como "preferidas", "preferibles", "alternativas" o similares pueden estar presentes en la invención de forma aislada o en combinación con una o más características adicionales de la forma descrita (a menos que el contexto dicte lo contrario) y esto constituye una divulgación explícita de tales combinaciones de características.
Todas las características de cada realización descrita anteriormente se aplican mutatis mutandis a todas las demás realizaciones de la presente invención, que, en el sentido más amplio, son como se definen en las reivindicaciones.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Generación de un clon molecular de AdY25 en un cromosoma artificial bacteriano
El adenovirus AdY25 de chimpancé de tipo natural se obtuvo de Goran Wadell de la Universidad de Umea, Suecia. El virus se propagó a título alto en células HEK293 y el ADN fenólico viral se extrajo y se secuenció. La secuencia de nucleótidos del virus AdY25 de tipo natural se encuentra en la SEQ ID NO. 1. En base a los datos de secuenciación, se construyó un "vector de rescate" de BAC que contenía regiones de homología a los flancos izquierdo y derecho del genoma viral (los flancos de homología se amplificaron por PCR a partir de ADN viral). La recombinación homóloga se realizó a continuación en células BJ5183 de E. Coli entre el ADN viral y el vector de rescate linealizado para incorporar el genoma viral al vector BAC.
Se incluyó un flanco de homología extra corriente abajo de la región de adenovirus E1 para permitir la eliminación simultánea de E1 con el fin de hacer incompetente el nuevo vector de replicación inmediata.
Los sitios de recombinación específicos del sitio de fago lambda attR1 y attR2 se introdujeron en el locus Ad E1 como parte de un casete de destino de Invitrogen Gateway® para permitir la inserción direccional eficaz de transgenes de vacuna. Se ligó un casete de destino modificado en el sitio de restricción Asi/SI introducido en el locus E1 durante el aislamiento del clon genómico.
El vector AE1 Ad-BAC resultante se rastreó mediante PCR y digestión de restricción antes de que los clones incompetentes de replicación se transfectaran en células complementarias de E1 HEK293, donde el nuevo vector demostró la capacidad de producir viriones infecciosos capaces de replicación y efecto citopático en células HEK293.
Ejemplo 2: Eliminación de la región adenoviral E3
El genoma del vector AE1 Ad-BAC producido de acuerdo con el Ejemplo 1 se modificó adicionalmente utilizando la recombinación de GalK para eliminar la región adenoviral E3 y así aumentar la capacidad de inserción del nuevo vector en aproximadamente 5 kb.
5 La región E3 se eliminó por recombinación entre el genoma del vector y un casete de GalK amplificado por PCR, flanqueado por regiones de 50 pb de homología a cada lado del gen E3. La recombinación se realizó en células SW102 de E. coli, que se habían diseñado específicamente para carecer del gen GalK que se requiere para la utilización de galactosa como única fuente de carbono. Las células recombinantes se seleccionaron usando medios mimimales que contenían únicamente galactosa, en los que solo los recombinantes que contenían el gen GalK en 10 lugar del locus E3 podían crecer6.
Ejemplo 3: Modificación de la región E4 y sus efectos
i) Modificación de la región E4
El locus E4 del genoma del vector AE1 AE3 Ad-BAC producido de acuerdo con el Ejemplo 2 se modificó a continuación. La región E4 se eliminó mediante recombinación en células de E. coli SW102 entre el genoma del 15 vector y un casete GalK amplificado por PCR, flanqueado por regiones de homología de 50 pb a cada lado del gen E4. Las células recombinantes se seleccionaron usando medios mimimales que solo contenían galactosa. El gen GalK luego se reemplazó con los marcos de lectura abiertos de E4 requeridos de AdHu5 y AdY25 de una manera similar para proporcionar los 5 constructos enumerados en la Figura 3C. Después, las células recombinantes que comprendían el gen en lugar del gen GalK se seleccionaron usando medios que comprendían 2-desoxigalactosa 20 (DOG)6.
ii) Efecto de la modificación de E4 en el rendimiento viral
Las células HEK293 se infectaron con los siguientes vectores virales a una multiplicidad de infestación de 9 y se incubaron a 37°C durante 48 horas antes de la recogida:
i) AdHu5 ("Ad5")
25 ii) AdY25 E4 natural ("Y25E4wt")
iii) AdY25 E4 AdHu5 E4Orf6 ("Y25Ad5E4Orf")
iv) AdY25 E4 AdHu5 E4Orf 4, 6, 6/7 ("AdChOXI")
El título infeccioso del material recogido se midió cuantificando los focos positivos para GFP 48 horas después de la infección.
30 Como puede verse en la Figura 3 A, el título infeccioso del vector viral basado en AdY25 que comprende el locus E4 de tipo natural fue significativamente menor que el de AdHu5. La modificación del vector viral para reemplazar el locus E4 de tipo natural con el gen E4Orf6 de AdHu5 aumentó significativamente el título infeccioso. La sustitución del locus E4 de tipo natural con las regiones codificantes E4Orf4, E4Orf6 y E4Orf6/7 de AdHu5, y las regiones codificantes E4Orf1, E4Orf2 y E4Orf3 de AdY25 (para crear ChAdOXI) aumentó sorprendentemente el título 35 infeccioso.
iii) GFP vs. título anti-hexón
Con el fin de evaluar la inmunogenicidad y la eficacia del vector de vacuna, es esencial desarrollar un método confiable para cuantificar el título infeccioso del virus. Tradicionalmente, los ensayos de placa en células HEK293 han sido el método de elección, pero estos requieren un largo período de incubación y los títulos a menudo son 40 inconsistentes. Además, el ensayo de placa es intrínsecamente insensible, no todos los viriones infecciosos inducirán la formación de placa. Un método es el ensayo de infectividad de células individuales que simplemente implica cuantificar el número de células infectadas por virus. Los primeros vectores virales derivados de AdY25 recombinantes expresaban la proteína verde fluorescente (GFP), permitiendo que los virus que habían iniciado la expresión del transgén recombinante dentro de una célula se visualizaran directamente mediante microscopía de 45 fluorescencia. Sin embargo, se debe usar un método alternativo para evaluar la infectividad celular cuando las
construcciones de antígenos vacunales no contienen un gen marcador fluorescente, por ejemplo, cuando las
construcciones de antígenos vacunales son para uso clínico.
Ahora se ha desarrollado un ensayo de inmunotinción anti-hexón que permite la visualización de células infectadas en las que se expresa la proteína hexón viral. Este ensayo utiliza un anticuerpo policlonal anti-hexón, por lo que se 50 puede usar para valorar virtualmente cualquier vector de vacuna de adenovirus y se ha encontrado que el ensayo es
confiable y consistente tanto para vectores basados en AdHu5 como en vectores basados en AdCh63. Por supuesto, se basa en la suposición de que la velocidad de producción del hexón con respecto a la expresión transgénica es constante entre los vectores. Los títulos de vectores virales derivados de AdY25 que expresan GFP
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se compararon mediante GFP y ensayos basados en anti-hexón. Los títulos se evaluaron 48 horas después de la infección para AdHu5, AdC63, AdY25 E4 de tipo natural, y constructos A - E como se describe en la Figura 3C, todos expresan el antígeno TIPeGFP.
TIP es esencialmente una cadena de epítopos que consiste en varios epítopos de células T murinos fuertes que incluyen Pb9 (un epítopo CD8+ dominante del antígeno malárico PbCSP) y P15 (un epítopo CD4+ fuerte del antígeno 85A de M. tuberculosis). La cadena de epítopos TIP se fusiona con el extremo 5' de eGFP, lo que permite que la expresión del transgén se visualice directamente y simplifique la titulación de la vacuna.
La Figura 3B ilustra la relación entre los focos de GFP y el título anti-hexón. Para los vectores basados en Ad5 y AdC63, los títulos de GFP fueron aproximadamente dos veces más sensibles que los títulos anti-hexón. Sin embargo, para vectores basados en AdY25, la sensibilidad del ensayo anti-hexón varió considerablemente con la modificación de E4. Para el vector de tipo natural AdY25 E4, los títulos anti-hexón fueron 40 veces menos sensibles que los títulos de GFP después de 48 horas, lo que sugiere que la velocidad de producción de hexones es considerablemente más lenta que para los vectores AdHu5 y AdCh63. Esto era de esperar, dado el bajo rendimiento del vector de tipo natural AdY25 E4. Sorprendentemente, sin embargo, la construcción A ("Y25Ad5E4Orf6") era aún 30 veces menos sensible por anti-hexón que por GFP. Los mejores resultados se obtuvieron con el constructo E ("ChAdOX1"), en el que el locus E4 de tipo natural se reemplazó con las regiones codificantes E4Orf4, E4Orf6 y E4Orf6/7 de AdHu5, y las regiones codificantes E4Orf1, E4Orf2 y E4Orf3 de AdY25.
iii) Expresión de hexones
La relación del gen marcador frente al título del hexón para los vectores virales ChAdOX1 que expresan TIPeGFP se midió usando transgenes fluorescentes GFP y mCherry para controlar la sensibilidad de la detección fluorescente.
Los resultados se proporcionan en la Figura 3D. En ambos casos, la relación del título gen marcador:hexón fue aproximadamente el doble y, por lo tanto, el gen marcador particular utilizado no afectó la relación del título del gen marcador resultante:hexón. La relación del título del gen marcador:hexón para el vector ChAdOX1 es la misma que para HAdV-5, lo que indica que la modificación E4 del vector ChAdOX1 se ha optimizado.
Ejemplo 4: Inmunogenicidad de vectores basados en AdY25
La inmunogenicidad se evaluó usando el antígeno modelo TIPeGFP para determinar si se podía obtener una inmunogenicidad comparable a AdC63 y AdC68 en ratones usando un vector basado en AdY25.
Se inmunizaron ratones Balb/c (4/grupo) por vía intramuscular con 109 unidades infecciosas (ifu) de cada uno de los siguientes vectores virales, que expresan todos el antígeno TIPeGFP:
i) AdCh63;
ii) AEI AE3 AdCh68; y
iii) ChAdOXI.
Después de 14 días después del cebado, se evaluó la inmunogenicidad del bazo frente a un epítopo CD8+ fuerte (Pb9) mediante IFN-y ELISpot.
Las respuestas ELISpot del bazo IFN-y se muestran en la Figura 4. Las respuestas provocadas por ChAdOXI fueron robustas y comparables a las observadas usando AdCh63 y el vector basado en AdCh68. Estos datos apoyan el desarrollo continuo de vectores basados en AdY25 para su aplicación clínica.
Ejemplo 5: Efecto de la modificación de E4 en la inmunogenicidad de vectores basados en AdY25
El impacto de dos modificaciones diferentes de E4 en la inmunogenicidad de los vectores basados en AdY25 se evaluó usando los siguientes constructos:
(i) AdY25 E4 natural ("E4wt")
(ii) AdY25 E4AdHu5Orf6 ("E4Orf6"); y
(iii) AdY25 E4AdHu5Orf4/6/7 ("E4Orf4/6/7").
Se inmunizaron ratones Balb/c (4/grupo) por vía intramuscular con 106 ifu o 108 ifu de cada vector. Las respuestas a los epitopos de Pb9 y P15 se analizaron dos semanas después de la inmunización. Los títulos se calcularon una vez más en GFP para eliminar el efecto de las tasas de producción de hexón en el título de la vacuna.
El efecto de la modificación de E4 sobre las respuestas ELISpot del bazo de IFN-y se muestra en la Figura 5. Los datos indican que la modificación de E4 no tiene ningún efecto sobre la inmunogenicidad del vector. Por lo tanto, tales modificaciones pueden usarse para mejorar la velocidad de producción de los vectores virales, sin tener un impacto negativo sobre la inmunogenicidad de los vectores.
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Ejemplo 6: Prevalencia de anticuerpos neutralizadores de vector
Se evaluó la prevalencia de anticuerpos neutralizantes de vectores en sueros humanos del Reino Unido y Gambia frente a vectores basados en AdY25 y vectores basados en AdCh63.
Las células HEK293 se infectaron con Y25Ad5E4Orf6-SEAP o AdCh63-SEAP (SEAP = fosfatasa alcalina placentaria secretada). Los adenovirus recombinantes se incubaron con cinco diluciones seriadas de suero en FBS-DMEM antes de la infección. Las diluciones de suero finales fueron 1:18, 1:72, 1:288, 1:1152, 1:4608; cada muestra de suero se probó por duplicado. Los sobrenadantes se recogieron y se analizaron para la concentración de SEAP usando CSPD (Tropix) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La intensidad de luminiscencia se midió usando un luminómetro flash Varioskan (Thermo Scientific). Los títulos de neutralización se definieron como la dilución del suero requerida para reducir la concentración de SEAP en un 50% en comparación con los pocillos infectados solo con virus. El título de neutralización se calculó por interpolación lineal de valores adyacentes.
Como se muestra en la Figura 6, sorprendentemente se encontró que la seroprevalencia de anticuerpos neutralizantes contra Y25Ad5E4Orf6 era mucho más baja que la de AdCh63 tanto en el Reino Unido como en Gambia.
Ejemplo 7: Inmunogenicidad humoral de vectores basados en AdY25
Se inmunizaron ratones Balb/c (6/grupo) con 108 unidades infecciosas de cualquiera de los siguientes vectores, ambos expresan TIPeGFP:
i) AE1 AE3 AdCh68; o
ii) ChAdOX1.
Después de 56 días del cebado, los ratones se reforzaron con 106 pfu de MVA-TIPeGFP. El suero se recogió 50 días después del cebado y 10 días después del refuerzo para comparar las respuestas de anticuerpos anti-GFP antes y después del refuerzo. Las respuestas se midieron mediante ELISA de punto final. Los análisis estadísticos se realizaron por ANOVA de una vía.
Como se muestra en la Figura 7, la inmunogenicidad humoral del vector ChAdOX1 basado en AdY25 es superior al vector AdCh68 de adenovirus de chimpancé actual, lo que indica una respuesta de anticuerpo potenciada inducida por el vector basado en AdY25 en comparación con el vector basado en AdCh68.
Ejemplo 8: Inducción de la respuesta inmune frente a Mycobacterium tuberculosis
Se insertó un transgén que codificaba la proteína Ag85A de Mycobacterium tuberculosis en el locus E1 de ChAdOX1 bajo el control del promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano, usando la tecnología BAC como se describe en el Ejemplo 1. La secuencia de nucleótidos del transgén (SEQ ID NO. 42) codifica los residuos 1 a 323 del antígeno, codificados por una secuencia optimizada para el uso de codones humanos (nucleótidos 103 a 1071), fusionados en el extremo N-terminal a tPA (el péptido señal del activador del plasminógeno tisular humano) (nucleótidos 1 a 102) y en el extremo C a un marcador PK (nucleótidos 1072 a 1104). La secuencia de aminoácidos del antígeno Ag85A se proporciona en la SEQ ID NO. 43.
El clon de BAC se transfectó en células HEK293 y el vector del virus se amplificó, purificó y tituló usando el ensayo de inmunotinción anti-hexón descrito en el Ejemplo 3.
La inmunogenicidad del vector se evaluó en ratones Balb/c inmunizados con dosis variables, expresadas en unidades infecciosas, de la vacuna administrada intramuscularmente. Después de 14 días, se determinaron las respuestas inmunes celulares frente a Ag85A mediante un ensayo ELIspot de IFN-y usando esplenocitos estimulados con péptidos sintéticos correspondientes al CD8+ inmunodominante conocido (p11; WYDQSGLSV (SEQ ID N° 44)) y células T CD4+ (p15; TFLTSELPGWLQANRHVPT (SEQ ID N° 45)) epítopos restringidos H-2d en Ag85A.
Los resultados se muestran en las Figuras 8A y 8B. Estos resultados indican que el vector ChAdOX1 es capaz de inducir respuestas inmunes contra Mycobacterium tuberculosis. La magnitud de estas respuestas es similar a la inducida por vectores basados en otros adenovirus.
Ejemplo 9: Inducción de la respuesta inmune contra Influenza A
Se insertó un transgén que codifica la nucleoproteína (NP) y la proteína matricial 1 (M1) del virus de influenza A en el locus E1 de ChAdOX1 bajo el control del promotor temprano inmediato principal de citomegalovirus humano, usando la tecnología BAC como se describe en el Ejemplo 1. La secuencia de nucleótidos del transgén (SEQ ID NO. 46) codifica la nucleoproteína de influenza A (nucleótidos 1 a 1494) fusionada a la proteína de matriz 1 (nucleótidos 1516 a 2274) y separada por un enlazador (nucleótidos 1495 a 1515). La secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión NPM1 se proporciona en SEQ ID NO. 47.
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El clon de BAC se transfectó en células HEK293 y el vector del virus se amplificó, purificó y tituló usando el ensayo de inmunotinción anti-hexón descrito en el Ejemplo 3. Un vector similar basado en adenovirus humano tipo 5 (HAdV- 5) se generó de forma similar y se tituló con fines comparativos.
La inmunogenicidad del vector se evaluó en ratones Balb/c inmunizados con dosis variables, expresadas en unidades infecciosas, de la vacuna administrada intramuscularmente. Después de 14 días, las respuestas inmunitarias celulares frente a NP se determinaron mediante el ensayo FN-y ELIspot usando esplenocitos estimulados con péptidos sintéticos correspondiente al epítopo inmunodominante de células T CD8+ H-2d restringido en NP ((TYQRTRALV) (SEQ ID N° 48)).
Los resultados se muestran en la Figura 9. Estos resultados indican que el vector ChAdOXI es capaz de inducir respuestas inmunitarias frente al virus de la gripe A y que, a las dosis probadas, son similares a las inducidas por un vector HAdV-5.
La vacuna ChAdOX1-NPM1 se ha producido recientemente para ensayos clínicos en humanos de acuerdo con las buenas prácticas actuales de fabricación en las Instalaciones de Biofabricación Clínica de la Universidad de Oxford. Esto indica la idoneidad del vector para su desarrollo como producto médico.
Referencias
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2. Farina et al., J. Virol, diciembre de 2001, p 11603-11613
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4. R. Wigand et al., Intervirology, Vol 30; 1 1989
5. Roy et al., Hum. Gen. Ther., 2004, 15: 519-530
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7.
http://www.invitrogen.com/gateway
8. Havenga et al, J.G.V., 2006, 87, 2135-214
9. Wanning, S. et al. Nucleic Acids Res, 2005, 24 de febrero; 33 (4): e36
Secuencias
SEC ID N°1 (Genoma del adenovirus AdY25 de chimpancé)
CCATCATCAATAATATACCTCAAACTTTTTGTGCGCGTTAATATGCAAATGAGGCGTTTGA
ATTTGGGAAGGGAGGAAGGTGATTGGCCGAGAGAAGGGCGACCGTTAGGGGCGGGGCGA
GTGACGTTTTGATGACGTGACCGCGAGGAGGAGCCAGTTTGCAAGTTCTCGTGGGAAAAG
TGACGTCAAACGAGGTGTGGTTTGAACACGGAAATACTCAATTTTCCCGCGCTCTCTGACA
GGAAATGAGGTGTTTCTAGGCGGATGCAAGTGAAAACGGGCCATTTTCGCGCGAAAACTG
AATGAGGAAGTGAAAATCTGAGTAATTTCGCGTTTATGACAGGGAGGAGTATTTGCCGAG
GGCCGAGTAGACTTTGACCGATTACGTGGGGGTTTCGATTACCGTGTTTTTCACCTAAATT
TCCGCGTACGGTGTCAAAGTCCGGTGTTTTTACGTAGGTGTCAGCTGATCGCCAGGGTATT
TAAACCTGCGCTCTCCAGTCAAGAGGCCACTCTTGAGTGCCAGCGAGAAGAGTTTTCTCCT
CCGCGCCGCGAGTCAGATCTACACTTTGAAAGATGAGGCACCTGAGAGACCTGCCCGATG
AGAAAATCATCATCGCTTCCGGGAACGAGATTCTGGAACTGGTGGTAAATGCCATGATGG
GCGACGACCCTCCGGAGCCCCCCACCCCATTTGAGGCACCTTCGCTACACGATTTGTATGA
TCTGGAGGTGGATGTGCCCGAGGACGACCCCAACGAGGAGGCGGTAAATGATTTATTTAG
CGATGCCGCGCTGCTAGCTGCCGAGGAGGCTTCGAGCCCTAGCTCAGACAGCGACTCTTC
ACTGCATACCCCTAGACCCGGCAGAGGTGAGAAAAAGATCCCCGAGCTTAAAGGGGAAG
AGATGGACTTGCGCTGCTATGAGGAATGCTTGCCCCCGAGCGATGATGAGGACGAGCAGG
CGATCCAGAACGCAGCGAGCCAGGGAATGCAAGCCGCCAGCGAGAGTTTTGCGCTGGACT
GCCCGCCTCTGCCCGGACACGGCTGTAAGTCTTGTGAATTTCATCGCTTGAATACTGGAGA
TAAAGCTGTGTTATGTGCACTTTGCTATATGAGAGCTTACAACCATTGTGTTTACAGTAAG
TGTGATTAAGTTGAACTTTAGAGGGAGGCAGAGAGCAGGGTGACTGGGCGATGACTGGTT
TATTTATGTATATATGTTCTTTATATAGGTCCCGTCTCTGACGCAGATGATGAGACCCCCA
CTACAGAGTCCACTTCGTCACCCCCAGAAATTGGCACATCTCCACCTGAGAATATTGTTAG
ACCAGTTCCTGTTAGAGCCACTGGGAGGAGAGCAGCTGTGGAATGTTTGGATGACTTGCT
ACAGGCTGGGGATGAACCTTTGGACTTGTGTACCCGGAAACGCCCCAGGCACTAAGTGCC
ACACATGTGTGTTTACTTGAGGTGATGTCAGTATTTATAGGGTGTGGAGTGCAATAAAAA
ATGTGTTGACTTTAAGTGCGTGGTTTATGACTCAGGGGTGGGGACTGTGGGTATATAAGCA
GGTGCAGACCTGTGTGGTTAGCTCAGAGCGGCATGGAGATTTGGACGATCTTGGAAGATC
TTCACAAGACTAGACAGCTGCTAGAGAACGCCTCGAACGGAGTCTCTCACCTGTGGAGAT
TCTGCTTCGGTGGCGACCTAGCTAAGCTAGTCTATAGGGCCAAACAGGATTATAGCGAAC
AATTTGAGGTTATTTTGAGAGAGTGTCCGGGTCTTTTTGACGCTCTTAATTTGGGTCATCA
GACTCACTTTAACCAGAGGATTGTAAGAGCCCTTGATTTTACTACTCCCGGCAGATCCACT
GCGGCAGTAGCCTTTTTTGCTTTTCTTCTTGACAAATGGAGTCAAGAAACCCATTTCAGCA
GGGATTACCAGCTGGATTTCTTAGCAGTAGCTTTGTGGAGAACATGGAAATCCCAGCGCC
TGAATGCAATCTCAGGCTACTTGCCGGTACAGCCACTAGACACTCTGAAGATCCTGAATCT
CCAGGAGAGTCCCAGGGCACGCCAACGTCGCCGGCAGCAGCAGCGGCAGCAGGAGGAGG
ATCAAGAAGAGAACCCGAGAGCCGGCCTGGACCCTCCGGCGGAGGAGGAGTAGCTGACC
TGTTTCCTGAACTGCGCCGGGTGCTGACTAGGTCTTC.GAGTGGTCGGGAGAGGGGGATTA
AGCGGGAGAGGCATGATGAGACTAATCACAGAACTGAACTGACTGTGGGTCTGATGAGCC
GCAAGCGTCCAGAAACAGTGTGGTGGCATGAGGTGCAGTCGACTGGCACAGATGAGGTGT
CAGTGATGCATGAGAGGTTTTCCCTAGAACAAGTCAAGACTTGTTGGTTAGAGCCTGAGG
ATGATTGGGAGGTAGCCATCAGGAATTATGCCAAGCTGGCTCTGAGGCCAGACAAGAAGT
ACAAGATTACTAAGCTGATAAATATCAGAAATGCCTGCTACATCTCAGGGAATGGGGCTG
AAGTGGAGATCTGTCTTCAGGAAAGGGTGGCTTTCAGATGCTGCATGATGAATATGTACC
CGGGAGTGGTGGGCATGGATGGGGTCACCTTTATGAACATGAGGTTCAGGGGAGATGGGT
ATAATGGCACGGTCTTTATGGCCAATACCAAGCTGACAGTTCATGGCTGCTCCTTCTTTGG
GTTTAATAACACCTGCATTGAGGCCTGGGGTCAGGTTGGTGTGAGGGGCTGTAGTTTTTCA
GCCAACTGGATGGGGGTCGTGGGCAGGACCAAGAGTATGCTGTCCGTGAAGAAATGCTTG
TTCGAGAGGTGCCACCTGGGGGTGATGAGCGAGGGCGAAGCCAGAATCCGCCACTGCGCC
TCTACCGAGACGGGCTGTTTTGTGCTGTGCAAGGGCAATGCTAAGATCAAGCATAATATG

Claims (14)

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    1. Un vector de adenovirus que comprende una cápside, en donde dicha cápside comprende las proteínas de la cápside del adenovirus AdY25 de chimpancé de tipo natural y encapsida una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos exógena de interés unida operativamente a secuencias de control de la expresión que dirigen la traducción, transcripción y/o expresión del mismo en una célula animal y una secuencia de señal de empaquetamiento de adenovirus,
    en el que la secuencia de nucleótidos que codifica el adenovirus AdY25 de chimpancé de tipo natural es la SEQ ID NO: 1,
    en el que dicho vector carece de un locus E1 funcional, y
    en el que el vector comprende al menos un marco de lectura abierto de E4 heterólogo de otro serotipo adenovírico.
  2. 2. El vector de la reivindicación 1, en el que el vector carece de un locus E3.
  3. 3. El vector de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el vector carece del locus E4 nativo y comprende un locus E4 heterólogo o un marco de lectura abierto del mismo de otro serotipo adenovírico, preferiblemente en el que el vector carece del locus E4 nativo y comprende la región de codificación E4Orf6 de AdHu5, o el vector de la reivindicación 2, en donde el locus E4 comprende las regiones codificantes E4Orf1, E4Orf2 y E4Orf3 naturales y las regiones codificantes heterólogas E4Orf4, Orf6 y Orf6/7 de AdHu5.
  4. 4. El vector de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la secuencia de nucleótidos exógena de interés codifica una proteína o polipéptido, preferiblemente en donde dicha proteína o polipéptido se selecciona del grupo que comprende un antígeno, un adyuvante molecular, una proteína inmunoestimuladora o una recombinasa, preferiblemente en donde dicho antígeno comprende Ag85A de Mycobacterium tuberculosis.
  5. 5. El vector de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha secuencia de nucleótidos exógena de interés es una secuencia de miARN o ARN inmunoestimulador.
  6. 6. El vector de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha cápside comprende las proteínas de la cápside:
    (a) una proteína hexón AdY25 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 2;
    (b) una proteína pentón AdY25 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 3; y
    (c) una proteína de fibra AdY25 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 4.
  7. 7. Una composición inmunogénica que comprende el vector de adenovirus de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes y opcionalmente uno o más ingredientes activos adicionales, un vehículo, diluyente, excipiente o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
  8. 8. La composición inmunogénica de la reivindicación 7 para su uso en medicina.
  9. 9. La composición inmunogénica según la reivindicación 7, para su uso en terapia génica, o para su uso en la prevención o tratamiento de al menos una infección o para su uso en la prevención o tratamiento de al menos una enfermedad, o para su uso en el desencadenamiento o potenciación de una respuesta inmune protectora en un animal, o para usar en inducir una respuesta inmune protectora en un animal que romperá la tolerancia a un autoantígeno.
  10. 10. Una secuencia de polinucleótidos que codifica el vector viral de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
  11. 11. Una célula huésped que comprende el vector viral de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
  12. 12. Un método para producir el vector viral de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende preferiblemente la etapa de incorporar el polinucleótido de la reivindicación 10 en un Cromosoma Artificial Bacteriano (BAC) para producir un vector Ad-BAC.
  13. 13. Un clon del Cromosoma Artificial Bacteriano (BAC) que comprende la secuencia de polinucleótidos de la reivindicación 10.
  14. 14. Una línea celular de empaquetamiento que produce el vector viral de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicha célula comprende el vector de adenovirus según las reivindicaciones 1 - 6 y el complemento de cualquier gen funcionalmente eliminado en el vector viral de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
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    Sustitución de aminoácidos por 100 residuos
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    Sustitución de aminoácidos por 100 residuos
    Figura 1
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    Sustitución de nucleótidos por 100 residuos
    Figura 2
    130
    (Q
    C
    Q)
    CJ
    imagen3
    Relación del título Gen marcador:Hexón
    £ £ p__5__?
    imagen4
    imagen5
    imagen6
    uomiu/ods
    Figura 4
    SFC/millón
    CD8+ epítopo
    Inmunogenicidad Pb9 Balb/c
    imagen7
    CD4+ epítopo
    Inmunogenicidad P15 Balb/c
    400-.
    c MQ
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    0-
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    imagen8
    Figura 5
    Seroprevalencia del Reino Unido
    imagen9
    ChAdOxl ^ AdCh63
    Seroprevalencia de Gambia
    w
    w
    <D
    3
    E
    <D
    T3
    o
    imagen10
    imagen11
    Ékj ChAdOxl E3 AdCh63
    Título de neutralización
    Figura 6
    Título del punto final (log 10)
    ELISA GFP
    aaa
    A
    . T
    * T
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    -----Hr«----- T ▼ _______i______________________
    ♦ ¿A ——-----i—---------------------*------------
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    Vector
    Figura 7
    135
    Figura 8
    imagen13
    SFC/millón de esplenocitos
    imagen14
    3
    136
    Figura 9
    SFC/millón de esplenocitos
    imagen15
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