JP2014516536A - サルアデノウイルス及び雑種アデノウイルスベクター - Google Patents

Abstract

組換えアデノウイルスベクターと、その免疫原組成物と、これらの医学における使用と、組換えアデノウイルスベクターの作製方法とが提供される。特に、チンパンジーアデノウイルスＡｄＹ２５由来のカプシドを含むアデノウイルスベクターであって、前記カプシドが関心のある外来ヌクレオチド配列を含む核酸分子をカプシド封入する、アデノウイルスベクターを提供する。

Description

本発明は、チンパンジーアデノウイルス由来の新規アデノウイルスベクターと、その免疫原組成物と、医学におけるそれらの使用とに関する。

本明細書において言及される全ての刊行物、特許及び特許出願は、引用により完全に取り込まれる。

従来、ウイルスは不活化又は弱毒化された病原体全体が利用されてきた。しかし、マラリアのような多くの感染症については、このアプローチは非実用的で、保護の免疫関連要因を誘導する病原体由来抗原のみを発現する「サブユニット・ワクチン」の開発に研究の焦点が変わってきた。

サブユニット・ワクチンは、感染性生物全体を導入することなく、抗原を免疫系に提示する。かかる方法の１つは、感染性生物由来の特異的な単離タンパク質の投与を伴う。しかし、この技術は弱い免疫応答しか誘発しないことがしばしばあり、前記単離タンパク質は正常なコンテキストでの該タンパク質とは異なる３次元構造を有する場合があり、結果的に、前記感染性生物を認識しない抗体が産生される場合がある。

したがって、抗原の送達用にウイルスベクターを用いる代替的な方法が開発されてきた。ウイルスは、そのＤＮＡを宿主細胞内にトランスフェクションし、該宿主細胞がウイルスゲノムを発現するように誘導する、偏性細胞内寄生体である。この複製戦略が、１種類以上の異種外来遺伝子を運搬する組換え非複製ウイルスベクターを作製することによりベクター型ワクチンを作製するのに利用されてきた。前記組換えウイルスゲノムの宿主細胞内へのトランスフェクション又は形質導入は、該宿主細胞内での前記異種外来遺伝子の発現をもたらす。前記異種外来遺伝子が例えば抗原をコード化するとき、前記宿主細胞内での抗原発現は、前記宿主の免疫系による保護的又は治療的免疫応答を誘発できる。したがって、前記ウイルスベクターは効果的なワクチンとして機能する場合がある。代替的には、前記異種外来遺伝子は遺伝子の機能的対立遺伝子をコード化する場合があり、該対立遺伝子の発現が、遺伝子治療として知られる過程で、該遺伝子の有害な突然変異体対立遺伝子の効果に対抗するために用いられる可能性がある。

ウイルス部Ｃ末端としての利用に特に適するのはアデノウイルスである。アデノウイルスは、ヌクレオカプシドと、線状２本鎖ＤＮＡゲノムを含む、直径約９０−１００ｎｍの非エンベロープ型ウイルスである。ウイルスのヌクレオカプシドは、ペントン及びヘクソンのカプソマーを含む。ユニークな線維が各ペントン基部と会合して、宿主細胞表面上のコクサッキーアデノウイルスレセプターを介して前記ウイルスの該宿主細胞への付着を助ける。アデノウイルスの５０種を超える血清型株が同定されており、そのたいていは、ヒトにおいて気道感染、結膜炎及び胃腸炎を起こす。宿主ゲノムにインテグレートされるよりも、アデノウイルスは宿主細胞の核内でエピソーム因子として複製するのが通常である。アデノウイルスのゲノムは、主に調節的機能を有し、宿主細胞にウイルス複製の準備をさせる、４種類の初期転写ユニット（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３及びＥ４）を含む。前記ゲノムは５種類の後期転写ユニット（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５）も含み、これらは、ペントン（Ｌ２）、ヘクソン（Ｌ３）、足場タンパク質（Ｌ４）及び線維タンパク質（Ｌ５）を含む、単一のプロモーターの制御下にある構造タンパク質をコード化する。ゲノムの両端は、ウイルス複製に必要な末端逆方向反復配列（Inverted Terminal Repeat、ＩＴＲ）を含む。

組換えアデノウイルスは、元来遺伝子治療用に開発されたが、これらの遺伝子送達剤により誘発される強力で持続的な外来遺伝子特異的免疫応答が、ワクチン担体としてのこれらの使用を促した。免疫原性が高いことに加えて、アデノウイルスは臨床的なワクチン開発のために多くに他の利点を提供する。アデノウイルスのゲノムは比較的小さく（２５ないし４５ｋｂｐ）、よく特徴づけられ、操作が容易である。単一の転写ユニットＥ１の欠失がウイルスを複製不能にし、その予測可能性を増大させ、臨床応用での副作用を減少させる。組換えアデノウイルスは、場合によっては８ｋｂまでの比較的大きな外来遺伝子を運搬でき、柔軟なサブユニット設計を可能にし、広く多様な細胞及び組織への外来遺伝子送達を容易にする、比較的広範な親和性を有する。臨床応用に重要なことには、高力価組換えアデノウイルスの大規模産生及び精製方法は十分に確立されている。これまで、サブグループＣ血清型ＡｄＨｕ２又はＡｄＨｕ５が圧倒的にベクターとして使われてきた。

しかし、原型ヒトアデノウイルスＡｄＨｕ５系第１世代のワクチンベクターは、有望な前臨床データにもかかわらず、臨床治験での薬効が低かった（非特許文献１）。その後、自然感染の結果、成人の大部分はＡｄＨｕ２及びＡｄＨｕ５のような一般的なヒト血清型に対する中和抗体を顕著な力価保持することが発見された。中和抗体は、宿主細胞内へのウイルスの侵入と、そして、標的外来遺伝子の送達とを阻止することによって、ウイルスベクターワクチンの有効性を低下させるかもしれない。

もとから抗ベクター免疫が存在することに対して、チンパンジー由来の血清型を含む、ヒト集団が曝露されてきた可能性の低い血清型を利用する新型アデノウイルスベクターの開発を通じて対処されている（非特許文献２及び３）。しかし、かかるチンパンジーアデノウイルスベクターの一部は、さまざまなレベルのヒトアデノウイルスとの交差反応性と、形質転換された株細胞での不十分な増殖という、説明できないヒト集団の免疫が原因で有効性が限られている。さらに、ベクターに対する中和抗体の誘導は別の適応症のための再投与を阻害する場合があるから、異なる疾患に対する免疫のために利用可能な広範な異なるアデノウイルスベクターを有することは有利である。

Buchbinderら、Lancet、Vol 372、Nov 2008 Farinaら、J. Virol、Dec 2001、p11603-11613 Dudarevaら、Vaccine 27、2009、3501-3504

したがって、標的外来遺伝子を効果的に送達し、アデノウイルス血清型に対するもとから存在する免疫の効果を最小にし、形質転換された株細胞で効率的に複製する、免疫原性の高い非ヒトアデノウイルスベクターの需要が本技術分野には引き続き存在する。

第１の局面では、本発明はＡｄＹ２５と本明細書でよばれるチンパンジーアデノウイルスの完全ゲノム配列を提供する。

第２の局面では、本発明はチンパンジーアデノウイルスＡｄＹ２５由来のカプシドを含むアデノウイルスベクターを提供し、前記カプシドは、動物細胞内での翻訳、転写及び／又は発現を制御する発現制御配列と、アデノウイルスパッケージングシグナル配列とに動作可能に連結された、関心のある外来ヌクレオチド配列を内包する。

第３の局面は、任意的に１種類以上の追加の活性成分、薬学的に許容可能な担体、希釈材、賦形剤又はアジュバントと併用される、第２の局面によるアデノウイルスベクターを含む免疫原組成物を提供する。

第４の局面は、第２の局面によるアデノウイルスか、第３の局面による免疫原組成物かの使用を提供する。特に、前記アデノウイルスベクター及び免疫原組成物は、外来遺伝子の宿主細胞内への送達と、動物での免疫応答誘発と、動物での免疫応答増強と、少なくとも１種類の疾患の治療又は予防と、自己抗原に対するトレランスを破る動物における免疫応答の誘導と、遺伝子治療とのために提供される。

本発明の第５の局面は、本発明の第２の局面によるアデノウイルスベクターをコード化するポリヌクレオチド配列を提供する。

本発明の第６の局面は、本発明の第２の局面によるウイルスベクターで形質導入された宿主細胞を提供する。

本発明の第７の局面は、好ましくは細菌人工染色体（ＢＡＣ）中にＡｄＹ２５の分子クローンを生成することにより、本発明の第２の局面によるウイルスベクターを作製する方法を提供する。

したがって本発明の第８の局面は、本発明の第５の局面によるポリヌクレオチド配列を含む細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンを提供する。

本発明の第９の局面は、本発明の第２の局面によるウイルスベクターを産生するパッケージング細胞株を提供する。

本発明の第１０の局面は、ＡｄＨｕ５由来のＥ４Ｏｒｆ４、Ｅ４Ｏｒｆ６及びＥ４Ｏｒｆ６／７コーディング領域を含む核酸分子を有する、ＡｄＨｕ５以外のアデノウイルスベクターを提供する。

本発明は、以下の図面を参照して説明される。

異なるアデノウイルス血清型の（Ａ）ヘクソンタンパク質及び（Ｂ）線維タンパク質の系統発生配列アライメント。配列は６つのアデノウイルスグループＡ−Ｆにクラスタリングされる。 異なる種の野生型アデノウイルスの全ゲノムヌクレオチド配列にもとづく系統発生配列アライメント。配列は６つのアデノウイルスグループＡ−Ｆにクラスタリングされる。 緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するＡｄＨｕ５及び３種類のＡｄＹ２５系ベクターのウイルス収率（感染単位／ｍＬ）の棒グラフ。ｉ）ＡｄＹ２５Ｅ４野生型（Ｙ２５Ｅ４ｗｔ）、ｉｉ）ＡｄＹ２５Ｅ４ＡｄＨｕ５Ｏｒｆ６（Ｙ２５Ａｄ５Ｅ４Ｏｒｆ６）、及び、ｉｉｉ）ＡｄＹ２５ＡｄＨｕ５Ｅ４Ｏｒｆ４／５／６（ＡｄＣｈＯＸ１）。 ＴＩＰｅＧＦＰ抗原を発現する、ＡｄＨｕ５と、ＡｄＣｈ６３と、ＡｄＹ２５Ｅ４野生型と、図３−Ｃに説明されるコンストラクトＡ−Ｅについての抗ヘクソン力価に対するＧＦＰ存在部位数の比の棒グラフ。 Ｅ４が改変されたＡｄＹ２５ベクターコンストラクトＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥの構築の詳細を示す表。 ＧＦＰ又はｍＣｈｅｒｒｙ蛍光外来遺伝子のいずれかを有する、ＴＩＰｅＧＦＰを発現するＡｄＣｈＯＸ１系ベクターについてのマーカー遺伝子：ヘクソン力価の比の棒グラフ。全てのデータは少なくとも２回の独立した実験を表す。誤差棒は平均及び標準誤差（ＳＥＭ）を示す。 ＡｄＣｈ６３及びＡｄＣｈ６８と比較されたＣｈＡｄＯＸ１の細胞免疫原性（細胞１００万個あたりのスポット形成細胞（ＳＦＣ））のグラフ。 ｉ）野生型Ｅ４領域（Ｅ４ｗｔ）、ｉｉ）ＡｄＨｕ５由来Ｅ４Ｏｒｆ６（Ｅ４Ｏｒｆ６）又はｉｉｉ）ＡｄＨｕ５由来Ｅ４Ｏｒｆ４、６及び７（Ｅ４Ｏｒｆ４／６／７）を有するＡｄＹ２５系ベクターの１０^８又は１０^６感染単位（ｉｆｕ）でＢａｌｂ／ｃマウス（４匹／群）の筋注免疫の２週間後における、２種類のエピトープＰｂ９及びＰ１５に対するＩＮＦ−γ脾臓ＥＬＩＳｐｏｔ応答（細胞１００万個あたりのＳＦＣ）に対するＥ４改変の効果を表すグラフ。 （図６で「ＣｈＡｄＯＸ１」とよばれた）Ｙ２５Ａｄ５Ｅ４Ｏｒｆ６及びＡｄＣｈ６３に対する、（Ａ）英国及び（Ｂ）ガンビアからのヒト血清中のベクター中和抗体の有病率を示すヒストグラム。 ＴＩＰｅＧＦＰ抗原を運搬するＣｈＡｄＯＸ１及びＡｄＣｈ６８系ベクターのヘキ性免疫原性を表すグラフ。プライミング５６日後、マウスはＭＶＡ−ＴＩＰｅＧＦＰ１０^６ｐｆｕでブーストされた。ａ）プライミング５０日後及びｂ）ブースト１０日後に血清が採取され、終点ＥＬＩＳＡにより応答が測定された。平均及び有意性が示される。統計解析は一元配置分散分析により実施された。破線は本アッセイの検出限界を示す。 ３種類の異なる投与量の結核菌Ａｇ８５Ａ抗原運搬ＣｈＡｄＯＸ１ベクターの細胞免疫原性（脾臓細胞１００万個あたりのスポット形成細胞（ＳＦＣ））を表すグラフ。Ａｇ８５Ａに対する細胞免疫応答は、Ａｇ８５Ａ（ｐ１５）中の既知免疫優勢ＣＤ４^＋Ｔ細胞Ｈ−２^ｄ拘束性エピトープに対応する合成ペプチドで刺激された脾臓細胞を用いるＩＦＮ−γＥＬＩｓｐｏｔアッセイによって測定された。 ３種類の異なる投与量の結核菌Ａｇ８５Ａ抗原運搬ＣｈＡｄＯＸ１ベクターの細胞免疫原性（脾臓細胞１００万個あたりのスポット形成細胞（ＳＦＣ））を表すグラフ。Ａｇ８５Ａに対する細胞免疫応答は、Ａｇ８５Ａ（ｐ１１）中の既知免疫優勢ＣＤ８^＋Ｔ細胞Ｈ−２^ｄ拘束性エピトープに対応する合成ペプチドで刺激された脾臓細胞を用いるＩＦＮ−γＥＬＩｓｐｏｔアッセイによって測定された。 ２種類の異なる投与量のインフルエンザＡウイルスの核タンパク質（ＮＰ）及びマトリックスタンパク質１（Ｍ１）を運搬するＣｈＡｄＯＸ１及びＨＡｄＶ−５の細胞免疫原性（脾臓細胞１００万個あたりのスポット形成細胞（ＳＦＣ））を表すグラフ。核タンパク質（ＮＰ）に対する細胞免疫応答は、ＮＰ中の既知免疫優勢ＣＤ８^＋Ｔ細胞Ｈ−２^ｄ拘束性エピトープに対応する合成ペプチドで刺激された脾臓細胞を用いるＩＦＮ−γＥＬＩｓｐｏｔアッセイにより測定された。

本発明は、チンパンジーアデノウイルスＡｄＹ２５由来の新規アデノウイルスベクターと、その免疫原組成物と、これらの医学における使用とに関する。

ＡｄＹ２５は本発明の発明者によりはじめて配列決定されたチンパンジーアデノウイルスである。ヌクレオチド配列は配列番号１に提供される。

したがって、本発明の第１の局面は、配列番号１の配列を揺する核酸分子を提供する。１つの実施態様では、前記核酸分子が単離される。

当業者は、本明細書に説明される核酸配列の全てに相同体、均等物及び誘導体が存在することを理解するであろう。したがって、本発明は本明細書で説明される核酸配列とその全長にわたって実質的に同一な配列を有する核酸分子を含む。

当業者は、本発明が本明細書で実施例として示される特定の核酸分子の変異体をも含むことを理解するであろう。これらは、例えば、系統間変異のために天然に存在する場合がある。例えば、付加、置換及び／又は欠失が含まれる。当業者は、本明細書で実施例として示される特定の核酸分子由来の変異体が遺伝コードの縮重性からみて可能であろうことも理解するであろう。前記変異体は本明細書に説明される核酸配列とその全長にわたって実質的な相同性があることが好ましい。

本明細書で用いられるところでは、「実質的な同一性」を有する核酸配列は、前記配列に対して少なくとも８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％又は９９．９％の相同性を有することが好ましい。「実質的な同一性」という用語は、前記配列が先行技術の核酸配列に対する同一性よりも本明細書に説明される配列のいずれかに対する同一性のほうが高いことを示すことが望ましい。

相同性又は同一性の程度を決定する目的のための核酸配列を比較するとき、ＢＥＳＴＦＩＴ及びＧＡＰ（両方ともウィスコンシン遺伝学コンピュータグループ（ＧＣＧ）ソフトウェアパッケージ由来）のようなプログラムが使用される。例えば、ＢＥＳＴＦＩＴは、２本の配列を比較して、最も類似するセグメントの最適なアライメントを作成する。ＧＡＰは、その全長にわたって配列のアライメントをとることを可能にし、いずれかの配列に適切にスペースを挿入することにより最適なアライメントを見つける。本発明のコンテキストでは、核酸配列の同一性を論じるとき、比較は配列の全長にわたるアライメントによって行われることが適切である。以上のことは、本出願で開示される全ての核酸配列に準用された。

第１の局面による核酸分子は、好ましくは配列番号１と少なくとも９８％の同一性、より好ましくは配列番号１と少なくとも９８．６％の同一性の配列を有する。

第１の局面による核酸分子は、
（ａ）配列番号１の１８３０２ないし２１１３０番目のヌクレオチドか、これと実質的に同一の配列と、
（ｂ）配列番号１の１３８９１ないし１５４８６番目のヌクレオチドか、これと実質的に同一の配列と、
（ｃ）配列番号１の３２２９０ないし３３６２１番目のヌクレオチドか、これと実質的に同一の配列とからなるグループから選択される、１本以上のヌクレオチド配列を含むことが好ましい。

これらのヌクレオチド配列は、ＡｄＹ２５の（ａ）ヘクソン、（ｂ）ペントン及び（ｃ）線維性カプシドタンパク質をコード化し、ＡｄＹ２５の外部領域が血清型を含むウイルスベクターの特性を決定する。

第１の局面による核酸分子は、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むヘクソンタンパク質をコード化するヌクレオチド配列又はこれと少なくとも９８．２％の同一性がある配列か、配列番号１の１８３０２ないし２１１３０番目のヌクレオチドにコード化されるタンパク質と少なくとも９８．２％の同一性がある配列を有するヘクソンタンパク質をコード化するヌクレオチド配列かと、
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含むペントンタンパク質をコード化するヌクレオチド配列又はこれと少なくとも９８．３％の同一性がある配列か、配列番号１の１３８９１ないし１５４８６番目のヌクレオチドにコード化されるタンパク質と少なくとも９８．３％の同一性がある配列を有するペントンタンパク質をコード化するヌクレオチド配列かと、
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を含む線維タンパク質をコード化するヌクレオチド配列又はこれと少なくとも９９．１％の同一性がある配列か、配列番号１の３２２９０ないし３３６２１番目のヌクレオチドにコード化されるタンパク質と少なくとも９９．１％の同一性がある配列を有する線維タンパク質をコード化するヌクレオチド配列かとからなるグループから選択される、１本以上のヌクレオチド配列をも含む場合がある。

本発明の第１の局面による核酸分子と相補的な配列を含む核酸分子は本発明の範囲内である。

本発明の第１の局面による核酸分子とだけ雑種形成する核酸分子も本発明に含まれる。したがって、雑種形成に用いられる条件は、かかる核酸配列だけが雑種形成しつづけるのに十分にストリンジェントでえある。当業者はかかる条件を容易に決定できるであろう。

前記核酸は、ｃＤＮＡを含むＤＮＡか、ｍＲＮＡを含むＲＮＡか、ＰＫＡ（ペプチド核酸）か、これらの混合物かの場合がある。

表１は、本明細書に開示される野生型ＡｄＹ２５の概要を示す。

前記ゲノム配列データは、サルＡｄＹ２５がヒトグループＥアデノウイルスと近縁関係にあるとの以前の血清学的研究（Ｒ． Ｗｉｇａｎｄら、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ３０； １ １９８９）を確認した。異なるアデノウイルス血清型由来のヘクソン及び線維タンパク質のアミノ酸配列のアライメントが、図１の系統樹を作成するために用いられた。これらは主要表面露出カプシド成分で、ベクター親和性の主たる決定因子であると信じられている。異なるアデノウイルス種の全ゲノムヌクレオチド配列のアライメントが図２の系統樹を作成するために用いられた。ゲノム及び線維タンパク質はＡｄＹ２５をグループＥアデノウイルスとアライメントした。しかし、ヘクソンタンパク質はＡｄＹ２５をグループＤアデノウイルスとアライメントした。

当業者の便宜のためだけに、クローン化されたチンパンジーアデノウイルスＹ２５（ｐＢＡＣｅ３．６ Ｙ２５、細胞株名Ｙ２５）を含む細菌人工染色体（ＢＡＣｓ）を含む大腸菌株ＤＨ１０ＢのサンプルがＩｓｉｓ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ社により、ブダペスト条約の下、欧州細胞培養コレクション（ＥＣＡＣＣ、the Health Protection Agency Culture Collections、Health Protection Agency、Porton Down、Salisbury SP4 0JG、United Kingdom）に２０１２年５月２４日付けで寄託され、仮アクセッション番号１２０５２４０１を付与された。

前記ＢＡＣを含む大腸菌はクラスＩ遺伝子改変生物である。大腸菌株ＤＨ１０Ｂの遺伝子型は、F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 endA1 recA1 deoR Δ(ara,leu)7697 araD139 galU galK nupG rpsL λ-である。チンパンジーアデノウイルスＹ２５は、ウイルスＤＮＡポリメラーゼのヌクレオチド配列にもとづいてヒトアデノウイルスＥの種内に暫定的に分類される。

前記ＢＡＣは細菌内で複製中に増殖し、クロラムフェニコールを用いる選択によって維持できる。前記ゲノムがクローン化されたＢＡＣを含む大腸菌株ＤＨ１０Ｂは、１２．５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含む３７℃のＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉブロス又は寒天培地中で増殖できる。

前記ウイルスゲノムのＢＡＣクローンのウイルスへの変換（レスキュー）は、以下のステップにより実行される場合がある。大腸菌宿主は増殖され、ＢＡＣのＤＮＡが標準的な方法により細菌から精製される。前記ＤＮＡは制限エンドヌクレアーゼＰｍｅＩで線状化され、ヒトアデノウイルスの増殖を補助するいずれかの細胞株（例えばＡ５４９）にトランスフェクションされる。その後、得られたアデノウイルスは増殖され、例えばワクチンとして使用されるために精製される。これらの試薬及び細胞の全ては公に入手可能である。前記寄託株がレスキューされる場合には、得られるウイルスは野生型アデノウイルスである。

かかる行為が可能な全ての指定国に関し、該指定国の法律の下で許容される範囲内で、関連する特許法制、例えば、ＥＰＣ規則３２（１）と、英国特許２００７規則１３（１）及びスケジュール１と、豪州特許規則３．２５（３）と、その他いずれかの指定国について準用されるほぼ同様の規定とにしたがい、寄託された材料のサンプルが独立の専門家への交付によってのみ利用可能となるように要求される。

さらに、当業者の便宜のためだけに、チンパンジーアデノウイルスＹ２５のＥ１領域の欠失を伴うクローン化ゲノムを含む細菌人工染色体（ＢＡＣｓ）を含む大腸菌ＤＨ１０Ｂ株（ｐＢＡＣｅ３．６ Ｙ２５ｄｅｌＥ１、細胞株名Ｙ２５ｄｅｌＥ１）のサンプルがＩｓｉｓ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ社により、ブダペスト条約の下、欧州細胞培養コレクション（ＥＣＡＣＣ、the Health Protection Agency Culture Collections、Health Protection Agency、Porton Down、Salisbury SP4 0JG、United Kingdom）に２０１２年５月２４日付けで寄託され、仮アクセッション番号１２０５２４０２を付与された。

前記ＢＡＣを含む大腸菌はクラスＩ遺伝子改変生物である。大腸菌株ＤＨ１０Ｂの遺伝子型は、Ｆ− ｍｃｒＡ Δ（ｍｒｒ−ｈｓｄＲＭＳ−ｍｃｒＢＣ） Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５ ΔｌａｃＸ７４ ｅｎｄＡ１ ｒｅｃＡ１ ｄｅｏＲ Δ（ａｒａ，ｌｅｕ）７６９７ ａｒａＤ１３９ ｇａｌＵ ｇａｌＫ ｎｕｐＧ ｒｐｓＬ λ−である。チンパンジーアデノウイルスＹ２５は、ウイルスＤＮＡポリメラーゼのヌクレオチド配列にもとづいて、ヒトアデノウイルスＥの種内に暫定的に分類される。

前記ＢＡＣは細菌内で複製中に増殖し、クロラムフェニコールを用いる選択により維持できる。前記ゲノムがクローン化される細菌人工染色体を含む大腸菌株ＤＨ１０Ｂは１２．５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含む３７℃のＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉブロス又は寒天中でクローン化され、増殖される場合がある。

前記ウイルスゲノムのＢＡＣクローンのウイルスへの変換（レスキュー）は、以下のステップにより実行される場合がある。大腸菌宿主は増殖され、ＢＡＣのＤＮＡが標準的な方法により細菌から精製される。前記ＤＮＡは制限エンドヌクレアーゼＰｍｅＩで線状化され、ＨＥＫ２９３細胞（又は同様のＥ１を相補する細胞株）にトランスフェクションされる。その後、得られたアデノウイルスは増殖され、例えばワクチンとして使用されるために精製される。これらの試薬及び細胞の全ては公に入手可能である。前記寄託株がレスキューされる場合には、得られるウイルスはクラスＩ遺伝子改変生物である。

かかる行為が可能な全ての指定国に関し、該指定国の法律の下で許容される範囲内で、関連する特許法制、例えば、ＥＰＣ規則３２（１）と、英国特許２００７規則１３（１）及びスケジュール１と、豪州特許規則３．２５（３）と、その他いずれかの指定国について準用されるほぼ同様の規定とにしたがい、寄託された材料のサンプルが独立の専門家への交付によってのみ利用可能となるように要求される。

本発明の第１の局面の具体的な実施態様は、ＡｄＹ２５と本明細書でよばれるチンパンジーアデノウイルスの全ゲノム配列を提供し、該ゲノム配列は、Ｉｓｉｓ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ社により、ブダペスト条約の下、欧州細胞培養コレクション（ＥＣＡＣＣ、the Health Protection Agency Culture Collections、Health Protection Agency、Porton Down、Salisbury SP4 0JG、United Kingdom）に２０１２年５月２４日付けで寄託され、仮アクセッション番号１２０５２４０１を付与された、大腸菌株ＤＨ１０Ｂ中のＢＡＣ中のゲノム配列か、Ｉｓｉｓ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ社により、ブダペスト条約の下、欧州細胞培養コレクション（ＥＣＡＣＣ、the Health Protection Agency Culture Collections、Health Protection Agency、Porton Down、Salisbury SP4 0JG、United Kingdom）に２０１２年５月２４日付けで寄託され、仮アクセッション番号１２０５２４０２を付与された、大腸菌株ＤＨ１０Ｂ中のＢＡＣ中のゲノム配列かを含むか、あるいは、からなる。

本発明の発明者は、新たに配列決定されたＡｄＹ２５系ウイルスベクターが非常に効果的な場合があることを発見した。したがって、本発明の第２の局面は、チンパンジーアデノウイルスＹ２５由来のカプシドを含むアデノウイルスベクターを提供し、該カプシドは、動物細胞内での翻訳、転写及び／又は発現を制御する発現制御配列と、アデノウイルスパッケージングシグナル配列とに動作可能に連結された、関心のある外来ヌクレオチド配列を内包する。

本明細書で用いられるところの文言「ウイルスベクター」は、組換えＤＮＡを含む遺伝物質を形質導入又は非生産的感染により宿主細胞又は宿主生物に導入可能な、組換えウイルス又はその誘導体を指す。例えば、本発明のベクターは、遺伝子送達ベクター、ワクチンベクター、アンチセンス送達ベクター又は遺伝子治療ベクターの場合がある。

本明細書で用いられるところの「ＡｄＹ２５」及び「Ｙ２５」は、チンパンジーアデノウイルスＹ２５か、これに由来するベクター又はこれを利用するベクターかを指す。野生型ウイルスへの改変を示すために省略形の用語が用いられる。例えば、「ΔＥ１」はＥ１遺伝子座の欠失又は機能的欠失を示す。文言「Ａｄ５Ｅ４Ｏｒｆ６」は、当該ウイルスベクターがＡｄ５ウイルスからの異種Ｅ４オープン・リーディング・フレーム６を含むことを示す。

本発明のベクターは、チンパンジーアデノウイルスＹ２５由来のカプシドを含む。該カプシドは、ペントンタンパク質、ヘクソンタンパク質、線維タンパク質及び／又は足場タンパク質を含む、原種又は野生型のＡｄＹ２５カプシドタンパク質を含むことが好ましい。しかし、ベクター親和性の不利な変更を伴うことなく前記カプシドタンパク質に小さな改変を行うことが可能であることを当業者は容易に理解するであろう。具体的な好ましい実施態様では、前記ベクターカプシドは、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列又はこれと実質的に同一な配列を含むヘクソンタンパク質と、
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列又はこれと実質的に同一な配列を含むペントンタンパク質と、
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列又はこれと実質的に同一な配列を含む線維タンパク質とからなるグループから選択される１種類以上のカプシドタンパク質を含む。

当業者は、本発明が本明細書に実施例として示される特定のアミノ酸配列の変異体を含む場合があることを理解するであろう。特に好ましいのは、親タンパク質のアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列を有し、１個以上のアミノ酸残基が、いずれかの組合せで置換、欠失又は付加される変異体である。特に好ましいのは、本発明のタンパク質の特性及び活性を変化させない、サイレントな置換、付加及び欠失である。さまざまなアミノ酸が類似の特性を有し、ある物質の１個以上のかかるアミノ酸が、その物質の望ましい活性を失うことなく、１個以上のかかるアミノ酸によって置換できることがしばしばある。したがって、アミノ酸グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンは、互いに（脂肪族側鎖を有するアミノ酸）置換できることがしばしばある。これらの可能な置換のうち、グリシン及びアラニンは、（疎水性の比較的大きな脂肪族側鎖を有するため）互いに置換するために用いられることが好ましい。互いにしばしば置換可能な他のアミノ酸は、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）と、リジン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）と、局面及びグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）と、アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）と、システイン及びメチオニン（含硫側鎖を含むアミノ酸）と含む。変異体は、天然に存在する変異体と、人工的な変異体とを含む。人工的な変異体は、核酸分子、細胞又は生物に適用される突然変異生成技術を含む突然変異生成技術を用いて作成される場合がある。

本明細書で用いられるところでは、「実質的な同一性」があるアミノ酸配列は、該配列と少なくとも８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％，９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％又は９９．９％の同一性を有することが好ましい。「実質的な同一性」という用語は、当該配列が、先行技術のアミノ酸配列との同一性よりも本明細書に説明される配列のいずれかとの同一性のほうがより大きいことを示すことが望ましい。

アミノ酸配列を比較するために、ＣＬＵＳＴＡＬプログラムのようなプログラムが使用できる。このプログラムは、アミノ酸配列を比較して、いずれかの配列に適宜スペースを挿入することにより最適なアライメントを見つける。最適なアライメントについて、アミノ酸の同一性又は類似性（同一性に加えてアミノ酸タイプの変換）を計算することが可能である。ＢＬＡＳＴｘのようなプログラムは、類似配列の最長ストレッチをアライメントして、前記適合に対する数値を割り当てる。したがって、複数の類似領域が見つかり、該類似領域のそれぞれが異なるスコアを有する比較を得ることが可能である。上記は、本出願に開示される全てのアミノ酸配列に準用された。

好ましくは、ヘクソンタンパク質は配列番号２と少なくとも９８．２％の同一性があるアミノ酸配列を含む。好ましくは、ペントンタンパク質は配列番号３と少なくとも９８．３％の同一性があるアミノ酸配列を含む。好ましくは、線維タンパク質は配列番号４と少なくとも９９．１％の同一性があるアミノ酸配列を含む。

ＡｄＹ２５のヘクソン、ペントン及び線維タンパク質のヌクレオチド配列は、配列番号１の１８３０２ないし２１１３０番目のヌクレオチド（ヘクソンタンパク質）と、配列番号１の１３８９１ないし１５４８６番目のヌクレオチド（ペントンタンパク質）と、配列番号１の３２２９０ないし３３６２１番目のヌクレオチド（線維タンパク質）とに列挙される。ベクターのカプシドは、これらのヌクレオチド配列又はこれらと実質的に同一な配列にコード化される１種類以上のＡｄＹ２５カプシドタンパク質を含む場合がある。

本発明の第２の局面によるベクターは、上記に説明されるとおりのヘクソン、ペントン及び線維タンパク質のうち１つか、前記タンパク質のうち２つのいずれかの組合せか、前記タンパク質３つ全てかを含む場合がある。

本発明のベクターは核酸分子も含む。最低限、前記核酸分子は、動物細胞内での翻訳、転写及び／又は発現を制御する発現制御配列と、アデノウイルスパッケージングシグナル配列とに動作可能に連結された、関心のある外来ヌクレオチド配列を含む。

前記外来ヌクレオチド配列は関心のある分子をコード化することが好ましい。前記関心のある分子は、関心のあるタンパク質、ポリペプチド又は核酸分子の場合がある。前記外来ヌクレオチド配列は、関心のある分子の１種類以上か、２種類以上か、３種類以上かをコード化する場合がある。

関心のあるタンパク質及びポリペプチドは、抗原、分子アジュバント、免疫刺激性タンパク質及びリコンビナーゼを含む。

関心のあるタンパク質又はポリペプチドは抗原であることが好ましい。１つの実施態様では、前記抗原は、病原体由来抗原である。前記病原体は、細菌、ウイルス、プリオン、菌類、原生生物及び寄生蠕虫からなるグループから選択されることが好ましい。前記抗原は、結核菌、プラスモジウム属種、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ、Ｃ型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトパピローマウイルス、マラリア寄生虫、レッシュマニア寄生虫又はいずれかの抗酸菌からなるグループに由来することが好ましい。好ましい抗原は、プラスモジウム属由来のＴＲＡＰ、ＭＳＰ−１、ＡＭＡ−１及びＣＳＰと、インフルエンザウイルス抗原と、結核菌由来のＥＳＡＴ６、ＴＢ１０．４ ８５Ａ及び８５Ｂ抗原を含む。特に好ましい抗原は、結核菌由来Ａｇ８５Ａと、インフルエンザＡ型ウイルス由来核タンパク質（ＮＰ）及びマトリックスタンパク質１（Ｍ１）とを含む。

代替的な実施態様では、前記抗原は自己抗原である。適当な自己抗原は、免疫系が主要細胞と他の細胞タイプとを区別できるように腫瘍細胞によって発現される抗原を含む。適当な自己抗原は、当該細胞タイプ及び／又はその環境については不適当な抗原か、あるいは、正常では当該生物の発生過程でだけ存在する抗原（例えば胎児抗原）かのいずれかである抗原を含む。例えば、ＧＤ２は正常では神経細胞の外表膜にのみ顕著なレベルで発現され、その免疫系への曝露は脳−血液関門によって制限される。しかしＧＤ２は、小細胞がん、神経芽腫、メラノーマ及び骨肉腫を含む広範な腫瘍細胞の表面に発現する。他の適当な自己抗原は、腫瘍細胞に見つかるが、健康な細胞の表面にはほとんどないか、存在しない、細胞表面レセプターを含む。かかるレセプターは、腫瘍細胞の調節のない増殖及び分裂をもたらす細胞シグナル伝達経路の活性化を起こす責任がある場合がある。例えば、ＥｒｂＢ２は、乳がん腫瘍細胞表面に異常に高いレベルで産生される。前記自己抗原は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を含むことが好ましい。

本明細書で用いられるところの用語「抗原」は、抗原由来の１つ以上のエピトープを含み、親抗原と、その断片及び変異体とを含む。これらの断片及び変異体は、親抗原と実質的に同一の生物学的活性又は機能を保持する。これらは、親抗原の抗原性及び／又は免疫原性を保持又は改善することが好ましい。一般に、「抗原性を有する」とは、当該タンパク質又はポリペプチドが抗体又はＴ細胞を産生するのに使用できるか、被検者の体内で抗体又はＴ細胞の産生を誘導できることを意味するようにとられる。「免疫原性を有する」とは、当該タンパク質又はポリペプチドが、強力で、好ましくは、保護的な免疫応答を被検者誘発できることを意味するようにとられる。したがって、後者の場合には、前記タンパク質又はポリペプチドは、抗体応答と、抗体を利用しない免疫応答とを発生できる場合がある。

好ましくは、前記抗原の断片は、親抗原の配列から少なくともｎ個の連続したアミノ酸を含み、ここでｎは、少なくとも、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５７、５８、５９、６０、７０、８０、又は１００か、あるいは、これらを超えるかである。前記断片は、親抗原由来の１つ以上のエピトープ領域を含むことが好ましい。実際、前記断片は、親抗原由来のあるエピトープを含むか、あるいは、からなる場合がある。代替的には、前記断片は、これらの抗原性／免疫原性の特性を保持するために、かかる領域との類似性が十分な場合がある。

本発明の抗原は、親抗原の誘導体、類縁体、相同体又は機能的均等物のような変異体を含む。特に好ましいのは、親抗原のアミノ酸配列と類似するアミノ酸配列を有する誘導体、類縁体、相同体又は機能的均等物で、１個以上のアミノ酸残基がいずれかの組合せで置換、欠失又は付加される。これらの変異体は親抗原と共通の抗原決定基又はエピトープを保持することが好ましい。

前記誘導体、類縁体、相同体及び機能的均等物が、親抗原のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有することが好ましい。

外来性ヌクレオチド配列は２個以上の抗原をコード化する場合がある。ウイルスベクターは、前記１個以上の抗原の遺伝子をエピトープの連鎖として発現するように設計される場合がある。複数のエピトープの連鎖の中のエピトープは、不必要な核酸及び／又はアミノ酸物質が回避されるように、介在配列なしに連結されることが好ましい。前記エピトープの連鎖の作製は、エピトープの連鎖のアミノ酸配列コード化し、前記１個以上のエピトープをコード化するＤＮＡが同一の読み枠になる、前記組換えＤＮＡコンストラクトを用いて達成されることが好ましい。実施例に示される抗原のＴＩＰｅＧＦＰは、Ｅ６ＦＰ、ＳＩＶ−ｇａｇ、ＰｙＣＤ３及びＰｙ３のエピトープを含むエピトープ連鎖を含む。代替的には、前記抗原は別々のポリペプチドとして発現される。

前記抗原又は抗原遺伝子の１個以上がＣ末端及び／又はＮ末端で切り取られる場合がある。これは、ベクター化されたワクチンのクローン化及び構築を容易にする、及び／又は、前記抗原の免疫原性又は抗原性を増強する場合がある。切り取る方法は当業者に知られているであろう。例えば、さまざまな遺伝子工学の周知技術が、前記抗原遺伝子のいずれかの端のコード化核酸配列を選択的に欠失するために用いられ、その後、所望のコード化配列を前記ウイルスベクター内に挿入する場合がある。例えば、コード化する核酸の３’末端及び／又は５’末端を選択的に分解させるために、それぞれ、３’及び／又は５’エキソヌクレアーゼ戦略を用いて、候補タンパク質の切り取りが行われる。前記野生型遺伝子配列は、親抗原に対して、発現される抗原が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上切り取られるようにことが好ましい。前記抗原遺伝子は、野生型抗原に対してＣ末端で１０−２０個のアミノ酸が切り取られることが好ましい。前記抗原遺伝子が野生型抗原に対して１３−１８個のアミノ酸が切り取られることがより好ましく、１５個のアミノ酸が切り取られることが最も好ましい。Ａｇ８５Ａ抗原がこのやり方でＣ末端で切り取られることが好ましい。

前記抗原遺伝子の１個以上がリーダー配列を含む場合もある。前記リーダー配列は、ｍＲＮＡの１次転写物のプロセッシング、翻訳効率、ｍＲＮＡ安定性に影響を与える場合があり、前記抗原の発現及び／又は免疫原性を増強する場合がある。前記リーダー配列は組織型プラスミノゲン・アクチベーター（ｔＰＡ）であることが好ましい。前記ｔＰＡリーダー配列は、前記１個以上の抗原に対してＮ末端に配置されることが好ましい。

前記ｔＰＡリーダー配列のようなリーダー配列は、ペプチドリンカーを介して前記抗原の配列に連結される場合がある。ペプチドリンカーは、一般的にアミノ酸２から約５０個の長さで、融合タンパク質のドメイン折り畳みと干渉する２次構造を形成しないことを条件として、いかなる配列を有してもよい。

前記抗原遺伝子の１個以上が、前記挿入された遺伝子配列の発現産物の検出を容易にするために、緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のようなマーカーを含む場合がある。

前記抗原遺伝子の１個以上は、翻訳されると前記抗原に共有結合で連結されるタグポリペプチドをコード化する核酸配列を含む場合がある。前記タグポリペプチドは、ＰＫタグ、ＦＬＡＧタグ、ＭＹＣタグ、ポリヒスチジンタグ又はモノクローナル抗体により検出可能ないずれかのタグからなるグループから選択されることが好ましい。前記タグポリペプチドをコード化する核酸配列は、翻訳後、該タグが発現された抗原のＣ末端又はＮ末端に位置するか、前記発現した抗原より内側の場合かになるように、配置される場合がある。前記タグは前記発現した抗原のＣ末端に配置されることが好ましい。好ましい実施態様では、前記抗原遺伝子の１個以上がＰＫタグをコード化する。このタイプのタグは、抗原発現及び該抗原を発現するクローンの検出を容易にする、及び／又は、前記抗原の免疫原性又は抗原性を増強する場合がある。

タグポリペプチドが用いられる場合には、該タグポリペプチドをコード化する核酸と、発現させられる抗原をコード化する核酸との間にリンカー配列が挿入されることが好ましい。代表的なリンカーは、ＩＰＮＰＬＬＧＬＤ（配列番号４９）である。

代替的な実施態様では、前記関心のある外来配列はタンパク質をコード化しない場合がある。例えば、前記外来ヌクレオチド配列は、ｍｉＲＮＡ又は免疫刺激的ＲＮＡ配列の場合がある。

アデノウイルスベクターは、１種類以上の外来ヌクレオチド配列、例えば、１、２又は３種類以上の外来ヌクレオチド配列を含む場合がある。各外来ヌクレオチド配列が外来遺伝子の実施態様であることが好ましい。前記外来遺伝子の実施態様である外来ヌクレオチド配列は、遺伝子か、該遺伝子の機能的部分かの場合がある。前記アデノウイルスベクターは、関心のある単一分子をコード化する１本のヌクレオチド配列を含む場合がある。代替的には、前記アデノウイルスベクターは、２個以上の関心のある分子をコード化する、１本のヌクレオチド配列又は２本以上のヌクレオチド配列を含む場合がある。

前記外来ヌクレオチド配列は、他のアデノウイルス配列を含む核酸分子内に配置されることが好ましい。前記外来ヌクレオチド配列は、部分的又は完全に欠失したＡｄＹ２５遺伝子、例えば、Ｅ１欠失又はＥ３欠失の部位に挿入される場合がある。前記外来ヌクレオチド配列は、既存のＡｄＹ２５遺伝子領域に挿入され、該領域の機能を破壊する場合がある。代替的には、前記外来ヌクレオチド配列は、周囲の遺伝子の機能又は配列に変化を起こさないＡｄＹ２５ゲノムの領域に挿入される場合がある。

外来ヌクレオチド配列又は外来遺伝子は、該外来ヌクレオチド配列／外来遺伝子の宿主細胞、例えば、哺乳類細胞での翻訳、転写及び／又は発現を駆動するのに必要な調節配列と動作可能に連結されることが好ましい。本明細書で用いられるところの文言「動作可能に連結される」とは、調節配列が、調節する核酸配列と連続していることか、前記調節配列が、調節される核酸配列を制御するために、トランスで、又は、離れたところで作用することかを意味する。かかる調節配列は、転写開始、終結、エンハンサー及びプロモーター配列のような適切な発現制御配列と、スプライシング及びポリアデニル化シグナルのような効率的なＲＮＡプロセッシングシグナルと、翻訳効率及びタンパク質安定化を増強する配列と、タンパク質分泌を促進する配列とを含む。さらに前記調節配列は、外来遺伝子発現を抑制するための配列、例えば、細胞株での作製中にトランスアクチベーティングなレセプターの発現を抑制するための配列を含む場合がある。プロモーターその他の核酸の発現を制御する調節配列は同定されており、当業者に知られている。プロモーターは、ヒトＣＭＶプロモーター、サルＣＭＶプロモーター、ネズミＣＭＶプロモーター、ユビキチン、ＥＦ１プロモーター、カエルＥＦ１プロモーター、アクチンその他の哺乳類プロモーターからなるグループから選択されることが好ましい。最も好ましいのは、ヒトＣＭＶプロモーター、特に、ヒトＣＭＶ腫瘍極早期プロモーターである。

関心のある外来ヌクレオチド配列は、カセットの一部としてウイルスベクターに導入される場合がある。本明細書に用いられるところの用語「カセット」とは、少なくとも１本の発現されるべきヌクレオチド配列を、該ヌクレオチド配列の宿主細胞内での発現を可能にする、転写及び翻訳制御配列と、任意的に、該カセットの５’及び３’末端の制限酵素切断部位とを含む核酸分子を指す。前記制限エンドヌクレアーゼ部位のために、前記カセットは容易に挿入、除去又は他のカセットと置換することができる。カセットの交換は、該カセットが取り込まれるベクターによって異なる配列の発現をもたらすであろう。代替的には、当業者に知られるいずれかの方法、例えば、ＰＣＲ突然変異誘発、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）、組換えを介する遺伝子工学技術（ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ）、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）クローニング、部位特異的組換え又はトポイソメラーゼクローニングが、前記カセットの構築、改変又は誘導体化に用いられる場合がある。

発現制御配列は、複製及びビリオンのカプシド封入に必要なアデノウイルスの構成要素を含むのが好ましい。前記構成要素は外来ヌクレオチド配列を挟むことが好ましい。Ｙ２５ベクターは、複製開始点として機能するＹ２５の５’逆位末端繰り返し（ＩＴＲ）配列と、３’ＩＴＲ配列とを含むことが好ましい。

パッケージングシグナル配列はウイルスベクターの集合を支持する機能がある。

当業者は理解するであろうが、ウイルスベクターにカプシド封入可能な核酸分子の長さには最短及び最長の制約がある。したがって、必要な場合には、前記核酸分子は、「詰め物（ｓｔｕｆｆｉｎｇ）」、すなわち、最終的なベクターゲノムを所要のサイズに増量するための余分なヌクレオチド配列を含む場合がある。前記核酸分子は、野生型核酸分子の長さの約８０％ないし約１０８％であることを確保するために十分な「詰め物」を含むことが好ましい。

前記核酸分子は、ＡｄＹ２５ゲノム由来の１個以上の遺伝子又は遺伝子座を含む場合もある。野生型ＡｄＹ２５ゲノムは、主に調節的機能を有し、宿主細胞にウイルス複製の準備をさせる、４個の初期転写ユニット（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３及びＥ４）を含む。前記ゲノムは、ペントン（Ｌ２）、ヘクソン（Ｌ３）、足場タンパク質（Ｌ４）及び線維タンパク質（Ｌ５）を含む構造タンパク質をコード化し、単一のプロモーターの制御下にある、５個の後期転写ユニット（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５）をも含む。前記ゲノムの各端部は、ウイルス複製に必要な逆位末端繰り返し（ＩＴＲ）を含む。本発明のウイルスベクターは、外来ヌクレオチド配列が挿入された完全な原種ＡｄＹ２５ゲノムを含む場合があり、該完全な原種ＡｄＹ２５ゲノムに外来ヌクレオチド配列が挿入されている。しかし、当業者は、ウイルスベクターを作製するときには、原種ＡｄＹ２５ゲノムへのさまざまな改変が可能で、実際に望ましいことを理解するであろう。

ウイルスベクターを最適化するために、１個以上の原種ＡｄＹ２５遺伝子が、欠失、機能的欠失又は改変される場合がある。本明細書で用いられるところの文言「欠失」とは、ある遺伝子の完全な欠失を指し、「機能的欠失」はある遺伝子／遺伝子座の部分的欠失か、前記遺伝子／遺伝子座を発現するアデノウイルスの能力を破壊するか、あるいは、前記遺伝子の産物を機能しないようにする、フレーム・シフト突然変異のようななんらかのその他の改変かを指す。ＡｄＹ２５ゲノムは、挿入容量の増大、宿主細胞内での複製阻害、及び／又は、形質転換パッケージング細胞株内でのウイルスベクターの増殖及び収率の増大のために改変される場合がある。当業者は、初期又は後期遺伝子を何個でも機能的に欠失できることを理解するであろう。かかる改変されたウイルスベクターの複製は、欠失された遺伝子の相補体を含む形質転換細胞株内ではまだ可能であろう。例えば、複製及び集合に必要なウイルスタンパク質は、遺伝子操作されたパッケージング細胞株又はヘルパーウイルスによってトランス状態で提供できる。

したがって外来ヌクレオチド配列に加えて、本発明のベクターは、該外来ヌクレオチド配列が挿入された、最小のアデノウイルス配列か、特定の遺伝子の１カ所以上の欠失又は機能的欠失を有するアデノウイルスゲノムか、完全な原種アデノウイルスゲノムかを含む場合がある。

本発明のベクターは、原種Ｙ２５後期転写ユニット（Ｌ１−Ｌ５）、及び／又は、原種Ｙ２５逆位末端繰り返し（ＩＴＲ）又はこれと実質的に同一の配列を含むことが好ましい。原種Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５遺伝子座のアミノ酸配列と、対応核酸配列とは、上記表１に列挙されている。

１個以上の初期転写ユニットが、改変、欠失又は機能的欠失されることが好ましい。

１つの実施態様では、ウイルスベクターは複製不能又は複製不全である。本明細書で用いられるところの用語「複製不能」又は「複製不全」とは、正常哺乳類細胞、好ましくは、正常ヒト細胞の大多数において、なんら有意な程度に複製する能力がないことを意味する。前記ウイルスベクターは、生産的感染又は疾病をヒト患者に起こすことができないことが好ましい。しかし、ウイルスベクターは免疫応答を刺激できることが好ましい。複製不能又は複製不全なウイルスは、自然界でそのようになってきた場合がある、すなわち、該ウイルスは自然界からそのようなものとして単離される場合がある。代替的には、前記ウイルスは、例えば試験管内育種又は遺伝子操作により、人工的に複製不能又は複製不全にさせられる場合がある。例えば、複製に重要な遺伝子は機能的に欠失されてもかまわない。ウイルス複製に必須の単一の転写ユニットの機能的欠失によってアデノウイルス複製が不能にされることが好ましい。Ｅ１遺伝子／遺伝子座が欠失又は機能的欠失されることが好ましい。Ｅ１遺伝子／遺伝子座は異種外来遺伝子、例えば、関心のあるタンパク質又はポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列又は発現カセットで置換される場合がある。

野生型ＡｄＹ２５のＥ１アミノ酸配列及び対応する核酸配列は、上記表１に列挙される。

本明細書で説明されるとおり、組換えアデノウイルスは、細菌人工染色体（ＢＡＣ）中でＡｄＹ２５の分子クローンを作製することにより作られる場合があり、ＡｄＹ２５ウイルスＤＮＡと、実施例１で説明される線状ＢＡＣ「レスキューベクター」との間での相同組換えの際同時にＥ１を欠失できるように、アデノウイルスＥ１領域の下流にもう１つの相同挟み込み領域（ｆｌａｎｋ）を含むことにより、Ｅ１遺伝子座が欠失されることが好ましい。

本発明によるウイルスベクターは、外来遺伝子か、外来ヌクレオチド配列を含むカセットかを１個以上挿入できるように、１個以上の組換え部位を含むことが好ましい。前記組換え部位は、ラムダファージの部位特異的組換え部位を含むことが好ましい。これらの組換え部位は、いずれの適当な遺伝子座に導入されてもかまわないが、アデノＥ１遺伝子座に導入されるのが好ましい。したがって、前記複製不能又は複製不全ベクターは、関心のあるタンパク質又はポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列でＥ１遺伝子を置換することにより調製される場合がある。実施例１に説明されるとおり、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＧａｔｅｗａｙ（登録商標）デスチネーションカセットの一部として、組換え部位ａｔｔＲ１及びａｔｔＲ２がアデノＥ１遺伝子座に導入されることが好ましい。

ベクターはアデノウイルスＥ３遺伝子／遺伝子座が欠失していることが好ましい。アデノウイルスＥ３領域の欠失は、新規ベクターのインサート容量を約５ｋｂ増大させる。Ｅ３の欠失は、この領域がウイルス複製に必要ではないので、パッケージング細胞株でトランス状態で提供される必要がないため、ウイルスベクターの収率にほとんど影響がない。Ｅ３遺伝子座は、実施例２に説明されるとおり、ＧａｌＫ組換えを介する遺伝子工学技術を用いて欠失される場合がある。

野生型ＡｄＹ２５のＥ３アミノ酸配列と、対応する核酸配列とは、上記表１に列挙される。

本発明の特に好ましい実施態様では、Ｅ１及びＥ３遺伝子座がＡｄＹ２５ゲノムから欠失される。

本発明のベクターは原種Ｅ２遺伝子座を含むことが好ましい。Ｅ２は、ポリメラーゼ、ＰＴＰ及びＩＶａ２タンパク質をコード化するオープン・リーディング・フレームを含む転写ユニットである。野生型ＡｄＹ２５のＥ４５アミノ酸配列と、対応するヌクレオチド配列は上記表１に列挙される。本発明のベクターは、Ｅ２又はこれと実質的に同一の配列をコード化するヌクレオチド配列を含むことが好ましい。

上記で説明したとおり、本発明のウイルスベクターは、ウイルス複製に必要ないずれかの欠失された遺伝子の相補体を含む遺伝子操作された細胞株内で産生される場合がある。しかし、本発明によるウイルスベクターの複製は、他の血清型の複製を促進するように設計された細胞内では最適とはいえない場合がある。例えば図３−Ａに示すとおり、野生型Ｅ４遺伝子座を含む第１世代のＡｄＹ２５系ベクターは、ＨＥＫ２９３細胞での増殖が非効率的で、収率が比較可能なＡｄＨｕ５系ベクターより約２桁低いことがわかった。収率が低いことは、（ＡｄＨｕ５ウイルスの増殖を補助するように設計された）細胞で発現するＥ１タンパク質と、ベクターにコード化されるＥ４遺伝子産物との間の相互作用が最適でなかったことが原因であるとの仮説が立てられる。したがって、本発明のアデノウイルスベクターは、本発明のアデノウイルスベクターで機能的に欠失される遺伝子を発現する、ＨＥＫ２９３のような形質転換細胞株でのベクター増殖及び収率を最適化するために設計された１つ以上の改変をさらに含むことが好ましい。

１つの実施態様では、原種Ｅ４領域は、その全体が他の血清型由来の異種Ｅ４領域で置換される場合があり、該異種Ｅ４領域は形質転換細胞株内でのベクター収率及び増殖を増大させることが好ましい。例えば、原種Ｅ４領域は、ＨＥＫ２９３におけるベクター収率及び増殖を増大させるためにＡｄＨｕ５由来のＥ４領域で置換される場合がある。

アデノウイルスＥ４領域は、少なくとも６個のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦｓ又はＯｒｆｓ）を含む。したがって、代替的な実施態様では、Ｅ４領域の１個以上のＯＲＦｓが、他の血清型のアデノウイルスのＥ４領域由来の１個以上の異種ＯＲＦｓと置換される場合があり、該異種ＯＲＦ（ｓ）は形質転換細胞株でのベクターの収率及び増殖を増大させることが好ましい。前記Ｅ４領域の１、２、３、４、５又は６個のＯＲＦｓが、他の血清型、例えば、ＡｄＨｕ５由来の１、２、３、４、５又は６個の異種ＯＲＦｓで置換される場合がある。

ＨＥＫ２９３細胞でのウイルス複製に特に重要なものは、後期ウイルスｍＲＮＡスプライシング及びウイルスｍＲＮＡの選択的輸送と、ウイルスＤＮＡ合成と、アポトーシス阻害とへの関与が推定される多機能タンパク質である、Ｅ４Ｏｒｆ６の遺伝子産物である。Ｅ４Ｏｒｆ６と、細胞が発現するＥ１Ｂ−５５Ｋとの相互作用が最適でないことが、ＨＥＫ２９３細胞におけるＡｄＣｈＯＸ１の収率を低下させると信じられている。したがって、原種Ｅ４Ｏｒｆ６領域が異種Ｅ４Ｏｒｆ６領域で置換されてもよい。例えば実施例３に説明されるように、原種Ｅ４遺伝子座全体がＡｄＨｕ５由来のＥ４Ｏｒｆ６で置換される場合がある。ＡｄＨｕ５由来のＥ４Ｏｒｆ６のアミノ酸配列は配列番号４０に列挙される。対応するヌクレオチド配列は、配列番号３８の２８２４８ないし２９１３２番目のヌクレオチドである。１つの実施態様では本発明のベクターは、ＡｄＨｕ５Ｅ４Ｏｒｆ６のヌクレオチド配列又はこれと実質的に同一の配列を含む。実施例３に説明され、図３−Ａに示されるとおり、この改変はウイルス収率及び増殖を改善することがわかった。

好ましい実施態様では、Ｅ４領域の２個以上のＯＲＦが他の血清型のＥ４領域由来の２個以上の異種ＯＲＦで置換される。例えば、原種のＥ４Ｏｒｆ４、Ｅ４Ｏｒｆ６及びＥ４Ｏｒｆ７が、ＳｄＨｕ５由来のＥ４Ｏｒｆ４、Ｅ４Ｏｒｆ６及びＥ４Ｏｒｆ６／７で置換される場合がある。特に好ましい実施態様では、組換えＥ４領域は、ＡｄＹ２５由来のＥ４Ｏｒｆ１、Ｅ４Ｏｒｆ２及びＥ４Ｏｒｆ３コーディング領域と、ＡｄＨｕ５由来のＥ４Ｏｒｆ４、Ｅ４Ｏｒｆ６及びＥ４Ｏｒｆ６／７とを含む。ＡｄＨｕ５由来のＥ４Ｏｒｆ４のアミノ酸配列は配列番号４１に列挙される。対応するヌクレオチド配列は配列番号３８の２９０５３ないし２９３９７番目のヌクレオチドに列挙される。ＡｄＨｕ５由来のＥ４Ｏｒｆ６のアミノ酸配列は配列番号４０に列挙される。対応するヌクレオチド配列は配列番号３８の２８２４８ないし２９１３２番目のヌクレオチドに列挙される。ＡｄＨｕ５由来のＥ４Ｏｒｆ６／７のアミノ酸配列は配列番号３９に列挙される。対応するヌクレオチド配列は配列番号３８の２８９５９ないし２９１３２番目と、２７９６９ないし２８２４７番目とのヌクレオチドに列挙される。１つの実施態様では、本発明のベクターは、ＡｄＨｕ５ Ｅ４Ｏｒｆ４、Ｅ４Ｏｒｆ６及びＥ４Ｏｒｆ６／７のヌクレオチド配列又はこれと実質的に同一な配列を含む。

本発明の特に好ましい実施態様では、本発明のウイルスベクターのゲノムは、アデノウイルスＥ１及びＥ３領域をコード化するヌクレオチド配列が欠けており、原種のＥ４遺伝子座は、ＡｄＨｕ５由来のＥ４Ｏｒｆ４、Ｅ４Ｏｒｆ６及びＥ４Ｏｒｆ６／７のコーディング領域と、ＡｄＹ２５由来のＥ４Ｏｒｆ１、Ｅ４Ｏｒｆ２及びＥ４Ｏｒｆ３のコーディング領域とで置換される。この特に好ましい実施態様は、本明細書では「ＣｈＡｄＯＸ１」又は「ＡｄＣｈＯＸ１」を交換可能なように指す。実施例３で説明され、図３−Ａに示されるとおり、このやり方で前記ベクターを改変することは、驚くべきことに、ヘクソン産生速度及び前記ウイルスの増殖及び複製を増大させることがわかった。

ＣｈＡｄＯＸ１をコード化する代表的なヌクレオチド配列は配列番号３８に列挙される。この実施態様では、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ １９ｋＤａ及びＥ１Ｂ ５５ｋＤａは欠失され、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎカセット（配列番号３８の５９２ないし２５５０番目のヌクレオチド）で置換される。Ｅ３ ＣＲ１ａ１、Ｅ３ ｇｐ１９ｋＤａ、Ｅ３ ２２．３ｋＤａ、Ｅ３ ３１ｋＤａ、Ｅ３ １０．４ｋＤａ、Ｅ３ １５．２ｋＤａ及びＥ３ １４．７ｋＤａが欠失され、ＰａｃＩ部位（配列番号３８の２６２８６ないし２６２９３番目のヌクレオチド）で置換される。原種のＥ４領域は欠失され、ＡｄＨｕ５由来のＥ４Ｏｒｆ４、Ｅ４Ｏｒｆ６及びＥ４Ｏｒｆ６／７のコーディング領域で置換される。配列番号３８にコード化されるウイルスベクターは、多数の野生型ＡｄＹ２５タンパク質を含むが、そのヌクレオチド配列は以下の表２に示される。

本発明のウイルスベクターのゲノムは、配列番号３８のヌクレオチド配列又はその実質的に同一な配列を含み、これに関心のあるタンパク質をコード化する外来ヌクレオチド配列が挿入される。

実施例５に説明され、図５に示されるとおり、Ｅ４領域の改変はウイルスベクターの免疫原性にはほとんど影響がないことがわかったが、ウイルス増殖及び複製の速度を改善した。したがって、かかるＦ４の改変はウイルスベクターの産生速度を増強するために使うことができるが、該ベクターの免疫原性への負の影響はないであろう。

実施例４及び図４は、ＡｄＹ２５系ベクターＣｈＡｄＯＸ１によって誘発される免疫応答はロバストで、ＡｄＣｈ６３（ＣｈＡｄ６３としても知られる）及びＡｄＣｈ６８（ＡｄＣ６８、ＣｈＡｄ６８、Ｃ９又はＳＡｄＶ−２５としても知られる）によって誘発される免疫応答と比肩できる。しかし実施例７及び図７に説明されるとおり、ＣｈＡｄＯＸ１の液性免疫原性はＡｄＣｈ６８より優れていることがわかった。当業者は、Ｔ細胞応答と抗体応答とが互いに完全に相関すると予想するであろう。したがって、ＣｈＡｄＯＸ１に対する液性応答のほうが優れていることは驚くべきことである。

英国及びガンビア由来のヒト血清中のベクター中和抗体の有病率も、驚くべきことに、ＡｄＹ２５利用ベクターのほうが別のチンパンジーのアデノウイルスベクターのＡｄＣｈ６３よりもはるかに低いことがわかった（実施例６及び図６を参照せよ。）。ＡｄＹ２５系ベクターは、ヒトアデノウイルスにもとづくベクターとの比較だけでなく、チンパンジーのアデノウイルス系の他の既存のベクターとの比較でもヒト集団内での既存の免疫に遭遇することは少ないかもしれないことを。

このデータは示唆する。

実施例８と、図８−Ａ及び８−ＢとはＣｈＡｄＯＸ１が結核菌に対する免疫応答を誘導可能であることを実証し、実施例９及び図９はＣｈＡｄＯＸ１がインフルエンザＡに対する免疫応答を誘導できることを実証した。

本発明の第３の局面は、本発明の第２の局面のウイルスベクターを、任意的に、１種類以上の追加の活性成分、薬学的に許容される担体、希釈材、賦形剤又はアジュバントとの組合せで含む、医薬又は免疫原組成物を提供する。

前記組成物は、免疫原及び／又は抗原組成物であることが好ましい。本発明の免疫原及び／又は抗原組成物は、予防的（感染を防止するため）、曝露後（感染後発症前に治療するため）又は治療的（疾病を治療するため）の場合がある。前記組成物は予防的又は曝露後であることが好ましい。前記組成物はワクチンであることが好ましい。

前記免疫原組成物が予防的用途のとき、被験者は、乳児、幼児、小児又は少年少女であることが好ましい。前記免疫原組成物が治療用途のとき、被験者は成人であることが好ましい。

前記組成物は、抗炎症剤（例えば、ｐ３８阻害剤、グルタミン酸レセプター拮抗剤又はカルシウムチャンネル拮抗剤）、ＡＭＰＡレセプター拮抗剤、化学療法剤及び／又は抗増殖剤のような、１種類以上の追加の活性薬剤を含む場合がある。前記組成物は、１種類以上の抗菌化合物も含む場合がある。適当な抗菌化合物の例は、リファンピシン、イソニアジド、エタンブトール及びピリジンアミドのような抗結核化学療法薬を含む。

適当な担体及び／又は希釈剤は当業者に周知で、薬用デンプン、マンニトール、乳糖、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、ブドウ糖、ショ糖（又はその他の糖）、カルボン酸マグネシウム、ゼラチン、油、アルコール、界面活性剤、乳化剤又は水（好ましくは滅菌水）を含む。前記組成物は、混合して調剤された組成物の場合があり、あるいは、同時にか、別々にか、順番にか（投与を含む）使用のための併用調剤の場合かがある。

適当なアジュバントは当業者に周知で、不完全フロイントアジュバントと、完全フロイントアジュバントと、ＭＤＰ（ムラミルジペプチド）、ミョウバン（水酸化アルミニウム）、ミョウバン及び百日咳菌、及び、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭｓ、典型的には、Ｑｕｉｌ Ａを含むウイルスタンパク質のマトリックス）を含むフロイントアジュバントとを含む。

上記の適用症に用いるための本発明の組成物は、いずれかの便利な方法、例えば、（吸引を含む）経口、非経口、経粘膜（例えば、口腔、舌下、鼻内）、直腸又は経皮投与により投与される場合があり、該組成物は投与態様に従って適合される。

経口投与には、前記組成物は、液状又は固形製剤として、例えば、溶液、シロップ、懸濁液又は乳剤、錠剤、カプセル及びトローチとして製剤される場合がある。

液状製剤は、一般に、前記組成物の懸濁液又は溶液か、適当な水性又は非水性液体担体、例えば、水、エタノール、グリセリン、ポリエチレングリコール又は油の中に入った生理学的に許容される塩かからなるであろう。

錠剤状の組成物は、固形製剤を調合するためにルーティンに使用されるいずれかの適当な医薬担体を用いて調製される場合がある。かかる担体の例は、ステアリン酸マグネシウム、デンプン、乳糖、ショ糖及び微結晶性セルロースを含む。

カプセル状の組成物は、ルーティンなカプセル化手順を用いて調製される場合がある。例えば、活性成分を含む、粉末、顆粒又はペレットが標準的な担体を用いて調製され、硬いゼラチンカプセルに充填される場合があり、代替的には、いずれかの適当な医薬担体、例えば、水溶性ガム、セルロース、ケイ酸塩又は油を用いて分散体又は懸濁液が調製され、その後、該分散体又は懸濁液が柔らかいゼラチンカプセルに充填される場合がある。

経口投与用組成物は、例えば、錠剤又はカプセルの外側をコーティングすることによって、消化管を通過する際の分解に対して活性成分を保護するように設計される場合がある。

典型的な非経口組成物は、前記化合物又は生理学的に許容される塩の滅菌水性又は非水性担体か、非経口的に許容される油、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、レシチン、ラッカセイ油又はゴマ油かの溶液又は懸濁液からなる。代替的には、前記溶液は、凍結乾燥され、その後、投与直前に適当な溶媒で再構成される場合がある。

経鼻又は経口投与用組成物は、エアロゾル、ドロップ、ゲル及び粉末として便利に製剤される場合がある。エアロゾル製剤は、生理学的に許容される水性又は非水性溶媒中の活性物質の溶液又は微細懸濁液を含むのが典型的で、通常は、封止された容器に滅菌状態で単回又は複数回投与量で提供され、該容器は、噴霧器で使う用のカートリッジ又は詰め替えの形状をとる場合がある。代替的には、前記封止された容器は、単回投与経鼻吸引器か、容器の中身を使いきったら廃棄するつもりの、計測バルブが取り付けられたエアロゾルディスペンサーかのような単回分注装置の場合がある。投与形態がエアロゾルディスペンサーを含むときは、薬学的に許容される推進剤を含むであろう。エアロゾル投与形態は、ポンプ式噴霧器の形状をとる場合もある。

口腔又は舌下投与に適する組成物は、錠剤及びトローチ（ｌｏｚｅｎｇｅｓ ａｎｄ ｐａｓｔｉｌｌｅｓ）を含み、活性成分は糖及びアラビアゴム、トラガカントゴム、又は、ゼラチン及びグリセリンのような担体で製剤される。

直腸又は膣投与用組成物は、（ココアバターのような従来技術の座薬基剤を含む）座薬、膣錠、泡又は浣腸剤の形状であるのが便利である。

経皮投与に適する組成物は、軟膏と、ゲルと、パッチと、粉末注射を含む注射とを含む。

前記組成物は、錠剤、カプセル又はアンプルのような単位投与形状であることが便利である。

医薬品組成物は滅菌状態であることが好ましい。医薬品組成物は発熱物質を含まないことが好ましい。医薬品組成物は、ｐＨ６ないしｐＨ８の間、一般的には、ｐＨ７付近のｐＨに緩衝剤で調整されることが好ましい。前記組成物は実質的にヒトと等張であることが好ましい。

本発明の医薬品組成物は、免疫原又は医薬品として有効な量のウイルスベクターを患者に送達することが好ましい。本明細書に用いられるところの「免疫原又は医薬品として有効な量」とは、単回投与量又は一連の投与量のいずれかで個人にその量を投与することが、疾患又は症状の予防又は治療に有効であることを意味する。特にこの文言は、疾患又は症状の予防又は治療に有効な免疫応答を刺激するために十分な量の抗原が患者の細胞によって産生されるように、適当なタイムフレームにわたってウイルスベクターの十分な量が患者に送達されることを意味する。この量は、治療される個人の健康及び身体状態、年齢、当該個人の免疫系の能力、所望の保護の程度、ワクチンの処方、医学的状況についての医師の評価その他の関連する因子に応じて変化する。

一般に、医薬として有効な投与量は、ウイルス粒子１×１０^７ないし１×１０^１２個、好ましくは、１×１０^１０ないし１×１０^１１個を含む。

本発明の免疫原組成物は、１種類以上の他のウイルスベクター、好ましくは、他のアデノウイルスベクターをも含む場合がある。

本発明の第４の局面は、本発明の第２の局面のウイルスベクターか、本発明の第３の局面の免疫原組成物かの使用を提供する。特に第４の局面は、本発明のウイルスベクター又は免疫原組成物の医学における使用を提供する。

本局面は、ｉ）医学における使用のための本発明のウイルスベクター又は免疫原組成物と、ｉｉ）医学における使用のための薬剤の製造における本発明のウイルスベクター又は免疫原組成物の使用とを提供する。一部の代表的な医学的使用は以下にさらに詳しく説明される。

１つの実施態様では、本発明の第２の局面のウイルスベクターか、本発明の第３の局面の免疫原組成物かは、宿主細胞内に外来遺伝子を送達するために使用される場合がある。

この方法は、本発明の第２の局面のウイルスベクターか、本発明の第３の局面の免疫原組成物かを前記宿主細胞に投与するステップを含むことが好ましい。

前記宿主細胞は、好ましくは動物細胞で、より好ましくは哺乳類細胞である。好ましい哺乳類は、ニワトリ、その他の鳥類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、野生のイノシシ、バッファロー、バイソン、ウマ、ラクダ科動物、シカ、ゾウ、アナグマ、フクロネズミ、ネコ、ライオン、サル及びヒトを含む。宿主細胞は体細胞であることが好ましい。宿主細胞は、抗原提示樹状細胞、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、リンパ球、白血球、筋細胞及び線維芽細胞からなるグループから選択される場合がある。

この方法は、試験管内又は生体内で実施される場合がある。この方法が試験管内で実施される場合には、ウイルスベクターを用いる宿主細胞の形質導入又は非生産的感染が促進されるような適当な条件下で該宿主細胞に前記ウイルスベクター又は免疫原組成物が折衝される。この実施態様では、宿主細胞は、単離された宿主細胞か、動物被験体由来のサンプルかを含む場合がある。前記方法が生体内で実施されるとき、前記ウイルスベクター又は免疫原組成物は、動物被験体の１個以上の細胞の前記ウイルスベクターを用いる形質導入が促進されるように、前記被験体に投与されることが好ましい。前記ウイルスベクター又は免疫原組成物は、（吸引を含む）経口、非経口、経粘膜（例えば、口腔、舌下、経鼻）、経直腸又は経皮投与により被験体に投与されることが好ましい。

本発明のウイルスベクターを用いる前記宿主細胞の形質導入は、関心のある外来ヌクレオチド配列の該宿主細胞への安定的な送達をもたらすことが好ましい。

したがって、別の実施態様では、本発明の第２の局面のウイルスベクターか、本発明の第３の局面の免疫原組成物かは、動物において免疫応答を誘発するために使用される場合がある。この方法は、本発明の第２の局面のウイルスベクターか、本発明の第３の局面の免疫原組成物かを前記動物に投与するステップを含むことが好ましい。

関心のあるタンパク質又はポリペプチドが抗原のとき、動物における該タンパク質又はポリペプチドの発現はその抗原に対する１次免疫応答の誘発をもたらし、第２の遭遇、例えば、前記抗原が由来する病原体による感染の際には、増強された応答を提供するであろう免疫学的記憶の発生につながるであろう。

前記動物はナイーブな動物、すなわち、問題の病原体又は抗原にかつて曝露されたことのない動物であることが好ましい。

本発明のウイルスベクターか、本発明の免疫原組成物かは、動物に免疫応答を誘発するとともに、前記抗原にかつて曝露された動物の免疫応答をブーストするために用いられる場合がある。

したがって、さらなる実施態様では、本発明の第２の局面のウイルスベクターか、本発明の第３の局面の免疫原組成物かは、動物における免疫応答をブーストするために用いられる場合がある。この方法は、本発明の第２の局面のウイルスベクターか、本発明の第３の局面の免疫原組成物かを前記動物に投与するステップを含むことが好ましい。

動物被験体は問題の抗原にかつて曝露されている、あるいは、「プライムされている」ことが好ましい。例えば、前記被験体は、前記抗原を含む組成物でかつて接種又はワクチン処理されるか、該抗原が由来する病原体によってかつて感染されている場合がある。前記被験体は前記抗原が由来する病原体で潜伏感染している場合がある。

別の実施態様では、本発明の第２の局面のウイルスベクターか、本発明の第３の局面の免疫原組成物かは、患者における少なくとも１種類の疾患を治療又は予防するために使用される場合がある。この方法は、本発明の第２の局面のウイルスベクターか、本発明の第３の局面の免疫原組成物かを前記患者に投与するステップを含むことが好ましい。

前記疾患は、結核その他の抗酸菌感染症、マラリア、インフルエンザ、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、Ｃ型肝炎、サイトメガロウイルス感染症、ヒトパピローマ感染症、アデノウイルス感染症、リーシュマニア症、連鎖球菌、ブドウ球菌、髄膜炎菌感染症、リフトバレー熱、口蹄疫及びチクングンヤ熱ウイルス感染症からなるグループから選択されることが好ましい。

本発明のアデノウイルスベクターは、異種抗原が由来した病原体生物に対する免疫応答を誘導するとともに、該ウイルスベクターが由来したアデノウイルスに対する免疫応答も誘導する場合がある。そこで、ＡｄＹ２５に対する免疫応答が誘発される場合がある。ＡｄＹ２５に対して誘導される免疫応答は、他のアデノウイルス血清型との交差反応性もある場合があり、そこで、２種類以上のアデノウイルスに対する免疫応答が誘発される場合がある。したがって、本発明の第２の局面のウイルスベクターか、本発明の第３の局面の免疫原組成物かがアデノウイルス疾患を治療又は予防するために使用される場合がある。

したがって本発明のこの実施態様は、少なくとも１種類のアデノウイルス疾患と、少なくとも１種類の非アデノウイルス疾患とを患者において治療又は予防することも提供する。

さらなる実施態様では、本発明の第２の局面のウイルスベクターか、本発明の第３の局面の免疫原組成物かが、自己抗原に対するトレランスを破るであろう動物の免疫応答を誘導するために用いられる場合がある。この方法は、本発明の第２の局面のウイルスベクターか、本発明の第３の局面の免疫原組成物かを前記動物に投与するステップを含むことが好ましい。

腫瘍細胞は、適切な調節制御なしに、増殖、分裂及び拡散をしている実質的に患者の自己細胞であることから、多くの腫瘍細胞は患者の免疫系によるトレランス状態にある。したがって、がん化腫瘍は患者の体内で制約なしに増殖できる。しかし、本発明のウイルスベクターは、「がん免疫療法」として知られるプロセスで前記腫瘍細胞を攻撃するように患者の免疫系を刺激するのに使用できる。具体的には、本発明のベクターは、破壊されるべき標的として腫瘍細胞を認識するように患者の免疫系を「訓練」するために使用できる。これは、適当な自己抗原をコード化する外来ヌクレオチド配列をウイルスベクター内に含むことによって達成できる。上記に説明されるとおり、適当な自己抗原は、腫瘍細胞と他の細胞タイプとを免疫系が区別できるように腫瘍細胞により発現される抗原を含む。適当な自己抗原は、細胞タイプ及び／又はその環境にとって不適切か、生物個体発生期間中しか正常には存在しない（例えば胎児抗原）かのいずれかの抗原を含む。例えば、ＧＤ２は正常では神経細胞の外表膜でだけ顕著なレベルで発現し、その免疫系への曝露は血液−脳関門のために制限される。しかし、ＧＤ２は、小細胞肺がん、神経芽種、メラノーマ及び骨肉腫を含む広範な腫瘍細胞の表面に発現する。他の適当な自己抗原は、腫瘍細胞では見つかるが、健康な細胞の少なくともには稀か存在しないかである細胞表面レセプターを含む。かかるレセプターは、前記腫瘍細胞の調節されない増殖及び分裂をもたらす細胞シグナル伝達経路の活性化の原因かもしれない。例えば、ＥｒｂＢ２は、乳がん腫瘍細胞の表面では異常に高レベルで産生される。したがって、本発明のアデノウイルスベクターは、腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導するのに使用される場合があるため、がんの治療に使用できる。

以下の詳細は、本発明のベクター及び免疫原組成物の上記使用の全てに準用される。

肝臓期マラリア、結核及びインフルエンザを含む、多くの疾患の治療及び予防は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋のＴ細胞の両方を伴う感染への強力な細胞性応答と、Ｔｈ１−タイプのサイトカイン、特に、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２及びＩＬ−１７で応答する能力とを維持することと関連する。多くのサブユニットワクチンプラットフォームがヒト免疫を効果的に発生するが、ロバストな細胞性免疫応答、特にＣＤ４＋及びＣＤ８＋のＴ細胞免疫応答の発生はもっと挑戦的である。本発明のウイルスベクターは、コード化される抗原に対する細胞性及び液性免疫応答の両方を刺激することが好ましい。

免疫記憶応答を誘導することも望ましい。免疫記憶応答は、古典的には、分化したエフェクターＴ細胞から直接生じ、均一な休止状態に止まる、長寿命の抗原特異的Ｔリンパ球の再活性化が原因とされる。メモリーＴ細胞は不均一であり、異なる遊走能力及びエフェクター機能を有する少なくとも２種類のサブセットである、エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）及び中枢メモリーＴ細胞（ＣＴＭ）を含むことが示されてきた。ＴＥＭはリンパ節ホーミングレセプターのＬ−セレクチン及びＣＣＲ７がなく、炎症組織に遊走するためのレセプターを発現する点で、１次応答で発生するエフェクター細胞と似ている。抗原との再遭遇に際し、これらのＴＥＭは迅速にＩＦＮ−γ又はＩＬ−４を産生するか、予め蓄積されたものを放出した。ＴＣＭはＬ−セレクチン及びＣＣＲ７を発現するが即時型エフェクター機能はない。これらの細胞は活性化閾値が低く、２次リンパ器官での再刺激を受けると増殖してエフェクターに分化する。

本発明の第２の局面のウイルスベクターか、本発明の第３の局面の免疫原組成物かが抗原特異的免疫応答を誘発、誘導又はブーストできることが好ましい。免疫応答は強力なＴ細胞免疫応答、例えば強力なＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞応答であることが好ましい。前記Ｔ細胞免疫応答は保護的Ｔ細胞免疫応答であることが好ましい。前記Ｔ細胞免疫応答は長期持続し、少なくとも１、２、５、１０、１５、２０、２５年以上持続することが好ましい。誘導される免疫応答はＴ細胞免疫記憶応答であることが好ましい。

本発明の第２の局面のウイルスベクターか、本発明の第３の局面の免疫原組成物かが、単回免疫又は複数回免疫のいずれかで宿主細胞又は被験体に投与される場合がある。前記ウイルスベクター又は免疫原組成物は、単独、２種又は３種ワクチン接種戦略の一部として投与されることが好ましい。これらは同種又は異種プライム−ブースト免疫処方の一部として投与される場合もある。

ワクチン接種戦略又は免疫処方は、本発明のウイルスベクター又は免疫原組成物の２回目又はその後の投与を含む場合がある。２回目の投与は、短期間又は長期間にわたって投与される場合がある。投与量は、時間、日、週、月又は年の期間にわたって、例えば、１回目の投与後少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０週か、これ以内か、これを超える期間か、あるいは、少なくとも０．２５、０．５、０．７５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５又は４０年か、これ以内か、これを超える期間か投与される場合がある。２回目の投与は１回目の投与の少なくとも２ヶ月後に行うことが好ましい。２回目の投与は１回目の投与の１０年後までに行うことが好ましい。これらの時間間隔はその後のいずれかの投与感覚に準用されることが好ましい。

前記ウイルスベクター及び／又は免疫原組成物は、単独で、あるいは、他のウイルス又は非ウイルス性ＤＮＡ／タンパク質ワクチンとの併用で投与される場合がある。好ましい例は、ＭＶＡ、ＦＰ９その他のアデノウイルスベクターワクチンを含む。

前記ウイルスベクター及び／又は免疫原組成物は、（吸引を含む）経口、非経口、経粘膜（例えば、口腔、舌下、経鼻）、経直腸又は経皮投与によって被験体に投与される場合がある。代替的には、前記ウイルスベクター及び／又は免疫原組成物は、被験体から単離された宿主細胞又はサンプルに、該ウイルスベクターでの該宿主細胞の形質導入を促進する条件下で、前記ウイルスベクター又は免疫原組成物に試験管内で前記細胞を接触させることによって投与される場合がある。

本発明のウイルスベクター及び免疫原組成物は抗原をコード化する核酸配列の送達に限られない。がんを含む多くの疾患が患者のゲノム中の１個以上の有害な突然変異対立遺伝子と関連する。遺伝子治療は、前記有害な突然変異又は機能しない対立遺伝子を「正常な」又は機能する対立遺伝子で置換するために、患者の細胞又は組織内に遺伝子を挿入することを含む。機能しない対立遺伝子を置換するために、機能する対立遺伝子がゲノム内の不特定の場所に挿入されることが一般的である。代替的には、機能しない対立遺伝子は、相同組換えを通じて機能する対立遺伝子と交換される場合がある。標的細胞内での機能する対立遺伝子のその後の発現が該標的細胞を正常状態に回復し、疾患の治療を提供する。「正常」又は機能する対立遺伝子はウイルスベクターを使って患者のゲノムに挿入される場合がある。したがって本発明は、本発明の第２の局面のウイルスベクターか、本発明の第３の局面の免疫原組成物かの遺伝子治療における使用を提供する。

この方法は、本発明の第２の局面のウイルスベクターか、本発明の第３の局面の免疫原組成物かを動物に投与するステップを含むことが好ましい。

本発明のベクターは、機能のある、あるいは、「正常な」タンパク質をコード化する外来ヌクレオチド配列を含む場合があり、該タンパク質の機能がない、あるいは、「突然変異」バージョンが疾患又は症状と関係する。

標的細胞は体細胞であることが好ましい。治療される被験体は哺乳類が好ましい。好ましい哺乳類は、ニワトリ、他の鳥類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、野生のイノシシ、バッファロー、バイソン、ウマ、ラクダ科動物、シカ、ゾウ、アナグマ、フクロネズミ、ネコ、ライオン、サル及びヒトを含む。

本発明の第５の局面は、本発明の第２の局面のウイルスベクターをコード化するポリヌクレオチド配列を提供する。前記ポリヌクレオチド配列は配列番号３８の配列又はこれと実質的に同一の配列を含むことが好ましい。前記ポリヌクレオチドは関心のある外来ヌクレオチド配列をさらに含む場合がある。

本発明の第６の局面は、本発明の第２の局面のウイルスベクターで形質導入又は感染された宿主細胞を提供する。形質導入又は感染の後、前記宿主細胞は、前記核酸分子によってコード化されるいずれかの他のアデノウイルスタンパク質とともに、関心のある分子を産生するために前記核酸分子内の外来ヌクレオチド配列を発現するであろう。前記宿主細胞は安定的に形質導入され、ウイルス増殖に適することが好ましい。

宿主細胞は、単離された宿主細胞か、生物個体由来の組織サンプルの一部か、多細胞生物又はその器官又は組織の一部かの場合がある。

好ましくは宿主細胞は体細胞である。前記宿主細胞は幹細胞ではないことが好ましく、胚性幹細胞、より具体的には、ヒト胚性幹細胞でないことがより好ましい。

宿主細胞は、抗原提示樹状細胞、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、リンパ球、白血球、筋細胞及び線維芽細胞からなるグループから選択される場合がある。

宿主細胞は動物細胞であることが好ましく、哺乳類細胞であることがより好ましい。好ましい哺乳類は、ニワトリ、他の鳥類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、野生のイノシシ、バッファロー、バイソン、ウマ、ラクダ科動物、シカ、ゾウ、アナグマ、フクロネズミ、ネコ、ライオン、サル及びヒトを含む。

本発明の第５の局面は、本発明の第２の局面のウイルスベクターで形質導入又は感染された動物をも含む。

動物は、本発明の第２の局面のウイルスベクターで形質導入又は感染された１個以上の細胞を含むことが好ましい。前記動物は哺乳類が好ましい。好ましい哺乳類は、ニワトリ、他の鳥類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、野生のイノシシ、バッファロー、バイソン、ウマ、ラクダ科動物、シカ、ゾウ、アナグマ、フクロネズミ、ネコ、ライオン、サル及びヒトを含む。

第７の局面では、本発明は、本発明の第２の局面のウイルスベクターを作製する方法を提供する。本方法は、Ａｄ−ＢＡＣベクターを作製するために、ＡｄＹ２５由来のヌクレオチド配列を細菌人工染色体（ＢＡＣ）に取り込むステップを含むことが好ましい。

プラスミドベクターとは異なり、ＢＡＣは、遺伝的安定性を与えるために大腸菌体内で単一コピー存在する。さらに、単一コピーのＢＡＣは組換えを介する遺伝子工学技術（ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ）によってウイルスゲノムに施される非常に正確な改変を可能にする。

好ましくは、ＡｄＹ２５由来のヌクレオチド配列の細菌人工染色体（ＢＡＣ）への取り込みは、
ｉ）前記ウイルスヌクレオチド配列を挟む左右の挟み込み領域(ｆｌａｎｋ)と相同性のある領域を含むＢＡＣレスキューベクターを構築するステップと、
ｉｉ）前記ＢＡＣレスキューベクターを線状化するステップと、
ｉｉｉ）前記ウイルスヌクレオチド配列を前記ＢＡＣレスキューベクターに取り込むために、前記ウイルスヌクレオチド配列と、線状化され前記ＢＡＣレスキューベクターとの間の相同組換えを宿主細胞内で行わせるステップとを含む。

前記ＢＡＣレスキューベクターに取り込まれる前記ヌクレオチド配列は、配列番号１又は配列番号３８又はこれらと実質的に同一の配列を含むことが好ましい。

さらに、前記Ａｄ−ＢＡＣベクターゲノムをさらに改変するステップを含むことが好ましい。これらのさらなる改変はＧａｌＫ組換えを介する遺伝子工学技術（ＧａｌＫ ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ）により実行される場合がある。Ｓ▲ストローク付き小文字のｏ▼ｒｅｎ Ｗａｒｍｉｎｇとその同僚らによって開拓されたこの技術は、組換え体クローンの正及び負の両方の選択にＧａｌＫ遺伝子を利用する（Ｗａｒｍｉｎｇら、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ， ２００５， Ｖｏｌ３３；４）。組換えが実行される場合があるＳＷ１０２大腸菌細胞は唯一の炭素源としてガラクトースを利用するのに必要なＧａｌＫ遺伝子を欠失するように特異的に操作されている。遺伝子欠失は、ベクターゲノムと、欠失の標的となる遺伝子のいずれかの側の５０ｂｐの相同領域に挟まれるＰＣＲ増幅されたＧａｌＫカセットとの間の組換えにより実行される。ガラクトースのみを含む最小培地上での選択が、（前記標的遺伝子の代わりに）ＧａｌＫ遺伝子を含む組換え体のみが増殖することを担保する。ＧａｌＫを異なる遺伝子配列で置換することは同様なやり方で実行でき、この場合はＧａｌＫを負の選択に用いる。ＧａｌＫの産物であるガラクトキナーゼは２−デオキシガラクトース（ＤＯＧ）を大腸菌に非常に有毒な産物に代謝するため、ＤＯＧの選択培地への添加はＧａｌＫが置換されたクローンを選択するであろう。宿主細胞は、ステップｉ）ないしｉｉｉ）については大腸菌ＢＪ５１８３株が、さらなる改変にはＳＷ１０２株が好ましい。

実施例１に説明されるとおり、同時にＥ１の欠失を可能にするために、アデノウイルスＥ１領域の下流に余分の相同挟み込み領域が含まれることが好ましい。

前記方法は、Ａｄ−ＢＡＣベクターゲノムのＥ３領域の欠失をさらに含むことが好ましい。Ｅ３領域の欠失は、実施例２に説明されるとおり、ＧａｌＫ組換えを介する遺伝子工学技術によって実行される場合がある。

前記方法は、ベクターの増殖及び収率を最適化するために、Ｅ４領域を改変するステップをさらに含むことが好ましい。１つの実施態様では、原種のＥ４遺伝子座がＡｄＨｕ５由来のＥ４Ｏｒｆ６遺伝子で置換される。第２の実施態様では、実施例３で説明されるとおり、原種のＥ４遺伝子座はＡｄＨｕ５由来のＥ４Ｏｒｆ４、Ｅ４Ｏｒｆ及びＥ４Ｏｒｆ６／７のコーディング領域と、ＡｄＹ２５由来のＥ４Ｏｒｆ１、Ｅ４Ｏｒｆ２及びＥ４Ｏｒｆ３のコーディング領域とで置換される。

前記方法は、ラムダファージ部位特異的組換え部位ａｔｔＲ１及びａｔｔＲ２をＡｄのＥ１遺伝子座にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＧａｔｅｗａｙ（登録商標）ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎカセットの一部として導入するステップをさらに含むことが好ましい。かかる改変は、ワクチン外来遺伝子の効率的な方向挿入を可能にする。外来遺伝子は、組換えを介する遺伝子工学技術（ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ）、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）、従来技術のライゲーション又はギャップ修復によっても挿入できる場合がある。本発明の第８の局面は、本発明の第２の局面のウイルスベクターをコード化するポリヌクレオチド配列を含む細菌人工染色体（ＢＡＣ）を提供する。

前記ＢＡＣクローンは、
（ａ）ＢＡＣ骨格と
（ｂ）本発明の第５の局面のポリヌクレオチド配列とを含むことが好ましい。

上記のとおり、本発明の第２の局面のウイルスベクターは、形質転換された細胞株又はヘルパーウイルス（腑抜けベクターシステム）中で複製される場合があるが、該ヘルパーウイルスは、必要な場合には、前記ウイルスから欠失されつたいずれかの遺伝子の相補体を含む。かかる遺伝子は、宿主細胞内での複製を阻害するために前記ウイルスから欠失される場合があるが、前記ウイルスベクターを複製させて本発明の第２の局面の免疫原組成物を作製するためには必要であることは勿論である。機能的に欠失された遺伝子を発現するように改変された、野生型アデノウイルス複製を許容するいずれかの細胞株か、前記機能的に欠失された遺伝子に加えてＣＡＲ又はインテグリンを発現するように、さらに、あるいは、代替的に、改変された野生型ウイルス複製を許容しない細胞株かを利用することができる。

本発明は、本発明の第８の局面の細菌人工染色体（ＢＡＣ）を含み、これの増殖に適する宿主細胞を提供する。かかる宿主細胞は細菌であることが好ましく、大腸菌であることが最も好ましい。適当な例は大腸菌ＤＨ１０Ｂ及びＳＷ１０２株（Ｗａｒｍｉｎｇ， Ｓ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， ２００５， Ｆｅｂ ２４； ３３（４）： ｅ３６）である。

したがって、本発明の第９の局面は、本発明の第２の局面のウイルスベクターを産生するか、産生できる、パッケージング細胞又は細胞株を提供する。前記パッケージング細胞又は細胞株は、本発明の第２の局面のウイルスベクターをコード化する１本以上のヌクレオチド配列を含む。これらの配列の発現は、前記ウイルスベクターの産生をもたらす。必要な遺伝子の一部は、第２の局面のウイルスベクターで前記細胞又は細胞株を感染させることによって提供される場合がある。前記細胞は、前記ウイルスベクターから欠失されるか機能的に欠失されたいずれかの遺伝子の相補体を含むことが好ましい。前記細胞はＡｄＹ２５のＥ１遺伝子の相補体を含むことが好ましい。前記細胞はＨＥＫ２９３細胞又はＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）であることが好ましい。

上記に説明されるとおり、ＡｄＨｕ５由来のＥ４Ｏｒｆ４、Ｅ４Ｏｒｆ及びＥ４Ｏｒｆ６／７のコーディング領域を含むようにアデノウイルスベクターのＥ４遺伝子座を改変することは、ヘクソン産生速度を増大させ、細胞ウイルスベクター、特に蛍光マーカー遺伝子を含まない臨床用に開発されるウイルスベクターの感染力価の定量化を可能にする抗ヘクソン力価の感度を高める。さらに驚くべきことに、この改変は、前記ベクターの収率及び増殖速度を増大させることがみつかった。当業者は、かかる改変は、単にＡｄＹ２５由来のアデノウイルスだけでなく、広くさまざまなアデノウイルスに有利な効果があることが予想されることを理解するであろう。

したがって、本発明の１０番目の局面は、ＡｄＨｕ５由来の異種Ｅ４Ｏｒｆ４、Ｅ４Ｏｒｆ及びＥ４Ｏｒｆ６／７のコーディング領域を含む核酸分子を含む、ＡｄＨｕ５以外のアデノウイルスベクターを提供する。

１つの実施態様では、原種Ｅ４遺伝子座は欠失され、ＡｄＨｕ５由来の異種Ｅ４Ｏｒｆ４、Ｅ４Ｏｒｆ及びＥ４Ｏｒｆ６／７のコーディング領域で置換される。代替的には、ＡｄＨｕ５由来の異種Ｅ４Ｏｒｆ４、Ｅ４Ｏｒｆ及びＥ４Ｏｒｆ６／７のコーディング領域に加えて原種のコーディング領域を含む場合がある。前記原種コーディング領域は、Ｅ４Ｏｒｆ１、Ｅ４Ｏｒｆ２及びＥ４Ｏｒｆ３のコーディング領域であることが好ましい。

アデノウイルスベクターは、ＡｄＹ２５及びＡｄＹ６８からなるグループから選択されることが好ましい。

１０番目の局面のアデノウイルスベクターは、Ｅ１及びＥ３遺伝子座が欠失していることが好ましい。

当業者の便宜のためだけに、ＡｄＣｈＯＸ１（ｐＢＡＣｅ３．６ ＡｄＣｈＯｘ１（Ｅ４改変）ＴＩＰｅＧＦＰ、細胞株名“ＡｄＣｈＯｘ１ （Ｅ４改変）ＴＩＰｅＧＦＰ”）のクローン化ゲノムを含む細菌人工染色体（ＢＡＣｓ）を含む、大腸菌（ＤＨ１０Ｂ由来の）ＳＷ１０２株（Ｗａｒｍｉｎｇ， Ｓ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， ２００５， Ｆｅｂ ２４； ３３（４）： ｅ３６）が、Ｉｓｉｓ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ社により、ブダペスト条約の下、欧州細胞培養コレクション（ＥＣＡＣＣ、the Health Protection Agency Culture Collections、Health Protection Agency、Porton Down、Salisbury SP4 0JG、United Kingdom）に２０１２年５月２４日付けで寄託され、仮アクセッション番号１２０５２４０３を付与された
本明細書に説明されるとおり、ベクターＡｄＣｈＯＸ１は、チンパンジーアデノウイルスＹ２５に由来し、Ｅ１領域及びＥ３領域の欠失と、Ｅ４領域の改変と、ＴＩＰｅＧＦＰモデル抗原のＥ１遺伝子座への挿入とを有する。前記ＢＡＣを含む大腸菌はクラスＩ遺伝子改変生物である。

前記ＢＡＣは複製の際細菌菌体内で増殖し、クロラムフェニコールで選択することにより維持できる。前記ゲノムがクローン化される細菌人工染色体を含む大腸菌ＳＷ１０２株は、１２．５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉブロス又は寒天培地中３２℃で増殖できる。前記ゲノムは、本明細書に説明されるとおりの標準的な方法により大腸菌菌体内で遺伝子操作により改変される、例えば、ＴＩＰｅＧＦＰの代わりに代替的な組換え抗原が挿入される場合がある。

前記ウイルスゲノムのＢＡＣクローンをウイルスに変換すること（レスキュー）は、以下のステップにより実行される場合がある。大腸菌宿主が増殖され、ＢＡＣのＤＮＡが該細菌から標準的な方法にしたがって精製される。該ＤＮＡは制限エンドヌクレアーゼＰｎｅＩで線状化され、ＨＥＫ２９３細胞（又は類似のＥ１を相補する細胞株）にトランスフェクションされる。その後、得られたアデノウイルスは増殖され、例えばワクチンとして使用するために精製される。これらの試薬及び細胞の全ては公的に利用可能である。寄託物がレスキューされる場合には、得られたウイルスはクラスＩ遺伝子改変生物であろう。

かかる行為が可能な全ての指定国に関し、該指定国の法律の下で許容される範囲内で、関連する特許法制、例えば、ＥＰＣ規則３２（１）と、英国特許２００７規則１３（１）及びスケジュール１と、豪州特許規則３．２５（３）と、その他いずれかの指定国について準用されるほぼ同様の規定とにしたがい、寄託された材料のサンプルが独立の専門家への交付によってのみ利用可能となるように要求される。

本発明の第５の局面の具体的な実施態様は、本発明の第２の局面のアデノウイルスベクターをコード化するポリヌクレオチド配列を提供し、該ポリヌクレオチド配列はウイルスベクターＡｄＣｈＯＸ１のポリヌクレオチド配列を含むか、からなり、ＡｄＣｈＯＸ１は、ＳＷ１０２株（Ｗａｒｍｉｎｇ， Ｓ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， ２００５， Ｆｅｂ ２４； ３３（４）： ｅ３６）に含まれるＢＡＣ内でＩｓｉｓ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ社により、ブダペスト条約の下、欧州細胞培養コレクション（ＥＣＡＣＣ、the Health Protection Agency Culture Collections、Health Protection Agency、Porton Down、Salisbury SP4 0JG、United Kingdom）に２０１２年５月２４日付けで寄託され、仮アクセッション番号１２０５２４０３を付与された
寄託されたＢＡＣは、抗原ＴＩＰｅＧＦＰをコード化する外来遺伝子をさらに含む。本発明のこの局面では、ＡｄＣｈＯＸ１のポリヌクレオチド配列は、ＴＩＰｅＧＦＰ抗原をコード化する配列を含まないことが好ましい。

本発明のさらなる実施態様は、本発明の第２の局面のウイルスベクターで形質導入された宿主細胞を提供するが、該宿主細胞は、細菌が好ましく、Ｉｓｉｓ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ社により、ブダペスト条約の下、欧州細胞培養コレクション（ＥＣＡＣＣ、the Health Protection Agency Culture Collections、Health Protection Agency、Porton Down、Salisbury SP4 0JG、United Kingdom）に２０１２年５月２４日付けで寄託され、仮アクセッション番号１２０５２４０３を付与されたＡｄＣｈＯＸ１のクローン化ゲノムを含む細菌人工染色体（ＢＡＣ）を含む大腸菌ＳＷ１０２株（Ｗａｒｍｉｎｇ， Ｓ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， ２００５， Ｆｅｂ ２４； ３３（４）： ｅ３６）がより好ましい。前記寄託されたＢＡＣは、ＴＩＰｅＧＦＰ抗原をコード化する外来遺伝子をさらに含む。本発明のこの局面では、ＡｄＣｈＯＸ１のポリヌクレオチド配列は、ＴＩＰｅＧＦＰ抗原をコード化する配列を含まないことが好ましい。かかる宿主細胞はＢＡＣの増殖に使われる場合がある。

本発明の第７の局面の具体的な実施態様は、ＡｄＹ２５の分子クローンを細菌人工染色体（ＢＡＣ）中で生成することにより、本発明の第２の局面のウイルスベクターを作製する方法を提供する。前記ＢＡＣは、Ｉｓｉｓ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ社により、ブダペスト条約の下、欧州細胞培養コレクション（ＥＣＡＣＣ、the Health Protection Agency Culture Collections、Health Protection Agency、Porton Down、Salisbury SP4 0JG、United Kingdom）に２０１２年５月２４日付けで寄託され、仮アクセッション番号１２０５２４０３を付与されたＡｄＣｈＯＸ１のクローン化ゲノムを含むＢＡＣである。寄託されたＢＡＣは、ＴＩＰｅＧＦＰ抗原をコード化する外来遺伝子をさらに含む。本発明のこの局面では、ＡｄＣｈＯＸ１のポリヌクレオチド配列は、ＴＩＰｅＧＦＰ抗原をコード化する配列を含まないことが好ましい。

本発明の第８の局面の具体的な実施態様は、本発明の第５の局面のポリヌクレオチド配列を含む細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンを提供する。前記ＢＡＣは、Ｉｓｉｓ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ社により、ブダペスト条約の下、欧州細胞培養コレクション（ＥＣＡＣＣ、the Health Protection Agency Culture Collections、Health Protection Agency、Porton Down、Salisbury SP4 0JG、United Kingdom）に２０１２年５月２４日付けで寄託され、仮アクセッション番号１２０５２４０３を付与されたＡｄＣｈＯＸ１のクローン化ゲノムを含むＢＡＣである。寄託されたＢＡＣは、ＴＩＰｅＧＦＰ抗原をコード化する外来遺伝子をさらに含む。本発明のこの局面では、ＡｄＣｈＯＸ１のポリヌクレオチド配列は、ＴＩＰｅＧＦＰ抗原をコード化する配列を含まないことが好ましい。

疑義を避けるため、本明細書において「好ましい」、「好ましく」、「代替的」その他として説明される特徴は、単独で、あるいは、（文脈がそれ以外を語っている場合を除いて）そのように説明されるいずれか１つ以上の他の特徴とのいずれかの組合せで、本発明に存在する場合があり、これはかかる特徴の組合せの明示的な開示を構成する。

以上に説明された各実施態様の全ての特徴は、本発明の全ての他の実施態様に準用される。

実施例１ 細菌人工染色体におけるＡｄＹ２５の分子クローンの生成
野生型チンパンジーアデノウイルスＡｄＹ２５は、スウェーデン、Ｕｍｅａ大学のＧｏｒａｎ Ｗａｄｅｌｌから入手された。前記ウイルスはＨＥＫ２９３細胞内で高力価で増殖され、ウイルスＤＮＡは、フェノール抽出され、配列決定された。野生型ＡｄＹ２５ウイルスのヌクレオチド配列は配列番号１に示される。配列データにもとづいて、ウイルスゲノムの右側及び左側の挟み込み領域（ｆｌａｎｋｓ、ウイルスＤＮＡからＰＣＲ法で増幅された）と相同性のある領域を含むＢＡＣ「レスキューベクター」が構築された。それから、ウイルスゲノムをＢＡＣベクターに取り込むために、相同組換えが、ウイルスＤＮＡと、線状化されたレスキューベクターとの間でＢＪ５１８３大腸菌細胞内で実行された。

アデノウイルスＥ１領域の下流に、新規ベクターを即時型複製不能にするためにＥ１を同時に欠失できるようにもう１つの相同挟み込み領域が含まれた。

ワクチン外来遺伝子の効率的な方向挿入を可能にするために、ラムダファージ部位特異的組換え部位ａｔｔＲ１及びａｔｔＲ２がＡｄのＥ１遺伝子座にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＧａｔｅｗａｙ（登録商標）ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎカセットの一部として導入された。

得られたΔＥ１ Ａｄ−ＢＡＣベクターは、複製不能クローンがＥ１相補性ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションされる前に、ＰＣＲ及び制限酵素消化によりスクリーニングされた。前記新規ベクターはＨＥＫ２９３細胞での複製及び細胞変性効果を可能にする感染性ビリオンを産生する能力があることを実証した。

実施例２ アデノウイルスＥ３領域の欠失
実施例１にしたがって生成されたΔＥ１ Ａｄ−ＢＡＣベクターゲノムは、アデノウイルスＥ３領域を欠失されて、新規ベクターの挿入容量を約５ｋｂ増大させるために、ＧａｌＫ組換えを用いてさらに改変された。

Ｅ３領域は、ベクターゲノムと、Ｅ３遺伝子のいずれかの側に５０ｂｐの相同領域により挟まれた、ＰＣＲ増幅されたＧａｌＫカセットとの間の組換えにより欠失された。組換えはＳＷ１０２大腸菌細胞中で実行されたが、該大腸菌細胞はガラクトースを唯一の炭素源として利用するために必要なＧａｌＫ遺伝子が欠失するように特異的に操作されている。組換え細胞はガラクトースのみを含む最小培地を用いて選択された。該最小培地では、Ｅ３遺伝子座のかわりにＧａｌＫ遺伝子を含む組換え体だけが増殖可能である（Ｗａｒｍｉｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ， ２００５， Ｖｏｌ３３；４）。

実施例３ Ｅ４領域の改変及びその効果
ｉ）Ｅ４領域の改変
実施例２にしたがって作製されたΔＥ１ΔＥ３Ａｄ−ＢＡＣベクターゲノムのＥ４遺伝子座が改変された。Ｅ４領域は、ベクターゲノムと、Ｅ４遺伝子のいずれかの側に５０ｂｐの相同領域により挟まれた、ＰＣＲ増幅されたＧａｌＫカセットとの間の組換えによりＳＷ１０２大腸菌細胞中で欠失された。組換え細胞はガラクトースのみを含む最小培地を用いて選択された。その後、図３−Ｃに列挙される５個のコンストラクトを提供するために同様のやり方で、ＧａｌＫ遺伝子はＡｄＨｕ５及びＡｄＹ２５由来の必要なＥ４オープン・リーディング・フレームと置換された。ＧａｌＫ遺伝子のかわりに前記遺伝子を含む組換え細胞は、２−デオキシガラクトース（ＤＯＧ）を含む培地を用いて選択された（Ｗａｒｍｉｎｇら、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ， ２００５， Ｖｏｌ３３；４）。

ｉｉ）Ｅ４改変のウイルス収率への効果
ＨＥＫ２９３細胞は、感染多重度９で以下のウイルスベクターに感染させられ、回収まで３７℃４８時間インキュベーションされた。

ｉ） ＡｄＨｕ５（Ａｄ５）
ｉｉ） ＡｄＹ２５ Ｅ４野生型（Ｙ２５Ｅ４ｗｔ）
ｉｉｉ） ＡｄＹ２５ Ｅ４ ＡｄＨｕ５ Ｅ４Ｏｒｆ６（Ｙ２５Ａｄ５Ｅ４Ｏｒｆ）
ｉｖ） ＡｄＹ２５ Ｅ４ ＡｄＨｕ５ Ｅ４Ｏｒｆ４、６、６／７（ＡｄＣｈＯＸ１）
回収された材料の感染力価は感染後４８時間のＧＦＰ陽性存在部位数を定量することにより測定された。

図３−Ａに示されるとおり、野生型Ｅ４遺伝子座を含む、ＡｄＹ２５系ウイルスベクターの感染力価は、ＡｄＨｕ５の感染力価より著しく低かった。野生型Ｅ４遺伝子座をＡｄＨｕ５由来のＥ４Ｏｒｆ６遺伝子で置換するウイルスベクターの改変は、感染力価を有意に増大させた。（ＣｈＡｄＯＸ１を生成するために）ＡｄＨｕ５由来のＥ４Ｏｒｆ４、Ｅ４Ｏｒｆ及びＥ４Ｏｒｆ６／７のコーディング領域と、ＡｄＹ２５由来のＥ４Ｏｒｆ１、Ｅ４Ｏｒｆ２及びＥ４Ｏｒｆ３のコーディング領域とで野生型Ｅ４遺伝子座を置換することは、驚くべきことに、感染力価をさらに増大させた。

ｉｉｉ）ＧＦＰ 対 抗ヘクソン力価
ワクチンベクターの免疫原性及び有効性を評価するためには、ウイルスの感染力価を定量する信頼性の高い方法を開発することが必須である。従来は、ＨＥＫ２９３細胞におけるプラークアッセイが選択すべき方法であったが、これらは長いインキュベーション期間を要し、力価のつじつまがあわないことがしばしばある。さらに、プラークアッセイは内在的に敏感でなく、全ての感染性ビリオンがプラーク形成を誘導するわけではない。１つの方法は、ウイルス感染した細胞の数を定量することを伴う簡便な、単細胞感染性アッセイである。最初の組換えＡｄＹ２５由来ウイルスベクターは緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現し、細胞内で組換え外来遺伝子発現を開始したウイルスを蛍光顕微鏡により直接視覚化できる。しかし、ワクチン抗原コンストラクトが蛍光マーカー遺伝子をもたないとき、例えば、ワクチン抗原コンストラクトが臨床用であるとき、細胞の感染性を評価する代替的な方法が使われなければならない。

このたび、ウイルスヘクソン単が発現する感染細胞を視覚化できる、抗ヘクソン免疫染色アッセイが開発された。このアッセイは、ポリクローナル抗ヘクソン抗体を使用するので、ほとんどどのアデノウイルスワクチンベクターでも力価測定に使用でき、ＡｄＨｕ５及びＡｄＣｈ６３系ベクターの両方について信頼性がありつじつまがあうアッセイであることがわかった。もちろん、外来遺伝子発現に対するヘクソン産生速度がベクター間で一貫するとの前提に依存するのはたしかである。ＧＦＰを発現するＡｄＹ２５由来ウイルスベクターの力価は、ＧＦＰと、抗ヘクソンにもとづくアッセイとで比較された。全てＴＩＰｅＧＦＰ抗原を発現する、ＡｄＨｕ５と、ＡｄＣ６３と、ＡｄＹ２５Ｅ４野生型と、図３−Ｃに説明されるコンストラクトＡ−Ｅとについて、力価が感染４８時間後に比較された。

ＴＩＰは、本質的には、多数の強力なマウスＴ細胞エピトープからなるエピトープの連鎖で、Ｐｂ９（マラリア抗原ＰｂＣＳＰ由来の優勢ＣＤ８＋エピトープ）と、Ｐ１５（結核菌抗原８５Ａ由来の強力なＣＤ４＋エピトープ）とを含む。ＴＩＰエピトープ連鎖は、外来遺伝子発現を直接視覚化でき、ワクチン力価測定を簡便にするｅＧＦＰの５’末端に融合される。

図３−Ｂは抗ヘクソン力価に対するＧＦＰ存在部位数の比を示す。Ａｄ５及びＡｄＣ６３系ベクターについて、ＧＦＰ力価は抗ヘクソン力価より約２倍感度が高かった。しかし、ＡｄＹ２５系ベクターについては、抗ヘクソンアッセイの感度はＥ４の改変とともにばらついた。ＡｄＹ２５のＥ４野生型ベクターについては、抗ヘクソン力価は４８時間後のＧＦＰ力価より４０分の１未満感度が低く、ＡｄＨｕ５及びＡｄＣｈ６３ベクターよりもヘクソン産生速度がかなり遅いことを示唆した。これは、ＡｄＹ２５のＥ４野生型ベクターの収率が悪いことから予想されたことであった。しかし、驚くべきことには、コンストラクトＡ（Ｙ２５Ａｄ５Ｅ４Ｏｒｆ６）がまだＧＦＰよりも抗ヘクソンによって３０分の１未満の感度であった。最良の結果は、コンストラクトＥ（ＣｈＡｄＯＸ１）で得られたが、このコンストラクトでは、野生型Ｅ４遺伝子座が、ＡｄＨｕ５由来のＥ４Ｏｒｆ４、Ｅ４Ｏｒｆ及びＥ４Ｏｒｆ６／７のコーディング領域と、ＡｄＹ２５由来のＥ４Ｏｒｆ１、Ｅ４Ｏｒｆ２及びＥ４Ｏｒｆ３のコーディング領域とで置換された。

ｉｉｉ）ヘクソン発現
ＴＩＰｅＧＦＰを発現するＣｈＡｄＯＸ１ウイルスベクターのヘクソン力価に対するマーカー遺伝子の比が、蛍光検出の感度を制御するために、ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙ蛍光外来遺伝子を用いて測定された。

結果は図３−Ｄに提供される。両方の場合で、マーカー：ヘクソン力価の比は約２倍で、使用された特定のマーカー遺伝子は、得られたマーカー：ヘクソン力価の比には影響を与えなかった。ＣｈＡｄＯＸ１ベクターについてのマーカー：ヘクソン力価の比は、ＨＡｄＶ−５と同じであり、ＣｈＡｄＯＸ１ベクターへのＥ４改変は最適化されていることを示す。

実施例４ ＡｄＹ２５系ベクターの免疫原性
ＡｄＣ６３及びＡｄＣ６８に比肩する免疫原性がＡｄＹ２５系ベクターを用いてマウスで得ることができたかを決定するために、モデル抗原ＴＩＰｅＧＦＰを用いて評価された。

Ｂａｋｂ／ｃマウス（群あたり４匹）に、ＴＩＰｅＧＦＰを全て発現する以下のウイルスベクターのそれぞれが１０^９感染単位（ｉｆｕ）筋注で免疫された。

ｉ）Ａｄｃｈ６３
ｉｉ）ΔＥ１ΔＥ３ＡｄＣｈ６８、及び
ｉｉｉ）ＣｈＡｄＯＸ１
プライミング１４日後、強力なＣＤ８＋エピトープ（Ｐｂ９）に対する脾臓免疫原性がＩＮＦ−γＥＬＩＳｐｏｔにより評価された。

図４にＩＮＦ−γ脾臓ＥＬＩＳｐｏｔ応答が示される。ＣｈＡｄＯＸ１により誘発される応答はロバストで、ＡｄＣｈ６３及びＡｄＣｈ６８系ベクターを用いて検出されるのと比肩できた。これらのデータは、臨床用のＡｄＹ２５系ベクターの開発継続を支持する。

実施例５ Ｅ４改変のＡｄＹ２５系ベクターの免疫原性への効果
２種類の異なるＥ４の改変がＡｄＹ２５系ベクターに及ぼす影響が以下のコンストラクトを用いて評価された。

（ｉ） ＡｄＹ２５ Ｅ４野生型（Ｅ４ｗｔ）
（ｉｉ） ＡｄＹ２５ Ｅ４ ＡｄＨｕ５ Ｅ４Ｏｒｆ６（Ｅ４Ｏｒｆ６）
（ｉｉｉ） ＡｄＹ２５ Ｅ４ ＡｄＨｕ５ Ｅ４Ｏｒｆ４／６／７（Ｅ４Ｏｒｆ４／６／７）
Ｂａｌｂ／ｃマウス（群あたり４匹）が各ベクター１０^６ｉｆｕ又は１０^８ｉｆｕで筋注免疫された。Ｐｂ９及びＰ１５に対する応答が免疫２週間後に検定された。ヘクソン産生速度のワクチン力価への効果を除くために、力価はもう一度ＧＦＰで計算された。

Ｅ４改変のＩＦＮ−γ脾臓ＥＬＩＳｐｏｔ応答に対する効果が図５に示される。データあ、Ｅ４改変はベクターの免疫原性には効果がないことを示す。したがって、かかる改変は、ベクターの免疫原性に負の影響を与えることなく、ウイルスベクターの産生速度を向上させるのに利用できる。

実施例６ ベクター中和抗体の有病率
英国及びガンビア由来のヒト血清中のＡｄＹ２５系ベクター及びＡｄＣｈ６３系ベクターに対する中和抗体の有病率が評価された。

ＨＥＫ２９３細胞はＹ２５Ａｄ５Ｅ４Ｏｒｆ６−ＳＥＡＰ又はＡｄＣｈ６３−ＳＥＡＰで感染された（ＳＥＡＰ＝分泌型胎盤アルカリフォスファターゼ）。組換えアデノウイルスは感染前にＦＢＳ−ＤＭＥＭ中で血清の５段階連続希釈とともにインキュベーションされた。最終血清希釈は、１：１８、１：７２、１：２８８、１：１１５２及び１：４６０８であり、各血清サンプルは２回繰り返しで試験された。上清が回収され、ＳＥＡＰ濃度についてＣＳＰＤ（Ｔｒｏｐｉｘ）を用いて製造者の指示書にしたがって検定された。発光強度はＶａｒｉｏｓｋａｎフラッシュ照度系（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定された。中和力価は、ウイルス単独で感染されたウェルと比較して、ＳＥＡＰ濃度を５０％低減するのに必要な血清希釈として定義された。中和力価は隣接する数値の線形補間により計算された。

図６に示すとおり、Ｙ２５Ａｄ５Ｅ４Ｏｒｆ６に対する中和抗体の血清有病率は、驚くべきことに、英国でもガンビアでも、ＡｄＣｈ６３に対する中和抗体の血清有病率よりはるかに低いことがわかった。

実施例７ ＡｄＹ２５系ベクターの液性免疫原性
Ｂａｌｂ／ｃマウス（群あたり６匹）が、両方ともＴＩＰｅＧＦＰを発現する以下のベクターのいずれかの１０８感染単位で免疫された。

ｉ）ΔＥ１ΔＥ３ＡｄＣｈ６８、又は
ｉｉ）ＣｈＡｄＯＸ１
プライミング５６日後に、マウスは１０^６ｐｆｕのＭＶＡ−ＴＩＰｅＧＦＰでブーストされた。血清は、ブースト前後の抗ＧＦＰ抗体応答を比較するために、プライミング５０日後と、ブースト１０日後とに採取された。応答は終点ＥＬＩＳＡ法で測定された。統計解析は一元配置分散分析により実行された。

図７に示すとおり、ＡｄＹ２５系ベクターＣｈＡｄＯＸ１の液性免疫原性は、現行のチンパンジーアデノウイルスベクターＡｄＣｈ６８より優れており、ＡｄＣｈ６８系ベクターと比較してＡｄＹ２５系ベクターにより誘発される抗原応答が強いことを示す。

実施例８ 結核菌に対する免疫応答の誘導
実施例１で説明されたＢＡＣ技術を用いて、結核菌タンパク質Ａｇ８５Ａｅコード化する外来遺伝子がＣｈＡｄＯＸ１のＥ１遺伝子座にヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーターの制御下で挿入された。外来遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号４２）は、前記抗原の１ないし３２３番目の残基をコード化し、ヒトコドン使用頻度に最適化された配列（１０３ないし１０７１番目のヌクレオチド）によりコード化され、Ｎ末端でｔ−ＰＡ（ヒト組織型プラスミノゲン・アクチベーター由来シグナルペプチドで、１ないし１０２番目のヌクレオチド）に融合され、Ｃ末端でＰＫタグ（１０７２ないし１１０４番目のヌクレオチド）に融合された。Ａｇ８５Ａ抗原のアミノ酸配列は配列番号４３に提供される。

ＢＡＣクローンはＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションされ、ウイルスベクターが増幅され、精製され、実施例３で説明された抗ヘクソン免疫染色アッセイを用いて力価が決定された。

ベクターの免疫原性は、感染単位で表されるさまざまな投与量のワクチンを筋注投与で免疫されたＢａｌｂ／ｃマウスで評価された。１４日後、Ａｇ８５Ａに対する細胞免疫応答がＡｇ８５Ａ中の既知の免疫優勢ＣＤ８＋（ｐ１１、ＷＹＤＱＳＧＬＳＶ（配列番号４４））及びＣＤ４＋Ｔ細胞（ｐ１５、ＴＦＬＴＳＥＬＰＧＷＬＱＡＮＲＨＶＫＰＴ（配列番号４５））Ｈ−２ｄ拘束性エピトープに対応する合成ペプチドで刺激された脾臓細胞を用いるＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ応答アッセイにより測定された。

結果は図８−Ａ及び８−Ｂに示される。これらの結果は、ＣｈＡｄＯＸ１ベクターが結核菌に対する免疫応答を誘導できることを示す。これらの応答の規模は、他のアデノウイルスを利用するベクターにより誘導される応答の規模と同様である。

実施例９ インフルエンザＡ型に対する免疫応答の誘導
実施例１で説明されたＢＡＣ技術を用いて、インフルエンザＡ型ウイルスの核タンパク質（ＮＰ）及びマトリックスタンパク質１（Ｍ１）をコード化する外来遺伝子がＣｈＡｄＯＸ１のＥ１遺伝子座にヒトサイトメガロウイルス主要前初期プロモーターの制御下で挿入された。前記外来遺伝子（配列番号４６）のヌクレオチド配列は、インフルエンザＡ型マトリックスタンパク質１（１５１６ないし２２７４番目のヌクレオチド）に、リンカー（１４９５ないし１５１５番目のヌクレオチド）で隔てられて融合された核タンパク質（１ないし１４９４番目のヌクレオチド）をコード化する。ＮＰＭ１融合タンパク質のアミノ酸配列は配列番号４７に提供される。

ＢＡＣクローンはＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションされ、ウイルスベクターは増幅され、精製され、実施例３で説明された抗ヘクソン免疫染色アッセイを用いて力価が決定された。比較のために、ヒトアデノウイルス５型（ＨＡｄＶ−５）を利用する類似のベクターが同様に作製されて、力価が測定された。

前記ベクターの免疫原性は、感染単位で表されるさまざまな投与量のワクチンを筋注投与で免疫されたＢａｌｂ／ｃマウスで評価された。１４日後、ＮＰに対する細胞免疫応答がＮＰ中の既知の免疫優勢ＣＤ８＋Ｈ−２ｄ拘束性エピトープ（ＴＹＱＲＴＲＡＬＶ（配列番号４８））に対応する合成ペプチドで刺激された脾臓細胞を用いるＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ応答アッセイにより測定された。

得られた結果は図９に示す。これらの結果は、ＣｈＡｄＯＸ１ベクターは、インフルエンザＡ型ウイルスに対する免疫応答を誘導でき、試験された投与量では、ＨＡｄＶ−５ベクターによって誘導されるのと類似の免疫応答である。

ＣｈＡｄＯＸ１−ＮＰＭ１ワクチンは、オックスフォード大学臨床バイオ製造施設（the University of Oxford Clinical Biomanufacturing Facility）の現行製造品質管理基準にしたがってヒト臨床治験のために製造された。これは、前記ベクターが医療用製品としての配備に適することを示す。

文献
１．Buchbinder et al, Lancet, Vol 372, Nov 2008
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９．Warming, S. et al. Nucleic Acids Res, 2005, Feb 24; 33(4): e36

Claims (34)

1. チンパンジーアデノウイルスＡｄＹ２５由来のカプシドを含むアデノウイルスベクターであって、
   前記カプシドは核酸分子をカプシド封入し、
   前記核酸分子は、動物細胞内での翻訳、転写及び／又は発現を制御する発現制御配列と動作可能に連結される外来ヌクレオチド配列と、アデノウイルスパッケージングシグナル配列とを含む、アデノウイルスベクター。
2. 前記ベクターは機能のあるＥ１遺伝子座がない、請求項１に記載のベクター。
3. 前記ベクターはＥ３遺伝子座がない、請求項１又は２に記載のベクター。
4. 別のアデノウイルス血清型由来の少なくとも１個の異種Ｅ４オープン・リーディング・フレームを含む、請求項１ないし３のいずれか１つに記載のベクター。
5. 原種Ｅ４遺伝子座がなく、別のアデノウイルス血清型由来の異種Ｅ４遺伝子座又はそのオープン・リーディング・フレームを含む、請求項１に記載のベクター。
6. 原種Ｅ４遺伝子座がなく、ＡｄＨｕ５由来のＥ４Ｏｒｆ６のコーディング領域を含む、請求項５に記載のベクター。
7. 前記Ｅ４遺伝子座は原種Ｅ４Ｏｒｆ１、Ｅ４Ｏｒｆ２及びＥ４Ｏｒｆ３のコーディング領域と、ＡｄＨｕ５由来の異種Ｅ４Ｏｒｆ４、Ｅ４Ｏｒｆ及びＥ４Ｏｒｆ６／７のコーディング領域とを含む、請求項４に記載のベクター。
8. 前記関心のある外来ヌクレオチド配列は、タンパク質又はポリペプチドをコード化する、請求項１ないし７のいずれか１つに記載のベクター。
9. 前記タンパク質又はポリペプチドは、抗原、分子アジュバント、免疫刺激性タンパク質又はリコンビナーゼを含みグループから選択される、請求項８に記載のベクター。
10. 前記関心のある外来ヌクレオチド配列は、ｍｉＲＮＡ又は免疫刺激性ＲＮＡ配列である、請求項１ないし９のいずれか１つに記載のベクター。
11. 前記カプシドは、
    （ａ）配列番号２のアミノ酸配列又はこれと９８．２％同一の配列を含むＡｄＹ２５ヘクソンタンパク質と、
    （ｂ）配列番号３のアミノ酸配列又はこれと９８．３％同一の配列を含むＡｄＹ２５ペントンタンパク質と、
    （ｃ）配列番号４のアミノ酸配列又はこれと９９．１％同一の配列を含むＡｄＹ２５線維タンパク質とからなるグループから選択される、１種類以上のカプシドタンパク質を含む、請求項１ないし９のいずれか１つに記載のベクター。
12. 請求項１ないし１１のいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターと、
    任意的に、１種類以上の追加の活性成分、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤又はアジュバントとを含む、免疫原組成物。
13. 医学における使用のための請求項１２に記載の免疫原組成物。
14. 医学における使用のための薬剤の製造における、請求項１２に記載の免疫原組成物の使用。
15. 前記使用は、外来遺伝子を宿主細胞内に送達することを含む、請求項１３に記載の免疫原組成物又は請求項１４に記載の使用。
16. 前記使用は、動物における免疫応答を誘発することを含む、請求項１３に記載の免疫原組成物又は請求項１４に記載の使用。
17. 前記使用は、動物における免疫応答をブーストすることを含む、請求項１３に記載の免疫原組成物又は請求項１４に記載の使用。
18. 前記使用は、少なくとも１つの疾患を治療又は予防することを含む、請求項１３に記載の免疫原組成物又は請求項１４に記載の使用。
19. 前記使用は、自己抗原に対するトレランスを破る免疫応答を動物において誘導することを含む、請求項１３に記載の免疫原組成物又は請求項１４に記載の使用。
20. 前記使用は遺伝子治療を含む、請求項１３に記載の免疫原組成物又は請求項１４に記載の使用。
21. 請求項１ないし１１のいずれか１つに記載のウイルスベクターをコード化するポリヌクレオチド配列。
22. 請求項１ないし１１のいずれか１つに記載のウイルスベクターで形質導入される宿主細胞。
23. 請求項１ないし１１のいずれか１つに記載のウイルスベクターを製造する方法。
24. Ａｄ−ＢＡＣベクターを作製するために、請求項２１に記載のポリヌクレオチドを細菌人工染色体（ＢＡＣ）に取り込むステップを含む、請求項２３に記載の方法。
25. 請求項２１に記載のポリヌクレオチド配列を含む、細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローン。
26. 請求項１ないし１１のいずれか１つに記載のウイルスベクターを製造するパッケージング細胞株。
27. 請求項１ないし１１のいずれか１つに記載のウイルスベクターにおいて機能的に欠失するいずれかの遺伝子の相補体を含む、請求項２６に記載のパッケージング細胞株。
28. ＡｄＨｕ５由来のＥ４Ｏｒｆ４、Ｅ４Ｏｒｆ及びＥ４Ｏｒｆ６／７のコーディング領域を含む核酸分子を含む、ＡｄＨｕ５以外のアデノウイルスベクター。
29. 前記核酸分子は、原種Ｅ４Ｏｒｆ１、Ｅ４Ｏｒｆ２及びＥ４Ｏｒｆ３のコーディング領域をさらに含む、請求項２８に記載のアデノウイルスベクター。
30. ＡｄＹ２５又はＡｄＣｈ６８由来である、請求項２８又は２９に記載のアデノウイルスベクター。
31. Ｅ１及びＥ３遺伝子座がない、請求項１８ないし３０のいずれか１つに記載のアデノウイルスベクター。
32. 配列番号１の全長にわたって少なくとも９０％同一の配列を有する単離された核酸分子。
33. （ａ）配列番号１の１８３０２ないし２１１３０番目のヌクレオチド又はこれと９０％同一の配列と、
    （ｂ）配列番号１の１３８９１ないし１５４８６番目のヌクレオチド又はこれと９０％同一の配列と、
    （ｃ）配列番号１の３２２９０ないし３３６２１番目のヌクレオチド又はこれと９０％同一の配列とからなるグループから選択される１本以上のヌクレオチド配列を含む、請求項３２に記載の単離された核酸分子。
34. （ａ）請求項３２又は３３に記載の配列と相補的な配列と、
    （ｂ）請求項３２又は３３に記載の配列とストリンジェントな条件下で雑種形成する配列とから選択される配列を有する、単離された核酸分子。

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