ES2898271T3 - Antígenos del virus de la inmunodeficiencia humana, vectores, composiciones y métodos de uso de los mismos - Google Patents
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Abstract
Un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de la envoltura del VIH sintética, en donde la proteína de la envoltura del VIH sintética comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18.
Description
DESCRIPCIÓN
Antígenos del virus de la inmunodeficiencia humana, vectores, composiciones y métodos de uso de los mismos Antecedentes de la invención
El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) afecta a millones de personas en todo el mundo y la prevención del VIH mediante una vacuna eficaz sigue siendo una prioridad fundamental, incluso en la época del uso generalizado del tratamiento antirretroviral. El VIH-1 es la cepa más común y patógena del virus, donde más del 90 % de los casos de VIH/SIDA corresponden a infecciones con el grupo M del VIH-1. El grupo M se subdivide a su vez en clados o subtipos. Idealmente, una vacuna eficaz sería capaz de provocar tanto respuestas celulares potentes como anticuerpos ampliamente neutralizantes capaces de neutralizar cepas del VIH-1 de diferentes clados.
La gran variabilidad genética del VIH-1 convierte el desarrollo de la vacuna contra el VIH-1 en un desafío sin precedentes. Con el fin de mejorar la cobertura de los posibles epítopos de los linfocitos T, y mejorar las respuestas celulares, se han descrito y desarrollado antígenos Gag, Pol y Env del VIH-1 "mosaico", derivados de las proteínas Antígeno específico de grupo (Gag), Polimerasa (Pol) y Envoltura (Env) del VIH, en un intento de proporcionar la máxima cobertura de posibles epítopos de linfocitos T (p. ej., Barouch et al, Nat Med 2010, 16: 319-323). Los antígenos mosaico tienen una longitud y estructura del dominio similares a los antígenos del VIH-1 de tipo silvestre, de origen natural.
Por ejemplo, los antígenos del VIH mosaico descritos y utilizados en las vacunas incluyen los descritos en Barouch et al, supra, y en el documento WO 2010/059732 tales como:
(a) antígenos mosaico Gag incluyendo:
(a)(i) una primera secuencia de Gag mosaico ("mos1Gag") que tiene la secuencia de aminoácidos como la expuesta en el presente documento en la SEQ NO: 1, y
(a) (ii) una segunda secuencia de Gag mosaico ("mos2Gag") que tiene la secuencia de aminoácidos como la expuesta en el presente documento en la SEQ NO: 2;
(b) antígenos mosaico Pol incluyendo:
(b) (i) una primera secuencia de Pol mosaico ("mos1Pol") que tiene la secuencia de aminoácidos como la expuesta en el presente documento en la SEQ ID NO: 3, y
(b) (ii) una segunda secuencia de Pol mosaico ("mos2Pol") que tiene la secuencia de aminoácidos como la expuesta en el presente documento en la SEQ ID NO: 4; y
(c) antígenos mosaico Env incluyendo:
(c) (i) una primera secuencia de Env mosaico ("mos1Env") que tiene la secuencia de aminoácidos como la expuesta en el presente documento en la SEQ ID NO: 5, y
(c)(ii) una segunda secuencia de Env mosaico ("mos2Env") que tiene la secuencia de aminoácidos como la expuesta en el presente documento en la SEQ ID NO: 6.
Las secuencias que codifican estos antígenos se han clonado en vectores, por ejemplo, tales como en vectores adenovíricos, por ejemplo, adenovirus recombinante de serotipo 26 (rAd26), y estos vectores recombinantes se utilizaron previamente como vacunas para generar respuestas inmunitarias contra los antígenos (véase p. ej., Barouch et al, supra; y el documento WO 2010/059732. Por ejemplo, las secuencias de los antígenos mosaico mos1Gag y mos1Pol se combinan normalmente en una proteína de fusión de Gag y Pol ("mos1GagPol"), cuya secuencia codificante se clona en un primer vector Ad26 ("rAd26.mos1GagPol"); y las secuencias de los antígenos mos2Gag y mos2Pol se combinan en otra proteína de fusión de Gag y Pol ("mos2GagPol"), cuya secuencia codificante se clona en un segundo vector Ad26 ("rAd26.mos2GagPol"). Las construcciones que codifican mos1 Env y mos2Env se clonan normalmente en vectores Ad26 independientes ("rAd26.mos1Env" y "rAd26.mos2Env", respectivamente).
Un conjunto de tales antígenos mosaico como los descritos anteriormente proporciona una buena cobertura global de los aislados de VIH-1 del grupo M, donde los vectores rAd26 que codifican las secuencias de los antígenos 1 mosaico (p. ej., rAd26.mos1GagPol y rAd26.mos1Env) favorecen el clado B y los subtipos del VIH-1 CRF01 y los vectores rAd26 que codifican las secuencias de los antígenos 2 mosaico (p. ej., rAd26.mos2GagPol y rAd26.mos2Env) favorecen las cepas del clado C. Los antígenos Gag, Pol y Env del VIH-1 mosaico expresados en los vectores rAd26 se pueden utilizar para mejorar tanto la amplitud como la profundidad de las respuestas por linfocitos T específicos del antígeno en monos rhesus, sin comprometer el alcance de las respuestas celular y humoral cuando se comparan con los antígenos del VIH-1 de secuencia consenso o natural (Barouch et al, supra; y el documento WO 2010/059732.
Sin embargo, tras esfuerzos adicionales de desarrollo de los componentes de las vacunas descritas anteriormente, se observó que rAd26.mos2Env mostraba una expresión en la superficie celular y una respuesta inmunitaria no óptimas en primates no humanos, pero además mostró una estabilidad genética no descrita hasta la fecha, inesperada e impredecible no óptima durante el proceso de fabricación en comparación con otros vectores rAd26, tales como rAd26.mos1Env. Así pues, las vacunas que contienen rAd26.mos2Env pueden dar como resultado respuestas inmunitarias no óptimas contra los subtipos del VIH-1 del Clado C, ya que el antígeno mosaico mos2Env favorece a las cepas del VIH-1 del clado C. En consecuencia, se necesita una alternativa al antígeno mos2Env en las vacunas contra el VIH que se pueda utilizar para inducir respuestas inmunitarias mejoradas contra el clado C del VIH-1.
Breve sumario de la invención
La invención se refiere a proteínas de la envoltura del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) sintéticas novedosas que tienen una expresión en la superficie celular y una estabilidad genética mejoradas en comparación con el antígeno mos2Env descrito previamente. La invención también se refiere a composiciones y métodos para utilizar tales proteínas de la envoltura del VIH sintéticas novedosas y/o sus secuencias codificantes para inducir mayores respuestas inmunitarias contra el VIH-1, en particular contra el clado C del VIH-1, preferiblemente cuando se utilizan combinadas con otros antígenos del VIH.
En un aspecto general, la invención se refiere a un ácido nucleico que codifica una proteína de la envoltura del VIH sintética que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, o la SEQ ID NO: 8 que tiene una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en (i) I529P (es decir, una sustitución de lle por Pro en la posición 529 de la SEQ ID NO: 8), (ii) K480E (es decir, una sustitución de Lys por Glu en la posición 480 de la SEQ iD NO: 8) y (iii) una combinación de EK479-480RRRR (es decir, un reemplazo de Glu-Lys en las posiciones 479-480 de la SEQ ID NO: 8 por cuatro restos consecutivos de Arg), I529P, A471C (es decir, una sustitución de Ala por Cys en la posición 471 de la SEQ ID NO: 8) y T575C (es decir, una sustitución de Thr por Cys en la posición 575 de la SEQ ID NO: 8). En una realización, la proteína de la envoltura del VIH sintética comprende además una secuencia señal, por ejemplo, una secuencia señal que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 9-12. En una realización, la secuencia señal tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9. En ciertas realizaciones, la proteína de la envoltura del VIH sintética comprende además un dominio transmembrana, preferiblemente un dominio transmembrana que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13.
En ciertas realizaciones, la proteína de la envoltura de VIH sintética comprende además un fragmento de un dominio citoplasmático, preferiblemente un fragmento de un dominio citoplasmático que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o los aminoácidos 1-4 de esta (es decir, NRVR). En las realizaciones en las que la proteína de la envoltura del VIH sintética comprende además un dominio transmembrana y un fragmento de un dominio citoplasmático, se prefiere que la proteína comprenda también la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 37, que está fusionada con el extremo carboxilo (extremo C) de la SEQ ID NO: 8 y el extremo amino (extremo N) de la región transmembrana.
En otra realización, la proteína de la envoltura del VIH sintética comprende un dominio de trimerización, por ejemplo, un dominio de trimerización que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15 (GCN4) o la SEQ ID NO: 16 (dominio foldon). En una realización preferida, el dominio de trimerización comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15. Tales realizaciones con los dominios de trimerización son útiles para las proteínas de la envoltura del VIH sintéticas solubles (es decir, no unidas a la membrana) basadas en las secuencias del ectodominio proporcionadas en el presente documento, tales como la que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, en la que el dominio de trimerización está localizado en el extremo C de la proteína de la envoltura del VIH sintética.
En otras realizaciones más, la proteína de la envoltura del VIH sintética comprende la SEQ ID NO: 8 con las siguientes mutaciones: EK479-480RRRR, I529P, A471C y T575C. La introducción de 6 restos de arginina consecutivos (las posiciones 478 y 481 de la secuencia natural de la SEQ ID NO: 8 ya son restos de Arg) da como resultado un sitio de escisión de furina más optimizado, de manera que se obtiene un ectodominio con un procesado (es decir, escindido) mejorado. Las tres mutaciones de I529P, A471C y T575C son conocidas como mutaciones SOSIP, en las que las dos últimas mutaciones dan como resultado la introducción de un posible puente disulfuro entre los restos de cisteína recién creados. En general, estas mutaciones pueden dar como resultado una proteína de la envoltura del VIH sintética soluble, trimerizada, sin que sea necesario un dominio de trimerización.
En una realización preferida, la invención se refiere a un ácido nucleico que codifica una proteína de la envoltura del VIH sintética que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17, la SEQ ID NO: 18 o los aa 1 -686 de la SEQ ID NO: 19. Lo más preferiblemente, la proteína de la envoltura del VIH sintética codificada por el ácido nucleico comprende o está constituida por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18.
En otro aspecto general, la invención se refiere a un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una
proteína de la envoltura del VIH sintética de acuerdo con una realización de la invención. En una realización, el vector es un vector vírico. En una realización preferida, el vector vírico es un vector adenovírico. En una realización preferida, el vector adenovírico es un vector de adenovirus 26.
Otro aspecto general de la invención se refiere a una composición, preferiblemente una composición de vacuna, que comprende una cantidad inmunogénicamente eficaz de un vector de acuerdo con una realización de la invención y un vehículo, donde el ácido nucleico que codifica la proteína de la envoltura del VIH sintética está ligado operativamente a una secuencia promotora. En una realización, la composición comprende un vector de adenovirus, preferiblemente un vector de adenovirus 26, que codifica una proteína de la envoltura del VIH sintética que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18.
En otro aspecto general, la invención se refiere a una combinación de vacuna para inducir una respuesta inmunitaria contra un virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) en un sujeto que lo necesite. La combinación de vacuna comprende una primera composición que comprende una cantidad inmunogénicamente eficaz de un vector, preferiblemente un vector de adenovirus, más preferiblemente un vector de adenovirus 26, que codifica una proteína de la envoltura del VIH sintética que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18, una segunda composición que comprende una cantidad inmunogénicamente eficaz de un segundo vector, preferiblemente un segundo vector de adenovirus, más preferiblemente un segundo vector de adenovirus 26, que codifica un polipéptido antigénico del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 y, opcionalmente, al menos una composición adicional que comprende una cantidad inmunogénicamente eficaz de al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un vector que codifica un polipéptido antigénico que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-4, 28 y 29, y un polipéptido que comprende una cantidad inmunogénicamente eficaz de un polipéptido antigénico del VIH aislado, incluyendo, aunque no de forma limitativa, un polipéptido que tiene los restos 30-708 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 o un polipéptido que tiene los restos 30-724 de la SEQ ID NO: 36, en donde la primera composición, la segunda composición y la composición adicional opcional están presentes en la misma composición o en una o más composiciones diferentes. Otro aspecto general más de la invención se refiere a métodos para inducir una respuesta inmunitaria contra un virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar al sujeto una composición o combinación de vacuna de acuerdo con una realización de la invención. La invención también se refiere a métodos para inducir una respuesta inmunitaria contra un VIH que comprende la sensibilización y refuerzo de la respuesta inmunitaria utilizando una composición o una combinación de vacuna de acuerdo con una realización de la invención.
Un aspecto adicional más de la invención se refiere a una proteína de la envoltura del VIH sintética que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, o la SEQ ID NO: 8 que tiene una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en (i) I529P, (ii) K480E, (iii) una combinación de EK479-480RRRR, I529P, A471C y T575C. En una realización, la proteína de la envoltura del VIH sintética comprende la SEQ ID NO: 8 con las mutaciones EK479-480RRRR, I529p , A471C y T575C. En otra realización, la proteína de la envoltura del VIH sintética comprende los restos 30-704 o 30-711 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18. En otra realización más, la proteína de la envoltura del VIH sintética comprende los restos 30-686 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19.
Otro aspecto de la invención se refiere a una célula, preferiblemente una célula aislada, que comprende un vector de acuerdo con una realización de la invención.
Breve descripción de varias vistas de los dibujos
El sumario anterior, así como la siguiente descripción detallada de la invención, se entenderán mejor al leerlos junto con los dibujos adjuntos. Se debe sobreentender que la invención no se limita a las realizaciones precisas que se muestran en los dibujos.
En los dibujos:
Las FIGS. 1A-1C son representaciones esquemáticas de la estructura de las proteínas de la envoltura del VIH; La FIG. 1A muestra una proteína de la envoltura del VIH completa; La FIG. 1B muestra la estructura de una proteína de la envoltura del VIH de una sola cadena soluble de acuerdo con una realización de la invención en la cual el dominio transmembrana (TM) está reemplazado por un dominio de trimerización GCN4 y el sitio de escisión de furina está mutado (sC4); La FIG. 1C muestra la estructura de una proteína de la envoltura del VIH unida a la membrana de acuerdo con una realización de la invención que comprende un dominio transmembrana y un fragmento de un dominio citoplasmático (C4D7);
La FIG. 2 muestra los niveles de expresión de la proteína de la envoltura sC1 soluble, que se basa en la secuencia del antígeno mosaico mos2Env con un dominio de trimerización C-terminal adicional y una proteína de la envoltura del VIH sintética soluble (sC4) de acuerdo con una realización de la invención; la expresión se midió mediante transferencia Western cuantitativa utilizando un anticuerpo policlonal contra gp120; los plásmidos que codifican sC1 o sC4 se expresaron de manera transitoria dos veces y cada transfección se cuantificó dos veces
mediante densitometría; la proteína sC1 mostró unos niveles de expresión muy bajos en comparación con la proteína de la envoltura del VIH sintética sC4, que mostró unos niveles de expresión relativamente elevados; Las FIGS. 3A y 3B muestran la unión de las proteínas de la envoltura del VIH sintéticas con el anticuerpo monoclonal 17b (mAb17b) en presencia (gris claro) y ausencia (gris oscuro) de CD4 soluble según se determina mediante un ensayo ELISA; La FIG. 3A muestra la unión de sC1; La FIG. 3B muestra la unión de sC4;
La FIG. 4 es una imagen de una transferencia Western a partir de una electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones nativas de la proteína sC1 y la proteína de la envoltura del VIH sintética sC4;
La FIG. 5 muestra los niveles de expresión en la superficie celular relativos de las proteínas de la envoltura del VIH sintéticas C1, C1D7, C4 y C4D7 unidas a la membrana mediante un análisis FACS de las células que expresan estas proteínas utilizando un anticuerpo policlonal anti-gp120 (GP120) y mediante la unión a los anticuerpos ampliamente neutralizantes PG9 (PG9) y PG16 (PG16) que presentan una dependencia de la estructura cuaternaria y que se unen preferiblemente al trímero de Env plegado correctamente;
La FIG. 6 es una representación gráfica de la estabilidad de los vectores de adenovirus que contienen secuencias que codifican proteínas de la envoltura del VIH sintéticas de la invención incluida la C4 completa (FLC4), C4D7 y sC4.después de múltiples pases víricos; los vectores de adenovirus 26 recombinante se generaron en células PER.C6; después de 3 pases iniciales para la transfección y la purificación de placas, se seleccionaron 5 placas y se aumentó de escala durante 10 pases en un formato T25, lo que dio como resultado un número de pases víricos total (npv) de 13; se muestra la estabilidad después de 3, 5, 10 y 13 npv según se determina mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del casete del transgén E1; por ejemplo, 3/5 significa que de 5 placas examinadas 3 placas fueron estables y 5/5 significa que de 5 placas examinadas 5 placas fueron estables; y
Las FIGS. 7A y 7B muestran los títulos de neutralización de los virus contra partículas víricas pseudotipadas de la envoltura del VIH-1 (PVE) en un ensayo de neutralización con células TZM-bl en conejos; los valores de la CI50 con una transformación Iog10 de los grupos a los que se administraron dosis elevadas del vector adenovírico se midieron frente a PVE VSV-G (control negativo) y MW965.26 (Nivel 1A clado C) en las semanas 1,8, 14 y 20; cada punto representa el valor de la CI50 con una transformación Iog10 de un conejo individual, indicándose la media del grupo con una línea horizontal; HD: dilución más elevada examinada (línea continua superior); LD: dilución más baja examinada (línea continua inferior); LOB: límite de fondo, valor del percentil 95 de las muestras negativas recopiladas (línea discontinua); los valores log 10 de la CI50 que superaron el umbral LD o HD se colocaron en la línea correspondiente; se realizó una comparación no paramétrica unidireccional con control utilizando el método de Dunn para una clasificación conjunta para cada punto temporal; las diferencias estadísticamente significativas se indican en los gráficos: * = P<0,05, ** = P<0,01, y *** = P<0,001; La FIG. 7A muestra los resultados con VSV-G (control negativo); y la FIG. 7B muestra los resultados con MW965.26 (Nivel 1A clado C).
Descripción detallada de la invención
El análisis de documentos, actos, materiales, dispositivos, artículos o similares, el cual se ha incluido en la presente memoria descriptiva, tiene el fin de proporcionar contexto para la invención. Tal análisis no es una admisión de que todos o cualquiera de estos temas formen parte de la técnica anterior respecto a cualesquiera invenciones descritas o reivindicadas.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos científicos y técnicos utilizados en el presente documento tienen los mismos significados que los que normalmente conoce un experto habitual en la materia a la que pertenece esta invención. Por otro lado, ciertos términos utilizados en el presente documento tienen los significados que se exponen en la memoria descriptiva. Cabe destacar que tal como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una", y "el/la" incluyen la referencia en plural a menos que el contexto estipule claramente otra cosa.
Como se usa en el presente documento, "sujeto" significa cualquier animal, preferiblemente un mamífero, lo más preferiblemente un ser humano, al cual se administrará o se ha administrado un vector, composición o combinación de vacuna de acuerdo con las realizaciones de la invención. El término "mamífero" tal y como se usa en el presente documento, abarca cualquier mamífero. Los ejemplos de mamíferos incluyen, aunque no de forma limitativa, vacas, caballos, ovejas, cerdos, gatos, perros, ratones, ratas, conejos, cobayas, monos, seres humanos, etc., más preferiblemente, un ser humano.
La invención se refiere en general a proteínas de la envoltura del VIH sintéticas, ácidos nucleicos y vectores que codifican las proteínas de la envoltura del VIH sintéticas y métodos para inducir una respuesta inmunitaria contra el VIH con vectores que codifican las proteínas de la envoltura del VIH sintéticas o las proteínas de la envoltura del VIH sintéticas, solos o combinados con uno o más vectores adicionales que codifican uno o más polipéptidos antigénicos del VIH adicionales y/o combinados con uno o más polipéptidos antigénicos del VIH aislados adicionales.
El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es un miembro del género Lentivirinae, que forma parte de la familia Retroviridae. Dos especies del VIH infectan a los seres humanos: VIH-1 y VIH-2. El VIH-1 es la cepa más común del virus VIH y se sabe que es más patógena que el VIH-2. Como se usa en el presente documento, la expresión "virus de la inmunodeficiencia humana" y el término "VIH" se refieren, aunque no de forma limitativa, al VIH-1 y VIH-2.
el VIH se clasifica en múltiples ciados con un alto grado de divergencia genética. Como se usa en el presente documento, la expresión "clado del VIH" o "subtipo del VIH" se refiere a virus de la inmunodeficiencia humana relacionados clasificados de acuerdo con su grado de similitud genética. En la actualidad existen tres grupos de aislados del VIH-1: M, N y O. El grupo M (cepas principales) consiste en al menos diez clados, de la A a la J. El grupo O (otras cepas) puede consistir en un número similar de clados. El grupo N es un aislado del VIH-1 nuevo que no se ha clasificado ni en el grupo M ni en el O.
Como se usa en el presente documento, las expresiones "polipéptido antigénico del VIH", "proteína antigénica del VIH", e "inmunógeno del VIH" se refieren a un polipéptido capaz de inducir una respuesta inmunitaria, por ejemplo, una respuesta de tipo celular y/o humoral, contra el VIH en un sujeto. El polipéptido antigénico puede ser una proteína del VIH, un fragmento o un epítopo de esta, o una combinación de múltiples proteínas del VIH o porciones de estas, que pueden inducir una respuesta inmunitaria o producir inmunidad, por ejemplo, inmunidad protectora, contra el VIH en un sujeto.
Preferiblemente, un polipéptido antigénico es capaz de provocar en un hospedador una respuesta inmunitaria protectora, por ejemplo, inducir una respuesta inmunitaria contra una infección o enfermedad vírica, y/o producir una inmunidad (es decir, vacunados) en un sujeto contra una infección o enfermedad vírica, que protege al sujeto contra la infección o enfermedad vírica. Por ejemplo, el polipéptido antigénico puede comprender una proteína o fragmentos de esta del virus de la inmunodeficiencia de simios (VIS) o de un VIH, tal como la proteína de la envoltura gp160 del VIS o del VIH, las proteínas de la matriz/cápside del VIS o del VIH y los productos de los genes gag, po ly env.
Un polipéptido antigénico del VIH puede ser cualquier antígeno o fragmento de este del VIH-1 o VIH-2. Ejemplos de antígenos del VIH incluyen, pero sin limitación, los productos de los genes gag, pol, y env, que codifican proteínas estructurales y enzimas esenciales. Los productos de los genesGag, pol y env se sintetizan como poliproteínas, que son procesadas adicionalmente para obtener múltiples productos proteicos diferentes. El producto proteico primario del gen gag es la proteína estructural vírica, la poliproteína gag, que se procesa adicionalmente en los productos proteicos MA, CA, SP1, NC, SP2 y P6. El gen pol codifica enzimas víricas (Pol, polimerasa) y el producto proteico primario se procesa adicionalmente en los productos proteicos RT, RNasa H, IN y PR. El gen env codifica proteínas estructurales, específicamente glucoproteínas de la envoltura del virión. El producto proteico primario del gen env es gp160, que se procesa adicionalmente en gp120 y gp41. Otros ejemplos de antígenos del VIH incluyen las proteínas reguladoras de genes Tat y Rev; las proteínas complementarias Nef, Vpr, Vif y Vpu; las proteínas de la cápside, las proteínas de la nucleocápside y la proteína vírica p24.
En ciertas realizaciones, el polipéptido antigénico del VIH comprende un antígeno Gag, Env o Pol del VIH, o cualquier porción antigénica o epítopo o combinación de estos, preferiblemente un antígeno Gag, Env o Pol del VIH-1 o cualquier porción antigénica o epítopo o combinación de estos.
Los polipéptidos antigénicos del VIH también pueden ser antígenos del VIH mosaico. Como se usa en el presente documento, "antígeno mosaico" se refiere a una proteína recombinante ensamblada a partir de fragmentos de secuencias naturales. Los antígenos mosaico se parecen a los antígenos naturales, pero están optimizados para maximizar la cobertura de posibles epítopos de los linfocitos T que se observan en las secuencias naturales, lo que mejora la amplitud y cobertura de la respuesta inmunitaria. Los antígenos del VIH mosaico para su uso con la invención son preferiblemente los antígenos Gag, Pol y/o Env mosaico y, más preferiblemente, un antígeno Gag, Pol y/o Env del VIH-1 mosaico, Como se usa en el presente documento, "un antígeno Gag, Pol y/o Env mosaico" se refiere específicamente a un antígeno mosaico que comprende múltiples epítopos obtenidos a partir de una o más de las secuencias de las poliproteínas Gag, Pol y/o Env del VIH.
En una realización, un antígeno del VIH mosaico para su uso con la invención es un antígeno Gag del VIH mosaico con epítopos obtenidos a partir de las secuencias de los productos del gen gag (se proporcionan ejemplos en las SEQ ID NO: 1, 2); un antígeno Pol del VIH mosaico con epítopos obtenidos a partir de las secuencias de los productos del gen pol (se proporcionan ejemplos en las SEQ ID NO: 3, 4); o un antígeno Env del VIH mosaico con epítopos obtenidos a partir de las secuencias de los productos del gen env (se proporcionan ejemplos en las SEQ ID NO: 5, 6; los antígenos novedosos de la invención, p. ej. en las SEQ ID NO: 8, 17, 18, 19, también se pueden considerar antígenos Env del VIH mosaico). En ciertas realizaciones, un antígeno del VIH mosaico para su uso con la invención puede comprender una combinación de epítopos obtenidos a partir de secuencias de los productos de los genes gag, pol, y/o env. Los ejemplos ilustrativos y no limitantes incluyen los antígenos Env-Pol mosaico con epítopos obtenidos a partir de las secuencias de los productos de los genes env y pol; antígenos Gag-Pol mosaico con epítopos obtenidos a partir de las secuencias de los productos de los genes gag y pol; antígenos Gag-Env mosaico con epítopos obtenidos a partir de las secuencias de los productos de los genes gag y env. Las secuencias de los productos de los genes gag, pol, y env se pueden obtener a partir de uno o más clados.
Ejemplos de antígenos Gag, Pol y/o Env del VIH mosaico que se pueden usar en la invención incluyen los descritos en, por ejemplo, US20120076812; Barouch et al., Nat Med 2010, 16:319-323; y Barouch et al., Cell 155:1-9, 2013, todas las cuales se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad. Preferiblemente, los antígenos Gag, Pol y/o Env del VIH mosaico para su uso con la presente invención incluyen, aunque no de forma
limitativa, mosIGag (SEQ ID NO: 1), mos2Gag (SEQ ID NO: 2), mosl Pol (SEQ ID NO: 3), mos2Pol (SEQ ID NO: 4), mosl Env (SEQ ID NO: 5), mos2Env (SEQ ID nO: 6), mos1GagPol (SEQ ID NO: 28), mos2GagPol (SEQ ID NO: 29), y combinaciones de estos.
Como se usa en el presente documento, cada una de las expresiones "proteína de la envoltura del VIH", "proteína env", y "Env" se refiere a una proteína que se expresa en la envoltura de un virión de un VIH y que permite a un VIH dirigirse y unirse a la membrana plasmática de las células infectadas por VIH, o un fragmento o un derivado de esta que puede inducir una respuesta inmunitaria o producir inmunidad contra el VIH en un sujeto que lo necesite. El gen env del VIH codifica la proteína precursora gp160, que es escindida proteolíticamente en dos glucoproteínas de la envoltura maduras, gp120 y gp41. La reacción de escisión está mediada por una proteasa de la célula hospedadora, la furina, en una secuencia sumamente conservada en los precursores glucoproteicos de la envoltura retrovírica. Más específicamente, gp160 trimeriza a (gp160)3 y a continuación, experimenta la escisión en dos gp120 y gp41 asociadas de manera no covalente. La entrada del virus está mediada posteriormente por un trímero de los heterodímeros gp120/gp41. Gp120 es el fragmento de unión del receptor y se une al receptor CD4 en una célula diana que tiene un receptor de este tipo, tal como, por ejemplo, un linfocito T cooperador. Gp41, que está unido a gp120 de manera no covalente, es el fragmento de fusión y proporciona la segunda etapa mediante la cual el VIH entra en la célula. Gp41 se encuentra en un principio enterrado en la envoltura vírica, pero cuando gp120 se une al receptor CD4, gp120 cambia su conformación lo que provoca que gp41 quede expuesto, de modo que puede facilitar la fusión con la célula hospedadora. Gp140 es el ectodominio no escindido de gp160 trimérico, es decir, (gp160)3 , que se ha utilizado como un sustituto para el estado nativo de la protuberancia vírica escindida.
Según realizaciones de la invención, una "proteína de la envoltura del VIH" puede ser una proteína gp160, gp140, gp120, gp41, combinaciones, fusiones, truncamientos o derivados de estos. Por ejemplo, una "proteína de la envoltura del VIH" puede incluir una proteína gp120 asociada de manera no covalente con una proteína gp41. También puede incluir una proteína gp140 trimérica estabilizada que puede tener o haberse modificado para incluir un dominio de trimerización que estabilice trímeros de gp140. Los ejemplos de dominios de trimerización incluyen, aunque no de forma limitativa, el dominio de trimerización "foldon" de la fibritina T4; el dominio de trimerización de la superhélice obtenido a partir de GCN4; y la subunidad catalítica de la aspartato-transcarbamoilasa de E. coli como una etiqueta trimérica. Una "proteína de la envoltura del VIH" también puede ser una proteína de la envoltura del VIH truncada incluyendo, aunque no de forma limitativa, proteínas de la envoltura que comprenden un truncamiento C-terminal en el ectodominio (es decir, el dominio que se extiende en el espacio extracelular), un truncamiento en gp41, tal como un truncamiento en el dominio transmembrana de gp41 o un truncamiento en el dominio citoplasmático de gp41. Una "proteína de la envoltura del VIH" puede además ser un derivado de una proteína de la envoltura del VIH de origen natural que tiene mutaciones en la secuencia, por ejemplo, en los sitios de escisión de furina, y/o las denominadas mutaciones SOSIP.
Preferiblemente, una "proteína de la envoltura del VIH" es una "proteína de la envoltura del VIH sintética". Como se usa en el presente documento, la expresión "proteína de la envoltura del VIH sintética" se refiere a una proteína de la envoltura del VIH que no tiene un origen natural que está optimizada para inducir una respuesta inmunitaria o producir inmunidad contra una o más cepas del VIH de origen natural en un sujeto que lo necesite. Las proteínas Env del VIH mosaico son ejemplos de proteínas Env del VIH sintéticas y la invención proporciona antígenos Env del VIH sintéticos novedosos, por ejemplo, los comprendidos en las SEQ ID NO: 8, 17, 18, o 19.
Proteínas de la envoltura del VIH sintéticas y secuencias que codifican las mismas
Las realizaciones de la invención se refieren a proteínas de la envoltura del VIH sintéticas novedosas y moléculas de ácido nucleico que las codifican.
En una realización, la invención se refiere a una proteína de la envoltura del VIH sintética que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, o la SEQ ID NO: 8 que tiene una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en (i) I529P, (ii) K480E, y (iii) una combinación de EK479-480RRRR, I529P, A471C y T575C. La SEQ ID NO: 8 comprende una gp120 madura sintética y una gp41 truncada sintética sin la región transmembrana, ni el dominio citoplasmático. La SEQ ID NO: 8 es una secuencia que no tiene un origen natural que comprende una quimera de secuencias del antígeno mosaico mos2Env (SEQ ID NO: 6) y otras secuencias de proteínas de la envoltura del VIH. La secuencia del antígeno Env sintético novedoso que comprende la SEQ ID NO: 8 está optimizada para proporcionar una cobertura amplia y una respuesta de linfocitos T potenciada contra el clado C del VIH (en comparación con el antígeno mos2Env (SEQ ID NO: 6)). En ciertas realizaciones, se pueden añadir más aminoácidos a la SEQ ID NO: 8 o una de sus variantes definidas en el presente documento.
En ciertas realizaciones, la proteína de la envoltura del VIH sintética comprende además una secuencia señal. La proteína de la envoltura del VIH sintética se sintetiza con una secuencia señal que es escindida de la cadena polipeptídica naciente durante su transporte al lumen del retículo endoplasmático (RE). En principio, se podría utilizar cualquier secuencia señal conocida. Preferiblemente, se utiliza una secuencia señal Env del VIH o una variante de esta. En la técnica se han utilizado diferentes secuencias señal para proteínas Env del VIH (véase p. ej. el documento WO 2014/107744). En ciertas realizaciones, las secuencias señal comprenden la SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 o s Eq ID NO: 12. En una realización preferida, la secuencia señal comprende la SEQ ID NO: 9.
En ciertas realizaciones, la proteína de la envoltura del VIH sintética comprende además un dominio transmembrana. El dominio transmembrana ancla la proteína de la envoltura del VIH sintética a la membrana del RE y contribuye al ensamblaje de la membrana y a la función de la envoltura del VIH. Preferiblemente, el dominio transmembrana comprende la SEQ ID NO: 13.
En otra realización, la proteína de la envoltura del VIH sintética comprende una gp41 que tiene un dominio citoplasmático truncado. La gp41 tiene un dominio citoplasmático inusualmente largo en su extremo carboxilo, normalmente de aproximadamente 150 aminoácidos (Edwards et al., J. Virology, 2002, 76:2683-2691). Se ha descrito que el truncamiento del dominio citoplasmático induce la exposición de regiones conservadas en el ectodominio de la proteína Env del VIH-1 (Id.). El dominio citoplasmático truncado en una envoltura del VIH sintética de la invención puede variar desde uno hasta aproximadamente 140 aminoácidos, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, o 140 aminoácidos de un dominio citoplasmático completo. En ciertas realizaciones, el dominio citoplasmático truncado se obtiene a partir de los aminoácidos 704-862 de la SEQ ID NO: 17 (es decir, a partir del dominio citoplasmático de la molécula C4 de la invención), mediante un truncamiento después de un aminoácido dado hasta el extremo C. En una realización preferida, la proteína de la envoltura del VIH sintética comprende un dominio citoplasmático truncado que tiene de 1 a 10 restos de aminoácidos, más preferiblemente de 4 a 8 restos de aminoácidos y, lo más preferiblemente, 7 restos de aminoácidos de un dominio citoplasmático de gp41 del VIH. El dominio citoplasmático, o el fragmento de este, de una proteína de la envoltura del VIH sintética tiene una ubicación C- terminal respecto al dominio extracelular (ectodominio) y cuando la proteína de la envoltura del VIH sintética también comprende un dominio transmembrana, el dominio citoplasmático, o el fragmento de este, tiene una ubicación C-terminal respecto al dominio transmembrana. Véase, por ejemplo, las FIGS. 1A y 1C. En una realización particular, la proteína de la envoltura del VIH sintética comprende una gp41 con un dominio citoplasmático truncado que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o un fragmento de esta, tal como los restos 1-4 de esta (es decir, NRVR). Se han descrito y se podrían utilizar otros dominios citoplasmáticos truncados (p. ej. Schiernle et al., PNAS 1997; Abrahamyan et al., J Virol 2005).
En las realizaciones en las que la proteína de la envoltura del VIH sintética comprende además un dominio transmembrana y un fragmento de un dominio citoplasmático, se prefiere que la proteína comprenda también la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 37, que contiene los restos 655-682 de la SEQ ID NO: 18, en donde la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 37 está fusionada al extremo C de la SEQ ID NO: 8 y al extremo N del domino transmembrana.
En una realización particularmente preferida de la invención, la proteína de la envoltura del VIH sintética comprende además un dominio transmembrana, tal como el que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13, y un dominio citoplasmático truncado o un fragmento del dominio citoplasmático, tal como el que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o los restos 1-4 de la SEQ ID NO: 14 (es decir, NRVR). Lo más preferiblemente, la proteína de la envoltura del VIH sintética comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18, con o sin la secuencia señal (es decir, los restos de aminoácidos 1-29 de la SEQ ID NO: 18).
En otra realización, la proteína de la envoltura del VIH sintética comprende un dominio de trimerización que sustituye a una región transmembrana Env. El dominio de trimerización aumenta la estabilidad de una estructura trimérica Env. Preferiblemente, la proteína de la envoltura del VIH sintética comprende un polipéptido gp140 que se modifica para incluir un dominio de trimerización que estabiliza trímeros de gp140. Los ejemplos de dominios de trimerización incluyen, aunque no de forma limitativa, el dominio de trimerización "foldon" de la fibritina T4, tal como el que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID: 16; el dominio de trimerización de la superhélice obtenido a partir de GCN4, tal como el que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID: 15; la subunidad catalítica de la aspartato transcarbamoilasa de E. coli como una etiqueta trimérica; o motivos de trimerización basados en la matrilina. Si está presente, el dominio de trimerización tiene normalmente una ubicación C-terminal respecto al dominio extracelular (véase la FIG. 1B). En ciertas realizaciones preferidas donde la proteína de la envoltura del VIH sintética comprende un dominio de trimerización, la proteína de la envoltura del VIH sintética comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19, con o sin la secuencia señal (es decir, los restos de aminoácidos 1 29 de la SEQ ID NO: 19). Estas realizaciones con dominios de trimerización son principalmente útiles para las variantes de ectodominios solubles de la proteína de la envoltura del VIH sintética. En ciertas realizaciones de tales variantes solubles de la invención, es posible mutar el sitio de escisión de furina (p. ej., mutación de Lys en Glu en la posición 480 de la SEQ ID NO: 8) para inactivar este sitio de escisión, de manera que la proteína tenga una sola cadena; esto combina bien con un dominio de trimerización, especialmente con el dominio de trimerización GCN4 de la SEQ ID NO: 19.
Las versiones alternativas de tales variantes de ectodominios solubles de la proteína de la envoltura del VIH sintética sin utilizar dominios de trimerización también son realizaciones de la invención y se pueden preparar a partir de la SEQ ID NO: 8 combinando mutaciones que optimicen el sitio de escisión de furina (reemplazando el dipéptido Gly-Lys en las posiciones 479-480 por cuatro restos de Arg) así como también las denominadas mutaciones SOSIP (mutación l>P en la posición 529, e introducción de un puente disulfuro entre las posiciones 471 y 575 reemplazando
las respectivas Ala y Thr en esas posiciones en la SEQ ID NO: 8 con un resto de Cys cada una). Esto da lugar a una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 con la siguiente combinación de mutaciones: EK479-480RRRR, I529P, A471C y T575C.
Una modificación posible para aumentar aún más el contenido trimérico de una proteína de la envoltura del VIH sintética de la invención (que comprende la SEQ ID NO: 8) es la modificación de Ile en Pro en la posición 529. Esta puede ser eficaz tanto para las variantes solubles como las unidas a la membrana.
Vectores
Otro aspecto general de la invención se refiere a vectores que comprenden ácido nucleico que codifica una proteína de la envoltura del VIH sintética. Según realizaciones de la invención, los vectores pueden comprender cualquiera de las proteínas de la envoltura del VIH sintéticas descritas en el presente documento. En una realización preferida de la invención, el vector comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de la envoltura del VIH sintética que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ iD NO: 8, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, o SEQ ID NO: 19, y más preferiblemente SEQ ID NO: 18.
Según realizaciones de la invención, el ácido nucleico que codifica la proteína de la envoltura del VIH sintética está ligado operativamente a un promotor, lo que significa que el ácido nucleico está bajo el control de un promotor. El promotor puede ser un promotor homólogo (es decir, obtenido a partir de la misma fuente genética que el vector) o un promotor heterólogo (es decir, obtenido a partir de un vector o una fuente genética diferentes). Ejemplos de promotores adecuados incluyen el promotor del citomegalovirus (CMV) y el promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV). Preferiblemente, el promotor está ubicado en dirección 5’ respecto al ácido nucleico dentro de un casete de expresión. Un ejemplo de secuencia promotora de CMV que puede estar ligada operativamente al ácido nucleico que codifica la proteína de la envoltura del VIH sintética se muestra en la SEQ ID NO: 24.
Según realizaciones de la invención, un vector puede ser un vector de expresión. Los vectores de expresión incluyen, aunque no de forma limitativa, vectores para la expresión de proteínas recombinantes y un vector para la administración de ácido nucleico a un sujeto para la expresión en un tejido del sujeto, tal como un vector vírico. Los ejemplos de vectores víricos adecuados para su uso con la invención incluyen, pero no se limitan a vectores adenovíricos, vectores de virus adenoasociados, vectores del virus de la viruela, vectores MVA, vectores de virus entéricos, vectores del virus de la encefalitis equina de Venezuela, vectores del virus del bosque Semliki, vectores del virus del mosaico del tabaco, vectores lentivíricos, etc. El vector también puede ser un vector no vírico. Los ejemplos de vectores no víricos incluyen, pero sin limitación, plásmidos, cromosomas bacterianos artificiales, cromosomas de levadura artificiales, bacteriófagos, etc.
En determinadas realizaciones de la invención, el vector es un vector adenovírico. Un adenovirus de acuerdo con la invención pertenece a la familia de los Adenoviridae y preferiblemente es uno que pertenece al género Mastadenovirus. Puede ser un adenovirus humano, pero también un adenovirus que infecte a otras especies, que incluyen, pero sin limitación, un adenovirus bovino (p. ej., adenovirus bovino 3, BAdV3), un adenovirus canino (p. ej., CAdV2), un adenovirus porcino (p. ej., PAdV3 o 5) o un adenovirus de simio (que incluye un adenovirus de monos y un adenovirus de simios, tal como un adenovirus de chimpancé o un adenovirus de gorila). Preferiblemente, el adenovirus es un adenovirus humano (HadV o AdHu) o un adenovirus de simio tal como un adenovirus de chimpancé o gorila (ChAd, AdCh o SAdV). En la invención, se entiende que es un adenovirus humano si se hace referencia a Ad sin indicar la especie, p. ej., la notación breve "Ad26" significa lo mismo que HadV26, que es el adenovirus humano de serotipo 26. Como también se usan en el presente documento, la notación "rAd" significa adenovirus recombinante, por ejemplo, "rAd26" se refiere a un adenovirus 26 humano recombinante.
Los estudios más avanzados se han realizado utilizando adenovirus humanos y, de acuerdo con ciertos aspectos de la invención, se prefieren adenovirus humanos. En determinadas realizaciones preferidas, un adenovirus recombinante de acuerdo con la invención está basado en un adenovirus humano. En realizaciones preferidas, el adenovirus recombinante está basado en un adenovirus humano del serotipo 5, 11,26, 34, 35, 48, 49, 50, 52, etc. De acuerdo con una realización particularmente preferida de la invención, un adenovirus es un adenovirus humano del serotipo 26. Una ventaja de este serotipo es una baja seroprevalencia y/o títulos bajos de anticuerpos neutralizantes preexistentes en la población humana y la experiencia con su uso en sujetos humanos en ensayos clínicos.
Los adenovirus de simios por lo general también tienen una baja seroprevalencia y/o títulos bajos de anticuerpos neutralizantes preexistentes en la población humana y se ha publicado una cantidad significativa de investigaciones que utilizan vectores de adenovirus de chimpancé (p. ej., los documentos US6083716; WO 2005/071093; WO 2010/086189; WO 2010085984; Farina et al, 2001, J Virol 75: 11603-13 [13]; Cohen et al, 2002, J Gen Virol 83: 151 55 [69]; Kobinger et al, 2006, Virology 346: 394-401 [70]; Tatsis et al., 2007, Molecular Therapy 15: 608-17 [71]; véase también la revisión de Bangari y Mittal, 2006, Vaccine 24: 849-62 [72]; y la revisión de Lasaro y Ertl, 2009, Mol Ther 17: 1333-39 [73]). Por lo tanto, en otras realizaciones, el adenovirus recombinante de acuerdo con la invención está basado en un adenovirus de simio, por ejemplo, un adenovirus de chimpancé. En ciertas realizaciones, el adenovirus recombinante se basa en el adenovirus de simios de tipo 1, 7, 8, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.1, 28.1, 29, 30, 31.1,32, 33, 34, 35.1,36, 37.2, 39, 40.1,41.1,42.1,43, 44, 45, 46, 48, 49, 50 o SA7P.
Preferiblemente, el vector de adenovirus es un vector vírico recombinante deficiente en la replicación, tales como rAd26, rAd35, rAd48, rAd5HVR48, etc.
En una realización preferida de la invención, los vectores adenovíricos comprenden proteínas de la cápside procedentes de serotipos raros que incluyen Ad26. En la realización típica, el vector es un virus rAd26. Una "proteína de la cápside de adenovirus" se refiere a una proteína de la cápside de un adenovirus (p. ej., los vectores Ad26, Ad35, rAd48, rAd5HVR48) que están implicados en la determinación del serotipo y/o tropismo de un adenovirus particular. Las proteínas de la cápside normalmente incluyen las proteínas de la fibra, pentona y/o hexona. Como se usa en el presente documento una "proteína de la cápside" para un adenovirus particular, tal como una "proteína de la cápside de Ad26" puede ser, por ejemplo, una proteína de la cápside quimérica que incluye al menos una parte de una proteína de la cápside de Ad26. En ciertas realizaciones, la proteína de la cápside es una proteína de la cápside completa de Ad26. En ciertas realizaciones, la hexona, la pentona y la fibra son de Ad26.
Un experto habitual en la materia comprenderá que se pueden combinar elementos obtenidos a partir de múltiples serotipos en un único vector de adenovirus recombinante. Así pues, se puede producir un adenovirus quimérico que combina propiedades deseables de diferentes serotipos. Así pues, en algunas realizaciones, un adenovirus quimérico de la invención podría combinar la ausencia de inmunidad preexistente de un primer serotipo con características tales como la estabilidad térmica, ensamblaje, anclaje, rendimiento de producción, infección redirigida o mejorada, estabilidad del ADN en la célula diana y similares.
En ciertas realizaciones, el vector de adenovirus recombinante útil en la invención se obtiene principal o totalmente de Ad26 (es decir, el vector es rAd26). En algunas realizaciones, el adenovirus es deficiente en la replicación, p. ej., debido a que contiene una deleción en la región E1 del genoma. Para los adenovirus obtenidos a partir de adenovirus que no pertenecen al grupo C, tal como Ad26 o Ad35, es habitual intercambiar la secuencia codificante E4-orf6 del adenovirus por la E4-orf6 de un adenovirus del subgrupo C humano, tal como Ad5. Esto permite la propagación de tales adenovirus en líneas celulares complementarias muy conocidas que expresan los genes E1 de Ad5, tales como, por ejemplo, las células 293, células PER.C6 y similares (véase, p. ej., Havenga, et al., 2006, J Gen Virol 87: 2135-43; WO 03/104467). Sin embargo, tales adenovirus no serán capaces de replicarse en células no complementarias que no expresen los genes E1 de Ad5.
La preparación de vectores adenovíricos recombinantes es muy conocida en la técnica. La preparación de los vectores de rAd26 se describe, por ejemplo, en el documento WO 2007/104792 y en Abbink et al., (2007) Virol 81 (9): 4654-63. Ejemplos de secuencias del genoma de Ad26 se encuentran en GenBank Acceso EF 153474 y en la SEQ ID NO: 1 del documento WO 2007/104792. Los ejemplos de vectores útiles para la invención incluyen, por ejemplo, los descritos en el documento WO2012/082918, cuya divulgación se incorpora al presente documento por referencia en su totalidad.
Normalmente, un vector útil en la invención se produce utilizando un ácido nucleico que comprende el genoma adenovírico recombinante completo (p. ej., un plásmido, cósmido o vector de baculovirus). Así pues, la invención también proporciona moléculas de ácido nucleico aislado que codifican los vectores adenovíricos de la invención. Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden estar en forma de ARN o en forma de ADN obtenido por clonación o producido sintéticamente. El ADN puede ser bicatenario o monocatenario.
Los vectores de adenovirus útiles en la invención son normalmente deficientes en la replicación. En estas realizaciones, el virus se vuelve deficiente en la replicación mediante la deleción o inactivación de regiones vitales para la replicación del virus, tales como la región E1. Las regiones pueden eliminarse o inactivarse sustancialmente, por ejemplo, insertando un gen de interés, tal como un gen que codifica una proteína de la envoltura del VIH sintética (normalmente ligado a un promotor) o un gen que codifica un polipéptido antigénico del VIH (normalmente ligado a un promotor) dentro de la región. En algunas realizaciones, los vectores de la invención pueden contener deleciones en otras regiones, tales como las regiones E2, E3 o E4, o inserciones de genes heterólogos ligados a un promotor dentro de una o más de estas regiones. Para los adenovirus mutados en E2 y/o E4, se utilizan generalmente líneas celulares complementarias E2 y/o E4 para generar adenovirus recombinantes. Las mutaciones en la región E3 del adenovirus no necesitan estar complementadas por la línea celular, ya que no se requiere E3 para la replicación.
Normalmente se utiliza una línea celular empaquetadora para producir cantidades suficientes de vectores de adenovirus para su uso en la invención. Una célula empaquetadora es una célula que comprende aquellos genes que han sido eliminados o inactivados en un vector deficiente en la replicación, permitiendo de esta manera que el virus se replique en la célula. Las líneas celulares empaquetadoras para los adenovirus con una deleción en la región E1 incluyen, por ejemplo, PER.C6, 911.293, y E1 A549.
De acuerdo con las realizaciones de la invención, y como se ha señalado anteriormente, cualquiera de las proteínas de la envoltura del VIH sintéticas descritas en el presente documento se pueden expresar en los vectores de la invención. Dada la degeneración del código genético, el experto es completamente consciente de que se pueden diseñar varias secuencias de ácido nucleico que codifiquen la misma proteína, de acuerdo con métodos totalmente rutinarios en la técnica. El ácido nucleico que codifica la proteína de la envoltura del VIH sintética puede
opcionalmente tener los codones optimizados para garantizar una expresión adecuada en la célula hospedadora tratada (p. ej., humana). La optimización de codones es una tecnología ampliamente aplicada en la técnica. Algunos ejemplos no limitantes de secuencias que codifican una proteína de la envoltura del VIH sintética de la invención se proporcionan en las SEQ ID NO: 25, 26 y 27. Normalmente, el ácido nucleico que codifica la proteína de la envoltura del VIH sintética se clona en la región E1 y/o E3 del genoma adenovírico.
En una realización preferida de la invención, el vector es un vector de adenovirus y, más preferiblemente, un vector de rAd26, o lo más preferiblemente un vector de rAd26 con al menos una deleción en la región E1 del genoma adenovírico, p. ej., como el descrito en Abbink, J Virol, 2007. 81(9): p. 4654-63, que se incorpora en el presente documento por referencia.
La invención también proporciona células, preferiblemente células aisladas, que comprenden cualquiera de los vectores descritos en el presente documento. Las células se pueden utilizar para la producción de proteínas recombinantes o para la producción de partículas víricas.
Por lo tanto, las realizaciones de la invención también se refieren a un método para producir un polipéptido antigénico del VIH sintético. El método comprende transfectar una célula hospedadora con un vector de expresión que comprende ácido nucleico que codifica el polipéptido antigénico del VIH sintético ligado operativamente a un promotor, cultivar la célula transfectada en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido antigénico del VIH sintético y aislar el polipéptido antigénico del VIH sintético de la célula. El polipéptido antigénico del VIH sintético se puede aislar o recoger a partir de la célula mediante cualquier método conocido en la técnica incluida la cromatografía por afinidad, etc. Las técnicas utilizadas para la expresión de proteínas recombinantes serán evidentes para el experto en la materia en vista de la presente divulgación.
La invención también incluye un método para producir un vector que codifica un polipéptido antigénico del VIH sintético de la invención, comprendiendo el método cultivar una célula que comprende el vector, propagar y multiplicar el vector durante dicho cultivo y aislar el vector que codifica el polipéptido antigénico del VIH sintético de la invención a partir del cultivo de células, p. ej., de las células, del medio de cultivo o de ambos. El vector se puede purificar adicionalmente de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona un vector de acuerdo con una realización de la invención que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido antigénico del VIH sintético y, en ciertas realizaciones ilustrativas, el ácido nucleico tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 25, 26 y 27.
Composiciones
En otro aspecto general, la invención se refiere a una composición que comprende un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de la envoltura del VIH sintética y un vehículo. Según realizaciones de la invención, cualquiera de los vectores descritos en el presente documento se pueden incluir en la composición. Preferiblemente, el vector es un vector vírico, más preferiblemente un vector de adenovirus y, aún más preferiblemente, un vector de adenovirus 26. En una realización preferida, una composición comprende un vector de adenovirus, preferiblemente un vector de adenovirus 26 que codifica una proteína de la envoltura del VIH sintética que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ Id NO: 8, la SeQ ID NO: 18, o la SEQ ID NO: 19, y más preferiblemente la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18.
En un aspecto, la invención proporciona una combinación de vacuna que comprende uno o más vectores juntos que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican (i) una proteína de la envoltura del VIH sintética que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 (p. ej., la SEQ ID NO: 18 o 19) y (ii) una segunda proteína de la envoltura del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5. Cada uno de los vectores puede estar en una composición independiente o se pueden combinar en una única composición. Se pretende que ambos ácidos nucleicos en el vector o vectores se administren a un sujeto, lo que dará como resultado una respuesta inmunitaria frente al VIH que es más amplia que la respuesta inmunitaria que se obtendría después de la administración de cualquiera de los vectores solos. Ambas secuencias de ácido nucleico pueden estar presentes en un único vector.
Según realizaciones de la invención, una composición comprende una cantidad inmunogénicamente eficaz de un vector, tal como un vector vírico. Como se usa en el presente documento, "cantidad inmunogénicamente eficaz" o "cantidad inmunológicamente eficaz" significa una cantidad de una composición suficiente para inducir una respuesta inmunitaria o efecto inmunitario deseados en un sujeto que lo necesite. En una realización, una cantidad inmunogénicamente eficaz significa una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto que lo necesite. En otra realización, una cantidad inmunogénicamente eficaz significa una cantidad suficiente para producir inmunidad en un sujeto que lo necesite, por ejemplo, proporcionar un efecto protector contra una enfermedad tal como una infección vírica. Una cantidad inmunogénicamente eficaz puede variar dependiendo de varios factores, tales como el estado físico del sujeto, edad, peso, salud, etc.; la aplicación concreta, si se va a inducir una respuesta inmunitaria o proporcionar inmunidad protectora; el vector recombinante específico
administrado; el inmunógeno o polipéptido antigénico codificado por el vector recombinante administrado; el polipéptido antigénico específico administrado; y la enfermedad particular, por ejemplo, infección vírica, para la cual se desea la inmunidad. El experto en la materia puede determinar fácilmente una cantidad inmunogénicamente eficaz en vista de la presente divulgación.
Como guía general, una cantidad inmunogénicamente eficaz cuando se utiliza haciendo referencia a un vector vírico recombinante tal como un vector adenovírico puede estar comprendida entre aproximadamente 108 partículas víricas y aproximadamente 1012 partículas víricas, por ejemplo 108, 109, 1010, 1011, o 1012 partículas víricas. Se puede administrar una cantidad inmunogénicamente eficaz en una única composición o en múltiples composiciones, tales como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 (p. ej., comprimidos, cápsulas o composiciones inyectables), en donde la administración de las múltiples cápsulas o inyecciones proporciona globalmente al sujeto la cantidad inmunogénicamente eficaz. En general, cuando se utiliza haciendo referencia a un polipéptido, tal como un polipéptido antigénico aislado, una cantidad inmunogénicamente eficaz puede variar desde, p. ej., aproximadamente 0,3 a aproximadamente 3000 microgramos (gg), p. ej., 1-1000 gg, p. ej., 10-500 gg, p. ej., aproximadamente 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 o 500 gg. Como un ejemplo no limitante, es posible combinar la administración del vector que codifica el antígeno Env del VIH sintético de la invención (que tiene la SEQ ID NO: 8) con la administración de un polipéptido Env, p. ej., 250 gg de la proteína trimérica Env del Clado C del VIH que tiene los aminoácidos 30-708 de la SEQ ID NO: 7. También es posible administrar una cantidad inmunogénicamente eficaz a un sujeto y, posteriormente, administrar otra dosis de una cantidad inmunogénicamente eficaz al mismo sujeto, en un régimen denominado de sensibilización-refuerzo. Este concepto general de un régimen de sensibilización-refuerzo es muy conocido por el experto en el campo de las vacunas. Opcionalmente, se pueden añadir administraciones de refuerzo adicionales al régimen, según sea necesario.
Las composiciones de la invención comprenden además un vehículo. Un vehículo puede incluir uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables tales como aglutinantes, disgregantes, agentes de hinchamiento, agentes de suspensión, agentes emulsionantes, agentes humectantes, lubricantes, saborizantes, edulcorantes, conservantes, colorantes, solubilizantes y agentes de recubrimiento. La naturaleza precisa del vehículo u otro material puede depender de la vía de administración, por ejemplo, intramuscular, subcutánea, oral, intravenosa, cutánea, intramucosal (p. ej., intestino), intranasal o intraperitoneal. Para las preparaciones inyectables líquidas, por ejemplo, suspensiones y soluciones, los vehículos y aditivos adecuados incluyen agua, glicoles, aceites, alcoholes, conservantes, agentes colorantes y similares. Para las preparaciones sólidas orales, por ejemplo, polvos, cápsulas, pastillas, cápsulas de gelatina y comprimidos, los vehículos y aditivos adecuados incluyen almidones, azúcares, diluyentes, agentes de granulación, lubricantes, aglutinantes, agentes disgregantes y similares. Para las mezclas de aerosoles/inhaladores nasales, la solución/suspensión acuosa puede comprender agua, glicoles, aceites, emolientes, estabilizantes, agentes humectantes, conservantes, aromatizantes, sabores y similares como vehículos y aditivos adecuados.
Las composiciones de la invención se pueden formular en cualquier materia adecuada para su administración a un sujeto para facilitar la administración y mejorar la eficacia, incluyendo, aunque no de forma limitativa, la administración oral (enteral) e inyecciones parenterales. Las inyecciones parenterales incluyen la inyección o perfusión intravenosa, inyección intraarterial, inyección subcutánea, inyección intramuscular e inyección intraarticular. Las composiciones de la invención también se pueden formular para otras vías de administración incluidas la administración transmucosal, ocular, rectal, implantes de acción prolongada, administración sublingual, debajo de la lengua, desde la mucosa oral para evitar la circulación portal, por inhalación o intranasal.
De acuerdo con determinadas realizaciones de la invención, una composición comprende una cantidad inmunogénicamente eficaz de un vector de adenovirus purificado o parcialmente purificado, tal como un vector de adenovirus 26, que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de la envoltura del VIH sintética de la invención. Dichas composiciones se pueden formular como una vacuna (también denominada como una "composición inmunogénica") de acuerdo con métodos muy conocidos en la técnica.
Las composiciones de la invención pueden comprender además opcionalmente un adyuvante para potenciar las respuestas inmunitarias. El término "adyuvante" y la expresión "estimulante inmunitario" se utilizan indistintamente en el presente documento y se definen como una o más sustancias que provocan la estimulación del sistema inmunitario. En este contexto, se utiliza un ayudante para potenciar una respuesta inmunitaria frente a los vectores que codifican proteínas de la envoltura del VIH sintéticas de la invención y/o polipéptidos antigénicos del VIH utilizados en combinación con vectores que codifican proteínas de la envoltura del VIH sintéticas de la invención.
Los adyuvantes adecuados para su uso con la invención deberían ser aquellos que son potencialmente seguros, bien tolerados y eficaces en las personas, tales como por ejemplo QS-21, Detox-PC, MPL-SE, MoGM-CSF, TiterMax-G, CRL-1005, GERBU, TERamide, PSC97B, Adjumer, PG-026, GSK-I, GcMAF, B-aletina, MPC-026, Adjuvax, CpG ODN, Betafectina, sales de aluminio (p. ej., AdjuPhos), Adjuplex, y MF59. Las proporciones óptimas de cada componente en la formulación se pueden determinar mediante técnicas muy conocidas por los expertos en la materia en vista de la presente divulgación.
En una realización preferida, el adyuvante es una sal de aluminio, tal como AdjuPhos.
Los expertos en la materia están muy familiarizados con la preparación y el uso de composiciones inmunogénicas. Las composiciones farmacéuticas líquidas incluyen, en general, un vehículo líquido tal como agua, vaselina, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. También se puede incluir solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacáridos o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol.
Por ejemplo, el vector de adenovirus recombinante se puede conservar en el tampón que también se utiliza en el Adenovirus World Standard (Hoganson et al., 2002, Bioprocessing J 1: 43-8): Tris 20 mM pH 8, NaCl 25 mM, glicerol al 2,5 %. Otro tampón de formulación de adenovirus útil adecuado para la administración a seres humanos es Tris 20 mM, MgCL2 mM, NaCl 25 mM, sacarosa 10 % p/v, polisorbato-800,02 % p/v. Otro tampón de formulación que es adecuado para el adenovirus recombinante comprende tampón citrato 10-25 mM pH 5,9-6,2, 4-6 % (p/p) de hidroxipropil-beta-ciclodextrina (HBCD), NaCl 70-100 mM, 0,018-0,035 % (p/p) de polisorbato-80, y opcionalmente 0,3-0,45 % (p/p) de etanol. Obviamente, se pueden utilizar muchos otros tampones y existen varios ejemplos de formulaciones adecuadas para el almacenamiento y para la administración farmacéutica de vectores purificados.
Según realizaciones de la invención, se puede utilizar una composición de la invención junto con uno o más vectores adicionales que codifican uno o más polipéptidos antigénicos del VIH adicionales y/o uno o más polipéptidos antigénicos del VIH aislados. Los vectores adicionales y/o polipéptidos antigénicos del VIH pueden estar presentes en la misma composición que comprende una proteína Env del VIH sintética de la invención. También pueden estar presentes en una o más composiciones diferentes que se pueden utilizar junto con una composición que comprende una proteína Env del VIH sintética de la invención en una combinación de vacuna. Preferiblemente, el vector o los vectores adicionales son vectores víricos, tales como vectores de adenovirus y, lo más preferiblemente, son vectores de adenovirus 26. El vector o los vectores adicionales pueden codificar cualquier polipéptido antigénico del VIH que identificarán los expertos en la materia en vista de la presente divulgación.
En una realización, una composición o una combinación de vacuna comprende además un segundo vector de adenovirus, preferiblemente un vector de adenovirus 26, que codifica un polipéptido antigénico del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5. Una ventaja de tales realizaciones es una mayor amplitud de la respuesta inmunitaria (que abarca las cepas de los Clados B y C).
En otra realización, una composición o una combinación de vacuna de la invención comprende además un vector de adenovirus, preferiblemente un vector de adenovirus 26, que codifica un polipéptido antigénico del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28 (mos1 GagPol).
En otra realización, una composición o una combinación de vacuna de la invención comprende además un vector de adenovirus, preferiblemente un vector de adenovirus 26, que codifica un polipéptido antigénico del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29 (mos2GagPol).
En una realización particular, una composición o una combinación de vacuna de la invención comprende además un segundo vector de adenovirus, preferiblemente un vector de adenovirus 26, que codifica un polipéptido antigénico del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 y uno o más vectores de adenovirus adicionales, preferiblemente vectores de adenovirus 26, que codifican uno o más polipéptidos antigénicos del VIH que comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 28 o la SEQ ID NO: 29. Por ejemplo, una composición o combinación de vacuna de acuerdo con una realización de la invención puede comprender cuatro vectores de adenovirus, preferiblemente vectores de adenovirus 26, donde un primer vector codifica una proteína de la envoltura del VIH sintética que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 (p. ej., la SEQ ID NO: 18); un segundo vector que codifica un polipéptido antigénico del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5; un tercer vector que codifica una proteína de la envoltura del VIH sintética que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ Id NO: 28; y un cuarto vector que codifica una proteína de la envoltura del VIH sintética que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29.
En algunas realizaciones, la composición o combinación de vacuna comprende además uno o más polipéptidos antigénicos del VIH aislados. Cualquier polipéptido antigénico del VIH que identifiquen los expertos en la materia en vista de la presente divulgación puede estar incluido además en una composición o combinación de vacuna de la invención, incluyendo, pero sin limitación, una proteína de la envoltura del VIH (p. ej., gp160, gp140, gp120 o gp41), preferiblemente una proteína gp140 trimérica estabilizada, tal como una proteína gp140 del clado C o del clado A estabilizada. En una realización preferida, el polipéptido antigénico del VIH aislado es una proteína gp140 trimérica del clado C del VIH estabilizada, tal como la que comprende los restos 30-708 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 (los restos 1-29 de la SEQ ID NO: 7 están en la secuencia señal). Un polipéptido Env del VIH alternativo o adicional que se podría utilizar solo o además de la proteína gp140 del clado C, es una proteína trimérica Env mosaico, por ejemplo, que tiene la secuencia de aminoácidos tal como se divulga en los aminoácidos 30-724 de la SEQ ID No : 36 (correspondiente a la SEQ ID NO: 2 del documento WO 2014/107744, los restos 1-29 de la SEQ ID NO: 36 están en la secuencia señal).
De acuerdo con una realización particular de la invención, una proteína antigénica del VIH puede ser una proteína de la envoltura del VIH sintética de la invención. Así pues, se puede utilizar una proteína de la envoltura sintética de la
invención en forma aislada y/o purificada para inducir una respuesta inmunitaria o proporcionar una inmunidad protectora, etc. contra el VIH en un sujeto que lo necesite. Cualquiera de las proteínas de la envoltura sintética descritas en el presente documento que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 se puede utilizar como una proteína antigénica del VIH en forma aislada y/o purificada. En una realización preferida, cuando se utiliza en forma aislada como una proteína antigénica del VIH, la proteína de la envoltura sintética comprende los restos 30-711 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18 o los restos 30-686 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19 y, más preferiblemente, los restos 30-704 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18. El polipéptido antigénico del VIH aislado también puede comprender la SEQ ID NO: 8 con las siguientes mutaciones: EK479-480RRRR, I529P, A471C y T575C.
Las realizaciones de la invención también se refieren a composiciones o combinaciones de vacuna que comprenden una proteína de la envoltura del VIH sintética aislada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8. Se puede utilizar cualquiera de las proteínas de la envoltura del VIH sintéticas descritas en el presente documento. En realizaciones en particular de la invención, la proteína de la envoltura del VIH sintética aislada comprende los restos 30-704 o 30-711 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18, los restos 30-686 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19 o la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 con las siguientes mutaciones: EK479-480RRRR, I529P, A471C y T575C. Tales composiciones o combinaciones de vacuna pueden comprender además uno o más vectores de expresión, por ejemplo, vectores adenovíricos tales como vectores de adenovirus 26, que codifican uno o más polipéptidos antigénicos del VIH adicionales, tales como las proteínas de la envoltura del VIH sintéticas de la invención, u otras proteínas antigénicas del VIH tales como las expuestas en las SEQ ID NO: 4, 5, 7, 28 o 29 o fragmentos de estas.
La invención también se refiere a un método para producir una composición o combinación de vacuna de la invención. Según realizaciones de la invención, un método para producir una composición o una combinación comprende combinar un vector que comprende ácido nucleico que codifica la proteína de la envoltura del VIH sintética de la invención con un vehículo y opcionalmente uno o más vectores adicionales que codifican uno o más polipéptidos antigénicos del VIH adicionales y/o uno o más polipéptidos antigénicos del VIH aislados. El experto en la materia está familiarizado con las técnicas habituales utilizadas para preparar tales composiciones.
Vacuna y combinaciones de vacuna
Según realizaciones de la invención, una composición puede ser una vacuna. Como se usa en el presente documento, el término "vacuna" se refiere a una composición que comprende un vector de expresión, preferiblemente, un vector vírico, que codifica una proteína de la envoltura del VIH sintética de la invención que puede proporcionar inmunidad protectora o una respuesta inmunitaria protectora a un sujeto, o vacunar a un sujeto. Según realizaciones de la invención, tras la administración de la composición a un sujeto, el vector de expresión expresa la proteína de la envoltura del VIH sintética codificada y la proteína de la envoltura del VIH sintética expresada se presenta al sistema inmunitario del sujeto, induciéndose de esta manera la respuesta requerida para producir la inmunidad o para inducir una respuesta inmunitaria.
Así pues, en otro aspecto general, la invención proporciona una vacuna para inducir una respuesta inmunitaria contra un virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) en un sujeto. Según realizaciones de la invención, la vacuna comprende una composición que comprende una cantidad inmunogénicamente eficaz de un vector de expresión que codifica una proteína de la envoltura del VIH sintética que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 y preferiblemente la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18. Preferiblemente, el vector de expresión es un vector vírico, más preferiblemente un vector de adenovirus y, lo más preferiblemente, un vector de adenovirus 26.
Según realizaciones de la invención, "inducir una respuesta inmunitaria", cuando se utiliza haciendo referencia a los métodos y composiciones descritos en el presente documento, abarca proporcionar inmunidad protectora y/o vacunar a un sujeto contra una infección, tal como una infección por VIH, con fines profilácticos, así como también provocar una respuesta o efecto inmunitarios deseados contra una infección en un sujeto que los necesite, tal como una infección por VIH, con fines terapéuticos. Preferiblemente, los métodos de la invención tienen fines profilácticos, tales como proporcionar inmunidad protectora. La respuesta inmunitaria puede ser una respuesta inmunitaria celular y/o una respuesta inmunitaria humoral.
Como se usa en el presente documento, "inmunidad protectora" o "respuesta inmunitaria protectora" significa que el sujeto vacunado es capaz de controlar una infección con el agente patógeno contra el que se realizó la vacunación. Habitualmente, el sujeto que ha desarrollado una "respuesta inmunitaria protectora" desarrolla únicamente síntomas clínicos leves o moderados o ningún síntoma en absoluto. Habitualmente, un sujeto que tiene una "respuesta inmunitaria protectora" o "inmunidad protectora" contra un cierto agente no fallecerá como resultado de la infección con dicho agente.
Según realizaciones de la invención, las composiciones de vacuna pueden comprender además uno o más vectores adicionales, por ejemplo, vectores víricos, tales como vectores de adenovirus, preferiblemente vectores de adenovirus 26, que codifican uno o más polipéptidos antigénicos del VIH adicionales y/o uno o más polipéptidos
antigénicos del VIH aislados. La proteína de la envoltura del VIH sintética, los vectores adicionales y/o uno o más polipéptidos antigénicos del VIH aislados se pueden formular en la misma composición o en una o más composiciones diferentes en la vacuna.
La invención también se refiere a combinaciones de vacuna para sensibilizar y reforzar una respuesta inmunitaria frente a uno o más clados del VIH en un sujeto que lo necesite utilizando uno o más vectores combinados con un polipéptido antigénico aislado. Así pues, en otro aspecto general, la invención proporciona una combinación de vacuna para inducir una respuesta inmunitaria contra un VIH en un sujeto. Según realizaciones de la invención, la combinación de vacuna comprende:
(i) una primera composición que comprende una cantidad inmunogénicamente eficaz de un vector de expresión que codifica una proteína de la envoltura del VIH sintética que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 o la SEQ ID NO: 8 que tiene una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en (a) I529P, (b) K480E, y (c) una combinación de EK479-480RRRR, I529P, A471C y T575C,y un vehículo; y
(ii) una segunda composición que comprende una cantidad inmunogénicamente eficaz de un polipéptido antigénico del VIH aislado y un vehículo,
en donde una de la primera y segunda composiciones se destina a la inmunización de sensibilización y la otra composición se destina a la inmunización de refuerzo.
Según realizaciones de la invención, la combinación de vacuna comprende además opcionalmente una cantidad inmunogénicamente eficaz de uno o más vectores de expresión adicionales que codifican uno o más polipéptidos antigénicos del VIH adicionales. El vector o los vectores de expresión adicionales pueden estar incluidos en la primera composición o en la segunda composición, o el vector o los vectores de expresión adicionales pueden estar incluidos en una o más composiciones adicionales que se administrarán junto con la primera y/o la segunda composición.
Como se usa en el presente documento, los términos "cosuministro", "coadministración" o "administrado junto con" se refieren a la administración simultánea de dos o más componentes, tales como un vector de expresión vírico y un polipéptido antigénico aislado o múltiples vectores de expresión víricos. La "administración simultánea" puede ser la administración de los dos o más componentes al menos en el mismo día. Cuando dos componentes se "administran junto con", se pueden administrar en composiciones independientes de manera secuencial en un periodo de tiempo corto, tal como 24, 20, 16, 12, 8 o 4 horas o en 1 hora o menos o se pueden administrar en una única composición a la vez.
En las realizaciones particulares de una combinación de vacuna de la invención, la primera composición comprende un vector de adenovirus, preferiblemente un vector de adenovirus 26, que codifica una proteína de la envoltura del VIH sintética que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18; y el polipéptido antigénico del VIH aislado comprende los restos 30-708 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 o los restos 30-724 de la SEQ ID NO: 36. En una realización particular, la primera composición comprende además un vector de adenovirus, preferiblemente un vector de adenovirus 26, que codifica un polipéptido antigénico del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5. En otra realización particular, la primera composición comprende además uno o más vectores de adenovirus adicionales, preferiblemente vectores de adenovirus 26, que codifican uno o más polipéptidos antigénicos del VIH adicionales que comprenden las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 28 y 29.
Otro aspecto general de la invención se refiere a un kit que comprende una combinación de vacuna de acuerdo con una realización de la invención.
Otras realizaciones de la proteína de la envoltura del VIH sintética, vectores de expresión, vectores de expresión adicionales, polipéptidos antigénicos del VIH codificados por los vectores de expresión y polipéptido antigénico del VIH aislado, etc. que se pueden utilizar en las combinaciones de vacuna de la invención se han analizado detalladamente anteriormente y en los ejemplos ilustrativos a continuación.
Método para inducir inmunidad protectora contra la infección por VIH
La invención también se refiere a un método para inducir una respuesta inmunitaria contra uno o más clados del VIH en un sujeto que lo necesite. Los métodos descritos en el presente documento incluyen métodos de sensibilización y refuerzo de una respuesta inmunitaria utilizando uno o más vectores de expresión en combinación con uno o más polipéptidos antigénicos aislados.
En un aspecto general, un método para inducir una respuesta inmunitaria contra un virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) en un sujeto comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad inmunogénicamente eficaz de un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de la envoltura del VIH sintética que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8. Se pueden utilizar cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento en un método para inducir una respuesta
inmunitaria contra el VIH en un sujeto. Preferiblemente, la composición comprende un vector de adenovirus, preferiblemente un vector de adenovirus 26, comprendiendo el vector un ácido nucleico que codifica una proteína de la envoltura del VIH sintética que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18. La composición puede comprender además uno o más vectores adicionales que codifican uno o más polipéptidos antigénicos del VIH adicionales y/o uno o más polipéptidos antigénicos del VIH aislados adicionales.
En otro aspecto general, un método para inducir una respuesta inmunitaria contra un virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) en un sujeto comprende:
(i) administrar al sujeto una primera composición que comprende una cantidad inmunogénicamente eficaz de un vector de expresión que codifica una proteína de la envoltura del VIH mosaico que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 o la SEQ ID NO: 8 que tiene una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en (a) I529P, (b) K480E, y (c) una combinación de EK479-480RRRR, I529P, A471C y T575C,y un vehículo;
(ii) administrar al sujeto una segunda composición que comprende una cantidad inmunogénicamente eficaz de un polipéptido antigénico del VIH aislado y un vehículo; y
(iii) opcionalmente, administrar al sujeto una cantidad inmunogénicamente eficaz de uno o más vectores de expresión adicionales que codifican uno o más polipéptidos antigénicos del VIH adicionales,
en donde las etapas (i) y (ii) se llevan a cabo en cualquier orden, siendo una de las etapas para la inmunización de sensibilización y la otra etapa para la inmunización de refuerzo. Según realizaciones de la invención, la cantidad eficaz, opcional del vector o de los vectores de expresión adicionales se administra junto con la primera composición o la segunda composición. En una realización preferida, la cantidad eficaz opcional del vector o los vectores de expresión adicionales se administra junto con la primera composición.
En una realización particular de un método para inducir una respuesta inmunitaria, la primera composición comprende un vector de adenovirus, preferiblemente un vector de adenovirus 26, que codifica una proteína de la envoltura del VIH sintética que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 y un segundo vector de adenovirus, preferiblemente un vector de adenovirus 26, que codifica un polipéptido antigénico del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5; la segunda composición comprende un polipéptido antigénico del VIH aislado que tiene los restos 30-708 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 o los restos 30-724 de la SEQ ID NO: 36; y el vector o los vectores de expresión adicionales son vectores de adenovirus, preferiblemente vectores de adenovirus 26, que codifican uno o más polipéptidos antigénicos del VIH adicionales que comprenden las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 28 y 29; en donde la primera composición se administra al sujeto, junto con el vector o los vectores de expresión adicionales, una o más veces para la inmunización de sensibilización y la segunda composición se administra al sujeto una o más veces para la inmunización de refuerzo.
La administración de las composiciones inmunogénicas que comprenden los vectores de expresión y/o los polipéptidos antigénicos es normalmente intramuscular, intradérmica o subcutánea. Sin embargo, también se pueden contemplar otros modos de administración tales como la administración intravenosa, rectal, cutánea, oral, nasal, etc. La administración intramuscular de las composiciones inmunogénicas se puede conseguir utilizando una aguja para inyectar una suspensión de los vectores de expresión, p. ej., vectores de adenovirus, y/o polipéptidos antigénicos. Una alternativa es el uso de un dispositivo de inyección sin aguja para administrar la composición (utilizando, por ejemplo, Biojector™) o un polvo liofilizado que contiene la vacuna.
Para la inyección intramuscular, intravenosa, cutánea o subcutánea, o la inyección en el sitio de la dolencia, el vector estará en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable sin pirógenos y con un pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. De manera análoga, el polipéptido antigénico aislado estará en forma de una solución parenteralmente aceptable con un pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Los expertos en la materia estarán capacitados para preparar soluciones adecuadas utilizando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de Ringer lactato. Pueden incluirse conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos, según sea necesario. También se puede emplear una formulación de liberación lenta.
Normalmente, la administración de las composiciones de vacuna de acuerdo con las realizaciones de la invención tendrá un objetivo profiláctico para generar una respuesta inmunitaria contra un antígeno del VIH antes de la infección o el desarrollo de los síntomas. En otras realizaciones, los vectores de expresión, por ejemplo, los vectores de adenovirus, y/o polipéptidos antigénicos del VIH se pueden administrar para una profilaxis posterior a la exposición.
Las composiciones inmunogénicas que contienen los vectores de expresión, por ejemplo, vectores de adenovirus, y/o polipéptidos antigénicos se administran a un sujeto, provocando una respuesta inmunitaria en el sujeto. Una cantidad de una composición suficiente para inducir una respuesta inmunitaria detectable se define como una "dosis inmunogénicamente eficaz" o "cantidad inmunogénicamente eficaz". En una realización típica de la invención, la respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria protectora.
La cantidad real administrada, y la tasa y la pauta de administración, dependerán de la naturaleza y la gravedad de lo que se está tratando. La prescripción del tratamiento, por ejemplo, decisiones sobre la dosificación, etc., es responsabilidad de los médicos generalistas y otros médicos, o en un contexto veterinario del veterinario, y normalmente tiene en cuenta el trastorno que se va a tratar, el estado del paciente individual, el sitio de suministro, el método de administración y otros factores conocidos por los facultativos. Se pueden encontrar ejemplos de las técnicas y protocolos mencionados anteriormente en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A. ed., 1980.
Después de la producción de vectores de adenovirus y la formulación opcional de tales partículas en composiciones, los vectores se pueden administrar a un individuo, especialmente a un ser humano u otro primate. El suministro a un mamífero no humano no necesita tener un fin terapéutico, sino que se puede utilizar en un contexto experimental, por ejemplo, en la investigación de los mecanismos de las respuestas inmunitarias a la proteína de la envoltura del VIH sintética expresada por los vectores de adenovirus de la invención.
En algunas realizaciones de los métodos divulgados, se utilizan uno o más vectores de adenovirus que codifican uno o más polipéptidos antigénicos del VIH para sensibilizar y provocar la respuesta inmunitaria. Se pueden utilizar uno o más polipéptidos antigénicos del VIH aislados junto con el vector o los vectores de adenovirus para la inmunización de sensibilización. La inmunización de sensibilización se puede administrar solo una vez, pero también se puede administrar opcionalmente múltiples veces, por ejemplo, la administración de sensibilización inicial en tiempo 0, seguida por otra administración de sensibilización aproximadamente 4-14 semanas, p. ej., 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 semanas, o en cualquier momento intermedio, después de la administración de sensibilización inicial. Se pueden utilizar uno o más polipéptidos antigénicos del VIH aislados opcionalmente junto con uno o más adenovirus u otros vectores adicionales que codifican uno o más polipéptidos antigénicos del VIH adicionales para reforzar la respuesta inmunitaria. También se puede administrar una inmunización de refuerzo una o múltiples veces, por ejemplo, la primera aproximadamente 18-36, p. ej., 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 o 36 semanas, o en cualquier momento intermedio, después de la administración de sensibilización inicial, seguida por otra administración de refuerzo aproximadamente 36-52, p. ej., 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 o 60 semanas, o en cualquier momento intermedio, después de la administración de sensibilización inicial. Se hace un seguimiento de la respuesta inmunitaria inducida por la inmunización.
Las realizaciones de los métodos divulgados también contemplan pautas más cortas de sensibilización-refuerzo, lo que significa que la inmunización de refuerzo final se administra aproximadamente 22-26 semanas después de la administración de sensibilización inicial. La inmunización de sensibilización se puede administrar en la semana 0. La inmunización de refuerzo se puede administrar múltiples veces, por ejemplo, en primer lugar aproximadamente 7-9 semanas u 11-13 semanas o aproximadamente, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, o 14 semanas, o cualquier momento intermedio, después de la administración de sensibilización inicial, seguida por otra administración de refuerzo aproximadamente 22-26 semanas o aproximadamente 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, o 28 semanas, o cualquier momento intermedio, después de la administración de sensibilización inicial. En ciertas realizaciones, se administran uno o más polipéptidos antigénicos del VIH aislados junto con el vector o los vectores de adenovirus para la inmunización de sensibilización y/o refuerzo.
Los expertos en la materia comprenderán fácilmente que la pauta para las administraciones de sensibilización y refuerzo se puede ajustar en función de las respuestas inmunitarias medidas después de las administraciones. Por ejemplo, las composiciones de refuerzo se administran generalmente semanas o meses después de la administración de la composición de sensibilización, por ejemplo, aproximadamente 2-3 semanas o 4 semanas u 8 semanas o 16 semanas o 20 semanas o 24 semanas o 28 semanas o 30 semanas o 32 semanas o de uno a dos años después de la administración de la composición de sensibilización.
Según realizaciones de la invención, se puede administrar un adyuvante junto con el polipéptido antigénico del VIH aislado como parte de la inmunización de sensibilización y/o de refuerzo. Se puede utilizar cualquier adyuvante en vista de la presente divulgación, y en ciertas realizaciones el adyuvante es una sal de aluminio, tal como AdjuPhos.
En una realización preferida de la invención, los vectores de adenovirus utilizados en los métodos divulgados en el presente documento incluyen un vector de rAd26. Preferiblemente, un vector de rAd26 que codifica una proteína de la envoltura del VIH sintética que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18 o la SEQ ID NO: 19), lo más preferiblemente la SEQ Id NO: 18, se utiliza para sensibilizar la respuesta inmunitaria, solo o en combinación con uno o más vectores de rAd26 adicionales que codifican uno o más polipéptidos antigénicos del VIH adicionales, tales como mos1Env que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, y un polipéptido antigénico del VIH aislado, tal como el que comprende los restos 30-708 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 o los restos 30-724 de la SEQ ID NO: 36, se utiliza para reforzar la respuesta inmunitaria o viceversa.
En una realización a modo de ejemplo, un vector de rAd26 que codifica una proteína de la envoltura del VIH sintética que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18 se utiliza para sensibilizar la respuesta inmunitaria en combinación con un vector de rAd26 que codifica un polipéptido antigénico del VIH que tiene la
secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5. Uno o más vectores de rAd26 adicionales que codifican uno o más polipéptidos antigénicos del VIH adicionales que tienen las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-4, 28 y 29 también se pueden administrar junto con los otros vectores de rAd26 para sensibilizar la respuesta inmunitaria. La administración de sensibilización en ciertas realizaciones se administra dos veces antes de que se administre cualquier inmunización de refuerzo. Un polipéptido antigénico del VIH aislado, tal como el que comprende los restos 30-708 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 (preferiblemente), o el que comprende los restos 30-724 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 36, o una combinación de al menos dos de tales polipéptidos antigénicos del VIH aislados, se administra a continuación para reforzar la respuesta inmunitaria y preferiblemente, se administra más de una vez. Preferiblemente, se administra además un ayudante con el polipéptido antigénico del VIH aislado en la inmunización de refuerzo.
En una realización particular, la respuesta inmunitaria se sensibiliza mediante la administración de cuatro antígenos del VIH codificados en los vectores adenovíricos, preferiblemente vectores de rAd26, siendo los cuatro antígenos codificados: (i) una proteína de la envoltura del VIH sintética que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18, (ii) el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, (iii) el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28 y (iv) el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29. Cada uno de estos cuatro antígenos puede estar codificado en un vector adenovírico independiente, preferiblemente un vector de rAd26, administrado con una dosis total de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 x1010 partículas víricas (pv), p. ej., aproximadamente 5x1010 pv (para todos los vectores juntos). Los vectores pueden estar premezclados, p. ej., en una proporción de 1:1:1:1. La administración de sensibilización se puede repetir después de la administración de sensibilización inicial, p. ej., 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 semanas después de la administración de sensibilización inicial. En esta realización, se refuerza una respuesta inmunitaria administrando la misma vacuna con el vector adenovírico utilizada para la administración de sensibilización junto con una proteína Env gp140 del VIH aislada, p. ej., proteína gp140 del clado C (que comprende los restos 30-708 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7), o la proteína gp140 mosaico (que comprende los restos 30-724 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 36), o la proteína gp140 del clado C y la proteína gp140 mosaico, con una dosis total de aproximadamente 50-300 pg de proteína, 50, 100, 150, 200, 250 o 300 microgramos, o cualquier cantidad intermedia, de la proteína gp140 del clado C, o, p. ej., 50, 100, 150, 200, 250 o 300 microgramos, o cualquier cantidad intermedia, de la proteína gp140 mosaico, o, p. ej., 50, 100, 150, 200, 250 o 300 microgramos, o cualquier cantidad intermedia, de una combinación de la proteína gp140 del clado C y la proteína gp140 mosaico (p. ej., en un proporción 1:1, ya sea mezcladas o administradas por separado). Preferiblemente, la proteína pg140 se administra junto con un adyuvante, p. ej., fosfato de aluminio. La administración del adenovirus más la proteína gp140 para reforzar la respuesta inmunitaria se puede realizar aproximadamente 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 semanas, o en cualquier momento intermedio, después de la administración de sensibilización inicial. La administración de refuerzo se puede repetir, p. ej., aproximadamente 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 o 54 semanas, o cualquier momento intermedio, después de la administración de sensibilización inicial. Todas las administraciones de acuerdo con esta realización se realizan preferiblemente mediante la vía intramuscular.
Ejemplos
Ejemplo 1: Diseño de las secuencias de antígenos de la envoltura del VIH
Se diseñaron varias secuencias de antígenos de la envoltura del VIH que tenían similitud de secuencia con el antígeno del VIH mosaico mos2Env (SEQ ID NO: 6; descrito también previamente en el documento WO 2010/059732). Las secuencias unidas a la membrana, recién diseñadas, se basaron en (una combinación de) secuencias de tipo silvestre totalmente naturales de proteínas de la envoltura del VIH o una quimera de la secuencia de mos2Env y secuencias de proteínas de la envoltura del VIH de tipo silvestre. Además de las secuencias de proteínas de la envoltura completas (véase la FIG. 1A), también se diseñaron secuencias que tenían un truncamiento C-terminal del dominio citoplasmático (véase, por ejemplo, la FIG. 1C). Véase también p. ej., Schiernle et al., PNAS 1997; Abrahamyan et al., J Virol 2005); Edwards et al., J. Virology, 2002, 76:2683-2691. También se prepararon variantes solubles mediante un truncamiento C-terminal antes de la región transmembrana (TM), que fue reemplazada por un dominio de trimerización, tal como un dominio de trimerización GCN4 (véase, por ejemplo, la FIG. 1B). Estas variantes solubles se convirtieron además en una variante monocatenaria mediante la mutación del sitio de escisión de furina, inhibiendo así el procesamiento del dominio extracelular de la proteína de la envoltura para obtener las subunidades gp120 y gp41.
De todas las construcciones generadas y probadas, las construcciones basadas en C4 tenían las propiedades más óptimas, por ejemplo, una buena procesabilidad, plegado, inmunogenicidad, etc. y estas se seleccionaron para estudios adicionales. También se generaron una variante soluble de la construcción C4 que tenía un dominio de trimerización GCN4 en lugar del dominio transmembrana (sC4, FIG. 1B) y una variante que comprendía un fragmento de 7 aminoácidos del dominio citoplasmático (C4D7, FIG. 1C) y se examinaron en estudios adicionales. Las secuencias de aminoácidos de C4, sC4, y C4D7 se muestran en las SEQ ID NO: 17, 19, y 18, respectivamente. Las secuencias que codifican estas se muestran en las SEQ ID NO: 25, 27, y 26, respectivamente. La construcción C1 tiene una secuencia del dominio extracelular basada en la secuencia de mos2Env (SEQ ID NO: 6). También se generaron una variante soluble de la construcción C1 que tiene un dominio de trimerización GCN4 en lugar del dominio transmembrana (sC1) y una variante que comprende un fragmento de 7 aminoácidos del dominio
citoplasmático (C1D7), similar a sC4 y C4D7 tal como se muestra en las FIGS. 1B y 1C, respectivamente. La construcción C1 y sus variantes se utilizaron en estudios adicionales a efectos de comparación, ya que están basadas esencialmente en la secuencia de mos2Env de la técnica anterior. Las secuencias de aminoácidos de C1, sC1, y C1D7 se muestran en las SEQ ID NO: 31,30, y 32, respectivamente. Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican estas se muestran en las SEQ ID NO: 34, 33, y 35, respectivamente. Otras construcciones que se examinaron resultaron ser menos óptimas que las basadas en la construcción C4 y no se utilizaron para un desarrollo adicional.
Ejemplo 2: Expresión y plegamiento de las proteínas de la envoltura del VIH sintéticas
Se midieron el nivel de expresión, plegamiento y expresión en la superficie celular de las proteínas de la envoltura del VIH sintéticas.
Niveles de expresión
Las células HEK293F se transfectaron de manera transitoria con un plásmido que codifica las proteínas de la envoltura del VIH sintéticas solubles sC1 y sC4 tal como se describen en el Ejemplo 1. Se midieron los niveles de expresión de la proteína soluble en el sobrenadante utilizando una transferencia Western cuantitativa (QWB). Los resultados se muestran en la FIG. 2. Los bajos niveles de expresión para sC1 (que corresponde esencialmente a mos2Env con un dominio transmembrana añadido) coinciden con los recientes conocimientos respecto a mos2Env de los autores. Tal como demuestran los resultados, la variante sC4 de la invención mostró unos niveles de expresión significativamente más elevados que la variante sC1 (control).
Plegamiento de las proteínas
Se examinó el plegamiento de las proteínas midiendo la unión de las proteínas de la envoltura del VIH sintéticas solubles a un anticuerpo (MAb 17b) que se sabe que se une al sitio de unión del correceptor de la proteína de la envoltura del VIH, que está expuesto únicamente después de la unión de CD4, mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA). En particular, se examinó la unión de sC4 purificada para determinar la unión a MAb 17b con una unión anterior de sC4 a CD4 y sin una unión anterior de sC4 a CD4. Se utilizó sC1 purificada como control. La unión de MAb17 a sC4 sin una unión anterior de CD4 a la proteína de la envoltura es una indicación de una proteína de la envoltura parcialmente desplegada o en un estado previo al inicio del cambio conformacional (es decir, una Env inestable que adopta la conformación "abierta" en ausencia de unión de CD4). Los resultados del ensayo ELISA se muestran en las FIGS. 3A y 3B.
Como se muestra en la FIG. 3B, sC4 muestra una fuerte unión a MAb 17b con una unión anterior a CD4, pero no hay una unión detectable a MAb 17b sin una unión anterior a CD4. Por el contrario, como se muestra en la FIG. 3A, sC1 mostró una unión a MAb 17 mucho menor tanto con unión anterior a CD4 como sin ella. Los resultados sugieren que sC4 tiene un patrón de plegamiento correcto, sin una exposición del sitio de unión del correceptor antes de la unión a CD4.
El plegamiento de las proteínas también se analizó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) en condiciones nativas de sC1 y sC4 para evaluar la estructura cuaternaria de las variantes solubles de la proteína y la posible formación de puentes disulfuro incorrectos entre los protómeros. Después de la electroforesis en un gel en condiciones nativas, se detectó la proteína en el gel mediante un análisis de transferencia Western. Tal como muestran los resultados en la FIG. 4, la mayoría de sC4 está presente en un estado trimérico, que es la estructura cuaternaria correcta.
En conjunto, los resultados de los experimentos del plegamiento de proteínas demuestran que la proteína de la envoltura del VIH sintética soluble sC4 tiene el perfil de plegamiento deseado, que ha mejorado en comparación con el perfil de plegamiento del antígeno mos2Env existente (representado por sC1).
Expresión en la superficie celular
También se estudió la expresión en la superficie celular de las variantes unidas a la membrana de las proteínas de la envoltura del VIH C1 (completa), C4 (completa, véase la FIG. 1A), C1D7 y C4D7. Las células HEK293T se transfectaron de manera transitoria solamente con un plásmido que codifica eGFP (control negativo, CN) o con un plásmido que codifica eGFP junto con una construcción de expresión que codifica una variante de una proteína de la envoltura del VIH. Dos días después de la transfección, las células se sometieron a un análisis por clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) tras la exposición a varios anticuerpos policlonales y monoclonales dirigidos contra gp120 y anticuerpos secundarios, y después se examinaron para determinar los niveles de expresión en la superficie celular de la proteína de la envoltura. Se evaluó la calidad de las variantes de la envoltura determinando los niveles de expresión globales utilizando un anticuerpo policlonal anti-gp120 y evaluando la unión relativa de los anticuerpos ampliamente neutralizantes PG9 y PG16, que presentan una dependencia de la estructura cuaternaria, y se unen preferiblemente al trímero de la envoltura plegado correctamente.
Los resultados de los experimentos de expresión en la superficie celular se muestran en la FIG. 5. Los niveles de expresión en la superficie de las variantes truncadas C1D7 y C4D7 según se midieron utilizando un anticuerpo antigp120, son mucho más elevados que los niveles de expresión en la superficie de sus homólogos completos, C1 y C4, respectivamente. Esto confirma que la deleción de 144 restos del extremo carboxi de Env incrementa los niveles de expresión en la superficie de la envoltura. La construcción C4 completa de la invención también mostró una mejor unión a PG9 y PG16 en comparación con C1 completa, lo que sugiere que la secuencia de la envoltura C4 está plegada adecuadamente (es decir, un trímero) en la superficie celular.
Los resultados también demuestran que la variante C1D7, que es esencialmente Mos2Env con un dominio transmembrana añadido y 7 aminoácidos del dominio citoplasmático, se puede expresar en la superficie de células HEK293T. Esto contrasta con la construcción soluble en Ad26.mos2Env, que no se puede expresar con niveles detectables en la superficie cuando se transfecta a células A549. Sin embargo, la unión relativa a PG9 y PG16 es apenas detectable por encima del fondo, lo que sugiere que la secuencia de la envoltura C1D7 está plegada de manera deficiente y, probablemente, no está presente como un trímero intacto en la superficie celular.
En general, la variante de la envoltura C4D7 tiene el perfil de unión al anticuerpo más óptimo, con una expresión de gp120 mayor que la de su homólogo completo C4 y con un aumento en la unión a PG9 y PG16 de más de 15 veces en comparación con C1 y C1D7 (FIG. 5).
Ejemplo 3: Estabilidad de los vectores que codifican las secuencias de la envoltura del VIH
Trabajos previos en los laboratorios de los autores (no publicados) indicaron que los vectores de adenovirus 26 (Ad26) que codifican la secuencia del antígeno mos2Env mostraban unas proporciones PV/UI relativamente altas (lo que indica una calidad menor de los lotes de productos de adenovirus) y además que tales vectores mostraban problemas de estabilidad. En consecuencia, era importante examinar la estabilidad de las construcciones de las proteínas de la envoltura del VIH sintéticas de la invención en un contexto de adenovirus.
Se generaron vectores de Ad26 recombinantes (rAd26) que codifican las secuencias de antígenos del VIH de la invención C4, C4D7 y sC4 tal como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1 en células PER.C6 (denominados respectivamente "rAd26.C4", "rAd26.C4D7", y "rAd26.sC4", respectivamente). Se recogieron clones del vector (placas) y se aumentó de escala para generar los lotes de investigación. Se aumentaron de escala como máximo 5 clones víricos (placas) hasta un formato T25 y se realizaron pases en serie durante 10 pases en un formato T25 (siendo los pases 1-3 las etapas de transfección y purificación de la placa, seguido de 10 pases en un formato T25, lo que dio como resultado un total de 13 pases). Se evaluó la estabilidad genética con un número de pases víricos (npv) de 3, 5, 10 y 13 mediante un ensayo de PCR del casete del transgén E1, seguido de secuenciación en npv 13. Los resultados se muestran en la FIG. 6.
Los vectores de rAd26 que codifican C4 completa (rAd26.C4) mostraron unas características de crecimiento deficientes, según se determinó por la ausencia de un efecto citopatógeno completo (CPE) en 2-3 días; inestabilidad genética, según se determina mediante las deleciones de la región del casete del transgén E1; o una combinación de estas (FIG. 6). Debido a las características de crecimiento deficientes y la inestabilidad genética observada, se dejó de considerar este vector que codifica C4 completa.
Por el contrario, para los vectores de rAd26 que codifican C4D7 (rAd26.C4D7) y sC4 (rAd26.sC4), todas las placas propagadas siguieron siendo genéticamente estables durante el transcurso del experimento (FIG. 6). Así pues, las construcciones de sC4 y C4D7 novedosas tuvieron un comportamiento mejor que la construcción de mos2Env original en lo que respecta a la estabilidad en un contexto de vector adenovírico. La estabilidad genética examinada hasta un npv 13 representa una propagación varios pases más allá de la utilizada en la preparación a escala industrial de los vectores.
Ejemplo 4: Expresión y antigenicidad in vivo de las secuencias de la envoltura del VIH en vectores de adenovirus Se evaluaron la expresión y la antigenicidad de rAd26.C4D7 y rAd26.sC4 por separado o combinados con un vector de Ad26 recombinante que codifica mos1Env (SEQ ID NO: 5) (en lo sucesivo "rAd26.mos1 Env") en células A549 (línea celular humana) transducidas con un vector in vitro (datos no mostrados). Los análisis por citometría de flujo demostraron que todos los antígenos se expresaron en los cultivos celulares transducidos con 2x104 partículas víricas (pv) de los antígenos de la envoltura solos como controles o con 1x104 pv de 2 antígenos Env combinados mediante transducción de adenovirus. Todas las transducciones contuvieron adicionalmente dosis únicas (1x104 pv) de vectores de adenovirus que codifican mos1GagPol ("rAd26.mos1GagPol") y mos2GagPol ("rAd26.mos2GagPol") (Barouch et al, Nat Med 2010, 16:319-323), de manera que las combinaciones de los vectores evaluadas mostraron las mismas proporciones relativas de los diferentes vectores adenovíricos como se pretendía para su uso preclínico y clínico. Preferiblemente, los vectores que codifican las proteínas de la envoltura del VIH sintéticas de la invención se combinan con los vectores que codifican los antígenos mos1GagPol y mos2GagPol para su uso clínico.
La combinación de rAd26.mos1 Env y rAd26.C4D7 generaba una cobertura máxima de los epítopos evaluados según se determina mediante la unión de anticuerpos monoclonales. En particular, la exposición del epítopo PG16,
que fue debida a la transformación con Ad26.C4D7, resulta prometedor para su uso como una vacuna ya que PG16 representa un anticuerpo monoclonal ampliamente neutralizante que reconoce la región bucle V1/V2 de Env del VIH-1 (Walker et al., Science. 2009). Por lo tanto, la proteína de la envoltura del VIH sintética de la invención obtenida a partir de la secuencia de C4 aumenta la amplitud de la respuesta inmunitaria contra la proteína de la envoltura del VIH en comparación con la respuesta inmunitaria generada únicamente con mos1Env. En el estudio RV144, se ha demostrado que las respuestas de anticuerpos inducidas por la vacuna dirigidos hacia la región de la proteína de la envoltura se correlacionan con la protección frente a la infección por VIH-1 (Haynes et al., N Engl J Med. 2012) y, por lo tanto, la proteína de la envoltura del VIH sintética de la invención es una candidata prometedora para incluirla en las pautas de vacunación contra el VIH.
Ejemplo 5: Inmunogenicidad de los vectores que codifican proteínas de la envoltura del VIH sintéticas
Se examinaron en conejos las secuencias de proteínas de la envoltura del VIH sintéticas de la invención en un contexto de vector de Ad26 para determinar si estas construcciones representaban una alternativa inmunogénica a la construcción rAd26.mos2Env.
La inmunogenicidad de un vector de adenovirus que codifica mos1 Env (rAd26.mos1 Env; SEQ ID NO: 5) se examinó solo y combinado con vectores de adenovirus que codifican las proteínas de la envoltura del VIH sintéticas de la invención (rAd26.C4D7 y rAd26.sC4; que comprenden la SEQ ID NO: 8, en particular las SEQ ID NO: 18 y 19, respectivamente). En todos los casos, también se administraron vectores de adenovirus 26 que codifican los antígenos mos1GagPol y mos2GagPol (rAd26.mos1GagPol [SEQ ID NO: 28] y rAd26.mos2GagPol [SEQ ID NO: 29], respectivamente. Más específicamente, se comparó la inmunogenicidad de rAd26.mos1Env solo (vacuna trivalente: rAd26.mos1GagPol, rAd26.mos2GagPol y rAd26.mos1Env) con la inmunogenicidad de rAd26.mos1Env en combinación con uno de rAd26.C4D7 o rAd26.sC4 (vacuna tetravalente: la administración de rAd26.mos1GagPol, rAd26.mos2GagPol, rAd26.mos1Env y rAd26.C4D7; o la administración de rAd26.mos1GagPol, rAd26.mos2GagPol, rAd26.mos1 Env y rAd26.sC4). Esta comparación de la vacuna trivalente, que carece de cualquier vector que codifica las proteínas de la envoltura del VIH sintéticas de la invención, con la vacuna tretavalente, que contiene vectores que codifican las proteínas de la envoltura del VIH sintéticas de la invención, permite determinar si las proteínas de la envoltura del VIH de la invención contribuyen a la amplitud de la protección.
La administración se realizó en pautas de vacunación, en las que se administraron estos vectores de Ad26 las semanas 0 y 6 como una doble sensibilización y una proteína gp140 del clado C (como una proteína Env gp140 trivalente que tiene la SEQ ID NO: 7 sin la secuencia del péptido señal de los restos 1-29, véase también el documento WO 2010/042942) las semanas 12 y 18 como un doble refuerzo (véase p. ej., Barouch et al., 2015, Science 349: 320-324). La Tabla 1 describe las pautas de vacunación utilizadas para el presente estudio. rAd26.Vacío se refiere a un vector de control que carece de cualquier gen que codifica una secuencia para una proteína antigénica del VIH. Cada grupo contuvo seis conejos.
Tabla 1: Pautas de vacunación examinadas en el estudio de la inmuno enicidad en coneos
La comparación de la vacuna de Ad26 trivalente (que carece de los antígenos Env novedosos de la invención) con la vacuna de Ad26 tetravalente (que comprende los antígenos sC4 o C4D7 Env novedosos) permite examinar si los antígenos novedosos contribuyen a la amplitud de la protección. Se utilizó un ensayo de neutralización con células TZM-bl establecido [Montefiori DC. Methods Mol Biol 2009,485:395-405; Sarzotti-Kelsoe M et al., J Immunol Methods 2014,409:131-146] para medir la actividad neutralizante de los candidatos para la vacuna.
Los resultados se muestran en la Fig. 7 y se analizaron estadísticamente utilizando la vacuna trivalente (grupo 1 de la Tabla 1) como grupo de control y comparándola con cada una de las vacunas cuadrivalentes novedosas (grupos 2 y 3 de la Tabla 1).
En general, las adenoconstrucciones obtenidas a partir de C4 novedosas (es decir, que codifican las proteínas Env que comprenden la SEQ ID NO: 8, y que son una alternativa a mos2Env) fueron inmunogénicas después de dos inmunizaciones intramusculares homologas en conejos.
No se observó capacidad de neutralización de los sueros inmunológicos de conejo contra los pseudovirus del nivel 1B (no se muestran los datos), lo que no es inesperado ya que se sabe que tales virus resultan más difíciles de neutralizar.
La capacidad de neutralización de los pseudovirus de los sueros inmunológicos de conejo contra los virus de nivel 1A del clado B no se vio afectada por la adición de nuevos componentes (datos que no se muestran). Esto demuestra que el antígeno novedoso no interfirió de manera negativa con la inmunogenicidad del antígeno del clado B existente presente en la vacuna (aunque los nuevos componentes estuvieron dirigidos al clado C, no pudiendo excluirse a priori tal interferencia no deseable antes de haberla examinado).
La capacidad de neutralización de los pseudovirus de los sueros inmunológicos de conejo contra un virus del nivel 1A del clado C se vio significativamente potenciada en la inmunización con adeno que contiene C4D7 novedosa cuadrivalente (cuadrivalente, grupo 2) en comparación con la trivalente (que tiene únicamente mos1 Env) sola (grupo 1) (Fig 7 cuadro B). Además, la capacidad de neutralización de los pseudovirus de los sueros inmunológicos de conejo contra un virus del nivel 1A del clado C en la semana 8 se vio significativamente potenciada en la inmunización con adeno que contiene sC4 novedosa cuadrivalente (cuadrivalente, grupo 3) en comparación con la trivalente (que tiene únicamente mos1 Env) sola (grupo 1) (Fig 7 cuadro B).
En conclusión, las construcciones C4D7 y sC4 codificadas en Ad26 fueron inmunogénicas y su adición aumentó la capacidad de unión y de neutralización de una vacuna que tiene mos1 Env (principalmente clado B) como único componente Env codificado por Ad26, hacia las cepas del clado C (Fig 7B).
Ejemplo 6: Inmunogenicidad de las pautas de vacunación que incluyen los vectores que codifican proteínas de la envoltura del VIH sintéticas de la invención
Un estudio en conejos adicional evaluó la combinación del vector tetravalente Ad26.Mos4.HIV (que consiste en cuatro vectores adenovíricos: Ad26.Mos1GagPol [que codifica la SEQ ID NO: 28], Ad26.Mos2GagPol [que codifica la SEQ ID NO: 29], Ad26.Mos1Env [que codifica la SEQ ID NO: 5] y Ad26.Mos2SEnv [el nombre "C4D7" tal como se ha utilizado anteriormente también se refiere como "Mos2S"; este vector codifica la SEQ ID NO: 18 novedosa de acuerdo con la invención], en una mezcla 1:1:1:1 con una dosis total de 5x109 pv), aplicada por vía intramuscular como inmunizaciones de doble sensibilización en las semanas 0 y 6, en combinación con refuerzos con la proteína Env del VIH-1 recombinante utilizando gp140 del clado C [que tiene la secuencia de los restos de aminoácidos 30 708 de la SEQ ID NO: 7], gp140 mosaico [que tiene la secuencia de los restos de aminoácidos 30-724 de la SEQ ID NO: 36] o la combinación de gp140 del clado C y gp140 mosaico, en las semanas 13 y 19. Estos refuerzos con proteína se aplicaron por vía intramuscular con una dosis total de 10 o 50 microgramos de proteína combinados con 250 mcg de adyuvante de tipo fosfato de aluminio formulado el día de la inmunización.
Los resultados indican que todas las pautas examinadas fueron inmunogénicas en todos los animales, induciendo títulos de anticuerpos elevados y una actividad de neutralización moderada contra los virus pseudotipados con Env del nivel 1. Si se utilizaba gp140 mosaico como antígeno vacuna, ya sea solo o combinado con gp140 del clado C, los títulos de ELISA específicos de gp140 mosaico y el reconocimiento de pseudovirus del Clado B aumentaron significativamente en la semana 15 en comparación con el grupo de referencia reforzado únicamente con gp140 del clado C. La magnitud del efecto global de la mejora fue moderada y mayor para el grupo reforzado con la combinación bivalente gp140 del clado C-gp140 mosaico en comparación con únicamente gp140 mosaico. En la semana 21 del estudio, estas diferencias desaparecieron y las respuestas inmunitarias medidas para las cohortes que recibieron los refuerzos bivalentes con gp140 del clado C-gp140 mosaico o los refuerzos monovalentes con gp140 del clado C fueron estadísticamente indistinguibles.
La pauta con la proteína bivalente mostró una inducción de títulos de ELISA y reconocimiento de pseudovirus del clado C comparables a la pauta de refuerzo solo con gp140 del clado C, lo que indica que la inclusión del inmunógeno relacionado con el clado B gp140 mosaico no tuvo un efecto negativo en la cobertura de los antígenos del clado C, a la vez que potenció significativamente la cobertura del clado B en la semana 15 del estudio.
Los datos confirman que el vector Ad26.Mos2SEnv que codifica un antígeno Env sintético de acuerdo con la invención se puede utilizar con éxito en las pautas de vacunación.
Claims (22)
1. Un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de la envoltura del VIH sintética, en donde la proteína de la envoltura del VIH sintética comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18.
2. El vector de la reivindicación 1, en donde el vector es un vector vírico.
3. El vector de la reivindicación 1 o 2, en donde el vector es un vector adenovírico.
4. El vector de la reivindicación 3, en donde el vector adenovírico es un vector adenovírico humano o un vector adenovírico de simio.
5. El vector de la reivindicación 3, en donde el vector adenovírico es un vector de adenovirus del serotipo 26 (Ad26) humano.
6. El vector de la reivindicación 1 o 2, en donde el vector es un vector de virus adenoasociados, un vector del virus de la viruela, un vector MVA, un vector de virus entéricos, un vector del virus de la encefalitis equina de Venezuela, un vector del virus del bosque Semliki, un vector del virus del mosaico del tabaco, o un vector lentivírico.
7. El vector de la reivindicación 1 o 2, en donde el vector es un vector MVA.
8. El vector de la reivindicación 1 o 2, en donde el vector es un vector de tipo plásmido, cromosoma bacteriano artificial, cromosoma de levadura artificial, o bacteriófago.
9. Una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7 y un vehículo, en donde el ácido nucleico que codifica la proteína de la envoltura del VIH sintética está ligado operativamente a una secuencia promotora.
10. Un producto de tipo combinación de vacuna, que comprende:
(i) una primera composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un vector de Ad26, que codifica una proteína de la envoltura del VIH sintética que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18; y
(ii) una segunda composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un segundo vector de Ad26, que codifica un polipéptido antigénico del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5,
en donde la primera y la segunda composición están presentes en la misma composición o en composiciones diferentes.
11. El producto de tipo combinación de vacuna de la reivindicación 10, que comprende además al menos una composición adicional que comprende:
una cantidad inmunológicamente eficaz de un vector que codifica al menos un polipéptido antigénico que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-4, 28 y 29, en donde la primera composición, la segunda composición y la composición adicional están presentes en la misma composición o en una o más composiciones diferentes.
12. El producto de tipo combinación de vacuna de la reivindicación 10 u 11, que además comprende al menos una composición adicional que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de uno o más polipéptidos antigénicos del VIH aislados, en donde la primera composición, segunda composición, composición adicional y otra composición están presentes en la misma composición o en una o más composiciones diferentes.
13. El producto de tipo combinación de vacuna de la reivindicación 12, en donde el uno o más polipéptidos antigénicos del VIH aislados incluyen uno o más polipéptidos antigénicos del VIH seleccionados del grupo que consiste en una proteína gp140 trimérica del clado C del VIH estabilizada que comprende los residuos 30-708 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 y la proteína trimérica Env del VIH mosaico que comprende los residuos 30-724 de la SEQ ID NO: 36.
14. Un kit que comprende un producto de tipo combinación de vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 10 13.
15. La composición de la reivindicación 9, o el producto de tipo combinación de vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 10-13, para su uso en la inducción de una respuesta inmunitaria contra el VIH en un sujeto.
16. Una composición que comprende:
(i) un primer vector de adenovirus 26 (Ad26) que codifica una proteína de la envoltura del VIH sintética que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18;
(ii) un segundo vector Ad26 que codifica un polipéptido antigénico del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5;
(iii) un tercer vector Ad26 que codifica un polipéptido antigénico del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28; y
(iv) un cuarto vector AD26 que codifica un polipéptido antigénico del VIH que comprende la secuencia aminoácidos de la SEQ ID NO: 29.
17. La composición de la reivindicación 16, en donde el primer, segundo, tercero y cuarto vectores Ad26 están presentes en una proporción de partículas víricas de 1:1:1:1
18. Una combinación de vacuna que comprende una composición de acuerdo con la reivindicación 16 y uno o más polipéptidos antigénicos del VIH aislados
19. La combinación de vacuna de la reivindicación 18, en donde el uno o más polipéptidos antigénicos del VIH aislados comprenden una proteína de la envoltura del VIH, por ejemplo, una proteína gp140 trimérica del clado C del VIH y/o una proteína trimérica de la envoltura mosaico.
20. La combinación de vacuna de la reivindicación 19, en donde la proteína gp140 trimérica del clado C comprende los residuos 30-708 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7, y/o en donde la proteína trimérica de la envoltura mosaico comprende los residuos 30-724 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 36.
21. Un vector Ad26 que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de la envoltura del VIH sintética que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18, para su uso en la inducción de una respuesta inmunitaria contra el VIH en un sujeto.
22. Una vacuna con el vector adenovírico que comprende: (i) un primer vector de adenovirus 26 (Ad26) que codifica una proteína de la envoltura del VIH sintética que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18; (ii) un segundo vector Ad26 que codifica un polipéptido antigénico del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5; (iii) un tercer vector Ad26 que codifica un polipéptido antigénico del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28; y (iv) un cuarto vector Ad26 que codifica un polipéptido antigénico del VIH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29, para su uso en una administración de sensibilización inicial,
y
la proteína gp140 Env del VIH, por ejemplo, (a) la proteína gp140 del clado C que comprende los residuos 30-708 de la SEQ ID NO: 7, o (b) la proteína gp140 mosaico que comprende los residuos 30-724 de la SEQ ID NO: 36, o (c) una combinación de la proteína gp140 del clado C y una proteína gp140 mosaico,
para su uso junto con la vacuna con el vector adenovírico en una administración de refuerzo, en donde las administraciones de sensibilización inicial y de refuerzo son para generar una respuesta inmunitaria contra el VIH en un sujeto.
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