CN1236057C - 表达人类激肽释放酶的重组腺相关病毒及其制法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种表达人类激肽释放酶的重组腺相关病毒，该重组腺相关病毒的制备方法和用途，以及含有该重组腺相关病毒的药物组合物，该重组腺相关病毒能驱动人类激肽释放酶基因在体内长期表达，具有长期高效降低血压、改善肾脏功能、预防中风等良好的生理和病理生理作用，可用于原发性高血压、慢性肾功能不全及其他相关性疾病的临床治疗。
Description
技术领域
本发明涉及基因重组和基因治疗领域，具体涉及一种重组腺相关病毒载体与人类激肽释放酶基因重组体，该重组体的制备方法和用途，以及含有该重组体的药物组合物。
背景技术
高血压病是一种多因素影响、多基因起源的慢性疾病，目前治疗这种疾病的有效方法只能是长期，甚至是终身服用降压药物，这对于高血压病患者来说无疑是一种负担，长期服用降压药物还会对机产生一些不良影响。因此，探索高血压病的基因治疗方法和药物成为当前的一项重要课题。
人类激肽释放酶(human kallikrein，HK)是一类丝氨酸蛋白酶，可裂解激肽原生成血管活性肽-激肽。激肽在细胞水平上可促进氯离子和葡萄糖的转运，促进神经元释放递质等。现在发现它还可EDRF/NO的释放，刺激肾脏分泌肾素，促进肾上腺释放血管加压素，促进肾上腺髓质分泌儿茶酚胺。它的这些作用是通过与BK1(配体为kallidin)、BK2(配体为bradykinin)受体结合后发挥的，现在发现激肽可能以NO为第二信使分子而发挥作用。激肽分子C末端的精氨酸可作为NO合成的原料，在NOS作用下合成NO，再通过激活鸟苷酸环化酶，促进cGMP的形成；增加细胞内游离钙；促进PIP2和IP3的形成进而影响多种基因的表达，实现自己舒张血管、增加血管通透性、调节平滑肌的收缩和舒张、等多种生理作用。从而可以治疗高血压，改善肾功能，预防中风。临床研究显示，原发性高血压患者尿中HK显著降低，而口服猪胰腺激肽释放酶可明显降低高血压患者的血压。另外，在SHR也观察到尿HK减少。实验研究已证明，敲除HK基因的大鼠血压升高，而导入HK基因的不同的高血压大鼠模型均出现持续的降压作用。天然状态的人类激肽释放酶cDNA序列(录自GENEBANK)在本说明书的后面。
腺相关病毒是一种动物单链DNA病毒，它属于细小病毒科，细小病毒亚科，依赖病毒属，自然缺陷、无包被和无致病原性。天然腺相关病毒(AAV)及重组腺相关病毒(rAAV)载体具有以下特点：
1.V基因组是一个线性、单链(ssDNA)分子，含4680个核苷酸(序列如附图1)，其特点在于：
1)其基因组由4个开放阅读宽读框(ORF)组成，分称rep区、lip区、inf区和cap区(见本说明书后面的腺相关病毒序列及具体分区表和附图1)。位于基因组DNA左端的一个大ORF由于移码突变或缺失会阻止DNA复制，因而被称为rep区，。右端的一个大ORF(cap)编码合成3种外壳蛋白。另有两个小ORF位于基因组DNA的中央区，即inf区和lip区，具体功能尚不清。
2)在分子单链每个末端含有一个145个碱基末端重复序列(ITR)(见本说明书后面的腺相关病毒序列及具体分区表)。ITR序列折叠成发卡结构作为DNA复制起始和包装重组AAV基因组为感染性的病毒颗粒所需的唯一已知顺式作用元件(见附图2)。
3)腺相关病毒的复制和转录调节相当复杂，按有无辅助病毒的共转染分，有增殖性和潜伏性两种表达方式(如附图3所示)。
在AAV的增殖性表达中，可转录生成6种mRNA，分别由启动子P5、P19、P40启动合成(如图4)。在腺病毒(Ad)的共转染的情况下，Ad的E1A基因负责AAV基因表达的反式激活；Ad E2A基因编码单链DNA结合蛋白，可刺激AAV启动子所启动的转录，还可促进AAV转录本从胞核向胞质转运；另外Ad VA1 RNA可能也有利于AAV蛋白合成的起始。而AAV也能够正调节和负调节自身基因和辅助病毒基因表达。AAV的rep基因能够正调节和负调节P5、P19、P40启动子所启动的转录，在有Ad的情况下，rep基因产物行使正调节功能，这是AAV基因大量合成所必须的；而在无辅助病毒共转染的情况下，rep基因产物则起负调节作用。
在无辅助病毒的情况下，AAV DNA以双链形式整合到宿主细胞基因组中，在那里以潜伏状态持续存在，形成AAV的潜伏感染。AAV整合的特异位点是在人染色体的19q13.3-19q ter上。Rep基因产物除了负调节作用外，还可识别和结合特异的整合位点，即GGTC序列，并介导了ITR与整合位点的重组。而腺病毒的感染可使其进入增殖感染状态。
AAV是目前已知的唯一能够在宿主基因组特异染色体位点整合的真核细胞病毒。这个发现产生了基因治疗的新希望，AAV基因治疗载体不仅仅能够和非整合载体(如腺病毒为基础的载体)相比更持续稳定地表达转基因，而且能够减少理论上的由于转基因的随机整合导致的插入突变几率。
发明内容
本发明的目的是提供一种表达人类激肽释放酶的重组腺相关病毒和该重组腺相关病毒的制备方法以及本发明表达人类激肽释放酶的重组腺相关病毒为活性成分的药物组合物，用以实现对高血压病的基因治疗，使表达人类激肽释放酶的重组腺相关病毒具有能驱动人类激肽释放酶基因在体内长期表达，具有长期高效降低血压、改善肾脏功能、预防中风等良好的生理和病理生理作用，可用于原发性高血压、慢性肾功能不全及其他相关疾病的治疗，且无副作用(无免疫源性)和感染效率高等特点。
本发明提供的表达人类激肽释放酶的重组腺相关病毒，包括编码腺相关病毒Rep蛋白和Cap蛋白编码序列的包装质粒pXX2、经删除腺病毒致病基因序列而保留了腺病毒E1A、E2A和VA1 RNA基因所得的辅助质粒pXX6和插入了人类激肽释放酶编码序列的真核表达载体，在包装质粒pXX2的上游和下游各有一个启动子序列，所说的真核表达载体为含有CMV启动子的pXXUF1或pXXUF3，所说的人类激肽释放酶基因为天然状态的人类激肽释放酶基因，或者为天然状态的人类激肽释放酶基因的突变体或人工修饰体。
本发明使用的载体系统是将天然腺相关病毒和腺病毒用分子生物学方法经一系列剪切和修饰而成，它们保留了腺相关病毒复制和转录所必需的部分，也保留了腺病毒的晚期基因辅助成份，其他多余的部分均已删除，既能实现病毒长期稳定的潜伏感染，又能避免腺病毒的致病危险，而且腺病毒晚期基因的表达可以保证被克隆基因的表达效率。本发明的载体系统的构成如下：
pXX2：(见附图5)保留了AAV的cap基因和rep基因(此时得到pACG-2)，并在下游区域又插入了一个p5启动子(在原来区域用XbaI和PstI切下，再连接到pACG-2的适当位置)。另外我们对照组所使用的报告基因(lacZ)也连在pXX2的下游。方法是：先在pXX2下游造一个ClaI的切口，再在其切口上加一个Sse8387I的接头(5’-CGCCTGCAGG-3’)，把两端为Pst I切口的lacZ片段连接于其上。
PXX6：(见图5)在腺病毒改造质粒pBH10(已切掉了E1、E3基因和包装信号)上用PmeI和SgfI切下一个8kb的片段(得到pXX5)，而pXX6则是由pXX5上用ClaI和SalI切下一段克隆入pBS中得到的，仅仅留下E2A、E4和VA编码区。
pXXUF1和pXXUF3(见图6)：rAAV包装所用的质粒pXXUF1和pXXUF3含有CMV启动子(箭头)所驱动的人gfp基因，它是将腺相关病毒的编码基因全部删除后再由NotI位点导入的。而pXXUF3又含有一个IRES启动子。为了便于基因克隆和表达，将其加工成环状。
本发明提供的制备表达人类激肽释放酶的重组腺相关病毒的方法包括：
(a)提供腺相关病毒包装所必需的Rep蛋白和Cap蛋白的编码序列——pXX2质粒，和刺激腺相关病毒复制和转录所必需的腺病毒E1A、E2A和VAI RNA基因——pXX6质粒；
(b)提供含腺相关病毒基因组的真核表达载体pXXUF1，在该真核载体中腺相关病毒缺失cap蛋白和rep蛋白编码区，并插入人类激肽释放酶基因(human kallikrein)，形成重组质粒pXXUF1-HK；
(c)将步骤a)中的pXX2、pXX6和步骤b)中的pXXUF1-HK共转染293细胞；
(d)回收，分离纯化重组体。
本发明提供的药物组合物由含有有效量的本发明提供的表达人类激肽释放酶的重组腺相关病毒和药学上可接受的载体或赋形剂构成，所说的载体可以是生理盐水，即以生理盐水为载体，按常规方法制成含有本发明表达人类激肽释放酶的重组腺相关病毒的注射用药剂。
附图说明
图1为腺相关病毒的基因组构造图
图2为ITR的序列及二级结构图
图3、图4为腺相关病毒的转录和翻译
图5为pXX2、pXX6质粒构成
图6为pXXUF1和pXXUF3质粒主要构成部分
图7为pXXUF1-HK的质粒构成
图8为rAAV杂交与放射自显影结果，上排为待测样品，按体积比对倍稀释，从左到右依次为10μl、5μl、2.5μl……；下排为标准品，按分子数对倍稀释，从左到右依次为1011、5×1010、2.5×1010……；
图9为rAAV-HK注射后对SHR血压的影响
图10、11为rAAV-HK注射后对SHR尿微量白蛋白的影响
具体实施方式
实施例1
人类激肽释放酶(HK)cDNA的克隆及其与rAAV的重组和构建。
1)人类激肽释放酶(HK)cDNA的克隆
设计引物：P1，5’-GCAGAATTCATGTGGTTCCTGG-3’；P2，5’-GACAAGCTTTTACTGGGGGTA-3’。由武汉生物合成公司合成。用TRIZOL试剂盒(购自GIBCO公司)自人体肝脏标本中提取总RNA，进行RT-PCR(试剂盒购自日本TAKARA公司)。PCR仪购自英国TECONE公司。并将产物与pXXUF1相连。HKcDNA将pXXUF1中的gfp基因所取代，pXXUF1-HK的质粒构成，如附图7所示。
将HKcDNA测序，所得结果与从GeneBank中的结果相同。但是根据Kozak序列原理：首先是启动子下游第一个ATG常作为翻译起始密码子，其次是ATG临近的3位通常是A/G，+4位是G，将任何一个3或+4的嘌呤换成嘧啶，翻译量会减少5～10倍，若均换成嘧啶，则翻译水平下降20倍。据此，提出(GCC)GCCA/GCCATGG是高等真核基因起始密码子附近的保守序列。因此，我们对HKcDNA作了修饰，将天然状态的人类激肽释放酶基因的起始密码ATG后第1位碱基由T改换为G，得到修饰后的HKcDNA，见本说明书后面的修饰后的HKcDNA序列表。
2、表达人类激肽释放酶的重组腺相关病毒的制备
1)rAAV-HK与rAAV-LacZ重组病毒的包装与回收
pXX2、pXX6、pXXUF1-HK、pdx-LacZ的质粒的大量提取，所用大提试剂盒购自Promega公司。方法依说明书所述。
将293细胞(人肾母胚胎肿瘤细胞系)传入数个150mm培养板中，传代培养需要0.25％胰蛋白酶、高糖DMEM培养基、新生小牛血清(购自Gibco公司)。待细胞生长到60％到70％聚集度时，按摩尔比1∶1∶1将pXX2、pXX6、pXXUF1-用(pdx-lacZ)用钙磷转染法转入293细胞。转染后48-72小时吸弃所有培养基，加入少量PBS缓冲液，刮取盘中293细胞，后-80℃冻存。
2)AAV-HK与rAAV-LacZ回收病毒的纯化
为祛除细胞中的异型蛋白，须用氯化铯梯度离心法提纯，方法如下：回收物反复冻融三次后，3000转离心，祛除沉淀，上清液加1/3体积的(NH4)2SO4，进一步祛除蛋白质，4℃、5000转/分离心10min后去上清。加2/3体积的(NH4)2SO4，混匀、4℃培育20min，再4℃、12000转/分离心20min，取沉淀溶于20ml1.37g/ml的氯化铯溶液中。后288，000转/分超速离心48小时。将离心管中的内容物分12-16节段，每一段用21-G型的针插入，从中收取10滴左右的液体，均用斑点杂交法测定滴度。
3)rAAV-HK与rAAV-LacZ滴度的测定—斑点杂交
a)cDNA探针的标记和纯化：
同位素标记的核苷酸α-P32购自北京雅辉公司。用Not I切下PCDNA3。1-HK中的HK片段做为已知序列的探针。随机引物法标记HK片段并纯化(试剂盒购自QIAGEN公司，按说明书方法操作)。
b)收物和定量标准的准备：
回收物经适量Dnase I和RNAse消化，消化细胞基因组的DNA、RNA。反应终止后再加Proteinse K，消化病毒的蛋白质外壳(以上试剂均购自日本TAKARA公司)。酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，祛除沉淀，上清中为病毒中的DNA。将上清按体积比对倍稀释。标准物采用目的基因片段，即HK片段，测定浓度后按分子数对倍稀释，并作加热和碱变性处理。
c)杂交与放射自显影
配好斑点杂交装置，并按装置大小安置一块0.45μm的尼龙膜，将待测病毒样品和标准样品按体积梯度和分子梯度分别上样，上样后将膜80℃干烤2小时，后42℃预杂交1小时(预杂交液购自INTERGEN公司)。再加加热处理的标记探针，45℃杂交12-16小时。洗膜后-80℃放射自显影2-3天。结果如图8。此结果说明本发明制备的rAAV-HK具备足够的滴度(1×1011p.f.u.)，可以用于动物实验和临床治疗。
上述方法制备的重组腺相关病毒被命名为“表达人类激肽释放酶的重组腺相关病毒(rAAV-HK)”，2001年9月29日保藏于位于中国武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.V200109。
实施例2
rAAV-HK对自发性高血压大鼠(SHR)模型的降压作用
自发性高血压大鼠模型购自上海高血压病研究所，共12只大鼠分两组，分别经尾静脉注射rAAV-HK与rAAV-LacZ病毒，每只所用量为1×1011p.f.u。注射后每周测血压，每半月收24小时尿。发现注射后第3-4周实验组大鼠血压开始下降，直至五个月后处死全部动物，结果见图9。
实施例3
rAAV-HK预防中风的作用
注射基因后8-16周，对照组(rAAV-lacZ组)6只动物中有2只发生中风(经解剖证实)，其中一只为脑出血，另一只为多发性脑梗塞。而实验组则全部无中风现象。
实施例4
rAAV-HK改善肾功能的作用
同时用ELISA法测尿微量白蛋白，发现多数实验组大鼠的尿微量白蛋白量呈阶梯形下降，结果见附图10、11。
而将动物肾脏固定后切片，均作HE染色和Van Gieson染色，则发现注射基因后16周左右的对照组动物肾脏的肾单位明显比实验组动物减少，而且多数肾脏组织被纤维组织替代，而实验组动物肾脏则无明显变化。
实施例5
rAAV-HK逆转心血管系统的重构
取动物心脏、血管固定后切片，均作HE和Van Gieson染色，比较两组动物发现：1)对照组动物的心脏从组织切面上看心室壁明显增厚，而心室腔则明显减小2)镜下观察，实验组动物的心室肌肌束增粗，部分被纤维组织取代。3)主动脉的V-G染色初步结果证明，对照组动物血管壁中的胶原纤维分布明显比实验组动物多且广范。
以上结果说明本发明提供的rAAV-HK病毒具有长期高效降低血压、改善肾脏功能、预防中风等良好的生理和病理生理作用，可用于原发性高血压、慢性肾功能不全及其他相关性疾病的临床治疗。
以下为本发明涉及的核苷酸序列表
1.腺相关病毒的序列及具体分区
61 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg
121 gccaactcca tcactagggg ttcctggagg ggtggagtcg tgacgtgaat tacgtcatag
241 gtggtcacgc tgggtattta agcccgagtg agcacgcagg gtctccattt tgaagcggga
301 ggtttgaacg cgcagccgcc atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg
361 accttgacgg gcatctgccc ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg
421 aatgggagtt gccgccagat tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga
481 ccgtggccga gaagctgcag cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc
541 cggaggccct tttctttgtg caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc
601 tcgtggaaac caccggggtg aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg
661 aaaaactgat tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg
721 tcacaaagac cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc
781 ccaattactt gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac
841 agtatttaag cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga
901 cgcacgtgtc gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc
961 cggtgatcag atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca
1021 aggggattac ctcggagaag cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca
1081 atgcggcctc caactcgcgg tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta
1141 tgagcctgac taaaaccgcc cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt
1201 ccagcaatcg gatttataaa attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt
1261 ccgtctttct gggatgggcc acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg
1321 ggcctgcaac taccgggaag accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct
1381 acgggtgcgt aaactggacc aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg
1441 tgatctggtg ggaggagggg aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc
1501 tcggaggaag caaggtgcgc gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga
1561 ctcccgtgat cgtcacctcc aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga
1621 ccttcgaaca ccagcagccg ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc
1681 tggatcatga ctttgggaag gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa
1741 aggatcacgt ggttgaggtg gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa
1801 gacccgcccc cagtgacgca gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc
1921 gttctcgtca cgtgggcatg aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga
1981 atcagaattc aaatatctgc ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg
2041 tgtcagaatc tcaacccgtt tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc
2101 atcatatcat gggaaaggtg ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt
2161 tggatgactg catctttgaa caataaatga tttaaatcag gtatggctgc cgatggttat
2281 cctggcccac caccaccaaa gcccgcagag cggcataagg acgacagcag gggtcttgtg
2341 cttcctgggt acaagtacct cggacccttc aacggactcg acaagggaga gccggtcaac
2461 agacaacccg tacctcaagt acaaccacgc cgacgcggag tttcaggagc gccttaaaga
2521 agatacgtct tttgggggca acctcggacg agcagtcttc caggcgaaaa agagggttct
2581 tgaacctctg ggcctggttg aggaacctgt taagacggct ccgggaaaaa agaggccggt
2641 agagcactct cctgtggagc cagactcctc ctcgggaacc ggaaaggcgg gccagcagcc
2701 tgcaagaaaa agattgaatt ttggtcagac tggagacgca gactcagtac ctgaccccca
2761 gcctctcgga cagccaccag cagccccctc tggtctggga actaatacga tggctacagg
2821 cagtggcgca ccaatggcag acaataacga gggcgccgac ggagtgggta attcctccgg
2881 aaattggcat tgcgattcca catggatggg cgacagagtc atcaccacca gcacccgaac
2941 ctgggccctg cccacctaca acaaccacct ctacaaacaa atttccagcc aatcaggagc
3001 ctcgaacgac aatcactact ttggctacag caccccttgg gggtattttg acttcaacag
3061 attccactgc cacttttcac cacgtgactg gcaaagactc atcaacaaca actggggatt
3121 ccgacccaag agactcaact tcaagctctt taacattcaa gtcaaagagg tcacgcagaa
3181 tgacggtacg acgacgattg ccaataacct taccagcacg gttcaggtgt ttactgactc
3241 ggagtaccag ctcccgtacg tcctcggctc ggcgcatcaa ggatgcctcc cgccgttccc
3301 agcagacgtc ttcatggtgc cacagtatgg atacctcacc ctgaacaacg ggagtcaggc
3361 agtaggacgc tcttcatttt actgcctgga gtactttcct tctcagatgc tgcgtaccgg
3421 aaacaacttt accttcagct acacttttga ggacgttcct ttccacagca gctacgctca
3481 cagccagagt ctggaccgtc tcatgaatcc tctcatcgac cagtacctgt attacttgag
3541 cagaacaaac actccaagtg gaaccaccac gcagtcaagg cttcagtttt ctcaggccgg
3601 agcgagtgac attcgggacc agtctaggaa ctggcttcct ggaccctgtt accgccagca
3661 gcgagtatca aagacatctg cggataacaa caacagtgaa tactcgtgga ctggagctac
3721 caagtaccac ctcaatggca gagactctct ggtgaatccg gccatggcaa gccacaagga
3781 cgatgaagaa aagttttttc ctcagagcgg ggttctcatc tttgggaagc aaggctcaga
3841 gaaaacaaat gtgaacattg aaaaggtcat gattacagac gaagaggaaa tcggaacaac
3901 caatcccgtg gctacggagc agtatggttc tgtatctacc aacctccaga gaggcaacag
3961 acaagcagct accgcagatg tcaacacaca aggcgttctt ccaggcatgg tctggcagga
4021 cagagatgtg taccttcagg ggcccatctg ggcaaagatt ccacacacgg acggacattt
4081 tcacccctct cccctcatgg gtggattcgg acttaaacac cctcctccac agattctcat
4141 caagaacacc ccggtacctg cgaatccttc gaccaccttc agtgcggcaa agtttgcttc
4201 cttcatcaca cagtactcca cgggacacgg tcagcgtgga gatcgagtgg gagctgcaga
4261 aggaaaacag caaacgctgg aatcCcgaaa ttcagtacac ttccaactac aacaagtctg
4321 ttaatcgtgg acttaccgtg gatactaatg gcgtgtattc agagcctcgc cccattggca
4381 ccagatacct gactcgtaat ctgtaattgc ttgttaatca ataaaccgtt taattcgttt
4441 cagttgaact ttggtctctg cgtatttctt tcttatctag tttccatggc tacgtagata
4561 cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg
4621 gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaa
2.人类激肽释放酶cDNA序列(录自GENEBANK)
tcctccacctgctggcccctggacacctctgtcaccatgtggttcctggttctgtgcct
cgccctgtccctgggggggactggtgctgcgcccccgattcagtcccggattgtgggag
gctgggagtgtgagcagcattcccagccctggcaggcggctctgtaccatttcagcact
ttccagtgtgggggcatcctggtgcaccgccagtgggtgctcacagctgctcattgcat
cagcgacaattaccagctctggctgggtcgccacaacttgtttgacgacgaaaacacag
cccagtttgttcatgtcagtgagagcttcccacaccctggcttcaacatgagcctcctg
gagaaccacacccgccaagcagacgaggactacagccacgacctcatgctgctccgcct
gacagagcctgctgataccatcacagacgctgtgaaggtcgtggagttgcccacccagg
aacccgaagtggggagcacctgtttggcttccggctggggcagcatcgaaccagagaat
ttctcatttccagatgatctccagtgtgtggacctcaaaatcctgcctaatgatgagtg
cgaaaaagcccacgtccagaaggtgacagacttcatgctgtgtgtcggacacctggaag
gtggcaaagacacctgtgtgggtgattcagggggcccgctgatgtgtgatggtgtgctc
caaggtgtcacatcatggggctacgtcccttgtggcacccccaataagccttctgtcgc
cgtcagagtgctgtcttatgtgaagtggatcgaggacaccatagcggagaactcctgaa
cgcccagccctgtcccctacccccagtaaaatcaaatgtgcatcc
3.修饰后的HKcDNA
tcctccacctgctggcccctggacacctctgtcaccatggggttcctggttctgtgcctcgccctgtccct
gggggggactggtgctgcgcccccgattcagtcccggattgtgggaggctgggagtgtgagcagcatt
cccagccctggcaggcggctctgtaccatttcagcactttccagtgtgggggcatcctggtgcaccgcc
agtgggtgctcacagctgctcattgcatcagcgacaattaccagctctggctgggtcgccacaacttgttt
gacgacgaaaacacagcccagtttgttcatgtcagtgagagcttcccacaccctggcttcaacatgagcc
tcctggagaaccacacccgccaagcagacgaggactacagccacgacctcatgctgctccgcctgac
agagcctgctgataccatcacagacgctgtgaaggtcgtggagttgcccacccaggaacccgaagtgg
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Claims (10)
1.一种表达人类激肽释放酶的重组腺相关病毒，其特征在于，它包括编码腺相关病毒Rep蛋白和Cap蛋白编码序列的包装质粒pXX2、经删除腺病毒致病基因序列而保留了腺病毒E1A、E2A和VA1RNA基因所得的辅助质粒pXX6和插入了人类激肽释放酶编码序列的真核表达载体，在包装质粒pXX2的上游和下游各有一个启动子序列。
2.根据权利要求1所述的表达人类激肽释放酶的重组腺相关病毒，其特征在于，所说的在包装质粒pXX2的上游和下游的启动子序列为p5启动子序列。
3.根据权利要求1、2所述的表达人类激肽释放酶的重组腺相关病毒，其特征在于，所说的真核表达载体为含有CMV启动子的pXXUF1或pXXUF3。
4.根据权利要求1、2所述的表达人类激肽释放酶的重组腺相关病毒，其特征在于，所说的人类激肽释放酶基因为天然状态的人类激肽释放酶基因或其人工修饰体。
5.根据权利要求3所述的表达人类激肽释放酶的重组腺相关病毒，其特征在于，所说的人类激肽释放酶基因为天然状态的人类激肽释放酶基因或其人工修饰体。
6.根据权利要求4所述的表达人类激肽释放酶的重组腺相关病毒，其特征在于，所说的人类激肽释放酶基因的人工修饰体是将天然状态的人类激肽释放酶基因的起始密码ATG后第1位碱基由T改换为G。
7.根据权利要求5所述的表达人类激肽释放酶的重组腺相关病毒，其特征在于，所说的人类激肽释放酶基因的人工修饰体是将天然状态的人类激肽释放酶基因的起始密码ATG后第1位碱基由T改换为G。
8.根据权利要求6、7所述的表达人类激肽释放酶的重组腺相关病毒，其特征在于，它是保藏于中国典型培养物保藏中心的表达人类激肽释放酶的重组腺相关病毒rAAV-HK，CCTCC No.V200109。
9.一种制备表达人类激肽释放酶的重组腺相关病毒的方法，包括：
(a)提供腺相关病毒包装所必需的Rep蛋白和Cap蛋白的编码序列的pXX2质粒，和刺激腺相关病毒复制和转录所必需的腺病毒E1A、E2A和VAI RNA基因的pXX6质粒；
(b)提供含腺相关病毒基因组的真核表达载体pXXUF1，在该真核载体中腺相关病毒缺失cap蛋白和rep蛋白编码区，并插入人类激肽释放酶基因，形成重组质粒pXXUF1-HK；
(c)将步骤(a)中的pXX2、pXX6和步骤(b)中的pXXUF1-HK共转染293细胞；
(d)回收，分离纯化重组腺相关病毒。
10.一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物含有有效量的权利要求1至8所述的任何一种表达人类激肽释放酶的重组腺相关病毒和药学上可接受的载体或赋形剂。
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