KR20200044990A - 급속 및 지속적 면역학적제제-치료제 - Google Patents

급속 및 지속적 면역학적제제-치료제 Download PDF

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KR20200044990A
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Abstract

본 발명은 E1/E3-결손형 아데노바이러스 입자의 비내 투여가 다양한 질병 환경에서 바이러스 및 박테리아 병원체에 대하여 급속의 광범한 방어를 부여할 수 있다는 것을 보여준다. 방어 반응은 동물 모델에서 단일 용량 치료요법에 의해 많은 주(week) 동안 지속되었다. 병원체 유래의 항원 유전자가 E1/E3-결손형 아데노바이러스 게놈 내로 삽입되었을 때, 특정 병원체에 대한 항원-유도성 방어 면역은 아데노바이러스-매개의 방어 반응이 소멸되기 전에 유도되었고, 이에 따라 병원체에 대하여 급속의 지속적이고 끊임없는 방어가 부여되었다. E1/E3-결손형 아데노바이러스 외에, 병원체 유래의 항원을 암호화하는 다른 생체공학적으로 처리된 비복제성 벡터도 신세대 급속 및 지속적인 면역학적제제-치료제(RAPIT)로 개발될 수 있다.

Description

급속 및 지속적 면역학적제제-치료제{RAPID AND PROLONGED IMMUNOLOGIC-THERAPEUTIC}
관련 출원 및 참고 인용 문헌
본 출원은 2011년 3월 21일에 출원된 61/454,819 및 2011년 12월 8일에 출원된 61/568,054의 미국 임시특허출원들을 우선권으로 주장한다.
참고인용문헌으로는 미국 특허 6,348,450, 6,706,693, 6,716,823 및 7,524,510과 미국특허공개번호 20030045492, 20030125278, 2004009936, 20050271689, 20070178115, 20090175897 및 20110268762 및 미국특허출원 일련번호 12/959,791이 있다.
상기 출원들과 여기서 인용된 모든 문서 또는 출원 진행 동안의 모든 문서("출원 인용 문서") 및 출원 인용 문서에 인용되거나 언급된 모든 문서 및 여기에 인용되거나 언급된 모든 문서("여기에 인용된 문서"), 및 여기에 인용된 문서에 인용되거나 언급된 모든 문서, 및 이와 함께 여기에 언급되거나 여기에 참고인용된 모든 문서에 언급된 모든 제품에 대한 제조업자의 모든 지시, 설명, 제품 시방서 및 제품 시트는 여기에 참고 인용되고 본 발명을 실시하는데 사용할 수 있다. 더 상세하게는, 언급된 모든 문서는 각각 개별 문서가 참고 인용되는 것으로 특별히 개별적으로 표시되었지만, 모두 참고 인용된 정도는 동일하다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 면역학 및 치료 기술 분야에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 급속-지속적인 선천적 면역 반응을 유도해내는 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
연방 재원지원 설명
본 발명은 부분적으로 국립보건원 보조금 2-R44-AI-068285-02, 1-UC1-AI-067198-01 및 1-UC1-AI-067205-1; 국립보건원 계약 N01-AI-30063; 및 국립 알러지 및 감염 질환 협회 비임상 평가 협정의 지원을 받았다. 연방정부는 본 발명에 일정 권리가 있을 수 있다.
발명의 배경
면역학적제제(예, 백신) 및 치료제(예, 약물)의 질병 투쟁력은 사망률 및 이환율의 세계적 감소에 의해 인정을 받은 공중보건 상의 대성공이었다. 의학적 시술력을 더욱 증폭시키기 위한 목표는 저비용으로 대량 생산할 수 있고 비의료인에 의해 집단 투여될 수 있는 신세대 급속-반응 면역제제; 뿐만 아니라 지속적인 보호를 제공할 수 있고 바람직하게는 약물내성으로 인해 손상되지 않는 신세대 치료제의 개발을 필요로 한다. 또한, 신 면역제제 및 치료제는 종래의 백신 및 약물보다도 더 높은 안전성 보장여지를 지니고 있어야 한다.
미생물 병원체에 대한 종래 약물의 사용은 종종 미생물이 돌연변이 압력 하에 끊임없이 진화하기 때문에 시간이 갈수록 약물내성을 유도한다. 본 발명은 병원체의 성장을 방해하는 기도의 서식처를 변화시켜 E1/E3-결손성(△E1E3) 아데노바이러스 입자를 비내 투여한 후 동물에서 항바이러스 또는 항균 상태가 빠르게 유도될 수 있다는 것을 예시한다. 아데노바이러스 입자는 병원체를 직접 공격하지 않기 때문에, 이 신규 치료제가 약물 내성을 유도할 가능성은 거의 없다. 더구나, 아데노바이러스-유도된 항병원체 상태는, 병원체 유래의 항원이 백신으로서 아데노바이러스 게놈 내에 삽입된다면, 이 아데노바이러스로부터 발현된 병원체 유래의 항원에 의해 유도되어진 방어 면역의 유도와 중복되기에 충분히 길게, 다수의 수 주 동안 동물에서 지속될 수 있다. 비복제성 아데노바이러스 입자는 치료 보강제로서 다른 점막 백신과 공동투여될 수 있는 것으로 생각한다.
비복제성 아데노바이러스-벡터화된 백신은 이 벡터가 수요 급증에 대응하여 무혈청 현탁 세포에서 빠르게 제조될 수 있기 때문에 백신 적용 범위를 증가시킬 가능성이 있다. 더욱이, 기존의 아데노바이러스 면역성은 아데노바이러스 벡터화된 비측 백신의 효능을 눈에 띄게 방해하지 않는다. 사람 백신접종 외에 동물도 역시 이러한 종류의 벡터화된 백신에 의해 집단 면역화될 수도 있다.
더 나은 백신에 대한 수요는 끝이 없다. 백신접종은 질병 예방에 가장 비용 효과적인 방법인 것으로 증명되었지만, 백신 적용범위를 증가시키기 위한 전면적인 공세는 세계적으로 공중보건 향상을 위한 움직임에 주목하지 않을 수 없는 목표이다. 판매 허가를 받은 현행 백신으로는, 사멸된 전체 미생물, 약독화된 생미생물, 미생물 추출물, 정제된 단백질 또는 재조합 단백질, DNA 백신 및 바이러스-유사 입자가 포함된다. 이러한 백신들의 광범한 분포로 인해 많은 질병들이 격퇴되었지만, 매우 다양한 질병 환경에서 집단(무리) 면역성을 발생시키기 위한 목표는 현행 백신 접종 프로그램들의 많은 문제점들로 인해 아직 달성하기 어려운 상태이다.
구체적으로, 백신-관련 부작용은 국소 및 전신 염증 반응, 열, 혈소판 활성화, 심장 자율신경 기능이상, 아나필락시스 반응(특정 백신의 바늘 주사에 의해 유도됨) [Salomon ME, Halperin R, Yee J. Evaluation of the two-needle strategy for reducing reactions to DPT vaccination. Am. J. Dis. Child. 141, 796-798 (1987), Lanza GA, Barone L, Scalone G et al. Inflammation-related effects of adjuvant influenza A vaccination on platelet activation and cardiac autonomic function. J. Intern. Med. 269, 118-125 (2011), Jae SY, Heffernan KS, Park SH et al. Does an acute inflammatory response temporarily attenuate parasympathetic reactivation? Clin. Auton. Res. 20, 229-233 (2010) and Sever JL, Brenner Al, Gale AD et al. Safety of anthrax vaccine: an expanded review and evaluation of adverse events reported to the Vaccine Adverse Event Reporting System (VAERS). Pharmacoepidemiol. Drug Saf. 13, 825-840 (2004)]에서부터 마비성 회색질척수염의 희귀 발생(경구 폴리오 백신의 섭취로 인해 중재됨)[Minor P. Vaccine-derived poliovirus (VDPV): impact on poliomyelitis eradication. Vaccine 27, 2649-2652 (2009)], 심근심막염(Dryvax 마마 백신의 접종에 의해 유도) [Poland GA, Grabenstein JD, Neff JM. The US smallpox vaccination program: a review of a large modern era smallpox vaccination implementation program. Vaccine 23, 2078-2081 (2005)] 및 벨 마비(Bell's palsy) (박테리아 독소 비측 보강제에 의해 유도)[Lewis DJ, Huo Z, Barnett S et al. Transient facial nerve paralysis (Bell's palsy) following intranasal delivery of a genetically detoxified mutant of Escherichia coli heat labile toxin. PLoS ONE 4, e6999 (2009) and Couch RB. Nasal vaccination, Escherichia coli enterotoxin, and Bell's palsy. N. Engl. J. Med. 350, 860-861 (2004)]에까지 이른다.
2010년, 백신접종자 중에서 기면증의 급증이 스쿠알렌 보강제를 함유하는 H1N1 유행성 인플루엔자 백신을 바늘 주사로 맞은 후에 몇몇 국가에서 보고되었다. 스쿠알렌 단독 주사는 동물의 류마티스성 관절염을 유도할 수 있다[Carlson BC, Jansson AM, Larsson A, Bucht A, Lorentzen JC. The endogenous adjuvant squalene can induce a chronic T-cell-mediated arthritis in rats. Am. J. Pathol. 156, 2057-2065 (2000)]. 최근의 증거는 만성 경도의 염증이 심혈관 질환[Finch CE, Crimmins EM. Inflammatory exposure and historical changes in human life-spans. Science 305, 1736-1739 (2004)], 비만[Gregor MF, Hotamisligil GS. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu. Rev. Immunol. 29, 415-445 (2011)], 당뇨[Gregor MF, Hotamisligil GS. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu. Rev. Immunol. 29, 415-445(2011)], 암[O'Callaghan DS, O'Donnell D, O'Connell F, O'Byrne KJ. The role of inflammation in the pathogenesis of non-small cell lung cancer. J. Thorac. Oncol. 5, 2024-2036 (2010)] 및 신경계 장애[Witte ME, Geurts JJ, de Vries HE, van der Valk P, van Horssen J. Mitochondrial dysfunction: a potential link between neuroinflammation and neurodegeneration? Mitochondrion 10, 411-418 (2010)]와 관련이 있음을 보이고 있는 바, 이제는 백신 유도 염증에 관심을 집중할 필요가 있다.
면역자극 백신-보강제 복합체를 주사 시 유도된 급성 염증 반응[Salomon ME, Halperin R, Yee J. Evaluation of the two-needle strategy for reducing reactions to DPT vaccination. Am. J. Dis. Child. 141, 796-798 (1987), Lanza GA, Barone L, Scalone G et al. Inflammation-related effects of adjuvant influenza A vaccination on platelet activation and cardiac autonomic function. J. Intern. Med. 269, 118-125 (2011) and Jae SY, Heffernan KS, Park SH et al. Does an acute inflammatory response temporarily attenuate parasympathetic reactivation? Clin. Auton. Res. 20, 229-233 (2010)]이 만성 경도 염증으로 진화할 수 있고 백신접종자들의 아집단에서 이러한 임의의 병을 촉발할 수 있는지의 여부는 공중보건에 있어서 가장 중요하다; 하지만, 이 잠재적 위험은 철저하게 연구된 적이 없다. 백신 안전성의 개념은 '병원체 유도 질병에 대한 방어'에서부터 '부작용 유도의 가능성 전무'로 진화하고 있기 때문에, 백신에서 발견된 임의의 공지된 외인성 제제, 독성 및 잔류 독력(virulence)은 허용되지 않을 것이며, 미지의 부작용(예, 생명유지 기관의 염증)을 유도할 수 있는 모든 가능성은 회피되어야 한다.
점막 면역반응 및 전신 면역반응은 유도되고 상당한 독립성 정도로 조절되며, 대부분의 백신은 전신 면역성을 잘 유도하나 종종 점막 병원체(예, 인플루엔자 바이러스, 결핵균 및 HIV)에 대한 방어 시에 결정적인 약한 점막 면역성을 유도하는, 근육내 주사에 의해 침습적으로 투여되고 있다[Gallichan WS, Rosenthal KL. Long-lived cytotoxic T lymphocyte memory in mucosal tissues after mucosal but not systemic immunization. J. Exp. Med. 184, 1879-1890 (1996) and Saurer L, McCullough KC, Summerfield A. In vitro induction of mucosa-type dendritic cells by all-trans retinoic acid. J. Immunol. 179, 3504-3514 (2007)]. 점막 면역의 효과적인 유도는 보통 상주 점막 수지상 세포(DC)가 IgA 전환을 유도하고 림프구 위에 점막 특이적 귀소 수용체(예, CCR9 및 α4β7 인테그린)를 각인함으로 인해 비측 또는 경구 백신접종을 이용한다[Saurer L, McCullough KC, Summerfield A. In vitro induction of mucosa-type dendritic cells by all-trans retinoic acid. J. Immunol. 179, 3504-3514 (2007) and Molenaar R, Greuter M, van der Marel AP et al. Lymph node stromal cells support dendritic cell-induced gut-homing of T cells. J. Immunol. 183, 6395-6402 (2009)].
주사가능한 백신에 의해 유도된 약한 점막 면역 외에도, 백신 투여 기구로서 주사기 바늘은 위기 동안 면허가 있는 의료인에 의한 제한적인 주사 서비스뿐 아니라 부적절한 폐기물 처리, 바늘에 찔리는 상처, 의도적이거나 우연한 비멸균 상태의 재사용을 통해 심각한 문제를 야기한다[Tang DC, Van Kampen KR. Toward the development of vectored vaccines in compliance with evolutionary medicine. Expert Rev. Vaccines 7(4), 399-402 (2008)]. 뾰족한 바늘에 대한 대중의 공포(첨예공포증)는 백신 범위를 방해하는 또 다른 역할을 한다. 따라서, 몇몇 사람들은 전신 백신접종에 의한 고통, 상처 또는 사망을 겪는 곤란에 비해 질병에 걸리는 곤란을 선호할 수 있다. 백신접종 프로그램의 목적은 지역(무리) 면역을 발생시켜 전반적인 감염 확률을 감소시키는 것이므로, 임무는 위험의 대중적인 공포로 인한 백신접종의 지연으로 인해 약화될 것이다. 지금까지, 안전하고, 효능적이며, 고통이 없고 경제적인 신세대 급속 반응 백신을 발전시켜 부정적인 인식을 반전시키는 합법적인 기술이 수면 위로 떠오르고 있다.
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본 발명은 병원체 유래 항원을 암호화하는 아데노바이러스 벡터 또는 돌연변이유전자(transgene)-무함유(free) △E1E3 아데노바이러스 빈(empty) 입자가 비내 투여 시 다양한 질병 환경에 있는 병원체에 대하여 급속-지속적-광범위 방어 반응을 유도해낼 수 있다는 본 발명자들의 우연한 발견을 기반으로 한다.
제한하려는 것은 아니고, 출원인은 아데노바이러스가 호흡기 점막 병원체의 증식을 방해하는 선천 면역의 특정 부문을 활성화시키는데 관여할 수 있다고 가정한다.
본 발명은 E1 및/또는 E3 영역이 결손성이거나 결실된 아데노바이러스를 반응 유도에 효과적인 양으로 환자에게 투여하는 것을 포함할 수 있는, 필요로 하는 환자 중에서 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 양태에 따르면, 환자는 포유동물일 수 있다.
한 양태에 따르면, 아데노바이러스는 돌연변이유전자를 함유하거나 발현하지 않는다.
다른 양태에 따르면, 아데노바이러스는 유전자 산물을 암호화하는 핵산 분자를 함유하고 발현할 수 있다. 특히, 아데노바이러스는 방어 면역을 유도하는 병원체 유래의 유전자 산물을 암호화하는 외인성 또는 이종 핵산 분자를 함유할 수 있다. 외인성 또는 이종 핵산 분자는 당해의 에피토프를 암호화할 수 있다. 특히, 외인성 또는 이종 핵산 분자는 하나 이상의 인플루엔자 바이러스; 호흡기합포체바이러스(RSV); 탄저균(Bacillus anthracis); 또는 다른 당해의 병원체 유래 에피토프 및/또는 하나 이상의 인플루엔자 항원을 암호화할 수 있다.
바람직한 양태에 따르면, 아데노바이러스는 사람 아데노바이러스일 수 있다. 다른 양태에 따르면, 면역 반응은 24시간 내에 유도될 수 있다. 다른 양태에 따르면, 투여는 약 1일 내지 약 47일간 방어 반응을 산출한다.
따라서, 본 발명의 목적은 이전에 공지된 모든 산물, 산물의 제조 방법 또는 산물의 사용 방법을 본 발명에 포함하지 않는 것으로 출원인들이 권리를 보존하도록 하고 여기서 이전에 공지된 모든 산물, 공정 또는 방법의 포기를 밝히는 바이다. 또한, 특히 본 발명은 USPTO(35 U.S.C. §112, 첫 문단) 또는 EPO(EPC의 Article 83)에 적힌 명세서 및 실시가능 요건에 부합하지 않는 임의의 산물, 공정 또는 산물의 제조 또는 산물의 사용 방법을 본 발명의 범위 내에 포함하려는 것이 아닌 것으로, 출원인들이 권리를 보존하도록 하고 여기서 이전에 기술된 모든 산물, 산물의 제조 공정 또는 산물의 사용 방법의 포기를 밝히는 바이다.
본 명세서에서, 특히 특허청구범위 및/또는 문단에서, "함유한다", "함유한", "함유하는" 등과 같은 용어는 미국 특허법에서 규정하는 의미를 가질 수 있음을 주의해야 하고; 예컨대, 이 용어들은 "포함한다", "포함한", "포함하는" 등을 의미할 수 있고; "본질적으로 이루어지는" 및 "본질적으로 이루어진다"와 같은 용어들은 미국 특허법에서 규정하는 의미를 갖는 것으로, 예컨대 분명하게 언급되지 않은 구성요소를 허용하되, 종래 기술에서 발견되거나 또는 본 발명의 기본 특성 또는 신규 특성에 영향을 미치는 구성요소는 배제한다.
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도 1은 아데노바이러스 입자의 비내 투여로, 인플루엔자 바이러스 공격에 대해 나타나는 마우스의 급속 방어를 보여준다.
도 2는 아데노바이러스 입자의 비내 투여로, 탄저병에 대해 나타나는 마우스의 급속 방어를 보여준다.
도 3a 및 도 3b는 마우스에서 A/PR/8/34(PR8)에 의한 치명적 공격에 대한 예방 요법을 도시한 것이다. 예방 요법은 PR8 공격 직전에 Ad5 입자를 비내 투여하여 수행했다. AdE/in/-2 및 AdE*/in/-2, -2일째 AdE의 비내 투여; AdE/in/+1, PR8 공격 1일 후 AdE의 비내 투여; AdE/im/-2, -2일째 AdE의 근육내 주사; AdNC/in/-2 및 AdNC*/in/-2, -2일째 AdNC.H1.1의 비내 투여; AdNC/im/-2, -2일째 AdNC.H1.1의 근육내 주사; 미처리 대조군, PR8 공격 전 처리되지 않은 Balb/c 마우스; 1.7x6106 ifu 용량을 투여한 AdE*/in/-2 및 AdNC*/in/-2 그룹을 제외한 모든 그룹에는 AdE 또는 AdNC.H1.1을 1.7x6106 ifu 용량으로 접종했다; 모든 그룹은 0일째 4xLD50의 PR8을 비내 점적하여 공격했다; 체중은 공격후 18일 동안 매일 기록했고, 30% 체중 감량 시 질병 종점으로 간주했다; 괄호 안의 수는 각 그룹에 속한 동물의 수를 나타낸다.
도 4a 및 도 4b는 더 고 용량의 PR8 공격에 대하여 Ad5-매개의 예방 요법 및 백신접종에 의한 마우스의 방어를 도시한 것이다. AdNC/in/-47, -47일에 AdNC.H1.1의 비내 투여; AdE/in/-47, -47일에 AdE의 비내 투여; AdE/in/-47-2, -47일에 AdE의 비내 투여 후, -2일에 추가 적용; AdE/in/-1, -1일에 AdE의 비내 투여; wtAd/in/-1, -1일에 E1+/E3+ 야생형 Ad5 입자의 비내 투여; 모든 그룹에게는 Ad5 입자를 1.2x108 ifu 용량으로 접종한 다음, 0일째 10xLD50의 PR8로 공격했다; 체중은 공격 후 14일 동안 매일 기록했다; 다른 기호 및 프로토콜은 도 3의 범례에 기술된 것과 같다.
도 5는 체중 감량으로 확인되는 바와 같이 PR8-공격을 받은 동물의 건강 상태를 도시한 것이다. 공격후 체중은 1일째 각 마우스의 체중을 100%로 간주하여 평균 체중%로 나타냈다. 기호 및 공격 프로토콜은 도 3 및 4의 범례에 기술된 것과 같다. AdE/in/-47-2 및 AdNC/in/-47 동물이 다른 그룹의 마우스보다 더 적은 체중을 상실했지만, 그 차이는 통계적 유효성에 이르지 못했다(터키 다중 비교 후검사와 함께 일방향 ANOVA로 검사시; 미처리 대조군은 데이터 점의 조기 종결로 인해 통계 분석에서 배제했다).
도 6a 내지 6h는 PR8 감염에 의해 유도된 폐 조직병리를 도시한 것이다. (a 및 e) PR8 공격 19일 후 미처리 대조군 마우스(도 3)로부터 절제된 폐. (b 및 f) 대조군으로서, 정상 Balb/c 마우스로부터 절제된 폐. (c 및 g) PR8 공격 19일 후 AdE/in/-2 마우스(도 3)로부터 절제된 폐; 각 절편은 3마리 마우스의 대표이다. (d 및 h) PR8 공격 19일 후의 AdNC/in/-2 마우스(도 3)로부터 절제된 폐; 각 절편은 3마리 마우스의 대표이다. 폐 절편은 Axiocam 디지털 카메라와 함께 2X (a-d) 또는 10X (e-h) 대물 렌즈를 사용하여 Zeiss Axioskop2 플러스 현미경으로 조사했다.
도 7은 공격 후 폐의 PR8 역가를 도시한 것이다. AdE 입자(1.2x108 ifu/50ml)는 -2일째 마우스 내에 비내 점적했고, 그 다음 대조군 및 AdE-노출된 마우스를 0일째 4.6x106 pfu의 PR8로 공격했다. 5일, PR8 공격 5일 후 대조용 마우스로부터 절제된 폐의 PR8 역가; AdE-5일, PR8 공격 5일 후 AdE 노출된 마우스로부터 절제된 폐의 PR8 역가; 7일, PR8 공격 7일 후 대조용 마우스로부터 절제된 폐의 PR8 역가; AdE-7일, PR8 공격 7일 후 AdE 노출된 마우스로부터 절제된 폐의 PR8 역가; 삼각형 및 원, 각 마우스의 log2 (PR8 pfu)/폐g; 막대, 폐에 존재하는 PR8 역가의 기하 평균. PR8 역가는 PR8로 공격받지 않은 대조용 마우스로부터 절제된 폐에서는 검출되지 않았다. 7일과 AdE-7일 사이의 차이는 통계적 유의성에 도달했다(일방향 ANOVA와 터키 다중 비교 후검사에 의해).
도 8은 마우스에서 전염성 CA04에 의한 치명적 공격에 대한 방어를 도시한 것이다. AdE 또는 AdNC.H1.1 입자(50㎕당 2.5x108 ifu)는 다양한 시점에 마우스에게 비내 점적한 후 CA04 공격했다. AdE/in/-22, -22일째 AdE의 비내 투여; AdNC/in/-22, -22일째 AdNC.H1.1의 비내 투여; 위약 대조군, -22일째 50㎕ 식염수의 비내 투여; 동물에게 0일째 3xLD50 전염성 CA04의 비내 점적으로 공격했다; 다른 기호와 프로토콜은 도 3의 범례에 기술된 것과 같다.
도 9는 아데노바이러스의 아키텍처를 도시한 것이다. (A) Ad 입자의 구조. Ad는 20면체의 무엔벨로프성 DNA 바이러스이다. 이의 치밀하게 코일화된 DNA 게놈은 6각형 단백질 캡시드 내에 포장되어 있다. (B) △E1E3 Ad5 벡터의 레이아웃. △E1E3 Ad5 벡터는 백신 실험뿐 아니라 다수의 유전자요법에 널리 사용되고 있다. 이의 높은 면역원성은 재투여의 장애로 생각되었다; 하지만, 이 문제는 최근 △E1E3 Ad5-벡터화된 비측 백신이 기존 Ad5 면역성을 우회할 수 있음을 입증하는 증거에 의해 경감되었다. Ad: 아데노바이러스; LITR: 좌측 전도된 말단 반복체; 프로모터: 돌연변이유전자 발현을 유도하는 일반적인 프로모터는 사이토메갈로바이러스 조기 프로모터이다; PolyA+: 일반적인 폴리아데닐화 부위는 SV40 폴리아데닐화 시그널이다; RITR: 우측 전도된 말단 반복체.
도 10은 생체공학적으로 처리된 비복제성 아데노바이러스 벡터의 계통도이다. 사람 및 동물의 Ad는 모두 동물 및 사람 피검체에 외인성 유전자를 전달하기 위한 다양한 비복제성 Ad 벡터에 생체공학적으로 처리되었다. Ad: 아데노바이러스.
도 11은 Ad5-벡터화된 약물-백신 듀오의 비내 투여에 의해 부여된 끊임없는 방어를 도시한 것이다. AdE(돌연변이유전자가 없는 빈 △E1E3 Ad5 입자) 또는 AdNC.H1.1(A/New Caledonia/20/99 HA1 도메인을 암호화하는 △E1E3 Ad5 벡터)의 비내 점적이 생 인플루엔자 바이러스 공격에 대하여 마우스의 거의 즉각적인 방어를 부여할 수 있다는 것이 최근 입증되었다[Zhang et al. PLoS ONE 6, e22605(2011)]. AdE 유도된 예방 요법은 적어도 22일 동안 마우스에서 지속되었고 효능의 부분 감소는 AdE 투여 47일 후에 관찰되었다. AdNC.H1.1-유도된 방어는 47일 후 연속적이었다. 실선: 연속 방어의 시간프레임; 대시선: 부분 방어의 시간프레임. AdE 유도된 완전 방어는 22일 동안 관찰된 반면, 부분 방어는 투여후 47일째 관찰되었기 때문에, 실선 이후 대시선에 의해 확인되듯이 DVD의 약물 효과는 22일 후 감소하기 시작한 것으로 추정되었다. Ad5 입자가 0일째 접종되었을 때 DVD의 백신 효과가 14일째 시작되는 실선으로 확인되는 바와 같이, Ad5-벡터화된 백신은 면역화후 2주 정도의 초기에 방어 면역을 유도해낼 수 있는 것으로 보고되었다[Boyer et al. Hum. Gene Ther. 16, 157-168(2005)]. 결과는 인플루엔자에 대한 중단 없는 방어가, 방어 면역이 약물 효과가 감소하기 전에 백신에 의해 유도될 수 있기 때문에, Ad5-벡터화된 DVD의 비내 투여에 의해 마우스에서 달성될 수 있다는 것을 보여준다. Ad: 아데노바이러스; DVD: 약물-백신 듀오.
도 12는 Ad5-벡터화된 비측 백신이 A/VN/1203/04(H5N1) 조류 인플루엔자 바이러스에 대하여 마우스를 방어했음을 도시한 것이다. 마우스는 0일째 비내 면역화되었고, 63일째 SRI에서 10XMLD50(104.4 EID50) 용량의 A/VN/1203/04(H5N1)로 공격을 받았다. HA, HA1+HA2를 암호화하는 Ad; HA1, HA1을 암호화하는 Ad; E7, 107 vp; E10, 1010 vp; HI, 49일째 혈청 HI 역가의 GMT.
도 13은 A/VN/1203/04(H5N1) 조류 인플루엔자 바이러스에 대하여 Ad5-벡터화된 비측 백신이 페럿(ferret)을 방어했음을 도시한 것이다. 페럿은 0일째 비내 면역화되고; 56일째 SRI에서 10 FLD50(102 EID50) 용량의 A/VN/1203/04로 공격을 받았다. HA, HA1+HA2를 암호화하는 Ad; HA1, HA1을 암호화하는 Ad; E10, 1010 vp; HI, 51일째 혈청 HI 역가의 GMT.
도 14는 포자 공격 직전에 아데노바이러스 입자의 비내 점적에 의한 예방적 탄저병 요법을 도시한 것이다. AdVAV/-2, 1.3X108 ifu 용량으로 공격 2일 전에 비내 점적된 AdVAV 입자; AdE/-2, 1.3X108 ifu 용량으로 공격 2일 전에 비내 점적된 AdE 입자; AdE*/-2, 1.3X106 ifu 용량(PBS 중의 100배 희석물)으로 공격 2일 전에 비내 점적된 AdE 입자; AdE/-1, 1.3X108 ifu 용량으로 공격하기 1일 전에 비내 점적된 AdE 입자; 대조군, 미처리된 대조용 마우스; 괄호 안의 수는 각 그룹에 속한 동물의 수를 나타낸다.
도 15는 AdVAV 입자의 비내 점적에 의한 노출후 탄저병 치료법을 도시한 것이다. AdVAV/D-2, 1.3X108 ifu 용량의 공격 2일 전에 비내 점적된 AdVAV 입자; AdVAV/D0, 1.3X108 ifu 용량으로 공격 1시간 후 비내 점적된 AdVAV 입자; AdVAV/Cipro/D0, 시프로플록사신(ciporfloxacin)의 복강내 주사와 함께 1.3X108 ifu 용량으로 공격 1시간 후 비내 점적된 AdVAV 입자; Cipro/D0, 시프로플록사신의 복강내 주사; 대조군, 공격 전에 처리되지 않은 미처리 대조용 마우스; 괄호 안의 수는 각 그룹에 속한 동물의 수를 나타낸다.
도 16은 RSV-Tracy 비측 세척물뿐 아니라 폐 삼출액 바이러스 역가에 있어서 +4일째 확인되는 비내 투여된 AdE의 효과를 도시한 것이다: 그룹 1: 부형제(A195 완충액)로 예방적으로(-2일) 비내 처리된 6 CR, 그룹 2: AdE 2.4x108 ifu로 예방적으로(-30일) 비내 처리된 6 CR, 그룹 3: AdE 2.4x108 ifu로 예방적으로(-2일) 비내 처리된 6 CR, 그룹 4: 각 처리 사이클(초기/추가) 동안 AdE 2.4x108 ifu로 예방적으로(-30일 및 -2일) 비내 처리된 6 CR 및 그룹 5: AdE 2.4x108 ifu로 예방적으로(-5h) 비내 처리된 6 CR.
본 발명은 부분적으로 빈 Ad 벡터(삽입체 없이 결실된 E1/E3)를 투여한 후 1일 만큼 급속하게 마우스가 독감 공격으로부터 방어된다는 본 발명자들의 발견을 기반으로 한다. 이 방어에 대한 기전은 현재 알려지지 않았지만, 매우 광범한 방어이다. 마우스는 계절 독감 공격, 돼지 독감 공격, 조류 독감 공격, RSV 공격 및 심지어 탄저병 공격으로부터 방어되었다. 이 방어는 약 1일부터 약 47일간 지속된다. 야생형 Ad 대조군은 어떠한 방어도 제공하지 못했고 근육내로 투여된 백신도 어떠한 방어도 제공하지 못했다. E1 영역에 유전자가 삽입되었을 때에도 방어가 나타났지만, 유전자가 독감 HA 유전자일 때는 약간의 방해가 있었지만, 흥미롭게도 유전자가 탄저병 방어 항원 유전자인 경우에는 방어가 증강되는 것으로 나타났다. 마우스 외에도, 코튼 래트(cotton rat)는 공격 2일전 또는 30일전에 AdE 입자를 비내 투여받은 후 RSV 공격에 대해 방어되었다.
아데노바이러스 재조합체를 이용하는 본 발명의 양태들은 E1 결손성, E3 결손성 및/또는 E4 결손성 아데노바이러스 벡터를 포함할 수 있다. E1 돌연변이는 E1 결손성 아데노바이러스 돌연변이체가 비-증식허용 세포에서 복제 불능성이기 때문에 벡터의 안전성 보장여지를 상승시킨다. E3 돌연변이는 아데노바이러스가 MHC 클래스 I 분자를 억제조절하는 기전을 방해하여 항원의 면역원성을 증강시킨다. E4 돌연변이는 후기 유전자 발현을 억제하여 아데노바이러스 벡터의 면역원성을 감소시킨다. RGD 모티프와 같은 특정 서열 모티프는 감염성을 증강시키기 위해 아데노바이러스 벡터의 H-I 루프 내로 삽입될 수 있다. 아데노바이러스 재조합체는 전술한 바와 같은 임의의 아데노바이러스 벡터에 특정 돌연변이유전자 또는 돌연변이유전자의 단편을 클로닝하여 작제한다.
돌연변이유전자-무함유 △E1E3 Ad5 빈 입자의 생성은 문헌[Tang DC, Zhang J, Toro H, Shi Z, Van Kampen KR(2009) Adenovirus as a carrier for the development of influenza virus-free avian influenza vaccines. Expert Rev Vaccines 8: 469-481]에 기술된 바와 같이 수행할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "바이러스 벡터"란 용어는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 알파바이러스 및 헤르페스 단순 바이러스를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.
아데노바이러스는 임의의 아데노바이러스, 예컨대 비제한적으로 소 아데노바이러스, 개 아데노바이러스, 사람을 제외한 영장류 아데노바이러스, 병아리 아데노바이러스 또는 돼지(porcine) 또는 돈형(swine) 아데노바이러스일 수 있다.
본원에 사용된 "사람 아데노바이러스"란 용어는 마스타아데노바이러스 속의 멤버들을 포함하는, 아데노비리데 과의 모든 사람 아데노바이러스를 포괄하는 것이다. 지금까지, 51가지가 넘는 사람 혈청형의 아데노바이러스가 동정되었다(예컨대, Fields et al., Virology 2, Ch. 67 (3d ed., Lippincott-Raven Publishers) 참조). 이 아데노바이러스들은 혈청군 A, B, C, D, E 또는 F일 수 있다. 사람 아데노바이러스는 혈청형 1(Ad1), 혈청형 2(Ad2), 혈청형 3(Ad3), 혈청형 4(Ad4), 혈청형 6(Ad6), 혈청형 7(Ad7), 혈청형 8(Ad8), 혈청형 9(Ad9), 혈청형 10(Ad10), 혈청형 11(Ad11), 혈청형 12(Ad12), 혈청형 13(Ad13), 혈청형 14(Ad14), 혈청형 15(Ad15), 혈청형 16(Ad16), 혈청형 17(Ad17), 혈청형 18(Ad18), 혈청형 19(Ad19), 혈청형 19a(Ad19a), 혈청형 19p(Ad19p), 혈청형 20(Ad20), 혈청형 21(Ad21), 혈청형 22(Ad22), 혈청형 23(Ad23), 혈청형 24(Ad24), 혈청형 25(Ad25), 혈청형 26(Ad26), 혈청형 27(Ad27), 혈청형 28(Ad28), 혈청형 29(Ad29), 혈청형 30(Ad30), 혈청형 31(Ad31), 혈청형 32(Ad32), 혈청형 33(Ad33), 혈청형 34(Ad34), 혈청형 35(Ad35), 혈청형 36(Ad36), 혈청형 37(Ad37), 혈청형 38(Ad38), 혈청형 39(Ad39), 혈청형 40(Ad40), 혈청형 41(Ad41), 혈청형 42(Ad42), 혈청형 43(Ad43), 혈청형 44(Ad44), 혈청형 45(Ad45), 혈청형 46(Ad46), 혈청형 47(Ad47), 혈청형 48(Ad48), 혈청형 49(Ad49), 혈청형 50(Ad50), 혈청형 51(Ad51) 또는 바람직하게는 혈청형 5(Ad5)일 수 있으나, 이 예들에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 1보다 많은 아데노바이러스 혈청형 유래의 서브바이러스 입자를 함유할 수 있는 재조합 아데노바이러스, 약물-백신 조성물, 재조합 벡터 및 수용체-결합 리간드도 포함한다. 예를 들어, 아데노바이러스 벡터는 특정 조직 또는 세포 종류에 대해 변경된 향성(tropism)을 나타낼 수 있고(Havenga, M.J.E. et al., 2002), 이에 따라 다양한 아데노바이러스 혈청형 유래의 다른 아데노바이러스 캡시드, 즉 섬유 또는 펜톤 단백질의 혼합 및 매칭(matching)이 유익할 수 있다. 섬유 및 펜톤을 비롯한 아데노바이러스 캡시드의 변형은 미변형 아데노바이러스와 다른 향성을 가진 아데노바이러스 벡터를 초래할 수 있다. 변형되어 표적 세포를 감염시키는 능력이 최적화된 아데노바이러스 벡터는 치료 용량 또는 예방 용량의 유의적인 감소를 가능하게 할 수 있고, 그 결과 국소적이고 산재성인 독성을 감소시킨다.
바이러스 벡터 유전자 전달 시스템은 유전자전달 및 유전자요법 분야에 일반적으로 사용된다. 다른 바이러스 벡터계는 자기 고유의 장점과 단점이 있다. 본 발명의 병원체 유래의 리간드를 발현하는데 사용될 수 있는 바이러스 벡터는 이하에 더 상세하게 설명되는, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 헤르페스 단순 바이러스 벡터, 및 레트로바이러스 벡터를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
아데노바이러스 벡터는 유전자 전달, 특히 기도로의 전달에 이상적인 많은 특성을 갖고 있다. 이러한 특성의 예로는 다음을 포함한다:
(a) 동일계에서 유사분열기 세포 및 유사분열후 세포를 형질도입시키는 아데노바이러스 벡터의 능력;
(b) 세포를 동일계에서 높은 감염다중도(MOI)로 변환시키는 고 역가의 바이러스[1012 ifu(감염 단위)/ml 초과]를 함유하는 스톡(stock)을 제조하는 기존 기술;
(c) 아데노바이러스의 흡입은 진화 의학에 따른다(Tand and Van Kampen, 2008);
(d) 비내 투여된 아데노바이러스 벡터의 효능은 아데노바이러스에 대한 기존 면역성에 의해 방해될 수 없다(Hoelscher et al., 2006; Shi et al., 2001; Van Kampen et al., 2005); 이것은 이론적으로 국한하려는 것은 아니지만, 높은 효율의 유전자전달, 돌연변이유전자의 높은 발현 수준, 및 기도의 점막 장벽을 따라 높은 항원제시(antigen presentation) 정도 때문일 수 있다;
(e) 돌연변이유전자의 높은 발현 수준(적어도 초기 방출량으로서)을 유도하는 아데노바이러스의 능력; 및
(f) 복제-결손성 아데노바이러스 벡터가 생체공학적으로 처리될 수 있는 용이성.
아데노바이러스의 다른 일반적 특징은 아데노바이러스의 생물학이 상세하게 특성화되어 있다는 점; 아데노바이러스가 사람의 중증 병리상태에 관여하지 않는다는 점; 아데노바이러스가 숙주 세포에 자신의 DNA를 도입시키는데 매우 효과적이라는 점; 아데노바이러스가 매우 다양한 세포를 감염시킬 수 있고 숙주 범위가 광범하다는 점; 아데노바이러스가 비교적 용이하게 다량으로 생산될 수 있다는 점; 아데노바이러스가 바이러스 게놈의 초기 영역 1("E1")의 결실에 의해 비복제성 및/또는 복제 결손성이 될 수 있다는 점이다.
발현된 유전자 산물, 항체 및 이의 용도, 외인성 핵산 분자를 생체내 및 시험관내 발현하기 위한 벡터, 발현 유도를 위한 또는 발현될 핵산 분자에 작동적으로 결합하기 위한 프로모터, 이러한 벡터를 생산하기 위한 방법 및 문헌, 이러한 벡터 또는 핵산 분자 또는 항체를 함유하는 조성물, 투약량 및 투여 방식 및/또는 경로(비측 투여를 위한 조성물을 포함해서)에 대한 정보, 특히 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 상기한 것들에 대한 정보는 미국 특허 5,990,091[(1999.11.23 특허 허여됨), Einat et al. 또는 Quark Biotech, Inc.], WO 99/60164(1999.11.25 공개)[PCT/US99/11066(1999.5.14 출원) 유래, Fischer or Rhone Merieux, Inc.], WO98/00166(1998.1.8 공개) [PCT/US97/11486(1997.6.30 출원) (미국 출원 일련번호 08/675,556 및 08/675,566을 우선권으로 주장)], van Ginkel et al., J. Immunol 159(2):685-93 (1997) ("Adenoviral gene delivery elicits distinct pulmonary-associated T helper cell responses to the vector and to its transgene"), 및 Osterhaus et al., Immunobiology 184(2-3): 180-92 (1992)("Vaccination against acute respiratory virus infections and measles in man")를 참조하며; 따라서, 미국 특허 5,990,091[(1999.11.23 특허 허여됨), Einat et al. 또는 Quark Biotech, Inc.], WO 99/60164(1999.11.25 공개)[PCT/US99/11066(1999.5.14 출원) 유래, Fischer or Rhone Merieux, Inc.], WO98/00166(1998.1.8 공개) [PCT/US97/11486(1997.6.30 출원) (미국 출원 일련번호 08/675,556 및 08/675,566을 우선권으로 주장)], van Ginkel et al., J. Immunol 159(2):685-93 (1997) ("Adenoviral gene delivery elicits distinct pulmonary-associated T helper cell responses to the vector and to its transgene"), 및 Osterhaus et al., Immunobiology 184(2-3): 180-92 (1992)("Vaccination against acute respiratory virus infections and measles in man") 및 여기에 인용되거나 참조된 모든 문서 및 미국 5,990,091[(1999.11.23 특허 허여됨), Einat et al. 또는 Quark Biotech, Inc.], WO 99/60164(1999.11.25 공개)[PCT/US99/11066(1999.5.14 출원) 유래, Fischer or Rhone Merieux, Inc.], WO98/00166(1998.1.8 공개) [PCT/US97/11486(1997.6.30 출원) (미국 출원 일련번호 08/675,556 및 08/675,566을 우선권으로 주장)], van Ginkel et al., J. Immunol 159(2):685-93 (1997) ("Adenoviral gene delivery elicits distinct pulmonary-associated T helper cell responses to the vector and to its transgene"), 및 Osterhaus et al., Immunobiology 184(2-3): 180-92 (1992)("Vaccination against acute respiratory virus infections and measles in man") 각각에 인용된 문서에 인용되거나 참조된 모든 문서는 본원에 참고 인용된다. 1999년 11월 23일에 특허 허여된 미국 특허 5,990,091, WO 99/60164, WO 98/00166, van Ginkel et al., J. Immunol 159(2):685-93 (1997), 및 Osterhaus et al., Immunobiology 184(2-3): 180-92 (1992)의 정보는 본 발명의 실시에 필요할 수 있다(예컨대, 특히 발현 산물, 항체 및 이의 용도, 외인성 핵산 분자의 생체내 및 시험관내 발현을 위한 벡터, 당해의 에피토프를 암호화하는 외인성 핵산 분자 또는 항원 또는 치료제 등, 프로모터, 이러한 벡터 또는 핵산 분자 또는 발현된 산물 또는 항체를 함유하는 조성물, 투약량).
본 발명에 따라 수득된 면역학적 산물 및/또는 항체 및/또는 발현된 산물은 시험관내에서 발현될 수 있고 이러한 면역학적 및/또는 발현된 산물 및/또는 항체가 일반적으로 사용되는 방식으로 사용되며, 이러한 면역학적 및/또는 발현된 산물 및/또는 항체를 발현하는 세포가 시험관내 및/또는 생체외 이용분야에 이용될 수 있음을 주목해야 하며, 예컨대 이러한 용도 및 이용분야로는 진단, 분석, 생체외 요법(예, 유전자 산물 및/또는 면역학적 반응을 발현하는 세포는 시험관내에서 팽창되고 숙주 또는 동물 내로 재도입된다) 등을 포함할 수 있고, 미국 특허 5,990,091, WO 99/60164 및 WO 98/00166 및 여기에 인용된 문헌을 참조한다.
또한, 본원의 방법으로부터 분리되거나 또는 본원의 투여 방법 후 시험관내에서 팽창된 세포로부터 분리된 발현된 항체 또는 유전자 산물은, 면역을 유도하고, 치료 반응을 자극하고 및/또는 수동 면역을 자극하는 서브유닛 에피토프 또는 항원 또는 치료제 또는 항체의 투여와 유사한 조성물로 투여할 수 있다. 투여되는 양은 환자(숙주) 및 치료받는 상태에 따라 달라질 것이고 1 마이크로그램 또는 수 마이크로그램부터 수백 또는 수천 마이크로그램, 예컨대 1㎍ 내지 1mg, 약 100ng/체중kg 내지 100mg/체중kg/이로 달라질 것이며, 바람직하게는 10pg/kg 내지 10mg/kg/일 범위일 것이다.
벡터는 환자 또는 숙주에게 유전자산물(예, 에피토프, 항원, 치료제 및/또는 항체) 조성물에서 언급한 양을 달성하기 위한 양으로 투여할 수 있다. 물론, 본 발명은 본원에 예시된 양보다 적거나 많은 투약량도 사용될 수 있을 것으로 예상하며, 동물 또는 사람에게 투여되는 모든 조성물, 예컨대 이의 성분들에 대해, 그리고 모든 특정 투여 방법에 대해 다음을 측정하는 것이 바람직하다: 독성, 예컨대 적당한 동물 모델, 예컨대 마우스와 같은 설치류에서 치사량(LD) 및 LD50을 측정하여; 적당한 반응을 유도해내는 조성물(들)의 투약량, 이 조성물 내 성분들의 농도 및 조성물(들)의 투여 시기, 예컨대 혈청의 적정 및 이의 분석, 예컨대 ELISA 및/또는 혈청중화 분석을 통해. 이러한 측정들은 당업자의 지식, 당해 명세서 및 본원에 인용된 문헌들로부터 과도한 실험을 요하지 않는다. 또한, 본 발명은 본 발명의 조성물의 연속 투여, 또는 본원의 방법의 연속 수행, 예컨대 증상의 치료법(therapy) 또는 처리(treatment) 및/또는 면역학적 조성물의 추가 투여 및/또는 초회감작-추가투여 치료요법 과정에서와 같은 본 발명의 조성물의 주기적 투여와 같은 본 발명의 조성물의 연속 투여 또는 본원의 방법의 연속 수행을 포함하며; 연속 투여의 시간 및 방식은 과도한 실험 없이도 확인될 수 있다.
본 발명의 아데노바이러스의 투약량은 약 106 ifu 내지 약 1010 ifu 범위일 수 있다. 이 투약량은 약 106 ifu, 약 107 ifu, 약 108 ifu, 약 109 ifu 또는 약 1010 ifu일 수 있다. 유익한 양태에 따르면, 투약량은 약 106 ifu, 약 107 ifu 또는 약 108 ifu이다.
특히 유익한 양태에 따르면, 본 발명의 아데노바이러스는 다회 투약량으로 투여된다. 특히 유익한 양태에 따르면, 약 2회 용량으로 투여된다. 유익한 양태에 따르면, 용량은 약 20일 간격, 약 25일 간격, 약 30일 간격, 약 35일 간격, 약 40일 간격, 약 45일 간격, 약 50일 간격, 약 55일 간격, 약 60일 간격 또는 약 65일 간격으로 투여된다. 유익하게는, 용량은 약 40일 간격, 약 41일 간격, 약 42일 간격, 약 43일 간격, 약 44일 간격, 약 45일 간격, 약 46일 간격, 약 47일 간격, 약 48일 간격, 약 49일 간격 또는 약 50일 간격으로 투여된다.
또한, 본 발명은 벡터를 제조 및 사용하는 조성물 및 방법, 예컨대 생체내 및/또는 시험관내 및/또는 생체외에서 유전자산물 및/또는 면역학적 산물 및/또는 항체를 생산하는 방법(예컨대, 시험관내 및 생체외는 예컨대 본 발명에 따라 비침습성 투여가 이루어진 숙주 유래의 세포로부터 분리한 후, 예컨대 이러한 세포의 임의적 팽창 후), 및 이러한 유전자 및/또는 면역학적 산물 및/또는 항체의 용도, 예컨대 진단학, 분석법, 치료법, 처리 등에 사용되는 용도를 포함한다. 벡터 조성물은 벡터를 적당한 운반체 또는 희석제와 혼합하여 조제하고; 유전자 산물 및/또는 면역학적 산물 및/또는 항체 조성물도 마찬가지로 유전자 및/또는 면역학적 산물 및/또는 항체를 적당한 운반체 또는 희석제와 혼합하여 조제한다: 예컨대, 미국 특허 5,990,091, WO 99/60164, WO 98/00166, 여기에 인용된 문헌, 및 여기에 인용된 여타 문헌, 및 여기에 기술된 다른 교시(예컨대, 운반체, 희석제 등에 관한 것)를 참조한다.
유익한 양태에 따르면, 벡터는 인플루엔자 항원, RSV 항원, HIV 항원, SIV 항원, HPV 항원, HCV 항원, HBV 항원, CMV 항원 또는 스타필로코커스 항원을 암호화하는 유전자를 발현한다. 인플루엔자는 돼지 인플루엔자, 계절 인플루엔자, 조류 인플루엔자, H1N1 인플루엔자 또는 H5N1 인플루엔자일 수 있다.
다른 유익한 양태에 따르면, 벡터는 인플루엔자 헤마글루티닌, 인플루엔자 핵 단백질, 인플루엔자 M2, 파상풍 독소 C 단편, 탄저병 방어 항원, 탄저병 치사 인자, 광견병 당단백질, HBV 표면 항원, HIV gp120, HW gp160, 사람 암태아성 항원, 말라리아 CSP, 말라리아 SSP, 말라리아 MSP, 말라리아 pfg, 결핵균 HSP 또는 이의 돌연변이체를 암호화하는 유전자를 발현한다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 동물의 면역 반응은 동물의 세포에서 당해의 항원을 암호화하는 유전자를 발현하는 유전자 벡터에 의해 유도된다. 당해의 항원은 본원에 기술된 임의의 항원 중에서 선택될 수 있다.
방법의 다른 양태에 따르면, 동물 세포는 표피 세포이다. 방법의 다른 양태에 따르면, 면역 반응은 병원체 또는 신생물에 대항한 반응이다. 방법의 다른 양태에 따르면, 유전자 벡터는 예방 백신 또는 치료 백신으로서 사용된다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 유전자 벡터는 동물 세포에서 당해의 항원을 발현할 수 있는 유전자 벡터를 포함한다. 방법의 추가 양태에 따르면, 동물은 척추동물이다.
벡터(예컨대, 당해의 에피토프 및/또는 항원 및/또는 치료제를 암호화하는)에서 발현되는 외인성 DNA 및 이러한 외인성 DNA를 제공하는 문헌과 관련해서, 뿐만 아니라 핵산 분자의 발현을 증강시키기 위한 전사 및/또는 해독 인자의 발현과 관련해서 및 "당해의 에피토프", "치료제", "면역반응", "면역학적 반응", "방어 면역 반응". "면역학적 조성물", "면역원성 조성물, 및 "백신 조성물"과 같은 용어와 관련해서, 특히 미국 특허 5,990,091(1999.11.23. 특허 허여됨), 및 WO 98/00166 및 WO 99/60164 및 여기에 참고 인용된 전부가 참고된다. 따라서, 미국 특허 5,990,091 및 WO 98/00166과 WO 99/60164 및 여기에 인용된 문헌 및 이 특허와 이들의 PCT 출원의 진행 중에 기록된 문헌들, 및 여기에 인용되거나, 그렇지 않다면 여기에 참고 인용된 여타 문헌들은 본 발명의 실시에서 참고될 수 있고; 여기에 인용된 모든 외인성 핵산 분자, 프로모터 및 벡터는 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 또한 미국 특허 6,004,777, 5,997,878, 5,989,561, 5,976,552, 5,972,597, 5,858,368, 5,863,542, 5,833,975, 5,863,542, 5,843,456, 5,766,598, 5,766,597, 5,762,939, 5,756,102, 5,756,101, 5,494,807도 참조한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 동물은 유익하게는 척추동물, 예컨대 포유류, 조류, 파충류, 양서류 또는 어류; 더 유익하게는 사람, 또는 동반 동물 또는 길든 동물 또는 식품 생산용 또는 사료 생산용 동물 또는 가축 또는 게임이나 레이싱 또는 스포츠용 동물, 예컨대 소, 개, 고양이, 염소, 양 또는 돼지 또는 말, 또는 심지어 칠면조, 오리 또는 병아리와 같은 가금류이다. 특히 유익한 본 발명의 다른 양태에 따르면, 척추동물은 사람이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 유전자 벡터는 바이러스 벡터, 박테리아 벡터, 원생동물 벡터, 레트로트랜스포존(retrotransposon), 트랜스포존, 바이러스 외피(shell) 또는 DNA 벡터이다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 바이러스 벡터, 박테리아 벡터, 원생동물 벡터 및 DNA 벡터는 재조합 벡터이다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 면역 반응은 인플루엔자 A에 대항한 반응이다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 인플루엔자 A에 대항한 면역 반응은 인플루엔자 헤마글루티닌, 인플루엔자 핵 단백질, 인플루엔자 M2 또는 이의 단편을 암호화하는 유전자를 발현하는 유전자 벡터에 의해 동물 세포에서 유도된다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 유전자 벡터는 바이러스 벡터 및 플라스미드 DNA로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 유전자 벡터는 아데노바이러스이다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 아데노바이러스 벡터는 E1 영역이 결손성이다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 아데노바이러스 벡터는 E3 영역이 결손성이다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 아데노바이러스 벡터는 E1 및/또는 E3 영역이 결손성이다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, DNA는 플라스미드 형태이다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 접촉 단계는 추가로 당해의 유전자를 함유하는 유전자 벡터를 전달 기구에 배치하는 단계 및 당해의 유전자를 함유하는 유전자 벡터를 담고 있는 기구를 동물의 피부에 적용하는 단계를 포함한다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 유전자 벡터는 면역조절 유전자, 보조자극 유전자, 또는 사이토킨 유전자를 암호화한다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 벡터는 모든 바이러스 유전자가 결실된 것이다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 유전자 벡터는 종양유전자, 종양-억제인자 유전자 또는 종양-관련 유전자를 발현한다.
본 발명의 방법을 사용하여 면역 반응을 생산하는데 사용될 수 있는 항원의 대표적인 예로는 인플루엔자 헤마글루티닌, 인플루엔자 핵 단백질, 인플루엔자 M2, 파상풍 독소 C-단편, 탄저병 방어 항원, 탄저병 치사 인자, 광견병 당단백질, HBV 표면 항원, HIV gp 120, HIV gp 160, 사람 암태아성 항원, 말라리아 CSP, 말라리아 SSP, 말라리아 MSP, 말라리아 pfg, 및 결핵균 HSP 등을 포함한다. 가장 바람직하게는, 면역 반응은 신생물 또는 감염성 병원체에 대한 방어 효과를 생산한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 벡터는 추가로 보조자극 유전자 및 사이토킨 유전자로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 유전자를 함유한다. 이 방법에서, 유전자는 GM-CSF 유전자, B7-1 유전자, B7-2 유전자, 인터루킨-2 유전자, 인터루킨-12 유전자 및 인터페론 유전자로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
본 발명의 재조합 벡터 및 방법은 다양한 호흡기 병원체의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다. 이러한 병원체로는 인플루엔자 바이러스, 중증 급성 호흡기 증후군-관련 코로나바이러스(SARS-CoV), 사람 리노바이러스(HRV) 및 호흡기 합포체 바이러스(RSV)를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 인플루엔자 균주 및/또는 혼성체에 대한 면역원성 반응을 자극하거나 조절하는 다가 백신 또는 면역원성 조성물을 제공하기 위해 별도의 재조합 벡터 또는 함께 하나의 재조합 벡터로 전달되는, 본원에 개시된 벡터 및 방법에 사용되는 치료 리간드, 면역원 또는 항원 그 이상의 용도를 포함한다. 또한, 본 발명은 별도의 재조합 벡터 또는 함께 하나의 재조합 벡터로 전달되는, 본원에 개시된 벡터 및 방법에 사용되는 하나 이상의 병원체 유래의 치료 리간드, 면역원 또는 항원의 용도도 포함한다.
DNA/아데노바이러스 복합체를 사용하는 본 발명의 양태는 PEI(폴리에틸렌이민) 또는 폴리리신과 같은 적당한 제제를 이용하여 아데노바이러스 벡터와 복합체화된 플라스미드 DNA를 보유할 수 있다. 복합체 내의 아데노바이러스 벡터는 "생" 벡터이거나 또는 UV 조사에 의한 "사멸" 벡터일 수 있다. DNA 매개의 형질감염을 촉진하기 위한 엔도조모라이시스제(endosomolysis agent) 및 수용체-결합 리간드로서의 UV-불활성화된 아데노바이러스 벡터(Cotten et al., 1992)는 백신 운반체의 안전성 여지를 상승시킬 수 있다. DNA/아데노바이러스 복합체는 면역화제로서 사용하기 위해 비침습적 방식으로 척추동물의 표피 세포를 형질감염시키는데 사용된다.
또한, 본 발명에 의해 제공된 유전자 벡터는 체액 및 세포 면역 반응을 자극하는 보강제로서 작용할 수 있는 면역조절 분자를 암호화할 수 있다. 이러한 분자에는 사이토킨, 보조자극 분자 또는 면역반응 과정을 변화시킬 수 있는 임의의 분자가 포함된다. 따라서, 항원의 면역원성을 더욱 더 증강시키기 위해 이 기술이 변형될 수 있는 방식을 생각해낼 수 있다.
본원에 사용된 용어에 따르면, 면역학적 유효량은 동물에게 투여했을 때 당해 유전자 산물에 대한 면역반응을 생성하는 당해의 유전자를 암호화하는 유전자 벡터의 양 또는 농도이다.
다양한 에피토프, 항원 또는 치료제는 다른 농도로 발현되어 국소적으로 전달될 수 있다. 일반적으로, 아데노바이러스 벡터의 유용한 양은 적어도 약 100pfu이고 플라스미드 DNA의 경우에는 적어도 약 1ng의 DNA이다. 다른 양은 본 명세서와 당해 기술 분야의 이해, 예컨대 인용된 문헌 및 본원에 참고 인용된 문헌으로부터 과도한 실험 없이 확인될 수 있다.
본 발명의 방법은 예방 백신접종으로 질병을 예방하거나 치료 백신접종으로 질병을 치료하기 위해 적절하게 적용할 수 있다.
본 발명의 백신은 단독으로 또는 면역학적 조성물의 일부분으로서 동물에게 투여될 수 있다.
기술된 사람 백신 외에, 본 발명의 방법은 동물 가축을 면역화시키는데 사용될 수 있다. 동물이란 용어는 사람을 비롯한 모든 동물을 의미한다. 동물의 예로는 사람, 소, 개, 고양이, 염소, 양, 말, 돼지, 칠면조, 오리 및 병아리 등을 포함한다. 모든 척추동물의 면역계는 유사하게 작동하기 때문에 기술된 적용예는 모든 척추동물계에 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은 벡터의 배합물, 특히 아데노바이러스 벡터의 배합물도 포함한다. 예를 들어, 빈 아데노벡터(삽입체 없이 E1/E3 결실된 것)는 이를 필요로 하는 환자에게 본원에 기술된 바와 같은 외인성 유전자와 같은 삽입체가 있고 E1/E3 결실될 수 있는 아데노벡터와 같은 다른 벡터와 함께 연속해서 또는 동시에 투여될 수 있다. 이론적으로 제한됨이 없이, 빈 아데노벡터(삽입체 없이 E1/E3 결실된 것)는 급속 면역 반응을 초기에 유도해낼 수 있고, 항원 또는 에피토프와 같은 외인성 유전자를 발현하는 벡터가 추가 방어 반응을 유도낼 수 있다.
본 발명 및 이의 장점은 상세하게 설명되었지만, 후속되는 특허청구범위에 정의된 바와 같은 본 발명의 취지와 영역으로부터 벗어남이 없이 여기에 다양한 변화, 치환 및 변경이 이루어질 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명은 예시적으로만 제공되고 어떠한 방식으로든지 본 발명을 제한하려는 것이 아닌 다음과 같은 실시예에 더 상세하게 설명될 것이다.
실시예
실시예 1: 호흡기 병원체에 대한 광범위 약물로서의 아데노바이러스 입자
백신접종은 미리 수주 또는 수개월 전에 투여했을 때 감염성 질환을 예방하기에 효과적인 시도지만, 즉각적인 위험에 처한 사람 또는 동물을 방어하기에는 너무 느리다. 감염 직전 또는 감염 직후에 처치되었을 때 감염의 중증도를 감소시킬 수 있는 제제는 공중보건에 있어서 가장 중요하다. 타미플루(오셀타미비르 포스페이트(oseltamivir phospahte)) 및 렐렌자(자나미비르(zanamivir))는 인플루엔자 바이러스 감염을 예방하는데 있어서 효과적인 것으로 입증되었다; 하지만, 이러한 뉴라미니다제(neuraminidase) 억제제는 시간이 경과함에 따라 약물내성 인플루엔자 바이러스 균주를 발생시킬 수 있다(Poland et al., 2009). 바이러스와 마찬가지로, 약물내성균도 역시 약물 과용에 의해 일반적으로 발생된다(Davies and Davies, 2010). 따라서, 사용 중인 한 약물이 약물내성에 의해 손상된 경우, 의료진은 병원체를 저지하기 위한 개발 중인 다른 약물을 사용할 방안을 택할 것이기 때문에 추가 약물을 개발하는 것이 시급하다.
출원인은 치사량의 인플루엔자 바이러스로 비내 공격하기 1 내지 2일 전에 E1/E3-결손성 아데노바이러스(Ad) 입자의 비내 점적이 인플루엔자에 대한 급속 방어를 마우스에 부여할 수 있다는 것을 입증했다(도 1). 또한, 출원인은 치사량의 탄저균 스턴(Sterne) 포자에 의한 비내 공격 1 내지 2일 전에 Ad의 비내 투여가 탄저병에 대하여 마우스를 방어할 수 있다는 것도 밝혀냈다(도 2). 이로써 Ad의 비내 투여가 기도에 존재하는 다른 미생물들의 성장을 방해하는 일련의 반응을 빠르게 유도한다고 생각할 수 있다.
Ad는 동물 및 사람에서 안전성 프로필이 우수한 비복제성 백신 운반체에 생체공학적으로 처리되었는 바(Tang et al., 2009), 병원체 유래의 항원을 암호화하는 Ad 벡터는 적응 면역이 유도되기 전에 다양한 병원체에 대하여 빠르고 광범한 방어를 부여할 수 있고; 그 다음 백신으로서 병원체 특이적 방어 면역을 유도해낼 수 있는 약물 백신 듀오(DVD)를 단일 패키지로 개발할 수 있을 것으로 생각해볼 수 있다. 도 1 및 2는 돌연변이유전자-무함유 Ad 골격(AdE)이 약물로서 바이러스 및 박테리아에 대하여 빠른 방어를 부여할 수 있을 뿐만 아니라 병원체 유래의 항원을 암호화하는 그 대응부가 약물로서 병원체를 저지할 수 있었음을 보여준다.
도 1의 방법. A/NC/20/99(H1N1) 인플루엔자 바이러스의 HA1 및 이에 대응하는 돌연변이유전자-무함유 대응부(AdE)를 암호화하는 정제된 AdNC.H1.1 벡터들을 공격 전에 기술된 바와 같이(Shi et al., 2001) 기계적 피펫을 사용하여 각각 어린 BALB/c 마우스(2개월령)의 비공내로 0.05ml의 용량으로 적가 투여했다. Ad 투여 1일 또는 2일 후, 치사량(0.2 HA 단위)의 A/PR/8/34(H1N1) 인플루엔자 바이러스로 마우스를 비내 공격하고 생존에 대해 매일 모니터했다.
도 1의 결과. 공격 2일전(AdEin-2) 1.7X108 감염 단위(ifu) 용량의 AdNC.H1.1 벡터를 비내 점적하여 마우스의 70%(7/10)가 치사량의 생 A/PR/8/34 인플루엔자 바이러스에 대하여 방어되었다; 공격 2일전(AdEin-2) 1.7X106 ifu 용량의 AdE 벡터를 비내 점적하여 마우스의 100%(10/10)가 인플루엔자에 대하여 방어되었다; 공격 2일전(AdE*in-2) 1.7X106 ifu 용량의 AdE 벡터를 비내 점적하여 마우스의 20%(2/10)가 인플루엔자에 대하여 방어되었다; 공격 1일전(AdEin-1) 1.7X108 ifu 용량의 AdE 벡터를 비내 점적하여 마우스의 90%(9/10)가 인플루엔자에 대하여 방어되었다; 모든 대조 마우스(약물처리되지 않은 대조군)는 공격 후 10일 이내에 사망했다. 데이터는 공격 후 경과일에 대한 생존율%로 플로팅했다. 괄호 안의 수는 각 그룹의 동물 수를 나타낸다.
도 1의 유의성. 생 인플루엔자 바이러스 공격 1일 또는 2일 전에 Ad 벡터를 비내 투여한 경우 인플루엔자에 대한 동물의 방어성은 Ad 입자가 기도 내에 항바이러스 상태를 빠르게 유도할 수 있음을 보여준다. 인플루엔자 바이러스 HA를 암호화하는 Ad 벡터는 인플루엔자 백신으로 개발되어 있고(Hoelscher et al., 2006; Tang et al., 2009; Van Kampen et al., 2005), A/NC/20/99 HA를 암호화하는 AdNC.H1.1 벡터는 적응 면역이 유도되기 전에 인플루엔자 약물로서 빠른 방어성을 부여하는 바, 이 치료요법은 항바이러스 약물로서 광범위하고 빠른 방어를 부여한 다음 항바이러스 백신으로서 방어 면역을 유도해낼 수 있는 단일 패키지의 약물-백신 듀오(DVD)를 나타낸다는 강력한 증거이다.
도 2의 방법. 탄저균 방어 항원 및 이에 대응하는 돌연변이유전자-무함유 대응부(AdE)를 암호화하는 정제된 AdPA83 벡터들을 0.05ml의 용량으로 공격 전에 기술된 바와 같이(Shi et al., 2001) 기계적 피펫을 사용하여 각각 어린 A/J 마우스(2개월령)의 비공 내로 적가 투여했다. Ad 투여 1일 또는 2일 후에 치사량[1X105 콜로니 형성 단위(cfu)]의 탄저균 스턴 포자로 마우스를 비내 공격했고, 생존에 대해 매일 모니터했다.
도 2의 결과. 공격 2일전(AdPAin-2) 1.3X108 ifu 용량의 AdPA83 벡터를 비내 점적하여 마우스의 67%(6/9)가 치사량의 탄저병 포자에 대하여 방어되었다; 공격 2일전(AdEin-2) 1.3X108 ifu 용량의 AdE 벡터를 비내 점적하여 마우스의 30%(3/10)가 탄저병에 대하여 방어되었다; 공격 2일전(AdE*in-2) 1.3X106 ifu 용량의 AdE 벡터를 비내 점적하여 탄저병에 대하여 방어된 마우스(0/10)는 전혀 없었다; 공격 1일전(AdEin-1) 1.3X108 ifu 용량의 AdE 벡터를 비내 점적하여 마우스의 22%(2/9)가 탄저병에 대하여 방어되었다; 모든 대조 마우스(약물처리되지 않은 대조군)는 공격 후 4일 이내에 사망했다. 데이터는 공격 후 경과일에 대한 생존율%로 플로팅했다. 괄호 안의 수는 각 그룹의 동물 수를 나타낸다.
도 2의 유의성. 탄저병 포자 공격 1일 또는 2일 전에 Ad 벡터를 비내 투여함에 의한 탄저병에 대한 동물의 방어성은 Ad 입자가 기도에서 항균 상태를 빠르게 유도할 수 있다는 것을 보여준다. PA를 암호화하는 Ad 벡터는 탄저병 백신으로 개발되어 있고(McConnell et al., 2007), PA를 암호화하는 AdPA83 벡터는 여전히 적응 면역이 유도되기 전에 탄저병 약물로서 빠른 방어성을 부여하는 바, 이 치료요법은 항균 약물로서 빠른 방어를 부여한 다음 항균 백신으로서 방어 면역을 유도해낼 수 있는, 단일 패키지의 약물-백신 듀오(DVD)를 나타낸다는 강력한 증거이다.
참고문헌
Davies, J., and Davies, D. (2010). 항생제 내성의 기원 및 진화(Origins and evolution of antibiotic resistance). Microbiol Mol Bioi Rev 74,417-433.
Hoelscher, M. A., Garg, S., Bangari, D. S., Belser, J. A., Lu, X., Stephenson, I., Bright, R. A., Katz, J. M., Mittal, S. K., and Sambhara, S. (2006). 마우스에서 항원적으로 상이한 사람 H5N1 균주에 대한 아데노바이러스-벡터 기반의 유행병성 인플루엔자 백신의 개발(Development of adenoviral-vector-based pandemic influenza vaccine against antigenically distinct human H5N1 strains in mice). Lancet 367,475-481.
McConnell, M. J., Hanna, P. C, and Imperiale, M. J. (2007). 탄저병에 대한 급속 백신접종을 위한 아데노바이러스 기반의 초회감작-추가접종 면역화(Adenovirus-based prime-boost immunization for rapid vaccination against anthrax). Mol Ther 15,203-210.
Poland, G. A., Jacobson, R. M., and Ovsyannikova, I. G. (2009). 항바이러스제에 대한 인플루엔자 바이러스 내성: 합리적 사용을 위한 답변(Influenza virus resistance to antiviral agents: a plea for rational use). Clin Infect Dis 48, 1254-1256.
Shi, Z., Zeng, M., Yang, G., Siegel, F., Cain, L. J., Van Kampen, K. R., Elmets, C. A., and Tang, D. C. (2001). 아데노바이러스 벡터화된 비측 및 표피 백신의 무바늘 접종에 의한 파상풍 방어(Protection against tetanus by needle-free inoculation of adenovirus-vectored nasal and epicutaneous vaccines). J Virol 75, 11474-11482.
Tang, D. C, Zhang, J., Toro, H., Shi, Z., and Van Kampen, K. A. (2009). 인플루엔자 바이러스 무함유 조류 인플루엔자 백신의 개발에 사용되는 운반체로서의 아데노바이러스(Adenovirus as a carrier for the development of influenza virus-free avian influenza vaccines). Expert Rev Vaccines 8, 469-481.
Van Kampen, K. R., Shi, Z., Gao, P., Zhang, J., Foster, K. W., Chen, D. T., Marks, D., Elmets, C. A., and Tang, D. C. (2005). 사람에서의 아데노바이러스 벡터화된 비측 및 표피 인플루엔자 백신의 안전성 및 면역원성(Safety and immunogenicity of adenovirus-vectored nasal and epicutaneous influenza vaccines in humans). Vaccine 23, 1029-1036.
실시예 2: 인플루엔자에 대한 끊임없는 방어를 부여하기 위한 급속-반응 도구로서의 아데노바이러스-벡터화된 약물-백신 듀오
인플루엔자만큼 거대한 환자수를 나타내는 질병은 거의 없다. 출원인은 여기서 E1/E3-결손성(△E1E3) 아데노바이러스 혈청형 5(Ad5) 입자의 비내(i.n.) 투여가 마우스에서 수 주 동안 지속되는 예방 요법의 수단으로서 항-인플루엔자 상태를 빠르게 유도했음을 보고한다. Ad5-HA1 벡터는 인플루엔자 바이러스(IFV) 헤마글루티닌(HA) HA1 도메인을 암호화하여 예방 약물로서 빠른 방어성을 부여했고, 그 다음 단일 패키지의 약물-백신 듀오(DVD)로서 인플루엔자에 대한 끊임없는 방어를 유도하기 위한 백신으로서 지속적인 방어 면역을 유도해냈다. Ad5 입자는 기도에서 IFV 성장을 방해하는 선천적 면역의 특정 부문을 활성화시켜 인플루엔자를 저지할 수 있는, 숙주 반응의 복잡한 망을 유도하기 때문에, 이러한 다중-가닥의 인플루엔자 DVD는 현행 인플루엔자 약물을 손상시키는 약물 내성의 운명을 피할 수 있다고 생각할 수 있다.
인플루엔자는 유행성 인플루엔자뿐만 아니라 계절성 인플루엔자를 촉발시키는 원인 바이러스를 근절할 가능성이 사실상 없는 재발하고 새로 출현하는 질병이다. 동물과 사람 모두를 병들게 할 잠재성이 있는 동물매개 감염 질병으로서[1], 디자이너 IFV는 역유전학[2]에 의해 빠르게 생성될 수 있고, 목표 지역 내에서 농업, 공중보건 및 경제를 파괴하는 테러리스트에 의해 전파될 수 있다. 이러한 고도의 전염성이고 치사 가능성이 있는 질병은 백신접종에 의해 부분적으로 제어되었지만, 허가된 인플루엔자 백신은 대량 생산이 어렵고[1] 이종아형 IFV 균주에 대한 광범하면서 적시의 방어를 부여할 수 없다[3]. 인플루엔자에 대한 다른 방어 라인은 인플루엔자 약물[예, 오셀타미비르(타미플루); 자나미비르(렐렌자)]의 사용이지만, 이 옵션은 돌연변이 압력 하에서의 선택으로 인한 약물 내성 IFV의 출현 때문에 제한적이다[4,5].
급속 반응 항인플루엔자 제제의 개발을 위해, 우리는 Ad5-벡터화된 비측 인플루엔자 백신이 약물 유사 방식으로 인플루엔자에 대하여 빠른 방어를 부여할 수 있다는 것을 뜻하지 않게 입증해보였다. 따라서, 병원체 항원을 암호화하는 복제-적격성 아데노바이러스(RCA)-무함유 Ad5 벡터는 아마도 다양한 임상 환경에서 DVD로서 점막 병원체에 대한 끊임없는 방어를 부여할 수 있다. RCA-무함유 Ad5 벡터는 무혈청 PER.C6 현탁 세포에서 빠르게 대량생산될 수 있고; 비측 스프레이로 고통없이 집단 투여될 수 있으며[1]; 그 다음 기존 Ad5 면역에도 불구하고 선천적 뿐만 아니라 후천적 면역 반응을 유도해낼 수 있다. 인플루엔자 DVD의 경우에, Ad5 입자는 예상컨대 IFV를 직접 공격함이 없이 항인플루엔자 상태를 유도하기 때문에 약물 내성 IFV를 생성할 기회가 아주 적다. 약독화된 IFV 생백신(LAIV)과 달리, Ad5-벡터화된 DVD는 비복제성이고 야생 IFV와 재편성되지 않는다. Ad5-벡터화된 인플루엔자 DVD의 비측 분무는 예방 약물로서 수 주 동안 이종아형 IFV 균주에 대하여 광범한 방어를 부여할 수 있고; 그 다음 약물 유도 방어가 약화되기 전에 수개월 또는 심지어 수년 동안 백신으로서 균주-특이적 방어 면역을 유도해낼 수 있을 것으로 예상한다. 이러한 신규 치료요법은 DVD 방어 효과가 사람 피검체에서 반드시 재현될 수 있다면 인플루엔자 및 여타 질병에 대해서도 공중보건 무기고에 추가적인 급속 반응 도구가 될 수 있다.
항인플루엔자 제제로서의 △E1E3 Ad5 입자. 돌연변이유전자-무함유 △E1E3 Ad5 빈(AdE) 입자 및 이에 대응물인 A/New Caledonia/20/99 H1N1 IFV(NC20) HA1 도메인을 암호화하는 AdNC.H1.1은 기술된 바와 같이[1] PER.C6 세포에서 생성되었다. 도 3에 도시된 바와 같이, 공격 2일 전(-2일) 1.7x108 감염 단위(ifu)의 AdE의 비내 점적은 치사량의 생 A/Puerto Rico/8/34 H1N1 IFV(PR8)에 대하여 마우스 100%(10/10)를 방어했고; AdE의 용량이 1.7x106 ifu로 100배 감소한 경우에는 동물의 20%(2/10)만이 방어되었으며; 1.7x108 ifu의 AdE가 -2일에 근육내 주사 또는 PR8 공격 1일 후 비내 점적에 의해 마우스에 투여되었을 때에는 어떠한 방어도 나타나지 않았다. 1.7x108 ifu의 AdNC.H1.1이 -2일에 마우스에 비내 투여되었을 때 동물의 70%(7/10)만이 방어된 것처럼, AdE 게놈내로 NC20 HA1 도메인의 삽입은 항인플루엔자 상태를 유도하는 △E1E3 Ad5의 능력을 약간 방해했다. AdE와 유사하게, 비내 점적되는 1.7x106 ifu 또는 근육내 주사되는 1.7x108 ifu의 AdNC.H1.1도 모두 -2일에 투여되었을 때 PR8에 대한 방어를 전혀 부여하지 못했다(도 3). -2일째 1.7x108 ifu 용량으로 비내 투여된 AdE(P, 0.0001) 또는 AdNC.H1.1(P=0.0077)에 의해 제공된 방어는 미처리 대조군과 비교했을 때 통계적 유의성에 도달했다(로그 순위 검정 시).
-47일째(PR8 공격 47일 전) AdE의 비내 투여는 동물의 70%(7/10)를 방어했고, 이는 AdE-유도 항인플루엔자 상태가 수 주 동안 지속될 수 있다는 것을 보여준다(도 4). -47일째 AdNC.H1.1의 비내 점적은 마우스의 100%(10/10)를 방어했는데(도 4), 이는 아마도 PR8에 대한 혈청 혈구응집-억제(HI) 항체가 검출되지는 않았지만 PR8과 교차반응하는 NC20 HA1-유도 적응 면역 때문일 것이다(표 1). NC20에 대한 높은 HI 항체 역가 및 PR8에 대한 검출할 수 없는 역가를 유도해 낸 -47일째의 AdNC.H1.1에 의한 면역화와 달리, PR8에 의한 공격은 생존체 중에서 PR8에 대한 높은 HI 항체 역가 및 NC20 대한 낮은 역가를 유도했고, -2일째 AdE 또는 AdNC.H1.1의 투여는 NC20 또는 PR8 중 어느 하나에 대해서도 HI 역가를 유도하지 못했다(표 1). -47일째 AdNC.H1.1(P, 0.0001), -47일째 AdE(P=0.0032), AdE 이중-용량 치료요법(-47일 후 -2일째 추가 적용)(P,0.0001), -1일째 AdE(P,0.0001) 또는 -2일째 AdE(P=0.0005)를 1.2x108 ifu 용량으로 비내 투여하여 제공된 방어성은 모두 미처리 대조군에 비해 통계적 유의성을 달성했다.
Figure pat00001
여러 가지 치료요법이 인플루엔자-매개의 사망률에 대항하여 마우스를 방어했지만, AdE 이중 용량 치료요법은 차이가 통계적 유의 수준에 도달하지는 못했지만 PR8 공격 후 더 적은 체중 감량에 의해 입증되듯이, 단일 용량(-47일째 또는 -2일째) 대응 요법보다 더욱 확고한 방어를 부여하는 경향이 있었다(도 5). 항인플루엔자 상태를 유도하기 위해, E1+/E3+ 야생형 Ad5는 동일 조건 하에 마우스에 비내 투여된 후 인플루엔자를 저지할 수 없었기 때문에 E1 및/또는 E3을 결실시키는 것이 필수적이다(도 4).
인플루엔자에 대항한 폐의 Ad5-유도 방어. PR8 공격 후 폐의 조직병리에 의해 입증되듯이, -2일째 AdE 또는 AdNC.H1.1의 비내 투여는 중증 폐 손상의 발달을 예방하여 인플루엔자에 대항하여 마우스를 방어했다. Ad5 방어 없이 PR8의 비내 점적은 PR8 공격 7일 후 터키 다중 비교 후검사와 함께 1방향 ANOVA에서 공격 19일 후 엄청난 폐 염증을 유도했다.
유행성 IFV 균주에 대항한 방어. △E1E3 Ad5 입자가 PR8뿐만 아니라 더욱 임상적 관련성이 있는 IFV 균주에 대항하여 마우스를 방어할 수 있는지를 증명하기 위해, 2.5x108 ifu의 AdE 또는 AdNC.H1.1을 마우스에 비내 투여한 다음, 유행성 2009 H1N1 돈형 플루 분리물 A/California/04/2009(CA04)의 치사량으로 동물을 공격했다. 도 8에서 보여주듯이, 100%(10/10)의 동물이 -2일째 AdE 또는 AdNC.H1.1과 -22일째 AdNC.H1.1의 비내 점적에 의해 방어되었고; 90%(9/10)가 -22일째 AdE의 비내 투여에 의해 방어되었다. 이러한 Ad5-노출된 그룹 전부에서 CA04에 대항하여 제공된 방어성은 위약 대조군에 비해 통계적 유의성을 달성했다(P, 0.0001).
비복제성 △E1E3 Ad5 벡터는 높은 효능과 우수한 안전성 프로필을 가진 비측 인플루엔자 백신 운반체 내로 생체공학적으로 처리되었다[1]. 백신으로서 방어 면역성을 유도하는 것 외에, 우리는 여기서 이러한 클래스의 백신이 적응 면역이 유도되기 전에 인플루엔자에 대항하여 예방 치료법을 부여할 수도 있음을 보여준다. 마우스 내로 △E1E3 Ad5 입자의 투여는 광범한 일련의 염증성 사이토킨과 케모킨[6], 예컨대 I형 인터페론(IFN-a 및 IFN-b)[7]의 생산을 빠르게 유도하고; 폐 수지상 세포를 손상시키며[8]; 천연 킬러 세포를 활성화시키고[9]; 항바이러스성 산화질소의 생산을 유도하고[10]; Ad5와 혈액 단백질, 혈소판, 대식세포, 내피 세포 및 각각의 실질 세포 사이에 다면적 상호작용을 촉발한다[6]는 것은 기록되어 있다. Ad5 E1A, E1B 및 E3 단백질에 의한 Ad5-관련 염증의 억제[11]는 △E1E3 Ad5 입자가 많은 면역뿐 아니라 비면역 반응을 유도하고 일부 반응은 동물에서 미확인 상태이기 때문에 다른 기전이 배제될 수는 없을지라도[12], 항인플루엔자 상태를 유도하는 E1+/E3+ Ad5의 부적격성(도 4)이 염증 억제의 결과로 생각할 수 있음을 암시한다. 따라서, 기도에 항인플루엔자 상태를 확립시키기 위해 △E1E3 Ad5 입자에 의해 유도된 다중 반응이 통합되어, IFV에 의해서는 거의 회피될 수 없는 다차원적 방어 장벽이 생성되는 것으로 생각할 수 있다. 이러한 가설은 동물이 인플루엔자에 반응하는 중복 기전을 발달시켰음을 보여주는, IFN-α/β 수용체가 없어도 되는 방식으로 인플루엔자에 대항한 방어를 제공한다는 발견에 의해 뒷받침된다[13]. 게다가, 이 연구들에서 공격받은 Balb/c 마우스는 IFN-α/β-유도된 인플루엔자-내성 인자 Mx1의 결손성 대립유전자를 운반하는데[14], 이는 I형 IFN의 △E1E3 Ad5-유도 생산[7]이 이 마우스 균주에서 항인플루엔자 상태를 확립하는 동안 주요 역할을 할 수 없다는 것을 암시한다.
PR8 공격 1일 후 AdE의 비내 투여가 인플루엔자를 저지할 수 없다는 발견(도 3)은 AdE 입자가 PR8 또는 CA04 전에 비내 투여되었을 때 IFV에 의해 반전될 수 없는 Ad5-유도 항인플루엔자 상태와 유사한, PR8 전에 AdE가 기도로 유입될 때 △E1E3 Ad5 입자에 의해 파괴되지 않는 프로인플루엔자 상태를 IFV가 유도할 수 있다는 것을 암시한다(도 3 내지 9). △E1E3 Ad5-기반의 예방 약물을 노출 후 인플루엔자 약물로 더 발전시키기 위해서는 기도에서 2종의 바이러스에 의해 유도된 길항작용적 반응을 특성규명하는 것이 중요하다.
Ad5에 대한 예비노출은 이 벡터가 근육내 주사될 때 Ad5의 효력 상실과 연관이 있다[15]. 하지만, 출현하는 증거는 Ad5-벡터화된 비측 백신이 아마도 면역적격 경계 조직과 관련된 강력한 항원 제시와 연계하여 점막 장벽을 따라 표재층의 세포로의 고효율 유전자 전달로 인하여, 마우스[15], 마카크[16] 및 사람[17]에서 이미 존재하는 Ad5 면역을 우회할 수 있음을 보여준다. AdE 이중 용량 치료요법에 의해 유도된 1차 적용과 추가 적용 사이의 상승작용(도 4 및 5)은 AdE에 의해 유도된 빠른 항인플루엔자 반응이 이미 존재하는 Ad5 면역의 존재 하에 부가적이라는 것을 보여준다. 이러한 발견은 이러한 비측 인플루엔자 DVD가 단일용량 치료요법에서 인플루엔자에 대하여 빠르고 지속적인 방어를 유도할 수 있을 뿐만 아니라 효력 상실 없이 반복적으로 투여될 수 있다(예컨대, 백신 성분에 다른 HA가 필요한 경우)는 가능성을 지닌다.
예방 인플루엔자 치료법은 복합 박테리아 용해물[18] 또는 박테리아 독소[19]의 비내 투여에 의해 수행될 수 있지만, 박테리아 성분-유도된 항인플루엔자 상태는 치료법후 며칠 이내에 방어 효과가 감소하는 매우 일시적인 것이었다[18,19]. 단일 용량 치료요법에서 AdE-유도된 방어 효과가 적어도 3주(도 6), 최대 47일(도 4)까지 지속될 수 있다는 발견은 박테리아 성분-유도 항인플루엔자 상태와 Ad5-유도 항인플루엔자 상태 사이의 기본 기전이 다를 수 있음을 암시한다. 또한, 오로지 Ad5-유도 항인플루엔자 상태만이 약물 효과가 약화되기 전에 DVD 백신 성분이 적응 면역을 유도해 내기에 충분한 시간을 허용할 것이다. 게다가, 복제성 야생형 Ad5는 양성 호흡기 바이러스이고, 본 연구에 사용된 이의 비복제성 대응물은 심지어 더 안전해야 한다; 특히, 사람 피검체에서 Ad5-벡터화된 비측 인플루엔자 백신의 안전성 프로필은 밝혀져 있다[17]. 일반적인 호흡기 바이러스처럼, 사람 점막 면역계는 Ad5 입자에 익숙하고 Ad5-특이적 방어 기전을 발달시켜야 한다. 이에 반해, 인플루엔자 약물로서 소화관-관련 박테리아 독소의 기도로의 투여[19]는 면역계를 놀라게 할 수 있고 이러한 비자연적 치료요법은 사람 피검체에서 벨 마비(Bell's palsy)와 연관되었다[20].
IFV는 인플루엔자 약물[예, M2 이온 채널 차단제(아만타딘; 리만타딘) 또는 뉴라미니다제 억제제(오셀타미비르; 자나미비르)]로 공격을 받을 때 약물 내성 균주로 서서히 변이한다[5]. 현대의 인플루엔자 약물과 달리, Ad5-벡터화된 DVD는 예상컨대 IFV를 직접 공격함이 없이 기도의 서식처를 변화시키고; 이에 따라 DVD는 약물 내성을 유도하는 돌연변이 압력을 전혀 부여하지 않는다. 후속 점막 병원체 감염에 대한 취약성을 증가시킬 위험이 있는 점막 면역의 오셀타미비르-유도 억제와 반대로[21], Ad5-벡터화된 DVD는 최소한 점막 병원체의 서브세트에 대하여 점막의 선천 면역을 증진시킨다. DVD의 효능은 이의 약물 효과가 완전히 사라지기 전에 지속적인 적응 면역을 유도해내는 백신 성분에 의해 추가로 강화된다(도 2 내지 8). 승인된 LAIV(예, 미국의 FluMistH)는 생 IFV를 함유하기 때문에[1], LAIV와 인플루엔자 약물의 공동투여는 약물이 생 IFV를 사멸시켜 백신을 무력화할 수 있기 때문에 역효과를 낳을 것이다. Ad5-벡터화된 DVD는 승인된 인플루엔자 약물과 융화성일 뿐만 아니라 백신능 외에도 스스로 약물로서 예방 요법을 부여하기도 한다.
출현하는 증거는 비측 백신이 더욱 강력한 점막 적응 면역 반응을 유도해내어 호흡기 점막 병원체에 대하여 더욱 강한 방어를 부여할지라도[22,25], 다수의 비측 백신은 이의 비경구 대응물보다는 약한 전신 적응 면역 반응을 유도한다는 것을 보여준다[22-26]. 출원인은 적응 면역뿐만 아니라 선천적 면역이 △E1E3 Ad5 입자가 근육내가아닌 비내로 투여될 때, 각각 비내 경로 및 근육내 경로에 의해 제공되는 생존률%로 입증되는 바와 같이(도 3), 점막 병원체에 대하여 기도에 초점을 맞추어 유도될 수 있다는 증거를 제공한다. Ad-5 벡터화된 비측 DVD가 다른 경로(예, 경구 감염)에 의해 유도된 인플루엔자에 대해서도 방어를 부여할 수 있는지의 여부는 여전히 불확실하다.
-47일에 AdNC.H1.1의 비내 투여가 -2일에 접종된 대응물 또는 -47일에 투여된 AdE보다 PR8 공격에 대하여 더욱 강한 방어를 유도한다는 발견(도 3 및 4)은 AdNC/in/-47 그룹의 동물이 PR8에 대한 검출성 혈청 HI 항체의 부재에서 면역화 47일 후 PR8과 교차반응한 NC20 HA1-매개의 적응 면역 반응에 의해 방어될 수 있다는 것을 암시한다(표 1). 이 데이터는 혈청 HI 항체 역가가 비측 인플루엔자 백신에 의해 유도된 방어 면역을 예측하기에는 부적당한 대체 마커라는 다른 보고들을 확증한다[24, 26].
Ad5-벡터화된 DVD가 단일 패키지로 백신접종과 연계하여 예방 요법을 부여할 수 있다는 발견은 배양 세포에서 대량생산될 수 있고 비측 분무에 의해 고통없이 투여될 수 있으며 기존 Ad5 면역을 우회하고 약물 내성 IFV 균주를 발생시킬 가능성 없이 인플루엔자에 대한 빠르고 지속적인 유익한 반응 쪽으로 선천 면역 뿐만 아니라 적응면역 레퍼토리를 이동시키는 능력이 있는, 신규 항인플루엔자 제제의 개발에 기초를 마련한다.
아데노바이러스. AdE 입자를 제조하기 위해, 셔틀 pAdHigh 플라스미드와 Ad5 백본 pAdEasy-1 플라스미드 사이의 상동성 재조합을 에세리키아 콜리 BJ5183 세포에서 수행한 뒤, PER.C6 세포(Crucell Holland BV에서 제공함; Leiden, The Netherlands)에서 RCA-무함유 AdE 입자를 기술된 바와 같이[1] 발생시켰다. 따라서, AdE는 임의의 돌연변이유전자를 암호화함이 없이 E1 영역[1]에 발현 카세트를 가진 △E1E3 Ad5이다. AdNC.H1.1 벡터를 제조하기 위해, NC20 HA 유전자는 GENEART(Regensburg, Germany)에서 개시 ATG 코돈으로부터 바로 상류에 진핵생물 리보솜 결합 부위의 삽입과 함께 사람 세포에서 발견된 tRNA 풀(pool)에 정합하도록 코돈을 최적화시켜 합성했다[27]. 347개 아미노산을 함유하는 NC20 HA1 단편은 프라이머 5'-CACAGGTACCGCCACCATGAAGGCCAAGCTG-3' 및 5'-GAGTCTAGATTATCAGCCGAACAGGCCTCTGCTCTGG-3'를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 합성 HA 주형으로부터 증폭시켰다. 종결 코돈이 프레임에 맞게 첨가된 HA1 증폭 단편을 함유하는 KpnI-XbaI 단편은 사람 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 프로모터의 전사 조절 하에 정확한 배향으로 pAdHigh의 KpnI-XbaI 부위에 삽입했다. 이어서 PER.C6 세포에서 전술한 바와 같이 NC20 HA1을 암호화하는 RCA-무함유 Ad5 벡터(AdNC.H1.1)를 생성시켰다. AdE 및 AdNC.H1.1 둘 모두를 DNA 서열분석으로 확인하고; PER.C6 세포에서 대량생산하고; 기술된 바와 같이[27] 염화세슘 구배 하의 초원심분리로 정제하고; A195 완충액[28]으로 투석하고, 역가(ifu/ml)는 293 세포[17]에서 Spearman-Karber 법[29]에 의해 Ad5-감염된 단층을 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-결합된 항 Ad5 헥손 항체 및 3,3'-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드(DAB) 기질(Clontech Laboratories, Inc.; Mountain View, CA)로 염색한 후 측정했다. E1+/E3+ 야생형 Ad5(VR-1516)는 미국모식균배양수집소(ATCC; Manassas, VA)에서 수득했다.
인플루엔자 바이러스. PR8(VR-95)은 ATCC에서 입수하여 Madin Darby Canine Kidney(MDCK)세포에서 TPCK-트립신 존재 하에 기술된 바와 같이[17] 증식시키고 역가는 플라크 분석법[30]으로 측정했다. 마우스-적응된 CA04는 나탈리아 에이. 일류시나에 의해 제조되어 세인트 유다 아동 연구 병원(테네시 멤피스 소재)에서 근무하는 엘레나 고보코바로부터 받았다. CA04 바이러스는 마우스 폐를 통해 9회 연속 계대배양하여 Balb/c 마우스의 폐에서 복제하도록 적응되었다. 바이러스는 MDCK 세포에서 플라크 정제하고 바이러스 스톡은 10일령의 부화계란 및 그 다음 MDCK 세포에서 기술된 바와 같이[31] 증식시켜 제조했고, 역가는 세포 배양물 감염 용량(CCID50)으로서 기술된 바와 같이[32] 나타냈다. NC20은 질병 통제 센터(CDC; 조지아 애틀랜타 소재)에서 받았다.
공격 연구. 어린(약 2개월령) 암컷 Balb/c 마우스에 Ad5 입자 50㎕의 비내 투여 및 근육내 주사를 기술된 바와 같이[27] 수행했다. 마우스는 버밍햄에 있는 알라바마 대학(UAB)에서 1.4x106 플라크형성단위(pfu)[약 4xLD50(50% 치사량)에 해당) 또는 3.5x106 pfu(약 10xLD50에 해당)를 함유하는 PR8 50㎕, 뿐만 아니라 유타주립대학(USU)에서 26105 CCID50(약 3xLD50에 해당)을 함유하는 CA04 90㎕의 비내 점적에 의해 공격을 받았다. 마우스를 이용한 모든 실험은 UAB 및 USU에 있는 동물보호및사용협회의 승인에 따라(UAB Approval ID, #7705; UAB Animal Welfare Assurance Number, A3255-01; USU Approval ID, #552; USU Animal Welfare Assurance Number, A3801-01) 수행했다. UAB 및 USU에 있는 동물 시설은 AAALAC 인가를 받은 곳이다.
공격 후 폐의 PR8 역가. AdE 입자는 -2일에 50㎕ 부피 중에 1.2x108 ifu 용량으로 어린 암컷 Balb/c 마우스에게 비내 투여했다. 0일째, 4.6x106 pfu의 PR8을 비내 점적하고 5 내지 7일 후, 대조군 폐와 AdE-노출된 마우스 폐를 절제 후 즉시 드라이아이스에서 동결시키고 분석 시까지 280uC에서 보관했다. 해동 후, 각 폐의 일부분을 칭량해서 저온 인산염 완충 식염수(PBS)에 10%(w/v) 현탁액으로 균질화시켰다. 조직 파편은 원심분리로 제거하고 상청액은 바이러스 역가 측정을 위해 다른 멸균 튜브로 이동시켰다. IFV의 플라크 분석은 기술된 바와 같이 수행했다[30].
혈구응집 억제 분석. 혈청은 기술된 바와 같이[17] 수용체-파괴 효소로 혈청을 전처리한 후 표준 HI 분석에 의해 PR8 또는 NC20에 대한 활성에 대해 검사했다. 각 혈청 샘플은 1:10의 희석율로 시작해서 검사했다. 모든 혈청은 코드-부착되고 매칭된 면역화 전 및 면역화 후 샘플에 대해 블라인드 방식으로 검사했다. 동물은 혈청반응음성으로 간주되었고 혈청 표본의 HI 역가가 <10이라면 HI 항체 역가는 5(log2 스케일에서 2.3)로 지정했다.
폐 조직병리 분석. 마우스 폐는 기관지를 통해 10% 완충 포르말린을 관류시켜 고정시켰다. 파라핀 매립 조직을 5㎛ 두께의 절편으로 절단한 뒤, 절편을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색했다.
통계 분석. 모든 통계 분석은 GraphPad Prism 버전 5.04(GraphPad Software, San Diego, CA)를 사용하여 수행했다. 로그 순위 검정은 캐플란-마이어 생존률 곡선을 비교하여 수행했고; 일방향 ANOVA와 터키 다중 비교 후검정은 폐의 PR8 역가뿐 아니라 체중 손실을 비교하기 위해 수행했다. 통계 유의성은 P,0.05로 설정했다.
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실시예 3: 감염성 질병에 대한 집단 방어를 부여하기 위한 잠재적 견인제로서 아데노바이러스-벡터화된 약물-백신 듀오
백신의 질병 투쟁력은 사망률 및 이환율의 세계적인 감소로 인정을 받은 공중보건의 대성공이었다. 백신 적용범위를 증가시켜 그 투쟁력을 더욱 증폭시키기 위한 목표는 적은 비용으로 대량 생산할 수 있고 비의료진에 의해 집단 투여될 수 있는 신세대 급속 반응 백신의 개발을 필요로 한다. 이 신규 백신은 또한 종래의 백신보다 높은 안전성 여지도 부여되어 있어야 한다. 비복제성 아데노바이러스-벡터화된 백신은 이 벡터가 수요 급증에 부응하여 무혈청 현탁 세포에서 빠르게 제조될 수 있고 진화 의학에 따라 사람 피검체에게 비측 분무에 의해 비침습적으로 투여될 수 있기 때문에 백신 적용범위를 증가시킬 가능성이 있다. 비경구 주사와는 대조적으로, 비침습적 점막 백신접종은 전신 염증을 최소화한다. 게다가, 기존의 아데노바이러스 면역은 아데노바이러스 벡터화된 비측 백신의 효능을 인지할 수 있을 정도로 방해하지 않는다. 병원체 항원을 암호화하는 아데노바이러스 벡터의 비측 투여는 두려움이 없고 고통이 없을 뿐만 아니라 돌연변이유전자 발현없이 아데노바이러스 입자가 단독으로 기도에서 항인플루엔자 상태를 유도할 수 있기 때문에 약물-백신 듀오로서 점막 병원체에 대하여 빠르고 지속적인 방어를 부여할 수도 있다. 사람 백신접종 외에, 동물도 이러한 부류의 벡터화된 백신에 의해 집단 면역화될 수 있다.
더 나은 백신에 대한 장황한 요구. 백신접종은 질병을 예방하기에 가장 비용효과적인 방법인 것으로 입증되지만, 백신 적용범위를 증가시키기 위한 광범위한 공격은 세계적으로 향상된 공중보건에 대한 움직임에서 어쩔 수 없는 목표로 남아 있다. 시판 승인된 현행 백신은 사멸된 전체 미생물, 생 약독화된 미생물, 미생물 추출물, 정제된 단백질 또는 재조합 단백질, DNA 백신 및 바이러스 유사 입자를 포함한다. 이러한 백신들의 광범한 분포로 인해 다수의 질병이 퇴치되었지만, 매우 다양한 질병 환경에서 지역(무리) 면역을 발생시키기 위한 목표는 현행 백신접종 프로그램에 존재하는 다수의 문제점들로 인해 해결하기 힘든 상태이다. 특히, 백신 관련 부작용은 국소 및 전신 염증 반응, 열병, 혈소판 활성화, 심장 자율 기능장애, 아나필락시스 반응(특정 백신의 바늘 주사에 의해 유도됨)[1-4]에서부터 마비성 회색질척수염의 희귀 발생(경구 폴리오 백신의 섭취로 인해 중재됨)[5], 심근심막염(Dryvax 마마 백신의 접종에 의해 유도) [6] 및 벨 마비(Bell's palsy)(박테리아 독소 비측 보강제에 의해 유도)[7,8]에까지 이른다. 2010년, 백신접종자 중에서 기면증의 급증이 스쿠알렌 보강제를 함유하는 H1N1 유행성 인플루엔자 백신을 바늘 주사로 맞은 후에 몇몇 국가에서 보고되었다[210]. 스쿠알렌 단독 주사는 동물의 류마티스성 관절염을 유도할 수 있다[9]. 최근의 증거는 만성 경도의 염증이 심혈관 질환[10], 비만[11], 당뇨[11], 암[12] 및 신경계 장애[13]와 관련이 있음을 보이고 있는 바, 이제는 백신 유도 염증에 관심을 집중할 필요가 있다. 면역자극 백신-보강제 복합체를 주사 시 유도된 급성 염증 반응[1-3]이 만성 경도 염증으로 진화할 수 있고 백신접종자들의 아집단에서 임의의 병을 촉발할 수 있는지의 여부는 공중보건에 있어서 가장 중요하다; 하지만, 이 잠재적 위험은 철저하게 연구된 적이 없다. 백신 안전성의 개념은 '병원체 유도 질병에 대한 방어'에서부터 '부작용 유도 가능성의 전무'로 진화하고 있기 때문에, 백신에서 발견된 임의의 공지된 외인성 제제, 독성 및 잔류 독력은 허용되지 않을 것이며, 미지의 부작용(예, 생명유지 기관의 염증)을 유도할 수 있는 모든 가능성은 회피되어야 한다.
점막 면역반응 및 전신 면역반응은 유도되고 상당한 정도의 독립성으로 조절되며, 대부분의 백신은 전신 면역성을 잘 유도하나 종종 점막 병원체(예, 인플루엔자 바이러스, 결핵균 및 HIV)에 대한 방어 시에 결정적인 약한 점막 면역성을 유도하는, 근육내 주사에 의해 침습적으로 투여되고 있다[14,15]. 점막 면역의 효과적인 유도는 보통 상주 점막 수지상 세포(DC)가 IgA 전환을 유도하고 림프구 위에 점막 특이적 귀소 수용체(예, CCR9 및 α4β7 인테그린)를 각인함으로 인해 비측 또는 경구 백신접종을 이용한다[15,16]. 주사가능한 백신에 의해 유도된 약한 점막 면역 외에도, 백신 투여 기구로서 주사기 바늘은 위기 동안 면허가 있는 의료인에 의한 제한적인 주사 서비스뿐 아니라 부적절한 폐기물 처리, 바늘에 찔리는 상처, 의도적이거나 우연한 비멸균 상태의 재사용을 통해 심각한 문제를 야기한다[17]. 뾰족한 바늘에 대한 대중의 공포(첨예공포증)는 백신 적용범위를 방해하는데 있어서 다른 역할을 한다. 따라서, 몇몇 사람들은 전신 백신접종에 의한 고통, 상처 또는 사망을 겪는 곤란에 비해 질병에 걸리는 곤란을 선호할 수 있다. 백신접종 프로그램의 목적은 지역(무리) 면역을 발생시켜 전반적인 감염 확률을 감소시키는 것이므로, 임무는 대중의 위험 공포로 인한 백신접종의 지연으로 인해 훼손될 것이다. 지금까지, 안전하고, 효능적이며, 고통이 없고 경제적인 신세대 급속 반응 백신을 발전시켜 부정적인 인식을 반전시키는 합법적인 기술이 수면 위로 떠오르고 있다.
백신 적용범위를 증가시키기 위한 수단으로서의 비침습적 백신접종. 무바늘의 비침습적 백신접종은 '바늘 주사를 어쩔 수 없이 맞아야 하는 것'에서 '공포 없이 주도적으로 백신접종을 찾는 것'으로 대중의 태도를 변화시킬 가능성을 갖고 있다. 백신은 경구 섭취[5], 비측 분무[18,19], 뿐만 아니라 무통 방식의 피부 패치 국소 적용[19-23]에 의해 비침습적으로 투여될 수 있다. 신체 내부와 외측 환경 사이의 계면에 대한 백신의 투여에 의한 비침습적 백신접종은 백신접종자에게 고도의 편안함을 부여할 뿐만 아니라 종래의 전신 백신접종에 비해 질적으로 우수한 면역 반응을 초래할 수 있다. 점막피부 표면은 물리적 장벽으로 작용하고 표재 층 내로 침투하는 항원이 효과적으로 포획되어 면역계에 제시되도록 하는 고도의 면역적격 상피로 덮여있다. 논리적으로 동물 및 사람은 침입성 병원체를 드물게 만나는 심부 조직에서 이러한 '전문 면역 병사'를 유지하는 것이 비생산적일 수 있기 때문에, 감염을 피하기 위해 표면 장벽을 따라 가장 유능한 면역 세포를 배치해야 한다. 다수의 DC 서브세트[24,25], gdT 세포[26] 등을 비롯한 전문 항원제시세포(APC)는 점막피부 표면을 따라 고밀도로 발견될 수 있다. 레틴산 합성 효소를 발현하는 마우스 골수 세포의 서브세트는 점막 DC 기능, 예컨대 Foxp3+ 조절 T 세포, IgA-분비성 B 세포 및 점막-특이적 귀소 수용체의 생성[27]을 유도하기 위해 DC 전구체로 레틴산을 제공할 수 있다. 백신접종 경로는 마우스에서 항원-특이적 CD8+ T 림프구의 정도뿐만 아니라 표현형 및 트래피킹에도 영향을 미치는 것으로 밝혀져 있다. 아데노바이러스(Ad)-벡터화된 백신의 근육내 주사는 강한 국소 돌연변이유전자 발현을 유도했고 전신 구역 및 점막 구역 모두로 광범하게 트래피킹된 고빈도의 다작용기성 CD8+ T 림프구를 유도해내었다. 이에 반해, Ad-벡터화된 백신의 비내 점적은 유사하게 강한 돌연변이유전자 발현을 유도했지만, 제한적인 해부학적 트래피킹 패턴으로 저빈도의 일작용기성 CD8+ T 림프구를 발생시켰다[28]. 따라서, 비침습적 백신접종은 과잉반응성 전신 면역 반응을 유도함이 없이 문맥에서 점막 병원체에 대하여 국소적 방어 면역을 유도해내기 위해 점막피부 표면을 따라 표재성이나 면역적격성인 조직 부위에서 반응하도록 면역계의 능력에 영향을 미치는 기존의 생물학적 경로를 이용한다.
백신은 현재의 양호한 제조 관행 하에 무균적으로 제조해야 하지만, 미지의 미생물에 의한 오염 또는 현대의 기구와 고처리량의 분석에 의한 검출 이하의 오염은 여전히 일어날 수 있다. 이러한 오염물과 비침습적 백신을 점막피부 표면에 동시투여하면, 계면은 항상 미생물과 접촉하고 있어서 점막피부 면역계는 항상 미생물 침습을 없애는데 정통하기 때문에 백신접종자에게 거의 위험을 주지 않을 것이다. 이에 반해, 오염된 백신의 심부 조직으로의 주사는 이론적으로 적시의 면역 반응의 부재 시에 체내에서 미생물의 지수적 성장을 촉발할 수 있거나, 또는 반대로 과잉반응성 면역계에 의해 유도된 '면역 폭풍'을 촉발할 수 있다. 종합해보면, 점막피부 표면을 따라 방어 면역의 유인은 일상적이고; 동물 및 사람은 전쟁(전반적인 건강)에 지지않고 매일의 싸움(매일매일의 미생물 침습)에 이기기 위해 적당한 기전을 진화시켰다. 비침습적 백신접종은 면역적격이 낮은 심부 조직 내로 면역자극성 백신-보강제 복합체의 물리적 전달에 의해 면역계를 놀라게 함이 없이 계면을 따라 면역계의 일상적인 작용을 이용한다.
아데노바이러스를 백신 운반체로 발달시키기 위한 지그재그 경로. 아데노바이러스는 전도된 말단 반복서열에 의해 브래킷화된 30 내지 38kb(크기는 그룹마다 다르다)의 선형 DNA 게놈을 가진 20면체의 엔벨로프화되지 않은 DNA 바이러스 패밀리에 속한다. Ad 입자는 육각형 단백질 캡시드 내에 포장된 촘촘히 코일화된 DNA 게놈을 함유한다(도 9a). Ad 게놈은 조절 단백질을 암호화하는 초기 유전자 및 구조 단백질을 암호화하는 후기 유전자를 모두 함유한다[29]. 다중 Ad 혈청형은 동물 및 사람에서 일반적으로 발견되고 다른 혈청형 간에 병원성 및 질병 과정에 유의적인 차이가 있을 수 있고; 일부는 면역적격 사람 숙주(예, 사람 Ad 혈청형 5[30])에서 꽤 양성인 반면, 다른 일부는 보통 경미하고 자기 제한적인 질병을 유발할 수 있다. 많은 주목할만한 이유가 Ad의 백신 운반체로의 발달을 보장한다. 구체적으로, 사람 Ad4- 및 Ad7-기반의 경구 백신(비침습성 백신의 한 종류)은 신병의 집단 면역화 동안 효과적일 뿐만 아니라 안전한 것으로 입증되었다[31]. 잠재적으로, 복제성 Ad4 또는 Ad7은 다시 다른 병원체 유래의 항원에 대하여 면역을 유도해내기 위해 경구 백신 운반체로 생체공학적으로 처리될 수 있다. 하지만, 유전자 변형 유기체를 나타내는 복제성 생체공학적으로 처리된 벡터를 조절된 방식으로 정량적으로 방출하기는 어렵다. 또한, 생태계 내로 유전자 변형된 유기체의 도입은 대중의 인식에 바람직하지 않다. 따라서, 비복제성 벡터가 복제성 벡터보다 더 안전하고 더욱 허용성일 것이다. 비복제성 Ad5 벡터는 거의 30년 전에 E1 영역을 절두하여 개발되었지만(도 9b)[32], 사람 293 세포에서 생산된 E1 결손성(△E1) Ad5 벡터의 중대한 문제는 벡터 백본과 형질감염된 293 세포에 의해 전시된 E1 유전자를 프레임화하는 중첩 서열 사이의 상동성 재조합을 통해 발생하는 복제-적격성 Ad(RCA)에 의한 내재적 오염이다[33]. RCA는 바이러스 탈피를 통해 방관자에게 수평 전염될 능력이 있는 감염된 숙주에서 복제할 수 있기 때문에 생물학적위험물질을 나타낸다[30]. RCA의 문제점을 우회하기 위해, RCA-무함유 Ad 벡터는 PER.C6 게놈과 중첩성 서열을 함유하지 않는 PER.C6-화합성 셔틀 벡터를 사용하여 사람 PER.C6 세포에서 생성되었다[34,35]. 복제성 Ad4 및 Ad7과 달리, 비복제성 Ad5는 바이러스 증폭의 수행 불능성 및 낮은 pH, 위장 및 췌장 프로테아제 및 세포외 뮤신에 대한 민감성으로 인해 경구 투여했을 때 효과적으로 동물을 면역화하지 못한다[36].
경구 경로로 투여 후 관찰되는 문제점에도 불구하고, 비복제성 E1/E3-결손성(△E1E3) Ad5(도 9b)는 돌연변이유전자를 수용하는 높은 능력, 고역가 생산, 고효율 유전자 전달 및 고 수준의 돌연변이유전자 발현(최소 초기 방출량으로서)으로 인해, 다수의 치료 실험에서 비경구 유전자 요법 벡터로서 개발되고 사용되었다[35]. 하지만, Ad5는 돌연변이유전자 발현이 일시적이기 때문에 고전적 유전자 요법의 이상적인 벡터는 아니다[35]. 따라서, Ad5 벡터의 사용은 일반적으로 지속적인 돌연변이유전자 발현을 필요로 하는 유전자 요법의 주요 목표를 충족시키지 못한다. 게다가, 사람 집단에서 기존 Ad5 면역성의 공통적인 존재[37-39] 및 벡터를 1차 접종한 후의 항-Ad5 면역 반응의 급속 발달[40, 41]은 유전자 전이 효율을 제한하여 임상 용도를 방해했다. 이러한 단점을 우회하는 전략으로는 혈청형 전환, 캡시드 변형 및 비사람 Ad 벡터의 개발을 포함하며, 단 다른 Ad 벡터는 기존 Ad 면역성에 의해 초기 벡터가 불능화된 경우 대체될 수 있다는 가정 하에서이다. 사람 Ad3, Ad4, Ad35, Ad41 또는 Ad11이나 Ad35 섬유를 함유하는 키메라성 Ad5는 비복제성 Ad 벡터로 생체공학적으로 처리된 바 있지만(도 10), Ad5는 임상전 동물 모델에서 다른 혈청형보다 여전히 더욱 강력하고 더 안전하다[42]. 다수의 비사람 Ad, 예컨대 소 Ad[43]. 돼지 Ad[43] 및 비사람 영장류 Ad[44]도 Ad 벡터의 레퍼터리를 확장시키기 위해 개발되었다(도 10). 돼지 Ad-벡터화된 백신은 최소한 마우스의 Ad5 대응부만큼 강력할 수 있지만[45], 비사람 Ad가 예측할 수 없는 사람 병을 유도할 위험성이 있기 때문에 사람 Ad5는 여전히 최고의 유전자 전달 벡터이다[46]. 사람 Ad5의 게놈은 다른 Ad 혈청형과 동시감염 후에도 야생에서 놀라울 정도로 안정하다[47]. 게다가 Ad5 벡터는 자신의 DNA 게놈에서 병원체 항원을 암호화(도 10)하는 것 외에도 헥손-캡시드 단백질[49] 또는 pIX에 병원체 에피토프를 융합시킨 후 표면에서 이종 항원을 전시[48]하도록 추가 개발되었다. E2b를 결실시키거나[50,51] 또는 전도된 말단 반복서열 및 포장 시그널을 제외한 거의 모든 Ad5 서열을 결실시켜(무력한 Ad) 면역원성이 저하된 Ad5 벡터가 개발되었다(도 10)[52]. 지금까지, 이러한 복잡한 전략들은 완전한 임상적 향상을 초래하지 못했다.
Ad5의 근육내 또는 정맥내 주사와는 대조적으로, 비내 투여(Ad5 감염의 자연 경로)는 △E1E3 Ad5-벡터화된 백신이 마우스[41,53], 비사람 영장류[54] 및 사람[19]에서 효력을 인지가능할 정도로 상실함이 없이 기존 Ad5 면역을 우회할 수 있게 할 것이라는 것이 확인되었다. 이러한 관찰들은 예상컨대 기도의 점막 장벽을 따라 고효율의 유전자 전달, 강한 돌연변이유전자 발현 및 강력한 항원 제시의 결과인 것으로 생각된다. 따라서, 항-Ad5 면역성은 더 이상 넘을 수 없는 제한 요인이 아니며, 생체공학적으로 처리된 Ad 벡터의 개량은 더 이상 Ad-벡터화된 백신의 추가 개발을 위한 필수조건이 아닐 수 있다.
Ad5 벡터의 평판은 그 개발 동안 여러 번 붕괴되었다. 기존 Ad5 면역성 외에도, 사람 유전자 요법 실험[55] 동안 간동맥 내로 고용량의 Ad5-OTC 벡터가 주입된 후 부분 오르니틴 트란스카바밀라제(OTC) 결손증이 있는 환자의 사망은 Ad5를 대중이 위험한 벡터라고 인식하게 만들었다. 증거는 순환계(Ad 감염의 비자연 경로) 내로 Ad 입자의 주입이 안전하지 않은 시도이며 그 이유는 Ad 입자가 주사후 빠르게 전신 염증을 유도하고[56,57], 다양한 Ad 혈청형이 아마도 혈소판과의 상호작용을 통해 응집 활성화를 유발[42]하기 때문이라는 것을 보여준다. Ad5-벡터화된 HIV 백신의 대규모 사람 실험(단계 연구) 동안, 근육내 주사에 의한 투여는 HIV 바이러스 부하량을 저하시키지 못했고 백신접종은 Ad5-혈청양성 피검체에서 사람 HIV 감염의 위험성 증가와 연관이 있었다[58, 59]. 이러한 반직관적인 결과는 또 다시 벡터의 오용에 기인할 수 있는데, 그 이유는 Ad5-벡터화된 백신의 효능이 세포 면역을 유도하는데 있어서 다른 바이러스 기반 및 비바이러스 기반의 백신 플랫폼의 효능을 능가하기 때문이며[60]; 결과적으로, Ad5-유도된 CD4+ T 세포의 팽창은 CD4+ T 세포가 HIV 감염에 특이적인 표적인 바 이 특정 질병을 악화시킬 것이다[61]. 또한, 사람 피검체는 단계 연구[58,59] 동안 Ad5 입자의 근육내 주사에 의해 면역화되었는데, 이는 HIV와 같은 점막 병원체에 대항하여 점막 면역성을 유도해내는 데에는 그다지 강력하지 않은 것이다[14,62,63].
현행 아데노바이러스-벡터화된 백신의 현실성 점검. 안전하고 효과적인 차세대 백신을 개발하기 위해, 백신은 높은 유익유해비로 빠르게 방어 면역을 유도하는 것이 중요하다. 백신의 제조, 분배 및 투여는 용이하고 신속하며 경제적이어야 한다. 또한, 조제된 백신 및 최종 충진된 제품의 내재적 안전성은 저온유통체계없이 장기간 저장할 수 있게 해야 한다.
표 2에서 밝혀진 바와 같이, 매우 다양한 병원체에 대한 방어 면역성은 Ad-벡터화된 백신으로 면역화된 후의 마우스, 기니아 피그, 닭, 햄스터, 코튼 래트, 라쿤, 스컹크, 돼지 및 사람을 제외한 영장류에서 유도되었다. 종합해보면, Ad-벡터화된 백신은 동물 모델에서 다른 종류의 백신보다 생 병원체에 대한 빠르고 더욱 강력한 방어성을 부여할 수 있다.
Ad-벡터화된 백신의 다수의 사람 임상 실험이 수행되었지만, 독성 생 병원체에 의한 공격을 받은 면역화된 사람 피검체는 거의 없었다(표 3). 특히, DNA 및 Ad5-벡터화된 말라리아 백신(DNA-초회감작된/Ad5-추가접종된)의 근육내 주사에 의해 면역화된 사람 지원자의 서브세트는 Ad5-혈청음성 사람 피검체에서 모기 물림(mosquito feeding) 후 생(live) 말라리아 스포로조이트 공격에 대하여 방어되었다. Ad5 추가접종 없이 단독적인 DNA 백신접종은 말라리아에 대하여 사람을 방어하지 못한 것으로 관찰되었고; Ad5 백신접종이 단독적으로 방어를 부여할 수 있는지의 여부는 여전히 연구되어야 한다[64]. 면역화된 사람이 대부분의 사람 실험 동안 생 병원체에 의한 공격을 받지는 않았지만(표 3), 사람에서의 Ad 벡터 사용에 대한 광범한 안전성 데이터베이스를 제공했다.
아데노바이러스-벡터화된 비측 백신의 효력 및 안전성. 앞서 설명한 바와 같이, 비측 백신접종은 무바늘 방식으로 강력한 점막 면역성을 유도한다. 기도 DC는 선천 면역과 후천 면역을 이어주는, 비기도(nasorepiratory tract) 내에서 인접 상피하 망구조를 형성한다. 기도 내 DC의 밀도는 더 많은 양의 흡입 항원에 노출된 영역에서 가장 높다[65]. 사람에서 발데이어(Waldeyer) 고리를 구성하는, 비인강-관련 림프구 조직은 B 세포 반응 및 형질세포 발생의 독특한 유도 부위이다. 따라서, 비측 백신접종은 기도 내에서 분비성 IgA 항체의 형성을 비롯한 체액 면역을 유도해내기 위한 견인제(driver)이다[66]. 국소 체액 면역 반응은 사람을 제외한 영장류 내로 Ad-벡터화된 백신의 비내 투여 후에 비측, 질 및 타액 분비물에서 유도되었다[67]. Ad5-벡터화된 비측 백신은 마우스의 점막 분비물과 혈청에서 주사성 백신보다 더 큰 항원-특이적 IgA 반응을 유도해냈다[68]. 체액 면역 외에도, 세포 면역반응은 접종 경로와 상관없이 Ad-벡터화된 헤르페스 백신에 의한 마우스의 면역화 직후에 전신 및 점막 면역 구역에서 관찰되었다; 하지만, 면역기억 세포독성 T 림프구 반응은 점막 또는 전신 면역화 후, 각각 수개월 후 면역화 시[14] 점막 또는 전신 림프구 조직에만 구획화되었다.
DNA-초회감작된/Ad5-추가접종된 말라리아 백신은 Ad5-혈청음성 사람 피검체에서 생 말라리아 스포로조이트 공격에 대한 방어를 유도했지만, 5명의 Ad5-혈청양성 사람 지원자들의 방어 실패[64]는 기존 Ad5 면역에 기인할 수 있다[37,38,40,41]. 앞서 설명한 바와 같이, 이러한 장애를 우회하는 1가지 시도는 Ad-벡터화된 백신을 비측 투여로 접종하는 것이고, 이는 주사성 백신의 단점인 것을 후속 Ad5 재투여의 효과 감소 없이 비침습적 점막 백신의 장점으로 레버리지한다[19,41,53,54]. Ad5-벡터화된 비측 백신은 전신 면역화가 아닌 비내 면역화가 점막 조직에서 장기간 세포독성 T 림프구를 유도한다는 발견으로 입증되는 바와 같이[14], 기도에서 집중적인 점막 면역을 유도할 수 있다. 또한, Ad5-벡터화된 비측 백신은 전신 면역화가 더욱 강력한 전신 면역 반응을 유도하지만, 전신 면역화가 실패할 때 점막 병원체에 대하여 동물을 방어할 수 있다[63,69,70]. 비측 백신접종에 의해 유도된 집중적인 점막 면역 반응이 감염되지 않은 내부 조직과 기관에 대한 전신 부담(예, 전신 염증)을 상당히 감소시킬 수 있다는 가설은 CD103+ 점막 DC가 나이브(naive) T 세포의 Foxp3+ 조절 T 세포로의 변환을 조장하여 염증 반응을 약화시킬 수 있다는 발견에 의해 입증되었다[71].
전신으로 전달된 Ad 입자에 의해 유도된 일반적인 부작용은 주사 후 다수의 Ad 입자가 간에 격리됨으로 인한 간 손상과 전신 독성이다[72]. 비경구 주사와는 반대로, Ad의 생체분포는 비내 투여 후 폐에 제한적이고[73] 어떠한 내부 기관에서도 염증은 전혀 관찰되지 않았다[68].
비강은 뇌에 근접하기 때문에, 비측 분무 후 Ad5 입자가 뇌에 염증 및 독성을 유도할 수 있는지를 측정하는 것은 중요하다. 사람 신경계 장애와 관련이 있는 인플루엔자와 달리[74], Ad5에 의한 자연 감염은 사람에게 뇌염을 유도하는 것으로 보고된 적은 없다. 마우스에게 비내 투여된 △E1E3 Ad5 벡터는 후각망울 이외에서 돌연변이유전자 발현을 매개하지도 않았고, 뇌에 염증을 유도하지도 않았다[68]. 따라서, 비측 전달 후 Ad5의 유의적인 양은 뇌로 유입될 수 없다고 생각할 수 있다. 소수의 Ad5 입자가 때로 뇌로 침투할 수 있지만, 비복제성 Ad5는 복제 및 후기 유전자 발현을 통한 부작용의 증폭 불능성으로 인해 복제성인 야생형 Ad5보다 해롭지 않을 것이다. 생-약독화된 인플루엔자 바이러스 백신(LAIV; 미국에서 FluMist®로 공지되어 있음)의 안전성 프로필[75]은 LAIV가 온도가 낮은 기도에서만 복제할 수 있고 저온-적응된 LAIV에게 너무 뜨거운 뇌에서는 복제할 수 없기 때문에, 인플루엔자 바이러스-유도 뇌염[74]이 뇌에서의 바이러스 복제를 기인할 수 있다는 가설을 확증한다. TLR-3 결손성 환자에서의 헤르페스 단순 뇌염의 유도[76]는 소량의 바이러스가 후삭을 통해 뇌로 침투하는 것은 흔한 일일 수 있고 뇌에서 조절불가능하게 복제하기 전에 바이러스를 저지하는 효과적인 방어 기전이 면역적격 사람에게 존재한다는 것을 암시한다. 복제성 야생형 Ad5에 의한 자연 감염은 뇌염과 관련이 없기 때문에, 비복제성 Ad5 벡터의 비측 분무는 백신 전달의 안전한 운반체를 추적하는데 있어서 견인제이다.
Ad5 벡터화된 HIV 백신의 근육내 주사를 통해 사람을 면역화하는 실수가 있었을 수 있지만[58,59], CD4+ T-세포 레퍼토리를 이동시키는 Ad5의 능력은 부분적으로 다른 병원체에 대하여 강력한 방어 면역을 유도해내는 견인제일 수 있다[41,53,63,77-79]. 지금까지, Ad5 벡터화된 인플루엔자 백신의 비내 투여는 기존 Ad5 면역성의 존재 하에서도 심각한 부작용을 일으킴이 없이 사람 피검체에서 혈청전환을 유도했다[19]. 다수의 동물 모델(표 2)에서 유도된 확실한 방어 면역과 함께 사람(표 2)에서의 인플루엔자에 대한 혈청전환[19] 및 말라리아에 대한 살균 면역의 유도[64]는 종합적으로 질병을 예방하는데 있어서 Ad 벡터화된 백신의 가치를 입증한다.
LAIV는 사람 집단의 서브세트(미국에서 2 내지 49세 연령)에 대한 면역화용으로 승인되었다[75]. LAIV와 같이, Ad 벡터화된 비측 백신은 적어도 대규모 필드 실험을 통해 안전성 프로필이 충분히 확립되기 전 초기 기간 동안에는 영아 및 장년층의 면역화에는 허용될 수 없다고 생각할 수 있다. 게다가, 비측 백신접종은 호흡기 병(예, 천식)이 있는 사람에게는 권장할 수 없다. 임산부가 비복제성 Ad 입자를 이용한 비측 백신접종에 순응성일지의 여부는 아직 연구해야할 과제이다.
Ad 벡터화된 백신 및 다른 재조합 DNA 기반 백신의 상업화 전망. RCA 오염이 없는 비복제성 △E1E3 Ad5-벡터화된 백신[35]은 비허용 세포에서의 복제 능력 없이 단백질 캡시드에 매립된 선형 DNA 게놈으로 이루어지기 때문에 DNA 백신의 변형체로 분류될 수 있다(도 9a). 유전자총[80,81], 주사기 바늘[82] 또는 일렉트로포레이터[83]와 같은 침투 기구를 사용하여 훈련된 자에 의해 접종되어야 하는 나출형 DNA 백신과 달리, Ad 입자는 비측 전달 후 점막 장벽을 따라 세포에 자율적으로 침투할 수 있다[35]. DNA 백신이 당대의 백신과 관련된 다수의 잠재적 안정성 문제를 앞서고, 재조합 DNA 기술이 적은 비용으로 빠르고 창조적으로 신규 백신을 생성할 수 있을지라도[80,82], 10년 전 만해도, DNA 백신은 과학계에서 허용이 제한된 증명되지 않은 신규물질이었다. 지금까지, 4가지 나출형 DNA 백신이 시판 규모의 동물용으로 승인되어 있다[84]. 293 세포에서 생산된 p53을 암호화하는 RCA-오염된 Ad5 벡터는 2004년 이래로 중국에서 다수의 암 환자를 치료하기 위한 용도로 승인되었다[85]. 수년간의 사용량 증가 및 신중한 환자 추적 조사의 결과로서 임상상이 밝혀지기 시작하는 바, 유망한 데이터는 감염성 질환에 대한 공중보건 무기고 중의 필수 도구 중 하나로서 Ad 벡터화된 백신과 함께 재조합 DNA 기반 백신 시대의 도래를 알릴 수 있을 것으로 생각한다.
저장 중에 Ad 벡터 생존성 유지. 안전성 및 효능 외에도, 차세대 백신은 저온시설체계에 덜 의존적이어야만 세계의 가장 풍족하지 못한 집단에게도 백신을 널리 보급할 수 있다. 지금까지, 신규 포뮬레이션들은 Ad 벡터가 4℃의 액체 완충액에서 적어도 1년 동안 저장되도록 하고[86]; 45℃에서는 탄수화물 유리에서 적어도 6개월 동안 저장되고[87]; 또는 4℃에서 동결건조된 무수 분말로서 적어도 1년 동안 저장되도록 했다[88]. 실온에서 Ad 입자를 액체 또는 동결건조 형태로 저장하는 특허권이 있는 기술들도 스타빌리테크[202]에서 개발되었다. 정리하면, RCA 무함유 Ad5 벡터는 무혈청 PER.C6 현탁 세포에서 빠르게 제조되고 컬럼 크로마토그래피로 용이하게 정제될 수 있으며 저온유통체계 없이 저장 및 운송될 수 있는 최종 충진 제품으로서 조제될 수 있다(도 5).
병원체에 대하여 빠르고 지속적이며, 끊임없는 방어를 부여하는 아데노바이러스 벡터화된 약물-백신 듀오. 출원인은 최근 Ad5 게놈에서 암호화된 병원체 항원의 존재 여부에 상관없이 △E1E3 Ad5 입자의 근육내 주사가 아닌 비내 투여가 적응 면역이 유도되기 전에 인플루엔자에 대한 예방 요법을 부여할 수 있다는 것을 입증했다[89]. 따라서, 병원체 항원을 암호화하는 Ad5 벡터는 약물-백신 듀오(DVD)로서 병원체에 대하여 빠르고 지속적이며 끊임없는 방어를 유도할 수 있다. Ad5 벡터화된 인플루엔자 DVD는 승인된 인플루엔자 백신(표 3) 및 약물(표 5)과 비교했을 때 많은 장점을 부여한다. 마우스에 대한 △E1E3 Ad5 입자의 투여가 광범한 일련의 염증성 사이토킨 및 케모킨[56], 예컨대 I형 인터페론(IFN-α 및 IFN-β)의 생산을 빠르게 유도하고[90], 폐 DC를 손상시키며[91], 자연 킬러 세포를 활성화시키고[92], 항바이러스성 산화질소의 생성을 유도하고[57], Ad5와 혈액 단백질, 혈소판, 대식세포, 내피세포 및 각각의 실질세포 사이에 다면적인 상호작용을 촉발[56]한다는 것은 기록되어 있다. △E1E3 Ad5 입자에 의해 유도된 다수의 반응은 조합하여 기도에서의 항인플루엔자 상태를 확립시킬 수 있고, 이에 따라 인플루엔자 바이러스가 쉽게 우회할 수 없는 다차원적 방어 장벽을 산출하는 것으로 생각할 수 있다.
예방적 인플루엔자 치료법은 복합 박테리아 용균물[93] 또는 박테리아 독소[94]의 비내 투여에 의해 수행될 수 있지만, 박테리아 성분-유도된 항인플루엔자 상태는 매우 일시적이어서, 이의 방어 효과는 치료법후 며칠 이내에 감소한다[93,94]. Ad5 유도된 방어 효과가 단일 용량 치료요법 후[89] 적어도 3주 동안 지속할 수 있고 47일째 단지 부분 감소가 관찰된다는 발견은 박테리아 성분 상태와 △E1E3-Ad5-유도된 항인플루엔자 상태 사이의 기본 기전이 다를 수 있음을 암시한다. 특히, Ad5-매개의 치료법만으로도 DVD의 백신 성분은 이의 약물 효과가 감소하기 전에 적응 면역을 유도해내기에 충분한 시간을 허용할 것이다(도 11). 게다가, 소화관-관련된 박테리아 독소를 인플루엔자 약물로서 기도로 투여하는 것[94]은 면역계를 놀라게 하여 진화 의학의 핵심 원리를 위반하는 것이며, 이러한 비자연적 치료요법은 사람 피검체에서 벨마비 유도와 연관성이 있었다[7,8].
인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 약물(예, M2 이온 채널 차단제[아만타딘, 리만타딘] 또는 뉴라미니다제 억제제[오셀타미비르, 자나미비르])에 의해 억제될 때, 약물 내성 균주로 서서히 변이한다[95]. 당대의 인플루엔자 약물과 달리, Ad5-벡터화된 DVD는 예상컨대 인플루엔자 바이러스에 직접 영향을 미침이 없이 기도에서 거주지를 변화시킬 것이며; 이에 따라 Ad5 입자는 약물 내성을 유도하기 위해 인플루엔자 바이러스에 어떠한 변이 압력도 부여하지 않는다. 약물처리된 동물에서 후속 점막 병원체 감염에 대한 취약성을 증가시킬 위험이 있는 점막 면역의 오셀타미비르-유도 억제[96]와 대조적으로, Ad5-벡터화된 DVD는 최소한 인플루엔자 환경에서 방어 점막 선천 면역성을 증강시킨다[89]. 승인된 비측 LAIV(예, FluMist)는 생 인플루엔자 바이러스를 함유하므로[35], 인플루엔자 약물과 LAIV의 공동투여는 약물이 생 인플루엔자 바이러스를 사멸시켜 백신을 무능화할 것이기 때문에 비생산적이다. Ad5-벡터화된 DVD는 약물 표적(예, 이온 채널 또는 뉴라미니다제)의 결여로 인해 승인된 인플루엔자 약물과 화합성일 뿐만 아니라(표 4), 백신 능력 외에 스스로 약물로서 예방 요법을 부여하기도 한다(표 5)[89].
인플루엔자는 Ad5 입자에 의해 저지될 수 있는 유일한 질병일 가능성은 없고; 또한 Ad5가 만병통치약처럼 모든 질병에 대응할 수 있을 가능성도 없다. 관찰결과들은 단지 Ad5-벡터화된 DVD의 단일 비내 투여가 예비임상 동물 모델에서 여러 주 동안 최소 점막 호흡기 병원체의 서브세트에 대하여 예방 요법을 부여할 수 있고 DVD의 사용은 약물 내성을 유도할 수 없어야 한다는 것을 보여준다. DVD 백신 성분에 의한 지속적인 방어 면역의 후속적 유도는 효능을 강화시킨다. DVD 플랫폼의 개발은 아마도 매우 다양한 질병 환경에서 새로운 임상 전략의 개발을 조장할 것이다.
아데노바이러스-벡터화된 백신에 의한 동물의 집단 면역화. 표 2에서 보여주듯이, Ad-벡터화된 백신은 농장 동물뿐 아니라 야생 동물을 집단 면역화하기 위해 개발되었다. 특히, 닭은 조류 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌을 암호화하는 사람 Ad5 벡터를 근육내 주사[78], 난 내 투여[97-101], 또는 에어로졸 분무[102,103]하여 조류 인플루엔자(아마도 다른 가금류 질병에 대해서도)에 대하여 면역화될 수 있다. 따라서, 가금류의 집단 면역화에서 Ad5-벡터화된 백신의 다재다능성은 다른 가금류 백신을 능가한다. 또한, 돼지도 Ad5-벡터화된 백신에 의해 성공적으로 면역화되었다[104,105]. 경구 개의 Ad-벡터화된 광견병 백신은 야생견을 집단 면역화하기 위해 먹이로서 개발되었다[106]. 종합해보면, Ad-벡터화된 백신은 집단 면역화 프로그램에서 유망한 도구로서 떠오르고 있다.
결론. 증거는 Ad-벡터화된 백신과 신규 DVD가 잠재적으로 획기적인 시도를 제공하는 것으로, 정확하게 디자인되고 쉽게 제조되며 고도로 효과적인 DVD가, 다른 시도들에서 관찰된 부작용 프로필, 저장 불안정성 또는 제조 문제점들 없이, 매우 다양한 질병 환경에서 사람과 동물의 빠르고 지속적이며 끊임없는 방어를 부여하도록 한다는 것을 보여준다.
전문가 논평. 백신 적용범위를 세계적으로 더 높이기 위해, 낮은 비용으로 빠르게 제조될 수 있고 저온체계를 요구함이 없이 비의료진에 의해 집단 투여될 수 있는 신세대 백신의 개발이 시급하다. Ad5-벡터화된 백신은 이러한 기준에 부합한다. DVD 플랫폼의 개발은 약물 내성에 의해 손상되지 않는 단일 패키지로 백신과 약물을 통합시켜 의료 전망을 잠재적으로 변화시킬 수 있다.
5년 검토. Ad5-벡터화된 비측 인플루엔자 백신의 2가지 사람 I단계 임상 실험은 유망한 결과로 완료되었다. Ad5 벡터화된 DVD의 비측 분무 후 생 인플루엔자 바이러스를 이용한 사람 피검체의 공격은 5년 이내에 수행될 예정이다. Ad5-벡터화된 가금류 백신은 5년 이내에 시판에 들어갈 예정이다.
핵심 문제. 빠르게 제조될 수 있고 위기 중에 비의료진에 의해 집단 투여될 수 있는 신세대 백신의 개발은 절실하다. 복제-적격성 아데노바이러스(RCA) 무함유 아데노바이러스(Ad)5-벡터화된 백신은 수요의 단계적 확대에 대해 대응하여 무혈청 배지에서 PER.C6 현탁 세포로부터 낮은 비용으로 빠르게 생산될 수 있다. RCA-무함유 Ad5-벡터화된 백신은 비측 분무에 의해 사람에게 집단 투여될 수 있을 뿐만 아니라 자동 난내 투여 및 에어로졸 분무에 의해 가금류에게 집단 투여될 수 있다. 야생동물은 개의 Ad-벡터화된 경구 백신을 함유하는 먹이로 집단 면역화될 수 있다. Ad-벡터화된 백신은 특이적 면역반응성의 핵심인 잘 정의된 항원을 기반으로 하는 고도의 특이적 면역 중재를 유도할 수 있다. RCA-무함유 Ad5 벡터는 비복제성이고 처치가 진화 의학에 따르는 것이기 때문에 사람에게 이 벡터의 비측 투여는 어떠한 안전성 문제도 없어야 한다. Ad5 벡터에 의한 가금류의 집단 면역화는 닭 세포가 사람 Ad5의 복제를 지원하지 않기 때문에 어떠한 안전성 문제도 없어야 한다. 닭은 백신접종 후 면역 레퍼토리가 유익한 면역 방어쪽으로 이동한 후 Ad5를 빠르게 제거할 것으로 생각된다. DNA-초회감작된/Ad5-추가접종된 말라리아 백신은 모기 물림 후 생 말라리아 스포로조이트 공격에 대하여 사람 피검체를 성공적으로 방어했다. Ad5-벡터화된 비측 백신은 약물 유사 방식으로 인플루엔자에 대한 빠른 방어를 부여하는 것으로 우연히 밝혀졌다. 약물 내성에 의해 손상되지 않는 단일 패키지로 약물과 백신을 통합시킨 약물-백신 듀오의 개발은 기본적으로 인플루엔자 약물과 백신이 제조되는 방식을 변화시킬 것이다. 종합해보면, 전신 백신접종에 의해 유도되는 더 많은 부작용이 확인되었다. 비침습적 점막 면역화는 전신 면역화보다 점막 병원체에 대한 방어를 부여하는데 있어서 더욱 안전하고 더욱 효과적이다.
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실시예 4. 아데노바이러스-벡터화된 인플루엔자 급속 및 지속적인 면역학적제제-치료제
Ad5-벡터화된 인플루엔자 RAPIT의 목표는 적은 비용으로 대량 생산할 수 있고 비의료진에 의해 집단 투여될 수 있으며; 약물 내성을 유도할 가능성 및 야생 인플루엔자 바이러스와의 재편성 가능성 없이 인플루엔자에 대하여 빠르고/지속적인 방어를 부여하는 능력이 있는 인플루엔자 급속 및 지속적인 면역학적 제제-치료제(RAPIT)를 개발하는 것이다. 인플루엔자 바이러스의 전파 및 면허증이 있는 의료진에 의한 바늘 주사도 필요 없다.
인플루엔자 바이러스의 증식 없이 Ad5-벡터화된 인플루엔자 백신을 급속 제조하는 것이 가능하다. 인플루엔자 바이러스에서 증식은 균주마다 다르고, 일부 균주는 치명적이며, 재편성 및 돌연변이 발생이 쉽고 난(egg)에서 저 역가 방어성이 있다. 인플루엔자 HA를 암호화하는 Ad 벡터에서는 증식률이 더욱 일정하고 이 벡터는 양성이며 재편성 발생도 없으며, PER.C6 세포에서 고역가 생산되고 신규 RCA-무함유 Ad는 1개월 내에 AdHigh 시스템으로 제조할 수 있다.
배양된 현탁 세포에서 Ad5-벡터화된 인플루엔자 백신은 대량 생산될 수 있다. Ad-벡터화된 플루 백신의 경우, Ad 내로 인플루엔자 HA의 클로닝에는 인플루엔자 바이러스의 증식을 필요로 하지 않고 500리터 웨이브 생물반응기는 무혈청 배지에서 PER.C6 현탁 세포로부터 한번에 1016 Ad 입자를 생산할 수 있고, Ad 입자는 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있고, Ad-벡터화된 플루 백신의 생산은 수요의 점진적 증가에 대한 빠른 반응으로 간소화될 수 있다. 종래의 플루 백신의 경우, 일부 인플루엔자 바이러스 균주는 난에서 잘 증식하지 않고, 평균 수율이 난(egg)당 약 1 용량이며, 오염은 세포 배양물에서보다 난에서 확인하기가 더욱 어렵고, 난-관련 알러지가 있을 수 있고 처리가 까다롭다.
Ad5-매개의 유전자 요법 및 비측 백신접종은 다음과 같이 비교될 수 있다. 유전자 요법에서, 치료 단백질은 Ad로부터 발현되고 생물학적 효과는 형질도입된 세포에서 Ad로부터 발현된 치료 단백질의 정확한 용량에 의해 직접 유도된다. 비측 백신접종에서, 항원 단백질은 Ad로부터 발현되고, 항원이 제시되고 면역 반응이 형질도입된 세포 중의 Ad로부터 발현된 항원에 의해 촉발된 일련의 반응을 통해 유도된다. Ad에 대한 기존의 면역성이 Ad-벡터화된 비측 백신의 효능을 방해하지 않는다는 가설을 지지하는 보고서로는 문헌[Shi Z et al. J. Virol. 75: 11474, 2001 (마우스), Hoelscher MA et al. Lancet 367: 475, 2006 (마우스), Croyle MA et al. PLoS ONE 3: e3548, 2008 (마우스), Song K et al. PNAS 107: 22213, 2010 (마커크) 및 Van Kampen KR et al. Vaccine 23: 1029, 2005 (사람)]이 있다.
Ad5-벡터화된 비측 조류 인플루엔자 백신의 사람 단계 I 임상 실험에 대한 연구 디자인은 다음과 같다. AdhVN1203/04.H5 벡터는 A/VN/1203/04(H5N1) 조류 인플루엔자 바이러스의 HA1+HA2를 암호화했다. 이 연구는 무작위로, 이중맹, 위약-대조된 단일 부위 연구였다. 상승 용량 108, 109, 및 1010 vp의 3 집단을 사용했다. 용량은 비측 분무로 투여했고 0일과 28일에 2회용량을 투여했다. 지원자는 19세부터 49세까지 총 48명의 건강한 지원자였다. 용량 집단마다 4명의 위약 대조군을 포함해서 용량 집단당 16명의 사람 피검체를 사용했다. 세포 배양물은 무혈청 배지에서 PER.C6 현탁 세포에서 제조한 것을 기반으로 하는 RCA 무함유 세포 배양물이었다. 30% 이상의 피검체에서 호흡계에 나타나는 부작용은 콧물, 비측 자극, 비측 울혈, 기침 및/또는 인후통을 포함했다.
실시예 5 호흡기 병원체에 대한 광범위 급속 및 지속적인 면역학적제제-치료제(RAPIT)로서의 아데노바이러스 입자
도 14는 포자 공격 직전에 아데노바이러스 입자의 비내 점적에 의한 예방적 탄저병 치료법을 도시한 것이다.
방법. AdE(돌연변이유전자가 없는 E1/E3-결손성 Ad5 빈 벡터) 및 AdVAV(탄저균 방어 항원을 암호화하는 E1/E3-결손성 Ad5 벡터) 입자는, 탄저균 Sterne 포자 1x105 cfu (~25xLD50)를 비내 공격하기 직전에, 단일 용량 치료요법으로 0.05ml 부피를 어린(2개월령) 암컷 A/J 마우스의 비공 내로 적가식으로 비내(i.n.) 투여했다. 공격된 동물은 14일 동안 매일마다 생존에 대해 모니터했다.
결과. 공격 2일 전에 투여된 AdVAV 입자는 탄저병에 대하여 마우스의 67%를 방어했다; 공격 2일 전에 투여된 AdE 입자는 탄저병에 대하여 마우스의 30%를 방어했다; 공격 1일 전에 투여된 AdE 입자는 탄저병에 대한 마우스의 22%를 방어했다; 미처리된 대조 마우스 및 희석된 AdE 입자 투여된 마우스는 모두 5일 이내에 탄저병으로 죽었다. AdVAV/-2, 1.3X108 ifu 용량으로 공격 2일 전에 비내 점적된 AdVAV 입자; AdE/-2, 1.3X108 ifu 용량으로 공격 2일 전에 비내 점적내 AdE 입자; AdE*/-2, 1.3X106 ifu 용량(PBS에 100배 희석)으로 공격 2일 전에 비내 점적된 AdE 입자; AdE/-1, 1.3X108 ifu 용량으로 공격 1일 전에 비내 점적된 AdE 입자; 대조군, 미처리된 대조용 마우스; 괄호 안의 수는 각 그룹의 동물 수를 나타낸다.
유의성. 데이터는 AdE 입자 또는 AdVAV 입자가 아마도 감염된 동물에서 탄저균의 증식을 방해하는 선천적 면역의 특정 부문을 활성화시켜, 약물 유사 방식으로 예방적 탄저병 치료법을 부여할 수 있음을 암시한다. 데이터는 AdVAV로부터 발현된 PA 유전자가 탄저병에 대한 AdE 매개의 방어와 상승작용을 부여할 수 있음을 암시한다. AdVAV 입자의 비측 분무는 위기 동안 다른 탄저병 백신보다 탄저병에 대하여 더욱 빠른 방어를 부여할 수 있을 것으로 생각된다.
도 15는 AdVAV 입자의 비내 점적에 의한 노출후 탄저병 치료법을 도시한 것이다.
방법. AdVAV 입자는, 탄저균 Sterne 포자 4X105 cfu (~100xLD50)를 비내 공격하기 전 또는 후에, 단일 용량 치료요법으로 0.05ml 부피를 어린(2개월령) 암컷 A/J 마우스의 비공 내로 적가식으로 비내(i.n.) 투여했다. 시프로플록사신은 30mg/kg 용량으로 복강내 주사로 투여했다(2일 동안 1일당 1회 주사; 공격 1시간 후 및 24시간 후에 주사됨). 공격된 동물은 14일 동안 매일 마다 생존에 대해 모니터했다.
결과. 공격 2일 전에 투여된 AdVAV 입자는 탄저병에 대하여 마우스의 40%를 방어했다(도 1의 결과 확인); 공격 1시간 후 투여된 AdVAV 입자는 사망을 지연시켰으나 생존률을 향상시키지는 못했다; 공격 1시간 후 주사된 시프로플록사신도 생존률의 향상에 대한 성공 없이 사망을 지연시켰다; 공격 1시간 후 시프로플록사신 주사와 함께 투여된 AdVAV 입자는 탄저병에 대하여 마우스의 56%를 방어했다; 미처리된 대조용 마우스는 모두 5일 이내에 사망했다. AdVAV/D-2, 1.3X108 ifu 용량으로 공격 2일 전에 비내 점적된 AdVAV 입자; AdVAV/D0, 1.3X108 ifu 용량으로 공격 1시간 후에 비내 점적내 AdVAV 입자; AdVAV/Cipro/D0, 시프로플록사신 복강내 주사와 함께 1.3X108 ifu 용량으로 공격 1시간 후 비내 점적된 AdVAV 입자; Cipro/D0, 시프로플록사신의 복강내 주사; 대조군, 공격 전 처리되지 않은 미처리된 대조용 마우스; 괄호 안의 수는 각 그룹의 동물 수를 나타낸다.
유의성. 데이터는 AdVAV 입자가 항생제 처리와 함께 노출 후 탄저병 치료법을 부여할 수 있음을 암시한다. AdVAV와 항생제 사이의 상승작용이 이 실험에서 드러났다. AdVAV 입자의 비측 분무가 노출후 환경에서 항생제 사용의 필요성을 감소시킬 수 있는 것으로 생각된다.
실시예 6 호흡기 병원체에 대한 광범위 급속 및 지속적 면역학적제제-치료제(RAPIT)로서의 아데노바이러스 입자
최근, Ad5 게놈에서 암호화된 병원체 항원의 존재 유무에 상관없이 △E1E3 아데노바이러스 5형(Ad5) 입자의 비내(i.n.) 투여가 적응 면역이 유도되기 전에 인플루엔자에 대하여 예방 요법을 부여할 수 있다는 것이 입증되었다. 따라서, 병원체 항원을 암호화하는 Ad5 벡터는 약물-백신 듀오(DVD)로서 병원체에 대하여 빠르고 지속적인 끊임없는 방어를 유도할 수 있다. 마우스에 △E1E3 Ad5 입자의 투여는 광범한 일련의 염증성 사이토킨 및 케모킨, 예컨대 I형 인터페론(IFN-α 및 IFN-β)의 생산을 빠르게 유도하고; 폐 수지상 세포를 손상시키며; 천연 킬러 세포를 활성화시키고; 항바이러스성 산화질소의 생성을 유도하고; Ad5와 혈액 단백질, 혈소판, 대식세포, 내피세포 및 각각의 실질세포 사이에 다면적인 상호작용을 촉발한다는 것은 기록되어 있다. △E1E3 Ad5 입자에 의해 유도된 다수의 반응은 조합하여 기도에 항인플루엔자 상태를 확립시킬 수 있고, 이에 따라 인플루엔자 바이러스가 거의 우회할 수 없는 다차원적 방어 장벽을 산출하는 것으로 생각할 수 있다. 인플루엔자는 Ad5 입자에 의해 저지될 수 있는 유일한 질병일 가능성은 없고; 또한 Ad5 입자가 만병통치약처럼 모든 질병에 대응할 수 있을 가능성도 없다. 관찰결과들은 단지 Ad5 입자의 단일 비내 투여가 마우스에서 여러 주 동안 최소 점막 호흡기 병원체의 서브세트에 대하여 예방 요법을 부여할 수 있고, AdE 입자가 다른 바이러스에 대한 돌연변이 압력을 직접 부여함이 없이 기도에서 거주지를 변화시키기 때문에 DVD의 사용은 약물 내성을 유도할 수 없어야 한다는 것을 보여준다. DVD 백신 성분에 의한 지속적인 방어 면역의 후속적 유도는 효능을 강화시킨다. DVD 플랫폼의 개발은 아마도 매우 다양한 질병 환경에서 새로운 임상 전략의 개발을 조장할 것이다.
본 실시예의 목표는 호흡기합포체 바이러스(RSV)-감염된 코튼 래트(CR)에서의 박신(Vaxin) AdE(RSV 돌연변이유전자가 없는 Ad5 빈 벡터)로의 예방적 비내 처리를 평가하는 것이다. 이 연구의 종점은 미처리 코튼 래트에 비해 감염된 코튼 래트(약 60 내지 125g 중량)의 폐 삼출액(3ml) 및 비측 세척물(2ml)에 존재하는 바이러스 역가의 감소를 증명하는 것이다. 바이러스 정량은 플라크 감소 분석에 의해 수행될 것이다.
RSV-코튼 래트 모델에서의 예방적 효과: 코튼 래트(60 내지 125g 체중):
그룹 1: 부형제(A195 완충액)로 예방적(-2일)으로 비내 처리된 6CR.
그룹 2: AdE 2.4x108 ifu로 예방적(-30일)으로 비내 처리된 6CR.
그룹 3: AdE 2.4x108 ifu로 예방적으로(-2일) 비내 처리된 6CR.
그룹 4: 각 처리 사이클(초회감작/추가접종) 동안 AdE 2.4x108 ifu로 예방적으로(-30일 및 -2일) 비내 처리된 6CR.
그룹 5: AdE 2.4x108 ifu로 예방적으로(-5h) 비내 처리된 6CR.
공격 바이러스: RSV-Tracy(HEp-2 세포에서 증식된 P3 w.p.1/20/12), 이소플루란으로 약하게 마취된 코튼 래트(60 내지 125g)에 비내 투여된 2.25x105 PFU. 스톡: 2.25x106 PFU/ml.
AdE 벡터: 부형제(A195 완충액) 및 2.4x109 농도의 AdE는 -80℃에 저장했다. 사용 직전에 물질들을 실온으로 승온시켰다. 각 그룹에 대해 적어도 0.8ml의 각 처리(6CR/그룹 x 0.1ml 접종물)가 필요하다. 미사용 물질은 -80℃에 보관했다.
기관 및 샘플의 수집. CO2로 안락사시킨 후, 각 코튼 래트의 체중을 재고 성별과 연령을 기록했다. 폐의 좌엽과 하나의 큰 우엽을 떼어내어 외부 혈액 오염물을 제거하기 위해 멸균수로 세정하고 칭량했다. 좌엽은 26g3/8 바늘이 달린 3ml 주사기로 2% FBS-MEM(1:1, v:v)과 혼합된 15% 글리세린과 함께 이소코브(Iscove) 배지 3ml를 사용하여 흉막을 통해 세척하고 이 엽을 완전히 팽창시키기 위해 여러 부위로 주사했다. 세척액은 팽창된 엽을 부드럽게 편평하게 압착시켜 회수하고 동일한 기술에 따라 우엽을 흉막을 통해 세척하는데 사용했다. 세척액을 모아서 적정할 때까지 얼음에 보관했다. 상기도의 비측 세척을 위해 턱을 분리시켰다. 그 후, 머리를 분리하고, 2% FBS-MEM(1:1, v:v)와 15% 글리세린이 혼합되어 있는 이스코브 배지 1ml를 각 비공을 통해 밀어넣었다. 팔레트의 후방 구멍으로부터 유출액을 수집하고 적정 시까지 얼음에 보관했다. 샘플은 샘플 수집 종료 시에 일어나는 적정 전에는 동결하지 않는다.
RSV 트레이스 폐 세척물 역가(PFU/g 폐) 및 비측 세척물 역가(총 PFU).
분석 개시 24hr 전에 10% FCS에 제조된 거의 융합성인 HEp-2 세포 단층(20 내지 40x104 세포/웰)을 함유하는 24웰 조직배양판을 사용하여 플라크 분석을 수행했다. 각 분석을 개시할 때, 시험 샘플로 희석물(보통 일련의 log10)을 제조한다. 각 샘플 0.2ml를 2반복으로 웰에 첨가하고 때로 완만한 교반 하에 90분 동안 흡착시킨다. 접종물을 제거한 후 단층을 항생제, 비타민 및 다른 영양소를 함유하는 2% FBS-MEM 중의 0.75% 메틸셀룰로오스와 중층시킨다. 각 분석에는 조직 배양물과 양성 바이러스 대조군도 포함시켰다. 평판은 36℃, 5% CO2 배양기에 집어넣었다. 6±1일 후, 평판은 0.1% 크리스탈 바이올렛/10% 포르말린 용액(1.5ml/웰)으로 염색하고 실온에서 24 내지 48시간 동안 방치했다. 웰은 물로 세정했다. 플라크는 존재하면 쉽게 확인할 수 있다(매우 어두운 청색 배경 위의 투명 원). 20 내지 80개 사이의 플라크를 함유하는 웰 중의 모든 플라크를 계수하고 평균을 내어 바이러스 역가를 비측 세척액의 총 log10 PFU 또는 폐 또는 다른 기관의 조직 g당 log10 PFU로서 계산했다. 이 방법에 의한 검출 하위 한계는 약 1.5 log10 PFU/g 조직이었다.
AdE에 대한 항체 반응: 혈액은 -30일째 그룹 2 및 4(3CR/그룹)와 -2일째 그룹 2 및 4(6CR/그룹)의 안와신경총으로부터 수집했다. 혈액은 그룹 1 내지 5로부터 +4일째 수집될 것이다. 혈청은 -20℃에서 보관했다.
예비 샘플. 비측 세척물과 폐 세척액(그룹 1 내지 5)의 일정량을 모아서, -80℃에 보관했다. +4일째의 혈청 샘플도 모아서 -80℃에 보관했다.
Figure pat00006
약어: i.n., 비내; PFU, 플라크 형성 단위. 1N= 6 동물/그룹; 총 30동물. 2 모든 동물은 0일째 RSV-트레이스(약 2.25x105 PFU)로 비내 공격됨(100㎕).
Figure pat00007
약어: i.n., 비내; PFU, 플라크 형성 단위; gp, 그룹.
검사계획 0일:
9am⇒ 그룹 5를 i.n.AdE로 처리
2pm⇒모든 그룹을 감염시킴
+4일째 투약량 및 폐 중량 및 체중:
Figure pat00008
1 그룹 1 v 3,4,5 사이의 통계적으로 유의적인 차이가 있었다; 각각 P=0.41, 0.011 및 0.004.
2 그룹 1 v 5 사이에 통계적으로 유의적인 차이가 있었다; P = 0.047.
RSV-트레이시 비측 세척액 및 폐 세척액 플라크 감소 역가:
Figure pat00009
최소 검출 = 0.7 log10 총 PFU. 통계적 분석(스투던트 t 검정, 양측 검정) 최소 검출(0 플라크)은 0.35 log10 총 PFU로서 계산했다. 추가 유의적 P값: 그룹 5 v 2,4, P<0.02.
Figure pat00010
* 최소 검출 = 1.3 log10/g폐. **비측 세척액에 바이러스가 존재할지라도 플라크는 없었다. 따라서, 폐는 감염되지 않았거나 기술적 오류가 있는 것으로 추정되었다. 이러한 분석 데이터에는 포함시키지 않았다. 통계적 분석(스투던트 t 검정, 양측 검정)을 위해, 최소 검출(0 플라크)은 1.1 log10/g 폐로 계수했다. 다른 유의적 P 값은 없었다.
이와 같이 본 발명은 바람직한 양태를 상세히 기술했지만, 본 발명의 취지 또는 범위에서 벗어남이 없이 다수의 분명한 변형이 가능한 바, 이상의 문단들에 의해 정의된 본 발명은 상기 명세서에 제시된 특정 구체예들에 의해 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다.

Claims (2)

  1. 병원체 유래의 항원을 암호화하지 않고, 107 감염 단위(ifu) 이상의 E1 및 E3 결실된 아데노바이러스(adenovirus)의 유효량을 포함하는, 포유동물 피검체에서 호흡기 병원체에 대한 방어 반응을 유도하기 위한 조성물로서,
    상기 E1 및 E3 결실된 아데노바이러스는 병원체 유래의 항원을 암호화하지 않는 빈(empty) 아데노바이러스이고,
    상기 호흡기 병원체는 인플루엔자 바이러스, 호흡기합포체바이러스(RSV), 또는 탄저균 박테리아이며,
    상기 조성물은 비내로 투여되고,
    상기 반응이 투여 24시간 내에 시작되고 적어도 21일 동안 지속되는,
    조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 호흡기 병원체가 인플루엔자 바이러스 또는 탄저균 박테리아인 조성물.
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