JP2003530305A - 非侵襲的遺伝子免疫、それによる発現産物、およびそれらの使用 - Google Patents

非侵襲的遺伝子免疫、それによる発現産物、およびそれらの使用

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JP2003530305A JP2000615062A JP2000615062A JP2003530305A JP 2003530305 A JP2003530305 A JP 2003530305A JP 2000615062 A JP2000615062 A JP 2000615062A JP 2000615062 A JP2000615062 A JP 2000615062A JP 2003530305 A JP2003530305 A JP 2003530305A
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Abstract

(57)【要約】 動物における非侵襲的遺伝子免疫の方法および／または動物において全身性免疫反応または治療反応を誘導する方法、それら方法による産物、およびそれら方法およびそれら方法による産物の使用について開示および請求する。本方法は、動物において全身性免疫反応または治療反応を誘導するのに有効な量のベクターと動物の皮膚とを接触させることを含む。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 関連出願 本出願は、１９９９年５月３日出願の米国仮特許出願第60/132,216号に基づき
優先権を主張する。また、本出願は、１９９９年１０月５日出願の米国特許出願
第09/402,527号の一部継続出願である２０００年３月２３日出願の米国特許出願
第09/533,149号の一部継続出願である。米国特許出願第09/402,527号は、１９９
８年８月１３日出願の国際特許出願第PCT/US98/16739号の国内段階の一部継続出
願であり、その国際特許出願第PCT/US98/16739号は１９９７年８月１３日出願の
米国仮特許出願第60/055,520号および１９９８年２月１１日出願の米国仮特許出
願第60/075,113号に基づき優先権を主張する。それら特許出願およびそれら特許
出願において挙げられている文献（「特許出願引用文献」）、ならびにそれら特
許出願の本文中においてまたは手続き追行の間に引用された特許出願引用文献で
参照または引用されている文献、さらにはそのような手続き追行の間に提出した
特許性を支持する全ての抗弁は、参照によってこの中に組み込まれる。また、様
々な文献が本明細書において挙げられている（「特許出願引用文献」）。それら
特許出願引用文献、およびそれら特許出願引用文献において引用または参照され
ている文献も参照によってこの中に組み込まれる。
【０００２】 連邦政府援助 本発明に関連してなされた研究は、部分的に、国立衛生研究所からの補助金第
1-R43-AI-43802号によって援助された。米国政府は、本発明に関して特定の権利
を有する。
【０００３】 発明の分野 本発明は、概して、免疫学およびワクチン技術の分野に関する。また、本発明
は、免疫反応を誘導するための皮膚標的非侵襲的遺伝子輸送の技術、ならびにそ
の使用に関する。さらに、本発明は、動物における非侵襲的遺伝子免疫の方法お
よび／または動物において免疫反応（例えば全身性免疫反応）および治療反応（
例えば全身性治療反応）を誘導する方法、それら方法による産物、ならびにそれ
ら方法およびそれら方法による産物の使用に関する。さらに本発明は、動物にお
いて例えば全身性免疫反応のような反応を誘導するのに有効な量のベクターと、
動物の皮膚とを接触させることを含む前記方法に関する。さらに、本発明は、ベ
クターが、例えば抗原または医薬のような関心のあるエピトープまたは遺伝子産
物をコードする外因性核酸分子を包含および発現するような前記方法に関する。
さらに、本発明は、例えば全身性免疫反応または全身性治療反応のような反応が
、エピトープまたは遺伝子産物に対して誘導されるような前記方法に関する。
【０００４】 さらに、本発明は、核酸分子が：関心エピトープ；および／または関心抗原；
および／または免疫反応を刺激および／または調節し、および／または転写およ
び／翻訳等（例えば内因性および／または外因性核酸分子の転写および／または
翻訳等）を含む発現を刺激および／または調節する核酸分子：をコードするよう
な前記方法に関する。さらには、本発明は、核酸分子がベクターに対して外因性
であるような前記方法に関する。また、本発明は、外因性核酸分子が、例えばア
レルギー反応を調節するエピトープ、抗原または遺伝子産物、あるいは生理的機
能を調節するエピトープ、抗原または遺伝子産物（例えばインフルエンザ血液凝
集素、インフルエンザ核タンパク質、インフルエンザＭ２、破傷風毒素Ｃ断片、
炭疽菌防御抗原、炭疽菌致死因子、狂犬病糖タンパク質、ＨＢＶ表面抗原、ＨＩ
Ｖ ｇｐ 120ＨＩＶ ｇｐ 160、ヒト癌胎児性抗原、マラリアＣＳＰ、マラリアＳ
ＳＰ、マラリアＭＳＰ、マラリアｐｆｇ、およびマイコバクテリウム・ツベルク
ローシスＨＳＰ）のような、病原菌由来の１つ以上の抗原またはその部分あるい
は１つ以上の関心エピトープ；および／または医薬または免疫調節遺伝子、副刺
激遺伝子および／またはサイトカイン遺伝子：をコードするような前記方法に関
するものである。
【０００５】 さらに、本発明は、動物の細胞（例えば表皮細胞）において核酸分子を発現す
るベクターによって免疫反応が誘導され得るような前記方法に関する。さらに、
本発明は、免疫反応が病原菌または新生物に対して誘導され得るような前記方法
に関する。
【０００６】 また、本発明は、本方法において用いる組成物に関する。例えば、本発明は、
ベクターを含有する予防ワクチンまたは治療ワクチンまたは免疫組成物に関する
。
【０００７】 さらに、本発明は、前記方法およびそのための組成物に関するものであり、こ
こで、動物は、例えば魚類、鳥類、爬虫類、両生類または哺乳類等の脊椎動物で
あって差し支えなく、好ましくは、ヒトまたはコンパニオン動物、飼い動物、食
料生産動物、家畜、ゲーム用動物、レース用動物、スポーツ用動物等の哺乳動物
であって差し支えなく、例えば、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ
または家禽（例えばニワトリ、アヒル、七面鳥）であって差し支えない。
【０００８】 さらに、本発明は、前記方法およびそのための組成物に関するものであり、こ
こで、ベクターは、例えば一部のまたは全てのウィルス遺伝子を欠失させたウィ
ルスコート等のウィルスベクター、細菌ベクター、原生動物ベクター、トランス
ポゾン、レトロトランスポゾン、および例えば組換えウィルスベクターのような
ＤＮＡベクターであって差し支えなく；例えばそのＥ１および／またはＥ４領域
が欠失しているアデノウィルスのようなアデノウィルスであって差し支えない。
【０００９】 さらに、本発明は、Ｅ1および／またはＥ３およびＥ４領域が欠失したアデノ
ウィルスの粘膜投与（例えば鼻腔内、頬側、舌下、経口、口腔内等）に関するも
のであり、好ましくは、そのアデノウィルスは、インフルエンザの関心エピトー
プ（例えば１つ以上の関心インフルエンザエピトープおよび／または１つ以上の
インフルエンザ抗原）をコードする外因性または異種核酸分子のような外因性ま
たは異種核酸分子を包含するアデノウィルスである。そのような投与は、防御免
疫反応のような免疫反応を誘導する方法となり得る。本例示におけるアデノウィ
ルスは、ヒトアデノウィルスであって差し支えない。アデノウィルスは、例えば
イヌアデノウィルスのような別のタイプのアデノウィルスであって差し支えない
。従って、宿主または動物がヒト以外である場合、アデノウィルスを宿主に適合
させて差し支えなく；例えば、宿主または動物がイヌのようなイヌ科である場合
における獣医での応用において、アデノウィルスはイヌアデノウィルスであって
差し支えない。
【００１０】 従って、さらに、本発明は、ベクターが異種または外因性関心遺伝子産物およ
び同種関心遺伝子産物の両方を動物において発現させることができるように、ベ
クターが宿主に適合しあるいは宿主または動物と関連して用いるのが興味深いベ
クターであるような本発明の方法に関するものであり；例えば、獣医での応用に
おいて、その動物に関連するベクターを用いるのが有用であり、例えばイヌ科に
おいて、イヌアデノウィルスを用いて差し支えなく；あるいはより一般的に、ベ
クターは、その方法が実施される宿主または動物の弱毒化または不活化病原菌で
あって差し支えない。
【００１１】 さらに、本発明は、ベクターを含有する輸送手段を動物の皮膚に付けることを
含む方法、ならびにその輸送手段中および／またはその輸送手段上にベクターを
組み込むことをさらに含む方法に関する。
【００１２】 さらに、本発明は、全てのウィルス遺伝子が欠失しているベクターを用いるよ
うな前記方法、ならびにそのようなベクターに関する。
【００１３】 さらに、本発明は、例えば癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、または腫瘍関連遺伝子
を発現することによって、ベクターが動物において抗腫瘍効果を誘導できるよう
な方法に関する。
【００１４】 さらには、本発明は、発現によって産生された免疫産物、本方法によって得ら
れた細胞、および発現産物、ならびにin vitroおよびex vivoでのそれらの使用
に関する。
【００１５】発明の背景 脊椎動物の免疫系の活性化は、病原菌および悪性腫瘍に対して動物を防御する
ための重要な機構である。免疫系は、液性および細胞性の多くの相互作用成分か
ら成る。液性免疫は、直接抗原に結合する抗体に関連する。液性免疫のエフェク
ターとしての抗体分子は、Ｂリンパ球によって分泌される。細胞性免疫は、非自
己抗原を産生する細胞を認識して殺す分化した細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ
）に関連する。ＣＴＬｓは、ＭＨＣ（主要組織適合複合体）クラスＩ分子に結合
して標的細胞の表面上に現れる分解ペプチド断片に反応する。細胞内に産生され
たタンパク質は細胞代謝の一部として連続的にペプチドに分解されることが分か
っている。それら断片がＭＨＣ分子に結合し、さらに細胞表面に運搬される。し
たがって、細胞性免疫系は、体内における全ての細胞によって産生されるタンパ
ク質の範囲を常にモニターし、非自己抗原を産生する全ての細胞を排除する態勢
になっている。
【００１６】 ワクチン接種は、抗原に反応するように動物を初回免疫する過程である。タン
パク質（古典的）として、または後で抗原を発現する遺伝子として（遺伝子免疫
）、抗原を投与して差し支えない。その過程は、ＴおよびＢリンパ球、他のタイ
プのリンパ系細胞、ならびに、抗原を加工して免疫系を活性化できる形態でその
抗原を提示できる分化した抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）を含む。遺伝子ワクチンを
投与するための現在の形態は、注射、切皮法、および遺伝子銃介在侵入(gene gu
n-mediated penetration)等の侵襲的方法に集中している。侵襲的形態でのワク
チン接種は、設備および特別な医療訓練を受けた人材を必要とし、さらに、一般
的に不快感および潜在的な危険（出血、感染）に関連する。
【００１７】 ワクチンの有効性は、その後の腫瘍または病原菌に対する防御の程度によって
評価される。有効なワクチンは、最小回数の接種の後、疾患の標的介在物に対す
る高力価でかつ長続きする防御免疫を誘導できる免疫原である。例えば、遺伝子
免疫は、タンパク質をコードする遺伝子を動物自身の細胞において発現させるこ
とによって、特定タンパク質に対する免疫反応を誘導する試みである。in vivo
での長期間の抗原提示によって生じる十分な抗原増幅および免疫刺激は、抗原に
対する確実な免疫を誘導することができる。タンパク質精製およびアジュバント
との混合等の困難な工程（共に、通常、ワクチン開発のために必要とされる）が
しばしば省かれるため、遺伝子免疫は、特定タンパク質に対する免疫反応をもた
らすためのワクチン接種プロトコルを簡素化する。遺伝子免疫はタンパク質の単
離を必要としないため、生化学的に精製される際に構造エピトープ(conformatio
nal epitope)を損なうタンパク質に関して特に有益である。また、遺伝子ワクチ
ンは、妨害を誘導することなくまたは効果に影響を及ぼすことなく、組み合わせ
て供給することができ(Tang et al., 1992;: Barry et al., 1995)、それによっ
て複合抗原に対するワクチン接種計画を簡素化することができる。
【００１８】 局所適用されるタンパク質ベースのワクチンが研究されてきたが、それらの有
用性は限られるであろう。コレラ毒素と組み合わせたタンパク質ベースのワクチ
ンの局所適用も非侵襲的形態で動物を免疫できるが、本発明の皮膚標的非侵襲的
遺伝子ワクチンはタンパク質ベースのワクチンと異なる機構を介して免疫系を活
性化する。さらには、自然感染に類似した抗原のde novo合成のため、遺伝子ワ
クチンの効果はタンパク質ワクチンの効果よりも通常優れている(McDonnell and
Askari, 1990)。米国特許第3,837,340号は、乾燥ウィルスと皮膚とを接触させ
ることによって動物にワクチン接種する方法に関するが、その中で用いられるウ
ィルスは、導入遺伝子あるいは異種または外因性核酸分子を発現できる遺伝子ベ
クターではない。さらには、その免疫原は、動物自身の細胞におけるウィルス遺
伝子の発現によって産生されるタンパク質ではなく、ウィルスコート中のタンパ
ク質であり、例えば、米国特許第3,837,340号によって誘導される任意の免疫反
応は、本発明に類似しないタンパク質ベースのワクチンの局所適用によって誘導
される皮膚への反応であり、従って、米国特許第3,837,340号は本発明に類似し
ない。
【００１９】 ワクチン接種の先行技術は、通常、例えばシリンジ針または遺伝子銃等の設備
を必要とし、さらにワクチン投与の特殊技能を必要とする。医療訓練および設備
の無い人材によるワクチン接種に対する要求および要望が当業界にある。簡単で
、効果的で、経済的で、苦痛が無く、さらに潜在的に安全な方法であるため、皮
膚への非侵襲的ワクチン接種（ＮＩＶＳ）の開発によって、多くの疾患に対して
免疫することが可能となる。結果的に、ＮＩＶＳは、医療資源が不足している発
展途上国において、ならびに患者の心地よさのために先進国において、ワクチン
対象を増やすことができる。ＡＩＤＳおよびインフルエンザ等のウィルスによっ
て、および破傷風およびＴＢによって、およびマラリア等の寄生虫によって生じ
る感染病、ならびに広範囲の癌のタイプを含む悪性腫瘍は、全て、特別な設備お
よび医療関係者を必要とすること無く、皮膚標的非侵襲的ワクチンで予防または
治療することができる。本発明は、当業界におけるそのような長年の要求および
要望に取り組む。
【００２０】 発明の目的および概要 皮膚は免疫応答性組織であり、さらに非侵襲的方法は特別に訓練された人材を
必要としないため、皮膚への非侵襲的ワクチン接種（ＮＩＶＳ）は、ワクチン接
種計画を改善することができる。皮膚標的非侵襲的遺伝子輸送は、皮膚での局在
的な導入遺伝子の発現および免疫反応の誘導を達成でき(Tang et al., 1997)、
さらにそれら反応の機構はコレラ毒素と組み合わせたタンパク質ベースのワクチ
ンの局所適用と異なっている(Glenn et al., 1998)。それら結果は、ベクターベ
ースのＮＩＶＳが、ワクチン輸送のための新規かつ有効な方法であることを示唆
する。本発明の簡単で、効果的で、経済的で、苦痛が無い免疫プロトコルは、ワ
クチン接種の医療資源への依存を少なくし、それによって、ワクチン接種の年間
稼働率を高める。
【００２１】 従って、本発明の目的は：宿主または動物（例えば哺乳類のような脊椎動物）
において、防御免疫反応等の免疫反応および／または治療反応を誘導する方法で
あって、その反応を誘導または刺激する遺伝子産物をコードする核酸分子を包含
および発現するベクターを局所投与する工程を含む方法；その核酸分子が宿主に
対して異種および／または外因性であるような前記方法；そのＥ1および／また
はＥ３および／またはＥ４領域を欠失させたアデノウィルス、好ましくはそのＥ
1およびＥ３およびＥ４領域を欠失させたアデノウィルスの粘膜投与（例えば鼻
腔内、頬側、舌下、経口、口腔内等）であって、例えばインフルエンザの関心エ
ピトープ（例えば１つ以上の関心インフルエンザエピトープおよび／または１つ
以上のインフルエンザ抗原）をコードする外因性または異種核酸分子のような外
因性または異種核酸分子を包含するアデノウィルスの粘膜投与；防御的免疫反応
のような免疫反応が誘導される前記投与；前記方法を実施するための産物；その
ような方法を実施することによる産物；そのような方法および産物の使用：の1
つ以上を提供することである。
【００２２】 本発明は、動物における非侵襲的遺伝子免疫の方法であって、その動物におい
て免疫反応を誘導するのに有効な量の遺伝子ベクターと動物の皮膚とを接触させ
る工程を含む方法を提供する。また、本発明は、動物を免疫する方法であって、
遺伝子ベクターを含む調製物の皮膚標的非侵襲的輸送の工程を含み、それによっ
てベクターが表皮細胞に取り込まれ、さらに脊椎動物に免疫原効果をもたらす方
法を提供する。さらに本発明は、輸送手段によって動物を免疫する方法であって
、その輸送手段中に遺伝子ベクターを封入し、さらにその手段内に封入された単
一量の遺伝子物質と脊椎動物のむき出しの皮膚とを接触させる工程を含み、それ
によって、ベクターが表皮細胞によって取り込まれて、免疫応答性皮膚組織にお
いて特定抗原が発現されるような方法を提供する。遺伝子ウィルスは、組換えア
デノウィルス、ＤＮＡ／アデノウィルス複合体、ＤＮＡ／リポソーム複合体、あ
るいは脊椎動物の皮膚において抗原を発現できる任意の他の遺伝子ベクターであ
って差し支えない。
【００２３】 以下の詳細な説明は、例示の目的で与えられたものであり、記載された特定の
実施形態に本発明を限定することを意図しておらず、添付図面と関連させて理解
することができる。
【００２４】詳細な説明 侵襲形態でのワクチン接種は不必要であろう(Tang et al., 1997; Glenn et a
l., 1998)。皮膚は直接外部環境と接し、さらに潜在的病原菌と常に接触してい
るため、免疫系は潜在的感染を防ぐために皮膚境界に沿って常に生物学的軍隊を
動員し続けなければならない。その結果、皮膚の外層は、必然的に免疫応答性組
織である。液性免疫反応および細胞傷害性の細胞性免疫反応の両方を誘導するた
めに皮膚に存在する免疫成分として、表皮のランゲルハンス細胞（ＭＨＣクラス
II陽性抗原提示細胞）、ケラチノサイト、ならびにＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔリン
パ球が挙げられる。それら成分は、皮膚をワクチン投与のために理想的な部位と
する。皮膚の広い接触可能領域およびその耐久性が、その組織にワクチンを投与
する他の利点である。物理的侵入無しに、皮膚の外層における少量の抗原の発現
が免疫監視機構に警報を発することによって、強力な免疫反応を誘導することが
できる。
【００２５】 皮膚標的非侵襲的ワクチン、あるいは免疫原的または免疫学的または治療的組
成物のような新規なやり方で遺伝子ワクチンを接種できることが本明細書中に記
載されている。遺伝子ワクチンと非侵襲的輸送形態との組合せは、結果的に、投
与に特別な技能および設備をほとんどまたは全く必要としない新しいクラスの「
庶民的」ワクチン、免疫原的、免疫学的または治療的組成物をもたらす。したが
って、自分自身の皮膚（好ましくは、例えば確実に適切な用量とするために、そ
の投与は医師の指導下に置くことができる）、あるいは動物の皮膚（この中に記
載のように脱毛は必要ではないが、その動物が哺乳類である場合、好ましくは毛
を剃った皮膚、さらに好ましくは、こすりつけ、毛繕いまたは他の動きによって
動物がその投与を取り外さない部位）にそのような組成物を投与することができ
；さらに、本発明は、特に例えば針を使うような侵襲的な投与が多少困難であり
または不便でありまたは骨がおれるような新生児、動物の子、動物全般、幼児等
にそのような組成物を投与することに関して、遺伝子産物を発現するベクターを
含有するワクチン、免疫原的、免疫学的、治療的組成物の投与において利点をも
たらす。
【００２６】 本発明は、動物における非侵襲的遺伝子免疫または治療の方法であって、動物
において免疫反応を誘導するのに有効な量の遺伝子ベクターと動物の皮膚とを接
触させることを含む方法に関する。
【００２７】実施例 プロトコル マウスおよび細胞培養 近交系マウスは、バーミンガムのアラバマ大学で維持した。細胞は、２％ウシ
胎仔血清および６％仔牛血清を含有するRPMI 1640またはDMEM培地中において培
養した。
【００２８】 遺伝子ベクターの局所適用 マウスに麻酔し、ブラシまたは脱毛剤（例えばＮＡＩＲ）によって、腹部また
は頸部の皮膚の限定領域を覆う毛および角化表皮を除いた。剃髪した皮膚上に遺
伝子ベクターをピペットで採って乗せ、様々な時間（例えば１時間から１８時間
）、むき出しの皮膚と接触させた。ピペットで直接むき出しの皮膚上にベクター
を乗せて差し支えなく、あるいは皮膚に接着剤でくっつけたシリンダに入れて差
し支えない。
【００２９】 アデノウィルスベクターの調製 特定の組換えアデノウィルスに感染したヒトの２９３の細胞から高力価アデノ
ウィルスストックを調製した。溶解物を塩化セシウム密度勾配によって超遠心し
た。ウィルス層を抽出し、さらに10mM Tris(pH7.5)/135mM NaCl/5mM KCl/1mM Mg
Cl2で透析した。１０％まで添加したグルセロールと共に精製ウィルスを濾過滅
菌し、−８０℃で一部を保存した。アデノウィルスストックの力価をプラークア
ッセイで特定した。
【００３０】 ルシフェラーゼ測定法 以前記載したように(Tang, 1994)、皮膚におけるルシフェラーゼの量を特定し
た。簡単には、Kontesガラス組織粉砕機を用いて、溶解バッファー中において、
摘出した皮膚の断片をホモジナイズした。遠心によって組織片を除去した後、過
剰のＡＴＰおよびルシフェリンの存在下における積分発光強度の測定によって、
皮膚抽出物中のルシフェラーゼ活性を特定した。
【００３１】 β―ガラクトシダーゼ測定法 液体窒素中、Tissue-Tek O.C.T.コンパウンド(Miles Laboratories Inc.)中に
おいて、摘出した皮膚断片を急いで凍結し、使用するまで−８０℃で保存した。
その凍結組織を４μｍの厚さにスライスし、４％パラホルムアルデヒド中におい
て固定し、さらに、以前記載のように(Tang et al., 1994)、Ｘ-gal染色液中で
インキュベートすることによってβ-ガラクトシダーゼ活性に関して染色した。
ヘマトキシリンおよびエオシンで切片を対比染色した。
【００３２】 ＤＮＡ／アデノウィルス複合体の調製 各投与のために、縮合剤ポリリジンの存在下において、100μｇのプラスミド
ＤＮＡと1ｘ1011粒子のアデノウィルスとを混合することによって、ＤＮＡ／ア
デノウィルス複合体を調製した。吸光度によってアデノウィルスの力価を特定し
た。
【００３３】 ＤＮＡ／リポソーム複合体の調製 各投与のために、100μｇのプラスミドＤＮＡと100μｇのＤＯＴＡＰ／ＤＯＰ
Ｅ(1:1; Avanti)とを混合することによって、ＤＮＡ／リポソーム複合体を調製
した。Qiagen Plasmid Maxiキットを用いてプラスミドを調製した。
【００３４】 ウェスタンブロット分析 尾部出血からの血清を1：250−1：500に希釈し、ＳＤＳ-ポリアクリルアミド
ゲル中において分離しさらにImmobilon-P膜(Millipore)に移した精製タンパク質
と反応させた。ＥＣＬキット(Amersham)を用いて反応を可視化した。
【００３５】 実施例１ 本発明は、高度な設備を用いることなく、遺伝子ベクターの皮膚標的非侵襲的
輸送によって、簡素化されたやり方で、マウスの皮膚に抗原遺伝子を輸送できる
ことを示す。図１は、限られた量のＡｄＣＭＶ-ｌｕｃ（ホタルルシフェラーゼ
をコードするアデノウィルスベクター）を皮膚に輸送後、相当な量のルシフェラ
ーゼ酵素が産生されることを示す(Tang et al., 1994)（Ａｄ、アデノウィルス
；ｐｆｕ、プラーク形成単位；ＬＵ、光単位）。結果は、ｌｏｇ［ＬＵ／ｃｍ2
皮膚］（平均値）±ＳＥ（各カラムの先端部にｎを示す）である。偽塗布または
ルシフェラーゼをコードしないアデノウィルスベクターを塗布されたマウスは、
皮膚において検出可能なルシフェラーゼ活性を産生しなかった。皮膚におけるア
デノウィルスベクターからの導入遺伝子の発現レベルは、ウィルスの力価と相関
しなかった。限定された皮膚の部分においてほんのわずかな細胞のみがウィルス
によって形質導入され、108プラーク形成単位（ｐｆｕ）の組換えアデノウィル
スが標的細胞を飽和させた可能性がある。その変動性は、おそらく部分的に、個
々のマウスのばらつきのせいであろう。さらには、標準化されていない角化表皮
を除去する方法からある程度の変動性が生じる(Johnston and Tang, 1994)。産
生される抗原の量は、より広範囲に、より多くのベクターを投与することによっ
て増幅される可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ベクターの局所適用による、皮膚における組換えアデノウィルスから
の導入遺伝子の発現を示す
【図２Ａ】 図２Ａは、局所適用された組換えアデノウィルスによって形質導入され得る潜
在的標的細胞の特徴付けを示す
【図２Ｂ】 図２Ｂは、局所投与された組換えアデノウィルスによって形質導入され得る潜
在的標的細胞の特徴付けを示す
【図３Ａ】 図３Ａは、アデノウィルス介在ＮＩＶＳによって免疫されたマウスの血清中で
の特異的抗体の検出を示す
【図３Ｂ】 図３Ｂは、アデノウィルス介在ＮＩＶＳによって免疫されたマウスの血清中で
の特異的抗体の検出を示す
【図４】 図４は、致死量の腫瘍細胞を攻撃接種された対照マウスおよび免疫マウスの生
存率（％）を示す
【図５】 図５は、腫瘍浸潤Ｔ細胞の特徴付けを示す
【図６】 図６は、腫瘍浸潤ＣＴＬｓの特徴付けを示す
【図７】 図７は、ワクチン包帯の局所適用によって免疫されたマウスにおける、ヒトＣ
ＥＡタンパク質に対する抗体のウェスタンブロット分析を示す
【図８Ａ】 図８Ａは、ＤＮＡ／アデノウィルス介在ＮＩＶＳによって免疫されたマウスの
血清中での特異的抗体の検出を示す
【図８Ｂ】 図８Ｂは、ＤＮＡ／リポソーム介在ＮＩＶＳ（Ｂ）によって免疫されたマウス
の血清中での特異的抗体の検出を示す
【図９】 図９は、標的細胞におけるＤＮＡコード導入遺伝子およびアデノウィルスコー
ド導入遺伝子の共同発現(co-expression)を示す
【図１０】 図１０は、局所適用された組換えアデノウィルス、ＤＮＡ／アデノウィルス複
合体、およびＤＮＡ／リポソーム複合体からの相対的な導入遺伝子の発現を示す
【図１１】 図１１は、皮膚標的非侵襲的ワクチンの投与のための手段を示す
【図１２】 図１２は、マウスにおいて皮膚標的非侵襲的ワクチンによって産生された抗イ
ンフルエンザ抗体を示す
【図１３】 図１３は、ウィルス攻撃接種に続く死からのマウスの防御を示す
【図１４】 図１４は、インフルエンザＨＡをコードするアデノウィルスベクターを含有す
る皮膚パッチによって、ピッグテイルマカクザル(pigtail macaque)において産
生されたＥＬＩＳＡ抗体を示す
【図１５】 図１５は、アデノウィルスベクターの局所適用後の皮膚における抗原スポット
の移転を示す
【図１６】 図１６は、非侵襲形態での局所的遺伝子輸送後における、種々の組織での外来
ＤＮＡの増幅を示す
【図１７】 図１７は、ＮＡＩＲのような脱毛剤がＮＩＶＳには必須でないことを示す
【図１８】 図１８は、アデノウィルスベースの破傷風ワクチンの局所適用または鼻腔内接
種による、破傷風菌攻撃接種に続く死からの防御を示す
【手続補正書】
【提出日】平成１４年３月１１日（２００２．３．１１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の名称】 非侵襲的遺伝子免疫、それによる発現産物、およびそれら
の使用
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【０００１】 関連出願 本出願は、１９９９年５月３日出願の米国仮特許出願第60/132,216号に基づき
優先権を主張する。また、本出願は、１９９９年１０月５日出願の米国特許出願
第09/402,527号の一部継続出願である２０００年３月２３日出願の米国特許出願
第09/533,149号の一部継続出願である。米国特許出願第09/402,527号は、１９９
８年８月１３日出願の国際特許出願第PCT/US98/16739号の国内段階の一部継続出
願であり、その国際特許出願第PCT/US98/16739号は１９９７年８月１３日出願の
米国仮特許出願第60/055,520号および１９９８年２月１１日出願の米国仮特許出
願第60/075,113号に基づき優先権を主張する。それら特許出願およびそれら特許
出願において挙げられている文献（「特許出願引用文献」）、ならびにそれら特
許出願の本文中においてまたは手続き追行の間に引用された特許出願引用文献で
参照または引用されている文献、さらにはそのような手続き追行の間に提出した
特許性を支持する全ての抗弁は、参照によってこの中に組み込まれる。また、様
々な文献が本明細書において挙げられている（「特許出願引用文献」）。それら
特許出願引用文献、およびそれら特許出願引用文献において引用または参照され
ている文献も参照によってこの中に組み込まれる。
【０００２】 連邦政府援助 本発明に関連してなされた研究は、部分的に、国立衛生研究所からの補助金第
1-R43-AI-43802号によって援助された。米国政府は、本発明に関して特定の権利
を有する。
【０００３】 発明の分野 本発明は、概して、免疫学およびワクチン技術の分野に関する。また、本発明
は、免疫反応を誘導するための皮膚標的非侵襲的遺伝子輸送の技術、ならびにそ
の使用に関する。さらに、本発明は、動物における非侵襲的遺伝子免疫の方法お
よび／または動物において免疫反応（例えば全身性免疫反応）および治療反応（
例えば全身性治療反応）を誘導する方法、それら方法による産物、ならびにそれ
ら方法およびそれら方法による産物の使用に関する。さらに本発明は、動物にお
いて例えば全身性免疫反応のような反応を誘導するのに有効な量のベクターと、
動物の皮膚とを接触させることを含む前記方法に関する。さらに、本発明は、ベ
クターが、例えば抗原または薬剤のような関心のあるエピトープまたは遺伝子産
物をコードする外因性核酸分子を包含および発現するような前記方法に関する。
さらに、本発明は、例えば全身性免疫反応または全身性治療反応のような反応が
、エピトープまたは遺伝子産物に対して誘導されるような前記方法に関する。
【０００４】 さらに、本発明は、核酸分子が：関心エピトープ；および／または関心抗原；
および／または免疫反応を刺激および／または調節し、および／または転写およ
び／翻訳等（例えば内因性および／または外因性核酸分子の転写および／または
翻訳等）を含む発現を刺激および／または調節する核酸分子：をコードするよう
な前記方法に関する。さらには、本発明は、核酸分子がベクターに対して外因性
であるような前記方法に関する。また、本発明は、外因性核酸分子が、例えばア
レルギー反応を調節するエピトープ、抗原または遺伝子産物、あるいは生理的機
能を調節するエピトープ、抗原または遺伝子産物（例えばインフルエンザ血液凝
集素、インフルエンザ核タンパク質、インフルエンザＭ２、破傷風毒素Ｃ断片、
炭疽菌防御抗原、炭疽菌致死因子、狂犬病糖タンパク質、ＨＢＶ表面抗原、ＨＩ
Ｖ ｇｐ 120ＨＩＶ ｇｐ 160、ヒト癌胎児性抗原、マラリアＣＳＰ、マラリアＳ
ＳＰ、マラリアＭＳＰ、マラリアｐｆｇ、およびマイコバクテリウム・ツベルク
ローシスＨＳＰ）のような、病原菌由来の１つ以上の抗原またはその部分あるい
は１つ以上の関心エピトープ；および／または薬剤または免疫調節遺伝子、副刺
激遺伝子および／またはサイトカイン遺伝子：をコードするような前記方法に関
するものである。
【０００５】 さらに、本発明は、動物の細胞（例えば表皮細胞）において核酸分子を発現す
るベクターによって免疫反応が誘導され得るような前記方法に関する。さらに、
本発明は、免疫反応が病原菌または新生物に対して誘導され得るような前記方法
に関する。
【０００６】 また、本発明は、本方法において用いる組成物に関する。例えば、本発明は、
ベクターを含有する予防ワクチンまたは治療ワクチンまたは免疫組成物に関する
。
【０００７】 さらに、本発明は、前記方法およびそのための組成物に関するものであり、こ
こで、動物は、例えば魚類、鳥類、爬虫類、両生類または哺乳類等の脊椎動物で
あって差し支えなく、好ましくは、例えば、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒ
ツジ、ブタまたは家禽（例えばニワトリ、アヒル、七面鳥）のような、ヒトまた
はコンパニオン動物、飼い動物、食料生産動物、家畜、狩猟用動物、レース用動
物、スポーツ用動物等の哺乳動物であって差し支えない。
【０００８】 さらに、本発明は、前記方法およびそのための組成物に関するものであり、こ
こで、ベクターは、例えば一部のまたは全てのウィルス遺伝子が欠損したウィル
スコート等のウィルスベクター、細菌ベクター、原生動物ベクター、トランスポ
ゾン、レトロトランスポゾン、およびＤＮＡベクターであって差し支えなく；例
えばそのＥ１および／またはＥ４領域が欠損したアデノウィルスのような組換え
ウィルスベクターであって差し支えない。
【０００９】 さらに、本発明は、Ｅ1および／またはＥ３およびＥ４領域が欠損したアデノ
ウィルスの粘膜投与（例えば鼻腔内、頬側、舌下、経口、口腔内等）に関するも
のであり、好ましくは、そのアデノウィルスは、インフルエンザの関心エピトー
プ（例えば１つ以上の関心インフルエンザエピトープおよび／または１つ以上の
インフルエンザ抗原）をコードする外因性または異種核酸分子のような外因性ま
たは異種核酸分子を包含するアデノウィルスである。そのような投与は、防御免
疫反応のような免疫反応を誘導する方法となり得る。本例示におけるアデノウィ
ルスは、ヒトアデノウィルスであって差し支えない。アデノウィルスは、例えば
イヌアデノウィルスのような別のタイプのアデノウィルスであって差し支えない
。従って、宿主または動物がヒト以外である場合、アデノウィルスを宿主に適合
させて差し支えなく；例えば、宿主または動物がイヌのようなイヌ科である場合
における獣医での用途において、アデノウィルスはイヌアデノウィルスであって
差し支えない。
【００１０】 従って、さらに、本発明は、ベクターが異種または外因性関心遺伝子産物およ
び同種関心遺伝子産物の両方を動物において発現させることができるように、ベ
クターが宿主に適合しあるいは宿主または動物と関連して用いるのが興味深いベ
クターであるような本発明の方法に関するものであり；例えば、獣医での用途に
おいて、その動物に関連するベクターを用いるのが有用であり、例えばイヌ科に
おいて、イヌアデノウィルスを用いて差し支えなく；あるいはより一般的に、ベ
クターは、その方法が実施される宿主または動物の弱毒化または不活化病原菌で
あって差し支えない。
【００１１】 さらに、本発明は、ベクターを含有する輸送手段を動物の皮膚に適用すること
を含む方法、ならびにその輸送手段中および／またはその輸送手段上にベクター
を組み込むことをさらに含む方法に関する。
【００１２】 さらに、本発明は、全てのウィルス遺伝子が欠損したベクターを用いるような
前記方法、ならびにそのようなベクターに関する。
【００１３】 さらに、本発明は、例えば癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、または腫瘍関連遺伝子
を発現することによって、ベクターが動物において抗腫瘍効果を誘導できるよう
な方法に関する。
【００１４】 さらには、本発明は、発現によって産生された免疫産物、本方法によって得ら
れた細胞、および発現産物、ならびにin vitroおよびex vivoでのそれらの使用
に関する。
【００１５】発明の背景 脊椎動物の免疫系の活性化は、病原菌および悪性腫瘍に対して動物を防御する
ための重要な機構である。免疫系は、液性および細胞性の多くの相互作用成分か
ら成る。液性免疫は、直接抗原に結合する抗体に関連する。液性免疫のエフェク
ターとしての抗体分子は、Ｂリンパ球によって分泌される。細胞性免疫は、非自
己抗原を産生する細胞を認識して殺す分化した細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ
）に関連する。ＣＴＬｓは、ＭＨＣ（主要組織適合複合体）クラスＩ分子に結合
して標的細胞の表面上に現れる分解ペプチド断片に反応する。細胞内に産生され
たタンパク質は細胞代謝の一部として連続的にペプチドに分解されることが分か
っている。それら断片がＭＨＣ分子に結合し、さらに細胞表面に運搬される。し
たがって、細胞性免疫系は、体内における全ての細胞によって産生されるタンパ
ク質の範囲を常にモニターし、非自己抗原を産生する全ての細胞を排除する態勢
になっている。
【００１６】 ワクチン接種は、抗原に反応するように動物を初回免疫する過程である。タン
パク質（古典的）として、または後で抗原を発現する遺伝子として（遺伝子免疫
）、抗原を投与して差し支えない。その過程は、ＴおよびＢリンパ球、他のタイ
プのリンパ系細胞、ならびに、抗原を加工して免疫系を活性化できる形態でその
抗原を提示できる分化した抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）を含む。遺伝子ワクチンを
投与するための現在の形態は、注射、切皮法、および遺伝子銃介在侵入(gene gu
n-mediated penetration)等の侵襲的方法に集中している。侵襲的形態でのワク
チン接種は、設備および特別な医療訓練を受けた人材を必要とし、さらに、一般
的に不快感および潜在的な危険（出血、感染）を含む。
【００１７】 ワクチンの有効性は、その後の腫瘍または病原菌に対する防御の程度によって
評価される。有効なワクチンは、最小回数の接種の後、疾患の標的介在物に対す
る高力価でかつ長続きする防御免疫を誘導できる免疫原である。例えば、遺伝子
免疫は、タンパク質をコードする遺伝子を動物自身の細胞において発現させるこ
とによって、特定タンパク質に対する免疫反応を誘導する試みである。in vivo
での長期間の抗原提示によって生じる十分な抗原増幅および免疫刺激は、抗原に
対する確実な免疫を誘導することができる。タンパク質精製およびアジュバント
との混合等の困難な工程（共に、通常、ワクチン開発のために必要とされる）が
しばしば省かれるため、遺伝子免疫は、特定タンパク質に対する免疫反応をもた
らすためのワクチン接種プロトコルを簡素化する。遺伝子免疫はタンパク質の単
離を必要としないため、生化学的に精製される際に構造エピトープ(conformatio
nal epitope)を損なうタンパク質に関して特に有益である。また、遺伝子ワクチ
ンは、妨害を誘導することなくまたは効果に影響を及ぼすことなく、組み合わせ
て供給することができ(Tang et al., 1992;: Barry et al., 1995)、それによっ
て複合抗原に対するワクチン接種計画を簡素化することができる。
【００１８】 局所適用されるタンパク質ベースのワクチンが研究されてきたが、それらの有
用性は限られるであろう。コレラ毒素と組み合わせたタンパク質ベースのワクチ
ンの局所適用も非侵襲的形態で動物を免疫できるが、本発明の皮膚標的非侵襲的
遺伝子ワクチンはタンパク質ベースのワクチンと異なる機構を介して免疫系を活
性化する。さらには、自然感染に類似した抗原のde novo合成のため、遺伝子ワ
クチンの効果はタンパク質ワクチンの効果よりも通常優れている(McDonnell and
Askari, 1990)。米国特許第3,837,340号は、乾燥ウィルスと皮膚とを接触させ
ることによって動物にワクチン接種する方法に関するが、その中で用いられるウ
ィルスは、導入遺伝子あるいは異種または外因性核酸分子を発現できる遺伝子ベ
クターではない。さらには、その免疫原は、動物自身の細胞におけるウィルス遺
伝子の発現によって産生されるタンパク質ではなく、ウィルスコート中のタンパ
ク質であり、例えば、米国特許第3,837,340号によって誘導される任意の免疫反
応は、本発明に類似しないタンパク質ベースのワクチンの局所適用によって誘導
される皮膚への反応であり、従って、米国特許第3,837,340号は本発明に類似し
ない。
【００１９】 ワクチン接種の先行技術は、通常、例えばシリンジ針または遺伝子銃等の設備
を必要とし、さらにワクチン投与の特殊技能を必要とする。医療訓練および設備
の無い人材によるワクチン接種に対する要求および要望が当業界にある。簡単で
、効果的で、経済的で、苦痛が無く、さらに潜在的に安全な方法であるため、皮
膚への非侵襲的ワクチン接種（ＮＩＶＳ）の開発によって、多くの疾患に対して
免疫することが可能となる。結果的に、ＮＩＶＳは、医療資源が不足している発
展途上国において、ならびに患者の心地よさのために先進国において、ワクチン
対象を増やすことができる。ＡＩＤＳおよびインフルエンザ等のウィルスによっ
て、および破傷風およびＴＢによって、およびマラリア等の寄生虫によって生じ
る感染病、ならびに広範囲の癌のタイプを含む悪性腫瘍は、全て、特別な設備お
よび医療関係者を必要とすること無く、皮膚標的非侵襲的ワクチンで予防または
治療することができる。本発明は、当業界におけるそのような長年の要求および
要望に取り組む。
【００２０】 発明の目的および概要 皮膚は免疫応答性組織であり、さらに非侵襲的方法は特別に訓練された人材を
必要としないため、皮膚への非侵襲的ワクチン接種（ＮＩＶＳ）は、ワクチン接
種計画を改善することができる。皮膚標的非侵襲的遺伝子輸送は、皮膚での局在
的な導入遺伝子の発現および免疫反応の誘導を達成でき(Tang et al., 1997)、
さらにそれら反応の機構はコレラ毒素と組み合わせたタンパク質ベースのワクチ
ンの局所適用と異なっている(Glenn et al., 1998)。それら結果は、ベクターベ
ースのＮＩＶＳが、ワクチン輸送のための新規かつ有効な方法であることを示唆
する。本発明の簡単で、効果的で、経済的で、苦痛が無い免疫プロトコルは、ワ
クチン接種の医療資源への依存を少なくし、それによって、ワクチン接種の年間
稼働率を高める。
【００２１】 従って、本発明の目的は：宿主または動物（例えば哺乳類のような脊椎動物）
において、防御免疫反応等の免疫反応および／または治療反応を誘導する方法で
あって、その反応を誘導または刺激する遺伝子産物をコードする核酸分子を包含
および発現するベクターを局所適用する工程を含む方法；その核酸分子が宿主に
対して異種および／または外因性であるような前記方法；そのＥ1および／また
はＥ３および／またはＥ４領域が欠損したアデノウィルス、好ましくはそのＥ1
およびＥ３およびＥ４領域が欠損したアデノウィルスの粘膜投与（例えば鼻腔内
、頬側、舌下、経口、口腔内等）であって、例えばインフルエンザの関心エピト
ープ（例えば１つ以上の関心インフルエンザエピトープおよび／または１つ以上
のインフルエンザ抗原）をコードする外因性または異種核酸分子のような外因性
または異種核酸分子を包含するアデノウィルスの粘膜投与；防御的免疫反応のよ
うな免疫反応が誘導される前記投与；前記方法を実施するための産物；そのよう
な方法を実施することによる産物；そのような方法および産物の使用：の1つ以
上を提供することである。
【００２２】 本発明は、動物における非侵襲的遺伝子免疫の方法であって、その動物におい
て免疫反応を誘導するのに有効な量の遺伝子ベクターと動物の皮膚とを接触させ
る工程を含む方法を提供する。また、本発明は、動物を免疫する方法であって、
遺伝子ベクターを含む調製物の皮膚標的非侵襲的輸送の工程を含み、それによっ
てベクターが表皮細胞に取り込まれ、さらに脊椎動物に免疫原効果をもたらす方
法を提供する。さらに本発明は、輸送手段によって動物を免疫する方法であって
、その輸送手段中に遺伝子ベクターを封入し、さらにその手段内に封入された単
一量の遺伝子物質と脊椎動物のむき出しの皮膚とを接触させる工程を含み、それ
によって、ベクターが表皮細胞によって取り込まれて、免疫応答性皮膚組織にお
いて特定抗原が発現されるような方法を提供する。遺伝子ウィルスは、組換えア
デノウィルス、ＤＮＡ／アデノウィルス複合体、ＤＮＡ／リポソーム複合体、あ
るいは脊椎動物の皮膚において抗原を発現できる任意の他の遺伝子ベクターであ
って差し支えない。
【００２３】 本発明の実施形態において、免疫反応を誘導する方法であって：関心遺伝子を
コードする、免疫学的に有効な濃度の遺伝子ベクターを局所適用することによっ
て、そのような処置を必要とする個体または動物の皮膚とベクターとを接触させ
る：工程を含む方法を提供する。
【００２４】 本発明の別の実施形態において、そのような処置を必要とする個体または動物
において防御的免疫反応を誘導する方法であって：投与された個体または動物に
防御的免疫効果を誘導する抗原をコードする遺伝子を包含する、免疫学的に有効
な濃度のベクターを皮膚に局所適用することによって、前記動物の皮膚とベクタ
ーとを接触させる：工程を含む方法を提供する。
【００２５】 本発明の別の実施形態において、ＤＮＡ／アデノウィルス複合体とむき出しの
皮膚とを接触させることによって、同じ細胞において複数の導入遺伝子を同時発
現(co-expression)させる方法を示す。そのプロトコルは、同じ細胞内において
、抗原と共に、サイトカイン、副刺激分子、または他の免疫調節剤を同時産生す
ることによって、免疫系の操作を可能とする。
【００２６】 従って、本発明は、動物における非侵襲的遺伝子免疫の方法および／または動
物において免疫反応（例えば全身性免疫反応）または治療反応を誘導する方法、
それら方法による産物、ならびにそれら方法およびそれら方法による産物の使用
を提供する。さらに、本発明は、動物において、例えば免疫反応（例えば全身性
免疫反応）または治療反応のような反応を誘導するのに有効な量のベクターと、
動物の皮膚とを接触させることを含む前記方法を提供する。さらに、本発明は、
ベクターが、関心エピトープまたは遺伝子産物をコードする外因性核酸分子を包
含および発現するような前記方法を提供する。さらに、本発明は、全身性免疫反
応が、エピトープまたは遺伝子産物に対して誘導されるような前記方法を提供す
る。
【００２７】 さらに、本発明は、核酸分子が：免疫反応を刺激および／または調節し、およ
び／または転写および／翻訳等（例えば内因性および／または外因性核酸分子の
転写および／または翻訳等）を含む発現を刺激および／または調節し、および／
または治療反応を誘導する、関心エピトープおよび／または関心抗原および／ま
たは核酸分子をコードするような前記方法を提供する。
【００２８】 さらには、本発明は、核酸分子がベクターに対して外因性であるような前記方
法を提供する。また、本発明は、外因性核酸分子が：病原菌由来の１つ以上の抗
原または例えば関心エピトープのようなその部分（例えば、インフルエンザ血液
凝集素、インフルエンザ核タンパク質、インフルエンザＭ２、破傷風毒素Ｃ断片
、炭疽菌防御抗原、炭疽菌致死因子、狂犬病糖タンパク質、ＨＢＶ表面抗原、Ｈ
ＩＶ ｇｐ 120ＨＩＶ ｇｐ 160、ヒト癌胎児性抗原、マラリアＣＳＰ、マラリア
ＳＳＰ、マラリアＭＳＰ、マラリアｐｆｇ、およびマイコバクテリウム・ツベル
クローシスＨＳＰ等の１つ以上の抗原またはそれら抗原由来の関心エピトープ）
；および／または薬剤および／または免疫調節遺伝子（例えば副刺激遺伝子およ
び／またはサイトカイン遺伝子）：をコードするような前記方法を提供する。米
国特許第5,990,091号、国際特許公開第WO99/60164号および第WO98/00166号、な
らびにそれらにおいて引用されている文献を参照。
【００２９】 さらに、本発明は、動物細胞（例えば表皮細胞）において核酸分子を発現する
ベクターによって免疫反応が誘導されるような前記方法を提供する。さらに、本
発明は、免疫反応が、病原菌または新生物に対して誘導されるような前記方法を
提供する。
【００３０】 また、本発明は、本方法において用いる組成物を提供する。例えば、本発明は
、局所適用を介しておよび／または粘膜を介しておよび／または鼻腔内投与およ
び／または舌下投与および／または頬側投与および／または経口投与および／ま
たは口腔内投与によって反応を誘導または刺激する際に用いるための、ベクター
を含有する予防ワクチン組成物または治療ワクチン組成物あるいは免疫組成物ま
たは治療組成物を提供する。
【００３１】 さらに、本発明は、動物が、例えば、ヒトまたはコンパニオン動物、飼い動物
、食料生産動物、家畜、狩猟用動物、レース用動物、スポーツ用動物（例えば、
ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、または例えばニワトリ、アヒル
、七面鳥のような家禽）のような、魚類、鳥類、爬虫類、両生類または哺乳類等
の脊椎動物であって差し支えないような、前記方法およびそのための組成物を提
供する。
【００３２】 さらに、本発明は、ベクターが、例えば一部のまたは全てのウィルス遺伝子が
欠損したウィルスコート等の1つ以上のウィルスベクター、細菌ベクター、原生
動物ベクター、トランスポゾン、レトロトランスポゾン、およびＤＮＡベクター
であって差し支えなく、例えばそのＥ１および／またはＥ４領域が欠損したアデ
ノウィルスのような組換えウィルスベクターであって差し支えないような、前記
方法およびそのための組成物を提供する。
【００３３】 さらに、本発明は、例えばインフルエンザの関心エピトープ（例えば１つ以上
の関心インフルエンザエピトープおよび／または１つ以上のインフルエンザ抗原
）をコードする外因性または異種核酸分子のような外因性または異種核酸分子を
包含するアデノウィルスであって、Ｅ1および／またはＥ３および／またはＥ４
領域が欠損したアデノウィルス（好ましくはそのＥ1およびＥ３およびＥ４領域
が欠損したアデノウィルス）の鼻腔内および／または粘膜および／または舌下お
よび／または頬側および／または経口および／または口腔内投与を提供する。そ
のような投与は、防御免疫反応のような免疫反応を誘導する方法となり得る。本
例示におけるアデノウィルスは、ヒトアデノウィルスであって差し支えない。ア
デノウィルスは、例えばイヌアデノウィルスのような別の型のアデノウィルスで
あって差し支えない。従って、宿主または動物がヒト以外である場合、アデノウ
ィルスを宿主に適合させて差し支えなく；例えば、宿主または動物がイヌのよう
なイヌ科であるような獣医での用途において、アデノウィルスはイヌアデノウィ
ルスであって差し支えない。
【００３４】 従って、本発明は、ベクターが異種または外因性関心遺伝子産物および同種関
心遺伝子産物の両方を動物において発現できるように、宿主に適合したあるいは
宿主または動物と関連して用いるのが興味深いベクターを用いるような本発明の
方法に関するものであり；例えば、獣医での用途において、その動物に関連する
ベクターを用いるのが有用であり、例えばイヌ科において、イヌアデノウィルス
を用いて差し支えなく；あるいはより一般的に、ベクターは、その方法が実施さ
れる宿主または動物の弱毒化または不活化病原菌であって差し支えない。当業界
におけるそれに関する開示および知識についての情報を有する当業者は、過度の
実験無しに、ベクターを宿主または動物に適合させることができる。
【００３５】 さらに、本発明は、ベクターを含有する輸送手段を動物の皮膚に適用すること
を含むような前記方法、ならびにその輸送手段中および／またはその輸送手段上
にベクターを組み込むことをさらに含むような前記方法を提供する。
【００３６】 さらに、本発明は、ベクターが全てのウィルス遺伝子を欠いているような前記
方法、ならびにそのようなベクターに関する。
【００３７】 さらに、本発明は、例えば癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、または腫瘍関連遺伝子
を発現することによって、ベクターが動物において抗腫瘍効果を誘導できるよう
な前記方法を提供する。
【００３８】 さらには、本発明は、発現によって産生された例えば発現産物等の遺伝子産物
、ならびにその発現産物から産生された抗体等の免疫産物、本方法によって得ら
れた細胞、ならびにin vitroおよびex vivoでのそれらの使用を提供する。発現
産物およびそれからの免疫産物を測定および診断等において用いることができ；
さらに、免疫産物および／または発現産物を発現する細胞を宿主から単離し、in
vitroで増やし、宿主に再導入することができる。
【００３９】 さらには、非侵襲的輸送は全ての投与例において望ましいが、侵襲的輸送と共
に本発明を用いて差し支えなく；さらに、プライム−ブースト法の一部として本
発明を用いて差し支えない。例えば、非侵襲的投与の前、間または後に、同じま
たは類似の病原菌のための異なるワクチン組成物または免疫組成物（例えば非侵
襲的投与においてその関心抗原またはエピトープがベクターによって発現される
のと同じまたは類似の病原菌のための完全ワクチンまたはサブユニットワクチン
）を注射によって投与する等、同じまたは異なる免疫成分または治療成分の別の
非侵襲的または侵襲的投与の前にまたは後にまたは同時に本発明方法の非侵襲的
投与を行うような、プライム−ブースト法の一部として本発明の方法を用いて差
し支えない。
【００４０】 また、本発明は、皮膚標的および他の非侵襲的なワクチン組成物または免疫組
成物の輸送のための輸送手段（包帯(bandage)、絆創膏、ぴったりくっつく製品(
spot-on formulation)およびその適用手段、注ぎ式の製品(pour-on formulation
)およびその適用手段、ロールオン式の製品およびその適用手段、シャンプー式
の製品(shampoo formulation)およびその適用手段等）、およびその使用、なら
びにベクターの非侵襲的輸送のための組成物；さらにはベクターの非侵襲的輸送
のための組成物を調製するためのキットを含む。そのようなキットは、ベクター
および薬剤的に許容されるまたは適切な担体または希釈剤および必要に応じて輸
送手段をそれぞれの包装中に含み；その包装は単一の容器中に含まれ、または各
包装が別々の容器中に含まれ、または各包装がそれ自身の別々の容器中に含まれ
ていて差し支えなく；そのキットは、必要に応じて、成分を混合および／または
組成物を投与するための指示書を含んでいて差し支えない。
【００４１】 注ぎ式およびぴったりくっつく製品は、米国特許第6,010,710号および第5,475
,005号に記載されている。ロールオン式手段は、米国特許第5,897,267号に記載
されている。米国特許第6,010,710号、第5,475,005号および第5,897,267号の内
容は、それらの中で引用または参照されている文献およびそのような文献中にお
いて引用または参照されている全ての文献と共に、参照によってこの中に組み込
まれる。さらには、熟練者は、シャンプー式製品ならびにその製品を動物に適用
するための手段を作ることを知っている。
【００４２】 従って、本発明は、この中に記載の方法において検討した全ての使用のための
全ての遺伝子ベクターを含む。
【００４３】 本開示において、例えば「含む」、「含まれる」、「含んでいる」等の用語は
、米国特許法における意味に帰するものであり、例えば、それらは「包含する」
、「包含される」、「包含している」等を意味する。
【００４４】 上記および他の実施形態は開示され、あるいは以下の詳細な説明から明らかで
ありかつそれらに含まれる。
【００４５】 以下の詳細な説明は、例示の目的で与えられたものであり、記載された特定
の実施形態に本発明を限定することを意図しておらず、添付図面と関連させて理
解することができる。
【００４６】詳細な説明 侵襲形態でのワクチン接種は不必要であろう(Tang et al., 1997; Glenn et a
l., 1998)。皮膚は直接外部環境と接し、さらに潜在的病原菌と常に接触してい
るため、免疫系は潜在的感染を防ぐために皮膚境界に沿って常に生物学的軍隊を
動員し続けなければならない。その結果、皮膚の外層は、必然的に免疫応答性組
織である。液性免疫反応および細胞傷害性の細胞性免疫反応の両方を誘導するた
めに皮膚に存在する免疫成分として、表皮のランゲルハンス細胞（ＭＨＣクラス
II陽性抗原提示細胞）、ケラチノサイト、ならびにＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔリン
パ球が挙げられる。それら成分は、皮膚をワクチン投与のために理想的な部位と
する。皮膚の広い接触可能領域およびその耐久性が、その組織にワクチンを投与
する他の利点である。物理的侵入無しに、皮膚の外層における少量の抗原の発現
が免疫監視機構に警報を発することによって、強力な免疫反応を誘導することが
できる。
【００４７】 皮膚標的の非侵襲的なワクチン組成物または免疫原性組成物または免疫組成物
または治療組成物のような新規な形態で遺伝子ワクチンを接種できることが本明
細書中に記載されている。遺伝子ワクチンと非侵襲的輸送形態との組合せは、結
果的に、投与に特別な技能および設備をほとんどまたは全く必要としない新しい
クラスの「庶民的」ワクチン組成物、免疫原性組成物、免疫組成物または治療組
成物をもたらす。したがって、自分自身の皮膚（好ましくは、例えば確実に適切
な用量とするために、その投与は医師の指導下に置くことができる）、あるいは
動物の皮膚（この中に記載のように脱毛は必要ではないが、その動物が哺乳類で
ある場合、好ましくは毛を剃った皮膚、さらに好ましくは、こすりつけ、毛繕い
または他の動きによって動物がその投与物を取り外さない部位）にそのような組
成物を投与することができ；さらに、本発明は、特に例えば針を使うような侵襲
的な投与が多少困難でありまたは不便でありまたは骨がおれるような新生児、動
物の子、動物全般、幼児等にそのような組成物を投与することに関して、遺伝子
産物を発現するベクターを含有するワクチン組成物、免疫原性組成物、免疫組成
物または治療組成物の投与において利点をもたらす。
【００４８】 本発明は、動物における非侵襲的遺伝子免疫または治療の方法であって、動物
において免疫反応を誘導するのに有効な量の遺伝子ベクターと動物の皮膚とを接
触させることを含む方法に関する。
【００４９】 この中で用いられているように、ベクターは、ある環境から別の環境への実体
物の運搬を可能としまたは促進する道具である。例示として、組換えＤＮＡ技術
において用いられるいくつかのベクターは、例えばＤＮＡ断片（例えば異種ｃＤ
ＮＡ断片等の異種ＤＮＡ断片）のような実体物を標的細胞に運搬することを可能
とする。好ましい実施形態において、ベクターは、ウィルスベクター、細菌ベク
ター、原生動物ベクター、ＤＮベクター、またはそれらの組み換え体を含む。
【００５０】 この中で用いられている「AdCMV-tetC:IM」は、破傷風毒素Ｃ断片をコードす
るアデノウィルスベクターを表し；「pCMV-tetC」は、破傷風毒素Ｃ断片をコー
ドするプラスミド発現ベクターを表す。
【００５１】 本発明の実施において用いることができる、例えば、発現された遺伝子産物、
抗体およびそれらの使用、外因性核酸分子のin vivoおよびin vitroでの発現の
ためのベクター、発現を高めるためまたは発現されるべく核酸分子に作動可能に
連結するためのプロモーター、そのようなベクターを作成するための方法および
文献、そのようなベクターまたは核酸分子または抗体を含む組成物、用量、なら
びに投与形態または経路（粘膜、鼻腔内、経口、口腔内、頬側、舌下投与のため
の組成物を含む）等に関する情報について、１９９９年１１月２３日に発行され
た米国特許第5,990,091号、１９９９年５月１４日出願のPCT/US99/11066号の１
９９９年１１月２５日公開の国際特許公開WO99/60164号 (Einant et al, or Qua
rk Biotech, Inc.)、１９９７年６月３０日出願のPCT/US97/11486号の１９９８
年１月８日に公開された国際特許公開第WO98/00166号((Fischer or Rhone Merie
ux, Inc.)(米国特許出願第08/675,556号および第08/675,566号に基づく優先権を
主張する)、van Ginkel et al., J. Immunol 159(2): 685-93 (1997)（アデノウ
ィルス遺伝子輸送が、ベクターおよびその導入遺伝子に対する顕著な肺関連ヘル
パーＴ細胞反応を誘導する）、Osterhaus et al., Immunobiology 184 (2-3): 1
80-92 (1992)（ヒトにおける急性呼吸器ウィルス感染症および麻疹に対するワク
チン接種）、１９９９年４月２３日出願のPCT/US99/08895の１９９９年１０月２
８日公開の国際特許公開第WO99/53940号(Briles et al. or UAB)、および２００
０年３月２８日発行の米国特許第6,042,838号(Briles et al. or UAB)、および
米国特許第6,004,802号(Briles et al. or UAB)を参照する；従って、１９９９
年１１月２３日発行の米国特許第5,990,091号、１９９９年５月１４日出願のPCT
/US99/11066号の１９９９年１１月２５日公開の国際特許公開WO99/60164号(Eina
t et al. or Quark Biotech, Inc.)、１９９７年６月３０日出願のPCT/US97/114
86号の１９９８年１月８日に公開された国際特許公開第WO98/00166号(Fischer o
r Rhone Merieux, Inc.)(米国特許出願第08/675,556号および第08/675,566号に
基づく優先権を主張する)、van Ginkel et al., J. Immunol 159(2): 685-93 (1
997)（アデノウィルス遺伝子輸送が、ベクターおよびその導入遺伝子に対する顕
著な肺関連ヘルパーＴ細胞反応を誘導する）、Osterhaus et al., Immunobiolog
y 184 (2-3): 180-92 (1992)（ヒトにおける急性呼吸器ウィルス感染症および麻
疹に対するワクチン接種）、１９９９年４月２３日出願のPCT/US99/08895の１９
９９年１０月２８日公開の国際特許公開第WO99/53940号(Briles et al. or UAB)
、および２０００年３月２８日発行の米国特許第6,042,838号(Briles et al. or
UAB)、および米国特許第6,004,802号(Briles et al. or UAB)、ならびにそれら
において引用または参照されている全ての文献および１９９９年１１月２３日発
行の米国特許第5,990,091号、１９９９年５月１４日出願のPCT/US99/11066号の
１９９９年１１月２５日公開の国際特許公開WO99/60164号(Einat et al. or Qua
rk Biotech, Inc.)、１９９７年６月３０日出願のPCT/US97/11486号の１９９８
年１月８日に公開された国際特許公開第WO98/00166号(Fischer or Rhone Merieu
x, Inc.)(米国特許出願第08/675,556号および第08/675,566号に基づく優先権を
主張する)、van Ginkel et al., J. Immunol 159(2): 685-93 (1997)（アデノウ
ィルス遺伝子輸送が、ベクターおよびその導入遺伝子に対する顕著な肺関連ヘル
パーＴ細胞反応を誘導する）、Osterhaus et al., Immunobiology 184 (2-3): 1
80-92 (1992)（ヒトにおける急性呼吸器ウィルス感染症および麻疹に対するワク
チン接種）、１９９９年４月２３日出願のPCT/US99/08895の１９９９年１０月２
８日公開の国際特許公開第WO99/53940号(Briles et al. or UAB)、および２００
０年３月２８日発行の米国特許第6,042,838号(Briles et al. or UAB)、および
米国特許第6,004,802号(Briles et al. or UAB)のそれぞれにおいて参照または
引用されている文献中において引用または参照されている全ての文献が参照によ
ってこの中に組み込まれる。１９９９年１１月２３日発行の米国特許第5,990,09
1号、国際特許公開第WO99/60164号、第WO98/00166号、van Ginkel et al., J. I
mmunol 159(2): 685-93 (1997)、Osterhaus et al., Immunobiology 184 (2-3):
180-92(1992)、国際特許公開第WO99/53940号、米国特許第6,042,838号および第6
,004,802号に記載の情報を本発明の実施のための基礎とすることができる（例え
ば、発現産物、抗体およびそれらの使用、外因性核酸分子のin vivoおよびin vi
troでの発現のためのベクター、関心エピトープまたは抗原または薬剤等をコー
ドする外因性核酸分子、プロモーター、そのようなベクターまたは核酸分子また
は発現産物または抗体を含む組成物、用量等）。本発明に基づいて得られた免疫
産物および／または抗体および／または発現産物をin vitroで発現させ、かつそ
のような免疫産物および／または発現産物および／または抗体を局所的に用いる
ことができ、さらにそのような免疫産物および／または発現産物および／または
抗体をin vitroおよびex vivo適用で用いることができ、例えば、そのような使
用および投与は診断、測定、ex vivo治療を含んでいて差し支えない（例えば、
遺伝子産物および／または免疫反応物を発現する細胞をin vitroで増やし、さら
に、宿主または動物に再導入する）（米国特許第5,990,091号、国際特許公開第W
O99/60164号、WO98/00166号、WO99/53940号および米国特許第6,042,838および第
6,004,802号、ならびにそれらにおいて引用されている文献およびそのような文
献において引用または参照されている文献を参照）。さらには、この中に記載の
方法によって単離された、またはこの中に記載の投与方法の後にin vitroで増や
した細胞から単離された発現抗体または遺伝子産物を、サブユニットエピトープ
または抗原または薬剤または抗体の投与と同様に、組成物中に含めて投与し、免
疫を誘導し、治療反応を刺激しおよび／または受動免疫を刺激することができる
。投与されるべき用量は、患者（宿主）および治療される症状によって変化し、
さらに、１〜数マイクログラムから数百〜数千マイクログラムまで変化するであ
ろう（例えば、１μｇから１ｍｇ、１日当たり約１００ｎｇ／ｋｇ体重から１０
０ｍｇ／ｋｇ体重、さらに好ましくは、1日当たり１０ｐｇ／ｋｇから１０ｍｇ
／ｋｇ）。遺伝子産物（例えばエピトープ、抗原、薬剤、および／または抗体）
の組成物の規定量を達成するための用量でベクターを患者または宿主に非侵襲的
に投与することができる。もちろん、この中に例示されている用量より少ない用
量およびそれを超える用量を本発明は想定しており、さらに、動物またはヒトに
投与すべき任意の組成物（その成分を含む）に関して、および任意の特定投与方
法に関して：毒性（例えばマウス等の齧歯動物のような適切な動物モデルにおい
て致死量（ＬＤ）およびＬＤ５０を特定する等）；ならびに、適切な反応を誘導
するような、組成物の用量、その中の成分の濃度、および組成物を投与するタイ
ミング（例えばＥＬＩＳＡおよび／または血清中和分析による血清の滴定および
その分析によって）：を特定することが好ましい。そのような特定は、熟練者の
知識、本開示およびこの中で引用されている文献に基づき、過度の実験を必要と
しない。さらに、本発明は、発明組成物の連続投与またはこの中に記載の方法の
連続実施（例えば、症状の治療または処置および／または免疫組成物の追加投与
および／またはプライム−ブースト法の過程における、発明組成物の定期的投与
）を含み：さらに、過度の実験無しに、連続投与の回数および方法を特定するこ
とができる。さらには、本発明は：in vivoおよび／またはin vitroおよび／ま
たはex vivoで（例えば、in vitroとex vivoの場合、本発明に基づいて非侵襲的
に投与された宿主から得た細胞（例えばそのような細胞を必要に応じて増やした
後）から単離した後）、遺伝子産物および／または免疫産物および／または抗体
を作成する方法；ならびに、診断、測定、治療、処置等におけるそのような遺伝
子産物および／または免疫産物および／または抗体の使用：を含む、ベクターを
作成および用いるための組成物および方法を含む。ベクターを適切な担体または
希釈剤と共に混合することによって、ベクター組成物を製剤化し；さらに同様に
、遺伝子産物および／または免疫産物および／または抗体を適切な担体または希
釈剤と共に混合することによって、遺伝子産物および／または免疫産物および／
または抗体の組成物を製剤化する（例えば、米国特許第5,990,091号、国際特許
公開第WO99/60164号、WO98/00166号、WO99/53940号および米国特許第6,042,838
号および第6,004,802号、ならびにそれらにおいて引用されている文献、および
本明細書において引用されている他の文献、および本明細書における他の教示（
例えば、担体、希釈剤等に関して）を参照）。
【００５２】 鼻腔内または呼吸器（粘膜）投与が望ましい場合、圧搾スプレーディスペン
サー、ポンプディスペンサーまたはエアゾルディスペンサーによって製剤化およ
び投与される。組成物を口または口腔（例えば頬側または舌下）粘膜に輸送する
ためにそのようなディスペンサーを用いても差し支えない。エアゾルは通常、炭
化水素により加圧されている。ポンプディスペンサーは、好ましくは、定量また
は特定の粒子径を有する一定量を噴霧させることができる。
【００５３】 本発明の組成物は、特に経口投与（または頬側または舌下投与）される場合に
飲み易くするために、薬剤的に許容される香味料および／または着色剤を含んで
いて差し支えなく；さらに、そのような組成物は、口の中で溶解する、または噛
まれて液体を放出して、頬側でまたは舌下で吸収されるような（例えばニトログ
リセリンまたはニフェジメン等の狭心症のための経口、舌下または頬側用の薬剤
に類似の）、錠剤またはカプセルの形態であって差し支えない。粘性組成物は、
ゲル、ローション、軟膏、クリーム等の形態であって差し支えなく（例えば、局
所および／または粘膜および／または鼻腔内および／または経口および／または
口腔内および／または舌下および／または頬側投与のために）、通常、その粘度
が約2500から6500cps（10,000cpsまでのより粘度の高い組成物を使用できるが）
となるように十分な量の増粘剤を含むであろう。粘性組成物は、2500から5000cp
sの粘度の範囲を越えると投与するのが困難となるため、好ましくは2500から500
0cpsの粘度を有する。しかしながら、その範囲より粘度が高い場合は、経口摂取
のための嚥下剤として容易に投与できる固形またはゼラチンの形態および／また
は例えば頬側もしくは舌下投与等のために口腔内に保持するための丸薬またはカ
プセルまたは錠剤の形態に、その組成物を製剤化して差し支えない。
【００５４】 液体製剤は通常、ゲル、他の粘性組成物、および固形組成物よりも、調製が容
易である。さらには、液体組成物は、動物、子供、とりわけ幼児、ならびに丸剤
、錠剤、およびカプセル等を嚥下するのが困難である他の人達に、あるいは多様
な量の条件下で、特に注射または経口または頬側または舌下により投与するのに
多少都合がよい。一方、例えば胃または鼻腔粘膜の内壁のような粘膜と長期間接
触させ、あるいは舌下または頬側または口腔内で吸収させるために、粘性組成物
を適切な粘度範囲内に調製することができる。
【００５５】 明らかに、適切な担体および他の添加剤の選択は、正確な投与経路、ならびに
例えば液体の剤形（例えばその組成物を溶液、懸濁液、ゲルまたは他の液体製剤
のいずれの形態にすべきか）あるいは固形の剤形（例えばその組成物を丸薬、錠
剤、カプセル、カプレット、除放性製剤、または液体被覆製剤のいずれの形態に
すべきか）のような特定の剤形の性質に依存するであろう。
【００５６】 溶液、懸濁液およびゲルは、通常、抗原、リポタンパク質、および任意のアジ
ュバントに加えて、大部分を占める水（好ましくは精製水）を含む。ｐＨ調節剤
（例えばNaOHのような塩基）、乳化剤または分散剤、緩衝剤、防腐剤、湿潤剤、
軟化剤(jelling agent)（例えばメチルセルロース）、着色剤および／または香
味料のような少量の他の成分も含んでいて差し支えない。本組成物は、等張、す
なわち血液および涙液と同じ浸透圧を有するであろう。
【００５７】 本発明組成物の所望の等張性は、食塩、あるいは例えばデキストロース、ホウ
酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコールまたは他の無機もしくは有機の溶
質のような他の薬剤的に許容される物質を用いて達成できる。食塩はナトリウム
イオンを含む緩衝溶液において特に好ましい。
【００５８】 本組成物の粘度は、薬剤的に許容される増粘剤を用いて選択されたレベルに維
持することができる。メチルセルロースは、容易にかつ安価に利用でき、さらに
使い易いため好ましい。他の適切な増粘剤として、例えばキサンゴム(xanthan g
um)、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマ
ー等が挙げられる。増粘剤の好ましい濃度は、選択された薬剤に依存するであろ
う。重要な点は、選択された粘度をもたらすと考えられる量を用いることである
。粘性組成物は通常、そのような増粘剤の添加によって溶液から調製される。
【００５９】 薬剤的に許容される防腐剤は、組成物の保管期間を延ばすために使用される。
例えばパラベン、チメロサール、クロロブタノール、または塩化ベンザルコニウ
ム等の種々の防腐剤を使用することができるが、ベンズアルコールが適切であろ
う。防腐剤の適切な濃度は、選択された薬剤に基づきかなり変化するが、０．０
２重量％から２重量％であろう。
【００６０】 ベクターまたは抗原または関心エピトープおよび任意のアジュバントまたは他
の活性成分または免疫増強成分に関して、化学的に不活性となるように本組成物
の成分を選択しなければならないことを当業者は理解するであろう。このことは
化学または製薬業界における当業者に問題とはならないであろうし、または標準
的教科書を参照することにより、または簡単な実験（過度の実験は含まない）に
より、本開示およびこの中で引用されている文献から、問題を容易に回避するこ
とができる。
【００６１】 本発明の免疫学的に有効な組成物は、一般的に認められた方法に従って材料を
混合することにより調製される。例えば、選択した成分をブレンダーまたは他の
標準的装置において単に混合して、水または増粘剤および場合によってはｐＨを
制御するために緩衝剤または弾性力を制御するために追加の溶質を添加すること
によって、最終濃度および粘度に調整され得る濃縮混合物を作成することができ
る。通常、ｐＨは約３から７．５の範囲であろう。特定の患者または動物の年齢
、性別、体重、および症状のような因子、ならびに投与に用いられる組成物の形
態（例えば固形または液体）を考慮して、医療および獣医業界の当業者に周知で
ある用量および技術により組成物を投与することができる。本開示、この中で引
用されている文献、以下の実施例、ならびにこの中で引用されている特許出願、
特許および他の文献およびこの中で引用されている文献において引用または参照
されている文献（それらの全てが参照によってこの中に組み込まれる）から、熟
練者が過度の実験無しに、ヒト、または他の哺乳類の用量を決定できる。
【００６２】 初回投与および追加投与の用量または連続投与ための適切な投与計画は変更可
能であり、初回投与の後に連続投与が続く場合も含まれ；しかしそれにもかかわ
らず、熟練者は、本開示、ならびにこの中で引用されている特許出願、特許およ
び他の文献およびこの中で引用されている文献において引用または参照されてい
る文献（それらの全てが参照によってこの中に組み込まれる）を含むこの中で引
用されかつ参照によって組み込まれている文献、ならびに以下の実施例から、適
切な投与計画を特定することができる。本組成物単独で、あるいは本発明の他の
組成物と共にまたは他の予防的もしくは治療組成物と共に、本組成物を同時投与
または連続投与して差し支えない。
【００６３】 別の好ましい実施形態において、ベクターは、インフルエンザ血液凝集素、イ
ンフルエンザ核タンパク質、インフルエンザＭ２、破傷風毒素Ｃ断片、炭疽菌防
御抗原、炭疽菌致死因子、狂犬病糖タンパク質、ＨＢＶ表面抗原、ＨＩＶ ｇｐ
120ＨＩＶ ｇｐ 160、ヒト癌胎児性抗原、マラリアＣＳＰ、マラリアＳＳＰ、マ
ラリアＭＳＰ、マラリアｐｆｇ、およびマイコバクテリウム・ツベルクローシス
ＨＳＰ、あるいはそれらの変異体をコードする遺伝子を発現する。
【００６４】 本発明の実施形態において、動物における免疫反応は、動物細胞において関心
抗原をコードする遺伝子を発現する遺伝子ベクターによって誘導される。本発明
の別の実施形態において、関心抗原は、インフルエンザ血液凝集素、インフルエ
ンザ核タンパク質、インフルエンザＭ２、破傷風毒素Ｃ断片、炭疽菌防御抗原、
炭疽菌致死因子、狂犬病糖タンパク質、ＨＢＶ表面抗原、ＨＩＶ ｇｐ 120ＨＩ
Ｖ ｇｐ 160、ヒト癌胎児性抗原、マラリアＣＳＰ、マラリアＳＳＰ、マラリア
ＭＳＰ、マラリアｐｆｇ、およびマイコバクテリウム・ツベルクローシスＨＳＰ
より成る群から選択される。本方法の別の実施形態において、動物の細胞は表皮
細胞である。本方法の別の実施形態において、免疫反応は、病原菌または新生物
に対する反応である。本方法の別の実施形態において、遺伝子ワクチンは、予防
ワクチンまたは治療ワクチンとして用いられる。本発明の別の実施形態において
、遺伝子ベクターは、動物の細胞において関心抗原を発現できる遺伝子ベクター
を含む。本方法のさらに別の実施形態において、動物は脊椎動物である。
【００６５】 ベクターにおいて発現させる外因性ＤＮＡ（例えば関心エピトープおよび／ま
たは抗原および／または薬剤をコードする）およびそのような外因性ＤＮＡを提
供する文献に関して、ならびに核酸分子の発現を高めるための転写および／また
は翻訳因子の発現に関して、ならびに例えば「関心エピトープ」、「薬剤」、「
免疫反応」、「免疫反応」、「防御免疫反応」、「免疫組成物」、「免疫原性組
成物」、および「ワクチン組成物」等に関して、１９９９年１１月２３日発行の
米国特許第5,990,091号、国際特許公開第WO98/00166号およびWO99/60164号、な
らびにそれらにおいて引用されている文献およびそれら特許および国際特許出願
の遂行における記録の書類（それらの全てが参照によってこの中に組み込まれる
）を参照する。従って、米国特許第5,990,091号、国際特許公開第WO98/00166号
およびWO99/60164号、ならびにそれらにおいて引用されている文献およびそれら
特許および国際特許出願の遂行における記録の書類、さらにはこの中で引用され
または参照によって組み込まれている他の文献を本発明の実施において参考にす
ることができ；さらに、それらの中で挙げられている全ての外因性核酸分子、プ
ロモーターおよびベクターを本発明の実施において用いることができる。これに
関連して、米国特許第6,004,777号、第5,997,878号、第5,989,561号、第5,976,5
52号、第5,972,597号、第5,858,368号、第5,863,542号、第5,833,975号、第5,86
3,542号、第5,843,456号、第5,766,598号、第5,766,597号、第5,762,939号、第5
,756,102号、第5,756,101号、第5,494,807号、第6,042,838号、第6,004,802号お
よび国際特許公開第99/53940号に言及する。
【００６６】 本発明の別の実施形態において、動物は、好ましくは、例えば魚類、鳥類、爬
虫類、両生類または哺乳類等の脊椎動物であり；さらに好ましくは、例えば、ウ
シ、ウマ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタまたは家禽（例えばニワトリ、アヒ
ル、七面鳥）のような、ヒトまたはコンパニオン動物、飼い動物、食料生産動物
、家畜、狩猟用動物、レース用動物、スポーツ用動物である。本発明の特に好ま
しい別の実施形態において、脊椎動物はヒトである。本発明の別の実施形態にお
いて、遺伝子ベクターは、ウィルスベクター、細菌ベクター、原生動物ベクター
、レトロトランスポゾン、トランスポゾン、ウィルスの外殻(viral shell)、ま
たはＤＮＡベクターである。本発明の別の実施形態において、ウィルスベクター
、細菌ベクター、原生動物ベクター、またはＤＮＡベクターは、組換えベクター
である。本発明の別の実施形態において、免疫反応はインフルエンザＡに対する
反応である。本発明の別の実施形態において、インフルエンザ血液凝集素、イン
フルエンザ核タンパク質、インフルエンザＭ２またはそれらの断片をコードする
遺伝子を動物において発現する遺伝子ベクターによって、インフルエンザＡに対
する免疫反応が誘導される。本発明の別の実施形態において、遺伝子ベクターは
、ウィルスベクターおよびプラスミドＤＮＡより成る群から選択される。本発明
の別の実施形態において、遺伝子ベクターはアデノウィルスである。本発明の別
の実施形態において、アデノウィルスベクターは、そのＥ１領域を欠いている。
本発明の別の実施形態において、アデノウィルスベクターは、そのＥ３領域を欠
いている。本発明の別の実施形態において、アデノウィルスベクターは、そのＥ
１およびＥ３領域を欠いている。本発明の別の実施形態において、ＤＮＡはプラ
スミド形態である。本発明の別の実施形態において、接触工程は、関心遺伝子を
包含する遺伝子ベクターを輸送手段上に組み込み、さらに関心遺伝子を包含する
遺伝子ベクターを有する前記手段を動物の皮膚に適用する工程をさらに含む。本
発明の別の実施形態において、遺伝子ベクターは、免疫調節遺伝子、副刺激遺伝
子またはサイトカイン遺伝子をコードする。本発明の別の実施形態において、ベ
クターは、ウィルス遺伝子を欠いている。本発明の別の実施形態において、遺伝
子ベクターは、動物において抗腫瘍効果を誘導する。本発明のさらに別の実施形
態において、遺伝子ベクターは、癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、または腫瘍関連遺
伝子を発現する。
【００６７】 また、本発明は、動物における非侵襲的遺伝子免疫の方法であって、その動物
において免疫反応を誘導するのに有効な量の遺伝子ベクターと動物の皮膚とを接
触させる工程を含む方法を提供する。
【００６８】 本発明の方法を用いて免疫反応を誘導するために用いることができる抗原の代
表的な例示として、インフルエンザ血液凝集素、インフルエンザ核タンパク質、
インフルエンザＭ２、破傷風毒素Ｃ断片、炭疽菌防御抗原、炭疽菌致死因子、狂
犬病糖タンパク質、ＨＢＶ表面抗原、ＨＩＶ ｇｐ 120ＨＩＶ ｇｐ 160、ヒト癌
胎児性抗原、マラリアＣＳＰ、マラリアＳＳＰ、マラリアＭＳＰ、マラリアｐｆ
ｇ、およびマイコバクテリウム・ツベルクローシスＨＳＰ等が挙げられる。最も
好ましくは、免疫反応は、新生物または伝染性病原菌に対して防御効果をもたら
す。
【００６９】 本発明の実施は、動物を免疫するためまたは薬剤を投与するための非侵襲的方
法によって、ポリペプチドを作動可能にコードする遺伝子ベクターを脊椎動物の
皮膚の外層に輸送することを含む。何れの手段も用いないで皮膚に直接遺伝子物
質を運搬することによって、または包帯または包帯様手段を利用して、むき出し
の皮膚に接触させることによって、それら遺伝子ベクターを脊椎動物に投与する
子ができる。好ましい適用において、遺伝子ベクターは水溶液である。凍結乾燥
粉末から再構築されたベクターも利用できる。ベクターは、発現に必要な転写／
翻訳シグナルと共に、完全な遺伝子、１つまたは複数の遺伝子の断片、例えばユ
ビキチンまたはＣｐＧリッチな合成ＤＮＡのような免疫調節配列と融合させた遺
伝子断片をコードするであろう。
【００７０】 本発明の別の実施形態において、ベクターは、副刺激遺伝子およびサイトカイ
ン遺伝子より成る群から選択される遺伝子をさらに含む。本方法において、遺伝
子は、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子、Ｂ７-１遺伝子、Ｂ７-２遺伝子、インターロイキン
-２遺伝子、インターロイキン-１２遺伝子およびインターフェロン遺伝子より成
る群から選択される。
【００７１】 本発明のさらに別の実施形態において、反応は破傷風菌感染症に対する反応で
あり、あるいは、ベクターはAdCMV-tetC:IMまたpCMV-tetCを含む。本方法のさら
に別の実施形態において、外因性核酸分子は、破傷風毒素Ｃ断片、または破傷風
毒素の抗原またはエピトープをコードする。
【００７２】 また、本発明は、非侵襲的にインフルエンザＡウィルスに対する免疫反応を誘
導する方法であって：投与した動物において抗インフルエンザ効果を誘導するよ
うなインフルエンザ特異的抗原またはその断片をコードする遺伝子ベクターの免
疫学的に有効な量を投与することによって、そのような処置を局所的に必要とす
る被検者の皮膚とベクターとを接触させる：工程を含む方法を提供する。本方法
の１つの実施形態において、遺伝子ベクターは、ウィルスベクターおよびプラス
ミドＤＮＡより成る群から選択される。本方法の別の実施形態において、遺伝子
ベクターはアデノウィルスである。本方法の別の実施形態において、アデノウィ
ルスベクターは、そのＥ１およびＥ３領域を欠いている。本方法のさらに別の実
施形態において、ＤＮＡはプラスミド形態である。本方法のさらに別の実施形態
において、接触工程は、関心遺伝子を包含する遺伝子ベクターを輸送手段上に組
み込み、さらに関心遺伝子を包含する遺伝子ベクターを有する前記手段を動物の
皮膚に適用する工程をさらに含む。
【００７３】 組換えアデノウィルスを用いる本発明の実施形態は、Ｅ１-欠損、Ｅ３-欠損、
および／またはＥ４欠損アデノウィルスベクター、あるいは全てのウィルス遺伝
子が欠損した「弱い(gutless)」アデノウィルスベクターを含む。Ｅ１欠損アデ
ノウィルス変異体は非許容性細胞において複製する能力がないため、Ｅ１変異は
ベクターの安全域を引き上げる。Ｅ３変異は、アデノウィルスがＭＨＣクラスＩ
分子を抑制する機構を破壊することによって、抗原の免疫原性を高める。Ｅ４変
異は、遅い遺伝子発現を抑制することによってアデノウィルスの免疫原性を減ら
し、従って、同じベクターを利用した連続再ワクチン接種を可能とする。「弱い
」アデノウィルスベクターは、アデノウィルスベクターファミリーにおける最新
のモデルである。その複製は、ヘルパーウィルス、ならびにＥ１ａおよびＣｒｅ
の両方を発現している特定のヒト２９３細胞株といった、自然環境において存在
しない条件を必要とし；そのベクターは全てのウィルス遺伝子を剥奪されており
、従って、ワクチン担体としてのベクターは非免疫原性であり、さらに再ワクチ
ン接種のために複数回接種することができる。「弱い」アデノウィルスベクター
は、導入遺伝子を収納するための３６ｋｂの空間を含み、従って、細胞に多くの
抗原遺伝子を同時輸送することができる。例えばＲＧＤモチーフのような特定配
列モチーフをアデノウィルスベクターのＨ-Ｉループ中に挿入して、その感染性
を高めることができる。例えば上記のような任意のアデノウィルスベクター中に
特定導入遺伝子または導入遺伝子の断片をクローニングすることによって、組換
えアデノウィルスを構築する。組換えアデノウィルスを用いて、免疫剤として使
用するために、非侵襲的形態で脊椎動物の表皮細胞に形質導入する。
【００７４】 ＤＮＡ／アデノウィルス複合体を用いる本発明の実施形態は、例えばＰＥＩ（
ポリエチレンイミン）またはポリリジンのどちらかのような、それに適した薬剤
を用いてアデノウィルスベクターと複合体を形成したプラスミドＤＮＡを含む。
その複合体内のアデノウィルスベクターは、「生きて」いても、あるいはＵＶま
たはγ線照射によって「死んで」いても差し支えない。受容体結合リガンドとし
ての、およびＤＮＡ介在トランスフェクションを促進させるためのエンドソモリ
シス(endosomolysis)剤としての(Cotton et al., 1992)、照射-不活化アデノウ
ィルスベクターは、ワクチン担体の安全域を引き上げることができる。ＤＮＡ／
アデノウィルス複合体を用いて、免疫剤として使用するために、非侵襲的形態で
脊椎動物の表皮細胞をトランスフェクトする。
【００７５】 ＤＮＡ／リポソーム複合体を使用する本発明の実施形態は、リポソームを形成
するための材料、およびそれら材料から作られたＤＮＡ／リポソーム複合体を含
む。ＤＮＡ／リポソーム複合体を用いて、免疫剤として使用するために、非侵襲
的形態で脊椎動物の表皮細胞をトランスフェクトする。
【００７６】 本発明によって提供された遺伝子ベクターは、液性および／または細胞性免疫
反応を誘導するためのアジュバント剤として作用できる免疫調節分子をコードし
ていて差し支えない。そのような分子として、サイトカイン、副刺激分子、また
は免疫反応の進路を変化させ得る任意の分子が挙げられる。抗原の免疫原性をさ
らに高めるためにその技術を修飾できるような方法を人は考えつくことができる
。
【００７７】 ＮＩＶＳのために使用される遺伝子ベクターは任意の形態であって差し支えな
く、さらに、本発明は、特定ポリペプチドをコードする特定遺伝子物質に限定さ
れない。皮膚標的非侵襲的ワクチン担体として用いられる場合、ウィルスベクタ
ー、細菌ベクター、原生動物ベクター、トランスポゾン、レトロトランスポゾン
、ウィルス様粒子、およびＤＮＡベクターを含む遺伝子ベクターの全ての形態が
、本発明によって熟慮されている方法に含まれる。
【００７８】 特定の手段を含まない局所適用等の種々の方法によって、またはパッドまたは
包帯（例えばバンドエイド）のような手段によって、動物の皮膚の表面をウィル
スで被覆することによって、遺伝子を輸送することができる。図１１は、非侵襲
的ワクチン接種のための手段を示す。そのワクチン輸送手段は、その中に設置さ
れたブレブ(bleb)を有する非アレルギー性で皮膚接着性のパッチを含む。１つの
実施形態において、パッチは、直径約１ｃｍのプラスチックをさらに含む。ワク
チンはブレブ内に配置される。別の実施形態において、ブレブは、約１ｍＬのワ
クチンを含有する（液体として、再構成用の液体と共に凍結乾燥粉末として、お
よびそれらの変形物として）。好ましい実施形態において、圧力が反対表面に与
えられた場合に、下側の表面が破れてブレブ内のワクチン内容物を皮膚上に放出
するように、皮膚と接触するブレブの表面は、反対表面よりも意図的に弱くなっ
ている。プラスチックパッチは、皮膚表面にワクチンを捕らえる。
【００７９】 本発明の遺伝子ベクターおよび関心遺伝子の局所投与のための剤形として、液
体、軟膏、粉末およびスプレーが挙げられる。要求またはたは要望される生理学
的に許容される担体および任意の防腐剤、緩衝剤、高圧ガス、または吸収増強剤
と、活性成分とを、滅菌条件下において混合することができる。例えば、米国特
許第5,990,091号、第6,042,838号および第6,004,802号、国際特許公開第WO98/00
166号およびWO99/60164号およびWO99/53940号のようなこの中で引用されている
文献、ならびに、ベクターを構築するための方法および局所適用のための組成物
（例えば、クリームおよび軟膏のような粘性組成物、ならびに鼻腔内および／ま
たは粘膜および／または口腔内および／または頬側および／または舌下投与のた
めの組成物）に関するそれら文献において引用されている文献を参照する。
【００８０】 この中で用いられている専門用語において、免疫学的に有効な量は、動物に投
与した場合に関心遺伝子産物に対する免疫反応をもたらすような関心遺伝子をコ
ードする遺伝子ベクターの量または濃度である。
【００８１】 種々のエピトープ、抗原または薬剤を、異なる濃度で発現させることによって
、局所的に輸送することができる。通常、アデノウィルスベクターの有効量は、
少なくとも約１００pfuであり、さらにプラスミドＤＮＡでは少なくとも約１ｎ
ｇ ＤＮＡである。本開示および当業界での知識（この中で引用されかつ参照に
よって組み込まれている文献を含む）から、過度の実験無しに、他の量を確認す
ることができる。
【００８２】 予防ワクチンとして疾患を予防するために、または治療ワクチンとして疾患を
治療するために、本発明の方法を適切に適用することができる。
【００８３】 本発明のワクチンを単独で、あるいは免疫組成物の一部として、動物に投与す
ることができる。
【００８４】 記載されているヒトワクチン以外にも、動物系統を免疫するために本発明の方
法を用いることができる。動物の用語は、ヒトを含む全ての動物を意味する。動
物の例示として、ヒト、ウシ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、七面鳥
、アヒル、およびニワトリ等が挙げられる。全ての脊椎動物の免疫系は同様に働
くため、全ての脊椎動物系において、記載の用途を実施することができる。
【００８５】 以下の実施例は、本発明の種々の実施形態を例示する目的で与えられており、
いずれにしても、本発明を限定することを意味しない。
【００８６】実施例 プロトコル マウスおよび細胞培養 近交系マウスは、バーミンガムのアラバマ大学で維持された。細胞は、２％ウ
シ胎仔血清および６％仔牛血清を含有するRPMI 1640またはDMEM培地中において
培養した。
【００８７】 遺伝子ベクターの局所適用 マウスに麻酔し、ブラシまたは脱毛剤（例えばＮＡＩＲ）によって、腹部また
は頸部の皮膚の限定領域を覆う毛および角化表皮を除いた。剃髪した皮膚上に遺
伝子ベクターをピペットで採って載せ、様々な時間（例えば１時間から１８時間
）、むき出しの皮膚とベクターとを接触させた。ピペットで直接むき出しの皮膚
上にベクターを載せて差し支えなく、あるいは皮膚に接着剤でくっつけたシリン
ダに入れて差し支えない。
【００８８】 アデノウィルスベクターの調製 特定の組換えアデノウィルスに感染したヒト２９３細胞から高力価アデノウィ
ルスストックを調製した。溶解物を塩化セシウム密度勾配によって超遠心した。
ウィルス層を抽出し、さらに10mM Tris(pH7.5)/135mM NaCl/5mM KCl/1mM MgCl2
で透析した。１０％まで添加したグルセロールと共に精製ウィルスを濾過滅菌し
、−８０℃で一部を保存した。アデノウィルスストックの力価をプラークアッセ
イで特定した。
【００８９】 ルシフェラーゼ測定法 以前記載したように(Tang, 1994)、皮膚におけるルシフェラーゼの量を特定し
た。簡単には、Kontesガラス組織粉砕機を用いて、溶解バッファー中において、
摘出した皮膚の断片をホモジナイズした。遠心によって組織片を除去した後、過
剰のＡＴＰおよびルシフェリンの存在下における集積発光強度の測定によって、
皮膚抽出物中のルシフェラーゼ活性を特定した。
【００９０】 β―ガラクトシダーゼ測定法 液体窒素中、Tissue-Tek O.C.T.コンパウンド(Miles Laboratories Inc.)中に
おいて、摘出した皮膚断片を急いで凍結し、使用するまで−８０℃で保存した。
その凍結組織を４μｍの厚さにスライスし、４％パラホルムアルデヒド中におい
て固定し、さらに、以前記載のように(Tang et al., 1994)、Ｘ-gal染色液中で
インキュベートすることによってβ-ガラクトシダーゼ活性に関して染色した。
ヘマトキシリンおよびエオシンで切片を対比染色した。
【００９１】 ＤＮＡ／アデノウィルス複合体の調製 各投与のために、縮合剤ポリリジンの存在下において、１００μｇのプラスミ
ドＤＮＡと１ｘ１０11粒子のアデノウィルスとを混合することによって、ＤＮＡ
／アデノウィルス複合体を調製した。吸光度によってアデノウィルスの力価を特
定した。
【００９２】 ＤＮＡ／リポソーム複合体の調製 各投与のために、１００μｇのプラスミドＤＮＡと１００μｇのＤＯＴＡＰ／
ＤＯＰＥ(１：１； Avanti)とを混合することによって、ＤＮＡ／リポソーム複
合体を調製した。Qiagen Plasmid Maxiキットを用いてプラスミドを調製した。
【００９３】 ウェスタンブロット分析 尾部出血からの血清を１：２５０−１：５００に希釈し、ＳＤＳ-ポリアクリ
ルアミドゲル中において分離しさらにImmobilon-P膜(Millipore)に移した精製タ
ンパク質と反応させた。ＥＣＬキット(Amersham)を用いて反応を可視化した。
【００９４】 実施例１ 本発明は、高度な設備を用いることなく、遺伝子ベクターの皮膚標的非侵襲的
輸送によって、簡素化されたやり方で、マウスの皮膚に抗原遺伝子を輸送できる
ことを示す。図１は、限られた量のAdCMV-luc（ホタルルシフェラーゼをコード
するアデノウィルスベクター）を皮膚に輸送後、相当量のルシフェラーゼ酵素が
産生されることを示す(Tang et al., 1994)（Ａｄ、アデノウィルス；pfu、プラ
ーク形成単位；ＬＵ、光単位）。結果は、ｌｏｇ［ＬＵ／ｃｍ2皮膚］（平均値
）±ＳＥ（各カラムの先端部にｎを示す）で示されている。偽投与またはルシフ
ェラーゼをコードしないアデノウィルスベクターを投与されたマウスは、皮膚に
おいて検出可能なルシフェラーゼ活性を産生しなかった。皮膚におけるアデノウ
ィルスベクターからの導入遺伝子の発現レベルは、ウィルスの力価と相関しなか
った。限定された皮膚の部分においてほんのわずかな細胞のみがウィルスによっ
て形質導入され、１０8プラーク形成単位（pfu）の組換えアデノウィルスが標的
細胞を飽和させた可能性がある。その変動性は、おそらく部分的に、個々のマウ
スのばらつきのせいであろう。さらには、標準化されていない角化表皮を除去す
る方法からある程度の変動が生じる(Johnston and Tang, 1994)。産生される抗
原の量は、より広範囲に、より多くのベクターを投与することによって増幅され
る可能性がある。
【００９５】 実施例２ 大腸菌β-ガラクトシダーゼ遺伝子をコードするアデノウィルスベクター(AdCM
V-βgal)の皮膚標的非侵襲的輸送後にX-gal基質で凍結切片を染色することによ
って示されているように、皮膚への非侵襲的ワクチン接種の主な標的細胞は、毛
嚢内の毛マトリックス細胞（図２ａ）および表皮の最外層内のケラチノサイト（
図２ｂ）であるように思われた(Tang et al., 1994)。処置を受けた皮膚組織に
おいて、物理的剥離は認められず、さらに炎症は全く生じなかった。１０８pfu
のAdCMV-βgalを皮膚上にピペットで載せた後、１日後、非侵襲的遺伝子輸送を
受けた皮膚組織を切除し、切片を作成し、固定し、さらに記載のX-gal基質で染
色した(Tang et al., 1994)。図２ａは、毛嚢内のアデノウィルス形質導入毛マ
トリックス細胞（ｘ１５０）を示す。図２ｂは、表皮の最外層内のアデノウィル
ス形質導入ケラチノサイト（ｘ１５０）を示す。偽投与されたまたはAdCMV-luc
を投与された対照動物においては、青く染色された細胞は全く認められなかった
。
【００９６】 実施例３ アデノウィルス介在ＮＩＶＳによる液性免疫反応の誘導 ＮＩＶＳは、動物にワクチン接種するための新規な方法である。その方法が、
ベクターによってコードされる抗原に対して特異的免疫反応を誘導できることを
実証するために、AdCMV-hcea（ヒト癌胎児性抗原(ＣＥＡ)）をコードするアデノ
ウィルスベクター）をＣ５７ＢＬ／６マウスの皮膚上にピペットで載せた。１０８ pfu AdCMV-hceaの皮膚標的非侵襲的輸送の１ヶ月後、ワクチン接種マウスから
採取した血清を１：５００に希釈し、さらに、精製ヒトＣＥＡタンパク質(T. St
rongによって提供された)および５％ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲルで分離しさ
らにImmobilon-P膜(Millipore)に移したアデノウィルスタンパク質と反応させた
。図３ａを参照（レーン１, ０．５μgヒトＣＥＡ；レーン２, ０．５μgＢＳＡ
；レーン３, １０7pfuアデノウィルス）。図３ａは、ワクチン接種動物から採取
した試験血清が、ウェスタンブロットにおいて、精製ヒトＣＥＡタンパク質と反
応するが、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とは反応しないことを示し、そのこと
は、皮膚標的非侵襲的遺伝子輸送の結果として、アデノウィルスベクターによっ
てコードされている外因性タンパク質に対する特異的抗体が産生されたという結
論を支持する。
【００９７】 本技術を一般的に適用できるか否かを調べるために、AdCMV-hgmcsf（ヒト顆粒
球マクロファージコロニー刺激因子(ｈＧＭ−ＣＳＦ)をコードするアデノウィル
スベクター）を皮膚上に投与した。ヒトＧＭ−ＣＳＦタンパク質に対する抗体を
検出するため、１０８pfu AdCMV-hgmcsfの皮膚標的非侵襲的輸送によって、動物
にワクチン接種した。１５％ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲルで分離した精製ヒ
トＧＭ−ＣＳＦタンパク質(CalBiochem)を膜に移し、さらに希釈した血清と反応
させた。図３ａに記載のように、他の処置を実施した。図３ｂを参照（レーン１
, ０．２５μgヒトＧＭ−ＣＳＦ；レーン２, ０．５μgＢＳＡ；レーン３, １０7 pfuアデノウィルス）。複製欠損ヒトアデノウィルス血清型５由来のAdCMV-hcea
およびAdCMV-hgmcsfをヒト２９３細胞において作成した。サイトメガロウィルス
（ＣＭＶ）初期エンハンサー−プロモーター要素によって作動されるヒトＣＥＡ
遺伝子またはヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を包含するカセットをＥ１ａ欠損の位置に
挿入した。Ｅ１ａ領域における配列が欠損しているため、非許容性細胞において
それらウィルスが自律的に複製する能力が損なわれた。
【００９８】 結果(Tang et al., 1997)は、AdCMV-hceaの皮膚標的非侵襲的輸送の１ヶ月後
、９６％（２３／２４）のＣ５７ＢＬ／６マウスがヒトＣＥＡタンパク質に対す
る抗体を産生し、さらに、AdCMV-hgmcsfの皮膚標的非侵襲的輸送後、４３％（６
／１４）のＣ５７ＢＬ／６マウスがヒトＧＭ−ＣＳＦタンパク質に対する抗体を
産生したことを示す。ＮＩＶＳの前に採取した免疫前血清および未処置動物から
採取した血清は、ヒトＣＥＡおよびＧＭ−ＣＳＦタンパク質と反応できなかった
。（１）動物が麻酔から回復する前に皮膚からベクターを洗浄除去し、（２）剃
っていない皮膚上にベクターをピペットで載せ、さらに（３）同じケージにおい
て処置を受けていない動物とワクチン接種動物とを混ぜることによって、毛繕い
によってベクターを摂取することによる経口ワクチン接種の可能性について見当
した。未処置マウスとワクチン接種マウスとの間で交差-ワクチン接種は全く観
察されず、毛を剃った経路に沿って角化表皮が機械的に除去されるため、毛剃り
はＮＩＶＳに必須の要素であるように思われた。従って、アデノウィルス介在Ｎ
ＩＶＳは、ベクターによってコードされている抗原に対する液性免疫反応を誘導
することができる。
【００９９】 実施例４ 本発明の技術が防御的抗腫瘍免疫反応を誘導できることを実証するために、ヒ
ト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）遺伝子(MC38-CEA-2)(Conry et al., 1995)を発現する
同系腫瘍細胞を未処置Ｃ５８ＢＬ／６マウスおよびヒトＣＥＡ遺伝子をコードす
るアデノウィルスベクター(AdCMV-hcea)の局所適用によってワクチン接種を受け
た同系マウスに接種した。腫瘍の攻撃摂取を受けた動物の生存を観察した（図４
）。対照群において、９０％（７／１０）の動物が、触診できる腫瘍塊を発生し
、かつ腫瘍細胞移植後３０日以内に死亡した。ワクチン接種群では、１０％（１
／１０）の動物のみが死亡し、かつ７０％（７／１０）の動物が全体として腫瘍
を発生しなかった。腫瘍径が１ｃｍを越えると、マウスを安楽死させた。腫瘍細
胞注射と安楽死との間の間隔を個々の生存期間として用いた。図４を参照して、
対照マウス（ワクチン投与されていない）およびＮＩＶＳによって免疫されたマ
ウス(１ヵ月前に１０８pfu AdCMV-hceaを局所適用した)に腫瘍を攻撃接種した。
括弧内の数は、各処置群の動物数を表す。結果は、遺伝子ワクチンの皮膚への非
侵襲的輸送が特異的抗原を発現する腫瘍細胞に対する防御的免疫反応を誘導でき
ることを示す。
【０１００】 実施例５ サイトカイン遺伝子および副刺激遺伝子をコードする組換えアデノウィルスベ クターの構築 ワクチン接種動物における免疫プロフィールを方向付ける目的で免疫調節遺伝
子と抗原遺伝子とを皮膚細胞内に同時輸送するために、副刺激遺伝子およびサイ
トカイン遺伝子をコードするアデノウィルスベクターを構築した。新しいアデノ
ウィルスベクターを作成するための標準的方法(Gomez-Foix et al., 1992)の後
、ヒト２９３細胞中にトランスフェクトされた２つのプラスミドの間での相同組
換えによって、マウスＢ７-1遺伝子をコードするアデノウィルスベクターAdCMV-
mB7.1およびマウスＧＭ-ＣＳＦ遺伝子をコードするアデノウィルスベクターAdCM
V-mgmcsfを構築した。それらベクター中の全ての導入遺伝子は、転写において、
ＣＭＶ初期エンハンサー−プロモーター要素によって作動された。形質導入ヒト
肺癌ＳＣＣ-５細胞を抗ＣＤ８０抗体(PharMingen)で染色し、その後、フローサ
イトメトリー分析を実施することによって、AdCMV-mB7.1を特徴づけした。ＥＬ
ＩＳＡキット(Amersham)を用いて形質導入ＳＣＣ-５細胞から分泌されたマウス
ＧＭ-ＣＳＦを測定することによって、AdCMV-mgmcsfを特徴付けした。
【０１０１】 実施例６ in vivo細胞傷害性測定法による抗腫瘍免疫の検出 マウスの筋肉組織上に単層として標的細胞を移植する、in vivo細胞傷害性測
定法が開発された(Tang et al., 1996)。単層としての標的細胞の移植は、in vi
voでの増殖の数日後におけるその最終結果を評価するために、標的細胞を効率的
に回収することを可能とする。本測定法は、標的細胞を全滅させる程は十分強く
ないような弱い免疫反応を検出するために特に有用であった。その移植床の組織
学的分析によって、免疫反応を特徴付けすることができる。免疫反応が無ければ
、標的細胞は増殖するであろう。強い免疫反応がある場合は、おそらく増殖する
標的細胞への遊走およびそれらの周りでのin situ感作によって移植床に多くの
免疫エフェクター細胞が存在して、標的細胞は全滅するであろう。弱い免疫反応
の場合は、移植床において、増殖標的細胞は浸潤性免疫エフェクター細胞と混ざ
り合うであろう。単層として５ｘ１０５ RM1-luc細胞を未処置Ｃ５７ＢＬ／６マ
ウスに移植すると、免疫介入の証拠は無く、in vivoでのRM1-luc細胞の増殖によ
る腫瘍層が認められた。AdCMV-lucの皮膚標的非侵襲的輸送によるワクチン接種
を受けた動物では、対照動物とは対照的に、移植床において、RM1-luc細胞が多
くの免疫エフェクター細胞と混ざり合っていた。
【０１０２】 実施例７ 腫瘍細胞によって徴兵された免疫エフェクター細胞の特徴付け in vivo細胞傷害性測定法は、筋肉に単層としての少量の標的細胞を移植する
ことによって、移植床に多くの免疫エフェクター細胞を集めることができた。移
植床に存在する特異的免疫エフェクター細胞の特徴付けは、標的細胞を殺すため
の細胞性免疫反応が誘導されたか否かに関する証拠を提供するであろう。AdCMV-
lucの皮膚標的非侵襲的輸送によってワクチン接種された動物におけるルシフェ
ラーゼ発現腫瘍細胞によって徴兵されたＴ細胞を特徴付けするため、移植床の組
織切片を抗ＣＤ３モノクロナール抗体(ｍＡｂ)で染色した。RM1前立腺腫瘍細胞(
Baylor College of MedicineのT. Thompsonによって提供された)中に、pHBA-luc
ＤＮＡをリポフェクションし、その後、Ｇ４１８含有培地中において選択する
ことによって、RM1-luc細胞を作成した。ルシフェラーゼ測定法によって、ルシ
フェラーゼを発現するクローンを特徴付けした。１０８pfu AdCMV-lucの皮膚標
的非侵襲的輸送によってワクチン接種されたマウスに、５ｘ１０５RM1-luc細胞
を単層として移植した。移植の５日後、移植床をO.C.T.中において凍結し、さら
に切片を４μｍにスライスし、１００％アセトン中において乾燥し、さらに、色
原体としてジアミノベンジジンを用いるＡＢＣ酵素免疫化学法によって抗ＣＤ３
ｍＡｂ(UABのP.Bucyによって提供されたクローンF500A2)で染色した。
【０１０３】 図５に示すように、１０８pfu AdCMV-lucの皮膚標的非侵襲的輸送によってワ
クチン接種されたマウスにおけるRM1-luc細胞のin vivo増殖の5日後、多くのＴ
細胞が移植床に浸潤していた（ｘ１５０）が、未処置動物ではわずかなＴ細胞が
認められるのみであった。未処置動物におけるよりも、ワクチン接種動物におい
て、同じ数のRM1-luc標的細胞がより多くのＴリンパ球を移植床に徴兵すること
ができるように思われた。
【０１０４】 標的細胞によって徴兵されたＣＴＬｓを特徴付けするために、プローブとして
アンチセンスグランザイムＡ ＲＮＡ分子を用いて、移植床の凍結切片のin situ
ハイブリダイゼーションを実施した。未処置Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたは１０８ pfu AdCMV-lucの皮膚標的非侵襲的輸送によってワクチン接種されたマウスの何
れかに、５ｘ１０５RM1-luc細胞を単層として移植した。移植の５日後、移植床
をO.C.T.中において凍結し、さらに切片を４μｍにスライスした。凍結切片を３
％パラホルムアルデヒド中において固定し、内因性アルカリホスファターゼ活性
を阻害するために０．２Ｍ ＨＣｌ中においてインキュベートし、さらに、熱変
性させたアンチセンスグランザイムＡ ＲＮＡプローブを用いてハイブリダイズ
させた。in situハイブリダイゼーションのためのプローブは、バクテリオファ
ージプロモーターを包含するプラスミドからの転写によって作られた単鎖ＲＮＡ
分子であった。転写の間に、ジゴキシゲニン-ＵＴＰはその配列中に直接組みこ
まれた。陰性対照として、センス配列プローブを用いた。プローブを用いてハイ
ブリダイズさせた後、切片を洗浄し、さらにアルカリホスファターゼ結合抗ジゴ
キシゲニン抗体と共にインキュベートし、その後、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ酵素基質溶
液中においてインキュベートした。
【０１０５】 グランザイムＡを発現するＣＴＬｓは活性化ＣＴＬｓであり、かつ移植の間に
おける組織拒絶の予測マーカーとして用いられている。AdCMV-lucの皮膚標的非
侵襲的輸送によってワクチン接種された動物においてのみ、グランザイム陽性Ｃ
ＴＬｓがRM1-luc移植床内において認められた（図６）。移植床におけるそのよ
うな細胞の存在は、特異的抗原を発現する腫瘍細胞に対する細胞性免疫反応がＮ
ＩＶＳによって誘導されたことを示唆する。
【０１０６】 実施例８ バンドエイドによる遺伝子ワクチンの局所適用 包帯をワクチン投与に用いることができることを始めて実証した。本開発は、
医療訓練を受けていない人材が単一用量の非侵襲的ワクチンを皮膚に輸送するこ
とを可能とするであろう。包帯によって皮膚に形質導入するために、図７に記載
の５０μｌのAdCMV-lucベクターをバンドエイド(Johnson＆Johnson)のパッドに
ピペットで添加した。続いて、予め毛を剃ったマウスの皮膚に、ベクター含有バ
ンドエイドを付着させた。むき出しの皮膚とベクターとを１８時間接触させ続け
た。バンドエイドによって輸送された遺伝子ベクターからの導入遺伝子発現を検
出するため、ルシフェラーゼに関して皮膚を測定した（表１）。結果はかなりの
ばらつきを示したが、皮膚における導入遺伝子発現がバンドエイドを用いて達成
された。
【０１０７】 非侵襲的バンドエイドを用いて動物にワクチン接種できることを実証するため
、AdCMV-hcea含有バンドエイドをマウスの皮膚に付着させた後、２ヶ月後、抗Ｃ
ＥＡ抗体に関して尾部出血からの血清を測定した。図７に示すように、バンドエ
イドによって非侵襲的ワクチン接種されたマウスの１００％（１０／１０）にお
いて抗ＣＥＡ抗体が検出された。
【０１０８】 実施例９ ＤＮＡ／アデノウィルス介在ＮＩＶＳ アデノウィルスの外部にプラスミドＤＮＡを結合させることによって、アデノ
ウィルスベースのベクターの用途をさらに広げることができる。得られたベクタ
ーシステムは、広範囲の標的細胞への高い効率での遺伝子輸送を仲介する。本試
みは、外来遺伝子のサイズおよび設計に関して、非常に高い柔軟性をもたらす。
ＤＮＡ／アデノウィルス複合体は、同じアデノウィルス受容体介在エンドサイト
ーシス経路を介して、より柔軟に、皮膚に抗原遺伝子を輸送することができる。
【０１０９】 ＤＮＡ／アデノウィルス介在ＮＩＶＳの実施可能性を実証するために、ヒト成
長ホルモンをコードするプラスミドＤＮＡ(pCMV-GH)(Tang et al., 1992)とＥ４
欠損アデノウィルスとを結合させた。ＤＮＡ／アデノウィルス複合体とむき出し
の皮膚とを１日間接触させることによって、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）にワクチ
ン接種した。その後、尾部出血からの血清を測定することによって、ヒト成長ホ
ルモンタンパク質（ｈＧＨ）に対する抗体の産生に関して免疫動物を監視した。
図８ａ（レーン１, ｈＧＨ(０．５μg)；レーン２, ＢＳＡ(０．５μg)）に示す
ように、試験血清は、ウェスタンブロットにおいて精製ｈＧＨと反応したが、無
関係なタンパク質とは反応しなかった。ＤＮＡ／アデノウィルス複合体でワクチ
ン接種した１０匹のマウスの内、８匹（８０％）が３ヶ月内に抗ｈＧＨ抗体を産
生し、このことは、アデノウィルスと複合体を形成して非侵襲的形態で投与され
たプラスミドＤＮＡによってコードされている外因性タンパク質に対して特異的
抗体が産生されたことを示唆する。処置前に採取した免疫前血清、未処置動物か
ら採取した血清、および無関係なベクターでワクチン接種した動物から採取した
血清は、全てｈＧＨと反応できなかった。従って、ＤＮＡ／アデノウィルス複合
体は、組換えアデノウィルスと同様に、ＮＩＶＳのための適当なベクターシステ
ムであるように思われる。
【０１１０】 実施例１０ ＤＮＡ／リポソーム介在ＮＩＶＳ 非侵襲的ワクチンのための担体としてアデノウィルスに関連する遺伝子ベクタ
ーを開発することに加えて、ウィルス要素を含まないＤＮＡ／リポソーム複合体
の局所適用によってマウスにワクチン接種できることが実証された。皮膚標的非
侵襲的ワクチンの投与のために、創造的なやり方で、多くの異なるワクチンを投
与できることは明らかである。図８ｂ（レーン１, ｈＧＨ(０．５μg)；レーン
２, ＢＳＡ(０．５μg)）に示すように、ｈＧＨをコードするＤＮＡ／リポソー
ム複合体の局所適用によって免疫されたマウスから採取した試験血清は、ｈＧＨ
と反応したが、ＢＳＡとは反応しなかった。５ヶ月内に、ＤＮＡ／リポソーム複
合体でワクチン接種した１０匹のマウスの内、９匹（９０％）の処置動物におい
て、試験血清が精製ｈＧＨと反応した。従って、ＤＮＡ／リポソーム複合体は、
アデノウィルスおよびＤＮＡ／アデノウィルス複合体と同様に、ＮＩＶＳのため
の別の適当なベクターシステムであるように思われる。
【０１１１】 実施例１１ ＤＮＡコード導入遺伝子およびアデノウィルスコード導入遺伝子の同時発現 免疫系の反応を増強させる策略は、おそらく、ワクチンの臨床結果を改善する
ことができるであろう。リンパ球集団の活性化および増大に関連する免疫調節分
子の局所的産生は、ワクチン効果を顕著に改善するであろう。マウスＢ７-１お
よびＧＭ-ＣＳＦ遺伝子をコードするアデノウィルスベクターを作成した。ＤＮ
Ａ／アデノウィルス複合体の局所適用は、抗原に対する免疫反応を高めるために
、個々の皮膚細胞において、ＤＮＡコード抗原または免疫調節分子とアデノウィ
ルスコード抗原または免疫調節分子とを同時発現することができる。
【０１１２】 図９は、標的細胞におけるプラスミドＤＮＡからの導入遺伝子の発現が、アデ
ノウィルスの存在に依存し、従って、プラスミドコード導入遺伝子とアデノウィ
ルスコード導入遺伝子とを同じ細胞中において同時発現させることができること
を示す。pVR-1216プラスミドＤＮＡ（Vicalによって提供された）、AdCMV-βgal
粒子、およびポリリジンを図面に示す特定の割合で混合した。ウェル中の２ｘ１
０５ＳＣＣ−５細胞に複合体を接種して、２時間インキュベートした。その後、
複合体を除去し、次の日、ルシフェラーゼおよびβ-ガラクトシダーゼ測定のた
めに細胞を回収した（オープンカラム：ルシフェラーゼ活性；斜線付きカラム：
β-ガラクトシダーゼ活性）。結果は、アデノウィルスが存在しなければＤＮＡ
コード導入遺伝子は標的細胞において発現されないが、一方、ＤＮＡが存在して
もアデノウィルスコード導入遺伝子は発現され得ることを示す。従って、本プロ
トコルは、組換えウィルスおよび外部に結合したプラスミドの両方からの導入遺
伝子を同時に発現させることができる、単純であるが多目的に使える遺伝子輸送
システムを提供する。
【０１１３】 実施例１２ 局所適用による、皮膚における、異なる遺伝子ベクターからの相対的導入遺伝 子発現 組換えアデノウィルス、ＤＮＡ／アデノウィルス複合体、ＤＮＡ／リポソーム
複合体、およびおそらく多くの他の遺伝子ベクターは、全て、非侵襲的ワクチン
のための担体として用いられることが分かっている。導入遺伝子発現の効率が高
くなればなる程、担体も強力になると考えられる。利用されるベクターの相対的
能力を特定するため、局所適用によって、１８時間、組換えアデノウィルス、Ｄ
ＮＡ／アデノウィルス複合体、またはＤＮＡ／リポソーム複合体をマウス皮膚と
接触させた。続いて、処置された皮膚を動物から除去し、プロメガのルシフェラ
ーゼ測定系を用いて２分間の集積発光を測定することによって、照度計を用いて
ルシフェラーゼ活性を測定し、読み取り値からバックグラウンドを差引いた。図
１０に示すように、組換えアデノウィルスが、皮膚標的非侵襲的遺伝子輸送のた
めの最も効率的なベクターシステムであることが分かった。偽処置マウスは、皮
膚において検出可能なルシフェラーゼ活性を全く産生しなかった（ＬＵ, 光単位
；Ａｄ,AdCMV-luc；ＤＮＡ／Ａｄ, Ad dl1014と複合体を形成したpVR-1216 ＤＮ
Ａ；ＤＮＡ/リポソーム, DOTAP/DOPEと複合体を形成したpVR-1216 ＤＮＡ）。結
果は、ｌｏｇ［ＬＵ／ｃｍ2皮膚］（平均値）±ＳＥ（各カラムの先端部にｎを
示す）で示されている。ＤＮＡ／アデノウィルス複合体の効率は組換えアデノウ
ィルスの効率よりも低いが、ＤＮＡ／リポソーム複合体の効率よりは有意に高い
。さらには、生存ウィルス粒子が伝播するのを防ぐため、ＤＮＡと複合体を形成
する前に、アデノウィルスをＵＶまたはγ線照射によって不活化して差し支えな
い。従って、ＤＮＡ／アデノウィルス複合体は、新しい世代のワクチンの製剤化
において効率因子と安全性因子の両方が考慮される場合、非侵襲的ワクチンの輸
送のための最も有望な担体システムであるように思われる。
【０１１４】 実施例１３ インフルエンザ抗原をコードする発現ベクターの構築 A/PR/8/34HA遺伝子をコードするＥ１／Ｅ３欠損組換えアデノウィルス(AdCMV-
PR8.ha)を記載のように構築した(Gomez-Foix et al., 1992)。簡単には、ＨＡの
完全コード配列を包含する1.8ｋｂのBamHI断片をプラスミドpDP122B [American
Type Culture Collection(ATCC)]から切り出し、次に、ヒトサイトメガロウィル
ス（ＣＭＶ）初期プロモーターの転写制御下に、正しい配向で、pACCMV.PLPAのB
amHI部位に挿入した。Ｅ１／Ｅ３欠損組換えアデノウィルスを作るため、ヒト２
９３細胞中に、得られたＨＡをコードするプラスミドとプラスミドPJM17とを同
時トランスフェクトした。pACCMV.PLPA中にＮＰ遺伝子（Merckによって提供され
た）をクローニングし、続いて、上記のように２９３細胞中において相同組換え
することによって、A/PR/8/34核タンパク質(ＮＰ)遺伝子をコードするＥ１／Ｅ
３欠損組換えアデノウィルスを構築した。
【０１１５】 pVR1012(Vicalによって提供された)中にそれぞれＨＡおよびＮＰをクローン化
することによって、ＨＡをコードするプラスミド発現ベクター(pCMV-PR8.ha)お
よびＮＰをコードする別のプラスミド発現ベクター(pCMV-PR8.np)を構築した。
【０１１６】 実施例１４ マウスにおいて、アデノウィルスベースのワクチンの局所適用および鼻腔内接 種によって産生された抗インフルエンザ抗体 図１２に示すように、ＤＮＡの筋肉内注射、アデノウィルスベクターの鼻腔内
接種、およびアデノウィルスベースのワクチンパッチの局所使用等の種々のワク
チン接種形態によってＢＡＬＢ／ｃマウス（３ヶ月）を免疫した。予め毛を剃っ
た腹部皮膚上にアデノウィルスベクターをピペットで載せ、その後、むき出しの
皮膚を覆う薄膜としてのベクターにTegadermパッチ(3M)で覆いを付けた。1時間
内に吸収されなかったベクターを洗浄除去した。全ての動物を３週間間隔で３回
免疫した。最後の追加免疫の１週間後、抗インフルエンザ抗体に関して血清試料
を測定した。捕獲抗原として精製A/PR/8/34ウィルスを用いて、記載（１２）の
ようにＥＬＩＳＡによって抗インフルエンザＩｇＧの力価を特定した。血清試料
およびペロキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ(Promega)を順次に、プレートに
おいて室温で１時間インキュベートし、各インキュベーションの間に数回の洗浄
を行った。免疫前血清の１／１００希釈でのＯＤ４９０と同じＯＤ４９０をもた
らす血清の希釈率として終点を計算した。試験された最も低い希釈率で陰性であ
る血清は、終点力価１００が与えられた。免疫後血清は、低レベルで、対照抗原
（例えばＢＳＡ）とも反応した。抗ＨＡ抗体がおそらく細胞表面結合を遮断する
ことによってウィルスによる赤血球（ＲＢＣ）の凝集を阻害する能力を測定する
ために、血球凝集阻害（ＨＩ）測定法を実施した。ニワトリＲＢＣｓで予め吸収
させた血清試料を希釈し、４ＨＡ単位のインフルエンザA/PR/8/34と混合した。
次に、ニワトリＲＢＣｓを最終濃度０．５％まで添加した。目視検査によって凝
集を特定した。阻害の限界である希釈率として力価を特定した。全ての免疫前血
清の力価が≦２０であった。群１, ２．５ｘ１０7 pfu野生型アデノウィルス血
清型５を鼻腔内接種し、その２週間後、１０8pfu AdCMV-PR8.haおよび１０8pfu
AdCMV-PR8.npを局所適用した(ｎ＝９)；群２, ２．５ｘ１０7 pfu野生型アデノ
ウィルス血清型５を鼻腔内接種し、その２週間後、１００μgのAdCMV-PR8.ha Ｄ
ＮＡおよび１００μgのAdCMV-PR8.np ＤＮＡを筋肉内注射した(ｎ＝１０)；群３
, ２．５ｘ１０7 pfu野生型アデノウィルス血清型５を鼻腔内接種し、その２週
間後、２．５ｘ１０7pfu AdCMV-PR8.haおよび２．５ｘ１０7pfu AdCMV-PR8.npを
鼻腔内接種した(ｎ＝８)；群４, １０8pfu AdCMV-PR8.haおよび１０8pfu AdCMV-
PR8.npを局所適用した(ｎ＝１０)；群５, １０8pfu AdCMV-PR8.npを局所適用し
た(ｎ＝１０)；群６, １０8pfu AdCMV-PR8.haを局所適用した(ｎ＝１０)；群７,
１００μgのAdCMV-PR8.ha ＤＮＡおよび１００μgのAdCMV-PR8.np ＤＮＡを筋
肉内注射した(ｎ＝１０)；群８, ２．５ｘ１０7pfu AdCMV-PR8.haおよび２．５
ｘ１０7pfu AdCMV-PR8.npを鼻腔内接種した(ｎ＝９)。幾何平均終点力価として
データをプロットした。未処置対照群（ｎ＝７）において、抗インフルエンザ抗
体は全く検出されなかった。分散分析（ＡＮＯＶＡ）法を用いて、ＥＬＩＳＡ力
価とＨＩ力価における差を比較した。全体のα水準を０．０５に設定したTukey
法を用いて複数一対比較(multiple pairwise comparisons)を行った。ＡＮＯＶ
Ａ法によって要求される一定の分散の仮定に適合させるために、ｌｏｇスケール
での測定値で解析を実施した。ＥＬＩＳＡ力価とＨＩ力価における８つの群での
差は有意であった(p<0.0001)。群８におけるＥＬＩＳＡ力価は他の群におけるＥ
ＬＩＳＡ力価よりも有意に高かった(p<0.02)。群１において平均ＥＬＩＳＡ力価
は最も低かったが、群５または群６での力価と有意差はなかった。群８において
ＨＩ力価が最も高く、群３における力価が二番目に高かった。群１、２、４、５
および６におけるＨＩ力価の間で有意差は無かった。
【０１１７】 実施例１５ ウィルス攻撃接種後における死からのマウスの防御 図１３に示すように、ＤＮＡの筋肉内注射、アデノウィルスベクターの鼻腔内
接種、およびアデノウィルスベースのワクチンパッチの局所使用等の種々のワク
チン接種形態によってＢＡＬＢ／ｃマウス（３ヶ月）を免疫した。予め毛を剃っ
た腹部皮膚上にアデノウィルスベクターをピペットで載せ、その後、むき出しの
皮膚を覆う薄膜としてのベクターにTegadermパッチ(3M)で覆いを付けた。1時間
内に吸収されなかったベクターを洗浄除去した。全ての動物を３週間間隔３回免
疫した。最後の追加免疫の１週間後、致死量のインフルエンザウィルスA/PR/8/3
4 (1,000ＨＡ単位)をマウス鼻腔内に攻撃接種し、毎日生存を監視した。攻撃接
種後の日数に対する生存（％）としてデータをプロットした。未処置対照, アデ
ノウィルスに暴露していない未処置マウス；群１, ２．５ｘ１０7 pfu野生型ア
デノウィルス血清型５を鼻腔内接種し、その２週間後、１０8pfu AdCMV-PR8.ha
および１０8pfu AdCMV-PR8.npを局所適用した；群２, ２．５ｘ１０7 pfu野生型
アデノウィルス血清型５を鼻腔内接種し、その２週間後、１００μgのAdCMV-PR8
.ha ＤＮＡおよび１００μgのAdCMV-PR8.np ＤＮＡを筋肉内注射した；群３, ２
．５ｘ１０7 pfu野生型アデノウィルス血清型５を鼻腔内接種し、その２週間後
、２．５ｘ１０7pfu AdCMV-PR8.haおよび２．５ｘ１０7pfu AdCMV-PR8.npを鼻腔
内接種した；群４, 108pfu AdCMV-PR8.haおよび108pfu AdCMV-PR8.npを局所適用
した；群５, 108pfu AdCMV-PR8.npを局所適用した；群６, 108pfu AdCMV-PR8.ha
を局所適用した；群７, １００μgのAdCMV-PR8.ha ＤＮＡおよび１００μgのAdC
MV-PR8.np ＤＮＡを筋肉内注射した；群８, ２．５ｘ１０7pfu AdCMV-PR8.haお
よび２．５ｘ１０7pfu AdCMV-PR8.npを鼻腔内接種した。AdCMV-PR8.ha, A/PR/8/
34血球凝集素をコードするアデノウィルスベクター；AdCMV-PR8.np, A/PR/8/34
核タンパク質をコードするアデノウィルスベクター；pCMV-PR8.ha, A/PR/8/34血
球凝集素をコードするプラスミド発現ベクター；pCMV-PR8.np, A/PR/8/34核タン
パク質をコードするプラスミド発現ベクター。括弧内の数字は各処置群の動物数
を表す。
【０１１８】 野生型アデノウィルスへの予備暴露は本形態のワクチン接種を邪魔しなかった
。フェーズI最終報告に示すように、アデノウィルスに予め暴露された動物にお
いても、それらベクターの鼻腔内接種によって、インフルエンザA/PR/8/34に対
する高いレベルの中和抗体が誘導された。結果は、組換えアデノウィルスの鼻腔
内接種によって動物を免疫した場合に、防御が主に液性免疫反応によって仲介さ
れることを示唆する。鼻腔内経路とは対照的に、AdCMV-PR8.ha およびAdCMV-PR8
.npの局所適用によって免疫された動物は、攻撃接種から７１％防御された。し
かしながら、アデノウィルスに予備暴露された動物は、ＮＩＶＳ（皮膚への非侵
襲的ワクチン接種）によって防御されなかった。フェーズI最終報告に示すよう
に、ＮＩＶＳによって免疫された動物は、インフルエンザA/PR/8/34に対する比
較的低レベルの中和抗体を産生した。鼻腔内ワクチン接種によって誘導された抗
体と同様に、ＮＩＶＳによって誘導される抗インフルエンザ抗体の産生は、アデ
ノウィルスへの予備暴露によって邪魔されなかった。結果は、ＮＩＶＳによって
動物が免疫される場合、防御免疫は細胞性免疫反応によって仲介され、その免疫
機構はベクターに対する先在の免疫によって抑制され得ることを示唆した。呼吸
困難による合併症無しに鼻腔内ワクチンを摂取できる患者のために、免疫系の両
方の体系を同時に活性化する目的で、アデノウィルスベースの皮膚用ワクチンを
鼻腔内対応ワクチンと共に同時投与するのが適切であろう。また、アデノウィル
スに対する先在の免疫を有する動物にワクチン接種するために、ＮＩＶＳのため
の非免疫原性ワクチン担体を急ぎ開発する必要がある。
【０１１９】 実施例１６ ピッグテイルマカクザルにおける、ＮＩＶＳによる抗ＨＡ抗体の誘導 ＮＩＶＳは、再現可能に、マウスにおいて全身性免疫反応を誘導できる（図１
２および１３）が、ヒトの皮膚はマウスの皮膚よりも厚いため、ワクチン接種の
ためにワクチンの経皮拡散が生じることが要求される場合には、ＮＩＶＳでヒト
を免疫することはできないであろう。しかしながら、皮膚の外層内の細胞におけ
る抗原発現の一時的ではあるが有意義な上昇のみが要求されるのであれば、非侵
襲的ワクチンパッチは、厚い皮膚を持つヒトまたは他の動物を免疫することがで
きるであろう。そのような問題に対処するために、非侵襲的形態で、AdCMV-PR8.
haをピッグテイルマカクザルに免疫した。図１４に示すように、免疫された動物
は、４週間の間にＨＡに対する抗体を産生した。結果は、非侵襲的ワクチンパッ
チが、マウス以外の多くの異なる種を免疫できるであろう証拠を提供する。
【０１２０】 図１４において、予め毛を剃った腹部皮膚上に１０10pfuのAdCMV-PR8.haを載
せることによって、非侵襲的形態でピッグテイルマカクザルを免疫し、次に、む
き出しの皮膚を覆う薄膜としてのベクターにTegadermパッチ(3M)で覆いを付けた
。５時間内に吸収されなかったベクターを洗浄除去した。接種の４週間後、抗Ｈ
Ａ抗体に関して血清試料を測定した。捕獲抗原として精製A/PR/8/34ウィルスを
用いて、ＥＬＩＳＡによって抗ＨＡ ＩｇＧの力価を特定した。血清試料および
ペロキシダーゼ結合ヤギ抗サルＩｇＧ(Bethyl Laboratories, Inc.)を順次に、
プレートにおいて室温で１時間インキュベートし、各インキュベーションの間に
数回の洗浄を行った。免疫前血清の１／１００希釈でのＯＤ４９０と同じＯＤ４ ９０ をもたらす血清の希釈率として終点を計算した。試験された最も低い希釈率
で陰性である血清は、終点力価１が与えられた。
【０１２１】 実施例１７ 非侵襲的形態での局在的遺伝子輸送後の皮膚におけるルシフェラーゼスポット の移転 皮膚表面上に輸送された抗原遺伝子が深部組織に拡散しかつ表皮を越えた細胞
において抗原を発現できるか否かを特定する目的で、AdCMV-luc(ルシフェラーゼ
をコードするアデノウィルスベクター)とむき出しの皮膚とをインキュベートし
た(Tang et al., 1997)。図１５に示すように、むきだしの皮膚へのAdCMV-lucの
非侵襲的輸送の1日後、処置動物の一部において、ルシフェラーゼ活性が耳で検
出された（あるいは皮膚内の他の領域において離散ルシフェラーゼスポットとし
て）。リンパ節、肝臓、脾臓、心臓、肺および腎臓等の内蔵の何れにおいてもル
シフェラーゼは検出されなかった。
【０１２２】 図１５において、１ｘ１０8pfuのAdCMV-lucとむき出しの皮膚とを1時間インキ
ュベートした。接種の１日後、記載のように(Tang et al., 1994)、ルシフェラ
ーゼ測定のため、むき出しの皮膚ならびに耳を採取した。読み取り値からバック
グラウンドを差引いた光単位を表した。
【０１２３】 さらに、局所適用されたアデノウィルスベクターから導入遺伝子を発現できる
標的細胞および導入遺伝子から発現されたタンパク質を包含する推定上の移動細
胞を同定および特徴付けする目的で、AdCMV-βgal(β-ガラクトシダーゼをコー
ドするアデノウィルス)の局所適用後、皮膚切片をＸ-ｇａｌで染色した(Tang et
al., 1994)。紺色に染まった細胞を探して組織切片を調べることによって、非
侵襲的形態でベクターを接種する場合のアデノウィルス介在遺伝子導入のための
主な標的細胞として、毛嚢内の標識された毛マトリックス細胞、および表皮の最
外層内の標識されたケラチノサイトを同定した（要求に応じて写真を利用できる
）。結果は、局所適用されたアデノウィルス粒子のわずか（もしあれば）が表皮
の外層を越えて真皮に浸透できることを示唆した。組織切片の顕微鏡観察は、形
質導入された皮膚の物理的擦り傷を全く表さなかった。顕微鏡観察において、処
置された皮膚に関連して炎症は全くなかった。しかしながら、接種領域（例えば
むき出しの皮膚）内においてのみ遺伝子導入細胞を可視化することができた。お
そらくルシフェラーゼ測定法はX-gal介在βガラクトシダーゼ測定法よりも感度
が高いため、ルシフェラーゼ活性が耳または皮膚内の他の領域で検出される場合
には、それらの領域における紺色に染まった細胞を同定することができなかった
。我々は、ある抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）が、抗原を捕らえることによって、皮
膚表面上において発現された抗原に反応すると仮定する。タンパク質は急速に分
解され、従って、リンパ節等の内蔵から検出されない。皮膚内における抗原の移
転の生物学的重要性は分かっていない。
【０１２４】 実施例１８ 非侵襲的形態での局在的遺伝子輸送後の種々の組織における外来ＤＮＡの増幅 アデノウィルスベクターの局所適用が接種領域を越えて外因性ＤＮＡを輸送で
きるか否かを特定する目的で、AdCMV-PR8.haの皮膚への非侵襲的輸送後、種々の
組織からＤＮＡを抽出し、その後、導入遺伝子ならびにアデノウィルス血清型５
ファイバー遺伝子をＰＣＲで増幅した。図１６に示すように、接種後３時間の皮
膚から、完全長ＨＡおよびファイバー遺伝子が増幅された。完全長遺伝子は、通
常、１日後の皮膚ＤＮＡまたは他の組織から抽出されたＤＮＡでは検出できなか
った。しかしながら、ＨＡおよびファイバー遺伝子の両方のサブフラグメントが
、肝臓、全血、耳、腹部皮膚、またはプールリンパ節から、異なるプライマーセ
ットを用いて増幅された。接種後４週間の何れの組織においても、外来ＤＮＡは
全く検出されなかった。結果は、アデノウィルスベクターの局所適用は外因性Ｄ
ＮＡを皮膚の局在的領域に運ぶことができるが、外来ＤＮＡはある推定上の抗原
提示細胞によって迅速に捕らえられ、分解され、さらに深部組織に移転されるこ
とを示唆した。４週間の間における外来ＤＮＡの排除は、ＮＩＶＳの安全性を強
調する。図１６において、AdCMV-PR8.haおよびAdCMV-lucを非侵襲的形態で、予
め毛を剃った皮膚に接種した。DNAZOL(GIBCOBRL)によってＤＮＡを抽出し、さら
に以下のプライマーセットを用いて増幅した：
【化１】 Ha5.1およびHa3.1は、ほとんど完全長の1.7kb HA遺伝子を増幅した；Ha5.2およ
びHa3.2は、HA遺伝子の33％を含む0.6kbサブフラグメントを増幅した；Luc5.1お
よびLuc3.1は、ほとんど完全長の1.7kbルシフェラーゼ遺伝子を増幅した；Luc5.
2およびLuc3.2は、ルシフェラーゼ遺伝子の30％を含む0.52kbサブフラグメント
を増幅した；Fb5.1およびFb3.1は、ほとんど完全長の1.7kbアデノウィルス血清
型５ファイバー遺伝子を増幅した；Fb5.2およびFb3.2は、ファイバー遺伝子の32
%を含む0.55kbサブフラグメントを増幅した。レーンＭ, 分子量マーカー(HindII
Iで切断したLambda DNA)；レーン１, ＮＩＶＳ後３時間の皮膚ＤＮＡからLuc5.1
およびLuc3.1によって増幅されたほとんど完全長のルシフェラーゼ遺伝子；レー
ン２, ＮＩＶＳ後１日の皮膚ＤＮＡからLuc5.1およびLuc3.1によって増幅された
ほとんど完全長のルシフェラーゼ遺伝子；レーン３, ＮＩＶＳ後１日のマウス耳
ＤＮＡからLuc5.2およびLuc3.によって増幅されたルシフェラーゼＤＮＡのサブ
フラグメント；レーン４, ＮＩＶＳ後１日のリンパ節ＤＮＡからLuc5.2およびLu
c3.2によって増幅されたルシフェラーゼＤＮＡのサブフラグメント；レーン５,
ＮＩＶＳ後１日の肝臓ＤＮＡからLuc5.2およびLuc3.によって増幅されたルシフ
ェラーゼＤＮＡのサブフラグメント；レーン６, ＮＩＶＳ後１日の全血から抽出
されたＤＮＡからLuc5.2およびLuc3.2によって増幅されたルシフェラーゼＤＮＡ
のサブフラグメント；レーン７, ＮＩＶＳ後３時間の皮膚ＤＮＡからHA5.1およ
びHA3.1によって増幅されたほとんど完全長のＨＡ遺伝子；レーン８, ＮＩＶＳ
後１日の皮膚ＤＮＡからHA5.2およびHA3.2によって増幅されたＨＡ遺伝子のサブ
フラグメント；レーン９, ＮＩＶＳ後１日のリンパ節ＤＮＡからHA5.2およびHA3
.2によって増幅されたＨＡ遺伝子のサブフラグメント；レーン１０, ＮＩＶＳ後
１日の肝臓ＤＮＡからHA5.2およびHA3.2によって増幅されたＨＡ遺伝子のサブフ
ラグメント；レーン１１, ＮＩＶＳ後１日の腎臓ＤＮＡからHA5.2およびHA3.2に
よって増幅されたＨＡ遺伝子のサブフラグメント；レーン１２, ＮＩＶＳ後１日
の全血から抽出されたＤＮＡからHA5.2およびHA3.2によって増幅されたＨＡ遺伝
子のサブフラグメント；レーン１３, ＮＩＶＳ後３時間の皮膚ＤＮＡからFb5.1
およびFb3.1によって増幅されたほとんど完全長のファイバー遺伝子；レーン１
４, ＮＩＶＳ後1日の皮膚ＤＮＡからFb5.1およびFb3.1によって増幅されたほと
んど完全長のファイバー遺伝子；レーン１５, ＮＩＶＳ後1日の皮膚ＤＮＡからF
b5.2およびFb3.2によって増幅されたファイバー遺伝子のサブフラグメント；レ
ーン１６, ＮＩＶＳ後1日の耳ＤＮＡからFb5.2およびFb3.2によって増幅された
ファイバー遺伝子のサブフラグメント；レーン１７, ＮＩＶＳ後1日のリンパ節
ＤＮＡからFb5.2およびFb3.2によって増幅されたファイバー遺伝子のサブフラグ
メント；レーン１８, ＮＩＶＳ後1日の肝臓ＤＮＡからFb5.2およびFb3.2によっ
て増幅されたファイバー遺伝子のサブフラグメント；レーン１９, ＮＩＶＳ後1
日の全血から抽出されたＤＮＡからFb5.2およびFb3.2によって増幅されたファイ
バー遺伝子のサブフラグメント。鼠径部、頸部および上腕のリンパ節をプールし
て、DNAZOL溶液中において、リンパ節からのＤＮＡを抽出した。Stratagene Rob
ocycler勾配４０温度サイクラーにおいて、最適化されたアニーリング温度で、
３５サイクル、ＤＮＡを増幅した。１％アガロースゲルにおいて増幅したＤＮＡ
断片を分画し、その後、臭化エチジウムで染色した。
【０１２５】 実施例１９ ＮＩＶＳのために脱毛剤は必要ない ＮＡＩＲのような脱毛剤(Tang et al., 1997)がＮＩＶＳに必須であるか否か
を特定するため、ＮＩＶＳを用いた予備処置の有無による、ワクチンパッチによ
ってもたらされる抗体価を比較した。図１７は、ＮＡＩＲによる予備処置をしな
いマウスにおける抗体力価がＮＡＩＲで予備処置したマウスにおける抗体力価と
同程度の高さであることを示す。ＮＡＩＲの省略はＮＩＶＳ手順を簡素化する。
【０１２６】 図１７において、１０８pfuの容量でマウスに皮内注射（ＩＤ）し、あるいは
腹部皮膚上に１ｘ１０８pfuのAdCMV-hcea(Tang et al., 1997)をピペットで載せ
、その後、むき出しの皮膚を覆う薄膜としてのベクターにTegadermパッチ(3M)で
覆いを付けることによって非侵襲的形態でマウスを免疫した（ＮＩＶＳ）。吸収
されなかったベクターを洗浄除去した。接種の４週間後、抗ＣＥＡ抗体に関して
血清試料を測定した。捕獲抗原として精製ヒトＣＥＡ(CalBiochem)を用いて、Ｅ
ＬＩＳＡによって抗ＣＥＡ ＩｇＧの力価を特定した。血清試料およびペロキシ
ダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ(Promega)を順次に、プレートにおいて室温で１
時間インキュベートし、各インキュベーションの間に数回の洗浄を行った。免疫
前血清の１／１００希釈でのＯＤ４９０と同じＯＤ４９０をもたらす血清の希釈
率として終点を計算した。試験された最も低い希釈率で陰性である血清は、終点
力価１が与えられた。幾何平均終点ＥＬＩＳＡ力価としてデータをプロットし、
ここで、ＩＤについてｎ＝４、１時間についてｎ＝１４、ＮＡＩＲ（−）につい
てｎ＝１０、およびＮＡＩＲ／刈り込み（−）についてｎ＝１５である。ＩＤ,
皮内注射；１ｈｒ, 毛を剃り、さらにＮＡＩＲで予備処置して、皮膚の外層とベ
クターとを１時間接触させた；ＮＡＩＲ（−）, 毛を剃るが、ＮＡＩＲで予備処
置しないで、皮膚の外層とベクターとを１晩接触させた；ＮＡＩＲ／clip(−),
毛を剃らないで、かつＮＡＩＲで予備処置もしないで、皮膚の外層とベクターと
を１晩接触させた。
【０１２７】 実施例２０ 図１８に示すように、ＤＮＡの筋肉内注射、アデノウィルスベクターの鼻腔内
接種、およびアデノウィルスベースのワクチンパッチの局所適用等の種々のワク
チン接種形態によって、ＢＡＬＢ／ｃマウス（３ヶ月）を免疫した。予め毛を剃
った腹部皮膚上に１ｘ１０８pfuのAdCMV-tetCをピペットで載せ、その後、むき
出しの皮膚を覆う薄膜としてのベクターにTegadermパッチ(3M)で覆いを付けた。
1時間内に吸収されなかったベクターを洗浄除去した。鼻腔内に、約１０７pfuの
AdCMV-tetCをピペットで添加し、鼻腔ワクチンを投与した。全ての動物を３週間
間隔で３回免疫した。最後の追加免疫の１週間後、致死量の破傷風菌をフットパ
ッドに攻撃接種し、毎日生存を監視した。攻撃接種後の日数に対する生存（％）
としてデータをプロットした。未処置対照, 攻撃接種前にワクチン接種されてい
ない未処置マウス；Ad-tetC:NIVS, AdCMV-tetCの局所適用によって免疫されたマ
ウス；Ad-tetC:IN, AdCMV-tetCの鼻腔内接種によって免疫されたマウス；pCMV-t
etC:IM, １００gのpCMV-tetC ＤＮＡの筋肉内注射によって免疫されたマウス。A
dCMV-tetC, 破傷風毒素C断片をコードするアデノウィルスベクター; pCMV-tetC,
破傷風毒素C断片をコードするプラスミド発現ベクター。括弧内の数は、各処置
群の動物数を表す。
【０１２８】 鼻腔内投与に関連するこの中の実施例は、粘膜投与を介して適切な反応が達成
され；さらに、例えば口腔内の粘膜のような粘膜を投与経路として用いることが
できることをさらに記載しており、例えば、頬側および舌下投与が、本発明にお
いて考えられており、さらに、鼻腔内投与に関連するこの中の実施例を介してな
らびにこの中の一般技術によって実証および検討される。
【０１２９】 従って、本発明は、関心抗原またはエピトープあるいは免疫促進剤をコードす
る１つ以上の遺伝子挿入物を包含する組換えベクターワクチン、あるいは組換え
ワクチンからの遺伝子産物の、口腔内の頬面への適用を含み、挿入遺伝子によっ
てコードされる産物は、感染症に対して予防または治療となり得る免疫反応をも
たらす。さらに、本発明は、免疫のための産物が頬面上または口腔内に放出され
るような担体機構を形成する、マトリックス上もしくはマトリックス中に組み込
まれた、またはマトリックスに付着させたそのような組換えベクターワクチンま
たは組換えワクチンの遺伝子産物を含む。さらに、本発明は、免疫のための産物
が組み込まれているマトリックスが、生物活性または不活性であり、さらに、免
疫のための産物の完全性を維持する材料を含み；例えば、マトリックス材料が、
例えば、グルコースまたは他の生物分解性の糖、あるいは、他の生物分解性物質
、あるいは使い捨てできるが生物分解性ではない材料等の、高分子材料から成る
ものであって差し支えないような実施形態を含む。
【０１３０】
【表１】
【表２】 前記の実施例および図面において記載のように（例えば図１に関する記載）、Ad
CMV-PR8.haの局所適用によってマウスを免疫した。指摘の時点に、組織から全Ｄ
ＮＡを抽出し、さらに、前記の実施例において記載（例えば図３に関する記載）
の特定プライマーセットを用いたＰＣＲによって増幅した。特定組織について、
解析された動物の全匹数に対する、検出可能な信号を有する動物の匹数として、
データを表した。ａ投与部位；ｂプールしたリンパ節；ｃ後ろ足大腿四頭筋。
【０１３１】
【表３】 前記の実施例および図面において記載のように（例えば図１に関する記載）、Ad
CMV-PR8.haの筋肉内注射によってマウスを免疫した。指摘の時点に、組織から全
ＤＮＡを抽出し、さらに、前記の実施例において記載（例えば図３に関する記載
）の特定プライマーセットを用いたＰＣＲによって増幅した。特定組織について
、解析された動物の全匹数に対する、検出可能な信号を有する動物の匹数として
、データを表した。ａプールしたリンパ節；ｂ後ろ足大腿四頭筋（投与部位）。
【０１３２】
【表４】 局所適用後のAdCMV-PR8.ha ＤＮＡの移転の要約： AdCMV-PR8.ha粒子を９５℃で、１０分間加熱して不活化した。前記の実施例お
よび図面において記載のように（例えば図１に関する記載）局所適用によって、
または等量のベクターの注射針を用いた皮内注射によって、ベクターをマウスに
投与した。局在的遺伝子輸送の１日後、種々の組織から全ＤＮＡを抽出した。図
３のレジェンドに記載の特定プライマーセットを用いたＰＣＲによって、ほとん
ど完全長のＨＡおよびファイバー遺伝子、ならびにそれらのサブフラグメント対
応物を増幅した。特定組織について、解析された動物の全匹数に対する、検出可
能な信号を有する動物の匹数として、データを表した。括弧無しの数は局所適用
を表し、括弧内の数は皮内注射を表す。ａ投与部位；ｂプールしたリンパ節；ｃ 後ろ足大腿四頭筋。意義：局所適用後、３つの異なる機構：（１）拡散による皮
膚を越える転位およびその後の循環を介した移転；（２）皮膚を越える転位およ
びその後の抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）への飲作用による取り込み；（３）ケラチ
ノサイトへの形質導入およびその後の外因性生体分子のＡＰＣｓへの細胞内運搬
：によってベクターＤＮＡが遠隔組織に移転することは可能である。おそらく必
須リガンド（例えば、ＣＡＲおよびＲＧＤモチーフ）の変性のせいでヒト２９３
細胞において細胞変性効果（ＣＰＥ）をもたらすことができなかったことから分
かるように、熱不活化アデノウィルスベクターは細胞に形質導入することはでき
ないが、もし拡散が生じるべきであれば、それらアデノウィルスベクターが、生
きたベクターと同様に、まだ皮膚内に拡散する必要がある。結果は、ＮＩＶＳ後
のベクターＤＮＡ移転を介在する主な機構が、おそらく、拡散による皮膚を越え
る転位によるものではないことを示す。従って、アデノウィルスベクターの局所
適用は、経皮的ワクチン接種形態よりも、むしろ非侵襲的形態を示す。
【０１３３】 本発明の好ましい実施形態を詳細に説明したが、添付の請求項によって特定さ
れる本発明は、それらの精神または範囲を逸脱することなく多くの明白な変化が
可能であるため、上記の説明において示された特定の詳述によって限定されない
。
【０１３４】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ベクターの局所適用による、皮膚における組換えアデノウィルスから
の導入遺伝子の発現を示す
【図２Ａ】 図２Ａは、局所適用された組換えアデノウィルスによって形質導入され得る潜
在的標的細胞の特徴付けを示す
【図２Ｂ】 図２Ｂは、局所適用された組換えアデノウィルスによって形質導入され得る潜
在的標的細胞の特徴付けを示す
【図３Ａ】 図３Ａは、アデノウィルス介在ＮＩＶＳによって免疫されたマウスの血清中で
の特異的抗体の検出を示す
【図３Ｂ】 図３Ｂは、アデノウィルス介在ＮＩＶＳによって免疫されたマウスの血清中で
の特異的抗体の検出を示す
【図４】 図４は、致死量の腫瘍細胞を攻撃接種された対照マウスおよび免疫マウスの生
存率（％）を示す
【図５】 図５は、腫瘍浸潤Ｔ細胞の特徴付けを示す
【図６】 図６は、腫瘍浸潤ＣＴＬｓの特徴付けを示す
【図７】 図７は、ワクチン包帯の局所適用によって免疫されたマウスにおける、ヒトＣ
ＥＡタンパク質に対する抗体のウェスタンブロット分析を示す
【図８Ａ】 図８Ａは、ＤＮＡ／アデノウィルス介在ＮＩＶＳによって免疫されたマウスの
血清中での特異的抗体の検出を示す
【図８Ｂ】 図８Ｂは、ＤＮＡ／リポソーム介在ＮＩＶＳ（Ｂ）によって免疫されたマウス
の血清中での特異的抗体の検出を示す
【図９】 図９は、標的細胞におけるＤＮＡコード導入遺伝子およびアデノウィルスコー
ド導入遺伝子の同時発現(co-expression)を示す
【図１０】 図１０は、局所適用された組換えアデノウィルス、ＤＮＡ／アデノウィルス複
合体、およびＤＮＡ／リポソーム複合体からの相対的な導入遺伝子の発現を示す
【図１１】 図１１は、皮膚標的非侵襲的ワクチンの投与のための手段を示す
【図１２】 図１２は、マウスにおいて皮膚標的非侵襲的ワクチンによって産生された抗イ
ンフルエンザ抗体を示す
【図１３】 図１３は、ウィルス攻撃接種に続く死からのマウスの防御を示す
【図１４】 図１４は、インフルエンザＨＡをコードするアデノウィルスベクターを含有す
る皮膚パッチによって、ピッグテイルマカクザル(pigtail macaque)において産
生されたＥＬＩＳＡ抗体を示す
【図１５】 図１５は、アデノウィルスベクターの局所適用後の皮膚における抗原スポット
の移転を示す
【図１６】 図１６は、非侵襲形態での局所的遺伝子輸送後における、種々の組織での外来
ＤＮＡの増幅を示す
【図１７】 図１７は、ＮＡＩＲのような脱毛剤がＮＩＶＳには必須でないことを示す
【図１８】 図１８は、アデノウィルスベースの破傷風ワクチンの局所適用または鼻腔内接
種による、破傷風菌攻撃接種に続く死からの防御を示す １）外国語書面の明細書第８頁第１行から第１２頁第１６行、第１４頁第３２行
から第２７頁最終行、および第３０頁第１行から第５３頁最終行までの各部分の
翻訳が欠落していたので、補充して誤訳訂正する。 ２）併せて、既に翻訳済みの明細書および請求の範囲の一部について、些細な表
現の訂正を加えた（この部分は内容の変更はないので、詳細な訂正理由は省略す
る）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/00 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ 39/395 Ｅ Ａ６１Ｐ 31/12 Ａ６１Ｐ 31/12 35/00 35/00 37/02 37/02 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 マークス，ドナルド エイチ アメリカ合衆国 アラバマ州 35244 フ ーヴァー フェアウェイ ヴュー ドライ ヴ 1521 (72)発明者 カリエル，デイヴィッド ティー アメリカ合衆国 アラバマ州 35222 バ ーミンガム リンドウッド ロード 824 (72)発明者 シ，ツォンカイ アメリカ合衆国 アラバマ州 35205 バ ーミンガム ナインティーフォース アヴ ェニュー サウス 1611 アパートメント ２ (72)発明者 ヴァン カムペン，ケント アール アメリカ合衆国 アラバマ州 35244 フ ーヴァー レイク ウィンズ ドライヴ 1008 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 DA02 EA02 EA04 FA02 GA11 HA01 4C076 AA93 BB02 BB03 BB21 BB25 BB31 CC07 CC27 CC35 4C084 AA02 AA13 BA44 CA62 DA01 MA52 MA56 MA57 MA59 MA63 NA01 NA10 NA13 NA14 ZB071 ZB072 ZB261 ZB262 ZB331 ZB332 4C085 AA03 AA13 BB17 BB23 CC08 4C087 AA02 BC83 NA01 NA10 NA13 NA14 ZB07 ZB26 ZB33

Claims (57)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 動物における非侵襲的遺伝子免疫の方法および／または動物
    において遺伝子産物に対する全身性免疫反応または全身性治療反応を誘導する方
    法であって、前記反応を誘導するのに有効な量の遺伝子産物をコードする核酸分
    子を包含および発現するベクターと、動物の皮膚、鼻粘膜、口腔粘膜、舌粘膜、
    または頬側粘膜とを接触させる工程を含むことを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】 前記ベクターと動物の皮膚とを接触させる工程を含むことを
    特徴とする請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記ベクターと鼻腔粘膜とを接触させる工程を含むことを特
    徴とする請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】前記ベクターと口腔粘膜、頬側粘膜または舌粘膜とを接触させ
    る工程を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記核酸分子が、ベクターに対して外因性または異種である
    ことを特徴とする請求項１、２、３または４いずれか1項記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記反応が全身性免疫反応を含むことを特徴とする請求項１
    、２、３または４いずれか1項記載の方法。
  7. 【請求項７】前記ベクターが、関心エピトープをコードする外因性核酸分子
    を包含および発現することを特徴とする請求項１、２、３または４いずれか1項
    記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記ベクターが、抗原を包含および発現することを特徴とす
    る請求項１、２、３または４いずれか1項記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記ベクターが、治療的産物を包含および発現することを特
    徴とする請求項１、２、３または４いずれか1項記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記核酸分子が：関心エピトープ；および／または関心抗
    原；および／または免疫反応を刺激および／または調節する、および／または内
    因性および／または外因性核酸分子の転写および／または翻訳を含む発現を刺激
    および／または調節する核酸分子：をコードすることを特徴とする請求項１、２
    、３または４いずれか1項記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記外因性核酸分子が、病原菌由来の1つ以上の抗原また
    はその部分あるいは１つ以上の関心エピトープをコードすることを特徴とする請
    求項５記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記外因性核酸分子が：インフルエンザ血液凝集素、イン
    フルエンザ核タンパク質、インフルエンザＭ２、破傷風毒素Ｃ断片、炭疽菌防御
    抗原、炭疽菌致死因子、狂犬病糖タンパク質、ＨＢＶ表面抗原、ＨＩＶ ｇｐ 12
    0ＨＩＶ ｇｐ 160、ヒト癌胎児性抗原、マラリアＣＳＰ、マラリアＳＳＰ、マラ
    リアＭＳＰ、マラリアｐｆｇ、およびマイコバクテリウム・ツベルクローシスＨ
    ＳＰ：の１つ以上をコードすることを特徴とする請求項５記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記外因性核酸分子が、免疫調節剤をコードすることを特
    徴とする請求項５記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記反応が、動物の細胞において前記核酸分子を発現させ
    るベクターによって誘導されることを特徴とする請求項１０記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記細胞が、表皮細胞を含むことを特徴とする請求項１４
    記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記反応が、病原菌または新生物に対する免疫反応を含む
    ことを特徴とする請求項１０記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記動物が脊椎動物であることを特徴とする請求項１、２
    、３または４いずれか1項記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記脊椎動物が、鳥類または哺乳類であることを特徴とす
    る請求項１７記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記鳥類または哺乳類が、ヒト、コンパニオン動物、飼い
    動物、食料生産動物、家畜、ゲーム用動物、レース用動物またはスポーツ用動物
    であることを特徴とする請求項１８記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記動物が、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブ
    タ、ニワトリ、アヒルまたは七面鳥であることを特徴とする請求項１９記載の方
    法。
  21. 【請求項２１】 前記ベクターが：ウィルスベクター、一部または全てのウ
    ィルス遺伝子を欠失させたウィルスを包含するウィルスコート、細菌ベクター、
    原生動物ベクター、トランスポゾン、レトロトランスポゾン、およびＤＮＡベク
    ター：の1つ以上を包むことを特徴とする請求項１、２、３または４いずれか1項
    記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記ベクターが、組換えベクターを含むことを特徴とする
    請求項２１記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記ベクターが、アデノウィルスを含むことを特徴とする
    請求項２２記載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記アデノウィルスが、そのＥ１および／またはＥ３およ
    び／またはＥ４領域を欠失させたアデノウィルスであることを特徴とする請求項
    ２３記載の方法。
  25. 【請求項２５】 動物において遺伝子産物に対する全身性免疫反応または全
    身性治療反応を誘導する方法であって、Ｅ1および／またはＥ３および／または
    Ｅ４領域を欠失させたアデノウィルスを包含するベクターの鼻腔内および／また
    は粘膜および／または頬側および／または舌下および／または経口での投与を含
    み、ここで、前記アデノウィルスが前記反応のための遺伝子産物をコードする核
    酸分子を包含および発現することを特徴とする方法。
  26. 【請求項２６】 鼻腔内投与を含むことを特徴とする請求項２５記載の方法
    。
  27. 【請求項２７】 頬側投与を含むことを特徴とする請求項２５記載の方法。
  28. 【請求項２８】 舌下投与を含むことを特徴とする請求項２５記載の方法。
  29. 【請求項２９】 前記アデノウィルスが、そのＥ1およびＥ３領域を欠失さ
    せたアデノウィルスであることを特徴とする請求項２５、２６、２７または２８
    いずれか１項記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記アデノウィルが、反応のための遺伝子産物をコードす
    る外因性または異種核酸分子を包含することを特徴とする請求項２５、２６、２
    ７または２８いずれか１項記載の方法。
  31. 【請求項３１】 全身性免疫反応を誘導するための請求項２５、２６、２７
    または２８いずれか１項記載の方法であって、前記核酸分子が外因性または異種
    でありかつ関心エピトープをコードすることを特徴とする方法。
  32. 【請求項３２】 前記核酸分子が、外因性または異種であり、かつ１つ以上
    の関心インフルエンザエピトープおよび／または１つ以上のインフルエンザ抗原
    をコードすることを特徴とする請求項２５、２６、２７または２８いずれか１項
    記載の方法。
  33. 【請求項３３】 前記アデノウィルスが、ヒトアデノウィルスであることを
    特徴とする請求項２５、２６、２７または２８いずれか１項記載の方法。
  34. 【請求項３４】 前記アデノウィルスが、イヌアデノウィルスを含むことを
    特徴とする請求項２５、２６、２７または２８いずれか１項記載の方法。
  35. 【請求項３５】 前記ベクターが、動物に適合し、または動物の天然病原菌
    であることを特徴とする請求項１、２、３、４、２５、２６、２７または２８い
    ずれか１項記載の方法。
  36. 【請求項３６】 前記ベクターを含有する輸送手段を動物の皮膚に付ける工
    程を含むことを特徴とする請求項１または２５記載の方法。
  37. 【請求項３７】 前記輸送手段中および／または該輸送手段上に前記ベクタ
    ーを組み込む工程をさらに含むことを特徴とする請求項３６記載の方法。
  38. 【請求項３８】 前記ベクターが、全てのウィルス遺伝子を欠失させたウィ
    ルスベクターを包含することを特徴とする請求項１、２、３、４、２５、２６、
    ２７または２８いずれか１項記載の方法。
  39. 【請求項３９】 前記ベクターが、癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、または腫瘍
    関連遺伝子を発現することによって、動物において抗腫瘍効果を誘導することを
    特徴とする請求項１、２、３、４、２５、２６、２７または２８いずれか１項記
    載の方法。
  40. 【請求項４０】 請求項１、２、３、４、２５、２６、２７または２８いず
    れか１項記載の方法において使用するための医薬、ワクチン、免疫原的、免疫学
    的または治療的組成物であって、局所に、粘膜に、経鼻的に、頬側に、舌下に、
    または経口でベクターを投与するための薬剤的に許容される担体または希釈剤中
    に前記ベクターを含むことを特徴とする組成物。
  41. 【請求項４１】 請求項１、２、３、４、２５、２６、２７または２８いず
    れか１項記載の方法において使用するための医薬、ワクチン、免疫原的、免疫学
    的または治療的組成物を調製するためのキットであって：第１容器中にベクター
    を含有し、さらに第２器中に、局所に、粘膜に、経鼻的に、頬側に、舌下に、ま
    たは経口でベクターを投与するための薬剤的に許容される担体または希釈剤を含
    有し；ここで、前記容器が、必要に応じて、同じ包装中に存在し、または別々の
    包装中に存在し；さらに必要に応じて、前記ベクターと前記担体または希釈剤と
    の混合および／または投与のための指示書を含むことを特徴とするキット。
  42. 【請求項４２】 第３容器中に輸送手段をさらに含む請求項４１記載のキッ
    トであって、該第３容器が、必要に応じて、前記第１および第２容器の一方また
    は両方と同じ包装中に存在し、または該第１および第２容器と別々の包装中に存
    在し；さらに、必要に応じて、前記ベクター、あるいは前記ベクターと担体また
    は希釈剤とを前記輸送手段中または該輸送手段上へ組み込むためのおよび／また
    は該輸送手段の投与または貼り付けのための指示書を含むことを特徴とするキッ
    ト。
  43. 【請求項４３】 前記免疫調節剤が、副刺激因子および／またはサイトカイ
    ンを含むことを特徴とする請求項１３記載の方法。
  44. 【請求項４４】 前記反応が、破傷風菌感染に対する反応であることを特徴
    とする請求項１、２、３、４、２５、２６、２７または２８いずれか１項記載の
    方法。
  45. 【請求項４５】 前記ベクターが、ＡｄＣＭＶ-ｔｅｔＣ：ＩＭまたはｐＣ
    ＭＶ-ｔｅｔＣを含むことを特徴とする請求項１、２、３、４、２５、２６、２
    ７または２８いずれか１項記載の方法。
  46. 【請求項４６】 前記外因性核酸分子が、破傷風毒素Ｃ断片をコードするこ
    とを特徴とする請求項１、２、３、４、２５、２６、２７または２８いずれか１
    項記載の方法。
  47. 【請求項４７】 前記外因性核酸分子が、破傷風毒素の抗原またはエピトー
    プをコードすることを特徴とする請求項１、２、３、４、２５、２６、２７また
    は２８いずれか１項記載の方法。
  48. 【請求項４８】 インフルエンザＡウィルスに対する免疫反応を非侵襲的に
    誘導する方法であって：投与後動物において抗インフルエンザ効果を誘導するイ
    ンフルエンザ特異的抗原またはその免疫原性断片をコードおよび発現する関心遺
    伝子を包含する免疫学的有効量の遺伝子ベクターと、治療を必要とする被検者の
    皮膚、鼻腔粘膜、頬側粘膜、または舌粘膜とを接触させる：工程を含むことを特
    徴とする方法。
  49. 【請求項４９】 前記遺伝子ベクターと皮膚とを接触させる工程を含むこと
    を特徴とする請求項４８記載の方法。
  50. 【請求項５０】 前記遺伝子ベクターと鼻腔粘膜とを接触させる工程を含む
    ことを特徴とする請求項４８記載の方法。
  51. 【請求項５１】 前記遺伝子ベクターと頬側粘膜とを接触させる工程を含む
    ことを特徴とする請求項４８記載の方法。
  52. 【請求項５２】 前記遺伝子ベクターと舌粘膜とを接触させる工程を含むこ
    とを特徴とする請求項４８記載の方法。
  53. 【請求項５３】 前記遺伝子ベクターが、ウィルスベクターおよびプラスミ
    ドＤＮＡより成る群から選択されることを特徴とする請求項４８、４９、５０、
    ５１または５２いずれか１項記載の方法。
  54. 【請求項５４】 前記遺伝子ベクターが、アデノウィルスであることを特徴
    とする請求項５３記載の方法。
  55. 【請求項５５】 前記アデノウィルスベクターが、そのＥ１およびＥ３領域
    を欠失させたアデノウィルスであることを特徴とする請求項５４記載の方法。
  56. 【請求項５６】 ＤＮＡがプラスミド形態であることを特徴とする請求項５
    ５記載の方法。
  57. 【請求項５７】 前記接触工程が、関心遺伝子を包含する遺伝子ベクターを
    輸送手段上に組み込み、さらに関心遺伝子を包含する遺伝子ベクターを有する該
    手段を動物の皮膚に付ける工程を更に含むことを特徴とする請求項４９記載の方
    法。
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Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6348450B1 (en) 1997-08-13 2002-02-19 The Uab Research Foundation Noninvasive genetic immunization, expression products therefrom and uses thereof
AU2487300A (en) 1998-12-31 2000-07-31 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
US20040009936A1 (en) 1999-05-03 2004-01-15 Tang De-Chu C. Vaccine and drug delivery by topical application of vectors and vector extracts
JP4310108B2 (ja) 2001-04-06 2009-08-05 中外製薬株式会社 脈管系又は尿管を介して遺伝子を導入する方法
AU2002320314A1 (en) 2001-07-05 2003-01-21 Chiron, Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
BRPI0609362A2 (pt) * 2005-04-11 2010-03-30 Us Gov Health & Human Serv vetor de adenovìrus recombinante, adenovìrus recombinante, composição imunogênica e método para a produção da referida composição imunogênica
AU2012216357B2 (en) * 2005-04-11 2014-01-30 Purdue Research Foundation Vaccine against pandemic strains of influenza viruses
JP2009512421A (ja) 2005-08-15 2009-03-26 ヴァクシン インコーポレイテッド 非複製性ベクターワクチン投与による鳥類への免疫方法
US9333249B2 (en) 2006-02-09 2016-05-10 Educational Foundation Jichi Medical University Recombinant baculovirus vaccine
TWI477602B (zh) 2006-02-09 2015-03-21 Educational Foundation Jichi Medical Univ Novel viral vector
WO2012129295A1 (en) * 2011-03-21 2012-09-27 Vaxin Inc. Rapid and prolonged immunologic-therapeutic
US10183069B2 (en) 2011-03-21 2019-01-22 Altimmune Inc. Rapid and prolonged immunologic-therapeutic
WO2018209359A1 (en) * 2017-05-12 2018-11-15 President And Fellows Of Harvard College Systemic delivery of polypeptides
CN109825515B (zh) * 2019-02-26 2020-11-20 华中农业大学 一种牛分枝杆菌卡介苗低侵袭力突变株b2801
CN110305878B (zh) * 2019-04-16 2021-05-11 华中农业大学 一种牛分枝杆菌卡介苗低黏附力及低侵袭力突变株b2909

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999008713A1 (en) * 1997-08-13 1999-02-25 The Uab Research Foundation Vaccination by topical application of genetic vectors

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1059207A (zh) * 1990-08-21 1992-03-04 白求恩医科大学第一临床医学院 淋病快速诊断试剂盒
US5804566A (en) * 1993-08-26 1998-09-08 The Regents Of The University Of California Methods and devices for immunizing a host through administration of naked polynucleotides with encode allergenic peptides
US5679647A (en) * 1993-08-26 1997-10-21 The Regents Of The University Of California Methods and devices for immunizing a host against tumor-associated antigens through administration of naked polynucleotides which encode tumor-associated antigenic peptides
US5830877A (en) * 1993-08-26 1998-11-03 The Regents Of The University Of California Method, compositions and devices for administration of naked polynucleotides which encode antigens and immunostimulatory

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999008713A1 (en) * 1997-08-13 1999-02-25 The Uab Research Foundation Vaccination by topical application of genetic vectors

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