CN104144699A - 流感h5疫苗 - Google Patents
流感h5疫苗 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104144699A CN104144699A CN201280045059.1A CN201280045059A CN104144699A CN 104144699 A CN104144699 A CN 104144699A CN 201280045059 A CN201280045059 A CN 201280045059A CN 104144699 A CN104144699 A CN 104144699A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- virus
- protein
- clade
- sequence
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
- A61K39/17—Newcastle disease virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/70—Multivalent vaccine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/14043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vectore
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
- C12N2760/18134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Mycology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明基于下述令人惊讶的发现:进化枝1H5N1的H5蛋白质特别通过单次疫苗接种诱导针对具有H5N1HA的流感病毒的交叉进化枝保护性免疫应答。在一个方面,本发明因此涉及用于在治疗或预防由不同进化枝(即分别与进化枝1或除进化枝1外的任何进化枝不同的进化枝)的H5N1病毒感染的方法中使用的进化枝1H5N1病毒的H5蛋白质。
Description
技术领域
本发明涉及医学领域,优选涉及传染病领域。特别地,本发明涉及流感蛋白质和疫苗。最特别地,本发明涉及此类蛋白质或疫苗中的任何用于治疗和预防流感感染的用途,此外用于预防流感病毒的种内和种间传播的用途。
背景技术
流感感染仍是动物和人中的重要感染。流感由经历连续抗原变化/修饰且具有动物储库的病毒引起。因此,新的流行和大流行可以在未来发生,并且该疾病的根除将是难以实现的。流感病毒是本领域众所周知的,并且例如由P.Palese,Nature Medicine,第10卷,no.12,第S82-S86页,2004年12月与进一步的参考文献更详细地描述。简言之,A型流感病毒的基因组由八个单链区段组成,并且病毒颗粒在其表面上具有两种主要糖蛋白:血凝素(H)和神经氨酸酶(N)。具有至少16个不同的血凝素(H1到H16)和9个不同的神经氨酸酶(N1到N9)亚型,在流感病毒中存在相当大的抗原变异。
H5N1型鸡瘟病毒的流感病毒已证实感染家禽、猪和人类。病毒还可以从禽类物种直接传播到人(Claas等人,Lancet1998,351:472;Suarez等人,J.Virol.1998,72:6678;Subbarao等人,Science1998,279:393;Shortridge,Vaccine1999,17(Suppl.1):S26-S29)。在已知人临床病例中的死亡率接近约50%。
在上个世纪中,猪已成为流感大流行的重要载体。猪、骆驼和海豹(优选猪)可以充当禽流感病毒的“混合室”,并且因此代表克服从流感病毒的天然储库家禽到哺乳动物的物种障碍的潜在危险因素。这通常通过敏感动物(例如猪)由确定的哺乳动物(猪)以及禽流感病毒两者的双重感染而发生。这个双重感染可以产生新重组病毒,所述新重组病毒可以是人或猪大流行的原因。然而,近期证据指出目前的禽类H5毒株与哺乳动物流感病毒的重组将不导致高毒力重组体。另一方面,禽流感病毒可以感染猪,并且通过自发突变可以变得适应猪。一旦病毒可以引起猪(或其他哺乳动物)群体内的平行感染,关键障碍就将被克服。
然而,大部分东南亚猪已由源于附近养禽业的禽(H5)流感病毒毒株感染。因为这些感染迄今为止已经是亚临床的,所以它们仅能够通过实验法进行诊断,并且因此是通常被忽略的。存在这些亚临床感染的猪充当病毒适应哺乳动物系统、在猪群体内传播以及感染人类的机会的高风险。
目前的流感疫苗包括亚单位疫苗(Babai等人,Vaccine1999,17(9–10):1223-1238;Crawford等人,Vaccine1999,17(18):2265-2274;Johansson等人,Vaccine1999,17(15–16):2073-2080)、减毒疫苗(Horimoto等人,Vaccine2004,22(17–18):2244-2247)、DNA疫苗(Watabe等人,Vaccine2001,19(31):4434-4444)和灭活流感疫苗(Cao等人,Vaccine1992,10(4):238-242),其中后者是在商业规模上最广泛使用的(Lipatov等人,J Virol2004,78(17):8951-8959)。
亚单位疫苗、重组血凝素和神经氨酸酶(Babai等人,Vaccine1999,17(9–10):1223-1238;Crawford等人,Vaccine1999,17(18):2265-2274;Johansson等人,Vaccine1999,17(15–16):2073-2080)可以是灭活疫苗的有吸引力的替代物,尽管无一目前用作商业疫苗。此类疫苗的制剂明显比灭活疫苗更安全。此外,亚单位疫苗不生成针对内部流感病毒蛋白质的抗体应答,并且因此允许已接种疫苗和受感染动物之间的区分(Crawford等人,Vaccine1999,17(18):2265-2274)。
血凝素蛋白质是流感病毒的受体结合和膜融合糖蛋白和感染性中和抗体的靶。来自H5N1的整个血凝素蛋白质(HA)包含568个氨基酸,具有56kDa的分子量。HA分子由HA1和HA2亚基组成,其中HA1亚基介导与细胞膜的最初接触,而HA2引起膜融合(Chizmadzhev,Bioelectrochemistry2004,63(1–2):129-136)。
杆状病毒/昆虫细胞系统已用于表达从禽流感亚型中分离的血凝素基因(Babai等人,Vaccine1999,17(9–10):1223-1238;Crawford等人,Vaccine1999,17(18):2265-2274;Johansson等人,Vaccine1999,17(15–16):2073-2080);Nwe等人,BMC Mircobiology2006,6(16):doi:10.1186/1471-2180-6-16)。然而,这些重组蛋白质看起来在任何情况下都不是保护性的,或至少对于一些物种是仅更不有效的(Treanor等人,Vaccine2001,19:1732-1737)。
Lin等人的文件(J Vet Med Sci.200870(11):1147-52)公开了杆状病毒/昆虫细胞系统用于生产进化枝2H5N1病毒A/duck/China/E319-2/03的H5蛋白质的用途,所述H5蛋白质可用于预防由进化枝2病毒A/duck/China/E319-2/03的感染的初免-加强疫苗接种。
Bright等人(PLoS One.200830;3(1):e1501)描述了杆状病毒/昆虫细胞系统用于生成病毒样颗粒(VLP)的用途,所述病毒样颗粒包括来自进化枝2H5N1病毒的神经氨酸酶、血凝素和基质1蛋白质,用于在小鼠中诱导针对由进化枝1H5N1病毒A/VN/1203/2004的攻击的交叉进化枝保护性免疫应答。然而,VLP的生产并非没有问题,因为为了生成有效模拟真实病毒的功能VLP,需要多种病毒结构蛋白,其随后必须正确装配成再现感染性病毒的外壳(衣壳)的构象的颗粒。进一步地,研究还揭示VLP的体外装配与聚集竞争(Ding等人Biotechnology and Bioengineering107(3):550–560)。
因此,存在增加改良疫苗的可用性和新疫苗接种方法的需要,所述新疫苗接种方法提供控制流感感染且对疾病负荷具有正面影响的更佳方法。特别地,存在简单、有效和易于处理的系统的强烈需要,所述系统优选通过单次疫苗接种诱导针对具有H5N1HA的流感病毒的交叉进化枝保护性免疫应答。
具体实施方式
在本发明的实施方案前,应当指出如本文和附加权利要求中使用的,除非上下文另有明确说明,否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代。因此,例如,提及“制剂”包括多个此类制剂;提及“载体”指一种或多种载体及其本领域技术人员已知的等价物。除非另有定义,否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。除非另有说明或由本领域技术人员另外已知的,否则所有给定范围和值都可以在1到5%之间变动,因此术语“约”从说明书中省略。尽管目前描述了优选方法、装置和材料,但在本发明的实践或测试中可以使用与本文描述的那些相似或等价的任何方法和材料。本文提及的所有出版物都通过引用并入本文,为了描述和公开如出版物中报道的可以与本发明结合使用的物质、赋形剂、载体和方法的目的。本文的任何内容都不应解释为承认本发明未给予先于本发明的此类公开内容的资格。
上述技术问题的解决方案通过说明书和权利要求中表征的实施方案实现。
流感蛋白质及其编码核酸分子
本发明基于下述令人惊讶的发现:进化枝1H5N1的H5蛋白质特别通过单次疫苗接种诱导针对具有H5N1HA的流感病毒的交叉进化枝保护性免疫应答。作为一个特征,为清楚起见在本文中也称为“H5蛋白质(1)”的进化枝1H5N1病毒的H5蛋白质包含多肽序列或由多肽序列组成,所述多肽序列与SEQ ID NO:1中所示的多肽序列具有至少98%序列相同性。
“单次(single-shot)疫苗接种”指无需加强剂量,在其单次剂量后在减少感染发病率或严重性方面有效的免疫原性组合物。
在一个方面,本发明因此涉及用于在治疗或预防由不同进化枝(即分别与进化枝1或除进化枝1外的任何进化枝不同的进化枝)的H5N1病毒感染的方法中使用的进化枝1H5N1病毒的H5蛋白质(1),其中所述H5蛋白质(1)包含多肽序列或由多肽序列组成,所述多肽序列与SEQ ID NO:1的多肽序列具有至少98%序列相同性。
如本文使用的术语“进化枝”涉及用于高致病性禽流感病毒(H5N1)的WHO命名系统的一个或多个进化枝,其在通过引用并入本文的WHO网站URL处概括:
who.int/csr/disease/avian_influenza/guidelines/nomenclature/en/(12.08.2011)。
定义了10个不同的最初病毒进化枝(编号0-9)(WHO/OIE/FAO H5N1进化工作组,2008),其称为第一级进化枝。进化枝严格地在核苷酸水平上定义为符合由WHO/OIE/FAO H5N1进化工作组开发的下述三个具体进化枝定义标准:
·共同(进化枝限定)结点的共享;
·在进化枝限定结点处具有≥60的自举值的单系群(在1000次连续自举重复后);和
·在进化枝之间和之内分别为>1.5%和<1.5%的配对核苷酸距离平均百分比。
随着这10个进化枝内的病毒继续进化,新的亚系(潜在的H5N1进化枝)定期出现。一旦这些亚系符合与最初10个进化枝(编号0-9)相同的三个具体进化枝定义标准,它们就指定为分离的进化枝(WHO/OIE/FAO H5N1进化工作组Emerg.Inf.Dis.14,7(2008)。这些新进化枝定义为第二(或第三,等)级进化枝,并且使用分层十进制编号系统指定使其与其原始进化枝联系的数字“地址”。例如,在抗原上不同的进化枝2.3内,符合进化枝定义的第三级进化枝指定为进化枝2.3.1和2.3.2等等。这个逻辑分层编号系统客观上与HA系统发生相关。
根据用于H5N1的WHO命名系统的用于进化枝指定的标准是:
1可能时,维持先前指定的进化枝编号(即进化枝2.2仍为2.2,并且进化枝1仍为1)
2衍生自所有可用序列的基于系统树拓扑学的新进化枝指名(大型树)再指定为进化枝0的H5N1祖先(最接近于Gs/Guangdong/1/96)从进化枝3开始编号的后续进化枝(即进化枝3–9)
通过由至少4个分离物共享的不同共同结点的存在指定的进化枝(在单系群中)
指定为单个进化枝的另外分支进化成超过一个不同谱系(即进化枝2.2或进化枝2.3.1;基于共同结点的共享和单系群)
3在进化枝之间和之内的配对距离平均百分比(使用Kimura2-参数)不同进化枝应具有在其他进化枝之间的>1.5%平均距离不同进化枝应具有在进化枝内的<1.5%平均距离(在具有高度进化离群值的进化枝中可能略微更高;即进化枝7中的Ck/Shanxi/2/2006)
4自举(基于1,000次连续自举重复)在进化枝限定结点处的>60%自举值(得自WHO/OIE/FAO H5N1进化工作组Emerg.Inf.Dis.14,7(2008)的表1)。
关于每个进化枝的原型株在下表中列出:
(得自WHO/OIE/FAO H5N1进化工作组Emerg.Inf.Dis.14,7(2008)的表2)。
通过引用并入本文的出版物WHO/OIE/FAO H5N1进化工作组Emerg.Inf.Dis.14,7(2008)在CDC网站URL:cdc.gov/EID/content/14/7/e1.htm(12.08.2011)处发现。
已知H5N1病毒的进化枝分类的概述由通过引用并入本文的WHO网站URL:who.int/csr/disease/avian_influenza/H5CompleteTree.pdf(15.08.2011)处的系统树提供。
为了确定H5N1的H5蛋白质的进化枝,例如,可以使用基于网站的工具“Highly Pathogenic Avian Influenza(HPAI)H5N1HA clade prediction”,其由通过引用并入本文的Lu,Davis,Rowley和Donis:"A Web-based tool for theclade designation of highly pathogenic avian influenza H5N1viruses"inOptions for the Control of Influenza VI.J.M.Katz,N.Cox&A.W.Hampson(Eds.)London:Blackwell,2007描述,并且在网站URL:h5n1.flugenome.org/grouping.php(12.08.2011)处发现。
例如进化枝1H5N1病毒的H5蛋白质(H5蛋白质(1))因此是具有氨基酸序列的HA,所述氨基酸序列由根据上文提及的用于H5N1的WHO命名系统的进化枝1的核苷酸序列编码。
进化枝2.3.1H5N1病毒例如因此是落入根据上文提及的用于H5N1的WHO命名系统的进化枝2.3.1标准的H5N1。
在优选实施方案中,根据本发明的H5蛋白质(1)即如本文描述的进化枝1H5N1病毒的H5蛋白质,包含多肽序列或由多肽序列组成,所述多肽序列与SEQ ID NO:1的多肽序列具有至少98.1%、优选至少98.2%、更优选至少98.3%、且最优选至少98.4%序列相同性。
在本发明的背景下的序列相同性应理解为基于测定的蛋白质序列之间的配对相似性。两个序列之间的相似性百分比的测定优选使用计算机算法完成,所述计算机算法特别是众所周知的基本局部比对搜索工具(AltschulSF,Gish W,Miller W,Myers EW,Lipman DJ:Basic local alignment searchtool.J Mol Biol1990,215(3):403-410)。为了本发明的目的,氨基酸序列的序列相同性百分比使用BLAST blastp同源性搜索算法进行测定,使用下述参数:期望阈值10、字大小3、BLOSUM62矩阵、缺口开放罚分11、缺口延伸罚分1和条件组成得分矩阵调整。针对其搜索的数据库是非冗余蛋白质序列(nr)集合。BLAST同源性搜索算法在通过引用并入本文的AltschulSF(1990),J Mol Biol1990,215(3):403-410中描述。
变体可以例如与不含信号肽(SEQ ID NO:1中未显示的N末端16个氨基酸残基)的参考登记号BAE07201分子相差少至1到15个氨基酸残基、少至1到10个氨基酸残基、例如6-10个、少至5个、少至4、3、2或甚至1个氨基酸残基。
在一个示例性实施方案中,用于在治疗或预防由不同进化枝的H5N1病毒感染的方法中使用的根据本发明的H5蛋白质(1),即进化枝1H5N1病毒的H5蛋白质(1)优选是流感病毒的H5蛋白质,其中所述H5蛋白质具有氨基酸223N和修饰328K+,其中所述H5蛋白质的氨基酸位置编号指如SEQ ID NO:2中示例性给出的氨基酸位置,并且其中所述修饰328K+意指在H5蛋白质的氨基酸位置328处插入第二个赖氨酸(K+)。所述优选的H5蛋白质(1)在下文中也称为Mut k+或mutK+。优选地,此类H5蛋白质和根据本发明的任何其它的H5蛋白质是分离的H5蛋白质。
如本文使用的,术语“进化枝1H5N1的H5蛋白质(1)”优选意指“作为进化枝1H5N1病毒的单一抗原的H5蛋白质(1)”或特别是“作为单一抗原的H5蛋白质(1)”。
如本文使用的术语“血凝素5(H5)”或“禽流感病毒的H5”或“H5蛋白质”是等价的,并且意指但不限于任何天然存在的H5蛋白质和任何修饰形式的H5蛋白质,包括H5蛋白质的任何缺失、取代和/或插入突变体。
如本文使用的H5蛋白质(1)Mut k+的氨基酸位置编号指如SEQ IDNO:2中示例性给出的氨基酸位置。SEQ ID NO:2代表毒株duck/China/E319-2/03的血凝素的氨基酸序列,但缺乏氨基末端信号肽。换言之,如果提及在位置223处的氨基酸(氨基酸223),则意指对应于SEQ IDNO:2的氨基酸223的氨基酸残基。然而,这不意指根据本发明的H5蛋白质Mut k+具有与SEQ ID NO:2等同的氨基酸残基。它仅指根据本发明的H5蛋白质的相应氨基酸编码如明确提及的氨基酸残基。在当前实例下,氨基酸223将是丝氨酸(S)。术语“223N”或“155N”分别示例性意指在位置223和155处的氨基酸—根据SEQ ID NO:2的氨基酸位置编号—应编码氨基酸天冬酰胺(N)。换言之,如果提及“具有氨基酸223N的H5蛋白质(1)”,则在氨基酸位置223处天然编码丝氨酸的H5氨基酸分子—根据SEQ ID NO:2的氨基酸位置编号—该氨基酸应由天冬酰胺(N)取代。术语“328K+”或“修饰328K+”意指在H5蛋白质的氨基酸位置328处—根据SEQ ID NO:2的氨基酸位置编号—插入第二个赖氨酸(K+)。在其中在位置328和329处的氨基酸序列天然编码赖氨酸-赖氨酸的情况下,不应插入另外的赖氨酸(K)。然而,大多数已知H5序列在氨基酸位置328和329处编码赖氨酸-精氨酸。在任何此类情况下,术语328K+修饰意指第二个赖氨酸(K)应插入在位置328处的赖氨酸和在位置329处的精氨酸之间。经修饰的序列随后将读作赖氨酸-赖氨酸-精氨酸(KKR)。
关于本实例,毒株duck/China/E319-2/03的血凝素转变成进化枝1H5N1的H5蛋白质(1),因为它类似进化枝1H5N1病毒A/HongKong/213/2003(这种HK分离物的年份/位置/宿主)的H5序列,并且显示与进化枝1特异性抗体的反应性。因此,Mut K+序列分类为进化枝1H5N1的H5序列。在本发明的背景内,设计的Mut K+序列因此应理解为且定义为进化枝1H5N1病毒的H5蛋白质。
因此,特别地任何设计的H5蛋白质也应理解为且定义为根据本发明的进化枝1H5N1病毒的H5蛋白质,如果它由满足根据上文提及的用于H5N1的WHO命名系统的进化枝1核苷酸序列标准的核苷酸序列编码。
因此,在一个实施方案中,本发明由H5蛋白质和任何修饰形式的H5蛋白质,包括H5蛋白质的任何缺失、取代和/或插入突变体实现,其中这些H5蛋白质具有氨基酸223N和修饰328K+,其中H5蛋白质的氨基酸位置编号指如SEQ ID NO:2中示例性给出的氨基酸位置,并且其中修饰328K+意指在H5蛋白质的氨基酸位置328处插入第二个赖氨酸(K+)。不言自明的是,本文提供的H5蛋白质中的任一是抗原性的,这意指它们在用于流感病毒的标准血凝素抑制测定法中显示抗原性质。
根据另外的实施方案,本发明还涉及H5蛋白质(1)的任何部分,这意指在标准血凝素抑制测定法中显示抗原性质的任何肽片段,在一个实施方案中具有至少氨基酸223N和修饰328K+,其中H5蛋白质的氨基酸位置编号指如SEQ ID NO:2中示例性给出的氨基酸位置,并且其中修饰328K+意指在H5蛋白质的氨基酸位置328处插入第二个赖氨酸(K+)。
如果H5蛋白质(1)在例如如实施例2中所述的标准血凝素抑制测定法中抑制血凝反应,则它显示抗原性质。通常H5蛋白质(1)的所述抗原性部分包含氨基酸序列的200、180、160、150、140、130、120、110个或最优选105个连续氨基酸,所述氨基酸序列编码如上所述的修饰或未修饰的H5蛋白质,所述H5蛋白质在如实施例2中所述的标准血凝素抑制测定法中显示抗原性质。标准血凝素抑制测定法例如也在Stephenson等人,VirusResearch第103卷,第91-95页(2004)与进一步的参考文献中描述。然而,如实施例2中所述的HI测定法应理解为与如本文描述的本发明的所有方面结合的有关参考测定法:
简言之,进行HI测定法以检测HA特异性抗体的存在。异源H5N2病毒A/chicken/Mexico/232/94在HI测定法中以四血凝单位[4HA单位]的浓度使用。在U形底微量滴定板中,随后使在PBS中的系列两倍血清稀释物与含有4HA单位病毒的等体积(25μL)混合,并且在室温(约25℃)下温育30分钟。将在PBS中0.5%浓度的鸡红血细胞加入含血清-病毒的孔中,并且在室温下温育40分钟。HI滴度测定为在其中观察到血凝抑制的最高血清稀释度的倒数。
值得注意的是,Haesebrouck and Pensaert(1986)发现“在针对攻击病毒的HI滴度和不受攻击的保护之间可能存在关联”。Haesebrouck andPensaert(1986)还测定具有HI滴度>40的猪“在攻击时对攻击完全有抵抗力且在呼吸道中未发生病毒复制”。因此,在已接种疫苗的猪中HI滴度>40的发展将与保护关联。(F.Haesebrouck and M.B.Pensaert,1986.先前用灭活的流感H1N1疫苗免疫接种的肥育猪的气管内攻击效应。VeterinaryMicrobiology,11(1986)239—249)。必须假定等价或至少几乎等价的H5HI滴度也将导致猪针对禽流感病毒的完全免疫保护。较低滴度至少导致已接种疫苗的动物的血清阳转且导致这些动物的部分免疫保护,这也能急剧减少大流行的危险。
此外,根据本发明的H5蛋白质(1)的抗原性部分包括但不限于H5蛋白质的缺失突变体,其包含:
i.围绕且包括氨基酸223N的氨基酸序列的至少35、30、25、20、18、15、13、10、9个,或最优选8个连续氨基酸;和
ii.围绕且包括氨基酸修饰328K+的氨基酸序列的至少35、30、25、20、18、15、13、10、9个,或最优选8个连续氨基酸,和
iii.其中H5蛋白质的此类抗原性部分中的任一在如实施例2中所述的标准血凝素抑制测定法中显示血凝素抑制。
优选地,氨基酸223N和/或328K+的这些周围氨基酸由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5编码。
此外,根据本发明的优选H5蛋白质(1)是:
i.任何上文提及的具有氨基酸223N和修饰328K+的H5蛋白质(1);
ii.任何上文提及的具有氨基酸94N/223N和修饰328K+的H5蛋白质(1);
iii.具有氨基酸223N和修饰328K+的禽类起源的任何H5蛋白质,其中禽类起源意指H5序列衍生自最初从由5型禽流感病毒感染的家禽中分离的病毒分离物;或
iv.具有氨基酸94N/223N和修饰328K+的禽类起源的任何H5蛋白质,其中禽类起源意指H5序列衍生自最初从由5型禽流感病毒感染的家禽中分离的病毒分离物;或
v.具有氨基酸155N/223N和修饰328K+的禽类起源的任何H5蛋白质,其中禽类起源意指H5序列衍生自最初从由禽流感病毒5型感染的家禽中分离的病毒分离物;或
vi.具有氨基酸120N/155N/223N和修饰328K+的禽类起源的任何H5蛋白质,其中禽类起源意指H5序列衍生自最初从由禽流感病毒5型感染的家禽中分离的病毒分离物;或
vii.具有修饰94N/223N和修饰328K+的任何H5蛋白质;或
viii.具有修饰94N/155N/223N和修饰328K+的任何H5蛋白质;或
ix.具有修饰94N/120N/155N/223N和修饰328K+的任何H5蛋白质;或
x.具有修饰223N、修饰328K+和一个或多个选自以下的氨基酸簇的任何H5蛋白质:
a.aa93-95:GNF
b.aa123-125:SDH
c.aa128-130:SSG
d.aa138-140:GSS
e.aa226-228:MDF
f.aa270-272:EVE
g.aa309-311:NKL;或
xi.具有修饰223N、和修饰328K+和一个或多个选自以下的氨基酸簇的任何H5蛋白质:
a.aa93-95:GNF
b.aa128-130:SSG
c.aa138-140:GSS;或
xii.具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的任何H5蛋白质。
此外,本文提供的优选H5蛋白质(1)包括如由Hoffmann等人,PNAS,第106卷,no.36,第12915-12920页,2005年9月6日描述的H5蛋白质,其中该H5蛋白质包括如上所述的修饰中的一种或多种,至少氨基酸223N和修饰328K+,其中所述H5蛋白质的氨基酸位置编号指如SEQ ID NO:2中示例性给出的氨基酸位置,并且其中所述修饰328K+意指在H5蛋白质的氨基酸位置328处插入第二个赖氨酸(K+)。这个参考文献的公开内容应通过引用整体并入本文。
此外,本文提供的优选H5蛋白质(1)包括包含肽的H5蛋白质,所述肽包含氨基酸223N和修饰328K+,其中所述H5蛋白质的氨基酸位置编号指如SEQ ID NO:2中示例性给出的氨基酸位置,并且其中所述修饰328K+意指在H5蛋白质的氨基酸位置328处插入第二个赖氨酸(K+),和:
i.SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4;SEQ ID NO:5;SEQ IDNO:6或SEQ ID NO:7的氨基酸序列,或;
ii.任何肽,其与在如上所述的标准血凝素抑制中包含血凝素抑制的i)的多肽具有至少85%序列同源性、更优选至少约90%序列同源性、再更优选至少约95%序列同源性、甚至更优选至少约97%序列同源性、再甚至更优选至少约98%序列同源性、和甚至更优选至少约99%序列同源性;或
iii.i)或ii)的多肽的任何抗原性部分,其包含i)或ii)的肽中的任何的至少35、30、25、20、18、15、13、10、9个,或最优选8个连续氨基酸。
iv.i)、ii)或iii)的任何肽,其具有氨基酸36T、36K、83A、83T、83D、86A、86V、120N、120S、155N、155S、156A、156T、189R、189K、212K、212R、212E、223N、223N或120N/155N。
v.i)、ii)、iii)或iv)的任何肽,其具有一个或多个选自下述的氨基酸簇:
a.aa93-95:GNF
b.aa123-125:SDH
c.aa128-130:SSG
d.aa138-140:GSS
e.aa226-228:MDF
f.aa270-272:EVE
g.aa309-311:NKL;或
vi.i)、ii)、iii)或iv)的任何肽,其具有一个或多个选自下述的氨基酸簇:
a.aa93-95:GNF
b.aa128-130:SSG
c.aa138-140:GSS。
如本文使用的,“序列同源性”指测定两个序列的关联性的方法。为了测定序列同源性,将两个或更多个序列最佳比对,并且在需要时引入缺口。与序列相同性形成对比,当测定序列同源性时,保守氨基酸取代计数为匹配。换言之,为了获得与参考序列具有95%序列同源性的多肽或多核苷酸,参考序列中的85%、优选90%、甚至更优选95%氨基酸残基或核苷酸必须匹配或包含用另一个氨基酸或核苷酸的保守取代,或者在参考序列中总氨基酸残基或核苷酸的高达15%、优选高达10%、甚至更优选高达5%的数目的氨基酸或核苷酸(不包括保守取代)可以插入参考序列内。优选地,同源序列包含至少一段50、甚至更优选100、甚至更优选250、甚至更优选500个核苷酸的延伸(stretch)。在此类比对后,在逐个位置的基础上确定序列同源性,例如,如果在特定位置处,核苷酸或氨基酸残基是等同的,则序列在该位置处是“同源的”。此类位置相同性的总数目随后除以参考序列中的核苷酸或氨基酸残基总数目,以给出%序列同源性。序列同源性可以通过已知方法容易地计算,所述已知方法包括但不限于在下述中描述的那些:Computational Molecular Biology,Lesk,A.N.,编辑,Oxford University Press,New York(1988),Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,编辑,Academic Press,New York(1993);Computer Analysis of SequenceData,Part I,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.,编辑,Humana Press,NewJersey(1994);Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinge,G.,Academic Press(1987);Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.,编辑,M.Stockton Press,New York(1991);以及Carillo,H.和Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988),所述参考文献的教导通过引用并入本文。设计测定序列同源性的优选方法,以给出测试序列之间的最大匹配。测定序列同源性的方法在可公开获得的计算机程序中编码,所述计算机程序测定给定序列之间的序列相同性。此类程序的例子包括但不限于GCG程序包(Devereux,J.,等人,Nucleic Acids Research,12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul,S.F.等人,J.Molec.Biol.,215:403-410(1990)。BLASTX程序可从NCBI及其他来源公开获得(BLASTManual,Altschul,S.等人,NCVI NLM NIH Bethesda,MD20894,Altschul,S.F.等人,J.Molec.Biol.,215:403-410(1990),其教导通过引用并入本文)。这些程序使用缺省缺口权最佳比较序列,以便产生在给定和参考序列之间的最高水平的序列同源性。
此外,优选的H5蛋白质(1)包括这样的H5蛋白质,其包含如上所述的328K+修饰和表1中提供的氨基酸序列,或其任何免疫原性部分:
表1H5抗原
#表1中给出的氨基酸位置指如SEQ ID NO:2中示例性限定的位置。换言之,表1的氨基酸223指SEQ ID NO:2的序列的氨基酸223。
-意指与参考序列相比较,在该位置处的氨基酸是可变的。
此外,本发明还涉及具有至少氨基酸223N和修饰328K+的H5蛋白质
(1),其中所述H5蛋白质的氨基酸位置编号指如SEQ ID NO:2中示例性给出的氨基酸位置,并且其中所述修饰328K+意指在H5蛋白质的氨基酸位置328处插入第二个赖氨酸(K+),并且包含:
i.具有以上述方式修饰的下述NCBI登记号的序列的肽:AAT65209、CAJ32556、ABC47656、CAF21874、CAF21870、AAC58998、AAC58997、AAC58996、AAC58994、AAC58993、AAC58992、AAC58991、AAC58990、AAC58995、AAS45134、AAN17270、AAN17269、AAN17268、AAN17267、AAN17266、AAN17265、AAN17264、AAN17263、AAN17262、AAN17261、AAN17260、AAN17259、AAN17257、AAN17256、AAN17255、AAN17254、AAA43083、AAA43082、AAB19079、BAE48696、BAE48693、BAE48696、BAE48695、BAE48694、BAE48692、BAE48691、BAE48690、BAE48689、BAE48688、BAE48687、BAE48686、BAE48685、BAE48684、BAE48683、AAC58999、ABC72082、AAV91149、AAP71993、AAP71992、AAP71991、AAP71990、AAP71989、AAP72011、AAP72010、AAP72009、AAP72008、AAP72007、AAP72006、AAP72005、AAP72004、AAP72003、AAP72002、AAP72001、AAP72000、AAP71999、AAP71998、AAP71997、AAP71996、AAP71995、AAP71994、AAF99718、ABF58847、AAG38534、AAC32102、AAC32099、AAL75847、AAC32101、AAC32098、AAC32088、AAC32078、AAR99628、AAC32100、AAM49555、AAL75843、AAL75839、AAD13573、AAD13568、AAF04720、AAF04719、AAC34263、AAR16155、AAD13574、AAD13570、AAD13575、AAD13572、AAD13569、AAD13567、AAD13566、AAK57506、AAG01225、AAG01215、AAG01205、AAG01195或ABD83813,这意指这些序列包括并非野生型序列的部分的上述修饰223N和328K+;或
ii.任何肽,其与i)的多肽具有至少85%序列同源性、更优选至少约90%序列同源性、再更优选至少约95%序列同源性、甚至更优选至少约97%序列同源性、再甚至更优选至少约98%序列同源性、和甚至更优选至少约99%序列同源性,并且在如上所述的标准血凝素抑制中显示血凝素抑制;
iii.任何i)或ii)的肽,其具有氨基酸36T、36K、83A、83T、83D、86A、86V、120N、120S、155N、155S、156A、156T、189R、189K、212K、212R、212E、263A、263T或120N/155N;或
iv.任何i)、ii)或iii)的此类肽,其具有一个或多个选自下述的氨基酸簇:
a.aa93-95:GNF
b.aa123-125SDH
c.aa128-130:SSG
d.aa138-140:GSS
e.aa226-228:MDF
f.aa270-272:EVE
g.aa309-311:NKL;或
v.i)、ii)、iii)或iv)的任何肽,其具有一个或多个选自下述的氨基酸簇:
a.aa93-95:GNF
b.aa128-130:SSG
c.aa138-140:GSS
优选地,用于在治疗或预防由不同进化枝的H5N1病毒感染的方法中使用的H5蛋白质(1)通过杆状病毒表达系统优选在培养的昆虫细胞中重组表达和/或产生。
如本文提及的术语“H5蛋白质(1)”因此特别等价于本文使用的术语“重组H5蛋白质”。
关于不同进化枝的H5N1病毒,如本文提及的,所述不同进化枝的H5N1病毒优选选自进化枝0H5N1病毒、进化枝2H5N1病毒、进化枝3H5N1病毒、进化枝4H5N1病毒、进化枝5H5N1病毒、进化枝6H5N1病毒、进化枝7H5N1病毒、进化枝8H5N1病毒和进化枝9H5N1病毒。
在本发明的进一步优选的实施方案中,不同进化枝的H5N1病毒是进化枝2.2H5N1病毒或进化枝2.3H5N1病毒。
在本发明的特别优选的实施方案中,不同进化枝的H5N1病毒是进化枝2.2.1H5N1病毒或进化枝2.3.2H5N1病毒。
为了清楚起见,不同进化枝的H5N1病毒的H5蛋白质在下文被称为“H5蛋白质(2)”。因此,如本文提及的H5蛋白质(2)特别是由除进化枝1外的任何进化枝的H5N1基因组编码的H5蛋白质。
在再进一步优选的实施方案中,不同进化枝的H5N1病毒是北非或越南起源的H5N1病毒,其中所述北非起源的H5N1病毒优选是包含流感病毒的H5蛋白质(2)的H5N1病毒,
其中所述H5蛋白质(2)具有
(a)氨基酸113D、126H、145(-)、156R、160F、167T和181N,其中修饰145(-)意指H5的氨基酸位置145是缺失的,或
(b)氨基酸87P、145L、172T、201E、206I、208K、254T、341G和421K,或
(c)氨基酸145L、172T和254V,
并且其中所述H5蛋白质(2)的氨基酸位置编号指如SEQ ID NO:8中示例性给出的氨基酸位置;
或其中所述H5蛋白质(2)由氨基酸序列组成或包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与如SEQ ID NO:9-46中所示的任何一个序列至少95%、优选至少96%、更优选至少97%、再更优选至少98%、再更优选至少99%、或特别优选100%同源。
在本发明的背景下,根据(a)的所述H5蛋白质(2)是亚进化枝A蛋白质,并且根据(b)或(c)的所述H5蛋白质是亚进化枝B蛋白质。
在本发明的背景内,应当理解术语“氨基酸”特别指氨基酸残基,或分别指已经由肽键与两个另外的氨基酸共价连接的氨基酸,或如果氨基酸在肽序列中是N或C末端定位的,则指已经由肽键与一个另外的氨基酸共价连接的氨基酸。
在本发明的再更优选的实施方案中,不同进化枝的H5N1病毒包含H5蛋白质(2),所述H5蛋白质(2)具有:
(a)氨基酸87L、113D、126H、145(-)、156R、160F、167T和181N,或
(b)氨基酸87P、113N、126R、145L、160Y、172T、181H、201E、206I、208K、254T、341G和421K,或
(c)氨基酸87L、113N、126R、145L、156G、160Y、172T、181H和254V,
和/或
其中此类H5蛋白质(2)包括肽,所述肽包含:
i.SEQ ID NO:9-46的氨基酸序列中的任何一个;
ii.任何肽,其与i)的多肽具有至少85%、优选至少95%、甚至更优选至少96%、甚至更优选至少97%、甚至更优选至少98%、甚至更优选至少99%、最优选100%序列同源性,并且在标准血凝素抑制测定法中包含血凝素抑制;或
iii.i)或ii)的多肽的任何部分,其包含任何i)或ii)的此类肽中的至少34个连续氨基酸,并且其中任何此类肽在标准血凝素抑制测定法中包含血凝素抑制,
和/或
其中此类H5蛋白质(2)由连续氨基酸序列组成或包含连续氨基酸序列,所述连续氨基酸序列与SEQ ID NO:9-46中所示的任何一个序列具有至少95%、甚至更优选至少96%、甚至更优选至少97%、甚至更优选至少98%、甚至更优选至少99%、最优选100%序列相同性。
更特别地,不同进化枝的H5N1病毒优选包含由氨基酸序列组成或包含氨基酸序列的H5蛋白质(2),所述氨基酸序列与如SEQ ID NO:15或20中所示的任何一个序列至少95%、优选至少96%、更优选至少97%、再更优选至少98%、再更优选至少99%、或特别优选100%序列同源,并且其中包含SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列组成的此类H5蛋白质(2)是特别更优选的。
特别地,本发明涉及用于在治疗或预防下述感染的方法中使用的本文描述的H5蛋白质(1)
(A)北非起源的亚进化枝A H5N1病毒感染,即包含具有根据权利要求13或14的(a)的氨基酸的H5蛋白质(2),或包含涉及SEQ ID NO:9-19、或42或43中所示的任何一个序列的根据权利要求16或17的H5蛋白质的H5N1病毒感染,
或
(B)北非起源的亚进化枝B H5N1病毒感染,即包含具有根据权利要求13或14的(b)或(c)的氨基酸的H5蛋白质,或包含涉及SEQ ID NO:20-41或44-46中所示的任何一个序列的根据权利要求16或17的H5蛋白质的H5N1病毒感染。
根据另外的实施方案,本发明还涉及用于在治疗或预防由不同进化枝的H5N1病毒感染的方法中使用的,编码如上所述的H5蛋白质(1)中的任一个的核酸分子。优选地,这些核酸分子是RNA、DNA或拷贝(c)DNA分子。因此,本发明涉及编码H5蛋白质或任何修饰形式的H5蛋白质的核酸分子,优选cDNA分子,包括H5蛋白质的任何缺失、取代和/或插入突变体,其中这些H5蛋白质具有氨基酸223N和修饰328K+,其中所述H5蛋白质的氨基酸位置编号指如SEQ ID NO:2中示例性给出的氨基酸位置,并且其中所述修饰328K+意指在H5蛋白质的氨基酸位置328处插入第二个赖氨酸(K+)。
根据另外的实施方案,本发明还涉及编码H5蛋白质(1)的任何部分的核酸分子,优选cDNA分子,其意指编码任何肽片段,其在如上所述的标准血凝素抑制测定法中显示抗原性质,并且具有至少氨基酸223N和修饰328K+,其中所述H5蛋白质的氨基酸位置编号指如SEQ ID NO:2中示例性给出的氨基酸位置,并且其中所述修饰328K+意指在H5蛋白质的氨基酸位置328处插入第二个赖氨酸(K+)。通常编码H5蛋白质的抗原性部分的此类核酸分子包含核苷酸序列的600、540、480、450、420、390、360、330个或最优选315个连续核苷酸,所述核苷酸序列编码如上所述的修饰或未修饰的H5蛋白质,并且所述H5蛋白质在如本文所述的标准血凝素抑制测定法中显示抗原性质。
H5蛋白质(1)的抗原性部分的另外的实施方案在上文描述。构建编码如上所述的H5蛋白质的抗原性部分的任何此类核酸分子(优选cDNA分子)在本领域技术人员的常识内。这还包括但不限于构建编码如上所述的H5蛋白质(包括H5蛋白质的缺失突变体)的抗原性部分的核酸分子,优选cDNA分子,其包含:
i.围绕且包括编码氨基酸223N的编码序列的核苷酸序列的至少105、90、75、60、48、45、39、30、27个,或最优选24个连续核苷酸;和
ii.围绕且包括编码修饰328K+的编码序列的核苷酸序列的至少105、90、75、60、48、45、39、30、27个,或最优选24个连续核苷酸,和
iii.其中任何此类H5蛋白质的抗原性部分在如实施例2中所述的标准血凝素抑制测定法中显示血凝素抑制。
优选地,编码氨基酸223N和/或328K+的核苷酸的这些周围核苷酸编码SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5。
此外,编码根据本发明的H5蛋白质(1)的优选核酸分子是:
i.任何上文提及的编码氨基酸223N和修饰328K+的核酸分子;
ii.任何上文提及的编码氨基酸94N/223N和修饰328K+的核酸分子;
iii.编码氨基酸223N和修饰328K+的禽类起源的任何核酸分子,其中禽类起源意指H5序列衍生自最初从由5型禽流感病毒感染的家禽中分离的病毒分离物;或
iv.编码氨基酸94N/223N和修饰328K+的禽类起源的任何核酸分子,其中禽类起源意指H5序列衍生自最初从由5型禽流感病毒感染的家禽中分离的病毒分离物;或
v.编码氨基酸155N/223N和修饰328K+的禽类起源的任何核酸分子,其中禽类起源意指H5序列衍生自最初从由5型禽流感病毒感染的家禽中分离的病毒分离物;或
vi.编码具有氨基酸120N/155N/223N和修饰328K+的禽类起源的H5蛋白质的任何核酸分子,其中禽类起源意指H5序列衍生自最初从由5型禽流感病毒感染的家禽中分离的病毒分离物;或
vii.编码具有修饰94N/223N和修饰328K+的H5蛋白质的任何核酸分子;或
viii.编码具有修饰94N/155N/223N和修饰328K+的H5蛋白质的任何核酸分子;或
ix.编码具有修饰94N/120N/155N/223N和修饰328K+的H5蛋白质的任何核酸分子;或
x.编码具有修饰223N、修饰328K+和一个或多个选自下述的氨基酸簇的H5蛋白质的任何核酸分子:
a.aa93-95:GNF
b.aa123-125:SDH
c.aa128-130:SSG
d.aa138-140:GSS
e.aa226-228:MDF
f.aa270-272:EVE
g.aa309-311:NKL;或
xi.编码具有氨基酸223N、修饰328K+和一个或多个选自下述的氨基酸簇的H5蛋白质的任何核酸分子:
a.aa93-95:GNF
b.aa128-130:SSG
c.aa138-140:GSS;或
xii.编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的H5蛋白质的任何核酸分子。
此外,本文提供的优选H5蛋白质(1)包括如由Hoffmann等人,PNAS,第106卷,no.36,第12915-12920页,2005年9月6日描述的H5蛋白质,其中该H5蛋白质包括如上所述的修饰中的一种或多种,至少氨基酸223N和修饰328K+,其中所述H5蛋白质的氨基酸位置编号指如SEQ ID NO:2中示例性给出的氨基酸位置,并且其中所述修饰328K+意指在H5蛋白质的氨基酸位置328处插入第二个赖氨酸(K+)。这个参考文献的公开内容应通过引用整体并入本文。因此,根据另外的实施方案,本发明还涉及编码由Hoffmann等人,PNAS,第106卷,no.36,第12915-12920页,2005年9月6日描述的任何此类蛋白质的任何核酸分子,优选cDNA分子,其中该H5蛋白质包括如上所述的修饰中的一种或多种,至少氨基酸223N和修饰328K+,其中所述H5蛋白质的氨基酸位置编号指如SEQ ID NO:2中示例性给出的氨基酸位置,并且其中所述修饰328K+意指在H5蛋白质的氨基酸位置328处插入第二个赖氨酸(K+)。
如何在核苷酸序列(包括流感病毒的H5蛋白质的编码序列)内引入上述修饰中的任何的方法是本领域众所周知的。整个流感病毒的基因组序列可以根据本发明,例如根据US6,951,754与进一步的参考文献中所述的方法进行修饰。
此外,可以采用在本领域技术内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术,以修饰如本文描述的编码抗原的核酸序列。此类技术在文献中充分说明。参见例如,Sambrook等人,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第二版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.;DNA Cloning:A Practical Approach,第I和II卷(D.N.Glover编辑1985);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑1984);Nucleic AcidHybridization[B.D.Hames&S.J.Higgins编辑(1985)];Transcription AndTranslation[B.D.Hames&S.J.Higgins,编辑(1984)];Animal Cell Culture[R.I.Freshney,编辑(1986)];Immobilized Cells And Enzymes[IRL Press,(1986)];B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984);F.M.Ausubel等人(编辑),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.1994)。
根据另外的实施方案,本发明还涉及包含如上所述的此类核酸分子中的任何的载体。换言之,本发明涉及包括如上所述的任何此类H5蛋白质(1)的编码序列或其部分的载体。优选地,所述载体是表达载体,其允许表达如上所述的任何此类H5蛋白质(1)或其部分。根据本发明的载体是适合于在体外或体内转染或感染细菌、酵母或动物细胞的载体。
载体和用于制备和/或使用载体(或重组体)以表达的方法可以通过公开于下述的方法或类似于公开于下述的方法:美国专利号4,603,112、4,769,330、5,174,993、5,505,941、5,338,683、5,494,807、4,722,848、5,942,235、5,364,773、5,762,938、5,770,212、5,942,235、382,425,PCT公开WO94/16716、WO96/39491、WO95/30018,Paoletti,"Applications of pox virus vectors tovaccination:An update,"PNAS USA93:11349-11353,1996年10月,Moss,"Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression,vaccination,and safety,"PNAS USA93:11341-11348,1996年10月,Smith等人,美国专利号4,745,051,(重组杆状病毒),Richardson,C.D.(编辑),Methods in Molecular Biology39,"Baculovirus Expression Protocols"(1995Humana Press Inc.),Smith等人,"Production of Human Beta Interferon inInsect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector”,Molecular andCellular Biology,1983年12月,第3卷,No.12,第2156-2165页;Pennock等人,"Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase inInfect Cells with a Baculovirus vector,"Molecular and Cellular Biology1984年3月,第4卷,No.3,第399-406页;EPA0370573,于1986年10月16日提交的号920,197美国申请,EP专利公开号265785,美国专利号4,769,331(重组疱疹病毒),Roizman,"The function of herpes simplex virusgenes:A primer for genetic engineering of novel vectors,"PNAS USA93:11307-11312,1996年10月,Andreansky等人,"The application ofgenetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimentalbrain tumors,"PNAS USA93:11313-11318,1996年10月,Robertson等人"Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes",PNAS USA93:11334-11340,1996年10月,Frolov等人,"Alphavirus-based expression vectors:Strategies and applications,"PNAS USA93:11371-11377,1996年10月,Kitson等人,J.Virol.65,3068-3075,1991;美国专利号5,591,439、5,552,143、WO98/00166,两者均于1996年7月3日提交的允许的序列号08/675,556和08/675,566的美国申请(重组腺病毒),Grunhaus等人,1992,"Adenovirus ascloning vectors,"Seminars in Virology(第3卷)第237-52页,1993,Ballay等人EMBO Journal,第4卷,第3861-65页,Graham,Tibtech8,85-87,1990年4月,Prevec等人,J.Gen Virol.70,42434,PCT WO91/11525,Felgner等人(1994),J.Biol.Chem.269,2550-2561,Science,259:1745-49,1993和McClements等人,"Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein Dor glycoprotein B,alone or in combination,induces protective immunity inanimal models of herpes simplex virus-2disease",PNAS USA93:11414-11420,1996年10月,和美国专利号5,591,639、5,589,466和5,580,859,以及WO90/11092、WO93/19183、WO94/21797、WO95/11307、WO95/20660,Tang等人,Nature和Furth等人Analytical Biochemistry,尤其涉及DNA病毒载体。还参见WO98/33510;Ju等人,Diabetologia,41:736-739,1998(慢病毒表达系统);Sanford等人,美国专利号4,945,050;Fischbach等人(Intracel),WO90/01543;Robinson等人,seminars in Immunology第9卷,第271-283页(1997),(DNA载体系统);Szoka等人,美国专利号(将DNA插入活细胞内的方法);McCormick等人,美国专利号5,677,178(细胞病变病毒的使用);和美国专利号5,928,913(用于基因递送的载体),以及本文引用的其他文件,所述参考文献各自通过引用并入本文。
例如选自猪疱疹病毒例如伪狂犬病病毒,猪腺病毒,痘病毒尤其是牛痘病毒、鸟痘病毒、金丝雀痘病毒和猪痘病毒的病毒载体,以及DNA载体(DNA质粒)有利地用于本发明的实践中。
根据本发明产生H5蛋白质(1)的方法
根据另一个方面,本发明提供了产生和/或回收大量重组H5蛋白质的方法:i)通过允许含有H5DNA编码序列的重组病毒载体感染培养中的敏感细胞,其中H5蛋白质由重组病毒载体表达,和ii)其后从细胞培养物中回收H5蛋白质。大量H5蛋白质意指但不限于超过约20μg/mL细胞培养物,优选超过约25μg/mL,甚至更优选超过约30μg/mL,甚至更优选超过约40μg/mL,甚至更优选超过约50μg/mL,甚至更优选超过约60μg/mL,甚至更优选超过约80μg/mL,甚至更优选超过约100μg/mL,甚至更优选超过约150μg/mL,最优选超过约190μg/mL。
根据优选实施方案,通过收获表达H5蛋白质的全(即完整的)SF+细胞回收H5蛋白质(1)。
优选细胞是对于由合适的重组病毒载体感染敏感的细胞,所述重组表达载体含有H5DNA且表达H5蛋白质(1)。优选地,细胞是昆虫细胞,并且更优选地,它们包括在商标SF+昆虫细胞(Protein Sciences Corporation,Meriden,CT)下销售的昆虫细胞。优选的细胞培养物具有约0.3-2.0x106细胞/mL、更优选约0.35-1.9x106细胞/mL、再更优选约0.4-1.8x106细胞/mL、甚至更优选约0.45-1.7x106细胞/mL、且最优选约0.5-1.5x106细胞/mL的细胞计数。
优选的病毒载体包括杆状病毒例如BaculoGold(BD BiosciencesPharmingen,San Diego,CA),特别条件是生产细胞是昆虫细胞。尽管杆状病毒表达系统是优选的,但本领域技术人员应当理解其他表达系统将为本发明的目的工作,即H5表达到细胞培养上清液内。此类其他表达系统可能需要使用信号序列,以便引起H5表达到培养基内。
合适的生长培养基还可通过本领域技术人员用优选生长培养基测定,所述优选生长培养基是无血清昆虫细胞培养基,例如Excell420(JRHBiosciences,Inc.,Lenexa,KS)等。
当用于敏感细胞的感染时,含有H5DNA序列的重组病毒载体具有约0.03-1.5、更优选约0.05-1.3、再更优选约0.09-1.1、和最优选约0.1-1.0的优选感染复数(MOI)。优选地,上文提及的MOI涉及1mL细胞培养液。优选地,本文描述的方法包括用具有约0.03-1.5、更优选约0.05-1.3、再更优选约0.09-1.1、和最优选约0.1-1.0的MOI(感染复数)的重组病毒载体感染0.35-1.9x106细胞/mL、再更优选约0.4-1.8x106细胞/mL、甚至更优选约0.45-1.7x106细胞/mL、且最优选约0.5-1.5x106细胞/mL,所述重组病毒载体含有H5DNA且表达H5蛋白质。
受感染细胞随后温育高达十天、更优选约两天到约十天、再更优选约四天到约九天、和最优选约五天到约八天的时期。优选的温育条件包括约22-32℃、更优选约24-30℃、再更优选约25-29℃、甚至更优选约26-28℃、和最优选约27℃的温度。优选地,在温育后针对特征性杆状病毒诱导的变化观察SF+细胞。此类观察可以包括监控细胞密度趋势和在感染后期过程中活力的下降。发现在感染后3-5天观察到峰病毒滴度,并且细胞中的峰H5蛋白质表达在第5到8天之间,和/或当细胞活力下降到小于10%时获得。
因此,本发明的一个方面提供了通过下述优选以上文描述的量产生和/或回收重组H5蛋白质的方法:i)允许具有如上定义的MOI的重组病毒载体感染培养中的许多敏感细胞(参见上文),ii)由重组病毒载体表达H5蛋白质,和iii)其后从感染后第5到8天之间获得的和/或细胞活力下降到小于10%的细胞中回收H5蛋白质。优选地,重组病毒载体是含有H5DNA编码序列的重组杆状病毒,并且细胞是SF+细胞。另外,优选定期检查培养物肉眼和显微的污染证据或在感染后期过程中细胞形态中的非典型变化。显示出任何污染的任何培养物应弃去。
对于将在免疫原性或免疫组合物例如疫苗中使用的H5蛋白质(1)的回收,优选包括灭活步骤以便灭活病毒载体。
“免疫原性或免疫组合物”指包含至少一种抗原的物质组合物,所述抗原在细胞和/或抗体介导的免疫应答的宿主中引发针对目的组合物或疫苗的免疫应答。通常,“免疫应答”包括但不限于下述效应中的一种或多种:特别针对目的组合物或疫苗中包括的一种或多种抗原的抗体、B细胞、辅助T细胞、抑制T细胞、和/或细胞毒性T细胞和/或γ-δT细胞的产生或激活。优选地,宿主将展示治疗或保护性免疫应答,从而使得对新感染的抗性将得到增强和/或疾病的临床严重性得到减少。此类保护将通过通常由受感染宿主展示的症状的减少或缺乏、更快速的恢复时间和/或受感染宿主中降低的病毒滴度加以证实。
如本文使用的,“疫苗”指如本领域技术人员使用的该术语。更特别地,“疫苗”指免疫原性组合物,当施用于有此需要的动物时,所述免疫原性组合物导致流感感染的临床体征的发病率或严重性中的减少,直到包括此类临床体征的完全预防。优选地,与未接受本发明的组合物但暴露于感染水平的流感病毒的动物或动物组相比较,所述感染水平通常导致显示出临床体征的流感感染,发病率或严重性中的减少是至少10%、更优选至少20%、再更优选至少30%、甚至更优选至少40%、更优选至少50%、再更优选至少60%、甚至更优选至少70%、更优选至少80%、再更优选至少90%、甚至更优选至少95%、且最优选100%。
因此,本发明还涉及通过下述优选以上文描述的量产生和/或回收重组H5蛋白质的方法:i)允许具有如上定义的MOI的重组病毒载体感染培养中的许多敏感细胞(参见上文),ii)由重组病毒载体表达H5蛋白质,iii)回收在感染后第5到8天之间获得的和/或细胞活力下降到小于10%的细胞中表达的H5,和iv)灭活重组病毒载体。
优选地,这个灭活正好在过滤步骤之前或正好在过滤步骤之后完成,其中在过滤步骤之后是用于灭活的优选时间。任何常规灭活方法都可以用于本发明的目的。因此,灭活可以通过化学和/或物理处理进行。在优选形式中,测定收获液体的体积,并且使温度达到约32-42℃、更优选约34-40℃、和最优选约35-39℃。优选的灭活方法包括环化二乙烯亚胺(BEI)的添加,优选以约1mM-约20mM、优选约2mM-约10mM、再更优选约2mM-约8mM、再更优选约3mM-约7mM、最优选约5mM的浓度。例如,灭活包括向液体中添加优选约0.4M的2-溴乙撑胺氢溴化物溶液,以得到约5mM BEI的终浓度,所述2-溴乙撑胺氢溴化物溶液已在0.3N NaOH中环化为0.2M二乙烯亚胺(BEI)。优选地,随后将液体连续搅拌72-96小时,并且灭活的收获液体可以冷冻贮存于-40℃或低于约1-7℃或约1-7℃之间。在灭活完成后,添加优选以1.0M的硫代硫酸钠溶液,以中和任何残留BEI。优选地,硫代硫酸钠以与在灭活前添加的BEI相比较的等量添加。例如,在BEI添加至5mM终浓度的情况下,添加1.0M硫代硫酸钠溶液,以得到5mM的最终最小浓度,以中和任何残留BEI。
因此,本发明的一个另外的方面涉及通过下述优选以上文描述的量产生重组H5蛋白质的方法:i)允许具有如上定义的MOI的重组病毒载体感染培养中的许多敏感细胞(参见上文),ii)由重组病毒载体表达H5蛋白质,iii)回收在感染后第5到8天之间获得的和/或细胞活力下降到小于10%的细胞中表达的H5,和iv)灭活重组病毒载体。优选地,重组病毒载体是含有H5DNA编码序列的杆状病毒,并且细胞是SF+细胞。优选的灭活步骤是上文描述的那些。优选地,灭活在约35-39℃之间和在2-8mM BEI的存在下,再更优选在约5mM BEI的存在下进行。
根据本发明的一个另外的方面,上文描述的方法还包括在步骤iv)后的中和步骤。这个步骤v)包括添加中和溶液内的灭活试剂的等量试剂。优选地,如果灭活试剂是BEI,则硫代硫酸钠至等量的添加是优选的。因此,根据另外的方面,当灭活试剂是BEI时,步骤v)包括添加硫代硫酸钠溶液至约1mM-约20mM、优选约2mM-约10mM、再更优选约2mM-约8mM、再更优选约3mM-约7mM、最优选约5mM的终浓度。
在优选形式中且尤其在免疫原性组合物例如疫苗中使用重组H5蛋白质的形式中,每批收获的H5蛋白质将通过在依赖于贴壁的杆状病毒敏感昆虫细胞例如Sf9细胞中传代测试灭活。在这个测试的优选形式中,150cm2的合适细胞培养单层用1.0mL灭活的H5液体接种,并且在25-29℃下维持14天,伴随至少两次传代。在维持期结束时,对细胞单层检查H5杆状病毒典型的致细胞病变效应(CPE)。优选地,还使用阳性病毒对照。此类对照可以由用非灭活参考H5杆状病毒接种的Sf9细胞的一个培养物和保持未接种的Sf9细胞的一个烧瓶组成。在接种和传代后,在BEI处理的病毒液中病毒感染细胞的不存在将构成满意的灭活测试。用参考病毒接种的对照细胞应显示出H5杆状病毒典型的CPE,并且未接种的烧瓶不应显示出H5杆状病毒CPE的任何证据。可替代地,在维持期结束时,可以收集上清液样品且接种到Sf996孔板上,所述Sf996孔板已装载有Sf9细胞,并且随后在25-29℃下维持5-6天。随后将平板固定且用缀合至FITC的抗H5抗体或针对杆状病毒特异性蛋白质(即gp64)的任何标记抗体染色。在BEI处理的病毒液中CPE的不存在、H5表达或杆状病毒特异性蛋白质(即gp64)的表达构成满意的灭活测试。用参考病毒接种的对照细胞应显示出CPE和IFA活性,并且未接种的烧瓶不应显示出H5杆状病毒CPE的任何证据,且不含IFA活性。
因此,本文描述的另外的方面涉及用于测定表达H5蛋白质(1)的重组病毒载体灭活的有效性的灭活测试,其包括步骤:i)使至少部分含有重组病毒载体的培养液与优选如上所述的灭活试剂接触,ii)添加优选如上所述的中和试剂,以中和灭活试剂,和iii)通过如上所述的测定法测定残留感染性。
在灭活后,在样品中相对量的重组H5蛋白质可以以许多方式进行测定。优选定量方法包括SDS-PAGE光密度法、ELISA、和使已知数量的疫苗与临床结果(血清学等)关联的动物疫苗接种研究。当SDS-PAGE用于定量时,在凝胶上运行含有未知量的重组H5蛋白质的样品材料,连同含有不同已知量的重组H5蛋白质的样品。随后可以基于已知样品产生标准曲线,并且未知样品中的重组H5的量可以通过与这个标准曲线比较进行测定。因为ELISA一般公认为用于抗原定量的工业标准,所以它们对于定量是优选的。
包含H5蛋白质(1)或编码其的核酸分子或载体的疫苗
本发明进一步提供了用于在治疗或预防不同进化枝的H5N1病毒感染的方法中使用,特别是用于在如本文描述的治疗或预防不同进化枝的H5N1病毒感染的任何方法中使用的下述的组合
(a)本文描述的H5蛋白质(1)
和
(b)灭活的新城疫病毒。
所述组合在下文也称为“本文描述的组合”。
根据本发明,应当理解本文描述的组合优选包括在多价组合疫苗中,或本文描述的组合特别涉及组合疫苗接种,更特别涉及本文描述的H5蛋白质(1)和灭活的新城疫病毒在最多24小时内对有此需要的动物特别是家禽或人类的施用。
优选地,灭活的新城疫病毒是灭活的完整新城疫病毒粒子。
在另一个优选实施方案中,灭活的新城疫病毒是通过灭活新城疫病毒获得的灭活的新城疫病毒,所述新城疫病毒包含与SEQ ID NO:51(LaSota毒株病毒的cDNA序列)中所示的多核苷酸的RNA拷贝具有至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、再更优选至少95%或特别是100%序列相同性的RNA多核苷酸,其已得到灭活。
特别地,灭活的新城疫病毒是灭活的新城疫LaSota毒株病毒。
在一个优选实施方案中,灭活的新城疫病毒是已用选自下述的试剂灭活的新城疫病毒:甲醛、二乙烯亚胺(BEI)、β-丙内酯(BPL)及其组合。
在本文描述的组合中灭活的新城疫病毒的量优选是102-1010当量的鸡胚感染剂量(EID50),优选106-109EID50,特别优选107-109EID50。在本文描述的组合中H5蛋白质(1)的量优选与下文提及的相同。
根据本发明的H5蛋白质(1)的量优选是10-1000血凝单位(HAU)/剂,更优选50-950HAU/剂、甚至更优选100-900HAU/剂、甚至更优选200-800HAU/剂、甚至更优选300-700HAU/剂、再更优选300-500HAU/剂。
根据另外的方面,本发明涉及一般而言的疫苗或药物组合物,其包含
i.如本文描述的H5蛋白质(1)或本文描述的组合中的一种或多种;
ii.编码任何此类H5蛋白质(1)的如本文描述的核酸分子中的一种或多种;和/或
iii.如本文描述的载体中的一种或多种,其包括任何此类核酸分子且编码如本文描述的任何此类H5蛋白质(1);和
iv.药学可接受的载体和/或赋形剂。
如本文描述的术语“药物组合物”、“药物/疫苗组合物”包括但不限于用于减少或预防感染的疫苗或者用于治疗和减轻感染的物质组合物。
编码流感血凝素的基于核酸的疫苗(优选cDNA疫苗)的制备例如在Deck等人,Vaccine1997;15(1):71-78;Ulmer等人,Science1993;259:1745-1749;Ulmer等人,Vaccine1994;12(16):1541-1544中描述。这些方法中的任何都可以用于产生编码如本文描述的流感H5蛋白质的基于核酸的疫苗,优选cDNA疫苗。
此外,包含如本文描述的H5蛋白质(1)或其部分的疫苗可以通过常规方法产生,例如通过重组表达技术或通过生物化学纯化和分离技术。重组表达技术包括在昆虫细胞中的表达是本领域众所周知的,并且例如在下述中描述:Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.;DNACloning:A Practical Approach,第I和II卷(D.N.Glover编辑1985);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑1984);Nucleic Acid Hybridization[B.D.Hames&S.J.Higgins编辑(1985)];Transcription And Translation[B.D.Hames&S.J.Higgins,编辑(1984)];Animal Cell Culture[R.I.Freshney,编辑(1986)];Immobilized Cells And Enzymes[IRL Press,(1986)];B.Perbal,APractical Guide To Molecular Cloning(1984);F.M.Ausubel等人(编辑),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.1994)。充分确定的重组表达系统的另外的例子是细菌表达系统例如大肠杆菌(E.coli)或枯草芽孢杆菌(B.subtilis),基于酵母的表达系统例如酿酒酵母(S.cerevisiae)或粟酒裂殖酵母(S.pombe),或哺乳动物细胞表达系统例如基于BHK-、CHO-和/或NS0-的表达系统。此类系统是本领域众所周知的,并且一般例如通过Clontech Laboratories,Inc.4030Fabian Way,Palo Alto,California94303-4607,USA商购可得。另外的的表达策略例如在Lüschow等人,Vaccine no.19(2001),第4249-4259页,或Veit等人,PNAS第103卷(2006),第8197-8202页中描述。此外,重组腺伴随病毒系统是充分确定的,并且例如在US5,436,146或WO200203872与进一步的参考文献中描述。此外,例如如US6,265,183与进一步的参考文献中描述的基于牛痘(痘)病毒的表达系统也是充分确定的,并且适合于产生一种或多种重组抗原,如根据本发明使用的一种或多种抗原组合物。另外的的合适表达系统利用重组乳多空病毒(popova)病毒例如SV40、禽痘病毒、假性狂犬病病毒和逆转录病毒。
如本文描述的有关药物/疫苗组合物也可以包含灭活病毒,其包含如本文描述的H5蛋白质(1)、包含如本文描述的H5蛋白质(1)的无致病性形式的活病毒、病毒制剂和/或片段,其中所述制剂和/或片段包含如本文描述的H5蛋白质(1)。
技术人员了解可以连同抗原一起包含在所述组合物/疫苗中的另外组分(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.(1990).第18版MackPubl.,Easton)。专家可以使用已知可注射、生理学可接受的无菌溶液。为了制备即用型溶液,等渗水溶液例如盐水或相应的血浆蛋白质溶液是可容易获得的。药物组合物/疫苗可以作为冻干产物(lyophylisate)或干燥制剂存在,其可以在无菌条件下在使用前直接用已知的可注射溶液重构,例如作为试剂盒存在。
此外,本发明的药物/疫苗组合物可以包括一种或多种兽医学可接受的载体。如本文使用的,“兽医学可接受的载体”包括但不限于任何和所有溶剂、分散介质、包衣、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂等。
稀释剂可以包括水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油等。等渗剂尤其可以包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨糖醇和乳糖。稳定剂尤其包括白蛋白和乙二胺四乙酸(ethylendiamintetracetic acid)的碱金属盐。
如本文使用的防腐剂指抗微生物活性剂,例如庆大霉素、硫柳汞等。特别地,防腐剂的添加对于多剂量组合物的制备是最优选的。这些抗微生物活性剂以有效阻止目的组合物的任何微生物污染或抑制目的组合物内的任何微生物生长的浓度添加。
如本文使用的“佐剂”可以包括氢氧化铝和磷酸铝、皂苷例如Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Inc.,Cambridge MA)、GPI-0100(GalenicaPharmaceuticals,Inc.,Birmingham,AL)、油包水乳状液、水包油乳状液、水包油包水乳状液。
乳状液可以特别基于轻液体石蜡油(欧洲药典类型);类异戊二烯油例如角鲨烷或角鲨烯;来自烯烃特别是异丁烯或癸烯寡聚的油;含有线性烷基的酸或醇的酯,更特别是植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)、甘油基三-(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯;分支脂肪酸或醇的酯,特别是异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以形成乳状液。乳化剂优选是非离子型表面活性剂,特别是脱水山梨糖醇、二缩甘露醇(例如无水甘露醇油酸酯)、乙二醇、聚甘油、丙二醇以及油酸、异硬脂酸,蓖麻油酸或羟基硬脂酸的酯(它们都是任选乙氧基化的),和聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物,特别是Pluronic产品,尤其是L121。参见Hunter等人,The Theory and PracticalApplication of Adjuvants(Ed.Stewart-Tull,D.E.S.).John Wiley and Sons,NY,第51-94页(1995)和Todd等人,Vaccine15:564-570(1997)。合适的水包油乳状液的例子是基于Emulsigen的佐剂,例如 (MVP Laboratories,Inc.Omaha,NE,USA)。已惊讶地发现,包含H5蛋白质(优选如本文描述的重组H5蛋白质)的药物/疫苗组合物已由水包油乳状液,优选由此类基于Emulsigen的佐剂,更优选由和有效佐剂化。
此外,能够使用在由M.Powell和M.Newman编辑的"Vaccine Design,The Subunit and Adjuvant Approach"Plenum Press,1995的第147页上描述的SPT乳状液,和在同一本书的第183页上描述的乳状液MF59。
佐剂的其它实例是选自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物以及马来酸酐和烯基衍生物的共聚物的化合物。有利的佐剂化合物是尤其由糖或多元醇的聚烯基醚交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物。这些化合物通过术语卡波姆(Phameuropa第8卷,No.2,1996年6月)已知。本领域技术人员还可以参考美国专利号2,909,462,其描述了由聚羟基化化合物交联的此类丙烯酸聚合物,所述聚羟基化化合物具有至少3个羟基,优选不超过8个,至少三个羟基的氢原子替换为具有至少2个碳原子的不饱和脂肪族原子团。优选原子团是含有2–4个碳原子的原子团,例如乙烯基、烯丙基及其他烯属不饱和基团。不饱和原子团自身可以含有其他取代基例如甲基。在名称卡波普(BF Goodrich,Ohio,USA)下销售的产品是特别合适的。它们由烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交联。在它们中,可以提及卡波普974P、934P和971P。最优选的是卡巴普971P的使用。在马来酸酐与烯基衍生物的共聚物中,共聚物EMA(Monsanto)是马来酸酐和乙烯的共聚物。这些聚合物在水中的溶解导致酸性溶液,所述酸性溶液将优选被中和至生理pH,以便得到免疫原性、免疫或疫苗组合物自身将掺入其内的佐剂溶液。
其它的合适佐剂尤其包括但不限于RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)、嵌段共聚物(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰脂质A、阿夫立定脂质-胺佐剂、来自大肠杆菌的不耐热肠毒素(重组体或其他形式)、霍乱毒素或胞壁酰二肽。
优选地,佐剂以约100μg-约10mg/剂的量添加。甚至更优选的,佐剂以约100μg-约10mg/剂的量添加。甚至更优选的,佐剂以约500μg-约5mg/剂的量添加。甚至更优选的,佐剂以约750μg-约2.5mg/剂的量添加。最优选的,佐剂以约1mg/剂的量添加。
药物/疫苗组合物可以进一步包括一种或多种其他免疫调节剂,例如白细胞介素、干扰素或其他细胞因子。药物/疫苗组合物还可以包括庆大霉素和硫柳汞。尽管在本发明的背景下有用的佐剂和添加剂的量和浓度可以由技术人员容易地确定,但本发明考虑了包含约50μg-约2000μg佐剂的组合物且优选约250μg/1ml剂量的疫苗组合物。在另一个优选实施方案中,本发明考虑了包含约1ug/ml-约60μg/ml抗生素,且更优选小于约30μg/ml抗生素的疫苗组合物。
因此,根据另外的实施方案,本发明还涉及药物/疫苗组合物,其包含:
i.治疗有效量的如本文描述的流感病毒的H5蛋白质中的任何一种,其中所述H5蛋白质具有氨基酸223N和修饰328K+,其中所述H5蛋白质的氨基酸位置编号指如SEQ ID NO:2中示例性给出的氨基酸位置,并且其中所述修饰328K+意指在H5蛋白质的氨基酸位置328处插入第二个赖氨酸(K+);和
ii.如上所述的药学可接受的佐剂。
优选地,佐剂选自:
a),水包油乳状液(o/w);
b),具有双十八烷基二甲基溴化铵(dimethyldioctadecylammonum bromide)(DDA)的水包油(o/w);
c)Polygen,共聚物
d),具有有专利权的免疫刺激剂的水包油(o/w)
e)Carbigen是交联聚合物
f),由水包油(o/w)与交联聚合物组成的双重佐剂
g)ISA70是油包水(w/o)
最优选地,佐剂是水包油乳状液,例如选自下述的基于emulsigen的佐剂: 和。最优选地,和用于本发明的制剂中。
根据另外的方面,本文提供的药物/疫苗组合物包含一种或多种抗原。优选地,所述其它抗原是家禽或哺乳动物病原体的抗原。根据另外的实施方案,所述其它抗原是其它的流感抗原例如血凝素H5、H7、H9、或流感病毒的任何其他血凝素,其中H5优选是与进化枝1不同的进化枝的H5N1病毒,特别是北非起源的H5N1病毒的H5蛋白质,例如本文描述的H5蛋白质(2)。一种或多种另外抗原可以以纯化形式、作为抗原制剂的部分、以被杀死的微生物的形式或以经修饰的活微生物的形式添加。
如本文使用的,术语“抗原”意指但不限于肽、多肽、糖肽或多糖,其能够与免疫系统的抗原识别分子,例如免疫球蛋白(抗体)或T细胞抗原受体特异性相互作用,以便在所述抗原施用的宿主中引发、激活或刺激针对所述抗原的免疫应答。术语“抗原”还指核酸分子,优选DNA或RNA分子,其各自编码且表达肽、多肽或糖肽,所述肽、多肽或糖肽能够与免疫系统的抗原识别分子,例如免疫球蛋白(抗体)或T细胞抗原受体特异性相互作用,以便引发、激活或刺激针对由核酸分子编码的抗原的免疫应答。用于制备根据本发明使用的药物组合物的抗原是微生物或所述微生物的抗原性部分和/或制剂。在这一点上,如本文使用的,术语“免疫接种”意指但不限于免疫应答的任何原因或增强。术语“免疫应答”已在上文描述。
用于流感疫苗的施用策略是本领域众所周知的。考虑了用于灭活和减毒病毒疫苗的粘膜疫苗接种策略。虽然粘膜可以通过疫苗的局部递送靶向,但多种策略已用于将免疫原性蛋白质递送至粘膜。
在特定实施方案中,疫苗可以在具有霍乱毒素的混合物中,或作为具有霍乱毒素的缀合物或嵌合融合蛋白施用,所述霍乱毒素例如霍乱毒素B或霍乱毒素A/B嵌合体(Hajishengallis,J Immunol.,154:4322-32,1995;Jobling and Holmes,Infect Immun.,60:4915-24,1992)。基于霍乱毒素B亚基使用的粘膜疫苗已得到描述(Lebens and Holmgren,Dev Biol Stand82:215-27,1994)。在另一个实施方案中,可以制备具有不耐热肠毒素(LT)的混合物用于粘膜疫苗接种。
其他粘膜免疫接种策略包括将病毒封装在微胶囊中(US5,075,109、US5,820,883和US5,853,763)和使用免疫增强膜载体(WO98/0558)。经口施用的免疫原的免疫原性可以通过使用红血细胞(rbc)或rbc血影(US5,643,577)或者通过使用蓝舌抗原(US5,690,938)得到增强。
根据另一个方面,本发明涉及用于制备如上所述的药物/疫苗组合物的方法,优选用于产生疫苗的方法,所述疫苗包含如上所述的重组、杆状病毒表达的H5蛋白质。一般地,这种方法包括将构建体转染到病毒内的步骤,其中所述构建体包含i)如本文描述的重组H5cDNA,ii)用经转染的病毒感染生长培养基中的细胞,iii)促使病毒表达如本文描述的重组H5蛋白质,iv)从培养物中回收表达的H5蛋白质,和通过将表达的H5蛋白质与合适佐剂和/或其他药学可接受的载体掺和来制备组合物。
优选佐剂是上文描述的那些。因此,根据另外的方面,制备用于激活针对流感感染的免疫应答的抗原组合物例如疫苗的方法包括i)制备且回收H5蛋白质,和ii)将这与合适佐剂混合。
此外,本发明的疫苗组合物还可以包括稀释剂、等渗剂、稳定剂和/或防腐剂。稀释剂可以包括水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油等。等渗剂尤其可以包括无机或有机盐,例如氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨糖醇和乳糖、糖类、海藻糖、甘露醇、蔗糖。稳定剂尤其包括白蛋白和乙二胺四乙酸的碱金属盐。合适的佐剂是上文描述的那些。
本文描述的任何此类H5蛋白质(1)、核酸分子、载体、疫苗和组合的医学
用途
本文提供的H5蛋白质(1),编码任何此类H5蛋白质(1)的核酸分子,包含编码如本文描述的任何此类H5蛋白质(1)的任何此类核酸分子的载体,和包含本文描述的此类H5蛋白质(1)、核酸分子或载体或组合中的任何的任何药物组合物/疫苗组合物可以用作药物,优选用于治疗和预防由流感病毒,最优选由A型流感病毒引起的感染。本文提供的H5蛋白质(1),编码任何此类H5蛋白质的核酸分子,包含编码如本文描述的任何此类H5蛋白质(1)的任何此类核酸分子的载体,和包含如本文描述的此类H5蛋白质(1)、核酸分子或载体或本文描述的组合中的任何的任何药物组合物/疫苗组合物可以用于人类的治疗或预防以及用于兽医医学中。当在兽医医学中使用时,家禽优选鸟、鸡、鸭、火鸡等,以及哺乳动物优选猪、牛、马、海豹、骆驼、犬、猫、仓鼠、小鼠等的治疗是优选的。
根据本发明,“预防”指流感感染的临床体征的发病率或严重性的减少,直到包括此类临床体征的完全预防。优选地,与未接受本发明的组合物但暴露于感染水平的流感病毒的动物或动物组相比较,所述感染水平通常导致显示出临床体征的流感感染,发病率或严重性的减少是至少10%、更优选至少20%、再更优选至少30%、甚至更优选至少40%、更优选至少50%、再更优选至少60%、甚至更优选至少70%、更优选至少80%、再更优选至少90%、甚至更优选至少95%、且最优选100%。
因此,根据另一个方面,本发明涉及本文提供的H5蛋白质(1),编码任何此类H5蛋白质(1)的核酸分子,包含编码如本文描述的任何此类H5蛋白质(1)的任何此类核酸分子的载体,和包含如本文描述的此类H5蛋白质(1)、核酸分子或载体或本文描述的组合中的任何的任何药物组合物/疫苗组合物可以用作药物的用途,优选用作用于人类的药物和/或用作兽医药物,优选用于家禽特别是鸡。
此外,本文提供的H5蛋白质(1)、编码任何此类H5蛋白质(1)的核酸分子、包含编码如本文描述的任何此类H5蛋白质(1)的任何此类核酸分子的载体、或本文描述的组合可以用于制备如本文描述的药物组合物,优选单次疫苗或单剂量疫苗,用于预防或治疗由与进化枝1不同的进化枝的H5N1病毒引起的感染,其中所述与进化枝1不同的进化枝的H5N1病毒优选是如本文描述的不同进化枝的H5N1病毒。如上所述,这些药物组合物/疫苗组合物可以用于治疗和/或预防人类和/或用于治疗和/或预防动物,例如家禽优选鸟、鸡、鸭、火鸡等,以及哺乳动物优选猪、牛、马、海豹、骆驼、犬、猫、仓鼠、小鼠等。
根据另外的方面,本发明还涉及用于治疗或预防由与进化枝1不同的进化枝的H5N1病毒引起的流感病毒感染的方法,其中所述与进化枝1不同的进化枝的H5N1病毒优选是如本文描述的不同进化枝的H5N1病毒,其中所述方法包括给需要此类治疗的对象施用治疗有效量的如本文描述的H5蛋白质(1)或本文描述的组合。此外,本发明还涉及用于治疗或预防由与进化枝1不同的进化枝的H5N1病毒引起的流感病毒感染的方法,其中所述与进化枝1不同的进化枝的H5N1病毒优选是如本文描述的不同进化枝的H5N1病毒,其中所述方法包括给需要此类治疗的对象施用治疗有效量的如本文描述的任何H5核酸分子或载体,其编码如本文描述的任何H5蛋白质(1)。此外,本发明还涉及用于治疗或预防由与进化枝1不同的进化枝的H5N1病毒引起的流感病毒感染的方法,其中所述与进化枝1不同的进化枝的H5N1病毒优选是如本文描述的不同进化枝的H5N1病毒,其中所述方法包括给需要此类治疗的对象施用治疗有效量的疫苗,所述疫苗包含如本文描述的任何此类H5蛋白质(1)、核酸分子或载体。有此需要的对象可以是人类以及动物,优选家禽,甚至更优选鸟、鸡、鸭、火鸡或哺乳动物,优选猪、牛、马、海豹、骆驼、犬、猫、仓鼠、小鼠等。
优选地,如本文描述的施用是单次施用或单剂量施用。
优选地,当给鸡接种疫苗时,如本文描述的H5蛋白质可以用于在1日龄或之后的疫苗接种,例如在第10天时、或在第1到10天时、或在第10天或之后。
优选地,可以通过施用如本文描述的任何H5蛋白质(1)、编码任何此类H5蛋白质的核酸分子或载体、或任何药物组合物/疫苗组合物治疗的流感感染由与进化枝1不同的进化枝的H5N1病毒引起,其中所述与进化枝1不同的进化枝的H5N1病毒优选是如本文描述的不同进化枝的H5N1病毒,并且视情况而定,还与另一种禽、猪或人流感病毒或其任何组合或杂交物组合。
本发明的另外的优点是它有利于“DIVA”(受感染和已接种疫苗的动物的区分)概念,使用特定Elisa试剂盒用于区分已接种疫苗的人类或动物与由H5N1病毒感染的人类或动物。
根据另一个方面,本发明涉及试剂盒,其包含i)如本文描述的此类H5蛋白质(1)中的任何,编码任何此类H5蛋白质的核酸分子或载体,或包含如本文描述的任何此类H5蛋白质、核酸分子或载体的任何药物组合物/疫苗组合物,和ii)指示此类H5蛋白质、核酸分子、载体或疫苗用于治疗或预防由与进化枝1不同的进化枝的H5N1病毒引起的感染的用途的包装说明书,其中所述与进化枝1不同的进化枝的H5N1病毒优选是如本文描述的不同进化枝的H5N1病毒。当给鸡接种疫苗时,如本文描述的H5蛋白质(1)可以用于在1日龄或之后的疫苗接种。
因此,应当理解如本文提及的试剂盒分别用于治疗或预防由与进化枝1不同的进化枝的H5N1病毒引起的感染的用途,或用于治疗或预防由与进化枝1不同的进化枝的H5N1病毒引起的感染,其中所述与进化枝1不同的进化枝的H5N1病毒优选是如本文描述的不同进化枝的H5N1病毒。
根据另外的实施方案,试剂盒包含家禽或哺乳动物病原体的至少一种其它抗原,和指示该另外抗原特别是如上所述的其它抗原的医学、人或兽医学用途的信息。
本发明进一步提供了用于减少对象中的病毒脱落(viral shedding)的方法,其包括给对象施用本文描述的H5蛋白质(1)或如本文描述的组合,所述对象由与进化枝1不同的进化枝的H5N1病毒感染,或处于由与进化枝1不同的进化枝的H5N1病毒的病毒感染的危险中,其中所述与进化枝1不同的进化枝的H5N1病毒优选是如本文描述的不同进化枝的H5N1病毒。
本发明还涉及用于在减少对象中的病毒脱落的方法中使用的本文描述的H5蛋白质(1)或如本文描述的组合,其中将所述H5蛋白质(1)或所述组合施用于对象,所述对象由与进化枝1不同的进化枝的H5N1病毒感染,或处于由与进化枝1不同的进化枝的H5N1病毒的病毒感染的危险中,并且其中所述与进化枝1不同的进化枝的H5N1病毒优选是如本文描述的不同进化枝的H5N1病毒。
此外,本发明提供了本文描述的H5蛋白质(1)或如本文描述的组合用于制备用于减少对象中的病毒脱落的药物的用途,所述对象由与进化枝1不同的进化枝的H5N1病毒感染,或处于由与进化枝1不同的进化枝的H5N1病毒的病毒感染的危险中,其中所述与进化枝1不同的进化枝的H5N1病毒优选是如本文描述的不同进化枝的H5N1病毒。
优选地,根据本发明的H5蛋白质(1)、本文描述的组合、如本文描述的疫苗或本文提及的试剂盒用作单次疫苗或用于单剂量疫苗接种。
实施例
下述实施例阐述了依照本发明的优选材料和程序。然而,应当理解这些实施例仅提供作为举例说明,并且本文的任何内容都不应视为对本发明的总体范围的限制。
实施例1
编码且表达HA H5抗原的重组杆状病毒的构建
如下生成含有HA H5抗原的重组杆状病毒:化学合成H5HA(SEQ IDNO:3)的编码序列,并且亚克隆到转移载体pVL1392(BD BiosciencesPharmingen,San Diego,CA)内。通过使用寡核苷酸引物和定点诱变试剂盒(Stratagene,La Jolla,CA)生成H5HA MutK+(SEQ ID NO:5),并且亚克隆到转移载体pVL1392(BD Biosciences Pharmingen,San Diego,CA)内。随后将含有编码H5HA抗原(SEQ ID NO:3)和H5HA MutK+(SEQID NO:5)的基因的pVL1392质粒与(Sigma)杆状病毒DNA共转染到Sf9昆虫细胞(BD Biosciences Pharmingen)内,以生成含有编码SEQID NO:3的基因H5HA和编码SEQ ID NO:5的H5HA mutK+的重组杆状病毒。将含有编码H5HA(SEQ ID NO:3)和H5HA MutK+(SEQ ID NO:5)的基因的重组杆状病毒噬斑纯化,并且在SF+细胞系上繁殖原始种子病毒(MSV),等分且贮存于-70℃下。如上所述由H5HA杆状病毒感染昆虫细胞,以生成表达H5HA抗原(SEQ ID NO:3)和H5HA MutK+(SEQ ID NO:5)抗原的MSV或工作种子病毒,如通过在间接荧光抗体测定法或蛋白质印迹中的多克隆血清或单克隆抗体检测的。
在用合适量的重组杆状病毒(分别为H5HA和H5HA MutK+)接种后,随后使含有SF+细胞(Protein Sciences,Inc.,Meriden,CT)的旋转瓶在27±2℃下温育7天,并且在该时间过程中伴随100rpm搅拌。烧瓶使用通风盖,以允许空气流动。收获含有杆状病毒感染SF+细胞的粗制全细胞培养物和每个培养物的细胞培养上清液。
实施例2
包含HA H5抗原的药物组合物(疫苗)的制备
收获通过基于杆状病毒的表达系统在昆虫细胞中表达的粗制全细胞H5HA蛋白质和H5HA Mutk+蛋白质。在5mM环化二乙烯亚胺(BEI)(终浓度)的存在下,在约32-39℃下灭活杆状病毒72-96小时。在灭活完成后,将0.3M硫代硫酸钠溶液添加至5mM的终浓度,以中和任何残留BEI。在中和后,添加多种佐剂且生成下述疫苗/药物组合物。
疫苗
实施例3
鸡针对禽流感的疫苗接种
包含H5HA Mutk+(级分1)和灭活的新城疫病毒(级分2)的组合疫苗,即“BACULO AI+ND KV”,已在动物试验中进行评估。该疫苗用在基于MutK+构建体的杆状病毒表达系统中产生的血凝素H5配制(实施例1和2)。新城疫(ND)病毒级分的来源是全病毒。
级分1:
来自禽流感H5N1病毒的重组的、杆状病毒表达的H5血凝素(H5HA)。禽流感(AI)级分。
AI级分用二乙烯亚胺(BEI)灭活。不允许来自杆状病毒载体的残留感染性。
级分2:
全病毒粒子,新城疫病毒(ND),LaSota毒株。新城疫级分。
ND级分用甲醛、BEI或β-丙内酯(BPL)灭活。不允许来自ND病毒的残留感染性。
制剂组成:
将来自HA蛋白质和ND的灭活收集材料掺和到水/油乳状液内。混合物包括矿物油作为佐剂。
对于疫苗效力的评估,考虑三个临床参数:1)发病率/死亡率。2)抗体水平。3)病毒脱落。
在给SPF鸡接种疫苗的所有研究中,疫苗施用通过皮下途径,在颈背部。除非另有说明,否则施用0.5ml的剂量。
鸡在整个研究持续时间过程中维持在隔离单元内。研究遵循用于禽流感疫苗评估的OIE国际指导。
进行攻击以评估禽流感(AI)抗原级分。在疫苗接种后3周,通过鼻内(50μl)和经口(50μl)途径施用总共100μl含有106EID50攻击病毒的尿囊液来接种鸡。
为了评估不受HPAI H5N1的攻击的保护,进行两个研究:
1)保护型(Protectotypes)研究,使用单次或双重疫苗接种(评估加强效应),1日龄或10日龄鸡(评估年龄效应),和0.5或0.2ml的剂量(评估剂量效应)。
两个不同的攻击毒株用于这个研究:a)最近已在东南亚(中国,越南)家禽生产中引起疾病的亚进化枝2.3.2Vietnamese毒株(在2006年分离)。b)最近已在埃及家禽生产中引起疾病的亚进化枝2.2.1群B1Egyptian毒株(在2010年分离)。攻击毒株在遗传上不接近于疫苗杆状病毒构建体(MutK+)。结果在保护型的背景下解释为扩大对于具有相似或不同疫苗的两次免疫接种赋予的保护。
结论:
1)取决于年龄或剂量,观察到80-100%之间的保护。当在10日龄时作为二价制剂的0.5ml剂量施用时,观察到100%保护。
2)当在10日龄时作为BACULO AI+ND KV的单次0.5ml免疫接种施用时,观察到与施用两次灭活的常规产生的商业Volvac AIKV疫苗相同的保护。
3)当在10日龄时作为BACULO AI+ND KV的单次0.5ml免疫接种施用时,与施用两次灭活的常规产生的商业Volvac AI KV疫苗相比较,检测到相似水平的H5特异性抗体。
4)当在10日龄时作为BACULO AI+ND KV的单次0.5ml免疫接种施用时,直到攻击后3天时观察到低水平的病毒脱落。
2)BACULO效力研究,使用在10日龄时的单次、独特疫苗接种。
三个不同的攻击毒株用于这个研究:a)亚进化枝2.2.1Egyptian毒株(在2008年分离)。b)亚进化枝2.2.1群A1Egyptian毒株(在2010年分离)。c)亚进化枝2.2.1群B1Egyptian毒株(在2010年分离)。后面两个最近已在埃及家禽生产中引起疾病。
结论:
1)观察到90-100%之间的保护。
2)疫苗BACULO AI+ND KV显示遵循关于在鸟中针对HPAI病毒的疫苗的欧洲药物管理局(EMA)指导的表现。
3)这是证实用基于杆状病毒的疫苗的单次施用效力可获得的首次报道,所述基于杆状病毒的疫苗包括在遗传上远离用于攻击的病毒那些的血凝素。
实施例4
1.实验设计。
这个实验类似于上述实施例3进行设计和进行:
对于疫苗效力的评估,考虑三个临床参数:1)发病率/死亡率。2)抗体水平。3)病毒脱落。
在给SPF鸡接种疫苗的所有研究中,疫苗施用通过皮下途径,在颈背部。使用含有进化枝1H5蛋白质的疫苗原型(称为Mut K+),用第二个、ND(新城疫病毒)抗原级分配制为二价产品。
除非另有说明,否则施用0.5ml的剂量。动物在10日龄时进行疫苗接种。
鸡在整个研究持续时间过程中维持在隔离单元内。研究遵循用于禽流感疫苗评估的OIE国际指导。
进行攻击以评估禽流感(AI)抗原级分。在疫苗接种后3周,通过鼻内(50μl)和经口(50μl)途径施用总共100μl含有106EID50攻击病毒的尿囊液接种鸡。
这还在下表(表A)中概括(疫苗接种在10日龄时进行,第1列(根据应用的疫苗的实验组ID)、第2列(疫苗剂量)和第3列(攻击年龄))。
攻击病毒是A/Chicken/Egypt/1063/2010,其分类为亚进化枝2.2.1.1HPAIV H5N1亚型。这是在埃及用于评估疫苗批次的官方攻击毒株。攻击剂量是106EID50。
2.结果和数据分析。
结果和数据分析概括于下表(表A)中:第4列(疫苗接种后3周的HIGMT(几何平均滴度),攻击前),第5列(存活百分比,攻击后2周)和第6列(病毒脱落的检测,RT-PCR阳性样品)。
表A:实施例4的实验设计以及结果和数据分析的概括
3.结论
●接种疫苗的组经受住攻击。如使用同源抗原作为HI滴定测量的,疫苗原型触发有效的免疫应答。
●如作为减少病毒脱落的能力测量的,Mut K+疫苗原型提供良好的病毒保护。RT-PCR Ct值太低而无法代表感染性病毒,而是仅代表残留遗传材料。
在序列表中(SEQ ID NO:1-51):
SEQ ID NO:1对应于不含信号肽的A/Hong Kong/213/2003(H5N1)的H5,
SEQ ID NO:2-7对应于国际(PCT)申请号PCT/US2007/082699的SEQID NO:1-6,
SEQ ID NO:8对应于H5N1“1709-6“的H5序列,
SEQ ID NO:9对应于H5N1“1553-1/A1“的H5序列,
SEQ ID NO:10对应于H5N1“1553-15/A1“的H5序列,
SEQ ID NO:11对应于H5N1“2095-50/A1“的H5序列,
SEQ ID NO:12对应于H5N1“3982-2/A1“的H5序列,
SEQ ID NO:13对应于H5N1“3982-5/A1“的H5序列,
SEQ ID NO:14对应于H5N1“3982-7/A1“的H5序列,
SEQ ID NO:15对应于H5N1“3982-8/A1“的H5序列,
SEQ ID NO:16对应于H5N1“3982-9/A1“的H5序列,
SEQ ID NO:17对应于H5N1“3982-12/A1“的H5序列,
SEQ ID NO:18对应于H5N1“3982-20/A1“的H5序列,
SEQ ID NO:19对应于H5N1“3982-44/A1“的H5序列,
SEQ ID NO:20对应于H5N1“1553-2/B1“的H5序列,
SEQ ID NO:21对应于H5N1“1553-6/B1“的H5序列,
SEQ ID NO:22对应于H5N1“1553-13/B2“的H5序列,
SEQ ID NO:23对应于H5N1“1553-26/B2“的H5序列,
SEQ ID NO:24对应于H5N1“1553-28/B1”的H5序列,
SEQ ID NO:25对应于H5N1“2095-39/B2“的H5序列,
SEQ ID NO:26对应于H5N1“2095-46/B1“的H5序列,
SEQ ID NO:27对应于H5N1“2095-49/B1“的H5序列,
SEQ ID NO:28对应于H5N1“2095-65/B1“的H5序列,
SEQ ID NO:29对应于H5N1“2095-68/B2“的H5序列,
SEQ ID NO:30对应于H5N1“2095-70/B2“的H5序列,
SEQ ID NO:31对应于H5N1“2095-73/B2“的H5序列,
SEQ ID NO:32对应于H5N1“2095-75/B2“的H5序列,
SEQ ID NO:33对应于H5N1“3982-3/B1“的H5序列,
SEQ ID NO:34对应于H5N1“3982-4/B1“的H5序列,
SEQ ID NO:35对应于H5N1“3982-13/B1“的H5序列,
SEQ ID NO:36对应于H5N1“3982-14/B2“的H5序列,
SEQ ID NO:37对应于H5N1“3982-19/B3“的H5序列,
SEQ ID NO:38对应于H5N1“3982-21/B2“的H5序列,
SEQ ID NO:39对应于H5N1“3982-43/B1“的H5序列,
SEQ ID NO:40对应于H5N1“3982-50/B1“的H5序列,
SEQ ID NO:41对应于H5N1“3982-52/B1“的H5序列,
SEQ ID NO:42对应于H5N1“3982-55/A1“的H5序列,
SEQ ID NO:43对应于H5N1“3982-56/A1“的H5序列,
SEQ ID NO:44对应于H5N1“3982-78/B2“的H5序列,
SEQ ID NO:45对应于H5N1“4794-17/B“的H5序列,
SEQ ID NO:46对应于H5N1“4794-18/B“的H5序列,
SEQ ID NO:47对应于由SEQ ID NO:50翻译的H5序列,
SEQ ID NO:48编码H5N1“3982-8/A1“(SEQ ID NO:15)的H5序列,
SEQ ID NO:49编码H5N1“1553-2/B1”(SEQ ID NO:20)的H5序列,
SEQ ID NO:50对应于在分析编码SEQ ID NO:9–46的38个H5HA基因序列后获得的共有序列,
SEQ ID NO:51对应于新城疫病毒LaSota毒株的cDNA。
Claims (40)
1.一种用于在治疗或预防不同进化枝的H5N1病毒感染的方法中使用的进化枝1H5N1病毒的H5蛋白质(1),其中所述H5蛋白质(1)包含与SEQID NO:1的多肽序列具有至少98%序列相同性的多肽序列,或由与SEQ IDNO:1的多肽序列具有至少98%序列相同性的多肽序列组成。
2.根据权利要求1的H5蛋白质(1),其中所述H5蛋白质(1)包含与SEQID NO:1的多肽序列具有至少98.1%、优选至少98.2%、更优选至少98.3%、且最优选至少98.4%序列相同性的多肽序列,或由与SEQ ID NO:1的多肽序列具有至少98.1%、优选至少98.2%、更优选至少98.3%、且最优选至少98.4%序列相同性的多肽序列组成。
3.根据权利要求1或2的H5蛋白质(1),其中所述H5蛋白质(1)具有氨基酸223N和修饰328K+,其中所述H5蛋白质(1)的氨基酸位置编号指如SEQ ID NO:2中示例性给出的氨基酸位置,并且其中所述修饰328K+意指在H5蛋白质(1)的氨基酸位置328处插入第二个赖氨酸(K+)。
4.根据权利要求1-3中任一项的H5蛋白质(1),其中所述H5蛋白质(1)具有氨基酸94N。
5.根据权利要求1-4中任一项的H5蛋白质(1),其中所述H5蛋白质(1)具有氨基酸120N。
6.根据权利要求1-5中任一项的H5蛋白质(1),其中所述H5蛋白质(1)具有氨基酸155N。
7.根据权利要求1-6中任一项的H5蛋白质(1),其中所述H5蛋白质(1)具有一个或多个选自以下的氨基酸簇:
a.aa93-95:GNF
b.aa123-125:SDH
c.aa128-130:SSG
d.aa138-140:GSS
e.aa226-228:MDF
f.aa270-272:EVE
g.aa309-311:NKL。
8.根据权利要求1-7中任一项的H5蛋白质(1),其中所述H5蛋白质(1)包括包含下述的肽:
i.SEQ ID NO:5;SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的氨基酸序列,或
ii.任何肽,其与i)的多肽具有至少85%序列同源性,并且在标准血凝素抑制测定法中包含血凝素抑制;或
iii.i)或ii)的多肽的任何部分,其包含i)或ii)的此类肽中的任一的至少8个连续氨基酸,并且其中此类肽中的任一在标准血凝素抑制测定法中包含血凝素抑制;或
iv.i)、ii)或iii)的任何肽,其具有氨基酸36T、36K、83A、83T、83D、86A、86V、120S、155S、156A、156T、189R、189K、212K、212R、212E、263A或263T之一;或
v.i)、ii)、iii)或iv)的任何肽,其具有一个或多个选自以下的氨基酸簇:
a.aa93-95:GNF
b.aa123-125:SDH
c.aa128-130:SSG
d.aa138-140:GSS
e.aa226-228:MDF
f.aa270-272:EVE
g.aa309-311:NKL。
9.根据权利要求1-8中任一项的H5蛋白质(1),其中所述H5蛋白质(1)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
10.根据权利要求1-9中任一项的H5蛋白质(1),其中所述H5蛋白质(1)通过杆状病毒表达系统优选在培养的昆虫细胞中重组表达和/或产生。
11.根据权利要求1-10中任一项的H5蛋白质(1),其中所述不同进化枝的H5N1病毒选自进化枝0H5N1病毒、进化枝2H5N1病毒、进化枝3H5N1病毒、进化枝4H5N1病毒、进化枝5H5N1病毒、进化枝6H5N1病毒、进化枝7H5N1病毒、进化枝8H5N1病毒和进化枝9H5N1病毒。
12.根据权利要求1-11中任一项的H5蛋白质(1),其中所述不同进化枝的H5N1病毒是进化枝2.2H5N1病毒或进化枝2.3H5N1病毒。
13.根据权利要求1-12中任一项的H5蛋白质(1),其中所述不同进化枝的H5N1病毒是进化枝2.2.1H5N1病毒或进化枝2.3.2H5N1病毒。
14.根据权利要求1-13中任一项的H5蛋白质(1),其中所述不同进化枝的H5N1病毒是北非或越南起源的H5N1病毒。
15.根据权利要求14的H5蛋白质(1),其中所述北非起源的H5N1病毒是包含流感病毒的H5蛋白质(2)的H5N1病毒,
其中所述H5蛋白质(2)具有
(a)氨基酸113D、126H、145(-)、156R、160F、167T和181N,其中修饰145(-)意指H5的氨基酸位置145是缺失的,或
(b)氨基酸87P、145L、172T、201E、206I、208K、254T、341G和421K,或
(c)氨基酸145L、172T和254V,
并且其中所述H5蛋白质(2)的氨基酸位置编号指如SEQ ID NO:8中示例性给出的氨基酸位置;或
其中所述H5蛋白质(2)由这样的氨基酸序列组成或包含这样的氨基酸序列,所述氨基酸序列与如SEQ ID NO:9-46中所示的任何一个序列至少95%、优选至少96%、更优选至少97%、再更优选至少98%、再更优选至少99%、或特别优选100%同源。
16.根据权利要求1-15中任一项的H5蛋白质(1),其中包含H5蛋白质(2)的所述不同进化枝的H5N1病毒具有:
(a)氨基酸87L、113D、126H、145(-)、156R、160F、167T和181N,或
(b)氨基酸87P、113N、126R、145L、160Y、172T、181H、201E、206I、208K、254T、341G和421K,或
(c)氨基酸87L、113N、126R、145L、156G、160Y、172T、181H和254V,
和/或
其中所述H5蛋白质(b)包括包含下述的肽:
i.SEQ ID NO:9-46的氨基酸序列中的任何一个;
ii.任何肽,其与i)的多肽具有至少85%、优选至少95%、甚至更优选至少96%、甚至更优选至少97%、甚至更优选至少98%、甚至更优选至少99%、最优选100%序列同源性,并且在标准血凝素抑制测定法中包含血凝素抑制;或
iii.i)或ii)的多肽的任何部分,其包含i)或ii)的此类肽中的任一的至少34个连续氨基酸,并且其中此类肽中的任一在标准血凝素抑制测定法中包含血凝素抑制,
和/或
其中所述H5蛋白质(2)由连续氨基酸序列组成或包含连续氨基酸序列,所述连续氨基酸序列与SEQ ID NO:9-46中所示的任何一个序列具有至少95%、甚至更优选至少96%、甚至更优选至少97%、甚至更优选至少98%、甚至更优选至少99%、最优选100%序列相同性。
17.根据权利要求1-16中任一项的H5蛋白质(1),其中所述不同进化枝的H5N1病毒包括由这样的氨基酸序列组成的H5蛋白质(2)或包括包含这样的氨基酸序列的H5蛋白质(2),所述氨基酸序列与如SEQ ID NO:15或20中所示的任何一个序列至少95%、优选至少96%、更优选至少97%、再更优选至少98%、再更优选至少99%、或特别优选100%同源,并且其中包含SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列组成的此类H5蛋白质(2)是特别更优选的。
18.用于在治疗或预防下述的感染的方法中使用的根据权利要求1-17中任一项的H5蛋白质(1):
(A)北非起源的亚进化枝A H5N1病毒感染,即包含具有根据权利要求13或14的(a)的氨基酸的H5蛋白质(2)的H5N1病毒感染,或包含涉及SEQID NO:9-19、或42或43所示序列中的任何一个的根据权利要求16或17的H5蛋白质的H5N1病毒感染,
或
(B)北非起源的亚进化枝B H5N1病毒感染,即包含具有根据权利要求13或14的(b)或(c)的氨基酸的H5蛋白质的H5N1病毒感染,或包含涉及SEQ ID NO:20-41或44-46所示序列中任何一个的根据权利要求16或17的H5蛋白质的H5N1病毒感染。
19.一种用于在根据权利要求1-18中任一项的方法中使用的下述的组合:
权利要求1-10中任一项的H5蛋白质(1),和
灭活的新城疫病毒。
20.权利要求19的组合,其中所述灭活的新城疫病毒是灭活的完整新城疫病毒粒子。
21.权利要求19或20的组合,其中所述灭活的新城疫病毒是通过灭活新城疫病毒获得的灭活的新城疫病毒,所述新城疫病毒包含与SEQ IDNO:51中所示的多核苷酸的RNA拷贝具有至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、再更优选至少95%或特别是100%序列相同性的RNA多核苷酸,其已被灭活。
22.权利要求19-21中任一项的组合,其中所述新城疫病毒是新城疫LaSota毒株病毒。
23.权利要求19-22中任一项的组合,其中所述新城疫病毒用选自下述的试剂灭活:甲醛、BEI、β-丙内酯(BPL)及其组合。
24.一种用于在根据权利要求1-18中任一项的方法中使用的疫苗,其包含:
a.权利要求1-10中任一项的H5蛋白质(1)或权利要求19-23中任一项的组合,和
b.药学可接受的载体和/或赋形剂。
25.根据权利要求24的疫苗,其中所述赋形剂是一种或多种佐剂。
26.根据权利要求25的疫苗,其中所述佐剂是基于Emulsigen的佐剂。
27.根据权利要求24-26中任一项的疫苗,其中所述疫苗包含一种或多种其它抗原。
28.根据权利要求27的疫苗,其中所述一种或多种其它抗原是家禽病原体的抗原。
29.根据权利要求28的疫苗,其中所述一种或多种其它抗原是流感病毒的H5、H7或H9。
30.根据权利要求29的疫苗,其中所述流感病毒的H5是与进化枝1不同的进化枝的H5N1病毒的H5蛋白质。
31.权利要求1-10中任一项的H5蛋白质(1)或权利要求19-23中任一项的组合在制备用于预防或治疗由与进化枝1不同的进化枝的H5N1病毒引起的感染的药物组合物中的用途,所述药物组合物优选单次疫苗或单剂量疫苗,其中所述与进化枝1不同的进化枝的H5N1病毒优选是根据权利要求11-18中任一项的所述不同进化枝的H5N1病毒。
32.一种用于治疗或预防由与进化枝1不同的进化枝的H5N1病毒引起的流感病毒感染的方法,其中所述与进化枝1不同的进化枝的H5N1病毒优选是根据权利要求11-18中任一项的所述不同进化枝的H5N1病毒,其中所述方法包括给需要此类治疗的对象施用治疗有效量的权利要求1-10中任一项的H5蛋白质(1)或权利要求19-23中任一项的组合。
33.一种用于治疗或预防由与进化枝1不同的进化枝的H5N1病毒引起的流感病毒感染的方法,其中所述与进化枝1不同的进化枝的H5N1病毒优选是根据权利要求11-18中任一项的所述不同进化枝的H5N1病毒,其中所述方法由给需要此类治疗的对象施用治疗有效量的根据权利要求24-30中任一项的疫苗组成,或包括给需要此类治疗的对象施用治疗有效量的根据权利要求24-30中任一项的疫苗。
34.权利要求32或33的方法,其中所述施用是单次施用或单剂量施用。
35.一种试剂盒,其包含
a.根据权利要求1-10中任一项的H5蛋白质(1)、根据权利要求19-23中任一项的组合、或根据权利要求24-30中任一项的疫苗;和
b.指示a)的所述H5蛋白质(1)、组合或疫苗用于治疗或预防由与进化枝1不同的进化枝的H5N1病毒引起的感染的用途的包装说明书,其中所述与进化枝1不同的进化枝的H5N1病毒优选是根据权利要求11-18中任一项的所述不同进化枝的H5N1病毒。
36.根据权利要求35的试剂盒,其中所述试剂盒包含家禽或哺乳动物病原体的至少一种或多种其它抗原,其中所述其它抗原优选是根据权利要求27-29中任一项的其它抗原。
37.权利要求1-10中任一项的H5蛋白质(1)、权利要求19-23中任一项的组合、根据权利要求24-30中任一项的疫苗、或根据权利要求35或36的试剂盒,其用作单次疫苗或用于单剂量疫苗接种中。
38.一种减少流感感染的发病率或严重性的方法,其包括施用组合物的步骤,所述组合物选自权利要求1的蛋白质和权利要求19的组合。
39.用于在减少对象中的病毒脱落的方法中使用的权利要求1-10中任一项的H5蛋白质(1)或权利要求19-23中任一项的组合,其中将所述H5蛋白质(1)或所述组合施用于对象,所述对象被与进化枝1不同的进化枝的H5N1病毒感染,或处于与进化枝1不同的进化枝的H5N1病毒的病毒感染的危险中,并且其中所述与进化枝1不同的进化枝的H5N1病毒优选是根据权利要求11-18中任一项的所述不同进化枝的H5N1病毒。
40.权利要求1-10中任一项的H5蛋白质(1)或权利要求19-23中任一项的组合在制备用于减少对象中的病毒脱落的药物中的用途,所述对象被与进化枝1不同的进化枝的H5N1病毒感染,或处于与进化枝1不同的进化枝的H5N1病毒的病毒感染的危险中,其中所述与进化枝1不同的进化枝的H5N1病毒优选是根据权利要求11-18中任一项的所述不同进化枝的H5N1病毒。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201161523772P | 2011-08-15 | 2011-08-15 | |
US61/523,772 | 2011-08-15 | ||
PCT/EP2012/065940 WO2013024113A1 (en) | 2011-08-15 | 2012-08-15 | Influenza h5 vaccines |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104144699A true CN104144699A (zh) | 2014-11-12 |
Family
ID=46651534
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201280045059.1A Pending CN104144699A (zh) | 2011-08-15 | 2012-08-15 | 流感h5疫苗 |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20140199337A1 (zh) |
EP (1) | EP2744514B1 (zh) |
JP (1) | JP2014527526A (zh) |
KR (1) | KR101986071B1 (zh) |
CN (1) | CN104144699A (zh) |
AR (1) | AR088028A1 (zh) |
AU (1) | AU2012296834A1 (zh) |
BR (1) | BR112014003278A2 (zh) |
CA (1) | CA2845040A1 (zh) |
CO (1) | CO7020855A2 (zh) |
EA (1) | EA201400235A1 (zh) |
ES (1) | ES2765073T3 (zh) |
MX (1) | MX363464B (zh) |
WO (1) | WO2013024113A1 (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113260378A (zh) * | 2018-11-06 | 2021-08-13 | 勃林格殷格翰动物保健有限公司 | 针对禽流感病毒h5亚型的免疫原性组合物 |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8202967B2 (en) | 2006-10-27 | 2012-06-19 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | H5 proteins, nucleic acid molecules and vectors encoding for those, and their medicinal use |
AR088028A1 (es) | 2011-08-15 | 2014-05-07 | Boehringer Ingelheim Vetmed | Proteinas h5, de h5n1 para un uso medicinal |
EP2958586B1 (en) * | 2013-02-21 | 2018-09-05 | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | H5 proteins of h5n1 influenza virus for use as a medicament |
KR102173999B1 (ko) | 2014-07-17 | 2020-11-04 | 주식회사 만도 | 차량 통신 제어장치 및 방법 |
JP6941171B2 (ja) | 2016-11-03 | 2021-09-29 | ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ ゲーエムベーハーBoehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | ブタパルボウイルスおよびブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルスに対するワクチン、ならびにこれらを作製する方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008052173A2 (en) * | 2006-10-27 | 2008-05-02 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Novel h5 proteins, nucleic acid molecules and vectors encoding for those, and their medicinal use |
CN101553248A (zh) * | 2006-10-27 | 2009-10-07 | 贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司 | 新的h5蛋白、其编码核酸、载体及它们的医药用途 |
Family Cites Families (61)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US382425A (en) | 1888-05-08 | Brandt | ||
US2909462A (en) | 1955-12-08 | 1959-10-20 | Bristol Myers Co | Acrylic acid polymer laxative compositions |
US4769331A (en) | 1981-09-16 | 1988-09-06 | University Patents, Inc. | Recombinant methods and materials |
US4722848A (en) | 1982-12-08 | 1988-02-02 | Health Research, Incorporated | Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus |
US5364773A (en) | 1991-03-07 | 1994-11-15 | Virogenetics Corporation | Genetically engineered vaccine strain |
US4603112A (en) | 1981-12-24 | 1986-07-29 | Health Research, Incorporated | Modified vaccinia virus |
US4769330A (en) | 1981-12-24 | 1988-09-06 | Health Research, Incorporated | Modified vaccinia virus and methods for making and using the same |
US5338683A (en) | 1981-12-24 | 1994-08-16 | Health Research Incorporated | Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins |
US5174993A (en) | 1981-12-24 | 1992-12-29 | Health Research Inc. | Recombinant avipox virus and immunological use thereof |
US5833975A (en) | 1989-03-08 | 1998-11-10 | Virogenetics Corporation | Canarypox virus expressing cytokine and/or tumor-associated antigen DNA sequence |
US5505941A (en) | 1981-12-24 | 1996-04-09 | Health Research, Inc. | Recombinant avipox virus and method to induce an immune response |
US4745051A (en) | 1983-05-27 | 1988-05-17 | The Texas A&M University System | Method for producing a recombinant baculovirus expression vector |
US4552758A (en) | 1983-12-20 | 1985-11-12 | St. Jude Children's Research Hospital | Human use of avian-human reassortants as vaccines for influenza A virus |
US4945050A (en) | 1984-11-13 | 1990-07-31 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor |
IE872748L (en) | 1986-10-16 | 1988-04-16 | Arjomari Europ | Polypeptides derived from the evvelope gene of human¹immunodeficiency virus in recombinant baculovirus infected¹insect cells |
US5811128A (en) | 1986-10-24 | 1998-09-22 | Southern Research Institute | Method for oral or rectal delivery of microencapsulated vaccines and compositions therefor |
US5075109A (en) | 1986-10-24 | 1991-12-24 | Southern Research Institute | Method of potentiating an immune response |
GB8717430D0 (en) | 1987-07-23 | 1987-08-26 | Celltech Ltd | Recombinant dna product |
EP0386185A1 (fr) | 1988-07-29 | 1990-09-12 | IntraCel Corporation | Procede d'expression genetique de proteines heterologues par des cellules transfectees in vivo |
CA2003300A1 (en) | 1988-11-21 | 1990-05-21 | Franklin Volvovitz | Skin test and test kit for aids |
US5703055A (en) | 1989-03-21 | 1997-12-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery |
ES2200016T3 (es) | 1989-03-21 | 2004-03-01 | Vical Incorporated | Expresion de secuencias polinucleotidicas exogenas en un vertebrado. |
US5552143A (en) | 1989-03-24 | 1996-09-03 | The Wistar Institute Of Anatomy & Biology | Recombinant cytomegalovirus vaccine |
US5591439A (en) | 1989-03-24 | 1997-01-07 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | Recombinant cytomegalovirus vaccine |
US5690938A (en) | 1989-07-07 | 1997-11-25 | Oravax, Inc. | Oral immunization with multiple particulate antigen delivery system |
US5436146A (en) | 1989-09-07 | 1995-07-25 | The Trustees Of Princeton University | Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors |
GB9001766D0 (en) | 1990-01-25 | 1990-03-28 | Univ Court Of The University O | Vaccines |
US5643577A (en) | 1990-04-24 | 1997-07-01 | The University Of Newcastle Research Associates Limited | Oral vaccine comprising antigen surface-associated with red blood cells |
KR100242671B1 (ko) | 1991-03-07 | 2000-03-02 | 고돈 에릭 | 유전학적으로 처리한 백신 균주 |
US5997878A (en) | 1991-03-07 | 1999-12-07 | Connaught Laboratories | Recombinant poxvirus-cytomegalovirus, compositions and uses |
ATE181108T1 (de) | 1991-08-26 | 1999-06-15 | Immuno Ag | Direkt molekuläre klonierung eines modifizierten genoms eines chordopocken-virus |
US5643578A (en) | 1992-03-23 | 1997-07-01 | University Of Massachusetts Medical Center | Immunization by inoculation of DNA transcription unit |
US5807722A (en) | 1992-10-30 | 1998-09-15 | Bioengineering Resources, Inc. | Biological production of acetic acid from waste gases with Clostridium ljungdahlii |
US5846945A (en) | 1993-02-16 | 1998-12-08 | Onyx Pharmaceuticals, Inc. | Cytopathic viruses for therapy and prophylaxis of neoplasia |
EP0620277A1 (en) | 1993-03-18 | 1994-10-19 | Merck & Co. Inc. | Nucleic acid pharmaceuticals |
FR2711670B1 (fr) | 1993-10-22 | 1996-01-12 | Pasteur Institut | Vecteur nucléotidique, composition le contenant et vaccin pour l'immunisation à l'encontre d'une hépatite. |
EP1170368B1 (en) | 1994-01-27 | 2010-07-28 | University Of Massachusetts Medical Center | Immunization by inoculation of dna transcription unit |
EP0758397B1 (en) | 1994-04-29 | 2005-06-22 | Baxter Healthcare S.A. | Recombinant poxviruses with foreign polynucleotides in essential regions |
WO1996029421A1 (en) | 1995-03-23 | 1996-09-26 | Cantab Pharmaceuticals Research Limited | Vectors for gene delivery |
EP0979101B1 (en) | 1996-07-03 | 2010-10-27 | Merial, Inc. | Recombinant canine adenovirus 2 (cav2) containing exogenous dna |
US6183752B1 (en) | 1997-02-05 | 2001-02-06 | Pasteur Merieux Serums Et Vaccins | Restenosis/atherosclerosis diagnosis, prophylaxis and therapy |
US6204281B1 (en) | 1998-07-10 | 2001-03-20 | Novartis Ag | Method of treatment and pharmaceutical composition |
DE122011100039I1 (de) | 2000-04-28 | 2011-12-08 | St Jude Childrens Res Hospital | DNA-transfektionssystem zur erzeugung von infektiosen negativstrangigen RNA virus. |
WO2002003872A2 (en) | 2000-07-11 | 2002-01-17 | Johns Hopkins University | Application of photochemotherapy for the treatment of cardiac arrhythmias |
US20040071733A1 (en) | 2001-02-05 | 2004-04-15 | Hiroshi Takaku | Baculovirus vector vaccine |
US20040219208A1 (en) | 2001-08-03 | 2004-11-04 | Ryu Kawamura | Sustained-release medicines |
DE60326369D1 (de) * | 2002-08-27 | 2009-04-09 | Dow Agrosciences Llc | Verwendung von hitzelabilem escherichia-coli-toxin als adjuvans bei geflügel |
EP1633312A4 (en) | 2003-06-16 | 2012-09-26 | Medimmune Llc | INFLUENZA HEMAGGLUTININE AND NEURAMINIDASE VARIANTS |
US8080255B2 (en) | 2003-07-11 | 2011-12-20 | Novavax Inc. | Functional influenza virus like particles (VLPs) |
US20080254065A1 (en) | 2004-03-09 | 2008-10-16 | Chiron Corporation | Influenza Virus Vaccines |
CA2822895A1 (en) | 2004-05-25 | 2005-12-08 | Medimmune, Llc | Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants |
CN1748795A (zh) | 2004-09-17 | 2006-03-22 | 金宁一 | 多价禽流感重组活载体疫苗 |
CN101193655A (zh) | 2005-04-11 | 2008-06-04 | 美国政府健康及人类服务部,疾病控制和预防中心 | 抗大流行性流感病毒株的疫苗 |
US7871626B2 (en) | 2005-08-04 | 2011-01-18 | St. Jude Children's Research Hospital | Modified influenza virus for monitoring and improving vaccine efficiency |
PT1937301E (pt) | 2005-10-18 | 2015-09-14 | Novavax Inc | Partículas idênticas a vírus (vlps) da gripe funcionais |
US8883123B2 (en) * | 2005-10-28 | 2014-11-11 | Boehringer Ingleheim Vetmedica, Inc. | Use of vaccines for the treatment/prevention of the transmission of pathogens |
WO2008033105A1 (en) * | 2006-09-13 | 2008-03-20 | Dso National Laboratories | Hemagglutinin antibody and uses thereof |
US7981428B2 (en) | 2008-01-23 | 2011-07-19 | Academia Sinica | Flu vaccines and methods of use thereof |
JP5815676B2 (ja) | 2010-04-30 | 2015-11-17 | テマセック・ライフ・サイエンシズ・ラボラトリー・リミテッド | H5n1系列に対する汎用ワクチン |
AR088028A1 (es) | 2011-08-15 | 2014-05-07 | Boehringer Ingelheim Vetmed | Proteinas h5, de h5n1 para un uso medicinal |
EP2958586B1 (en) | 2013-02-21 | 2018-09-05 | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | H5 proteins of h5n1 influenza virus for use as a medicament |
-
2012
- 2012-08-14 AR ARP120102979A patent/AR088028A1/es unknown
- 2012-08-15 CN CN201280045059.1A patent/CN104144699A/zh active Pending
- 2012-08-15 CA CA2845040A patent/CA2845040A1/en not_active Abandoned
- 2012-08-15 US US14/238,796 patent/US20140199337A1/en not_active Abandoned
- 2012-08-15 EP EP12746361.0A patent/EP2744514B1/en active Active
- 2012-08-15 BR BR112014003278A patent/BR112014003278A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2012-08-15 AU AU2012296834A patent/AU2012296834A1/en not_active Abandoned
- 2012-08-15 JP JP2014525440A patent/JP2014527526A/ja active Pending
- 2012-08-15 MX MX2014001754A patent/MX363464B/es unknown
- 2012-08-15 KR KR1020147006803A patent/KR101986071B1/ko active IP Right Grant
- 2012-08-15 ES ES12746361T patent/ES2765073T3/es active Active
- 2012-08-15 EA EA201400235A patent/EA201400235A1/ru unknown
- 2012-08-15 WO PCT/EP2012/065940 patent/WO2013024113A1/en active Application Filing
-
2014
- 2014-02-27 CO CO14042269A patent/CO7020855A2/es unknown
-
2017
- 2017-07-28 US US15/662,358 patent/US10369211B2/en active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008052173A2 (en) * | 2006-10-27 | 2008-05-02 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Novel h5 proteins, nucleic acid molecules and vectors encoding for those, and their medicinal use |
CN101553248A (zh) * | 2006-10-27 | 2009-10-07 | 贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司 | 新的h5蛋白、其编码核酸、载体及它们的医药用途 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
ANNETT HESSEL ET AL: "Vectors Based on Modified Vaccinia Ankara Expressing Influenza H5N1 Hemagglutinin Induce Substantial Cross-Clade Protective Immunity", 《PLOS ONE》, vol. 6, no. 1, 24 January 2011 (2011-01-24), pages 16247, XP 055013626, DOI: doi:10.1371/journal.pone.0016247 * |
KYOKO SHINYA ET AL: ""Characterization of a Human H5N1 Influenza A Virus Isolated in 2003"", 《JOURNAL OF VIROLOGY》, vol. 79, no. 15, 31 August 2005 (2005-08-31), pages 9926 - 9932 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113260378A (zh) * | 2018-11-06 | 2021-08-13 | 勃林格殷格翰动物保健有限公司 | 针对禽流感病毒h5亚型的免疫原性组合物 |
CN113260378B (zh) * | 2018-11-06 | 2024-06-07 | 勃林格殷格翰动物保健有限公司 | 针对禽流感病毒h5亚型的免疫原性组合物 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR101986071B1 (ko) | 2019-06-07 |
EP2744514B1 (en) | 2019-10-16 |
JP2014527526A (ja) | 2014-10-16 |
EP2744514A1 (en) | 2014-06-25 |
US20140199337A1 (en) | 2014-07-17 |
AU2012296834A1 (en) | 2014-01-23 |
ES2765073T3 (es) | 2020-06-05 |
BR112014003278A2 (pt) | 2017-03-01 |
US10369211B2 (en) | 2019-08-06 |
CA2845040A1 (en) | 2013-02-21 |
CO7020855A2 (es) | 2014-08-11 |
KR20140090137A (ko) | 2014-07-16 |
AR088028A1 (es) | 2014-05-07 |
US20170348413A1 (en) | 2017-12-07 |
MX2014001754A (es) | 2014-08-26 |
WO2013024113A1 (en) | 2013-02-21 |
EA201400235A1 (ru) | 2014-09-30 |
MX363464B (es) | 2019-03-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2007308869B2 (en) | Novel H5 proteins, nucleic acid molecules and vectors encoding for those, and their medicinal use | |
US10369211B2 (en) | Influenza H5 vaccines | |
EP2630155B1 (en) | Novel hemagglutinin 5 (h5) proteins for the treatment and prevention of influenza infections | |
CN101300023A (zh) | 用于治疗/预防流感病原体在物种间传播的疫苗的用途 | |
US20160361409A1 (en) | H5 proteins of h5n1 influenza virus for use as a medicament | |
CN101553248B (zh) | 新的h5蛋白、其编码核酸、载体及它们的医药用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20141112 |