BRPI0614702A2

BRPI0614702A2 - partìculas semelhantes à vìrus como vacinas para paramixovìrus

Info

Publication number: BRPI0614702A2
Application number: BRPI0614702-0A
Authority: BR
Inventors: Trudy G Morrison; Homer D Pantua
Original assignee: Univ Massachusetts Medical
Priority date: 2005-08-05
Filing date: 2006-08-03
Publication date: 2011-04-12
Also published as: CA2617508C; US7951384B2; US9399059B2; JP2009502204A; US20070178120A1; HK1125051A1; CA2617508A1; EP1917033A4; JP2013176375A; WO2007019247A2; NZ565961A; CN101282744A; KR101120784B1; RU2008106445A; EP1917033B1; KR20080072627A; IL189313A0; ATE528016T1; JP5342234B2; IL189313A

Abstract

PARTìCULAS SEMELHANTES à VìRUS COMO VACINAS PARA PARAMIXOVìRUS. A presente invenção diz respeito ao método de preparar e usar uma vacina inédita, não infecciosa de paramixovírus. Proteínas estruturais de paramixovirus em uma partícula semelhante à vírus (VLP) compreendem um exemplo de uma vacina como esta. Observou-se que a presença de proteína matriz sozinha é suficiente e necessária para fornecer uma liberação de VLP efetiva. A co-expressão de quatro proteínas estruturais de paramíxovirus, entretanto, resulta na liberação de VLPs não infectivos com densidades e eficiências de liberação similares ao de partículas infectivas. Doenças representativas em que uma vacina de VLP pode ser usada incluem, mas sem limitações, doença de Newcastle, sarampo, infecção viral sincicíal respíratória e infecção por vírus para-influenza 3.

Description

"PARTÍCULAS SEMELHANTES À VÍRUS COMO VACINAS PARAPARAMIXOVÍRUS"

DECLARAÇÃO DO APOIO GOVERNAMENTAL

Este trabalho foi apoiado por uma doação do Natio-nal Institutes of Health AI 3 30572,

CAMPO TÉCNICO

A presente invenção diz respeito ao campo das va-cinas virais. Em uma modalidade, a presente invenção contem-pla uma vacina paramixoviral efetiva contra doenças tais co-mo, mas sem limitações, doença de Newcastle, sarampo, virusparainfluenza 3 e virus sincicial respiratório. Em uma moda-lidade, a presente invenção contempla uma vacina que compre-ende partículas semelhantes ao vírus (VLP) da doença de New-castle (NDV). Em uma modalidade, a presente invenção contem-pia um método que compreende transfectar células de aves comDNAcs que codificam as principais proteínas estruturais NDV.

Em uma outra modalidade, é descrito um método em que partí-culas que se parecem com vírions infecciosos são liberadascom quase 100% de eficiência. Em uma modalidade, as partícu-Ias não são infecciosas e provêem uma vacina contra NDV se-gura e efetiva.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Durante a última década, surgiram inúmeras preocu-pações relacionadas a questões de segurança considerando va-cinas contra o paramixovírus que tiveram um efeito contráriona confiança do público. Estas preocupações afetaram não so-mente pais cujas crianças são o receptor primário das vaci-nas contra a doença na infância, mas também fazendeiros de-dicados à criação de animais suscetíveis a vários tipos deparamixovirus.

Historicamente, a doença de Newcastle foi uma do-ença de aves devastadora e, em muitos países, a doença per-manece um dos maiores problemas que afetam as indústrias a-vicultoras existentes ou em desenvolvimento. Mesmo em paísesem que a doença de Newcastle pode ser considerada controla-da, um encargo econômico ainda está associado com a vacina-ção e/ou manutenção de rigorosas medidas de biossegurança. Anatureza variável das linhagens do vírus da doença de New-castle em termos de virulência para aves e as diferentessuscetibilidades das diferentes espécies de pássaros signi-fica que, com propósitos de controle e de negócios, a doençade Newcastle exige uma cuidadosa definição. Diagnóstico con-firmatório da doença de Newcastle exige o isolamento e ca-racterização do vírus envolvido. Atualmente, o controle dadoença de Newcastle é limitado à prevenção da introdução eda disseminação, a boas práticas de biossegurança e/ou vaci-nação com vírus vivos atenuados. Os vírus da doença de New-castle podem infectar humanos, usualmente, ocasionando con-juntivite temporária, mas a disseminação humano a humanonunca foi relatada. Alexander D. J., "Newcastle disease andother avian paramyxoviruses" Rev Sci Tech. 19(2):443-62(2000).

Historicamente, a vacina com vírus vivo atenuadode sarampo (MV) e a vacina em combinação multivalente contrasarampo, caxumba e rubéola (MMR) tiveram um impacto positivona saúde de crianças por todo o mundo impedindo doença in-fecciosa. Entretanto, a indução de uma imuno-resposta anti-viral efetiva usando estas vacinas com vírus vivos atenuadosé conhecida por resultar em uma taxa significativa de even-tos adversos (isto é, por exemplo, autismo). Kennedy et al.,"Measles virus infection and vaccination: potential role inchronic illness and associated adverse events" Crit Rev Im-munol. 24(2): 129-56 (2004).

Crianças saudáveis e em risco são suscetíveis àmorbidez e à mortalidade associadas com as doenças respira-tórias induzidas por vírus, incluindo vírus sincicial respi-ratório (RSV) e influenza. Atualmente, a Organização Mundialda Saúde está tentando desenvolver e distribuir vacinas efe-tivas para prevenir / reduzir doenças respiratórias viraischaves. Entretanto, o progresso é lento e a razão ris-co/benefício é alta. Um programa de vacinação para infecçõesrespiratórias virais deve incluir a prevenção de infecçõesdo trato respiratório inferior e prevenção de morbidez asso-ciada à infecção, hospitalização e mortalidade. Atualmente,há duas vacinas contra a influenza; i) uma vacina trivalenteinativada, e ii) uma vacina viva, adaptada a frio e atenua-da. Entretanto, a conformidade é relativamente baixa (istoé, 10 - 30%). Em virtude de acreditar-se que a baixa confor-midade esteja relacionada com o conhecido alto risco de va-cinas contaminadas, versados na técnica recomendam que apesquisa deve continuar em relação a vacinas seguras e efe-tivas para todas as enfermidades virais da infância. Green-berg et al., "Immunization against viral respiratory dis-ease: A review" Pediatr Infect Dis J. 23(11 Suppl) :S254-61(2004).

O que é necessário na tecnologia é uma vacina con-tra paramixovirus de baixo risco, altamente efetiva que sejacompatível com os objetos de comercialização e distribuiçãomundial de baixo custo e com altas taxas de produção.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito ao campo de vaci-nas virais. Em uma modalidade, a presente invenção contemplauma vacina paramixoviral efetiva contra doenças tais como,mas sem limitações, doença de Newcastle, sarampo, vírus pa-rainfluenza 3 e vírus sincicial respiratório. Em uma modali-dade, a presente invenção contempla uma vacina que compreen-de partículas semelhantes ao vírus (VLP) contra a doença deNewcastle. Em uma modalidade, a presente invenção contemplaum método que compreende transfectar células de aves comDNAcs que codificam as principais proteínas estruturais NDV.

Em uma outra modalidade, é descrito um método em que as par-tículas que se parecem com vírions infecciosos são liberadascom quase 100% de eficiência. Em uma modalidade, as partícu-las são não infecciosas e provêem uma vacina segura e efeti-va contra NDV.

Em uma modalidade, a presente invenção contemplaum método que compreende: a) prover i) um vetor de expressãoque compreende seqüências de DNA que codificam uma proteínamatriz da doença de Newcastle; ii) uma célula capaz de sertransfectada pelo dito vetor; b) transfectar a dita célulacom o dito vetor sob condições de maneira tal que par-tículas semelhantes ao vírus contra a doença de Newcastlesejam geradas. Em uma modalidade, o método compreende adi-cionalmente a etapa de c) coletar as ditas partículas seme-lhantes ao vírus para criar um preparação de partículas semcélulas. Em uma modalidade, o método compreende adicional-mente a etapa de d) administrar uma vacina que compreende adita preparação de partículas em uma galinha. Em uma modali-dade, a célula é parte de uma cultura celular e a dita cole-ta compreende obter as ditas partículas dò sobrenadante dadita cultura. Em uma modalidade, a cultura celular compreen-de células de aves subconfluentes. Em uma modalidade, o ve-tor compreende adicionalmente seqüências de DNA que codifi-cam proteínas virais adicionais da doença de Newcastle sele-cionadas do grupo que consiste em uma proteína nucleocapsí-dica, uma proteína de fusão e uma proteína hemaglutinina-neuraminidase. Em uma modalidade, as partículas não têm oDNA viral da doença de Newcastle.

Em uma modalidade, a presente invenção contemplauma célula transfectada que compreende um vetor de expressãoque compreende seqüências de DNA que codificam uma proteínamatriz da doença de Newcastle capaz de gerar partículas se-melhantes ao vírus contra a doença de Newcastle.

Em uma modalidade, a presente invenção contemplauma preparação de partículas semelhantes ao vírus sem célu-Ias coletada de uma célula transfectada que compreende umvetor de expressão que compreende seqüências de DNA que co-dificam. uma proteína matriz da doença de Newcastle capazde gerar partículas semelhantes ao vírus contra a doença deNewcastle.

Em uma modalidade, a presente invenção contemplaum método que compreende a) prover i) uma vacina que compre-ende partículas semelhantes ao vírus contra a doença de New-castle, as ditas partículas compreendendo uma proteína ma-triz viral da doença de Newcastle; ii) um hospedeiro susce-tível à doença de Newcastle; b) imunizar o dito hospedeirocom a dita vacina sob condições de maneira tal que anticor-pos direcionados à dita partícula semelhante ao vírus sejamproduzidos. Em uma modalidade, o hospedeiro é selecionado dogrupo que consiste em ave, murino e humano. Em uma modalida-de, as partículas compreendem adicionalmente uma ou maisproteínas virais adicionais da doença de Newcastle selecio-nadas do grupo que consiste em uma proteína de fusão, umaproteína nucleocapsídica e uma proteína hemaglutinina-neuraminidase.

Em uma modalidade, a presente invenção contemplauma vacina que compreende partículas semelhantes ao víruscontra a doença de Newcastle, as ditas partículas compreen-dendo uma proteína matriz viral da doença de Newcastle. Emuma modalidade, as partículas não têm DNA viral da doença deNewcastle. Em uma modalidade, as partículas compreendem adi-cionalmente uma ou mais proteínas virais adicionais selecio-nadas do grupo que consiste de uma proteína de fusão, umaproteína nucleocapsídica e uma proteína hemaglutinina-neuraminidase.Em uma modalidade, a presente invenção contemplauma vacina que compreende uma partícula semelhante ao vírusda doença de Newcastle e uma proteína matriz da doença deNewcastle. Em uma modalidade, a vacina compreende adicional-mente pelo menos duas glicoproteínas virais. Em uma modali-dade, as glicoproteínas são selecionadas do grupo que con-siste em uma proteína de fusão e uma proteína hemaglutinina-neuraminidase. Em uma modalidade, a vacina compreende adi-cionalmente uma proteína nucleocapsídica. Em uma modalidade,a proteína matriz compreende um Domínio Tardio. Em uma moda-lidade, o Domínio Tardio compreende uma seqüência FPIV (SEQID NO:l). Em uma modalidade, o Domínio Tardio compreende umaseqüência PXXP (SEQ DD NO:2). Em uma modalidade, o DomínioTardio compreende uma seqüência YXXL (SEQ ID N0:3). Em umamodalidade, a vacina é não-infecciosa.

Uma modalidade da presente invenção contempla umavacina de aves que compreende uma partícula semelhante aovírus da doença de Newcastle e uma proteína matriz da doençade Newcastle. Em uma modalidade, a vacina compreende adicio-nalmente pelo menos duas glicoproteínas virais. Em uma moda-lidade, as ditas glicoproteínas são selecionadas do grupoque compreende uma proteína de fusão e uma proteína hemaglu-tinina-neuraminidase. Em uma modalidade, a vacina compreendeadicionalmente uma proteína nucleocapsídica. Em uma modali-dade, a dita partícula semelhante ao vírus compreende umpartícula semelhante ao vírus Paramixovirus. Em uma modali-dade, a dita partícula semelhante ao vírus Paramixovíruscompreende uma partícula semelhante ao vírus da doença deNewcastle. Em uma modalidade, a dita proteína matriz compre-ende um Domínio Tardio. Em uma modalidade, o dito DomínioTardio compreende uma seqüência FPIV (SEQ ID N0:1). Em umamodalidade, o dito Domínio Tardio compreende uma seqüênciaPXXP (SEQ ID N0:2). Em uma modalidade, o dito Domínio Tardiocompreende uma seqüência YXXL (SEQ ID NO:3). Em uma modali-dade, a dita partícula semelhante ao vírus é não infecciosa.

Em uma modalidade, a presente invenção contemplaum método que compreende a) prover i) um vetor de expressãoque componente seqüências de DNAc que codificam uma proteínamatriz viral da doença de Newcastle e pelo menos duas glico-proteínas virais; ii) uma célula capaz de ser transfectadapelo dito vetor; b) transfectar a dita célula pelo dito ve-tor sob condições que geram uma partícula semelhante ao ví-rus da doença de Newcastle em que a dita partícula compreen-de a dita proteína matriz. Em uma modalidade, a célula com-preende células de aves subconfluentes. Em uma modalidade, ovetor de expressão compreende pCAGGS. Em uma modalidade, asglicoproteínas são selecionadas do grupo que consiste em umaproteína de fusão e em uma proteína hemaglutinina-neuraminidase. Em uma modalidade, o vetor de expressão com-preende adicionalmente uma seqüência de DNAc que codificauma proteína nucleocapsídica. Em uma modalidade, o métodocompreende adicionalmente liberar a dita partícula semelhan-te ao vírus em uma eficiência de pelo menos 85%. Em uma mo-dalidade, a partícula semelhante ao vírus compreende adicio-nalmente as ditas pelo menos duas glicoproteínas virais.Uma modalidade da presente invenção contempla ummétodo que compreende: a) prover i) um vetor de expressãoque compreende seqüências de DNAc que codificam uma proteínamatriz viral da doença de Newcastle e pelo menos duas glico-proteínas virais; ii) uma célula capaz de ser transfectadapelo dito vetor; e b) transfectar a dita célula pelo ditovetor sob condições que geram uma vacina de aves que compre-ende uma partícula semelhante ao vírus. Em uma modalidade, adita célula compreende células de aves subconfluentes. Emuma modalidade, a dita célula compreende células humanas. Emuma modalidade, o dito vetor de expressão compreende pCAGGS.

Em uma modalidade, as ditas glicoproteínas são selecionadasdo grupo que compreende uma proteína de fusão e uma proteínahemaglutinina-neuraminidase. Em uma modalidade, o vetor com-preende adicionalmente um seqüência de DNAc que codifica umaproteína nucleocapsídica. Em uma modalidade, o método com-preende adicionalmente liberar a dita partícula semelhanteao vírus em uma eficiência de pelo menos 85%. Em uma modali-dade, a dita partícula semelhante ao vírus compreende a ditaproteína matriz e as ditas pelo menos duas glicoproteínasvirais.

Em uma modalidade, a presente invenção contemplaum método que compreende: a) prover i) uma vacina que com-preende uma partícula semelhante ao vírus da doença de New-castle e uma proteína matriz viral da doença de Newcastle epelo menos duas glicoproteínas virais; ii) um hospedeiro ca-paz de imunização pela dita partícula semelhante ao vírus;b) imunizar o dito hospedeiro pela dita partícula semelhanteao vírus sob condições de maneira tal que anticorpos dire-cionados à dita partícula semelhante ao vírus sejam produzi-dos. Em uma modalidade, o hospedeiro é selecionado do grupoque consiste em ave, murino e humano. Em uma modalidade, asglicoproteínas são selecionadas do grupo que consiste em umaproteína de fusão e uma proteína hemaglutinina-neuraminidase. Em uma modalidade, a vacina compreende adi-cionalmente uma proteína nucleocapsídica.

Uma modalidade da presente invenção contempla ummétodo que compreende: a) prover i) uma vacina de aves quecompreende uma partícula semelhante ao vírus do vírus da do-ença de Newcastle, uma proteína matriz viral da doença deNewcastle e pelo menos duas glicoproteínas virais; ii) umhospedeiro capaz de imunização pela dita partícula semelhan-te ao vírus; b) imunizar o dito hospedeiro pela dita vacinasob condições de maneira tal que anticorpos direcionados àdita partícula semelhante ao vírus sejam produzidos. Em umamodalidade, o dito hospedeiro é selecionado do grupo quecompreende ave, murino e humano. Em uma modalidade, a ditapartícula semelhante ao vírus compreende uma partícula seme-lhante ao vírus da doença de Newcastle. Em uma modalidade,as ditas glicoproteínas são selecionadas do grupo que com-preende uma proteína de fusão e uma proteína hemaglutinina-neuraminidase. Em uma modalidade, a vacina compreende adi-cionalmente uma proteína nucleocapsídica.

Em uma modalidade, a presente invenção contemplaum sistema de expressão de vacina por VLP que compreende umprimeiro DNAc que codifica um primeiro gene de proteína vi-ral de uma primeira linhagem do vírus da doença de Newcas-tle, um segundo DNAc que codifica um segundo gene de proteí-na viral de uma segunda linhagem do vírus da doença de New-castle e um terceiro DNAc que codifica um terceiro gene deproteína viral de uma terceira linhagem. Em uma modalidade,o primeiro gene de proteína viral é selecionado do grupo quecompreende proteína HN, proteína F, proteína NP ou proteínaM. Em uma modalidade, a primeira linhagem é selecionada dogrupo que compreende linhagem Hertz, linhagem AV ou linhagemBI. Em uma modalidade, o segundo gene de proteína viral éselecionado do grupo que compreende proteína HN, proteína F,proteína NP ou proteína M. Em uma modalidade, a segunda li-nhagem é selecionada do grupo que compreende linhagem Hertz,linhagem AV ou linhagem BI. Em uma modalidade, o terceirogene de proteína viral é selecionado do grupo que componenteproteína HN, proteína F, proteína NP ou proteína M. Em umamodalidade, a terceira linhagem é selecionada do grupo quecompreende linhagem Hertz, linhagem AV ou linhagem BI. Emuma modalidade, a presente invenção contempla um método paradetectar um gene de proteína viral incorporado em uma vacinapor VLP que compreende colocar o gene de proteína viral emcontato com anticorpos de linhagem específica ou etiquetasde seqüência incorporadas.

DEFINIÇÕES

Os termos usados na presente invenção são usados,no geral, de acordo com aquelas definições aceitas pelosversados na técnica com as seguintes exceções:O termo "partícula semelhante ao vírus", da formaaqui usada, diz respeito a uma subunidade viral não infec-ciosa tanto com quanto sem proteínas virais. Por exemplo,uma partícula semelhante ao vírus pode carecer completamentedo genoma de DNA ou RNA. Adicionalmente, uma partícula seme-lhante ao vírus que compreende proteínas capsídicas viraispode passar por auto-montagem espontânea. Preparações departículas semelhantes ao vírus são contempladas em uma mo-dalidade em que a preparação é purificada sem vírions infec-ciosos (ou pelo menos substancialmente sem, de maneira talque a preparação tenha número insuficiente para ser infecciosa).

Os termos "proteína matriz",, "proteína de membra-na" ou "proteína M", da forma aqui usada, significam qual-quer proteína localizada entre o envelope e o núcleo do nu-cleocapsídeo e que facilita a organização e manutenção daestrutura do vírion e dos processos de gemulação.

Os termos "proteína de fusão" ou "proteína F", daforma aqui usada, significam qualquer proteína que projeta-se da superfície do envelope e medeia a entrada da célulahospedeira induzindo a fusão entre o envelope viral e a mem-brana celular. Entretanto, não pretende-se que a presenteinvenção seja limitada às proteínas F funcionais. Por exem-plo, uma proteína F pode ser codificada por um gene F mutan-te, tal como, mas sem limitações, F-K115Q. Acredita-se queF-K115Q elimina a clivagem normal e a subseqüente ativaçãoda proteína de fusão. F-K115Q imita naturalmente as mutaçõesde proteína F que ocorrem em linhagens de NDV avirulentas eem cultura celular e elimina todos efeitos colaterais poten-ciais da fusão célula-célula na liberação das VLPs.

Os termos "proteína nucleocapsídica" ou "proteínaNP", da forma aqui usada, significam toda proteína que asso-cia com RNA genômico (isto é, por exemplo, uma molécula porhexâmero) e protege o RNA da digestão nuclease.

Os termos "proteína haemaglutinina-neuraminidase","proteína HN", ou proteína G, da forma aqui usada, signifi-cam toda proteína que abrange o envelope viral e projeta-seda superfície como pontas para facilitar a anexação e a en-trada da célula (isto é, por exemplo, ligando ao ácido siá-Iico em uma superfície celular). Estas proteínas possuemtanto atividade de hemaglutinação quanto atividade de hema-glutinação.

0 termo "glicoproteína", da forma aqui usada, dizrespeito a toda proteína conjugada com um grupo não-proteínaque compreende um carboidrato.

0 termo "paramixovírus", da forma aqui usada, dizrespeito a todo vírus da família Paramyxoviridae da ordemMononegavirales que são vírus de RNA de sentido negativo efita única responsáveis por inúmeras doenças humanas e ani-mais (isto é, por exemplo, doença de Newcastle). Paramixovi-rus incluem, mas sem limitações, por exemplo, vírus Sendai,vírus da doença de Newcastle, vírus da Caxumba, vírus do Sa-rampo, Vírus sincicial respiratório (RS), vírus da peste bo-vina, vírus de cinomose, vírus parainfluenza de símios(SV5), vírus parainfluenza humana tipos I, II e III, etc.vírus Sendai podem ser linhagens tipo selvagem, linhagensmutantes, linhagens com passagem em laboratório, linhagensconstruídas artificialmente ou assim por diante. Vírus in-completos, tal como a partícula DI (J. Virol., 1994, 68,8413-8417), oligonucleotídeos sintetizados e assim por dian-te, também podem ser utilizados como material para produzira vacina da presente invenção.

O termo "Domínio Tardio", da forma aqui usada, dizrespeito a toda região em uma proteína viral que está envol-vida na gemulação de partículas virais da membrana plasmáti-ca de uma célula. Domínios tardios compreendem motivos alta-mente conservados conhecidos por mediar interações proteína-proteína entre proteínas celulares. Por exemplo, pelo menostrês classes de motivos compreendem PTAP (SEQ ID N0:4), PPXY(SEQ ID NO: 5) ou YXXL (SEQ ID NO: 3) (isto é, por exemplo,uma seqüência YANL).

0 termo "vetor", da forma aqui usada, diz respeitoa toda seqüência de nucleotídeos que compreende genes opera-tivos exógenos capazes de expressão em uma célula. Por exem-plo, um vetor pode compreender um ácido nucléico que codifi-ca uma proteína matriz viral e pelo menos duas glicoproteí-nas que são expressas em um sistema de cultura celular huma-no, de ave ou de inseto. Por exemplo, um vetor de baculoví-rus pode ser usado para transfectar várias Espécies de Lepi-doptera.

Os termos "transfecção" ou "transfectar", da formaaqui usada, dizem respeito a todo mecanismo pelo qual um ve-tor pode ser incorporado em uma célula hospedeira. Umatransfecção com sucesso resulta na capacidade da célula hos-pedeira expressar todos os genes operativos portados pelovetor. Transfecções podem ser estáveis ou temporárias. Umexemplo de uma transfecção temporária compreende expressãode vetor em uma célula, em que o vetor não está integrado nogenoma da célula hospedeira. Alternativamente, uma transfec-ção estável compreende a expressão de vetor em uma célula,em que o vetor é integrado no genoma da célula hospedeira.

0 termo "hospedeiro", da forma aqui usada, dizrespeito a todo organismo capaz de se tornar infectado porum virus e imunizado por uma partícula semelhante ao vírus.

Um hospedeiro pode ser uma ave hospedeira (isto é, por exem-plo, uma galinha) ou um mamífero hospedeiro (isto é, por e-xemplo, humano, camundongo, cão, rato, vaca, ovelha, etc.).

O termo "etiqueta de seqüência", da forma aqui u-sada, diz respeito a todo átomo ou molécula que pode ser u-sado para prover um sinal detectável (preferivelmente quan-tificável), e que pode ser anexado a um ácido nucléico ouproteína. "Etiquetas de seqüência" podem prover sinais de-tectáveis por fluorescência, radioatividade, colorimetria,gravimetria, difração ou absorção em raios X, magnetismo,atividade enzimática e semelhantes. Uma "etiqueta de seqüên-cia" pode ser uma fração carregada (carga positiva ou nega-tiva) ou, alternativamente, pode ter carga neutra. "Etique-tas de seqüência" podem incluir ou consistir em um ácido nu-cléico ou seqüência de proteína, desde que a seqüência quecompreende a "etiqueta de seqüência" seja detectável.O termo "adjuvante", da forma aqui usada, diz res-peito a todo composto que aumenta ou estimula a imuno-resposta quando administrado com um(s) antígeno(s).

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

As figuras seguintes são apresentadas somente comouma ilustração de modalidades especificas da presente inven-ção e não pretende-se que sejam limitantes.

A figura 1 apresenta dados exemplares que mostrama co-expressão de proteínas NP, F, HN, e M resultada em for-mação e liberação de VLP. Proteínas marcadas radioativamentetanto no extrato transfectado (Painel A) quanto no extratoinfectado (Painel B) foram imunoprecipitados com um coquetelde anticorpos específicos para todas as proteínas virais eproteínas precipitadas marcadas são mostradas no lado es-querdo de cada painel. As partículas VLP nos sobrenadantesdas células foram purificadas como descrito no Exemplo 4.

Depois da flutuação em gradientes de sacarose, cada fraçãode gradiente foi imunoprecipitada com coquetel de anticorpos(lado direito de cada painel). A densidade de cada fração(g/cc) está mostrada na base.

Painel A: células de aves, co-transfectadas compCAGGS(-NP), (-M), (F-K115Q) e (-HN), foram radioativamentemarcadas com 35S-metionina e 35S-Cisteina por 4 horas (P) eentão "chased" em meio não radioativo por 8 horas (C).

Painel B: células de aves, infectadas com NDV, li-nhagem AV, com uma Multiplicidade De Infecções (MOI) de 5pfu por 5 horas, foram marcadas por pulso por 30 minutos e"chased" em meio não radioativo por 8 horas.Painel C mostra a quantização da eficiência de ví-rion e liberação de VLP determinada pela quantidade de pro-teína M nos extratos celulares de "pulse-chase". Os resulta-dos de 3 experimentos separados foram ponderados e o desviopadrão é mostrado.

A figura 2 apresenta dados exemplares que mostramque a proteína M é suficiente para a liberação de VLP. Célu-las de aves foram transfectadas com pCAGGS-NP, -M, -F-K115Qe -HN individualmente.

0 painel A mostra proteínas marcadas radioativa-mente nos extratos no momento do pulso (esquerda) e "chase"(direita). Partículas nos sobrenadantes de células de avesque expressam NP, M, F e HN individualmente, foram concen-tradas e flutuadas em gradientes de sacarose supradescritosna figura 1.

0 painel B mostra a distribuição nos gradientes deproteínas marcados radioativamente derivados de cada sobre-nadante.

0 painel C mostra a quantificação das quantidadesde cada proteína em VLPs. Foi calculada a média dos resulta-dos de três experimentos separados e o desvio padrão é mostrado.

Figura 3 apresenta dados exemplares que mostramefeitos da co-expressão de proteínas NP, F ou HN com proteí-na M na liberação de VLP. Células de aves, transfectadas comtodas as combinações possíveis de dois genes de proteína es-trutural de NDV (isto é, combinações em par incluindo, massem limitações, F+NP, F+M, F+HN, HN+NP, HN+M e NP+M, em queF é F-K115Q). Marcação em um protocolo "pulse-chase" é comodescrito na Figura 1. Partículas presentes nos sobrenadantesforam concentradas e então flutuadas em gradientes de saca-rose como descrito no Exemplo 4.

0 painel A mostra proteínas marcadas em extratoscelulares no momento de pulso (topo) e "chase" (base).

0 painel B mostra as proteínas presentes em cadafração de gradiente depois da imunoprecipitação de cada fra-ção com um coquetel de anticorpos. Densidades (g/cc) dasfrações são mostradas na base. Gradientes das transfecçõesque não continham proteína M não são mostrados uma vez quenão havia proteínas marcadas radioativamente naqueles gradi-entes.

0 painel C mostra a quantificação de cada proteínaem VLPs liberada das células transfectadas de aves. Os re-sultados são a média de três experimentos, e o desvio padrãoé mostrado.

A figura 4 apresenta dados exemplares que mostramefeitos da expressão de todas as combinações de três proteí-nas virais na liberação de VLP. Células de aves transfecta-das com todas as combinações possíveis de três genes de pro-teína estrutural de NDV foram marcadas em um protocolo "pul-se-chase" e partículas no sobrenadante foram concentradas eflutuadas em um gradiente de sacarose como na figura 1. Asproteínas nos extratos celulares foram imunoprecipitadas como coquetel de anticorpos.

0 painel A mostra proteínas marcadas em extratoscelulares no momento do pulso (topo) e "chase" (base).O painel B mostra as proteínas presentes em cadafração de gradiente depois da imunoprecipitação de cada fra-ção com um coquetel de anticorpos para algumas das combina-ções de proteína viral. Densidades (g/cc) das frações sãomostradas na base.

0 painel C mostra a quantificação das quantidadesde cada proteína nas VLPs.

0 painel D mostra a eficiência da liberação de VLPcom base no percentual de proteína M marcada em pulso rema-nescente nos extratos de "chase".

0 painel E mostra as quantidades relativas de pro-teína M nos extratos de pulso.

A figura 5 apresenta dados exemplares que mostramque mutantes dominantes negativos de CHMP3 e Vps4-E228Q blo-quearam a liberação de partículas contendo proteína M.

0 painel A, esquerda, mostra extratos marcados empulso de células 2 93T humanas que foram simultaneamentetransfectadas com pCAGGS-M (1,0 pg) e com o vetor pDsRed2-Nl(0,1, 0,5 e 1,0 ug) ou pDsRed2-Nl-CHMP3-RFP (0,1, 0,5 e 1,0μg) . O painel A, direita, mostra as VLPs liberadas daquelascélulas depois uma "chase" de 8 horas.

O painel B, esquerda, mostra extratos de célulasmarcadas em pulso que foram simultaneamente transfectadascom pCAGGS-M e com o vetor pBJ5 ou pBJ5-Vps4A-E228Q-Flag. Opainel B, direita, mostra as VLPs liberadas daquelas célulasdepois de uma "chase" de 8 horas. Células 293T transfectadastanto em A quanto em B foram marcadas em um protocolo "pul-se-chase" como descrito na Figura 1. Partículas de sobrenadan-tes foram concentradas por centrifugação sobre um chumaço desacarose descrito no Exemplo 4.

Os painéis CeD mostram o percentual de VLPs li-beradas das células transiectadas com pCAGGS-M e pDsRed2-Nl-CHMP3 ou pBJ5-Vps4A-E22 8Q em relação a daquelas liberadasdas células transiectadas com pCAGGS-M e vetor somente.

Os painéis EeF mostram a quantização de expres-são protéica (marca de pulso) nos extratos celulares. Resul-tados idênticos foram obtidos em dois experimentos separados.

A figura 6 apresenta um esquema de uma modalidadeda estrutura da proteína viral de um Paramixovirus representativo.

A figura 7 apresenta um esquema de uma modalidadede um ciclo infeccioso ocasionado por um Paramixovírus re-presentativo.

A figura 8 apresenta uma seqüência de aminoácido(SEQ ID NO:6) (Painel A) e uma seqüência de nucleotídeos(SEQ ID NO:7) (Painel B) que codificam uma primeira proteínanucleocapsídica do vírus da doença de Newcastle (AB124608).

A figura 9 apresenta uma seqüência de aminoácido(SEQ ID NO:8) (Painel a) e uma seqüência de nucleotídeos(SEQ ID. NO: 9) (Painel B) que codificam uma primeira proteínahemaglutinina-neuraminidase do vírus da doença de Newcastle(AY288990).

A figura 10 apresenta uma seqüência de aminoácidoparcial (SEQ ID NO:10) (Painel A) e uma seqüência de nucleo-tídeos parcial (SEQ ID NO: 11) (Painel B) que codificam umaprimeira proteína de fusão do vírus da doença de Newcastle(Y18728).

A figura 11 apresenta uma seqüência de aminoácido(SEQ ID NO:12) (Painel A) e uma seqüência de nucleotídeos(SEQ ID NO:13) (Painel B) que codificam uma primeira proteí-na matriz viral da doença de Newcastle (AY728363).

As figuras 12A/B apresentam uma seqüência de nu-cleotídeos (SEQ ID NO:14) para um vetor de expressão de ba-culovírus (DQ0037 05).

A figura 13 apresenta dois plasmídeos exemplaresque compreendem um vetor de expressão pCAGGS. Painel A:pCAGGS/MCS; Painel B: pJW4303 (patente US 5.916.879, aquiincorporada pela referência). Percebe-se que o vetor de ex-pressão pCAGGS compreende uma seqüência promotora citomega-lovírus híbrido (CMV) beta actina.

A figura 14 apresenta dados autoradiográficos e-xemplares que mostram o acúmulo de proteína viral resultantede um experimento "pulse-chase" que compara a liberação devírus de células de ave e COS-7. Painel A: proteína F. Pai-nel B: proteína NP.

A figura 15 apresenta dados exemplares que mostrama quantificação da autorradiografia "pulse-chase" mostradana Figura 14. Painel A: proteína F. Painel B: proteína NP.Losangos: Células de aves. Quadrados: células COS-7.

A figura 16 apresenta dados autoradiográficos e-xemplares da purificação de VLPs em gradientes de sacaroseliberados de células de aves (Painel A) e de células COS-7(Painel B). Raias 1-9 provêem padrões de associação emdensidades de sacarose de 1,12 - 1,26, respectivamente. HN =proteína hemaglutinina-neuraminidase. Fo = proteína de fu-são; NP = proteína nucleocapsídica; M = proteína matriz.

A figura 17 apresenta uma autorradiografia exem-plar que mostra proteínas virais residuais em lisatos de ex-trato celular depois de um experimento "pulse-chase". PainelA: Células de aves. Painel B: células COS-7.

A figura 18 apresenta dados exemplares que demons-tram a melhor eficiência da liberação de VLP da proteína Mde ave (Painel A) em relação a células COS-7 de primata(Painel B) quando transfectadas somente por um DNAc de pro-teína M. Proteína M radioativamente marcada (seta M) é mos-trada em cada fração de densidade de gradiente de sacarose(isto é, Raias 1 - 9; 1,12 - 1,26).

A figura 19 apresenta dados de densiometria exem-plares que comparam uma quantificação de Liberação de partí-cula VLP de ave (Painel A) e de células COS-7 de primata(Painel B) depois da transfecção tanto por DNAc de proteínaNP, M, F-K115Q ou HN individualmente, quanto transfectadasusando uma combinação de DNAcs de proteína NP, M, F-K115Q eHN, em combinação (TODAS).

A figura 20 apresenta uma seqüência de aminoácido(SEQ ID NO:15) (Painel A) e uma seqüência de nucleotídeos(SEQ ID NO: 16) (Painel B) que codificam um segundo RNAm he-maglutinina-neuraminidase do vírus da doença de Newcastle(M22110).

A figura 21 apresenta uma seqüência de aminoácido(SEQ ID NO:17) (Painel A) e uma seqüência de nucleotídeos(SEQ ID NO:18) (Painel B) que codificam uma terceira proteí-na hemaglutinina-neuraminidase do vírus da doença de Newcas-tle (U37193).

A figura 22 apresenta uma seqüência de aminoácido(SEQ ID NO:19) (Painel A) e uma seqüência de nucleotídeos(SEQ ID NO:20) (Painel B) que codificam uma segunda proteínade fusão do vírus da doença de Newcastle (M21881).

A figura 23 apresenta uma seqüência de aminoácido(SEQ ID NO:21) para uma terceira proteína de fusão Bl do ví-rus da doença de Newcastle (AAG36978).

A figura 24 apresenta uma seqüência de aminoácido(SEQ ID NO:22) (Painel A) e uma seqüência de nucleotídeos(SEQ ID NO:23) (Painel B) que codificam uma segunda proteínanucleocapsídica do vírus da doença de Newcastle. (AF060483).

A figura 25 apresenta uma seqüência de aminoácido(SEQ ID NO:24) (Painel A) e uma seqüência de nucleotídeos(SEQ ID NO:25) (Painel B) que codificam uma segunda proteínamatriz viral da doença de Newcastle (M16622).

A figura 2 6 apresenta uma modalidade de uma se-qüência de aminoácido (SEQ ID NO: 26) (Painel A) e uma se-qüência de nucleotídeos (SEQ ID NO:27) (Painel B) que codi-ficam uma terceira proteína matriz viral da doença de New-castle (U25828).

As figuras 27A - 27D apresentam uma seqüência denucleotídeos (SEQ ID NO:28) de um genoma completo Bl do ví-rus da doença de Newcastle (AF309418).

A figura 28 ilustra um método para construir DNArecombinante de baculovírus.A figura 29 ilustra uma técnica de clonagem inde-pendente de ligação para produzir um DNA recombinante de ba-culovirus que contém etiquetas de seqüência His-tag e S-tag.

A figura 30 representa um mapa circular de um ge-noma de AcNPV C6 tipo selvagem que contém 154 supostos qua-dros de leitura abertos. Genes marcados com setas sólidassão conhecidos e relatados em bases de dados de seqüência deproteína, hr = AcNPV em posições de região homólogas e repe-titivas.

A figura 31 ilustra sete (7) modalidades de umplasmídeo de transferência do baculovírus (pBAC).

A figura 32 apresenta uma modalidade de uma se-qüência de aminoácido (SEQ ID NO: 29) (Painel A) e uma se-qüência de nucleotídeos (SEQ ID NO:30) (Painel B) que codi-ficam uma primeira proteína hemaglutinina do vírus do Saram-po (AY249267).

A figura 33 apresenta uma modalidade de uma se-qüência de aminoácido (SEQ ID NO: 31) (Painel A) e uma se-qüência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 32) (Painel B) que codi-ficam uma segunda proteína hemaglutinina do vírus do Sarampo(AY249269).

A figura 34 apresenta uma modalidade de uma se-qüência de aminoácido (SEQ ID NO: 33) (Painel A) e uma se-qüência de nucleotídeos (SEQ ID NO:34) (Painel B) que codi-ficam uma terceira proteína.hemaglutinina do vírus do Saram-po (DQ011611).

A figura 35 apresenta uma modalidade de uma se-qüência de aminoácido (SEQ ID NO: 35) (Painel A) e uma se-qüência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 36) (Painel B) que codi-ficam uma primeira proteína de fusão do vírus do Sarampo(AJ133108).

A figura 36 apresenta uma modalidade de uma se-qüência de aminoácido (SEQ ID NO:37) (Painel A) e uma se-qüência de nucleotídeos (SEQ ID NO:38) (Painel B) que codi-ficam uma segunda proteína de fusão do vírus do Sarampo(X05597).

A figura 37 apresenta uma modalidade de uma se-qüência de aminoácido (SEQ ID NO: 39) (Painel A) e uma se-qüência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 40) (Painel B) que codi-ficam uma terceira proteína de fusão do vírus do Sarampo(Y17840).

A figura 38 apresenta uma modalidade de uma se-qüência de aminoácido (SEQ ID NO: 41) (Painel A) e uma se-qüência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 42) (Painel B) que codi-ficam uma primeira proteína nucleocapsídica do vírus do Sa-rampo (M89921).

A figura 39 apresenta uma modalidade de uma se-qüência de aminoácido (SEQ ID NO: 43) (Painel A) e uma se-qüência de nucleotídeos (SEQ ID NO:44) (Painel B) que codi-ficam uma segunda proteína nucleocapsídica do vírus do Sa-rampo (AF171232).

A figura 40 apresenta uma modalidade de uma se-qüência de aminoácido (SEQ ID NO: 45) (Painel A) e uma se-qüência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 46) (Painel B) que codi-ficam uma terceira proteína nucleocapsídica do vírus do Sa-rampo (X01999).A figura 41 apresenta uma modalidade de uma se-qüência de aminoácido (SEQ ID NO: 47) (Painel A) e uma se-qüência de nucleotideos (SEQ ID NO: 48) (Painel B) que codi-ficam uma primeira proteína matriz do vírus do Sarampo(D12682).

A figura 42 apresenta uma modalidade de uma se-qüência de aminoácido (SEQ ID NO: 49) (Painel A) e uma se-qüência de nucleotideos (SEQ ID NO: 50) (Painel B) que codi-ficam uma segunda proteína matriz do vírus do Sarampo(D12683).

A figura 43 apresenta uma modalidade de uma se-qüência de aminoácido (SEQ ID NO: 51) (Painel A) e uma se-qüência de nucleotideos (SEQ ID NO: 52) (Painel B) que codi-ficam uma terceira proteína matriz do vírus do Sarampo(AY12477 9).

A figura 44 apresenta uma modalidade de uma se-qüência de aminoácido (SEQ ID NO: 53) (Painel A) e uma se-qüência de nucleotideos (SEQ ID NO: 54) (Painel B) que codi-ficam uma primeira proteína G do vírus sincicial respirató-rio (isto é por exemplo, uma proteína G de glicoproteína)(U92104).

A figura 4 5 apresenta uma modalidade de uma se-qüência de aminoácido (SEQ ID NO: 55) (Painel A) e uma se-qüência de nucleotideos (SEQ ID NO: 56) (Painel B) que codi-ficam uma segunda proteína G do vírus sincicial respiratório(AY333361).

A figura 4 6 apresenta uma modalidade de uma se-qüência de aminoácido (SEQ ID NO: 57) (Painel A) e uma se-qüência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 58) (Painel B) que codi-ficam uma terceira proteína G do vírus sincicial respirató-rio (ABI17522).

A figura 47 apresenta uma modalidade de uma se-qüência de aminoácido (SEQ ID NO: 59) (Painel A) e uma se-qüência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 60) (Painel B) que codi-ficam uma primeira proteína de fusão do vírus sincicial res-piratório (AY198177).

A figura 4 8 apresenta uma modalidade de uma se-qüência de aminoácido (SEQ ID NO: 61) (Painel A) e uma se-qüência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 62) (Painel B) que codi-ficam uma segunda proteína de fusão do vírus sincicial res-piratório (Z26524).

A figura 4 9 apresenta uma modalidade de uma se-qüência de aminoácido (SEQ ID NO: 63) (Painel A) e uma se-qüência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 64) (Painel B) que codi-ficam uma terceira proteína de fusão do vírus sincicial res-piratório (D00850).

A figura 50 apresenta uma modalidade de uma se-qüência de aminoácido (SEQ ID NO: 65) (Painel A) e uma se-qüência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 66) (Painel B) que codi-ficam uma primeira proteína matriz do vírus sincicial respi-ratório (U02470).

A figura 51 apresenta uma modalidade de uma se-qüência de aminoácido (SEQ ID NO: 67) (Painel A) e uma se-qüência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 68) (Painel B) que codi-ficam uma segunda proteína matriz do vírus sincicial respi-ratório (AY198177).A figura 52 apresenta uma modalidade de uma se-qüência de aminoácido (SEQ ID NO: 69) (Painel A) e uma se-qüência de nucleotideos (SEQ ID NO: 70) (Painel B) que codi-ficam uma primeira proteína nucleocapsidica do vírus sinci-ciai respiratório (U07233).

A figura 53 apresenta uma modalidade de uma se-qüência de aminoácido (SEQ ID NO: 71) (Painel A) e uma se-qüência de nucleotideos (SEQ ID NO:72) (Painel B) que codi-ficam uma segunda proteína nucleocapsidica do vírus sincici-al respiratório (X00001).

A figura 54 apresenta uma modalidade de uma se-qüência de aminoácido (SEQ ID NO: 73) (Painel A) e uma se-qüência de nucleotideos (SEQ ID NO: 74) (Painel B) que codi-ficam uma terceira proteína nucleocapsidica do vírus sinci-ciai respiratório (S40504).

A figura 55 apresenta uma modalidade de uma se-qüência de aminoácido (SEQ DD NO: 75) (Painel A) e uma se-qüência de nucleotideos (SEQ ID NO: 76) (Painel B) que codi-ficam uma primeira proteína nucleocapsidica do vírus parain-fluenza 3 (D10025).

A figura 56 apresenta uma modalidade de uma se-qüência de aminoácido (SEQ ID NO: 77) (Painel A) e uma se-qüência de nucleotideos (SEQ ID NO: 78) (Painel B) que codi-ficam uma primeira proteína de fusão do vírus parainfluenza3 (D00016).

A figura 57 apresenta uma modalidade de uma se-qüência de aminoácido (SEQ ID NO:79) (Painel A) e uma se-qüência de nucleotideos (SEQ ID NO: 80) (Painel B) que codi-ficam uma segunda proteína de fusão do vírus parainfluenza 3(AF394241).

A figura 58 apresenta uma modalidade de uma se-qüência de aminoácido (SEQ ID NO: 81) (Painel A) e uma se-qüência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 82) (Painel B) que codi-ficam uma proteína matriz do primeiro vírus parainfluenza 3(D00130).

A figura 59 apresenta uma modalidade de uma se-qüência de aminoácido (SEQ DD NO: 83) (Painel A) e uma se-qüência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 84) (Painel B) que codi-ficam uma primeira proteína hemaglutinina-neuraminidase dovírus parainfluenza 3 (AB189960).

A figura 60 apresenta uma modalidade de uma se-qüência de aminoácido (SEQ ID NO: 85) (Painel A) e uma se-qüência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 86) (Painel B) que codi-ficam uma segunda proteína hemaglutinina-neuraminidase dovírus parainfluenza 3 (AB 189961).

A figura 61 apresenta uma modalidade de uma se-qüência de aminoácido (SEQ ID NO: 87) (Painel A) e uma se-qüência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 88) (Painel B) que codi-ficam uma terceira proteína hemaglutinina-neuraminidase dovírus parainfluenza 3 (L25350).

A figura 62 apresenta dados exemplares que mostramque proteínas M podem ser confinadas em partículas da mem-brana. Células de aves foram transfectadas com pCAGGS-M eVLPs radioativamente marcadas foram isoladas e purificadas.Extratos (painel superior) e VLPs (painel do meio) foramtratados com diferentes concentrações (0,25, 0,5, 1, 5, 10,e 20 μg /mL; Raias 2 a 7 respectivamente) de Proteinase Kpor 30 minutos no gelo. Em paralelo, VLPs foram incubadas emTriton X-IOO 1% antes do tratamento com Proteinase K (painelbase). Depois da incubação com protease, as reações foraminterrompidas adicionando 0,1 mM PMSF. Então, proteínas Mforam imunoprecipitadas.

A figura 63 apresenta dados exemplares que mostramque proteína M é exigida para a liberação de VLP. Células deaves foram transfectadas com todas as combinações possíveisde DNAcs no vetor pCAGGS que codifica proteínas NP, F e HNna ausência de DNAc M (F-K115Q+HN, F-K115Q+NP, HN+NP, NP+F-K115Q+HN). Então, partículas em sobrenadantes de células fo-ram purificadas. Os painéis mostraram proteínas presentes emcada fração de gradiente. Extrato celular infectado radioa-tivamente marcado foi usado como marcador. Densidades defrações são mostradas na base (g/cc).

A figura 64 apresenta dados exemplares que mostrama co-localização da proteína M com as proteínas F e ΗΝ. Alocalização da superfície celular das proteínas NDV, F e HNe a localização celular de proteínas M foram analisadas pormicroscopia de imunofluorescência. Células de aves foramtanto transfectadas individualmente (A), quanto com F-K115Q+M ou HN+M (B), quanto com NP+M+F-K115Q, NP+M+HN ouM+F-K115Q+HN (C) quanto com todos os 4 DNAcs (D). Os núcleosforam manchado com DAPI (azul) 40 h pós-transfecção. Célulastransfectadas intactas foram manchado com anticorpos anti-proteína F de coelho ou anticorpos anti-proteína HN como in-dicado nos painéis. As células foram impermeabilizadas comTriton X-IOO 0,05% antes da incubação com anticorpo anti-proteina M. Anticorpos secundários foram Alexa 488 anti-coelho conjugado (verde) e Alexa 568 conjugado anti-camundongo (vermelho). Imagens foram mescladas usando o Ado-be Photoshop.

A figura 65 apresenta dados exemplares que mostrama co-imunoprecipitação de proteínas virais em VLPs. VLPs ra-dioativamente marcadas geradas a partir de células que ex-pressam NP+M+F-K115Q+HN (A), M+F-K115Q+HN (B), NP+M+F-K115Q(C) e NP+M+HN (D) foram lisadas em tampão TNE com Triton X -100 1%. Então, VLPs lisadas foram incubadas com quantidadesem excesso de coquetel de anticorpos anti-proteína F (anti-HRl, anti-HR2, anti-Ftail, anti-F2-96 e anti-F monoclonal(G5)), anticorpos anti-proteína HN (mistura de anticorposmonoclonais), anticorpo monoclonal anti-proteína M ou coque-tel de anticorpos específicos para NDV durante a noite em 4°C. Nenhum anticorpo nem soro pré-imune foram usados comocontroles negativos. Complexos imunes foram precipitados comPansorbin A pré-lavado por pelo menos 2 h em 4 0C com mistu-ra constante. Amostras foram lavadas três vezes em TNE friocom Triton X-IOO 0,5%. Todas as etapas de co-imunoprecipitação foram realizadas a 4 °C. Proteínas foramresolvidas por eletroforese em gel SDS-PAGE. Resultados mos-traram um de três experimentos independentes, todos com re-sultados idênticos.

A figura 66 apresenta dados exemplares que mostraminterações proteína-proteína em VLPs. Inserto: Várias moda-lidades de interações proteína viral-proteína detectadas porco-imunoprecipitação de proteínas em VLPs. Também são mos-tradas interações potenciais ilustrativas que podem resultarna montagem de VLPs formadas pela co-expressão de todas ascombinações de proteínas NP, F e HN com proteína M.

A figura 67 apresenta dados exemplares que mostramVLPs liberadas das células 293T. As células 293T transfecta-das com pCAGGS M (Painel A) ou com mistura de pCAGGS-NP, -M,-F-K155Q e -HN (Painel B) foram radioativamente marcadas com[35S] metionina e [35S] cisteína por 4 horas (P) e então"chased" em meio não radioativo por 8 horas (C) . Proteínaspresentes nos lisatos celulares foram imunoprecipitadas comum coquetel de anticorpos específicos para todas as proteí-nas virais e as proteínas precipitadas marcadas são mostra-das no lado esquerdo de cada painel. Então, partículas emsobrenadantes de células foram purificadas. Depois da flutu-ação em gradientes de sacarose (lado direito de cada pai-nel), cada fração de gradiente foi imunoprecipitada com ocoquetel de anticorpos. A densidade de cada fração (g/cc) émostrada na base.

A figura 68 apresenta dados exemplares que mostramo efeito da liberação de VLP da proteína M no caminho VPS daproteína tipo selvagem e mutante negativo dominante. O pai-nel A mostra extratos celulares de células 293T (topo) epartículas liberadas correspondentes (base) das células co-transfectadas com pCAGGS-M e tanto com o vetor pDsRed2-Nl(Raia 1), quanto com pBJ5-WT-CHMP3 (Raia 2) quanto com pDs-Red2-NI-CHMP3-RFP (Raia 3). O painel C mostra extratos celu-lares de células 293T (topo) e partículas liberadas corres-pondentes (base) de células co-transfectadas com pCAGGS-M etanto com o vetor pBJ5 (Raia 1), quanto com pBJ5-WT-Vps4A(Raia 2) quanto com pBJ5-Vps4A-B228Q (Raia 3) . 0 painel Emostra extratos de células 293T (topo) e VLPs corresponden-tes (base) de células co-transfectadas com pCAGGS-M e tantocom vetor pDsRed2-Nl (Raia 1), quanto com pBJ5-AlPl-HA (Raia2) ou pDsRed2-Nl-AIPl-HA-CHMP3-RFP (Raia 3). Os extratos sãode células marcadas em pulso. VLPs são liberadas de célulasmarcadas em pulso durante uma "chase" não radioativa de 8horas. Então, partículas foram purificadas. Proteínas foramimunoprecipitadas usando anticorpos específicos de proteínaNDV e resolvidas por SDS-PAGE. OS painéis B, D e F mostram aquantificação de partículas liberadas em relação àquelas li-beradas pelos controles de proteína VPS tipo selvagem. Re-sultados idênticos foram obtidos em dois experimentos sepa-rados.

A figura 69 apresenta dados exemplares que mostramo efeito de mutantes dominantes negativos de CHMP3, Vps4A eAIPl na liberação de VLPs completas. 0 painel A mostra ex-tratos de células 293T (Raias 1-3) e VLPs liberadas corres-pondentes (Raias 4-6) de células co-transfectadas com DNAcsde NDV que codificam proteínas NP, M, HN F e tanto com o ve-tor pDsRed2-Nl (Raias 1 e 4), quanto com pBJ5-WT-CHMP3 (Rai-as 2 e 5) quanto com pDsRed2-Nl-CHMP3-RFP (Raias 3 e 6) . 0painel C mostra extratos de células 293T (Raias 1-3) e VLPsliberadas correspondentes (Raias 4-6) de células co-transfectadas com a mistura de quatro DNAcs de NDV e tantocom o vetor pBJ5 (Raias 1 e 4), quanto com pBJ5-WT-Vps4A(Raias 2 e 5) quanto com pBJ5-Vps4A-E228Q (Raias 3 e 6) . 0painel E mostra extratos de células 293T (Raias 1-3) e VLPscorrespondentes (Raias 4-6) das células co-transfectadas coma mistura de DNAcs de NDV e tanto com o vetor pDsRed2-Nl(Raias 1 e 4), quanto com pBJ5-AlPl-HA (Raias 2 e 5) quantocom pDsRèd2-NI-AIPI-HA-RFP (Raias 3 e 6) . Os extratos sãodas células marcadas em pulso. VLPs são liberadas das célu-las marcadas em pulso durante uma "chase" não radioativa de8 horas. Então, partículas foram purificadas. Proteínas fo-ram imunoprecipitadas usando anticorpos específicos de pro-teína NDV e resolvidas por SDS-PAGE. Os painéis B, D e Fmostram a quantificação de VLPs liberadas em relação ao ve-tor e aos controles de proteína Vps tipo selvagem. Resulta-dos idênticos foram obtidos em dois experimentos separados.

A figura 70 apresenta dados exemplares que demons-tram a funcionalidade do domínio L na proteína M do NDV. 0painel A mostra proteína M tipo selvagem, proteínas M mutan-tes com substituições de alanina nas posições de aminoácido216 e 219 (M-A2I6A2I9) ou 232 e 235 (M-A232A235), e substitui-ções YPDL ou PTAP nas posições 232 - 235. O painel B mostraextrato (topo) e VLPs liberadas (base) das células 293T queexpressam proteínas M tipo selvagem ou mutantes. 0 painel Dmostra extrato (esquerda) e VLPs liberadas (direita) das cé-lulas 293T que expressam proteínas NP, F e HN tanto com pro-teínas M tipo selvagem quanto com proteínas M mutantes. En-tão, as partículas foram purificadas. Proteínas foram imuno-precipitadas usando anticorpos específicos de proteína NDV eresolvidas por SDS-PAGE. Os painéis CeE mostram a quanti-ficação de VLPs liberadas em relação à proteína M tipo sel-vagem. Resultados idênticos foram obtidos em dois experimen-tos separados.

A figura 71 apresenta dados exemplares que mostrama incorporação de AIPl em VLPs. Células 293T foram transfec-tadas com pCAGGS M e tanto com vetor vazio quanto com vetorcom AIPl com HA-tag. 0 painel A mostra proteína M radioati-vamente marcada precipitada dos extratos celulares (anti-MIP) e VLPs usando anticorpo monoclonal específico de proteí-na M. HA-AIPl (com etiqueta N terminal) e AIPl-HA (com eti-queta C terminal) foram detectados nos extratos e VLPs porimunoblotting usando anticorpo HA conjugado com peroxidase(anti-HA-IB). O painel B mostra proteína M precipitada ra-diomarcada e AIPl-HA de extratos celulares (topo) e VLPs(base).

A figura 72 apresenta dados exemplares comparandoum conteúdo de proteína do vírus NDV purificado e VLPs semimunoprecipitação anterior.

A figura 73 apresenta micrografias eletrônicas e-xemplares que mostram vírus (Bl) (painel superior), VLPs so-mente de proteína M (painel do meio) e VLPs NP, M, F e HN(painel inferior).

A figura 74 apresenta dados exemplares que mostramuma mancha prateada do vírus (Bl) quando crescido em ovos,comparados com VLPs preparados a partir de uma cultura emtecido em grande escala.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃOA presente invenção diz respeito ao campo das va-cinas virais. Em uma modalidade, a presente invenção contem-pla uma vacina paramixoviral efetiva contra doenças, taiscomo, mas sem limitações, doença de Newcastle, sarampo, ví-rus parainfluenza 3 e virus sincicial respiratório. Em umamodalidade, a presente invenção contempla uma vacina quecompreende partículas semelhantes ao vírus contra a doençade Newcastle (VLP). Em uma modalidade, a presente invençãocontempla um método que compreende transfectar células deaves com DNAcs que codificam as principais proteínas estru-turais NDV. Em uma outra modalidade, é descrito um método emque partículas que se parecem com vírions infecciosos sãoliberadas com quase 100% de eficiência. Em uma modalidade,as partículas são não infecciosas e provêem uma vacina segu-ra e efetiva contra NDV.

Paramixovírus têm um genoma de RNA negativo de fi-ta única que, usualmente, é linear. A morfologia do parami-xovírus compreende uma forma relativamente esférica com diâ-metros que variam entre aproximadamente 150 - 350 nanômetros(nm). No geral, os genomas são empacotados com nucleoproteí-na no interior dos núcleos de ribonucleoproteína. Proteínaspolimerases também podem ser associadas com aqueles núcleosde ribonucleoproteína que desempenham um papel nos processosde replicação e transcrição do início da infecção. A proteí-na matriz é um importante recurso dos paramixovírus e alinhaa superfície interna da membrana viral. Todas as proteínastransmembrana (isto é, por exemplo, proteínas hemagluti-nina, de fusão ou neuraminidase), formam complexos ho-mo-oligoméricos (isto é, conhecidos na tecnologia como pro-teínas espora) e ajudam na montagem do vírus localizado namembrana plasmática da célula hospedeira. Garoff et al.,"Virus Maturation By Budding" Microbiol Mol Biol Rev62:1171-1190 (1998).

I. Estrutura e Montagem Virál

Paramixovírus são envelopados e conhecidos pormontar seus componentes de vírion na membrana plasmática decélulas infectadas e subseqüentemente liberar partículas deprogênies para o processo de gemulação. Vírus da doença deNewcastle (NDV), sarampo, vírus parainfluenza 3 e vírus sin-cicial respiratório, todos, pertencem a Paramyxoviridae, ca-racterizado como um vírus envelopado com um RNA genômico defita negativa (isto é, por exemplo, aproximadamente 16 KB)que é empacotado com nucleoproteína no interior de um núcleoda ribonucleoproteína (RNP).

0 núcleo da RNP do paramixovírus também contém ocomplexo polimerase, que é composto por uma Fosfoproteína eGrande Polimerase. 0 núcleo da RNP é confinado em uma mem-brana que contém duas glicoproteínas transmembranas, a pro-teína hemaglutinina-neuraminidase (HN) e a proteína de fusão(F), bem como a proteína matriz (M), que é associada com asuperfície interna do envelope viral que contém lipídio.Lamb et al., "Paramyxoviridae: The Viruses and Their Repli-cation" pp. 1305-1340. In: Fields Virology. Third Edition.Vol. 1. Eds: D. Μ. Κ. & Ρ. M. Howley, LippincottWilliams &Wilkins, Philadelphia (2001).Acredita-se que a proteína matriz de muitos vírusde RNA envelopados desempenha um papel na montagem e gemula-ção do vírus. Freed, E. 0., "The HIV-TSGI01 interface: re-cent advances in a budding field" Trends Microbiol. 11:56-9(2003); Jasenosky et al., "Filovirus budding" Virus Res.10 6:1B1-8 (2004); Jayakar et al., "Rhabdovirus assembly andbudding" Virus Res. 106:117-32 (2004); Peeples M. E., "Para-myxovirus M proteins: pulling it ali together and taking iton the road" pp. 427-456. In: The Paramyxoviruses, Ed: D. W.Kingsbury, Plenum, New York, N. Y. (1991); Pornillos et al.,"Mechanisms of enveloped RNA virus budding" Trends CellBiol. 12:569-79 (2002); Schmitt et al., "Escaping from thecell: assembly and budding of negative-strand RNA viruses"Cuff TopoMicrobiol Immunol 283:145-96 (2004); e Takimoto etal., "Molecular mechanism of paramyxovírus budding" VirusRes. 106:133-45 (2004). Entretanto, a expressão da proteínagag precursora retroviral, na ausência de outros componentesvirais, também resulta na montagem e liberação de partículassemelhantes ao vírus (VLPs) gag da membrana plasmática. Del-chambre et al., "The GAG precursor of simian immunodefi-ciency virus assembles into vírus-like particles" EMBO J8:2653-60 (1989); Demirov et al., "Retrovirus budding" VirusRes 106:87 - 102 (2004); Gheysen et al., "Assembly and re-lease of HIV-I precursor Pr55gag vírus-like particles fromrecombinant baculovirus-infected insect cells" Cell 59:103-12 (1989); e Morita et al., "Retrovirus budding" Annu RevCell Dev Biol. 20:395-425 (2004). Portanto, não ficou claroquais proteínas do NDV são suficientes e necessárias paradirecionar a formação e liberação da partícula viral.

A. Proteínas M

Em uma modalidade, a presente invenção contemplaum método que compreende uma proteína M de um paramixovírus,sem nenhuma glicoproteína adicional, em que VLPs são criadas.

proteínas M isoladas de:

i) vírus Ebola (Jasenosky et al. , "Filovirus bud-ding" Virus Res. 106:lBl-8 (2004); Jasenosky et al. , "Ebolavirus VP40-induced particle formation and association withthe lipid bilayer" J. Virol. 75:5205-14 (2001); e Timmins etal., "Vesicular release of Ebola virus matrix protein VP40"Virology 283:1-6 (2001));

ii) vírus da estomatite vesicular (Jayakar et al.,"Rhabdovirus assembly and budding" Virus Res. 106:117-32(2004); Li et al., "Viral liposomes released from insectcells infected with recombinant baculovirus expressing thematrix protein of vesicular stomatitis virus" J. Virol.67:4415-20 (1993); e Sakaguchi et al. , "Double-Iayered mem-brane vesicles released from mammalian cells infected withSendai virus expressing the matrix protein of vesicularstomatitis vírus" Virology 263 : 230-43 (1999))

e, iii) vírus influenza (Gomez-Puertas et al. ,"Influenza virus matrix protein is the major driving forcein virus budding" J. Virol. 7A:11538-47 (2000)), quando ex-pressado sozinho, montam e são liberados como VLPs.Inversamente, virus da raiva deficiente de proteí-na M é conhecido pode ser severamente danificado na formaçãode vírion. Mebatsion et al., "Matrix protein of rabies virusis responsible for the assembly and budding of bullet-shapedparticles and interacts with the transmembrane spike glyco-protein G" J. Virol. 73:242-50 (1999).

Estudos em diversos sistemas paramixovirus tambémsugeriram um papel para a proteína M na montagem e na gemu-lação do vírus. Vírus do Sarampo (MV) e vírus Sendai (SV)modificados por genética reversa para não ter os genes daproteína M foram danificados na gemulação. Cathomen et al.,"A matrix-less measles virus is infectious and elicits ex-tensive cell fusion: consequences for propagation in thebrain" EMBO J 17:3899-3908 (1998); e Inoue et al. , "A newSendai virus vector deficient in the matrix gene does notform virus particles and shows extensive cell-to-cellspreading" J Virol. 77:6419-29 (2003), respectivamente. Alémdo mais, proteína M mutante contendo MV derivada do vírus dapancefalite esclerosante subaguda (SSPE) também foi defeitu-osa na gemulação. Patterson et al., "Evidence that the hy-permutated M protein of a subacute sclerosing panencephali-tis measles virus actively contributes to the chronic pro-gressive CNS disease" Virology 291:215-25 (2001).

Estudos recentes sobre a montagem do paramixovirustambém focaram na identificação das exigências da proteínaviral para a montagem e gemulação de VLPs e demonstraram umpapel para a proteína Μ. A proteína M do vírus parainfluenzahumana tipo 1 (hPIVl) e a proteína M SV expressa sozinha in-duziram a gemulação de VLPs da membrana plasmática. Coronelet al., "Human parainfluenza virus type 1 matrix and nucleo-protein genes transiently expressed in 12 mammalian cellsinduce the release of virus-like particles containing 13 nu-cleocapsid-like structures" J. Virol. 73:7035-8 (1999);Sakaguchi et al., "Double-Iayered membrane vesicles releasedfrom mammalian cells infected with Sendai virus expressingthe matrix protein of vesicular stomatitis virus" Virology263:230-43 (1999); Sugahara et al., "Paramyxovirus Sendaivirus-like particle formaion by expression of multiple viralproteins and acceleration of its release by C protein" Vi-rology 325:1-10 (2004); e Takimoto et al., "Role of matrixand fusion proteinn in budding of Sendai virus" J. Virol.75:11384-91 (2001). Expressão de proteína M também foi exi-gida para formação de VLP em Vírus de Símio 5 (SV5). Schmittet al., "Requirements for budding of paramyxovirus simianvirus virus-like particles" J Virol 76:3952-64 (2002).

Entretanto, ao contrário de PIYl e SV, a proteínaM de SV5 não foi suficiente para a liberação de VLP. Em vezdisto, foi exigida a expressão simultânea de proteína M deSV5, juntamente com NP e ambas glicoproteínas. Embora rela-tos existentes concordem sobre um papel para proteína M comoum organizador de gemulação na liberação de partícula em pa-ramixovírus, há diferenças nas exigências da proteína para amontagem e a gemulação de vírions. As capacidades de gemula-ção da proteína gag de retrovírus, proteína M de vírus Ebo-la, e proteína Ml de influenza são atribuídas, em parte, aosDomínios tardios (infra) . Demirov et al. , "Retrovírus bud-ding" Virus Res 106:87 - 102 (2004); Freed, Ε. O., "Virallate domains" J. Virol. 76:4679-87 (2002); Jasenosky et al. ,"Filovirus budding" Virus Res. 106:lBl-8 (2004); Jayakar etal., "Rhabdovirus assembly and budding" Vírus Res. 106:117-32 (2004); Morita et al. , "Retrovirus budding" Annu Rev CellDev Biol. 20:395-425 (2004); Nayak et al., "Assembly andbudding of influenza vírus" Virus Res 106:147-65 (2004);Pornillos et al. , "Mechanisms of enveloped RNA virus buding"Trends Cell Biol. 12:569-79 (2002); Schmitt et al., "Escap-ing from the cell: assembly and budding of negative-strandRNA viruses" Cuff Top Microbiol Immunol 283:145-96 (2004);Strack et al., "AlP 1/ALIX is a binding partner for HIV - 1p6 e EIA V p9 functioning in virus budding" Cell 114:689-99(2003); e von Schwedler et al., "The protein network of HIVbudding" Cell 4:701-13 (2003).

B. Domínios tardios

Domínios tardios são pequenos motivos de peptídeoque medeiam interações com um elemento das proteínas classeE que são envolvidos no caminho da seleção de proteína vacu-olar (VPS). 0 Domínio Tardio promove a gemulação por intera-ção com componentes do mecanismo celular responsável pelaseleção de carga no interior de corpos multivesiculares(MVB) . A formação de vesículas MVB e a gemulação de um vírussão processos topologicamente similares. Evidências disponí-veis sugerem que vírus de RNA envelopados brotam por co-opção do mecanismo celular que é normalmente usado para cri-ar MVB no interior da célula. Carter, C. A., "TsglOl:HIV-I'sticket to ride" Trends Microbiol. 10:203-205 (2002); Demirovet al., "Retrovirus budding" Virus Res 106:87 - 102 (2004);Freed, E. O., "The HIV-TSGI01 interface: recent advances ina budding field" Trends Microbiol. 11:56-9 (2003); Freed, E.O., "Viral late domains" J. Virol. 76:4679-87 (2002); Garruset al., "Tsg 1-01 and the vacuolar protein sorting pathwayare essential for HIV-I budding" Cell 107:55-65 (2001); Mo-rita et al., "Retrovirus budding" Annu Rev Cell Dev Biol.20:395-425 (2004); Pornillos et al., "Mechanisms of envel-oped RNA virus budding" Trends Cell Bíol. 12:569-79 (2002);Pornillos et al., "HN Gag mimics the TsglOl-recruiting ac-tivity of the human Hrs protein" J Cell Biol 162:425-34(2003); Strack et al., "AlP 1/ALIX is a binding partner forHIV -1 p6 and EIA V p9 functioning in virus budding" Cell114:689-99 (2003); von Schwedler et al., "The protein net-work of HIV budding" Cell 4:701-13 (2003). Martindale, D.,"Budding viral hijackers co-opt the endocytic machinery tomake a getaway" J Biol. 3:2 (2003); e Simons et al. , "Thebudding mechanisms of enveloped animal viruses" J. Gen. Vi-rol. 50:1-21 (1980).

Em uma modalidade, a presente invenção contemplaque componente de proteína mutante negativo dominante do ca-minho VPS também pode inibir a liberação de partícula. Emuma modalidade, uma seqüência YXXL (SEQ ID NO:3) na proteínaM do NDV tem propriedades de um Domínio Tardio. Embora nãoseja necessário entender o mecanismo da invenção, acredita-se que a mutação YXXL abole a liberação de partícula ao mes-mo tempo em que a substituição de domínios tardios, tais co-mo, YPDL e/ou PTAP restauram completamente a liberação departícula.

C. Gemulação

Na família paramixovírus, sabe-se que o caminhoVPS é envolvido na gemulação de SV5. Mostrou-se que uma mu-tação negativo dominante VPS4(E228Q) (um ATPase exigido parareciclar complexos protéicos envolvidos no caminho VPS) ini-biu a gemulação de vírions SV5 bem como VLPs SV5. Schmitt etal., "Evidence for a new viral late-domain core sequence,FPIV, necessary for budding of a paramyxovirus" J. Virol.79:2988-97 (2005). Uma vez que sabe-se que VPS4(E228Q) tam-bém inibe o caminho VPS, acredita-se que o caminho VPS estáenvolvido na gemulação de SV5. Além do mais, um suposto Do-mínio Tardio em SV5 M foi identificado. Entretanto, proteínaM de SV5 não é suficiente para a formação e liberação deVLP, complicando a interpretação deste resultado. Assim, asregras gerais para a montagem e liberação de paramixovírusainda não são claras. Schmitt et al., "Requirements for bud-ding of paramyxovirus simian virus virus-like particles" JVirol 76:3952-64 (2002). Questões em aberto incluem: i) adefinição adicional de domínios tardios de paramixovírus emproteínas estruturais virais, ii) o papel ou contribuição decada proteína viral na montagem do vírus, e iii) os fatorescelulares envolvidos nos processos de montagem e gemulação.

Várias modalidades da presente invenção respondema estas questões. Em uma modalidade, a presente invençãocontempla um método para produzir VLPs de NDV de célulastransfectadas com ácidos nucléicos que codificam proteínasestruturais virais. Em uma outra modalidade, a presente in-venção contempla a transfecção com ácido nucléico que codi-fica uma proteína M do NDV que é tanto necessário quanto su-ficiente para a liberação de partículas que contêm lipídio(isto é, por exemplo, VLPs). Em uma outra modalidade, a pre-sente invenção contempla que a incorporação mais eficiente(isto é, por exemplo, quase 100%) de outras proteínas viraisem VLPs exige a expressão de proteína M com pelo menos duasoutras proteínas do NDV. Por exemplo, sabe-se que mutaçõesnegativo dominante de proteínas CHMP3 e Vps4 (ambas compo-nentes do sistema hospedeiro VPS) inibiram a liberação deVLPs. Morita et al., "Retrovirus budding" Annu Rev Cell DevBiol. 20:395-425 (2004); Strack et al., "AlP 1/ALIX is abinding partner for HIV -1 ρβ and EIA V p9 functioning invirus budding" Cell 114:689-99 (2003); and von Schwedler etal., "The protein network of HIV budding" Cell 4:701-13(2003) . Percebe-se adicionalmente que AIPl também é incorpo-rada no interior das VLPs, desse modo, desempenhando um pa-pel na gemulação da partícula do NDV.

D. Mutações Negativas Dominantes

A proteína Vps4 negativo dominante pode bloquear aliberação de vírions SV5 ou VLPs compostos de proteínas NP,HN, F, e M implicando o sistema VPS na liberação de parami-xovírus. Schmitt et al., "Evidence for a new viral Iate-domain core sequence, FPIV, necessary for budding of a para-myxovirus" J. Virol. 79:2988-2997 (2005). Confirmando estesresultados, uma versão negativo dominante de Vps4, Vps4 A-E228Q, bloqueou a liberação de VLP do NDV. Martin-Serrano etal., "Role of ESCRT-I in retroviral budding" J Virol77:4794-4804 (2003); Strack et al., "AIP1/ALIX is a bindingpartner for HIV-I p6 and EIAV p9 functioning in vírus bud-ding" Cell 114:689-699 (2003); e von Schwedler et al., "Theprotein network of HIV budding" Cell 114:701-713 (2003)).

Embora não seja necessário entender o mecanismo dainvenção, acredita-se que os resultados aqui demonstradosmostram que estas proteínas negativas dominantes bloquearama liberação de partículas que contêm somente proteína M. Porexemplo, uma versão negativo dominante de CHMP3, uma subuni-dade do complexo ESCRT III (1), e um mutante negativo domi-nante de AIP1, uma proteína que liga tanto proteínas ESCT Iquanto III, inibiu a liberação de VLP do NDV bem como a li-beração de partículas que contêm somente proteína M. Estainibição não foi em função da sobrexpressão da proteína umavez que a transfecção das versões tipo selvagem destas pro-teínas teve pouco efeito na liberação de partícula M. Estesresultados mostraram que um caminho VPS intacto facilita agemulação de VLP do NDV. Além do mais, estes resultados in-dicam que o caminho VPS está envolvido na liberação de par-tícula M.

Muitos estudos demonstraram que domínios L nasproteínas matriz de vírus medeiam sua interação com molécu-las específicas do caminho VPS. Bieniasz, P. D., "Late bud-ding domains and host proteins in enveloped virus release"Virology 344:55-63 (2006); Freed, E. 0., "Viral late do-mains" J. Virol. 76:4679-4687 (2002); e Morita et al.,"Retrovirus budding" Annu Rev Cell Dev Biol 20:395-425(2004). Três motivos de domínio L, PTAP, YPXL e PPXY (Porn-illos et al., "Mechanisms of enveloped RNA vírus budding"Trends Cell Biol. 12:569-579 (2002)), foram identificados emretrovírus (Puffer et al., "Equine infectious anemia virusutilizes a YXXL motif within late assembly domain of the Gagp9 protein" J Virol 71:6541- 6546 (1997)), rabdovírus efilovírus (Irie et al., "Budding of PPxY-containing rhab-doviruses is not dependent on host proteins TGSlOl andVPS4A" J Virol 78:2657-2665 (2004)). Uma seqüência YRKL foiidentificada como um domínio tardio em ortomixovírus (Hui etal., "YRKL sequence of influenza virus Ml functions as the Ldomain motif and interacts with VPS28 and Cdc42" J Virol80:2291-2308 (2006)).

A ligação da seqüência PTAP em proteína TSG101(gene 101 com suscetibilidade a tumor), um componente deESCRT I, foi relatada. Huang et al., "p6Gag is required forparticle production from full-length human immunodeficiencyvirus type 1 molecular clones expressing protease" J Virol69:6810-6818 (1995). Adicionalmente, mostrou-se que a se-qüência YPXL interage com AP2 (proteína adaptadora 2) eAIPl. Chen et al., "Functions of early (AP-2) and late(AIP1/ALIX) endocytic proteins in equine infectious anemiavirus budding" J Biol Chem (2005); and Strack et al.,"AI Pl /ALIX is a binding partner for HIV-I p6 and EIAV p9functioning in virus budding" Cell 114:689-699 (2003), re-spectivamente. A seqüência YRKL na proteína Ml do vírus in-fluenza se liga a VSP28, uma proteína ESCRT 1 que ligatsglOl, bem como Cdc42, um elemento da família Rho das pro-teínas que ligam GTP. O motivo PPXY se liga em ubiquitinaligases tipo Nedd4 (célula neural precursora expressa, gene4regulado para baixo de forma desenvolvida). Vana et al.,"Role of Nedd4 and ubiquitination de Rous sarcoma virus Gagin budding of virus- Iike particles from cells" J Virol78:13943-13953 (2004); e Xiang et al., "Fine mapping andcharacterization of the Rous sarcoma virus Pr76gag late as-sembly domain" J Virol 70:5695-5700 (1996)).

As proteínas M do paramixovírus não têm um motivoPTAP, um motivo YPXL, um motivo YRKL ou um motivo PPXY. En-tretanto, a seqüência FPIV na proteína M do SV5 pode ser umdomínio tardio em paramixovírus. A mutação de FPIV inibiu aliberação de partículas e a adição desta seqüência em umaconstrução gag de retrovírus estimulou a liberação de partí-cuias. Entretanto, uma vez que a proteína M do SV5 não é su-ficiente para a liberação de partícula SV5, não acredita-seque FPIV funcione independentemente como um domínio tardiono contexto desta proteína M do paramixovírus. Schmitt etal., "Evidence for a new viral late-domain core sequence,FPIV, necessary for budding of a paramyxovirus" J. Virol.79:2988-2997 (2005).

Assim, não é claro como SV5 usa o caminho VPS oucomo a seqüência FPIV pode funcionar como um domínio tardio.A análise de seqüência da proteína M do NDV mostra a presen-ça deste motivo FPIV. Além do mais, a proteína M do NDV con-tém uma seqüência PKSP e uma seqüência YANL, não encontradasna proteína M do SV5. Em uma modalidade, a presente invençãocontempla um motivo YANL que compreende propriedades de umdomínio L. Em uma modalidade, uma mutação YANL reduz a libe-ração de partícula da proteína M. Embora não seja necessárioentender o mecanismo da invenção, acredita-se que a substi-tuição de uma mutação YANL por outra liberação de partículade domínios tardios conhecida (isto é, por exemplo, PTAP ouYPDL) pode ficar completamente restaurada.

Acredita-se adicionalmente que, provavelmente, ainibição da liberação de partícula por mutação da seqüênciaYANL não é em função somente dos efeitos no envelopamento deproteína. Os dados aqui providos sugerem que a proteína M doNDV pode acessar o caminho VPS usando ambos tipos de domíniotardio, um domínio YPDL ou um domínio PTAP e que a seqüênciaFPIV na proteína M do NDV pode não funcionar como um domíniotardio independente da seqüência YANL uma vez que a proteínamutante YANL M-A232-A235 tem uma seqüência FPIV tipo selvagem.

Domínios tardios YPDL mostraram interagir com aproteína AIPl do VPS. Em uma modalidade, a presente invençãocontempla que a proteína AIPl é encontrada em partículas li-beradas contendo somente proteína M.

A proteína M de vírus Sendai também mostrou sersuficiente para a liberação de partículas (Sugahara et al.,"Paramyxovirus Sendai virus-like particle formation by ex-pression of multiple viral proteins and acceleration of itsrelease by C protein" Virology 325:1-10 (2004); e Takimotoet al., "Role of matrix and fusion protein in budding ofSendai virus" J. Virol. 75:11384-11391 (2001)). A proteína Mdo vírus Sendai tem uma seqüência YLDL, que pode servir comoum domínio tardio para a proteína M do SV. Da forma exposta,a proteína M do SV5 não é suficiente para a liberação de ne-nhuma partícula nem tem um motivo YXXL. Schmitt et al., "Re-quirements for budding of paramyxovirus simian virus 5 vi-rus-like particles" JVirol 76:3952-3964 (2002). Entretanto,a proteína NP do SV5 tem inúmeros motivos YXXL incluindo umaseqüência YPLL. Alternativamente, um domínio tardio do SV5pode estar presente na NP do SV5 em vez da proteína M. Defato, relatou-se que a liberação de VLP do SV5 é significa-tivamente aumentada pela expressão da proteína NP do SV5 comproteína M bem como com uma glicoproteína. Schmitt et al.,"Requirements for budding of paramyxovirus simian virus 5virus-like particles" J Virol 76:3952-3964 (2002). Conse-qüentemente, é óbvio que existem exigências diferenciais pa-ra a liberação de partículas em diferentes sistemas parami-xovírus e podem ser em função, em parte, de diferentes dis-tribuições dos domínios tardios em proteínas estruturais.Contudo, a presente invenção contempla que o caminho VPS dacélula hospedeira facilita a gemulação da proteína M e que omotivo YANL na proteína M do NDV tem as propriedades de umdomínio tardio.

II. Formação e Liberação de Partícula Semelhanteao Vírus (VLP)

Em uma modalidade, a presente invenção contemplatransfectar uma célula hospedeira com ácido nucléico que co-difica somente uma proteína M do paramixovírus para que ascélulas transfectadas expressem a proteína matriz e criemVLPs paramixovirais. Em uma outra modalidade, a presente in-venção contempla a co-expressão de duas ou mais glicoproteí-nas do paramixovírus incluindo, mas sem limitações, proteí-nas NP, F-K115Q e/ou HN (juntamente com proteína M) sob con-dições de maneira tal que ocorra formação e liberação de VLPdo paramixovírus.

A presente invenção contempla condições para a ge-ração eficiente de VLPs de uma linhagem paramixoviral viru-lento. Em uma modalidade, a linhagem paramixoviral compreen-de o grupo que inclui, mas sem limitações, doença de Newcas-tle, sarampo, vírus parainfluenza 3 ou vírus sincicial res-piratório. Em uma outra modalidade, as VLPs compreendem osmesmos principais antígenos que os vírus infecciosos. Em umaoutra modalidade, as VLPs compreendem os principais antíge-nos com as mesmas taxas que os vírus infecciosos. Em uma mo-dalidade, os principais antígenos são selecionados do grupoque compreende proteína nucleocapsídica, membrana/proteínamatriz, proteína hemaglutinina-neuraminidase e proteína defusão.

A produção de VLPs de acordo com modalidades dapresente invenção é muito mais simples, e provavelmente maiseconômica, que as vacinas com vírus vivo ou atenuado atual-mente disponíveis. As VLPs podem ser coletadas dos sobrena-dantes das células e purificadas pelos mesmos protocolos u-sados para purificar vírus. VLPs podem ser construídos paraaumentar o espectro de imuno-respostas. As VLPs também podeser construídas para que a imuno-resposta possa ser distin-guida daquela induzida por uma infecção.

A. Características da Liberação de VLPEm uma modalidade, VLPs são liberada das célulasque co-expressam as principais proteínas estruturais de pa-ramixovírus. Em uma modalidade, as partículas VLP do NDV sãoliberadas de uma linhagem celular fibroblástica de galinhaque co-expressa proteínas NP, M, F e HN que podem ser puri-ficadas e caracterizadas. Em uma modalidade, uma versão nãoclivada da proteína F eliminou todos os efeitos potenciaisde fusão célula-a-célula na liberação de vírus. Em uma moda-lidade, células de aves são usadas em virtude de pássarosser o hospedeiro natural de NDV. Por exemplo, como detalhadonos Exemplos a seguir, células (isto é, por exemplo, de aveou humanas) foram co-transfectadas com plasmídeos que codi-ficam proteínas virais do NDV usando concentrações de DNApreviamente determinadas para resultar em níveis de expres-são e taxas de proteínas comparáveis às células infectadas.

Então, células foram marcadas no pulso com 35S-metionina e35S-Cisteina e então "chased" por 8 horas (uma vez tambémresultando na liberação máxima da partícula) . VLPs nos so-brenadantes de células foram isolada e fracionadas por ul-tracentrifugação em densidade de sacarose.

Em uma modalidade, a eficiência da liberação deVLP paramixoviral de células que expressam pelo menos quatroproteínas virais (85%) foi comparável com a eficiência daliberação de partícula infecciosa de células infectadas porparamixovírus (92%). Embora não seja necessário entender omecanismo da invenção, acredita-se que este resultado sugereque quatro proteínas do paramixovírus (isto é, por exemplo,proteína M, proteína NP, proteína F ou proteína HN) podemprover uma eficiente formação de partículas. Acredita-se a-dicionalmente que a Grande Polimerase viral ou proteínasFosfoproteína têm pouco efeito quantitativo na liberação devírus.

Embora não seja necessário entender o mecanismo dainvenção, acredita-se que VLPs paramixovirais, que podem serisolados em gradientes de sacarose, têm uma densidade rela-tivamente homogênea que é ligeiramente menor que a densidademédia de um vírus autêntico. Embora não seja necessário en-tender o mecanismo da invenção, acredita-se que, provavel-mente, este resultado é em função da ausência do RNA genômi-co viral nas partículas. Portanto, acredita-se adicionalmen-te que as VLPs são não infecciosas.

Embora não seja necessário entender o mecanismo dainvenção, acredita-se que, provavelmente, VLPs paramixovi-rais sejam envelopadas em conformações virtualmente idênti-cas a um vírus autêntico e sejam empacotadas em partículasde uma maneira idêntica a partículas paramixovirais. Em de-corrência disto, estas partículas devem ser tão antigênicasquanto o vírus autêntico. Entretanto, VLPs não contêm o ge-noma viral, uma vez que as células (isto é, por exemplo, deave ou humanas), que estão formando e liberando estas partí-culas, não são infectadas com vírus. Portanto, VLPs não po-dem ser infecciosas e não podem causar doença.

B. Função da Proteína M

Em uma modalidade, uma proteína M do paramixovírusé tanto suficiente quanto necessária para a liberação departícula VLP. Em uma modalidade, o paramixovírus é selecio-nado do grupo que inclui, mas sem limitações, virus da doen-ça de Newcastle, virus do Sarampo, virus parainfluenza 3 evirus sincicial respiratório. Deve-se dizer que a expressãoda proteína M sozinha resultou em liberação muito eficienteda proteína M que contém partículas VLP do paramixovírus.

Por exemplo, a eficiência da liberação de proteína M é com-parável com aquela observada quando pelo menos quatro prote-ínas foram co-expressas. Embora não seja necessário entendero mecanismo da invenção, acredita-se que este resultado su-gere que é a proteína M que direciona a gemulação das VLPsdo paramixovírus. Além do mais, VLPs são liberadas somentequando a proteína M está presente. Conseqüentemente, libera-ção significativa de partícula VLP não ocorrerá na ausênciade proteína M mesmo se a expressão de proteína viral (ou co-expressão de uma combinação de proteínas virais) estiverpresente. Por exemplo, células que expressam proteína HN so-zinha liberaram somente quantidades mínimas de um materialque contém proteína HN muito pouco denso no interior dos so-brenadantes de células, e é improvável que este material re-flita um componente significativo da montagem do vírus. Emuma modalidade, a presente invenção contempla que nenhumaProteína NDV, diferente da proteína M, pode funcionar inde-pendentemente na liberação de partículas que contêm lipídioque reflita a montagem do vírus.

Embora não seja necessário entender o mecanismo dainvenção, acredita-se que partículas VLP liberadas das célu-las que expressam somente proteína M têm densidades muitohomogêneas em virtude de esta gemulação ocorrer indiscrimi-nadamente a partir de diferentes membranas celulares ou apartir de diferentes domínios de membrana plasmática e, con-seqüentemente, conter diferentes taxas de lipidio para pro-teína em função da variável oligomerização da proteína M.

Por exemplo, partículas formadas do monômero da proteína Mpodem ter uma taxa de lipidio para proteína mais alta do queas partículas formadas a partir da proteína M em um estadooligomérico. Sabe-se que proteínas M de outros vírus de RNAcom fita negativa podem formar estruturas oligoméricas. Ga-roff et al., "Vírus maturation by budding" Microbiol MolBiol Rev 62:1171-90 (1998); e Panch et al., "In vivo oli-gomerization and raft localization of Ebola vírus proteinVP4 0 during vesicular budding" Proc Natl Acad Sci USA100:15936-41 (2003).

C. Função da Glicoproteina

Acredita-se que a formação de vírions infecciososdo paramixovírus envolve a incorporação tanto de glicoprote-ínas HN quanto de glicoproteínas F. Em uma modalidade, apresente invenção contempla uma composição que compreende aincorporação de glicoproteína em uma VLP do paramixovírusquando a proteína M é co-expressa com pelo menos duas glico-proteínas. Co-expressão de glicoproteína simples (isto é,por exemplo HN+M ou F+M) resultou somente em quantidades mí-nimas tanto de glicoproteína HN quanto de glicoproteína Fincorporadas em partículas VLP. Adicionalmente, quando gli-coproteínas HN e F foram co-expressas com proteína M, os ní-veis de incorporação de glicoproteína foram comparáveis comaqueles observados com a co-expressão de pelo menos quatroproteínas.

Embora não seja necessário entender o mecanismo dainvenção, acredita-se que estes resultados indicam que aproteína M se liga mais eficientemente com um complexo deglicoproteínas HN e F. Esta possibilidade também é suportadapor observações de que a co-expressão destas duas glicopro-teínas com proteína M resultou em VLPs do paramixovírus comuma densidade menor e mais homogênea. No geral, partículasVLP da proteína M têm uma densidade muito heterogênea. A co-expressão de proteína M tanto com glicoproteína quanto sozi-nha não mudou a densidade geral das partículas que contêmproteína M. Acredita-se que estes resultados indicam que in-terações de proteína M com um complexo de proteína HN-F afe-taram a taxa proteína para lipídio das VLPs ou afetaram amembrana a partir da qual as partículas foram liberadas.

Percebe-se que quase nenhuma combinação de proteí-na M e glicoproteínas virais produz VLPs do paramixovíruscom bom rendimento como aqui contemplado. Por exemplo, a co-expressão de uma única glicoproteína e uma proteína M resul-tou em uma supressão de 40-60% da liberação de VLP, compara-do com a liberação de VLP observada depois: i) co-expressãocom todas as quatro proteínas; ii) expressão de uma proteínaM com pelo menos duas glicoproteínas; e iii) expressão deproteína M sozinha. Estudos empíricos revelaram que esta su-pressão da liberação é auxiliada pela co-expressão da prote-ína M com a glicoproteína NP e uma outra glicoproteína.Embora não seja necessário entender o mecanismo dainvenção, acredita-se que a supressão da liberação de VLPpor uma única glicoproteina + proteína M é consistente comas observações de que a liberação de VLP da proteína NP +proteína M é: i) 70% menor se comparado com a liberação dascélulas que expressam pelo menos quatro proteínas; e ii) 80%menor se comparado com a liberação das células que expressamsomente proteína M. Embora não seja necessário entender omecanismo da invenção, acredita-se que a grande quantidadede NP no citoplasma pode afastar a proteína M da membranaplasmática, desse modo, impedindo sua associação com estamembrana e, portanto, a gemulação de partículas. Conseqüen-temente, uma hipótese sugere que a co-expressão com uma ou-tra glicoproteina pode redirecionar tanto a proteína NPquanto a proteína M para uma membrana celular, desse modo,auxiliando na liberação da supressão de VLP.

D. Sistema de Seleção de Proteína Vacuolar (VPS) eGemulações Multivesiculares (MVBs)

Embora não seja necessário entender o mecanismo dainvenção, acredita-se que a liberação de VLP dependente deproteína M do paramixovírus usa o sistema de seleção de pro-teína vacuolar (VPS) hospedeiro. O sistema VPS foi relatadopor mediar a gemulação de outros vírus envelopados. Moritaet al., "Retrovirus budding" Annu Rev Cell Dev Biol. 20:395-425 (2004); e Pornillos et al., "Mechanisms of enveloped RNAvirus budding" Trends Cell Biol. 12:569-79 (2002).

Acredita-se que a gemulação de retrovirus, filoví-rus e vírus influenza dependem do caminho VPS da célula hos-pedeira. O caminho VPS também serve para formar MVBs. Demi-rov et al., "Retrovirus budding" Virus Res 106:87 - 102(2004); Jasenosky et al. , "Filovirus budding" Vírus Res.106-.1B1-8 (2004); Morita et al., "Retrovirus budding" AnnuRev Cell Dev Biol. 20:395-425 (2004); Pornillos et al. ,"Mechanisms of enveloped RNA virus budding" Trends CellBiol. 12:569-79 (2002); Freed, E. 0., "Viral late domains"J. Virol. 76:4679-87 (2002); e Schmitt et al., "Escapingfrom the cell: assembly and budding of negative-strand RNAviruses" Cuff Top Microbiol Immunol 283:145-96 (2004). MVBssão formado pela invaginação de membranas endossômicas parao interior do lúmen endossômico, desse modo, criando uma ve-sicula dentro de uma vesicula. Martindale, D., "Budding vi-ral hijackers co-opt the endocytic machinery to make a get-away" J Biol. 3:2 (2003). A topologia da formação de MVB ésimilar àquela da gemulação viral a partir da membrana plas-mática.

Foi proposto que proteínas virais usurpam este me-canismo da célula hospedeira para direcionar a gemulação vi-ral. Demirov et al., "Retrovirus budding" Virus Res 106:87 -102 (2004); Martindale, D., "Budding viral hijackers co-optthe endocytic machinery to make a getaway" J Biol. 3:2(2003); e Morita et al., "Retrovirus budding" Annu Rev CellDev Biol. 20:395-425 (2004). Atualmente, pesquisas sugeremque a formação de MVBs envolve três complexos protéicos, ca-racterizados primeiro em levedura, e são coletivamente co-nhecidos como o Complexos de Seleção Endossômica Exigido pa-ra o Transporte (isto é, por exemplo, ESCRT I, II e III).Babst et al., "ESCRT -III: an endosome-associated heterooli-gomeric protein complex 4 required for MVB sorting" Dev Cell3:271-282 (2002); Jiang et al., "Multivesicular bodies: amechanism to package lytic and storage functions in one or-ganelle?" Trends Cell Biol. 12:362-7 (2002); Katzmann etal., "Ubiquitin-dependent· sorting into the multivesicularbody pathway requires the function of a conserved endosomalprotein sorting complex, ESCRT-I" Cell 106:145-55 (2001); eKatzmann et al., "Vps27 recruits ESCRT machinery to en-dosomes during MVB sorting" J Cell Biol. 162:413-23 (2003).

Além do mais, a proteína Vps4 (isto é, por exemplo, um aAT-Pase) é exigida para a dissociação de todo o Complexo ESCRT.Raiborg et al., "Protein sorting into multivesicular en-dosomes" Cuff Opin Cell Biol 15:446-55 (2003).

E. Inibiçâo da Liberação de VLP

Estudos com inúmeros tipos de vírus, de forma maisproeminente retrovírus, mostraram que proteínas celularesenvolvidas na formação de MVBs são recrutadas por proteínasgag de retrovírus e outras proteínas tipo matriz por intera-ções de Domínios Tardios virais com um componente do caminhoVPS. Demirov et al., "Retrovírus budding" Vírus Res 106:87 -102 (2004); Morita et al., "Retrovírus budding" Annu RevCell Dev Biol. 20:395-425 (2004); Pornillos et al., "Mecha-nisms of enveloped RNA virus budding" Trends Cell Biol.12:569-79 (2002); 44. Descobriu-se que mutantes dominantesnegativos de Vps4, CHMP3 e CHMP2 podem bloquear a liberaçãode retrovírus. Strack et al., "PIP1/ALIX is a binding part-ner for HIV-lp6 and EIAV p9 functioning in virus budding"Cell 114:689-699 (2003).

Embora não seja necessário entender o mecanismo dainvenção, acredita-se que uma mutação negativo dominante deVps4 ou Vps4 A-E228Q é capaz de bloquear a liberação de VLPda proteína M do paramixovírus. Acredita-se adicionalmenteque uma mutação negativo dominante de CHMP3 (isto é, por e-xemplo, uma subunidade do complexo ESCRT III) inibe a libe-ração de VLP da proteína M do paramixovírus. Estas observa-ções indicam não somente que o caminho VPS está envolvido nagemulação paramixoviral (isto é, por exemplo, liberação deVLP), mas que é a proteína M que interage diretamente com ocaminho VPS.

Relatou-se recentemente que a liberação de VLP evírion do SV5 também é inibida pela expressão da forma nega-tivo dominante de VSP4, implicando o caminho VPS na montageme liberação de SV5. Schmitt et al., "Evidence for a new vi-ral late-domínio core sequence, FPIV, necessary for buddingof a paramyxovirus" J. Virol. 79:2988-97 (2005). Além domais, acredita-se que a seqüência FPIV (SEQ ID N0:1) no pro-teína M do SV5 seja um Domínio Tardio. Entretanto, a proteí-na M do SV5 é conhecida por não ser suficiente para a libe-ração de partícula. Schmitt et al., "Requirements for bud-ding of paramyxovirus simian virus virus-like particles" JVirol 76:3952-64 (2002). Conseqüentemente, não é claro comoSV5 usa o caminho VPS ou como esta seqüência pode funcionarcomo um Domínio Tardio.Em uma modalidade, uma análise de seqüência de umaproteína M do NDV também mostra a presença de um motivo FPIV(SEQ ID N0:1). Em uma modalidade, uma proteína M do NDV com-preende adicionalmente um motivo PXXP (SEQ ID NO:2) e um mo-tivo YXXL (SEQ ID NO:3), seqüências não encontradas na pro-teína M do SV5. Outros motivos identificados na tecnologiatambém podem ser Domínios Tardios candidatos para outrasproteínas M do paramixoví rus; isto é, domínios que podemfuncionar na gemulação independente de outras proteínas vi-rais. Demirov et al., "Retrovirus budding" Virus Res 106:87- 102 (2004); e Freed, E. 0., "Viral late domains" J. Virol.76:4679-87 (2002).

F. Expressão VLP Específica de Hospedeiro

A expressão de partícula semelhante ao vírus dascélulas 293T humanas foi relatada em outros três sistemasparamixovírus (vírus Sendai (SV), PIVl e SV5) em eficiênciasque variam entre 18% a 70%. Schmitt et al., "Requirementsfor budding of paramyxovirus simian virus virus-like parti-cles" J Virol 76:3952-64 (2002); Sugahara et al. , "Para-myxovirus Sendai virus-like particle formation by expressionof multiple viral protein and acceleration of its release byC protein" Virology 325:1-10 (2004); e Takimoto et al.,"Role of matrix and fusion proteins in budding of Sendai ví-rus" J. Virol. 75:11384- 91 (2001).

Em uma modalidade, a presente invenção contemplaum método que compreende melhorar a eficiência da liberaçãode paramixovírus de VLP usando células do hospedeiro naturaldo vírus. Em uma modalidade, um paramixovírus é selecionadodo grupo que inclui, mas sem limitações, virus da doença deNewcastle, virus do Sarampo, virus parainfluenza 3 ou virussincicial respiratório. Em uma modalidade, uma VLP da prote-ína M do paramixovirus é liberada das células de aves comuma eficiência de 90%. Em uma outra modalidade, VLP da pro-teína M do paramixovirus é liberada das células 293T humanascom uma eficiência de 50%. Além do mais, a eficiência de li-beração de cada VLP da proteína M, bem como das VLPs comple-tas, das células COS foi significativamente menor que a Ii-beração das células de aves; uma diferença que não é em fun-ção de um nível inferior de expressão de proteínas virais emcélulas COS em relação a células de aves. Embora não sejanecessário entender o mecanismo da invenção, acredita-se queas diferenças entre as eficiências de formação de no parami-xovírus podem ser em função de uma dependência específica decélula hospedeira.

Sabe-se que as exigências de proteína para a for-mação de VLP em outros sistemas paramixovirus também variam.

Por exemplo, sistemas paramixovirus que compreendem proteí-nas M de SV, hPIVl e SV5 são considerados envolvidos no di-recionamento da montagem e da gemulação do vírus, mas há di-ferenças no papel da proteína M na real formação de partícu-la. Coronel et al., "Human parainfluenza virus type 1 matrixand nucleoprotein genes transiently expressed in 12 mammal-ian cells induce the release of virus-like particles con-taining 13 nucleocapsid-like structures" J. Virol. 73:7035-8(1999); Schmitt et al., "Requirements for budding of para-myxovirus simian virus virus-like particles" J Virol76:3952-64 (2002); Sugahara et al., "Paramyxovirus Sendaivirus-like particle formation by expression of multiple vi-ral proteins and acceleration of its release by C protein"Virology 325:1-10 (2004); e Takimoto et al., "Role of matrixand fusion proteins in budding of Sendai virus" J. Virol.75:11384-91 (2001). Similar à proteína M do NDV, as proteí-nas M SV e hPIVl foram suficientes para a liberação de par-tícula, a proteína M do SV5, entretanto, não foi suficiente.

A co-expressão da proteína M do SV5 com NP e pelo menos umaglicoproteína foi exigida para a eficiente formação e libe-ração de VLPs do SV5. Schmitt et al., "Requirements for bud-ding of paramyxovirus simian virus virus-like particles" JVirol 76:3952-64 (2002).

Em uma modalidade, a presente invenção contemplaque somente a proteína M, e nenhuma outra proteína de para-mixovírus, pode direcionar a liberação de partícula VLP. Es-tudos anteriores indicam que a proteína F SV pode exibir umaatividade de exocitose autônoma demonstrada pela liberaçãode vesículas que contêm somente a proteína F. Sugahara etal., "Paramyxovirus Sendai virus-like particle formation byexpression of multiple viral proteins and acceleration ofits release by C protein" Virology 325:1-10 (2004); e Taki-moto et al., "Role of matrix and fusion proteins in buddingof Sendai virus" J. Virol. 75: 11384- 91 (2001).

Ao contrário, células contempladas pela presenteinvenção que expressam sozinhas a proteína F do NDV não li-beraram material que contém proteína F, e células que ex-pressam sozinhas proteínas HN liberaram somente quantidadesmínimas de material muito pouco denso que contém proteína HNno interior dos sobrenadantes de células. Estas observaçõessão similares a outros relatos que mostram que a expressãode glicoproteínas F ou HN do SV5, sozinhas, não resultou naliberação de partícula VLP. Schmitt et al. , "Requirementsfor budding of paramyxovirus simian virus virus-like parti-cles" J Virol 76:3952- 64 (2002). Embora não seja necessárioentender o mecanismo da invenção, acredita-se que apesar dasobservações de que F do SV e outras glicoproteínas viraiscom fita negativa envelopadas mostraram exibir atividade degemulação, nenhum Domínio Tardios foi identificado em nenhu-ma glicoproteína viral. Schmitt et al. , "Escaping from thecell: assembly and budding of negative-strand RNA viruses"Cuff Top Microbiol Immunol 283:145-96 (2004).

Modalidades da presente invenção que compreendemco-expressão de proteína M e NP também é ao contrário daque-las relatadas no sistema SV. Por exemplo, a expressão simul-tânea de M e NP de SV é conhecida por resultar na liberaçãode VLPs que contêm ambas proteínas virais. Sugahara et al.,"Paramyxovirus Sendai virus-like particle formation by ex-pression of multiple viral protein and acceleration of itsrelease by C protein" Virology 325:1-10 (2004).

G. Interações proteína-proteína

A presente invenção contempla o uso de NDV como umparamixovírus protótipo a fim de esclarecer o papel de cadaproteína de paramixovírus na montagem e liberação da partí-cula. Usando este modelo, certas modalidades integram umadefinição das exigências da proteína viral para a montagem ea liberação de VLPs com uma caracterização das interaçõesproteina-proteina em VLPs formadas com diferentes combina-ções de proteínas virais.

Adicionalmente, em algumas modalidades, a presenteinvenção contempla uma co-localização da proteína M com asglicoproteínas virais nas membranas plasmáticas. Embora nãoseja necessário entender o mecanismo da invenção, acredita-se que os dados aqui apresentados mostram que a montagem dapartícula envolve uma rede de interações proteína-proteínaespecíficas e, provavelmente, corrigem o alvejamento de pro-teínas em domínios celulares específicos.

Em uma modalidade, a presente invenção contemplaforma de interações VLP proteína com todas as combinações detrês e quatro proteínas (isto é, por exemplo, quando defini-da por co-imunoprecipitação). Em uma outra modalidade, asproteínas HN e F de superfície celular são co-localizadascom a proteína M quando expressas em diferentes combinaçõescom proteínas M e NP. Em uma outra modalidade, a co-expressão de duas proteínas virais com proteína M também au-mentou significativamente a co-localização da proteína Mtanto com a proteína HN quanto com a proteína F na membranaplasmática, indicando mais interações com a proteína M.

Para definir estas interações proteína-proteína,VLPs formadas com diferentes combinações de três e quatroproteínas foram solubilizadas com detergente não-iônico eproteínas precipitadas com coquetéis de anticorpos monoespe-cíficos para proteínas M, HN ou F. Primeiro, cada coquetelde anticorpos precipitou todas as proteínas das VLPs forma-das com Μ, ΗΝ, F e NP, embora a eficiência da precipitaçãopara cada proteina tenha variado com a especificidade do an-ticorpo. Embora não seja necessário entender o mecanismo dainvenção, acredita-se que estes resultados sejam consisten-tes com uma rede de interações entre todas as quatro proteí-nas de maneira tal que a precipitação de um tenha resultadona precipitação das outras três proteínas, mas com eficiên-cias que variaram, determinadas por quão diretamente umaproteína foi ligada à proteína precipitada.

Interações proteína-proteína foram mais claramentedefinidas pela imunoprecipitação de proteínas das VLPs for-madas com todas as combinações de três proteínas. Estes re-sultados mostraram uma interação específica entre as proteí-nas HN e M, entre as proteínas NP e M e entre as proteínas Fe NP. (Veja a Figura 66). Uma interação direta entre a pro-teína Fea proteína M não foi diretamente observada, mas,provavelmente, há uma fraca interação entre as proteínas F eNH, uma vez que anticorpos anti-proteína F precipitaram pro-teína HN das proteínas M, HN e F que contêm VLPs. A aparenteincapacidade de as proteínas FeM interagirem sugere que aincorporação de proteína F nestas VLPs pode ser mediada porinterações com uma proteína HN. Alternativamente, uma inte-ração entre a proteína HN e NP também pode facilitar os pro-cessos de incorporação.

Assim, quando todas as quatro proteínas são co-expressas, as proteínas NP e HN são incorporadas em VLPs poruma interação direta com a proteína M. (Veja a Figura 66).

Embora não seja necessário entender o mecanismo da invenção,acredita-se que, provavelmente, a proteína F é incorporadaindiretamente em função das interações com proteínas NP eHN. Acredita-se adicionalmente que um complexo ordenado dasquatro proteínas é suportado por uma co-localização da pro-teína M com a proteína F e da proteína M com a proteína HNna membrana plasmática quando todas as quatro proteínas sãoco-expressas.

Entretanto, quando somente F é expressa com a pro-teína M, provavelmente a proteína F não foi significativa-mente incorporada em VLPs em virtude de uma interação diretaentre estas duas proteínas, não ter sido observada. (Veja aFigura 66) . A observação de que não houve co-localização deproteínas F e M na membrana plasmática nestas células supor-ta esta conclusão.

Apesar das associações diretas de M com NP, houvepouca incorporação de proteína.NP em VLPs quando as proteí-nas NP e M foram co-expressas na combinação em par. Relatosanteriores mostram que a proteína M do vírus Sendai é recru-tada no citoplasma pelo nucleocapsídeo viral. Stricker etal., "The Sendai virus matrix protein appears to be re-cruited in the cytoplasm by the viral nucleocapsid to fun-tion in viral assembly and budding" J Gen Virol 75 (Pt5):1031-1042 (1994). Talvez NP ocasione o realvejamento daproteína M neste compartimento. De fato, a co-expressão daproteína M com NP resultou em uma supressão de 2,5 vezes daliberação de VLP que contém proteína M, um resultado tambémconsistente com a retenção da proteína M nas células pelaproteína NP.Embora co-imunoprecipitações de proteínas VLP for-madas com proteína M, HN e F indicou uma interação direta daproteína HN com a proteína M, houve somente baixos níveis deincorporação da proteína HN em VLPs quando proteínas HN e Mforam co-expressas em uma combinação em par. Além do mais,houve pouca co-localização das duas proteínas na membranaplasmática. Talvez, na ausência de outras proteínas, as pro-teínas HN e M mostraram mínima co-localização nas mesmas re-giões da célula, desse modo, impedindo sua associação. Al-ternativamente, também é possível que a conformação datransmembrana ou cauda citoplasmática da proteína HN possaser diferente na ausência da expressão de proteína F ou deproteína NP que inibe a associação da proteína HN com a pro-teína M. A redução de 50% das VLPs da proteína M mediante aco-expressão de proteína HN com a proteína M não pode seratualmente explicada, mas resultados similares foram previa-mente relatados em sistema de vírus Sendai. Sugahara et al.,"Paramyxovirus Sendai virus-like particle formation by ex-pression of multiple viral proteins and acceleration of itsrelease by C proteína" Virology 325:1-10 (2004).

Percebe-se que a imunoprecipitação é não necessá-ria para produzir VLPs purificadas. Em uma modalidade, apresente invenção contempla uma preparação de VLP que com-preende proteínas virais puras. Composições de proteína fo-ram comparadas entre o vírus completo e as VLPS do NDV puri-ficado que não passaram por imunoprecipitação. Os dados mos-tra que a preparação de VLP não contém nenhum proteína quenão está presente na preparação do vírus completo. Veja aFigura 72. Conseqüentemente, as VLPs são tão puras quanto ovirus completo.

Embora não seja necessário entender o mecanismo dainvenção, acredita-se que, provavelmente, VLPs formadas comproteínas NP, MeF são em função das interações entre M eNP e das interações entre F e NP. (Veja a Figura 66) . Porexemplo, a proteína F pode realocar NP na membrana plasmáti-ca atraindo M para domínios específicos que contêm proteínaF. De fato, dados aqui apresentados mostram que a adição deNP aumenta a co-localização da proteína M com a proteína Fna membrana plasmática. Acredita-se adicionalmente que, pro-vavelmente, VLPs formadas com proteínas NP, M e HN se formamem função das interações tanto da proteína HN quanto da pro-teína NP com a proteína M. Dados aqui apresentados mostramque a expressão de NP com proteínas HN e proteínas M aumentaa co-localização das proteínas M e proteínas HN na membranaplasmática. Uma hipótese possível sugere que as interaçõesproteína NP-proteína M alteram a conformação de M, desse mo-do, facilitando sua interação com a proteína HN. De fato, aproteína HN de superfície na presença de NP parece mais a-centuada ao longo das bordas celulares.

Esta rede de interações proposta anteriormente po-de explicar as conclusões de que os domínios citoplasmáticos(CT) das proteínas HN e F têm funções redundantes. Schmittet al., "Requirements for budding of paramyxovirus simianvirus 5 virus-like particles" J Virol 76:3952-3964 (2002).Por exemplo, o domínio CT da proteína F pode alvejar comple-xos NP-M na membrana plasmática por interações com a proteí-na NP ao mesmo tempo que o domínio CT da proteína HN alvejaestes complexos em virtude de interações diretas com a pro-teína M.

A interação das proteínas M e NP sugerida pelosdados aqui expostos é suportada pelos estudos que usam o ví-rus Sendai. Stricker et al. , "The Sendai vírus matrix pro-tein appears to be recruited in the citoplasm by the viralnucleocapsid to function in viral assembly and budding" JGen Virol 75 (Pt 5):1031-1042 (1994). Adicionalmente, umainteração possível de proteína HN com outra proteína viral éconsistente com inúmeros estudos que sugerem uma interaçãoda proteína M com glicoproteínas virais em células infecta-das com paramixovírus ou em células transfectadas com DNAcsdo paramixovírus. Ali et al. , "Assembly of Sendai vírus: Mprotein interacts with F and HN proteins and with the cyto-plasmic tail and transmembrane domain of F protein" Virology276:289-303 (2000); Ghildyal et al., "Interaction betweenthe respiratory syncytial virus G glycoprotein cytoplasmicdomain and the matrix protein" J Gen Virol 86: 1879-1884(2005); Henderson et al. , "Sorting of the respiratorysyncytial virus matrix protein into detergent-resistantstructures is dependent on cell-surface expression of theglycoproteins" Virology 300:244-254 (2002); Sanderson etal. , "Sendai virus assembly: M protein binds to viral glyco-proteins in transit through the secretory pathway" J Virol67:651-663 (1993); e Yoshida et al., "Membrane (M) proteinof HVJ (Sendai virus) - Its role in virus assembly" Virology71 : 143-161 (1976). De fato, relatou-se que a proteína G dovírus sincicial respiratório interage especificamente com aproteína M. Entretanto, não há relatos anteriores de uma in-teração direta entre as proteínas F e NP. É possível que asinterações entre as proteínas virais variem nos paramixoví-rus e que as exigências para a formação de VLPs possa depen-der da distribuição de domínios tardios nas proteínas vi-rais. Os resultados aqui apresentados são consistentes com aproposta de que a proteína M do NDV brota e libera indiscri-minadamente a partir de diferentes membranas celulares naausência de outras proteínas virais. Embora não seja neces-sário entender o mecanismo da invenção, acredita-se quequando tanto as glicoproteínas quanto as proteínas M estãopresentes na membrana plasmática, a associação proteína M-membrana plasmática tem uma maior estabilidade. Acredita-seadicionalmente que a associação de NP com as proteínas FeMtambém pode estabilizar e organizar adicionalmente a rede deinterações na montagem da partícula.

Esta hipótese de rede de interação proteína-proteína é suportada pelas observações que comparam micro-grafias eletrônicas de vírus completos (Bl) com VLPs forma-das somente com a proteína M, e VLPs formadas com as proteí-nas NP, M, F e HN. Veja a Figura 73. Quando todas as quatroproteínas virais estão presentes, o tamanho e a forma da VLPsão muito similares às do vírus completo. Entretanto, o ta-manho e forma da VLP somente de uma proteína M são mais he-terogêneos, comparados com o vírus completo, mas ainda éconsideravelmente similar.Em uma modalidade, a presente invenção contemplaum sistema de produção de VLP para o NDV. Em uma modalidade,a proteína M facilita a gemulação de VLP do NDV de maneiratal que a gemulação de VLP do NDV virtualmente não exista naausência de proteína M. Em outras modalidades, as interaçõesproteína-proteína específicas ocorrem em VLPs envolvidas namontagem ordenada de partículas. Em uma modalidade, uma in-teração entre M e HN ou entre F e NP direciona o alvejamentode M e NP para o interior dos sítios de montagem na membranaplasmática.

III. Doenças Paramixovirais

A presente invenção não é limitada a NDV, sarampo,vírus parainfluenza 3 e doenças do paramixovírus sincicialrespiratório. Muitas outras doenças paramixovirais tambémestão no escopo desta invenção. Por exemplo, tanto doençashumanas (Veja Tabela 1) e doenças animais (Veja Tabela 2)são contempladas.

Tabela 1: Doenças Humanas Mediadas por Paramixovi-rus Suscetíveis a Vacinação VLP

<table>table see original document page 73</column></row><table><table>table see original document page 74</column></row><table>

Tabela 2: Doenças Animais Mediadas por Paramixoví-rus Suscetíveis a Vacinação VLP

<table>table see original document page 74</column></row><table>

A. Doença de Newcastle

O vírus da doença de Newcastle (NDV) é um patógenode aves. Há diferentes linhagens deste vírus que foram iso-ladas em muitas regiões do mundo. Algumas linhagens são avi-rulentas e são usadas como vacinas vivas atenuadas. Outrassão virulentas e ocasionam severas doenças sistêmicas empássaros, com uma alta taxa de mortalidade. Em virtude daameaça à indústria avicultora, o governo dos Estados Unidosclassificou linhagens virulentas do NDV como agentes de se-leção sob o Patriots Act.

A maior parte dos frangos nos Estados Unidos é va-cinada com uma linhagem avirulenta do NDV. Entretanto, a va-cina atual não é ideal. A vacina, um vírus vivo atenuado,infecta os frangos e causa uma suave doença respiratória. Emdecorrência disto, pássaros vacinados têm um menor peso cor-póreo e menor produção de ovos que pássaros não vacinados.Por este motivo, muitos outros países não vacinam contra oNDV. Assim, há surtos periódicos da doença nestes paísesforçando abate em massa de pássaros para conter a doença.Lotes de frangos vacinados também pode ser suscetíveis a al-gumas linhagens virulentas do NDV. Conseqüentemente, houvesurtos do vírus da doença de Newcastle nos Estados Unidos.Por exemplo, houve um surto do NDV na Califórnia em 2001-2002.

O que é necessário é uma vacina contra NDV que nãotenha conseqüências de produtividade negativas e que possainduzir uma faixa de proteção mais ampla do que as vacinasatualmente usadas.

Em pássaros, prova clínica do NDV inclui, mas semlimitações, os sistemas respiratório, neurológico e gastro-intestinal. Sinais clínicos que sugerem a doença de Newcas-tle são observados principalmente em pássaros jovens. Sinto-mas comuns incluem, mas sem limitações, incapacidade de an-dar ou voar, caminhada em círculos, paralisia, torcicolo,depressão, e alta freqüência de morte repentina. Em mamífe-ros, os sintomas da doença de Newcastle podem incluir, massem limitações, conjuntivite aguda.

Um problema significativo das vacinas contra o NDVatualmente utilizadas é uma falha em proteger de todas aslinhagens do NDV. Atualmente, vacinas inativadas contra oNDV (isto é, atenuadas) algumas vezes são usadas para vaci-nar lotes de pássaros. Embora eliminem os efeitos colateraisde uma vacinação com vírus vivo, estas vacinas ainda têm adesvantagem de que elas não estimulam um amplo espectro deimuno-respostas. Adicionalmente, a atenuação incompleta re-sulta em um percentual de pássaros vacinados contraindo adoença de Newcastle. Estas vacinas também são mais onerosasque modalidades contempladas pela presente invenção em fun-ção da maior manipulação exigida para a inativação e para omonitoramento da efetividade da inativação.

Um outro problema com as vacinas atualmente usa-das, tanto com vírus vivo quanto com vírus inativado, é queé difícil distinguir entre pássaros que foram vacinados eaqueles que foram infectados com um vírus selvagem. A pre-sente invenção contempla antígenos incorporados em uma pre-paração de VLP que compreende uma etiqueta de seqüência. Emuma modalidade, a etiqueta de seqüência pode ser detectadain vivo, desse modo, identificando um animal vacinado.

B. Sarampo

Acredita-se que sarampo seja uma infecção infantilcaracterizada por febre, tosse, coriza (isto é, por exemplo,uma infecção ou inflamação do trato respiratório superior)e, freqüentemente, conjuntivite seguida por uma erupção cu-tânea maculopapular. Observou-se que a severidade da doençavaria com a linhagem do vírus bem como com o estado de saúdedas crianças infectadas. Na maior parte das crianças, a re-cuperação é completa. Entretanto, há uma baixa incidência decomplicações neurológicas de severidade variada. Além domais, subnutrição ou uma outra doença encoberta pode aumen-tar significativamente a severidade da doença. Além do mais,a infecção é imunossupressora que resulta em maior susceti-bilidade da criança a outras infecções com risco de morte,particularmente, em um ambiente do terceiro mundo.

A vacina atualmente usada é um virus vivo atenuadoque é efetivo na geração de uma imuno-resposta protetora.Entretanto, a idade de imunização é problemática. A vacina-ção muito cedo resulta em uma fraca resposta dos anticorposem função dos anticorpos maternos. Aumentar a dose para su-perar estes efeitos resulta em imunossupressão e maior sus-cetibilidade a outras infecções com potencial risco de mor-te. A vacinação em uma idade posterior coloca o recém-nascido em risco de adquirir a doença antes da imunização,mas depois o nivel dos anticorpos maternos diminui. Assim,há uma necessidade de uma vacina que gere uma imuno-respostaefetiva diante do anticorpo material e, de forma mais impor-tante, uma vacina que não seja imunossupressora em nenhumadosagem. Em uma modalidade, a presente invenção contemplaque VLPs são candidatas para uma vacina como esta.

Certas modalidades da presente invenção provêempartículas semelhantes ao vírus (VLPs) as uma vacina segura,de amplo espectro e efetiva para proteger mamíferos de umvírus do Sarampo. Adicionalmente, estas modalidades provêemsistemas e protocolos para a produção em grande escala e e-conômica de uma vacina por VLP contra o sarampo (isto é, porexemplo, para ser usada como uma vacina, a produção de VLPdeve ser fácil e econômica).

A presente invenção contempla condições para a ge-ração de VLPs de uma linhagem do vírus do Sarampo. Em umaoutra modalidade, as VLPs compreendem os mesmos principaisantigenos como vírus infecciosos (mas, certamente, carecemdo genoma viral completo). Em uma outra modalidade, as VLPscompreendem os principais antigenos com as mesmas taxas queos vírus infecciosos. Em uma modalidade, os principais anti-genos são selecionados do grupo que compreende proteína nu-cleocapsídica, membrana/proteína matriz, proteína hemagluti-nina e proteína de fusão.

Outras modalidades da presente invenção provêemantigenos derivados de muitas linhagens diferentes do saram-po que podem ser incorporados em uma única preparação deVLP. Um problema significativo das vacinas contra o Sarampoatualmente utilizadas é uma falha em proteger de todas aslinhagens do sarampo.

Acredita-se que o sarampo seja uma enfermidade vi-ral altamente contagiosa com os sintomas primários incluin-do, mas sem limitações, febre, tosse, conjuntivite (isto é,vermelhidão e irritação nas membranas oculares) , e erupçãocutânea disseminada. A infecção viral pode ser disseminadapelo contato com gotículas do nariz, boca ou garganta de umapessoa infectada. No geral, período de incubação é de 8 a 12dias antes de os sintomas aparecerem.

A imunidade à doença ocorre depois da vacinação ouda infecção ativa. Atualmente, a vacinação é limitada ao ví-rus vivo atenuado que tem um risco significativo de causarsarampo no sujeito vacinado. Adicionalmente, acredita-se quea vacina Sarampo-Caxumba-Rubéola pode causar autismo. Antesda ampla imunização, o sarampo era tão comum durante a in-fância, que a maioria da população foi infectada até os 20anos. Os casos de sarampo diminuíram durante as últimas dé-cadas até virtualmente nenhum nos EUA e no Canadá em virtudeda ampla imunização, mas, atualmente as taxas estão aumen-tando. Portanto, a preocupação pública resulta em menorestaxas de vacinação que podem causar surtos de sarampo, ca-xumba e rubéola — o que pode ser sério. Uma vantagem de umamodalidade da presente invenção é que uma vacina contra sa-rampo por VLP não replicante não implica em nenhum risco deinfecção. Assim, espera-se que a vacina por VLP gere uma ta-xa de conformidade muito mais alta e, subseqüentemente, aocorrência do sarampo deve cair dramaticamente.

Em uma modalidade, os sintomas do sarampo incluem,mas sem limitações, dor de garganta, rinorréia, tosse, dormuscular, febre, olhos irritados e inflamados, pequenas man-chas brancas no interior da boca (chamadas de Manchas de Ko-plik), fotofobia (sensibilidade à luz), uma erupção cutâneaaparecendo perto do quinto dia da doença e durando de 4 - 7dias que, usualmente, inicia na cabeça e se difunde para ou-tras áreas progredindo para baixo (a erupção cutânea podeser uma erupção cutânea maculopapular que aparece tanto comomáculas (áreas chatas e descoloridas) e pápulas (áreas sóli-das, vermelhas e elevadas) que, posteriormente, se fundem(confluente)). Adicionalmente, a erupção cutânea pode coçar.

Não há tratamento específico contra o sarampo, em-bora algumas crianças possam exigir complementação com Vita-mina A. Os sintomas podem ser aliviados com repouso, parace-tamol e ar umedecido. 0 resultado possível é excelente emcasos não-complicados. Entretanto, pneumonia ou encefalitesão complicações possíveis.

C. Vírus Sincicial Respiratório

Acredita-se que o vírus sincicial respiratório(RSV) seja a única causa mais comum de hospitalização porinfecção respiratória de recém-nascidos e crianças novas portodo o mundo. A reinfecção também ocorre comumente. As taxasde ataque do RSV para todos as populações recém-nascido éestimada entre 100% e 83% e uma estimação de 50% destes pas-sa por duas ou mais infecções durante os dois primeiros anosde vida (revisado em Collins, et al, Respiratory SyncytialVirus, in Fields Virology, Ed. Knipe, D. and Howley, P. Lip-pincott Williams and Wilkins, 2001). RSV também é progressi-vamente reconhecido como um sério patógeno para os idosos.

Atualmente, não há vacina disponível para este pa-tógeno. Experiências preliminares com uma preparação de ví-rus inativado em formalina tiveram o desastroso efeito deaumentar a severidade da doença mediante exposição ao vírusvivo. Além do mais, vacinas de subunidade de proteína tive-ram um efeito similar em animais experimentais. Especula-seque proteínas em uma conformação anormal, tanto induzidaspor tratamento com formalina quanto por expressão e purifi-cação de proteínas individuais, resultaram em uma perda deepítopos que estimulou uma imuno-resposta protetora. Estudosem animais sugeriram que a imunopatologia foi em função dascélulas imunes (revisado em Collins, et al, RespiratorySyncytial Virus, in Fields Virology, Ed. Knipe, D. and Ho-wley, P. Lippincott Williams and Wilkins, 2001). Provável-mente, VLPs formadas com proteínas do RSV vão incorporarproteínas virais em suas conformações nativas. Estes imunó-genos têm o potencial de estimular uma imuno-resposta prote-tora e de evitar os efeitos contrários de proteínas não en-velopadas.

Certas modalidades da presente invenção provêempartículas semelhantes ao vírus (VLPs) como uma vacina segu-ra, de amplo espectro e efetiva para proteger mamíferos dovírus sincicial respiratório (RSV). Adicionalmente, estasmodalidades provêem sistemas e protocolos para a produção emgrande escala e econômica de vacinas por VLP contra o RSV(isto é, por exemplo, para ser usadas como uma vacina, aprodução de VLP deve ser fácil e econômica).

A presente invenção contempla condições para a ge-ração eficiente de VLPs de uma linhagem virulenta do RSV. Emuma outra modalidade, as VLPs compreendem os mesmos princi-pais antígenos dos vírus infecciosos. Em uma outra modalida-de, as VLPs compreendem os principais antígenos com as mes-mas taxas dos vírus infecciosos. Em uma modalidade, os prin-cipais antígenos são selecionados do grupo que compreendeproteína nucleocapsídica, membrana/proteína matriz, proteínaG ou de anexação e proteína de fusão.

Outras modalidades da presente invenção provêemantígenos derivados de muitas linhagens diferentes do RSVque podem ser incorporados em uma única preparação de VLP.Um problema significativo das vacinas contra o RSV atualmen-te utilizadas é uma falha em proteger de todas as linhagensdo RSV.Acredita-se que o vírus sincicial respiratório(RSV) seja um vírus muito comum que causa suaves sintomastipo resfriado adultos e crianças saudáveis mais velhas. ORSV pode causar sérias infecções respiratórias em bebês no-vos, especialmente, aqueles nascidos prematuramente, que têmdoenças cardíacas ou pulmonares, ou que são imunocomprometidos.

Acredita-se que o RSV seja o patógeno respiratóriomais comum em recém-nascidos e em crianças novas. Especifi-camente, acredita-se que o RSV infecte quase todos os recém-nascidos até a idade de dois anos. Surtos sazonais da enfer-midade respiratória aguda ocorrem a cada ano em uma escalaque é um tanto previsível em cada região. Tipicamente, atemporada começa no outono e vai até a primavera.

O RSV pode ser facilmente disseminado por contatofísico incluindo, mas sem limitações, toque, beijo e apertode mãos com um sujeito infectado. Embora não seja necessárioentender o mecanismo da invenção, acredita-se que, usualmen-te, a transmissão do RSV é por contato com secreções conta-minadas, o que pode envolver minúsculas gotículas ou objetosque as gotículas tocaram. O RSV pode viver por meia hora oumais na superfície da pele. Também acredita-se que o RSVtambém pode viver por até cinco horas em prateleiras e pordiversas horas em tecidos usados, conseqüentemente, freqüen-temente, o RSV se difunde muito rapidamente em arranjos do-mésticos cheios e em creches.

Em uma modalidade, a presente invenção contemplauma vacina por VLP contra o RSV que impede o desenvolvimentode doenças em recém-nascidos e adultos jovens tais como, massem limitações, pneumonia, bronquiolite (inflamação das pe-quenas vias aéreas dos pulmões) e traqueobronquite (laringi-te) . Em uma modalidade, a presente invenção contempla umavacina por VLP contra o RSV que impede o desenvolvimento deuma suave enfermidade respiratória em adultos saudáveis ecrianças mais velhas.

A falta de uma vacina contra RSV segura e efetivarepresenta um significativo risco de segurança e saúde pú-blica. Por exemplo, acredita-se que a cada ano até 125.000recém-nascidos são hospitalizados em função de severa doençado RSV; e cerca de 1-2% destes recém-nascidos morrem. Adi-cionalmente, recém-nascidos que: i) são nascidos prematura-mente; ii) sofrem de doença pulmonar crônica; iii) são imu-nocomprometidos; ou iv) são afligidos com certas formas dedoença cardíaca estão em maior risco de severa doença doRSV. Mesmo adultos que são expostos a fumaça de tabaco, cui-dam de creche, vivem em condições lotadas ou têm irmãos emidade escolar também estão em maior risco de contrair o RSV.

Em uma modalidade, a presente invenção contemplasintomas do RSV que incluem, mas sem limitações, congestãonasal, alargamento nasal, tosse, respiração rápida (taquip-néia), dificuldade respiratória ou respiração forçada, faltade ar, cianose (descoloração azulada de pele causada porfalta de oxigênio), ofegância, febre, ou tosse afônica (fre-qüentemente descrita como uma tosse "seal bark"). Percebe-seque os sintomas são variáveis e diferem com a idade. Por e-xemplo, recém-nascidos com menos de um ano de idade são maisseveramente afetados e, freqüentemente, têm a respiraçãomais problemática. Inversamente, usualmente, crianças maisvelhas têm somente suaves sintomas tipo resfriado. No geral,os sintomas aparecem usualmente 4-6 dias depois da exposi-ção.

Em virtude de não haver tratamento conhecido parauma infecção ativa do RSV, versados na técnica têm conside-rado medicamentos preventivos. Por exemplo, Synagis® (pali-vizumab) foi aprovado para a prevenção da doença do RSV emcrianças com menos de 24 meses de idade que estão em altorisco de séria doença do RSV. Entretanto, Synagis® deve serprescrito e dado como uma injeção mensal para prover prote-ção completa.

D. Parainfluenza 3 (PIV 3)

Acredita-se que PIV3 seja uma causa comum de doen-ça respiratória (rinite, faringite, laringite, bronquiolitee pneumonia). Este virus é a segunda causa mais comum de in-fecção respiratória em pacientes pediátricos hospitalizados.Nenhuma vacina está disponível para PIV 3. Inúmeras diferen-tes abordagens de vacinação foram consideradas, mas nenhumaresultou em uma vacina autorizada, (revisado em Chanock, etal, Parainfluenza Viruses, in Fields Virology, Ed. Knipe, D.and Howley, P. Lippincott Williams and Wilkins, 2001).

Fisiologicamente, usualmente, PIV 3 infecta ossistemas respiratórios superior e inferior. Atualmente, cin-co serótipos do vírus Parainfluenza são conhecidos (1, 2, 3,4a e 4b), todos os quais estão associados com a causa da do-ença. Acredita-se que crianças são altamente suscetíveis aoParainfluenza e ele pode ser responsável por aproximadamente40 porcento a 50 porcento de todos os casos de laringite, ede 10 porcento a 15 porcento de bronquiolite e bronquite ealgumas pneumonias. Na população geral, a incidência de pa-rainfluenza é desconhecida, mas suspeita-se que seja muitoalta. Enfermidade que causa somente uma rinorréia e sintomastipo resfriado pode passar como um simples resfriado em vezde parainfluenza. Fatores de risco incluem a juventude. Naidade escolar, a maior parte das crianças foi exposta ao vi-rus parainfluenza. A maior parte dos adultos tem anticorposcontra a parainfluenza, embora eles possam adquirir infec-ções repetidas.

Acredita-se que laringotraqueobronquite (isto é,por exemplo, laringite) seja uma manifestação clinica comumda infecção do virus parainfluenza. Virus parainfluenza sãoencontrados associados de forma incomum com outras infecçõesdo trato respiratório em crianças, tais como, traqueobron-quite, bronquiolite e broncopneumonia. Ocasionalmente, umasuave enfermidade não especifica é vista depois da infecçãodo virus parainfluenza. 0 virus parainfluenza produz doençapor todo o ano, mas o pico das taxas de prevalência ocorredurante os surtos de inverno das infecções do trato respira-tório, especialmente laringite, em crianças por todas as zo-nas temperadas dos hemisférios norte e sul. As infecções dovirus parainfluenza são, essencialmente, doenças infantis,as mais altas taxas de ataque especificas de idade para la-ringite ocorrem em crianças com menos de 3 anos. Infecçõesdo serótipo 3 ocorrem mais cedo e mais freqüentemente, então50% das crianças nos EUA são infectadas durante o primeiroano de vida e quase todas por volta dos 6 anos, como deter-minado pelos estudos seroepidemiológicos.

No geral, o virus parainfluenza entra em um hospe-deiro por meio da inalação de núcleos de goticula infecta-dos. A multiplicação do virus ocorre por toda a árvore tra-queobronquial induzindo a produção de muco. As cordas vocaisda laringe ficam excessivamente inchadas, ocasionando a obs-trução ao influxo de ar, o que é manifestado pelo estridorinspiratório. Em adultos, usualmente, o virus é limitado aocasionar inflamação nas partes superiores do trato respira-tório. Em recém-nascidos e crianças novas, o brônquio, bron-quiolos e pulmões são ocasionalmente envolvidos, o que poderefletir no pequeno tamanho das vias aéreas e na relativaimaturidade imunológica. Viremia não é nem uma fase essenci-al nem uma fase comum da infecção.

Tipicamente, crianças podem exibir uma tosse afô-nica, estridor inspiratório, voz ou grito roucos e dificul-dade respiratória na inspiração e, usualmente, são afebris.Cerca de 80% dos pacientes exibe tosse e rinorréia de 1 a 3dias antes do começo da tosse. Ronco respiratório é escutadofreqüentemente por todos os campos do pulmão. Usualmente, oexame radiológico é normal. Ocasionalmente, a epiglote ficaexcessivamente inchada e avermelhada. Severa obstrução dasvias aéreas pode suceder, necessitando de uma traqueotomiade emergência.

IV. Vacinas por VLPVacinas por VLP contra paramixovirus são inéditasna tecnologia. Embora vacinas virossômicas sejam conhecidas,estas vacinas exigem o rompimento de um vírus purificado,extraindo o genoma e remontando partículas com as proteínasvirais e os lipídios para formam proteínas virais que contêmpartículas de lipídio. Esta abordagem é muito onerosa. Tam-bém, uma vez que o material de início é vírus vivo, há umperigo de contaminação da vacina com vírus vivo. Além domais, provavelmente, a vacina resultante não é uma vacina deamplo espectro. Além do mais, a imuno-resposta a esta vacinanão pode ser distinguida de uma infecção viral.

Acredita-se que VLPs do paramixovirus sejam um ti-po altamente efetivo de vacina de subunidade que imita a es-trutura geral do -vírus sem conter material genético que re-sulta na infecção da célula hospedeira. Por exemplo, umapartícula semelhante ao vírus pode carecer completamente dogenoma do DNA ou do RNA ao mesmo tempo em que mantém a au-têntica conformação de proteínas capsídicas virais. Conse-qüentemente, a VLP é não infecciosa. Adicionalmente, umapartícula semelhante ao vírus que compreende proteínas cap-sídicas virais pode passar por automontagem espontânea simi-lar aos vírus autênticos. Entretanto, sabe-se que prepara-ções de VLP de poliomavírus estão entre as menos desenvolvi-das da tecnologia. Noad et al., "Virus-like particles as im-munogens" TrendsMicrobiol 11:438-444 (2003).

Em uma modalidade, a presente invenção contemplauma vacina que compreende uma VLP do paramixovirus. Em umamodalidade, o paramixovirus é selecionado do grupo que in-clui, mas sem limitações, doença de Newcastle, sarampo, ví-rus parainfluenza 3 ou vírus sincicial respiratório. Em umamodalidade, a VLP compreende uma proteína M. Em uma outramodalidade, a VLP compreende adicionalmente pelo menos duasglicoproteínas. Em uma modalidade, as glicoproteínas são se-lecionadas do grupo que consiste em proteína F e proteínaHN.

A. Vírus da Doença de Newcastle

Certas modalidades da presente invenção provêempartículas semelhantes ao vírus (VLPs) como uma vacina segu-ra, de amplo espectro e efetiva para proteger aves do vírusda doença de Newcastle. Adicionalmente, estas modalidadesprovêem sistemas e protocolos para a produção em grande es-cala e econômica de VLPs (isto é, por exemplo, para ser usa-da como uma vacina, a produção de VLP deve ser fácil e eco-nômica).

Uma comparação de mancha prateada do vírus comple-to (Bl) crescido em ovos é comparada com as VLPs crescidasem cultura em tecido em grande escala e demonstra que asVLPs podem ser produzidas em quantidades medidas em micro-gramas (isto é, suficiente para teste de imunogenicidade emcamundongos). Veja a Figura 74. VLPs foram rapidamente puri-ficadas a partir de grandes quantidades de meio para facili-tar as técnicas de produção de VLP em grande escala de. Vejaa Tabela 3.

Tabela 3: Preparações de VLP em Grande escala<table>table see original document page 89</column></row><table>

A preparação 1 foi contaminada com albumina, queco-migra com a proteína F. Portanto, as quantidades de F naPreparação 1 parecem aumentadas se comparado com NP. Estacontaminação com albumina foi eliminada com sucesso nas Pre-parações 2 & 3.

Embora não seja necessário entender o mecanismo dainvenção, acredita-se que vírus (Bl) crescido em ovos (comoé padrão na tecnologia) seja deficiente nas glicoproteínasHN e F (típico de partículas virais avirulentas (AV)), dife-rente dos métodos de produção de VLP atualmente divulgadosnos quais a VLP do vírus (AV) compreende glicoproteínas HN eF. Em uma modalidade, a presente invenção contempla uma me-lhor vacina que compreende um VLP DA NVD compreendendo gli-coproteínas HN e F.

A expressão protéica da subunidade do NDV foi re-latada na tecnologia. Por exemplo, exame por microscopia e-letrônica de fluidos extracelulares negativamente manchados(ECF) de culturas celulares de Spodoptera frugiperda infec-tadas com um baculovírus recombinante que expressa a hema-glutinina-neuraminidase (HN) do vírus da doença de Newcastle(NDV) revelou envelopes tipo NDV que se parecem com os enve-lopes do NDV autêntico. Mancha Immunogold com anticorpos mo-noclonais HN anti-NDV demonstrou antígeno HN em pontas dosenvelopes tipo NDV. 0 ECF das culturas infectadas com recom-binante também continha partículas do baculovírus que se pa-recem com as partículas padrão do baculovírus, exceto pelofato de que algumas mostraram projeções polares do envelope.Diferente das modalidades contempladas na presente invenção,concluiu-se que HN do NDV, na ausência da proteína matriz(isto é, proteína Μ), pode ser capaz de iniciar e controlara produção de envelopes virais que são morfologicamente i-dênticos àqueles do NDV autêntico. Nagy et al., "Synthesisof Newcastle disease vírus (NDV)-like envelopes in insectcells infected with a recombinant baculovirus expressing thehaemagglutinin-neuraminidase of NDV" J Gen Virol. 72:753-756(1991).

Em uma modalidade, a presente invenção contemplaum método que compreende uma vacina por VLP contra NDV co-mercialmente usada. Em uma modalidade, a produção de uma va-cina por VLP contra NDV é econômica e eficiente. Em uma ou-tra modalidade, a imunização com uma vacina por VLP contraNDV estimula a produção de um amplo espectro de anticorposprotetores. Em uma modalidade, uma linhagem celular de aveexpressa continuamente pelo menos quatro glicoproteínas doNDV.

Em uma modalidade, a presente invenção contemplaum método para produzir vacinas por VLP contra NDV em umsistema de expressão temporária. Em uma modalidade, o siste-ma compreende células de aves transfectadas com ácido nu-cléico (por exemplo, em plasmídeos, vetores de expressão,etc.) que codificam pelo menos uma glicoproteína viral doNDV. Em uma modalidade, o sistema compreende uma linhagemcelular de ave com seleção de genes virais como parte docromossomo celular de ave, em que o gene viral incorporadolibera continuamente partículas VLP do NDV usadas para vaci-nas. Em uma modalidade, o gene viral compreende uma glico-proteína viral. Em uma modalidade, a glicoproteína viral éselecionada do grupo que compreende proteína NP, proteína M,proteína F-K115Q ou proteína HN.Em uma modalidade, a presente invenção contemplaum método para gerar VLPs que compreendem antigenos paramuitas diferentes linhagens do NDV. Embora não seja necessá-rio entender o mecanismo da invenção, acredita-se que umavacina contra NDV integrada confira uma faixa de proteçãomais ampla do que aquela gerada pelas vacinas atuais. Em umamodalidade, a presente invenção contempla um sistema de ex-pressão de vacina por VLP que compreende um primeiro DNAcque codifica um primeiro gene de proteína viral de uma pri-meira linhagem; um segundo DNAc que codifica um segundo genede proteína viral de uma segunda linhagem; e um terceiroDNAc que codifica um terceiro gene de proteína viral de umaterceira linhagem. Em uma modalidade, o primeiro gene deproteína viral é selecionado do grupo que compreende proteí-na HN, proteína F, proteína NP ou proteína M. Em uma modali-dade, a primeira linhagem é selecionada do grupo que compre-ende linhagem Hertz, linhagem AV ou linhagem BI. Em uma mo-dalidade, o segundo gene de proteína viral é selecionado dogrupo que compreende proteína HN, proteína F, proteína NP ouproteína M. Em uma modalidade, a segunda linhagem é selecio-nada do grupo que compreende linhagem Hertz, linhagem AV oulinhagem BI. Em uma modalidade, o terceiro gene de proteínaviral é selecionado do grupo que compreende proteína HN,proteína F, proteína NP ou proteína M. Em uma modalidade, aterceira linhagem é selecionada do grupo que compreende li-nhagem Hertz, linhagem AV ou linhagem BI. Em uma modalidade,a presente invenção contempla um método para detectar um ge-ne de proteína viral incorporado em uma vacina por VLP quecompreende colocar o gene de proteína viral em contato comanticorpos de linhagem específica ou etiquetas de seqüênciaincorporadas.

Em uma modalidade, a presente invenção contemplaum método que compreende um sistema de expressão de baculo-vírus que produz vacinas por VLP contra NDV. Embora não sejanecessário entender o mecanismo da invenção, acredita-se queos sistemas de expressão de baculovírus sejam capazes dosmais altos níveis de expressão de uma proteína de todos ossistemas de expressão disponíveis. Em uma modalidade, umsistema de expressão de baculovírus produz miligramas da va-cina por VLP. Em uma modalidade, um vetor de expressão debaculovírus codifica uma vacina por VLP contra NDV. Em umamodalidade, uma célula de inseto é transfectada com um sis-tema de expressão de baculovírus que codifica uma vacina porVLP contra NDV. Em uma modalidade, um vetor de baculovíruscompreende pelo menos quatro proteínas estruturais do NDV.Para que uma VLP seja um candidato a vacina realístico, elaprecisa ser produzida em um sistema de expressão seguro queé receptivo à produção em grande escala. Um sistema de pro-dução de proteína com base em célula de inseto tem muitasvantagens para a produção de VLP. A primeira é que grandesquantidades de proteínas recombinantes podem ser produzidasem condições de cultura celular de alta densidade em célulaseucarióticas, resultando em alta recuperação de antígenoscorretamente envelopados. Segundo, já que as células de in-setos usadas para a produção da vacina podem ser cultivadassem complementos derivados de célula de mamífero, o risco decultivar patógenos oportunistas é minimizado. Terceiro, obaculovirus usado para a expressão protéica recombinante temuma estreita faixa de hospedeiro que inclui somente umaspoucas espécies de Lepidoptera e, portanto, não representaameaça a indivíduos vacinados. Quarto, baculovirus é facil-mente inativado por tratamento químico simples e é localiza-do, principalmente, no núcleo e no meio de cultura de prepa-rações de célula de inseto, por enquanto que a maior partedas VLPs são purificadas a partir de extratos citoplásmicos.Finalmente, o sistema de baculovirus pode ser aumentado paraprodução em grande escala da vacina.

B. Sarampo

Em uma modalidade, a presente invenção contemplauma vacina contra sarampo que compreende uma partícula seme-lhante ao vírus do Sarampo em que a dita partícula compreen-de uma Proteína matriz do sarampo. Em uma modalidade, a va-cina compreende adicionalmente pelo menos duas glicoproteí-nas do sarampo.

O uso de vacinas por VLP foi proposto para o vírusparamixovírus do sarampo, mas somente a produção de VLP doretrovírus HIV foi demonstrada em células de levedura. Mori-kawa Y., "Virus-like micrograins and process of producingthe same" United States Patent Application Publ. No.20040009193 (2004). Esta técnica proposta é limitada à ex-pressão de VLP em células de bactérias eucarióticas e nãosugere nem técnicas de cultura celular em baculovirus nem emmamífero. Adicionalmente, não há demonstração de que vacinaspor VLP eucarióticas sejam, de fato, seguras e efetivas. Deforma mais importante, as vacinas por VLP contra o Sarampode Morikawa baseiam-se na gemulação tipo IV descrito por Ga-roff et al., supra:. Algumas modalidades aqui descritas de-monstram claramente que o núcleo do ácido ribonucléico não éexigido para a gemulação do paramixovirus, como Garoff etal. preceituam.

Uma outra abordagem sugerida usada para o desen-volvimento de uma vacina contra o paramixovirus do sarampoenvolve técnicas de terapia genética pela administração deuma vacina de DNA. Robinson et al., "Compositions and meth-ods for generating an immune response" United States PatentApplication Publ. No. 20040105871 (2004). Esta técnica foidemonstrada pela transfecção estável de um genoma hospedeirocom um cassete de expressão que compreende uma vacina de DNApor VLP contra HIV. Veja também, Mazzara et al. , "Self as-sembled, defective, nonself-propagating viral particles" U-nited States Patent No. 5,804, 196 (1998)(aqui incorporadapela referência).

Uma abordagem de terapia genética alternativa su-gere incorporar virus vivo atenuado de sarampo em um vetorde expressão para produzir uma vacina, tanto in vivo quantoin vitro. Entretanto, VLPs não são contempladas pelas vaci-nas contra o virus do sarampo. Herold J., "SARS-coronavirusvirus Iike particles and methods of use" United States Pat-ent Application Publ. No. 20050002953 (2005).

C. Virus Sincicial Respiratório

Em uma modalidade, a presente invenção contemplauma vacina contra o virus sincicial respiratório que compre-ende uma partícula semelhante ao vírus sincicial respirató-rio em que a dita partícula compreende uma proteína matrizdo vírus sincicial respiratório. Em uma modalidade, a vacinacompreende adicionalmente pelo menos duas glicoproteínas dovírus sincicial respiratório.

As VLPs foram divulgadas para a produção e uso devacinas relacionadas ao HIV. A propósito, sugere-se que mui-tos outros vírus (isto é, vírus sincicial respiratório e ví-rus do Sarampo) também podem ser compatíveis com a tecnolo-gia divulgada. Entretanto, nenhum detalhe é apresentado parasuportar estas especulações. Barnett et al. , Expression ofHIV polypeptides and production of virus-like particles" U-nited States Patent No. 6,602,705 (2003).

Também sugeriu-se que pode ser possível produzirvacinas por VLP contra o vírus sincicial respiratório de umamaneira idêntica às VLPs da Língua Azul que compreendem osgenes VP3, VP7, VP2 e VP5. Ermak et al., "Oral immunizationwith multiple particulate antigen delivery system" UnitedStates Patent No. 5,690,938 (1997) (aqui incorporada pelareferência). À parte desta menção resumida, Ermak não provênenhuma informação técnica em relação ao paramixovírus, e élimitado ao gênero Orbivirus (família Reoviridae) .

Existe a hipótese de que respostas de linfócitocitotóxico in vivo em camundongo (isto é, uma resposta deimunização) ocorrem depois da exposição a glicoproteína deenvelope HIV-I-IIIB gpl60 recombinante complexada em micro-esferas e administrada como uma vacina. Rock, K. L., "Compo-sitions and methods for inducing cytotoxic T lymphocyte re-sponses by immunization with protein antigens" Patente Esta-dos Unidos 6.328.972 (2001). Rock sugere que VLPs com antí-genos tanto do vírus sincicial respiratório quanto do vírusdo Sarampo também podem estimular estes linfócitos citotóxi-cos para gerar uma imuno-resposta. Entretanto, não há dis-cussão sobre nenhum detalhe técnico nem expectativas de su-cesso considerando esta abordagem. De fato, Rock não mostrounenhum dado relevante em relação às vacinas por VLP para ne-nhum antígeno.

D. Vírus Parainfluenza 3

Em uma modalidade, a presente invenção contemplauma vacina contra o vírus parainfluenza 3 que compreende umapartícula semelhante ao vírus parainfluenza 3 em que dita apartícula compreende uma proteína matriz do vírus parainflu-enza 3. Em uma modalidade, a vacina compreende adicionalmen-te pelo menos duas glicoproteínas do parainfluenza 3.

E. Melhoria das Vacinas por VLP

Vacina ou composições de tratamento da invençãopodem ser administradas parenteralmente, por injeção, porexemplo, tanto subcutaneamente quanto intramuscularmente.Formulações adicionais que são adequadas para outros modosde administração incluem supositórios e, em alguns casos,formulações orais ou formulações adequadas para distribuiçãocomo aerossóis. Formulações orais incluem excipientes nor-malmente empregado tais como, por exemplo, graus farmacêuti-cos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, saca-rina sódica, celulose, carbonato de magnésio e semelhantes.Estas composições tomam a forma de soluções, suspensões,comprimidos, pílulas, cápsulas, formulações de liberaçãoprolongada ou pós, e contêm 10%-95% de ingrediente ativo,preferivelmente, 25-70%.

No caso de formulações orais, a manipulação desubconjuntos de células T que empregam adjuvantes, empacota-mento de antígeno ou a adição de citocinas individuais emvárias formulações, pode resultar em melhores vacinas oraiscom imuno-respostas otimizadas.

1. Adjuvantes

A presente invenção contempla adicionalmente a i-munização com ou sem adjuvante. Em uma modalidade, a presen-te invenção contempla uma co-administração de uma vacina porVLP contra paramixovírus e um adjuvante em que a imuno-resposta resultante é melhorada. Se adjuvante for usado, nãopretende-se que a presente invenção seja limitada a nenhumtipo de adjuvante em particular ou que o mesmo adjuvante,uma vez usado, seja usado por todo o tempo. Embora a presen-te invenção contemple todos os tipos de adjuvante, quer usa-dos separadamente quer em combinações, o uso preferido deadjuvante é o uso de adjuvante de Freund Completo seguidoalgum tempo depois por adjuvante de Freund Incompleto. Umoutro uso preferido de adjuvante é o uso de adjuvante Gerbu(GMDP; C.C. Biotech Corp.). A invenção também contempla ouso de adjuvante RIBI fowl (MPL; RIBI Immunochemical Resear-ch, Inc.). Outros adjuvantes incluem, mas sem limitações,alume de potássio, fosfato de alumínio, hidróxido de alumí-nio, QS21 (Cambridge Biotech), adjuvante Titer Max (CytRx)ou adjuvante Quil A.2. Citocinas

Em uma modalidade, a presente invenção contemplauma co-administração de uma vacina por VLP contra paramixo-virus e uma citocina em que a imuno-resposta resultante émelhorada. Embora não seja necessário entender o mecanismoda invenção, acredita-se que citocinas podem modular a pro-liferação, crescimento e diferenciação de células tronco he-matopoiéticas que, em última análise, produzem anticorposrelacionados à vacina. Em uma modalidade, uma citocina podeser selecionada do grupo que compreende interleucina-12 (IL-12), fator de estimulação de colônia granulócito-macrófago(GM-CSF), interleucina-β (IL-6), interleucina-18 (IL-18),alfa, beta, ou gamainterferona (α,β,γ-EFN) ou quimiocinas.Citocinas especialmente preferidas incluem IL-12 e GM-CSF.

As citocinas podem ser usadas em várias combinações para fa-zer ajuste fino da resposta do sistema imunológico de um a-nimal, incluindo tanto respostas do anticorpo quanto do Iin-fócito T citotóxico, para revelar o nivel especifico de res-posta necessário para controlar ou eliminar uma infecção pa-ramixoviral.

V. Sistemas de Expressão da Vacina por VLP

Em uma modalidade, a presente invenção contemplamétodos para produzir vacinas por VLP economicamente e emaltas taxas de produção. Em uma modalidade, a presente in-venção contempla um método que compreende transfectar umacultura celular com um vetor de expressão do ácido nucléicoque compreende um cassete de vacina por VLP contra o parami-xovirus. Em uma modalidade, a cultura celular compreende cé-lulas de aves (isto é, por exemplo, células ELL-0) . Em umamodalidade, a cultura celular compreende um vírus (isto é,por exemplo, baculovírus).

A. Sistemas de Expressão Contínuos de Cultura Ce-lular de Ave

Em uma modalidade, a presente invenção contemplaum método que compreende expressar proteínas paramixoviraisusando uma cultura celular de ave (isto é, por exemplo, cul-tura celular ELL-0). Em uma modalidade, a cultura celularexpressa continuamente as proteínas. Em uma modalidade, asproteínas paramixovirais são selecionadas do grupo que in-clui, mas sem limitações, proteína viral da doença de New-castle, proteínas do vírus do Sarampo, vírus parainfluenza 3ou proteínas do vírus sincicial respiratório. Em uma modali-dade, as proteínas paramixovirais são selecionadas do grupoque inclui, mas sem limitações, proteínas matriz (M), prote-ínas nucleocapsídicas (NP), proteínas de fusão (F), ou pro-teínas hemaglutinina-neuraminidase (NM) (e combinações des-tas).

Para gerar linhagem de células de ave que expres-sam proteínas paramixovirais, é útil integrar os genes vi-rais em um cromossomo de célula de ave. 0 uso de vetores doretrovírus é uma abordagem usada para realizar esta integra-ção. As células de aves podem ser infectadas com um retroví-rus que contém um gene do paramixovírus e, como parte do ci-clo de replicação do retrovírus, o genoma do retrovírus como gene do paramixovírus irá integrar em um cromossomo da cé-lula. Quatro linhagens de célula de ave serão feitas: i) cé-lulas de ave que expressam proteínas M, NP, F e HN; ii) cé-lulas de ave que expressam M, NP e F; iii) células de aveque expressam proteínas M, NP e HN; e iv) células de ave queexpressam proteínas M, HN e F.

O vetor do retrovírus pode ser construído de ma-neira tal que o vetor seja incapaz de direcionar a formaçãode nova progênie de retrovírus nas células de aves (isto é,não-replicabilidade). A abordagem geral para tais estudos écomo segue. Os genes do paramixovírus são clonados em um ve-tor com as extremidades do retrovírus (LTRs) e o sinal deempacotamento. Entretanto, este vetor é incompetente parareplicação em função da falta de genes essenciais para aque-le processo (isto é, por exemplo, gag ou pol).

O vetor DNA é transfectado em uma linhagem celularempacotada (isto é, por exemplo, GP-293), uma linhagem celu-lar que expressa as proteínas estruturais retrovirais; gag,pol, e env. Um outro DNA que codifica a proteína G do vírusda estomatite vesicular (VSV) (isto é, por exemplo, pVSV-G)também é transfectado com o vetor. Então, estas células re-plicam vetores do retrovírus e empacotam os vetores RNA emum envelope com a proteína env bem como com a proteína G VSV(chamado de um pseudotipo). Estas células liberam partículasque são então purificadas e usadas para infectar células deaves. A presença da proteína G VSV permite que estas partí-culas iniciem a infecção nas células de aves e expanda afaixa de hospedeiro do retrovírus.

Depois da transfecção, o vetor RNA é convertido emDNA que então é integrado mo cromossomo da célula de ave. Emvirtude de as células de aves não estar expressando gag oupol, a infecção retroviral não prossegue e nenhuma progêniede vírus é liberada. Assim, as células de aves transfectadasexpressam continuamente os genes paramixovirais integrados,mas não genes do retrovírus.

Este protocolo será repetido para integrar seqüen-cialmente cada uma das quatro proteínas do paramixovírus. Aslinhagens celulares serão caracterizadas para expressão dosgenes do paramixoví rus e a liberação de VLPs destas linha-gens celulares será verificada.

Vetores e linhagens celulares empacotadas (sistemade expressão de retrovírus pantrópico) para realizar estasetapas são disponíveis por Clontech (BD Biosciences Clonte-ch). Além do mais, há um vetor (vetor Q) disponível que éconstruído para que a transcrição do gene alvo seja acionadapor um promotor interno, uma vez que um cassete de expressãoé integrado no genoma da célula de ave. Os vetores Q reduzema probabilidade de que seqüências de células localizadas ad-jacentes ao sítio de integração do vetor interfiram na ex-pressão do gene do paramixovírus ou que estas seqüências se-jam anormalmente expressas em função da proximidade com oLTR retroviral.

B. Sistema de Expressão de Baculovirus

Em uma modalidade, a presente invenção pode serpraticada usando o sistema BacVetor® (Novagen). Este sistemausa o baculovírus vírus poliedrose nuclear Autographa cali-fornica (AcNPV) que contém genes inseridos para expressarproteínas em uma linhagem celular de inseto (isto é, por e-xemplo, Sf9) . Veja a figura 30. A presente invenção não élimitada a um método de integração de genes alvos no genomado AcNPV. Inúmeros diferentes plasmídeos de transferênciapodem ser usados. Por exemplo, co-transfectando células comDNA do AcNPV e com o plasmideo de transferência, virus podemser isolados para ter os genes inseridos no genoma do viruspor recombinação homóloga (isto é, por exemplo, usando Bac-Vetor® Triple Cut Virus DNA, Novagen). Veja a figura 28. Emuma modalidade, gene alvos (isto é, por exemplo, proteínasde partícula viral do NDV, sarampo, vírus parainfluenza 3 oudo vírus sincicial respiratório) podem ser clonados em umplasmideo de transferência pBAC para produzir vetores do ba-culovírus recombinantes. Em uma modalidade, a recombinaçãopode compreender uma técnica de clonagem independente de Ii-gação (LIC). Veja a figura 29. Por exemplo, um plasmideo detransferência pBAC/pBACgus-2cp LIC pode codificar um peptí-deo His-Tag e S-Tag à montante com um sítio de clivagem en-teroquinase (ek). A recombinação é facilitada por seqüênciasde iniciador que compreendem: fita sentido, 5' a ATG:GACGAC GACAAG (SEQ ID NO:89); fita anti-sentido, 5' a TTA:GAGGAGAAGCCCGG (SEQ ID NO:90).

Mediante a transfecção, o DNA BacVetor® não iráproduzir vírus a menos que haja um evento de recombinaçãoentre o DNA viral e o plasmideo de transferência; isto é,uma recombinação que repara o DNA viral circular exigido pa-ra replicação. Em uma modalidade, o plasmideo de transferên-cia compreende pBAC4x-l (Novagen). Veja a figura 31. Emboranão seja necessário entender o mecanismo da invenção, acre-dita-se que pBAC4x-l seja construído de maneira tal que atéquatro (4) genes podem ser inseridos em um único plasmídeoe, portanto, um único AcNPV. Também acredita-se que cada ge-ne seja expressado usando tanto o promotor polh quanto opromotor plO. Estes são promotores que podem resultar em ní-veis de expressão protéica muito altos entre 24-72 horaspós-infecção. O vetor de transferência pBAC4x-l foi projeta-do para expressão de complexos protéicos multi sub-unidade eé capaz de expressar os genes NDV M, NP, HN, e F tanto iso-ladamente quanto em alguma combinação.

Subseqüente à co-transformação usando um plasmídeode transferência e DNA de vírus, as células infectadas (istoé, por exemplo, Sf9) formam placas e expressam partículasvirais. Então, estas placas são isoladas, em que as partícu-las virais expressas são purificadas e caracterizadas para aexpressão de gene protéico inserido. Em uma modalidade, apresente invenção contempla uma célula infectada que expres-sa partículas virais que compreendem genes virais do NDV,sarampo, vírus parainfluenza 3 ou do vírus sincicial respi-ratório, em que a célula foi transformada com plasmídeo detransferência do baculovírus. Em uma modalidade, a expressãoé caracterizada por condições e tempos de expressão ideaispara suportar preparação de VLP em grande escala.

Células AcNPV infectadas são conhecidas por produ-zir quantidades extremamente altas dos principais produtosgenéticos muito atrasados; poliedrina (polh) e plO; 40-50%da proteína celular total consiste nestes dois produtos ge-néticos no fim do ciclo de infecção. Bem depois da infecção(isto é, ocorrendo depois da fase de gemulação e liberação),tanto em cultura de insetos quanto em tecido, uma ampla mai-oria da atividade transcricional da célula é dedicada aospromotores polh e plO, o que os torna ideal para uso paraacionar a expressão em alto nivel de genes alvos introduzi-dos que substituem estes genes virais. Produções de até 100mg de proteína alvo por IO9 células podem ser obtidas.

A conveniência de sistemas de expressão baculovi-rais melhorou desenvolvendo vírus com sítios de restriçãoBsu36 I posicionados em um gene essencial (isto é, por exem-plo, ORF 1629) à jusante do poliedrina gene AcNPV e no ORF603 à montante de maneira tal que a digestão libere um frag-mento contendo uma seqüência necessária para crescimento dovírus. Kitts et al., BioTechniques 14:810-817 (1993). Quandoas células de insetos são co-transfectadas com um plasmídeode transferência recombinante apropriado e DNA de vírus comcorte Bsu36 I, a seqüência ORF 1629 necessária é fornecidapelo plasmídeo de transferência por meio de recombinação ho-móloga. A ampla maioria das progênies de vírus derivadasdestas co-transfecções contém o vírus reparado com o genealvo, assim, minimizando a necessidade de examinar e multi-plicar recombinantes de purificação de placa. Alternativa-mente, outros sistemas de expressão baculovirais utilizamoutros genes essenciais. Por exemplo, os vírus progenitorBacVector-1000® e BacVector-2000® dos quais os BacVector-1000 e -2000 Triple Cut Virus DNAs® de alta eficiência sãopreparados para co-transfecções têm o gene IacZ (β-galactosidase) no lugar do gene poliedrina AcNPV. Estes re-combinantes negativos lacZ podem ser distinguidos facilmentede qualquer virus parental residual, que são visualizadoscomo placas azuis quando manchados com X-Gal.

Recombinantes LacZ formam placas claras no mancha-mento com X-GaI, uma vez que o gene alvo substitui IacZquando o plasmideo de transferência recombina com o genomaviral. Um terceiro sitio Bsu36 I no gene lacZ reduz adicio-nalmente a probabilidade de reformar o virus parental. Naprática e em condições ideais, a tecnologia de transfecçãode baculovirus comercialmente disponível produz placas quesão aproximadamente > 95% recombinante.

A recente elucidação da seqüência completa do ge-noma 133.894bp AcNPV revelou um total de cerca de 154 poten-ciais genes. Veja a figura 30. Um grande número destes genesé desnecessário para o crescimento do vírus em cultura emtecido. Estes genes não essenciais são conhecidos por compe-tir com genes alvos por recursos da célula e podem ser dano-sos à expressão de alguns produtos genéticos. É preferívelusar um sistema de expressão de baculovirus em que genes nãoessenciais competidores foram deletados.

Em uma modalidade, a presente invenção contemplausar plasmídeos de transferência pBAC projetados para a ex-pressão de proteína alvos (isto é, por exemplo, proteínasvirais do NDV, sarampo, vírus parainfluenza 3, ou do vírussincicial respiratório). Diversos potenciais plasmídeos detransferência pBAC são mostrados na figura 31. Por exemplo,duas espinhas dorsais vetores (mostradas no topo) diferemsomente pela presença do gene β-glucuronidase (gus) relatoracionado pelo promotor p6.9 (isto é, por exemplo, a sériepBACgus). Em virtude de o gene gus e P6.9 ser carreados como gene alvo para o interior do genoma do baculovírus, recom-binantes produzem β-glucuronidase e podem ser identificadospor manchamento com X-gluc. Os plasmídeos de transferênciacorrespondentes sem o gene indicador gus são cerca de 2kbpmenores e podem produzir eficiências de clonagem mais altascom alguns insertos maiores.

Adicionalmente, vetores LIC incluindo, mas sem Ii-mitações, plasmídeos pBAC-2cp e pBACgus-2cp são prontos paraanelamento com insertos devidamente preparados. Veja a figu-ra 31. Na prática, uma seqüência alvo é gerada por PCR usan-do iniciadores estendidos com seqüências definidas. Veja afigura 29. Por exemplo, extremidades coesivas compatíveiscom o vetor (13 e 14bp nas seqüências de codificação N- e C-terminal, respectivamente) são produzidas por tratamento comT4 DNA polimerase na presença de ATPd. A atividade exonucle-ase 3'-5' da enzima digere uma fita do duplex até que um re-síduo dT seja encontrado na fita complementar, após o que odA disponível é adicionado pela atividade polimerase. Asla-nidis et al. , Nucleic Acids Res. 18:6069-6074 (1990). O in-serto tratado e o plasmídeo de transferência pBAC LIC sãoresumidamente anelados, e a mistura transformada em CélulasCompetentes NovaBlue.

Os vetores preparados permitem a fusão dos genesalvos na posição mais desejável em relação ao sítio de cli-vagem enteroquinase seguinte às seqüências de fusão His-Tage S-Tag. Insertos podem ser colocados de maneira tal que se-qüências codificadas por vetor possam ser completamente re-movidas por clivagem com enteroquinase. Veja a figura 29.Além do mais, a configuração dos sítios de restrição em re-gião de clonagem múltipla permite a direta subclonagem deinsertos a partir de muitos vetores bacterianos pET em plas-mídeos série pBAC-1 ou -2. A seqüência His-Tag pode ser in-corporada, por exemplo, nos vetores pBAC-1 ou -2 e codificarum intervalo consecutivo de 6 histidinas. Alternativamente,uma seqüência S-Tag codifica um domínio 15 AA de ribonuclea-se A, que tem uma forte afinidade com a proteína 104 AA S-.Richards et al. , In: The Enzymes, Vol. IV (Boyer, P.D.,Ed.), pp. 647-806, Academic Press, New York (1971). Esta in-teração proteína-proteína altamente específica forma a basepara a sensível detecção das proteínas de fusão com conjuga-dos de molécula S-proteína-relatora. A detecção quimiolumi-nescente das proteínas de fusão S-Tag pode ser observada u-sando um conjugado proteína S HRP e substrato SuperSignal™CL-HRP, (S-Tag Rapid Assay Kit, Novagen).

Os vetores pBAC4x são projetados para co-expressãode até 4 genes na mesma célula. Estes vetores são extrema-mente usados para a expressão de proteínas multi subunidade,múltiplas cópias de um gene, complexos multiproteína e paraestudos de interações proteína-proteína. Weyer et al. , J.Gen. Virol. 72:2967-2974 (1991); Belyaev et al., Nucleic Ac-ids Res. 21:1219-1223 (1993); e Belyaev et al., Gene156:229-233 (1995).

Sabe-se que a tecnologia de expressão baculoviralpode ser desenvolvida em um sistema de exibição de vírus eu-cariótico. Boublik et al. , Bio/Technology 13:1079-1084(1995). Construindo apropriadamente a principal glicoproteí-na de superfície AcNPV (isto é, por exemplo, gp64) proteínasfuncionais, incluindo glicoproteínas, pode ser expressas nasuperfície do vírus. Um plasmídeo de transferência pBACsurf-1 pode ser projetado para inserção na estrutura de genes al-vos entre a seqüência de sinal gp64 e a seqüência de codifi-cação de proteína madura, sob o controle do promotor polh.Veja a figura 31. Com este sistema, é possível construir eanalisar bibliotecas de vírus de proteínas complexas em re-lação a características funcionais desejadas.

Em uma modalidade, a presente invenção contempla ouso de tecnologia de expressão de baculovírus para infectaruma cultura celular Sf9 de inseto para expressar proteínasvirais do NDV, sarampo, vírus parainfluenza 3 ou vírus sin-cicial respiratório. Estas células podem ser adaptadas paramonocamada, suspensão ou cultura de fermentação com soro ousem soro, e prontas para infecção direta, transfecção e en-saio de placa.

Extratos de células Sf9 infectadas e não infecta-das com AcNPV tipo selvagem são usadas para bloquear ligaçãonão específica de anticorpos e outros reagentes a vírus eproteínas de células de insetos. Os extratos também são usa-dos para correr os controles negativos em Western blots,ELISA, ensaios de ligação ou ensaios enzimáticos nos quaisas proteínas alvos são analisadas em lisatos celulares.

Em uma modalidade, a presente invenção contemplauma vacina por VLP que compreende proteínas de diferenteslinhagens de paramixovirus. Em uma modalidade, a linhagem deparamixovirus é selecionada do grupo que inclui, mas sem li-mitações, virus da doença de Newcastle, vírus do Sarampo,vírus parainfluenza 3 ou vírus sincicial respiratório, emuma modalidade, a linhagem do NDV é virulenta. Em uma outramodalidade, a linhagem virulenta do NDV pode ser selecionadado grupo que compreende linhagem AV e linhagem Hertz. Em umamodalidade, a linhagem do NDV é avirulenta. Em uma outra mo-dalidade, a linhagem avirulenta compreende a linhagem BI.

Em uma modalidade, a presente invenção contemplauma composição que compreende clones do DNAc que codificampelo menos uma proteína estrutural de paramixovirus. Em umamodalidade, a proteína estrutural compreende uma glicoprote-ína HN. Em uma modalidade, o paramixovirus é selecionado dogrupo que inclui, mas sem limitações, vírus da doença deNewcastle, vírus do Sarampo, vírus parainfluenza 3 ou vírussincicial respiratório. Em uma modalidade, o clone é deriva-do de uma linhagem virulenta do NDV. Em uma outra modalida-de, a linhagem virulenta do NDV pode ser selecionada do gru-po que compreende a linhagem AV e a linhagem Hertz. Em umaoutra modalidade, o clone é derivado de uma linhagem aviru-lenta do NDV. Em uma modalidade, a linhagem avirulenta doNDV compreende a linhagem Bl.

VI. Etiquetas de seqüência da Vacina por VLP

Em uma outra modalidade, a presente invenção con-templa uma vacina por VLP contra o paramixovirus, tais como,mas sem limitações, uma vacina por VLP contra o vírus da do-ença de Newcastle, uma vacina por VLP contra o vírus do sa-rampo, uma vacina por VLP contra o vírus parainfluenza 3 ouuma vacina por VLP contra o virus sincicial respiratório, emque a dita vacina compreende uma etiqueta de seqüência. Emuma modalidade, a vacina é administrada em um hospedeiro. Emuma modalidade, a etiqueta de seqüência é detectada.

Em uma modalidade, a presente invenção contemplaum vetor que compreende pelo menos um DNAc que codifica umaproteína paramixoviral, em que o dito DNAc compreende umaetiqueta de seqüência. Em uma modalidade, o DNAc é transfec-tado em uma célula hospedeira. Em uma modalidade, o DNAc éincorporado em um genoma hospedeiro. Em uma outra modalida-de, o DNAc fica residente no citoplasma do hospedeiro. Emuma modalidade, a etiqueta de seqüência é detectada.

A. Etiquetas do Anticorpo

A presente invenção contempla algumas modalidadesque compreendem um glicoproteína paramixoviral expressa comuma etiqueta de'seqüência terminal. Em uma modalidade, a e-tiqueta compreende etiquetas FLAG, HA e MYC.

Em resposta ao campo das proteômicas que crescerapidamente, o uso de proteínas recombinantes aumentou enor-memente nos últimos anos. Híbridos recombinantes contêm umpolipeptídeo parceiro de fusão, chamado de etiqueta de afi-nidade (isto é, por exemplo, uma etiqueta de seqüência), pa-ra facilitar a purificação dos polipeptídeos alvos. As van-tagens do uso de proteínas de fusão para facilitar a purifi-cação e detecção de proteínas recombinantes são bem reconhe-cidas. A presente invenção é compatível com várias etiquetasde seqüência de afinidade incluindo, mas sem limitações,Arg-tag, peptideo que liga calmodulina, domínio que liga ce-lulose, DsbA, c-myc-tag, glutationa S-transferase, FLAG-tag,HAT-tag, His-tag, proteína que liga maltose, NusA, S-tag,SBP-tag, Strep-tag e tioredoxina. Terpe K., "Overview of tagprotein fusions: from molecular and biochemical fundamentaisto commercial systems" Appl Microbiol Biotechnol. 60:523-33(2003).

FLAG, HA e MYC são seqüências de aminoácidos cur-tas para as quais há anticorpos comercialmente disponíveis(isto é, por exemplo, estojos ELISA). Em uma modalidade, umaproteína F compreende um FLAG tag terminal. Em uma modalida-de, o terminal compreende o C-terminal. Em uma outra modali-dade, o terminal compreende o N-terminal. Embora não sejanecessário entender o mecanismo da invenção, acredita-se queproteínas virais F ou HN que compreendem uma etiqueta de se-qüência terminal (isto é, por exemplo, FLAG ou HA.) são com-pletamente funcionais. Acredita-se adicionalmente que quandouma proteína F (ou qualquer outra proteína viral) que com-preende uma etiqueta terminal é incorporada em uma VLP, ani-mais imunizados criarão anticorpos não somente para a prote-ína F, mas também para a etiqueta terminal (isto é, por e-xemplo, uma seqüência de aminoácido FLAG).

Anticorpos específicos para etiquetas de seqüênciatêm afinidades para seqüências de proteínas específicas, co-nhecidas como epítopos. Um epítopo tem a propriedade de in-teragir seletivamente com moléculas e/ou materiais que con-têm grupos aceitantes. A presente invenção é compatível commuitas seqüências de epítopo relatadas na literatura inclu-indo, mas sem limitações, HisX6 (HHHHHH) (SEQ ID NO: 91)(ClonTech), C-myc (-BQKLISEEDL) (SEQ ID NO:92) (Roche-BM),FLAG (DYKDDDDK) (SEQ ID NO:93) (Stratagene), SteptTag(WSHPQFEK) (SEQ ID NO: 94) (Sigma-Genosys) e HA Tag(YPYDVPDYA) (SEQ ID NO:95) (Roche-BM).

O peptideo FLAG (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)(SEQ ID NO:93) foi usado como uma etiqueta de epitopo tag emuma variedade de tipos de célula. Por exemplo, a modificaçãodo citomegalovirus (CMV) promotor que contém vetor, pCMV5,criou dois vetores de expressão temporários projetados parasecreção e expressão intracelular de proteínas de fusão porFLAG em células de mamíferos. Como um teste funcional, o ge-ne fosfatase alcalino bacteriano foi clonado em ambos veto-res, e anticorpos monoclonais anti-FLAG foram usados para adetecção de fosfatase alcalino bacteriano etiquetado com e-pítopo FLAG em células de mamíferos. Além do mais, fosfatasealcalino bacteriano secretado foi purificado a partir domeio extracelular por cromatografia por afinidade anti-FLAG.Chubet et al., "Vectors for expression and secretion of FLAGepitope-tagged proteins in mammalian cells" Biotechniques20:136-41 (1996).

A seqüência HA-tag negativamente carregada (Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala) (SEQ ID NO:95) da hemaglu-tinina do vírus influenza provou-se útil para etiquetar pro-teínas relacionadas a uma ampla variedade de aplicações pro-teômicas. Em uma modalidade, a modalidade da presente inven-ção contempla um melhor epitopo HA-tag. Embora não seja ne-cessário entender o mecanismo da invenção, acredita-se que acapacidade de marcar metabolicamente as proteínas com 35S-metionina facilita a análise da síntese e renovação da pro-teína. Entretanto, a eficiente marcação de proteínas in vivoé, freqüentemente, limitada por um baixo número de resíduosde metionina disponíveis, ou por efeitos colaterais danososassociados com a sobrexpressão da proteína. Para superar es-tas limitações, uma variante rica em metionina do HA tag am-plamente usado, denominado HAM, pode ser usado com proteínasexpressas ectopicamente. Em uma modalidade, a presente in-venção contempla o desenvolvimento de uma série de vetores,e anti-soro correspondente, para a expressão e detecção deproteínas virais VLP com HAM-tag. Estas etiquetas HAM melho-ram a sensibilidade da marcação com 35S-metionina e permitea análise de renovação de oncoproteína Myc mesmo quando Myccom HAM-tag é expressa em níveis comparáveis com aquele daproteína endógena. Em virtude da maior sensibilidade providapelo HAM tag, os vetores aqui descritos devem ser usados pa-ra a detecção de proteínas VLP radiomarcadas. Herbst et al.,"HAM: a new epitope-tag for in vivo protein labeling" MolBiol Rep. 27:203-8 (2000).

Alternativamente, anticorpos podem ser gerados pa-ra reconhecer seqüências específicas em uma proteína ou oli-gonucleotídeo. Tais anticorpos podem ser policlonais ou mo-noclonais. Por exemplo, seqüências específicas para um antí-geno carcinoembriônico podem ser detectáveis por anticorpos.Barnett et al., "Antibody preparations specifically bindingto unique determinants of CEA antigens or fragments thereofand use of the antibody preparations in immunoassays" pat-ente US 6.013.772 (2000) (aqui incorporada pela referência).Similarmente, anticorpos pode ser criados para seqüência denucleotideos especificas. Tchen et al. , "Probe containing amodified nucleic acid recognizable by specific antibodiesand use of this probe to detect and characterize a homolo-gous DNA sequence" patente US 5,098,825 (1992)(aqui incorpo-rada pela referência).

Inúmeros imunoensaios podem ser usados de acordocom a presente invenção. Os sistemas de leitura capazes deser empregados nestes ensaios são inúmeros e exemplos nãolimitantes de tais sistemas incluem sistemas enzimáticosfluorescentes e colorimétricos, marcação e detecção radioi-sotópica e sistemas quimioluminescentes. Por exemplo, umapreparação de anticorpo com uma afinidade especifica de se-qüência para uma proteína viral do NDV com etiqueta de se-qüência (preferivelmente, uma proteína de partícula VLP) éanexada em uma sólida (isto é, por exemplo, uma placa de mi-crotitulaçãom ou microesferas de látex). Então, este comple-xo anticorpo-proteína VLP é lavado para remover proteínas departícula VLP livres. Depois da lavagem, cor ou fluorescên-cia é desenvolvida adicionando um substrato cromogênico oufluorogênico para ativar a etiqueta de seqüência protéica doVLP. A quantidade de cor ou fluorescência desenvolvida éproporcional à quantidade de proteína VLP na amostra.

B. Etiquetas Químicas

Etiquetas de seqüência (isto é, seqüências de nu-cleotídeo e/ou de proteínas) também incluem moléculas queserão reconhecidas pelas enzimas do processo de transcriçãoe/ou de tradução sem interferência estérica ou eletrostáti-ca. A detecção de etiquetas de seqüência pode ocorrer pormeio da liberação de uma marca. Tais marcas podem incluir,mas sem limitações, um ou mais de qualquer um de pigmentos,radiomarcadores, frações de ligação, tais como biotina, eti-quetas de massa, tais como ions metálicos ou grupos quími-cos, etiquetas de carga, tais como poliaminas ou pigmentoscarregados, haptenos, tais como frações digoxigenina, Iumi-nogênicas, fosforescentes ou fluorogênico, e pigmentos fluo-rescentes, tanto sozinhos quanto em combinação com fraçõesque podem suprimir ou deslocar o espectro de emissão, talcomo por transferência de energia por ressonância fluores-cente (FRET) ou transferência de energia por fluorescênciacolisional. Aizenstein et al., "Methodos and compositionsfor detecting target sequences" Patente US 6.913.881 (2005)(aqui incorporada pela referência).

Quando polimerase TdT ou polyA é empregada, um o-ligonucleotideo pode conter uma marca 5'terminal. A invençãonão é limitada pela natureza da marca 5'terminal. Uma amplavariedade de marcas 5'terminal adequadas é conhecida na tec-nologia e inclui biotina, fluoresceina, tetraclorofluoresce-ína, hexaclorofluoresceina, amidita Cy3, amidita Cy5 e digo-xigenina. Uma marca radioisótopa (por exemplo, um nucleotí-deo com marca 32P ou 35S) pode ser colocado tanto no51 terminal quanto no 3'terminal do oligonucleotídeo ou, al-ternativamente, distribuído por todo o oligonucleotídeo (is-to é, um oligonucleotídeo uniformemente marcado). Um oligo-nucleotídeo biotinilado pode ser detectado por sonda com umamolécula estreptavidina que é acoplada em um indicador (porexemplo, alcalino fosfatase ou um fluoróforo) ou um hapteno,tal como dioxigenina, e pode ser detectado usando um anti-corpo especifico acoplado em um indicador similar. 0 gruporeativo também pode ser uma configuração ou seqüência de nu-cleotideos especifica que pode ligar, ou de outra forma in-teragir, com um agente secundário, tais como um outro ácidonucléico, e enzima, ou um anticorpo.

Para ser usadas, etiquetas de seqüência devem pos-suir certas propriedades físicas e fisioquimicas. Primeiro,uma etiqueta de seqüência deve ser adequada para incorpora-ção tanto em uma cadeia crescente de peptídeo ou oligonucle-otídeo. Isto pode ser determinado pela presença de gruposquímicos que participarão da formação da ligação do peptídeoou fosfodiéster. Segundo, etiquetas de seqüência devem seranexáveis a uma molécula de RNAt ou a um complexo polimeraseácido nucléico. Terceiro, etiquetas de seqüência devem teruma ou mais propriedades físicas que facilitam a detecção e,possivelmente, o isolamento de proteínas ou oligonucleotí-deos nascentes. Propriedades físicas usadas incluem uma ca-racterística propriedade espectral eletromagnética, tais co-mo, emissão ou absorbância, magnetismo, ressonância de spinde elétron, capacitância elétrica, constante dielétrica oucondutividade elétrica.

Etiquetas de seqüência usadas compreendem aminoá-cidos nativos acoplados em uma marca detectável, aminoácidosnão nativos detectáveis, aminoácidos análogos detectáveis ederivados de aminoácido detectáveis. Marcas e outras fraçõesdetectáveis podem ser ferromagnética, paramagnética, diamag-nética, luminescente, eletroquimioluminescente, fluorescen-te, fosforescente, cromática ou ter uma massa distintiva.Frações fluorescentes que são usadas como etiquetas de se-qüência incluem fluoróforos, cumarinas e derivados de cuma-rina dansila, frações de acridinio fluorescente e fluorófo-ros baseados em benzopireno. Preferivelmente, o marcadorfluorescente tem uma alta quantidade de produção de fluores-cência em um comprimento de onda diferente dos aminoácidosnativos e, mais preferivelmente, tem alta quantidade de pro-dução de f luorescência que pode ser excitada tanto em UVquanto na parte visível do espectro. Mediante a excitação emum comprimento pré-selecionado de onda, o marcador é detec-tável em baixas concentrações, tanto visualmente quanto u-sando métodos convencionais de detecção por fluorescência.Marcadores eletroquimioluminescentes, tais como quelato derutênio e seus derivados ou aminoácidos nitróxidos e seusderivados são preferidos quando sensibilidade extrema é de-sejada. DiCesare et al., BioTechniques 15: 152-59 (1993).Estas etiquetas de seqüência são detectáveis nas faixas fem-tomolares e abaixo.

Além da f luorescência, propriedades com base nainteração e resposta de uma etiqueta de seqüência com camposeletromagnéticos, radiação, absorção de luz (isto é, por e-xemplo, UV, visível e infravermelho), espectroscopia de res-sonância Raman, atividade de ressonância de spin do elétron,ressonâncias magnéticas nucleares, e espectrometria de mas-sa. Preferivelmente, propriedades espectroscópicas eletro-magnéticas de uma etiqueta de seqüência não são possuídaspor um composto de ocorrência natural e, portanto, são fa-cilmente distinguiveis. Por exemplo, o aminoácido triptofanoabsorve quase 290 nm e tem emissão fluorescente de quase 340nm. Assim, triptofanos análogos com propriedades de absorçãoe/ou fluorescência que são suficientemente diferentes dotriptofano podem ser usados para facilitar sua detecção emproteínas.

Por exemplo, muitos aminoácidos modificados dife-rentes que podem ser usados como etiquetas de seqüência sãocomercialmente disponíveis (Sigma Chemical; St. Louis, Mo.;Molecular Probes; Eugene, Oreg.). Uma tal etiqueta de se-qüência é Ν-ε-dansyllysine e pode ser criada pela misaminoa-cilação de um fluoróforo dansyl em uma molécula de RNAt. Umaoutra tal etiqueta de seqüência é um fluorescente aminoácidoanálogo com base na molécula de cumarina altamente fluores-cente. Este fluoróforo tem uma quantidade de produção defluorescência muito maior que cloreto de dansyl e pode faci-litar a detecção de níveis muito inferiores. Rothschild etal., "Methods for the detection, analysis and isolation ofnascent proteins" Patente US 6.875.592 (2005) (aqui incorpo-rada pela referência).

Etiquetas de seqüência para uma proteína podem serquimicamente sintetizadas a partir de um aminoácido nativo ede uma molécula com propriedades de marcador que, normalmen-te, não podem funcionar como um aminoácido. Por exemplo, umamolécula altamente fluorescente pode ser quimicamente ligadaa um grupo aminoácido nativo. A modificação química pode o-correr na cadeia lateral do aminoácido, deixando as funcio-nalidades carboxila e amino livres para participar de umaformação de ligação de polipeptideo. Por exemplo, um cloretode dansyl altamente fluorescente pode ser ligado às cadeiaslaterais nucleofilicas de uma variedade de aminoácidos in-cluindo lisina, arginina, tirosina, cisteina, histidina,etc., principalmente, como um sulfonamida para grupos aminoou ligações de sulfato para produzir derivados fluorescen-tes. Tal derivatização deixa a capacidade de formar ligaçõesde peptideo intactas, permitindo a incorporação normal dèdansilisina em uma proteína.

Em uma modalidade, a presente invenção contemplaum fluoróforo que compreende um derivado de difluoreto dedipirometaneboro (BODIPY). A estrutura central de todos osfluoróforos BODIPY é 4,4-diflúor-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno. Veja patentes US 4.774.339, 5.187.288, 5.248.782,5.274.113, 5.433.896, 5.451.663 (todas aqui incorporadas pe-la referência). Todos os fluoróforos BODIPY têm um alto coe-ficiente de extinção, alta quantidade de produção de fluo-rescência, espectro que é insensível a polaridade solvente epH, estreita largura de banda de emissão resultando em umpico de intensidade maia alto se comparado com outros pig-mentos, tal como fluoresceína, ausência de carga iônica emaior fotoestabilidade se comparado com fluoresceína. A adi-ção de substituintes na estrutura básica do BÒDIPY, que oca-siona conjugação adicional, pode ser usada para deslocar ocomprimento de onda de excitação ou emissão em comprimentosde onda convenientes compatíveis com o meio de detecção.Uma variedade de moléculas BODIPY é comercialmentedisponível na forma de um amino reativo que pode ser usadopara derivar RNAts aminoacilados. Um exemplo de um compostodesta família que exibe propriedades superiores para a in-corporação de uma etiqueta de seqüência detectável em prote-ínas nascentes é 4,4-diflúor-5,7-dimetil-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indaceno (BODPY-FL). Quando a N-hidroxisuccinimida sulfo-nada (NHS) derivada de BODIPY-FL é usada para colocar umaetiqueta de seqüência em um iniciador RNAtfmet de E. coli, aproteína marcada pode ser facilmente detectada em géis depoliacrilamida depois da eletroforese que usa um transilumi-nador UV padrão e sistema de imageamento fotográfico ou CCD.Isto pode ser realizado usando RNAtfmet purificado que é,primeiro, aminoacilado com metionina e então o grupo a-aminode metionina é especificamente modificado usando NHS-BODIPY.Varshney et pelo menos, "Direct analysis of aminoacylationleveis of tRNA in vitro" J. Biol. Chem. 266:24712-24718(1991).

C. Etiquetas de seqüência Exclusivas

A Análise Serial de Expressão Genética (SAGE) éuma técnica que permite uma análise rápida e detalhada demilhares de transcrições. SAGE é baseada em dois princípios.Primeiro, uma curta etiqueta de seqüência de nucleotídeos(isto é, por exemplo, 9 a 10 pares base (bps)) contém infor-mação suficiente para identificar exclusivamente uma trans-crição, desde que ela seja isolada de uma posição definidana transcrição. Por exemplo, uma seqüência tão curta quanto9 bp pode distinguir 262.144 transcrições dada uma distribu-ição aleatória de nucleotideo no sitio da etiqueta, conside-rando que estimativas atuais sugerem que mesmo o genoma hu-mano codifica somente cerca de 80.000 transcrições. Segundo,a concatenação de etiquetas de seqüência curtas permite aeficiente análise de transcrições de uma maneira serial peloseqüenciamento de múltiplas etiquetas em um único clone. Co-mo na comunicação serial entre computadores, em que a infor-mação é transmitida como uma série continua de dados, a aná-lise serial de etiquetas de seqüência exige um dispositivopara estabelecer o registro e limites de cada etiqueta.

Então, DNAc de fita dupla pode ser sintetizado apartir de RNAm por meio de um iniciador oligo(dT) biotinila-do. Então, o DNAc é clivado com um endonuclease de restrição(enzima âncora) que pode ser esperada clivar o máximo detranscrições pelo menos uma vez. Tipicamente, endonucleasesde restrição com sítios de reconhecimento 4-bp são usadoscom este propósito em virtude de eles clivarem cada 256 bp,em média, considerando que a maioria das transcrições sãoconsideravelmente maiores. Então, a maioria de 3'parte doDNAc clivado é isolada por ligação em microesferas de es-treptavidina. Este processo provê um sítio exclusivo em cadatranscrição que corresponde ao sítio de restrição localizadomais próximo do final do [poly(A)] poliadenilado. Então, oDNAc é dividido ao meio e ligado por meio do sítio de res-trição de ancoragem em um de dois ligantes contendo um tipoIIS (enzima de etiqueta) . Endonucleases de restrição tipoIIS cliva em uma distância definida até 20 bp para longe dosseus sítios de reconhecimento assimétricos. Os ligantes sãoprojetados para que a clivagem dos produtos da ligação com aenzima de etiqueta resulte na liberação do ligante com umapequena parte do DNAc.

Por exemplo, uma combinação da enzima âncora e daenzima de etiqueta que produziria uma etiqueta de 9-bp podeser curada. Depois pontas cegas são criadas, as duas reuni-ões de etiquetas liberadas são ligadas entre si. Então, eti-quetas ligadas servem como gabaritos para a amplificação dareação em cadeia da polimerase (PCR) com iniciadores especí-ficos para cada ligante. Esta etapa serve para diversos pro-pósitos além do permitir a amplificação das seqüências deetiqueta. Primeiro, ela prove a orientação e pontuação daseqüência de etiqueta de uma maneira muito compacta. Os pro-dutos da amplificação resultantes contêm duas etiquetas (umadietiqueta) ligadas final a final, flanqueada por sitios pa-ra o enzima âncora. No gabarito de seqüenciamento final, is-to resulta em 4 bp de pontuação por dietiqueta. Segundo, ede forma mais importante, a análise de dietiquetas formadasantes de todas as etapas de amplificação provê um dispositi-vo para eliminar completamente potenciais distorções intro-duzidas por PCR. Em virtude da probabilidade de nenhuma dasduas etiquetas ser acoplada na mesma dietiqueta ser pequena,mesmo em transcrições abundantes, dietiquetas repetidas po-tencialmente produzidas por PCR induzido podem ser excluídasda análise sem alterar substancialmente os resultados fi-nais. A clivagem do produto do PCR com a enzima âncora per-mite o isolamento das dietiquetas que então podem ser con-centradas por ligação, clonadas e seqüenciadas.Além de prover informação quantitativa sobre a a-bundância de transcrições conhecidas, SAGE pode ser usadapara identificar genes expressados do NDV. SAGE pode proverdados tanto quantitativos quanto qualitativos sobre a ex-pressão genética. A combinação de diferentes enzimas âncorascom vários sítios de reconhecimento e enzimas tipo IIS comsítios de clivagem de 5 a 20 bp dos seus elementos de reco-nhecimento proporciona grande flexibilidade a esta estraté-gia.

D. Tecnologia de Detecção Direta

Quando uma quantidade de um ácido nucléico sufici-ente para ser detectada é disponível, há vantagens em detec-tar aquela seqüência diretamente em vez de fazer mais cópiasdaquele alvo, (por exemplo, como em PCR e LCR) . Mais nota-velmente, um método que não amplifica o sinal exponencial-mente é mais receptivo à análise quantitativa. Mesmo se osinal for aumentado pela anexação de múltiplos pigmentos emum único oligonucleotídeo, a correlação entre a intensidadedo sinal final e a quantidade de alvos é direta. Um sistemacomo este tem uma vantagem adicional de que os próprios pro-dutos da reação não irão promover adicionalmente a reaçãoentão a contaminação das superfícies do laboratório pelosprodutos não é uma preocupação muito incisiva. Métodos tra-dicionais de detecção direto, incluindo ensaios de proteçãoNorthern e Southern blotting e RNase, usualmente exigem ouso de radioatividade e não são receptivos a automação. Téc-nicas recentemente concebidas procuraram eliminar o uso deradioatividade e/ou melhorar a sensibilidade em formatos au-tomatizáveis. Dois exemplos são a "Reação de Sonda Cíclica"(CPR) e "DNA Ramificado" (DNAb).

A reação de sonda cíclica (CPR) usa um oligonucle-otídeo quimérico longo no qual uma parte central é feita deRNA enquanto que os dois terminais são feitos de DNA. Ducket al, BioTech., 9:142 (1990). A hibridização da sonda em umDNA alvo e a exposição em um RNase H termoestável faz comque a parte do RNA seja digerida. Isto desestabiliza as par-tes de DNA restantes do duplex, liberando o restante da son-da do DNA alvo e permitindo que uma outra molécula sonda re-pita o processo. O sinal, na forma de moléculas sondas cli-vadas, acumula em uma taxa linear. Embora a repetição doprocesso aumente o sinal, a parte do RNA do oligonucleotídeoé vulnerável a RNases que podem ser carreados por meio dapreparação da amostra.

DNA ramificado (DNAb) envolve oligonucleotídeoscom estruturas ramificadas que permite que cada oligonucleo-tídeo individual carreie de 35 a 40 marcas (por exemplo, en-zimas alcalino fosfatase). Urdea et al., Gene 61:253-264(1987). Embora isto aumente o sinal de um evento de hibridi-zação, o sinal proveniente da ligação não específica é simi-larmente aumentado.

VII. Vacinação In Vivo

Em uma modalidade, a presente invenção contemplauma vacina por VLP contra o paramixovírus que compreende pe-lo menos uma glicoproteína viral em que a vacina é antigêni-ca. Em uma modalidade, a vacina estimula uma imuno-respostaem doenças incluindo, mas sem limitações, doença de Newcas-tle, sarampo, viru-s parainf luenza 3 ou infecção do virussincicial respiratório. Em uma modalidade, a presente inven-ção contempla um método que compreende administrar uma vaci-na por VLP purificada contra o paramixovirus antigênico emum hospedeiro (isto é, por exemplo, um camundongo ou gali-nha) em condições que geram uma imuno-resposta. Em uma moda-lidade, a imuno-resposta é caracterizada por medir os níveisde anticorpos da glicoproteína sérica. Em uma modalidade, aglicoproteína viral compreende uma glicoproteína do NDV. Emuma modalidade, a glicoproteína viral compreende uma glico-proteína do vírus do Sarampo. Em uma modalidade, a glicopro-teína viral compreende uma glicoproteína vírus sincicialrespiratório.

Em uma modalidade, a presente invenção contemplaum método que compreende administrar uma vacina por VLP pu-rificada contra NVD antigênico, sarampo, vírus parainfluenza3 ou vírus sincicial respiratório em uma galinha para criaruma galinha vacinada. Em uma modalidade, o método compreendeadicionalmente administrar um desafio de vírus vivo em umagalinha vacinada. Em uma modalidade, o método compreende a-dicionalmente determinar a taxa de infecção de NDV em umagalinha vacinada.

EXPERIMENTOS

Os exemplos seguintes são somente ilustrativos demodalidades específicas da presente invenção e não pretende-se que sejam limitantes.

Exemplo 1: Culturas CelularesEste exemplo descreve as culturas celulares usadasnos exemplos a seguir para construir modalidades especificasda presente invenção.

Uma linhagem celular fibroblástica espontaneamentetransformada derivada da linhagem East Lansing (ELL-O) deembriões de galinha (UMNSAH/DF-1) foi obtida da American Ty-pe Culture Collection e mantida em meio Eagle modificado daDulbecco (DMEM) complementado com penicilina-estreptomicinae soro fetal bovino (FCS) 10%.

Células epiteliais renais humanas que expressam oantigeno SV 40 T (293T) também foram propagados em DMEM com-plementado com FCS 10%, penicilina-estreptomicina, vitami-nas, aminoácidos não essenciais e glutamina. NDV, linhagem AV, foi propagado em ovos de galinha embrionados por protoco-los padrão.

Exemplo 2: Plasmideos

Este exemplo descreve os tipos de plasmideos usa-dos nos exemplos a seguir para construir várias modalidadesda presente invenção.

Seqüências de DNAc do NDV que codificam proteínasNP (isto é, por exemplo, SEQ ID NO:23), M (isto é, por exem-plo, SEQ ID NO :21) , HN (isto é, por exemplo, SEQ ID N0:18),e F não clivado (isto é, por exemplo, SEQ ID NO: 20 ou, al-ternativamente, um F-K115Q) foram subclonadas no vetor deexpressão pCAGGS para gerar pCAGGS-NP, pCAGGS-M, pCAGGS-HN epCAGGS-F-KI15Q, respectivamente. Miyazaki et al. , "Expres-sion vector system based on the chicken beta-actin promoterdirects efficient production of interleukin-5" Gene 79:269-77 (1989); e Niwa et al. , "Efficient selection for high-expression transfectants with a NDVel eukaryotic vector"Gene 108: 193-9 (1991).

O DNAc da proteína F contém um ponto de mutação naseqüência do sítio de clivagem, F-KI15Q, que elimina o sítiode reconhecimento de furina. Li et al. , "Effect of cleavagemutants on syncytium formation directed by the wild-ttypefusion protein of Newcastle disease vírus" J. Virol.72:3789- 95(1998).

O vetor de expressão pBJ5 que contém o gene quecodifica um Vps4A com Flag-tag com mutação E228Q e vetorpDsRed2-M (Clontech) contendo o gene que codifica a proteínade fusão CHMP3-RFP foram previamente descritos. Strack etal., "PIPl/ALIX is a binding partner for HIV-lp6 and EIAV p9functioning in virus budding "Cell 114:689-699 (2003).

Exemplo 3: Transfecçâo, infecção, E Metabolic Mar-cação

Estes exemplos descrevem as técnicas básicas usa-das para desenvolver e expressar várias modalidades da pre-sente invenção.

As transfecções das células ELL-O subconfluentese/ou células das 293T foram realizadas usando Lipofectamina(Invitrogen) como recomendado pelo fabricante. As seguintesquantidades de DNA de plasmídeo foram usadas por placa de 35mm: 1,0 yg pCAGGS-NP, 1,0 yg pCAGGS-M, 0,75 \ig pCAGGS-F-KI15Q e 1,0 yg pCAGGS-HN, tanto sozinho qto em misturas. Es-tas quantidades foram previamente determinadas para produzirníveis de expressão similares em células infectadas com NDVem uma multiplicidade de infecção de 5.

Um total de 3,75 yg de DNA de plasmídeo por placade 35 mm foi usado em todos os experimentos de transfecção.

Quando somente um, dois ou três DNAcs foram usados, a quan-tidade total de DNA transfectado foi mantida constante adi-cionando DNA do vetor pCAGGS. Para cada transfecção, umamistura de DNA e 5 yL de Lipofectamina em meio OptiMEM (Gib-co/Invitrogen) foi incubada em temperatura ambiente por 45minutos e adicionada nas células previamente lavadas com Op-tiMEM. As células foram incubadas por 5 horas, os complexosLipofectamina-DNA foram removidos e 2 mL de DMEM complemen-tado foram adicionados.

Depois de 36 horas, o meio foi substituído com 0,7mL de DMEM sem cisteína e metionina e complementado com 100μCί de mistura 35S-metionina e 35S-Cisteina (NEG-772 EASYTAG™Mistura de Marcação da Proteína de Expressão, 35S, PerkinElmer Life Sciences Inc.). Depois de 4 horas de marca depulso, um conjunto de placas transfectadas foi lisado, aomesmo tempo em que em um outro conjunto o meio foi substitu-ído com 1,0 mL de DMEM complementado com 0,1 mM de metioninafria (Nutritional Biochemicals Corporation). Depois de 8 ho-ras de "chase", o meio foi coletado e as células foram Usa-das em 0,5 mL tampão de Iise contendo Triton-DOC (Triton 1%,deoxicolato de sódio 1%) e 25 mg de N-etilmaleimido (NEM) .Células foram coletadas com uma raspadeira de célula e homo-geneizadas passando por meio de uma agulha calibre 26 de 10a 15 vezes.Células 293T subconfluentes foram transfectadassimultaneamente com pCAGGS-M e diferentes concentrações tan-to de pBJ5-Vps4-E228Q-Flag quanto de pDsRed2-NI-CHMP3. Veto-res vazios correspondentes foram usados como controle. Célu-las foram incubadas por 36 horas e o mesmo protocolo "pulse-chase" foi realizado como exposto.

Células ELL-O foram infectadas em um MOI de 5 pfupor 5 horas, marcadas com mistura 35S-metionina e 35S-cisteina por 30 minutos e "chased" em meio não radioativopor 8 horas da forma supradescrita. O sobrenadante da célulafoi coletado e os virions foram purificados com descrito aseguir. Células foram lisadas e homogeneizadas da forma su-pradescrita .

Exemplo 4: Purificação e Isolamento de VLP

Virus e VLP, bem como virions, foram purificados apartir de sobrenadantes de células em protocolos previamenterelatados. Levinson et al., "Radiation studies of aviar tu-mor viruses and Newcastle disease virus" Virology 28:533-542(1966). Os sobrenadantes de células foram centrifugados em5.000 rpm por 5 minutos em 4 °C, revestidos no topo de umgradiente de bloqueio que consiste em 3,5 mL de soluções desacarose 20% e 0,5 mL de soluções de sacarose 65% em tampãoTNE (25 mM Tris-HCI pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA) , e re-centrifugados em 40.000 rpm por 12 horas em 4 0C usando umrotor SW50.1 (Beckman). A interface do gradiente de sacarose(contendo partículas concentradas) foi coletada em 0,5 mL,misturada com 2,0 mL de sacarose 80% e revestido no topo de1,0 mL de reforço de sacarose 80%. Camadas adicionais de sa-carose (1,0 mL de sacarose 50% e 0,5 mL de sacarose 10%) fo-ram dispostos em camada no topo da amostra. O gradiente foicentrifugado em 38.000 rpm por 20 horas em 4 °C. O gradientefoi coletado a partir da base em uma fração de 1 mL e oitofrações de 0,5 mL usando uma bomba peristáltica. Densidadesde cada fração foram determinadas usando um refratômetro.VLPs derivadas da expressão de todas as combinações de pro-teínas foram preparadas em um único experimento, assim, per-mitindo a comparação direta de resultados.

Os experimentos foram repetidos três vezes. Imuno-precipitação e eletroforese em gel poliacrilamida. Imunopre-cipitação foi realizada combinando um volume de lisato celu-lar ou fração de gradiente de sacarose com dois volumes detampão TNE. Amostras foram incubadas com anticorpos especí-ficos por 16 horas em 4°C. Anti-soro usado to precipitar NP,F e HN foram anticorpo policlonal de coelho criado contraNDV inativado em UV por protocolos padrão, anti-HRI e anti-HR2. McGinnes et al., "Newcastle disease virus HN proteinalters the conformation of the F protein at cell surfaces"J. Virol. 76:12622-33 (2002), anti-F2-96 e anti-A. McGinneset al. , "Role of carbohydrate processing and calnexin bind-ing in the folding and activity of the HN protein of Newcas-tle disease virus" Virus Res 53:175-85 (1998).

Anti-F2-96 foi criado contra uma proteína de fusãoglutationa S-transferase (GST) que continha as seqüências daproteína F do aminoácido 96 ao 117. O anti-soro usado paraprecipitar proteína M foi um anticorpo monoclonal de camun-dongo criado contra proteína M purificada. Faeberg et al. ,"Strain variation and nuclear association of 20 NDV Matrixprotein "J Virol. 62:586-593 (1988). Complexos imunológicos(ICs) foram adsorvidos na proteína A (Pansorbin Cells,CALBIOCHEM) por 2 horas em 4 °C, precipitado e então lavadostrês vezes em tampão de lavagem em imunoprecipitação (IP)solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 9 Tween-20 0,5% e dodecil sulfato de sódio (SDS) 0,4%. ICs foram ré-suspensos em tampão de amostra de eletroforese em gel polia-crilamida-SDS (125 mM Tris-HCI [pH 6,8], SDS 2%, glicerol10%, azul de Bromofenol 0,4%) com 1 M J3 mercaptoetanol(BME) e fervido.

Proteínas foram separadas em gel poliacrilamida-SDS 8% e detectadas por autorradiografia. A quantificaçãodas autorradiografias resultantes foi realizada usando umFluor-STM MultiImager (BioRad).

Exemplo 5: Liberação de VLP em Alta Eficiência

A co-expressão de proteínas NP, M, F e HN resultouna liberação de VLPs com uma densidade de 1,19 a 1,16 g/cc(Figura 1, painel A). Partículas virais purificadas em para-leio das células infectadas pelo NDV, linhagem AV, tinhamuma densidade de 1,21 a 1,19 g/cc (Figura 1, painel B) . Em-bora não seja necessário entender o mecanismo da invenção,acredita-se que, provavelmente, a densidade ligeiramente me-nor de VLPs comparada com o vírus autêntico é em função daausência do RNA do vírion nas VLPs. As eficiências da VLP eda liberação de vírus foram calculadas como o percentual deproteína M restante nos extratos celulares depois da "chase"em relação à quantidade de proteína no pulso. A perda deproteína M das células na parte da "chase" do experimento éera função da liberação das células como VLPs ou vírions. Poreste critério, a eficiência da liberação de VLP foi de 85%,enquanto que a eficiência da liberação de NDV foi de 92%(Figura 1, painel C) . Os resultados mostram que a liberaçãode VLPs é quase tão eficiente quanto a liberação de vírions.

Estes resultados demonstram que VLPs de NDV sãoeficientemente montadas e liberadas de células de aves queexpressam as quatro principais proteínas estruturais. Em umamodalidade, a proteína M é suficiente para a liberação deVLP. Exigências de proteína mínimas para a formação de VLPforam determinadas pala avaliar individualmente a capacidadede cada proteína na liberação direta de partícula. Célulasque expressam cada uma das proteínas virais individualmenteforam radioativamente marcada em um protocolo "pulse-chase"e VLPs foram isoladas da forma supradescrita.

Exemplo 6: Liberação de VLP Dependente da Proteína

VLPs são liberadas somente a partir de células queexpressam a proteína M. Figura 2, Painel B. Quase nenhumaproteína M é detectável em extratos celulares depois de"chase" de 8 horas. Figura 2A, painel direito. Embora nãoseja necessário entender o mecanismo da invenção, acredita-se que isto indica que muitas das proteínas marcadas em pul-so foram liberadas das células. Acredita-se adicionalmenteque comparando os níveis da proteína M no extrato marcado empulso e no extrato da "chase", a eficiência de liberação foicalculada em 90%.Ao contrário, a maior parte das proteínas NP, F eHN marcadas em pulso permaneceram em extratos depois da"chase" (Figura 2A). Quantidades significativas de VLPs tam-bém não foram detectadas no sobrenadante de célula corres-pondente (Figura 2, painel Β), embora tenha havido traços dematerial de densidade muito baixa liberado das células queexpressam proteína ΗΝ. A figura 2, painel C, mostra a quan-tificação de VLPs produzidas a partir das células que ex-pressam cada proteína individualmente. De forma interessan-te, a quantidade de partículas que contêm proteína M das cé-lulas que expressam proteína M sozinhas foi maior que quandotodas as quatro proteínas estruturais foram expressas. En-tretanto, as VLPs exclusivas da proteína M tinham uma densi-dade muito heterogênea, com valores variando de 1,23 a 1,12g/cc (Figura 2, painel B) . Estes resultados revelam que aproteína M é suficiente para a liberação de partículas.

Exemplo 7: Liberação de VLP Dependente de ProteínaM: Combinações em Par

Da forma mostrada no Exemplo 6, a proteína M é e-xigida para a liberação de VLP. Para determinar a contribui-ção das proteínas NP, F ou HN na formação de VLP induzidapor proteína M, VLPs das células que expressam todas as com-binações possíveis das duas proteínas foram isoladas e ca-racterizadas da forma supradescrita. Células que expressamqualquer combinação de proteínas sem proteína M não libera-ram VLPs (Figura 3, painel C). Além do mais, na ausência deproteína M, as proteínas NP, F e HN expressas em combinaçõesem par foram retidas em extratos celulares depois da "chase"de 8 horas (Figura 3A). Esta descoberta sugere que a proteí-na M é exigida para a liberação de partícula. A expressão empar das proteínas NP, F ou HN com a proteína M resultou naliberação de VLPs que contêm ambas proteínas (Figura 3, pai-nel B). Entretanto, de forma intrigante, houve somente quan-tidades mínimas de proteínas NP, F ou HN e proteína M foi aproteína predominante nas VLPs (Figura 3, painel B).

A distribuição de proteínas NP, F ou HN nos gradi-entes foi idêntica àquela da proteína M (Figura 3, painelB). Além do mais, as densidades da VLP foram muito heterogê-neas e foram muito como aquelas das VLPs exclusivas de pro-teína M. Surpreendentemente, também, a quantidade de VLPsque contêm proteína M foi significativamente diminuída (emcerca de 2 a 2,5 vezes) mediante a co-expressão de proteínaM tanto com proteínas NP, F quanto HN (Figura 3, painel C).Estes resultados sugerem que as proteínas NP, F ou HN podemsuprimir individualmente a liberação de VLP induzida porproteína M.

Exemplo 8: Incorporação de Proteína em VLP Depen-dente da Proteína M

A eficiente incorporação de outras proteínas vi-rais em VLPs exige a expressão de proteína M e de pelo menosduas outra proteínas. Para examinar os efeitos da expressãode três proteínas virais na liberação de partícula, célulasforam transfectadas com todas as combinações possíveis detrês DNAcs. Novamente, VLPs somente foram liberadas das cé-lulas que expressam proteína Μ. A expressão de proteínas NP,F e HN sem a proteína M não resultou na liberação de nenhumapartícula (Figura 4, painel C). Esta descoberta reforça adi-cionalmente nossa conclusão de que a proteína M é exigidapara a liberação de VLPs.

Ao contrário da expressão de uma única glicoprote-ína com a proteína M, a co-expressão de ambas glicoproteínasF e HN com a proteína M resultou em incorporação significa-tivamente maior de ambas glicoproteínas em VLPs (Figura 4,painéis B e C) . As proteínas F e HN foram detectadas nasmesmas frações de gradiente que a proteína M. Além do mais,as densidades das VLPs foram mais homogêneas se comparadocom aquelas geradas a partir das células que expressam pro-teína M somente (compare Figura 4, painel B e Figura 2, pai-nel B) ou proteína M com uma única glicoproteína. Estes re-sultados indicam que a expressão de ambas proteínas F e HNcom a proteína M é necessária para a eficiente incorporaçãode ambas glicoproteína nas partículas.

A expressão de proteína M com NP e tanto proteínaF quanto proteína HN resultou em maior incorporação de NPbem como de glicoproteína nas VLPs (Figura 4, painéis B eC). A distribuição de partículas que contêm proteína NP nogradiente foi similar àquela de VLPs liberadas das célulasque expressam todas as quatro proteínas estruturais (compareFigura 1, painel A e Figura 4, painel B). De forma importan-te, as densidades destas partículas foram mais homogêneas,comparadas com as partículas liberadas das células que ex-pressam M somente, e foram análogas às densidade do vírusautêntico ou VLPs completas (compare Figura 4, painel B eFigura 1, painel B). No todo, estes resultados indicam que aproteína M é necessária e suficiente para a liberação departícula e que a expressão de proteína M com pelo menos du-as outra proteínas é exigida para a eficiente incorporaçãode outras proteínas nas VLPs.

Exemplo 9: Inibição da Liberação de VLP

O caminho VPS da célula hospedeira é envolvido naformação e liberação de VLP. Estudos anteriores envolveram ocaminho VPS na gemulação de outros vírus de RNA envelopados.Demirov et ai., "Retrovirus budding" Virus Res 106:87 - 102(2004); Pornillos et al. , "Mechanisms of enveloped RNA virusbudding" Trends Cell Biol. 12:569-79 (2002); e Morita etal., "Retrovirus budding" Annu Rev Cell Dev Biol. 20:395-425(2004) . Este caminho deve estar envolvido na liberação deVLP induzida por proteína M em virtude de CHMP3 ser uma su-bunidade do complexo ESCRT III. von Schwedler et al. , "Theprotein network of HIV budding" Cell 4:701-13 (2003).

A fusão de CHMP3 com RFP transforma-o em uma pro-teína negativa dominante que inibe a liberação de VLP do HIV-1 gag. Strack et al., "PIP1/ALIX is a binding partner forHIV-lp6 and EIAV p9 functioning in virus budding" Cell114:689-699 (2003) . A expressão simultânea da proteína M comCHMP3-RFP resultou em 98,5% de inibição da liberação de VLP(Figura 5, painéis A e C). A expressão de um outro componen-te negativo dominante do caminho VPS, Vps4A-E228Q com a pro-teína M, produziu o mesmo resultado, com 96,2% de inibição(Figura 5, painéis BeD). A expressão tanto de CHMP3 quantode Vps4A negativo dominante não suprimiu a expressão da pro-teína M (Figura 5, painéis EeF). Assim, um caminho VPS dacélula hospedeira intacto é essencial para a liberação deVLP da proteína M.

Exemplo 10: Efeitos Dependentes do Tipo de CélulaTipo na Liberação de Vírus e de VLP

Este exemplo provê dados exemplares que mostramque a liberação de VLP é dependente do tipo de célula hospe-deira. O tipo de célula hospedeira afeta os mecanismos bási-cos de liberação de VLP bem como as eficiências totais deliberação de VLP.

Mecanismos Básicos de Liberação

A liberação de VLP das células de aves (ELL-O) foicomparada com a liberação de VLP de células de primatas (cé-lulas COS-7). Para comparar a liberação de partícula de ví-rus destas células, números iguais de células de aves e cé-lulas COS-7 foram infectadas com NDV em um MOI = 5. As célu-las foram radioativamente marcadas em um pulso e então su-jeitas a uma "chase" não radioativa. Vírions foram coletadosdo sobrenadante da célula em vários momentos durante a "cha-se" e as proteínas nas partículas virais resolvidas por ele-troforese em gel poliacrilamida.

Uma autorradiografia das proteínas NP e F em par-tículas virais em diferentes momentos da "chase" são mostra-das nas Figuras 14A e Figura 14B, respectivamente (gel dotopo: ave; gel da base: COS-7). Uma quantificação dos níveisde cada proteína é mostrada na Figura 15A e na Figura 15B,respectivamente. Claramente, as quantidades de vírus libera-das das células de aves foram mais altas que as quantidadesliberadas das células COS-7, e a velocidade de liberação dascélulas de aves foi maior que a velocidade de liberação decélulas COS-7. Esta diferença entre células de ave e de pri-mata não foi em função das diferenças nos níveis de expres-são protéica nos dois tipos de célula. Os níveis totais deproteínas virais feitas durante a marca de pulso foram maisaltos em células COS-7 do que em células de aves (não mos-trado) , um resultado que sugere que a entrada, replicação etradução de vírus foram pelo menos tão eficientes em COS-7quanto em células de aves.

Estes dados mostram que a velocidade da liberaçãoda partícula de vírus é maior em células de aves do que emcélulas de primatas, e as quantidades de vírus liberado dascélulas de aves são significativamente maiores do que asquantidades liberadas das células de primatas.

Eficiências de Liberação

Para determinar se células de aves também forammais eficientes na liberação de VLPs, números iguais de cé-lulas de aves e de células COS-7 foram transfectadas comDNAcs que codificam as proteínas NP, M, HN e F-K115Q do NDV.Células foram radioativamente marcadas por quatro (4) horas(isto é, pulsadas) e então sujeitas a uma incubação não ra-dioativo por oito (8) horas (isto é, "chased"). VLPs foramsubseqüentemente isoladas do sobrenadante da célula. VLPsnos sobrenadantes foram purificados por flutuação em gradi-entes de sacarose.

Foram gerados gradientes de sacarose que contêmVLPs liberadas de células de aves e células COS-7, respecti-vamente. Veja Figuras 16A e 16B, respectivamente. Claramen-te, os dados mostram que mais VLPs foram liberadas das célu-las de aves do que das células COS-7.

Extratos de lisato celular de célula ave e célulasCOS-7 foram preparados depois da marca em pulso e depois da"chase" não radioativo. Veja Figura 17A e 17B, respectiva-mente. De forma importante, as proteínas HN, FeM não esta-vam mais presentes nos extratos celulares de ave depois da"chase" não radioativo. Esta observação é consistente comuma liberação mais eficiente das células de aves e/ou incor-poração em VLPs. Ao contrário, níveis significativos destasproteínas virais permaneceram nos extratos celulares COS-7.Esta observação é consistente com a retenção de proteína vi-ral em células COS-7 e uma liberação inferior das proteínasvirais em partículas. Claramente, os dados demonstram que aliberação de VLP é mais eficiente a partir das células deaves do que das células COS-7.

Exemplo 11: Comparação de Liberação Específica deVLP Induzida por Proteína Viral

Este exemplo demonstra que VLPs também são maiseficientemente liberadas das células de aves quando trans-fectadas com NDV contendo somente uma proteína M.

A liberação de partícula VLP foi determinada apartir de células transfectadas somente com DNAc de proteínaM da forma supradescrita. A purificação de um gradiente dedensidade de sacarose das VLPs da proteína M foi gerada tan-to a partir de células de ave quanto de células COS-7 deprimata. Veja Figura 18A e Figura 18B, respectivamente. Cla-ramente, as quantidades de VLP das proteínas M liberadas dascélulas de aves foram significativamente maiores e, portan-to, mais eficiente do que VLP das proteínas M liberado dascélulas de primatas.

Adicionalmente, números iguais de células foramtransfectadas tanto com DNAc da proteína NP, DNAc da proteí-na M, DNAc da proteína F-K115Q quanto DNAc da proteína HNsomente. Alternativamente, o experimento usou células trans-fectadas com um vetor com DNAcs de todas as quatro (4) pro-teínas virais em combinação. Então, VLPs foram preparadas daforma supradescrita. A purificação de um gradiente de saca-rose foi gerada para cada transfecção e a liberação de par-tícula foi determinada por densiometria. Quando os váriosDNAcs de proteína viral foram transfectados individualmente,somente proteína M resultou em alguma liberação de proteínaviral em VLP (isto é, somente proteína M). Quando uma célulafoi transfectada com todas as quatro proteínas, a liberaçãode proteína viral em VLP continha todas as quatro proteínas.Em ambos casos, VLPs liberadas continham mais quantidades deproteínas virais em células de aves em relação a célulasCOS-7. Veja Figura 19A e Figura 19B, respectivamente. Clara-mente, a eficiência liberação tanto das VLPs de proteína Mquanto das VLPs completas é melhor a partir de células deaves do que de células COS-7.

Exemplo 12: Geração de Anticorpos para Vacinas Vi-rais por VLP

I. Anticorpos Monoclonais

Camundongos Balb/c são imunizados com múltiplasinoculações I.P. de um peptídeo viral do NDV conjugado comKLH. Então, esplenócitos de animais imunizados são fundidoscom o mieloma AG8 do camundongo usando protocolos padrão.Wunderlich et al., J. Immunol. Methods 147:1-11 (1992). En-tão, sobrenadantes dos hibridomas resultantes são triadospela imunorreatividade em um peptideo viral do NDV acopladoem ovalbumina usando protocolos ELISA padrão conhecidos natecnologia. Hibridomas positivos para a expressão de MAbsimunoreativos são clonados pelo menos duas vezes limitando adiluição e análise do isótipo MAb é realizada. IgG MAb puri-ficado será preparado a partir de fluidos ascites usandocromatografia por afinidade da proteina-A. Depois da fusão,a análise mostrará uma pluralidade de sinais parentais posi-tivos, a partir dos quais anticorpos monoclonais que produ-zem clones podem ser preparados.

Ensaio de Imunoprecipitação/Cintilação Exame deHibridoma

Para desenvolver e examinar anticorpos monoclonaisque reconhecem a proteína viral em VLP em solução em vez dequando anexado em uma fase sólida, será desenvolvido um en-saio no qual a imunoprecipitação de uma proteína viral emVLP traduzida in vitro marcada com 35S-metionina é medida.Uma quantidade padrão de proteína viral em VLP in vitro tra-duzida é permitira formar complexos anticorpo/antígeno com-plexos em uma solução que pode ser otimizada para resistên-cia iônica, pH e composição de detergente. Depois que oscomplexos imunológicos são precipitados com Proteína G (cé-lulas Omnisorb) e lavados extensivamente, radioatividade li-gada é contada em um contador de cintilação líquida; fundo ésubtraído e a eficiência de precipitação é calculada. Esteensaio de imunoprecipitação/Cintilação (IPSA) permite tantoa rápida identificação quanto caracterização de anticorpos,e será usado para testar uma variedade de anticorpos mono-clonais da proteína viral em VLP. O ensaio é aplicável, nogeral, a sobrenadantes de hibridoma monoclonal bem como asoro policlonal para identificar anticorpos que podem serusados para imunoprecipitações.

Em resumo, aproximadamente 1,5 χ 10^5 DPMs de pro-teínas virais em VLP traduzidas in vitro marcadas com 35S-metionina é adicionada em 10 μl de um tampão de imunopreci-pitação IOX (150 mM NaCi, NP-40 10%, ácido deoxicólico 5%,SDS 1%, 500 mM Tris pH 8) . Para isto, 90 μL de sobrenadanteda célula monoclonal proveniente da fusão de interesse mono-clonal são adicionados e reagem naturalmente por 2 horas em4°C. Depois de 2 horas, 40 μL de uma solução de células Om-nisorb 10% (Calbiochem) equilibrada em tampão de imunopreci-pitação IX (tampão RIPA; 150 mM NaCl, NP-40 1%, ácido deoxi-cólico 0,5%, SDS 0,1%, 50 mM Tris pH8) são adicionados e re-agem naturalmente por 2 horas adicionais em 4 °C com agita-ção. As células são peletizadas por centrifugação por 5 mi-nutos em 4.500 g e 4 °C, e lavadas 3X com 800 μL IX tampãode imunoprecipitação frio. Microesferas foram quantitativa-mente transferidas para frascos de cintilação e contadas emum contador de cintilação Beckman LS6000 no modo Auto DPM.Então, o percentual de proteína viral em VLP imunoprecipita-da pode ser calculado.

Caracterização de MAbs da proteína viral em VLPPara caracterizar adicionalmente uma melhor linha-gem celular, uma competição do ensaio imunoprecipita-ção/cintilação (Competição IPSA) pode ser realizada. Nestavariação, um clone que produz anticorpos monoclonais parauma proteína viral em VLP foi adicionado em um excesso molarde aproximadamente 200 vezes de peptídeo competidor não mar-cado juntamente com proteína viral em VLP traduzida in vitromarcada. Da forma esperada, peptídeos das regiões de epítoposuspeitas serão comparados com peptídeos que não são suspei-tos de representar as regiões de epítopo. Um alto percentualde competição em ensaios que contêm as regiões de epítoposuspeitas verificará a especificidade de ligação do anticor-po monoclonal da proteína viral em VLP.

II. Anti-soro

Anti-soro usado para precipitar proteínas viraisfoi um coquetel de anticorpos anti-NDV. Anti-soro usado paraprecipitar NP foi anticorpo policlonal de coelho criado con-tra NDV inativado por UV por protocolos padrão. Anti-sorousado para precipitar proteína F foi criado contra proteínasde fusão glutationa S-transferase (GST) que continham se-qüências de aminoácidos 130 a 173 (anti-HRl) (McGinnes etal., "Newcastle disease virus HN protein alters the confor-mation of the F protein at cell surfaces" J. Virol. 76:12622-12633 (2002)), 470 a 500 (anti-HR2) (Dolganiuc et al.,"Role of the cytoplasmic domain of the Newcastle disease vi-rus fusion protein in association with lipid rafts" J Virol77:12968-12979 (2003)), ou 96 a 117 (anti-F2-96) . Anti-sorousado para precipitar proteína HN foi criado contra seqüên-cias de proteína HN dos aminoácidos 96 a 117 (anti-A)(McGinnes et al., "Role of carbohydrate processing andcalnexin binding in the folding and activity of the HN pro-tein of Newcastle disease vírus" Virus Res 53:175-185(1998)). Anti-soro usado para precipitar proteína M foi umanticorpo monoclonal de camundongo criado contra proteína Mpurificada (Faeberg et al., "Strain variation and nuclearassociation of NDV Matrix protein" J. Virol. 62:586-593(1988)). Anticorpo usado para precipitar com proteínas comHA-tag foi um anticorpo HA monoclonal de camundongo conjuga-do com microesferas de agarose (Sigma). Anticorpo secundáriousado para imunoblotting foi um anti-anticorpo anti-HA mono-clonal de camundongo conjugado com peroxidase (Sigma).

Exemplo 13: Construção de Vetores Recombinantes deBaculovirus

Este exemplo descreve uma metodologia geral para aconstrução de vetores recombinantes de baculovírus.

Um esquema geral para a construção de recombinan-tes de baculovírus é mostrado na Figura 28. Como uma primei-ra etapa, o gene alvo (isto é, por exemplo, proteína de par-tícula do NDV), mostrado como um DNA derivado de PCR é clo-nado à jusante de uma cópia de um promotor AcNPV em um vetorde transferência de plasmídeo adequado (isto é, por exemplo,pBAC4x-l). O vetor de transferência tem segmentos à montantee à jusante de DNA do baculovírus que flanqueiam o promotore o gene alvo.

Um clone selecionado do vetor de transferência re-combinante derivado cresce em uma cultura celular bacteriana(isto é, por exemplo, E. coli), cultura celular de ave (istoé, por exemplo, ELL-O) ou um cultura de célula humana (istoé, por exemplo, 293T) e o DNA de plasmideo recombinante re-sultante é caracterizado e purificado.

Na segunda etapa, o plasmideo de transferência re-combinante purificado é co-transfectado com DNA de virus Ii-nearizado em células de insetos (isto é, por exemplo, Sf9)para construir o baculovirus recombinante. As regiões deflanqueamento do vetor de transferência participam da recom-binação homóloga com as seqüências de DNA do virus durante areplicação do virus e introduzem o gene alvo no genoma dobaculovirus em um local especifico (usualmente poliedrina ouplO, dependendo do plasmideo de transferência).

Depois da transfecção e purificação de placa pararemover virus parental, um estoque de virus de alta titula-ção é preparado a partir do recombinante apropriado. Uma vezque um estoque de virus de alta titulação é obtido, ele éempregado para determinar os momentos ideais para a expres-são de proteína alvo (dependendo do promotor e das proprie-dades do produto genético). Depois que estes parâmetros sãoestabelecidos, uma cultura em grande escala é preparada eusada para a produção de proteína.

Exemplo 14: Produção de Vacina por . VLP contra oSarampo

Este exemplo apresenta um protocolo que resultarána produção de vacinas por VLP específicas contra o vírus doSarampo.Vetores: Seqüências de DNAc do MV que codificamproteínas NP (isto é, por exemplo, SEQ ID NO:42), M (isto é,por exemplo, SEQ ID NO: 48), HA (i.e., por exemplo, SEQ IDN0:30), e F não clivada (isto é, por exemplo, SEQ ID NO:36)serão subclonadas no vetor de expressão pCAGGS para gerarpCAGGS-NP, pCAGGS-M, pCAGGS-HA e pCAGGS-F-KlllG, respectiva-mente. O DNAc que codifica a proteína F do MV sofrerá muta-ção para eliminar o sítio de reconhecimento de furina no a-minoácido 108-112. A mutação irá introduzir uma glicina nolugar de lisina no aminoácido 111, a posição análoga aoK115Q mutante na proteína F do NDV. A eliminação de clivagemda proteína F inibirá a capacidade da proteína F fundir.Provavelmente, a ausência da fusão célula-célula na culturaaumentará a produção de VLPs.

Linhagens celulares: O vírus do Sarampo é liberadoeficientemente de linhagens celulares de humano e de prima-ta, mas não de linhas celulares de murino (Vincent, et alVirology 265: 185). Assim, células Hela (células do carcino-ma cervical humano), células 293 (células embrionárias dorim humano) , células VERO (células do rim de macaco verdeafricano) e células COS-7 (primata) serão usadas.

Transfecção, infecção e marcação metabólica:Transfecções de células subconfluentes serão realizadas u-sando Lipofectamina (Invitrogen) da forma recomendada pelofabricante. As seguintes quantidades de DNA de plasmídeo se-rão usadas por placa de 35mm: 1,0 yg pCAGGS-NP, 1,0 pgpCAGGS-M, 0,75 ug pCAGGS-F-Kl1IG e 1,0 pg pCAGGS-HA. Um to-tal de 3,75 pg de DNA de plasmídeo por placa de 35mm seráusado em todos os experimentos de transfecção. Quando somen-te um, dois, ou três DNAcs forem usados, a quantidade totalde DNA transfectado será mantida constante adicionando DNAdo vetor pCAGGS. Para cada transfecção, um mistura de DNA e5 μl de Lipofectamina em meio OptiMEM (Gibco/Invitrogen) se-rá incubada em temperatura ambiente por 45 minutos e adicio-nada nas células previamente lavadas com meio OptiMEM. Ascélulas serão incubadas por 5 horas, os complexos Lipofecta-mina-DNA serão removidos, e 2 mL de DMEM complementado seráadicionado. Depois de 36 horas, o meio será substituído com0,7 mL de DMEM sem cisteína e metionina e complementado com100 \iCi de mistura 35S-metionina e 35S-Cisteina (NEG-772EASYTAG™ Mistura de Marcação da Proteína de Expressão, 35S,Perkin Elmer Life Sciences Inc.).Depois de 4 horas de marcade pulso, um conjunto de placas transfectadas será lisado,enquanto que em um outro conjunto, o meio será substituídocom 1,0 mL de DMEM complementado com 0,1 mM metionina fria(Nutritional Biochemicals Corporation). Depois de 8 horas de"chase", o sobrenadante da célula será coletado. Além domais, as células serão sonicadas para liberar VLPs associa-dos com célula. Os sobrenadantes de células resultantes se-rão combinados. As células serão lisadas em 0,5 mL de tampãode lise (10 mM NaCl, 1,5 mM MgC12, 10 mM Tris-HCl pH 7,4)contendo Triton-DOC (Triton 1%, deoxicolato de sódio 1%) e1,25 mg de N-etilmaleimido (NEM). Células serão coletadascom uma raspadeira de célula e homogeneizadas passando pormeio de uma agulha calibre 26 de 10 a 15 vezes.Para determinar se o caminho VPS está envolvido nagemulação de VLP, células 293T subconfluentes serão simulta-neamente transfectadas com pCAGGS-M e diferentes concentra-ções tanto do pBJ5-Vps4-E228Q-Flag quanto do pDsRed2-Nl-CHMP3. Vetores vazios correspondentes serão usados como con-trole. Células serão incubadas por 36 horas e o mesmo proto-colo "pulse-chase" foi realizado como supradescrito.

Para gerar partículas virais para controles, célu-las de primata ou humanas serão infectadas em um MOI de 5pfu por 30 horas e marcado com mistura 35S-metionina e 35S-cisteína por 4 horas e "chased" em meio não radioativo por 8horas da forma supradescrita. Sobrenadante da célula serácoletado e vírions serão purificados da forma descrita a se-guir. Células serão lisadas e homogeneizadas da forma supra-descrita.

Purificação de Virus e de VLP: VLPs bem como ví-rions serão purificados a partir de sobrenadantes de célulasem protocolos previamente desenvolvidos para a purificaçãode vírus. Os sobrenadantes de células serão clarificados porcentrifugação a 5.000 rpm por 5 minutos em 4 °C, revestidono topo de uma etapa de gradiente que consiste de 3,5 mL 20%e 0,5 mL 65% de soluções de sacarose em tampão TNE (25mMTris-HCl pH 7,4, 150 mM 'NaClf 5 mM EDTA), e centrifugado em40.000 rpm por 12 horas em 4 0C usando um rotor SW50.1(Beckman). A interface (contendo partículas concentradas)será coletada em 0,5 mL, misturada com 2,0 mL de sacarose80% e revestida no topo de 1,0 mL de reforço de sacarose80%. Camadas adicionais de sacarose (1,0 mL de sacarose 50 %e 0,5 mL de sacarose 10%) serão dispostas em camada no topoda amostra. O gradiente será centrifugado em 38.000 rpm por20 horas em 4°C. O gradiente será coletado da base em umafração de ImL e oito frações de 0,5 mL usando uma bomba po-listáltica. As densidades de cada fração serão determinadasusando um refratômetro. VLPs derivadas da expressão de todasas combinações de proteínas serão preparadas em um único ex-perimento, assim, habilitando a comparação direta de resul-tados .

Imunoprecipitação e eletroforese em gel poliacri-lamida: Imunoprecipitação será realizada combinando um volu-me de lisato celular ou fração de gradiente de sacarose comdois volumes de tampão TNE. Amostras foram incubadas com an-ticorpos policlonais específicos do MV por 16 horas em 4 °C.Anti-soro usado para precipitar NP, F e HA será anticorpopoliclonal de coelho criado contra MV inativado por UV porprotocolos padrão. Complexos imunológicos (ICs) serão adsor-vidos na proteína A (Células Pansorbina, CALBIOCHEM) por 2horas em 4 °C, precipitados e então lavados três vezes emtampão de lavagem de imunoprecipitação (IP) (solução salinatamponada com fosfato (PBS) contendo Tween-20 0,5% e dodecilsulfato de sódio (SDS) 0,4%). ICs serão ré-suspensos tampãode amostra de eletroforese em gel poliacrilamida-SDS (125 mMTris-HCl, pH 6,8, SDS 2%, glicerol 10%, azul de Bromofenol0,4%) com 1 M β-mercaptoetanol (BME) e fervido. Proteínasserão separadas em gel poliacrilamida-SDS 8% e sujeitas aautorradiografia. A quantificação de autorradiografias re-sultantes será realizada usando um Fluor-S™ MultiImager (Bi-oRad).

Exemplo 15: Produção de Vacina por VLP Contra oVirus Sincicial Respiratório

Este exemplo apresenta um protocolo que resultarána produção de vacinas por VLP especificas para o virus sin-cicial respiratório (RSV).

Vetores: Seqüências de DNAc do RSV que codificamproteínas NP (isto é, por exemplo, SEQ ID N0:70), M (isto é,por exemplo, SEQ ID NO:66 ou, alternativamente, M2-1), G(isto é, por exemplo, SEQ ID NO:54), e F não clivada (istoé, por exemplo, SEQ ID NO:60) serão subclonadas no vetor deexpressão pCAGGS para gerar pCAGGS-NP, pCAGGS-M2-l, pCAGGS-Ge pCAGGS-F-Rl08N/Rl0 9N, respectivamente. O DNAc que codificaa proteína F do RSV sofrerá mutação para eliminar um dosdois sítios de reconhecimento de furina nos aminoácidos 106-109 e 131-136, da forma previamente relatada (Gonzalez-Reyes, et al, PNAS 98: 9859). Eliminação da clivagem inibiráa capacidade da proteína F fundir. Provavelmente, a ausênciada fusão célula-célula aumentará a liberação de VLPs, Umamutação dupla, R108N/R109N, elimina uma clivagem e inibe aatividade de fusão da proteína (Gonzalez-Reyes, et al, PNAS98: 9859) . Proteínas adicionais RSV não encontradas em ou-tros paramixovírus são NSl, NS2, M2-2 e SH, mas todas mos-traram ser não essenciais para a montagem do vírus (revisadoem Collins, et al, Respiratory Syncytial Virus, in FieldsVirology, Ed. Knipe, D. and Howley, P. Lippincott Williams eWilkins, 2001) . A proteína G também é não essencial para amontagem, mas provavelmente contribui para uma imuno-resposta protetora contra o vírus.

Linhagens celulares: RSV cresce eficientemente emuma variedade de linhagens celulares de fontes humanas e a-nimais. Entretanto, células HEp-2 (um variante da célula He-la) são as mais eficientes na produção de vírus (revisado emCollins, et al, Respiratory Syncytial Virus, in Fields Viro-logy, Ed. Knipe, D. and Howley, P. Lippincott Williams andWilkins, 2001), assim, estas células serão usadas. CélulasA549 (células do carcinoma pulmonar epitelial alveolar tipoII), também relatadas como permissivas para RSV, também se-rão usadas.

Transfecção, infecção e marcação metabólica:

Transfecções de células subconfluentes serão realizadas u-sando Lipofectamina (Invitrogen) da forma recomendada pelofabricante. As seguintes quantidades de DNA de plasmídeo se-rão usadas por placa de 35mm: 1,0 μg pCAGGS-NP, 1,0 ygpCAGGS-M2-l, 0,75 ug pCAGGS-F-R108N/R109N e 1,0 ug pCAGGS-G.Um total de 3,75 yg de DNA de plasmídeo por placa de 35mmserá usado em todos os experimentos de transfecção. Quandosomente um, dois ou três DNAcs forem usados, a quantidadetotal de DNA transfectado será mantida constante adicionandoDNA do vetor pCAGGS. Para cada transfecção, uma mistura deDNA e 5 μL de Lipofectamina em meio OptiMEM (Gib-co/Invitrogen) será incubada em temperatura ambiente por 45minutos e adicionada nas células previamente lavada com meioOptiMEM. As células serão incubadas por 5 horas, os comple-xos Lipofectamina-DNA serão removidos, e 2 mL de DMEM com-plementado serão adicionados. Depois de 36 horas, o meio se-rá substituído com 0,7 mL de DMEM sem cisteína e metionina ecomplementado com 100 pCi de mistura 35S-metionina e 35S-cisteína (NEG-772 EASYTAG™ Mistura de Marcação da Proteínade Expressão, 35S, Perkin Elmer Life Sciences Inc.). Depoisde 4 horas de marca de pulso, um conjunto de placas trans-fectadas será lisado, ao mesmo tempo que em um outro conjun-to o meio será substituído com 1,0 mL de DMEM complementadocom 0,1 mM de metionina fria (Nutritional Biochemicals Cor-poration). Depois de 8 horas de "chase", o meio será coleta-do. Além do mais, as células irão sonicar para liberar VLPsassociados com as células. Os sobrenadantes de célula resul-tantes serão combinados. As células serão lisadas em 0,5 mLde tampão de Iise (10 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl,pH 7,4) contendo Triton-DOC (Triton 1%, deoxicolato de sódio1%) e 1,25 mg de N-etilmaleimido (NEM). Células serão cole-tadas com uma raspadeira de célula e homogeneizado passandopor meio de uma agulha calibre 26 de 10 a 15 vezes.

Para determinar se o caminho VPS está envolvido nagemulação de VLP, células HEp-2 subconfluentes serão simul-taneamente transfectadas com pCAGGS-M2-l e diferentes con-centrações tanto de pBJ5-Vps4-E228Q-Flag quanto de pDsRed2-N1-CHMP3. Vetores vazios correspondentes serão usados comocontrole. Células serão incubadas por 36 horas e o mesmoprotocolo "pulse-chase" foi realizado da forma supradescrita.

Para gerar partículas virais para controles, célu-las serão infectadas em um MOI de 10 pfu por 30 horas e mar-cadas com mistura 35S-metionina e 35S-Cisteina por 4 horas, e"chased" em meio não radioativo por 8 horas da forma supra-descrita. Sobrenadante da célula será coletado e virions se-rão purificados da forma descrita a seguir. Células serãolisadas e homogeneizadas da forma supradescrita.

Purificação de Virus e de VLP: VLPs bem como vi-rions serão purificados a partir de sobrenadantes de célulasem protocolos previamente desenvolvidos para a purificaçãode virus. Os sobrenadantes de células serão clarificados porcentrifugação a 5.000 rpm por 5 minutos em 4 °C, revestidosno topo de um gradiente de etapa que consiste em 3,5 mL 20%e 0,5 mL 65% de soluções de sacarose em tampão TNE (25 mMTris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA) , e centrifugado a40.000 rpm por 12 horas em 4 0C usando um rotor SW50.1(Beckman). A interface (contendo partículas concentradas)será coletada em 0,5 mL, misturada com 2,0 mL de sacarose80%, e revestida no topo de 1,0 mL de reforço de sacarose80%. Camadas adicionais de sacarose (1,0 mL de sacarose 50 %e 0,5 mL de sacarose 10%) serão dispostas em camada no topoda amostra. O gradiente será centrifugado em 38.000 rpm por20 horas em 4 °C. O gradiente será coletado da base em umafração de ImL e em oito frações de 0,5 mL usando uma bombapolistáltica. As densidades de cada fração serão determina-das usando um refratômetro. VLPs derivadas da expressão detodas as combinações de proteínas serão preparadas em um ú-nico experimento, assim, habilitando a comparação direta dosresultados.Imunoprecipitação e eletroforese em gel poliacri-lamida: Imunoprecipitação será realizada combinando um volu-me de lisato celular ou fração de gradiente de sacarose comdois volumes de tampão TNE. Amostras serão incubadas com an-ticorpos policlonais específicos contra RSV por 16 horas em4 °C. Anti-soro a ser usado é comercialmente disponível dediversas fontes. Complexos imunológicos (ICs) serão adsorvi-dos na proteína A (Células Pansorbina, CALBIOCHEM) por 2 ho-ras em 4 °C, precipitados e então lavados três vezes em tam-pão de lavagem em imunoprecipitação (IP) (solução salinatamponada com fosfato (PBS) contendo Tween-20 0,5% e dodecilsulfato de sódio (SDS) 0,4%). ICs serão ré-suspensos em tam-pão de amostra de eletroforese em gel poliacrilamida-SDS(125 mM Tris-HCl, pH 6,8, SDS 2%, glicerol 10%, azul de Bro-mofenol 0,4%) com 1 M β-mercaptoetanol (BME) e fervido. Pro-teínas serão separadas em gel poliacrilamida-SDS 8% e sujei-tas a autorradiografia. A quantificação das autorradiografi-as resultantes será realizada usando um Fluor-S™ Multilmager(BioRad).

Exemplo 16: Produção de Vacina por VLP Contra Pa-rainfluenza 3

Este exemplo apresenta um protocolo que resultarána produção de vacinas por VLP específicas contra o parain-fluenza 3 (PIV).

Vetores: Seqüências de DNAc do PIV3 que codificamproteínas NP (isto é, por exemplo, SEQ ID NO:76), M (isto é,por exemplo, SEQ ID N0:80), HN (isto é, por exemplo, SEQ IDNO:84), e F não clivada (isto é, por exemplo, SEQ ID NO:78)serão subclonadas no vetor de expressão pCAGGS para gerarpCAGGS-NP, pCAGGS-M, pCAGGS-HN e pCAGGS-F, respectivamente.O DNAc que codifica a proteína F do PIV3 sofrerá mutação pa-ra eliminar o sítio de reconhecimento de furina no aminoáci-do 109. A lisina no aminoácido 108 será modificada para gli-cina. A eliminação de clivagem inibirá a capacidade da pro-teína F fundir. Provavelmente, a ausência de fusão célula-célula aumentará a liberação de VLPs.

Linhagens celulares: PIV 3 cresce eficientementeem uma variedade de linhagens celulares de fontes humanas ede primata. Assim, células Hela (células do carcinoma cervi-cal humano), células 293 (células embrionárias de rim huma-no) , células VERO (células do rim de macaco verde africano)e células COS-7 (primata) serão usadas, (revisado em Cha-nock, et al, Parainfluenza Viruses, in Fields Virology, Ed.Knipe, D. and Howley, P. Lippincott Williams e Wilkins,2001. Células LLC-MK2 (células do rim de reso) e NCI-H292(carcinoma pulmonar humano) também serão usadas com se elastivessem sido usadas com sucesso para gerar vírus.

Transfecção, infecção e marcação metabólica:

Transfecções de células subconfluentes serão realizadas u-sando Lipofectamina (Invitrogen) da forma recomendada pelofabricante. As seguintes quantidades de DNA de plasmídeo se-rão usadas por placa de 35mm: 1,0 μg pCAGGS-NP, 1,0 ygpCAGGS-M, 0,75 μg pCAGGS-F-K108G e 1,0 μg pCAGGS-HN. Um to-tal de 3,75 yg de DNA de plasmídeo por placa de 35mm seráusado em todos os experimentos de transfecção. Quando somen-te um, dois, ou três DNAcs forem usados, a quantidade totalde DNA transfectado será mantida constante adicionando DNAdo vetor pCAGGS. Para cada transfecção, uma mistura de DNA e5 pL de Lipofectamina em meio OptiMEM (Gibco/Invitrogen) se-rá incubada em temperatura ambiente por 4 5 minutos e adi-cionada nas células previamente lavadas com meio OptiMEM. Ascélulas serão incubada por 5 horas, os complexos Lipofecta-mina-DNA serão removidos, e 2 mL de DMEM complementado serãoadicionados. Depois de 36 horas, o meio será substituído com0,7 mL de DMEM sem cisteína e metionina e complementado com100 pCi de mistura 35S-metionina e 35S-Cisteina (NEG-772EASYTAG™ Mistura de Marcação da Proteína de Expressão, 35S,Perkin Elmer Life Sciences Inc.). Depois de 4 horas de marcade pulso, um conjunto de placas transfectadas será lisado,ao mesmo tempo em que em um outro conjunto o meio será subs-tituído com 1,0 mL de DMEM complementado com 0,1 mM de meti-onina fria (Nutritional Biochemicals Corporation). Depois de8 horas de "chase", o sobrenadante da célula será coletado.As células serão lisadas em 0,5 mL de tampão de Iise (10 mMNaCl, 1,5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl pH 7,4) contendo Triton-DOC (Triton 1%, deoxicolato de sódio 1%) e 1,25 mg de N-etilmaleimido (NEM). Células serão coletadas com raspadeirade célula e homogeneizadas passando por meio de uma agulhacalibre 26 de 10 a 15 times.

Para determinar se o caminho VPS está envolvido nagemulação de VLP, células HEp-2 subconfluentes serão simul-taneamente transfectadas com pCAGGS-M e diferentes concen-trações tanto de pBJ5-Vps4-E228Q-Flag quanto de pDsRed2-Nl-CHMP3. Vetores vazios correspondentes serão usados como con-trole. Células serão incubadas por 36 horas e o mesmo proto-colo "pulse-chase" foi realizado da forma supradescrita.

Para gerar partículas virais para controles, célu-las serão infectadas em um MOI de 10 pfu por 30 horas, mar-cadas com mistura de 35S-metionina e 35S-Cisteina por 4 horase "chased" em meio não radioativo por 8 horas da forma su-pradescrita. O sobrenadante da célula será coletado e ví-rions serão purificados da forma descrita a seguir. As célu-las serão lisadas e homogeneizadas da forma supradescrita.

Purificação de Vírus e de VLP: VLPs bem como ví-rions serão purificados a partir de sobrenadantes de célulasem protocolos previamente desenvolvidos para a purificaçãode vírus. Os sobrenadantes de células serão clarificados porcentrifugação a 5.000 rpm por 5 minutos em 4 °C, revestidono topo de um gradiente de etapa que consiste em 3,5 mL 20%e 0,5 mL 65% de soluções de sacarose em tampão TNE (25mMTris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA) , e centrifugado em40.000 rpm por 12 horas em 4 °C usando um rotor SW50.1(Beckman). A interface (contendo partículas concentradas)será coletada em 0,5 mL, misturada com 2,0 mL de sacarose80% e revestida no topo de 1,0 mL de reforço de sacarose80%. Camadas adicionais de sacarose (1,0 mL de sacarose 50%e 0,5 mL de sacarose 10%) serão dispostas em camada no topoda amostra. O gradiente será centrifugado em 38.000 rpm por20 horas em 4 °C. O gradiente será coletado a partir da baseem uma fração de 1 mL e em oito frações de 0,5 mL usando umabomba polistáltica. As densidades de cada fração serão de-terminadas usando um refratômetro. VLPs derivados da expres-são de todas as combinações de proteínas serão preparadas emum único experimento, assim, habilitando a comparação diretados resultados.

Imunoprecipitação e eletroforese em gel poliacri-lamida: Imunoprecipitação será realizada combinando um volu-me de lisato celular ou fração de gradiente de sacarose comdois volumes de tampão TNE. Amostras serão incubadas com an-ticorpos policlonais específicos contra PIV3 por 16 horas em4 °C. Anti-soro a ser usado é comercialmente disponível dediversas fontes. Complexos imunológicos (ICs) serão adsorvi-dos na proteína A (Células Pansorbina, CALBIOCHEM) por 2 ho-ras em 4 °C, precipitados e então lavados três vezes era tam-pão de lavagem em imunoprecipitação (I-P) (solução salinatamponada com fosfato (PBS) contendo Tween-20 0,5% e dodecilsulfato de sódio (SDS) 0,4%) . ICs serão ré-suspensos em tam-pão de amostra de eletroforese em gel poliacrilamida-SDS(125 mM Tris-HCl, pH 6,8, SDS 2%, glicerol 10%, azul de Bro-mofenol 0,4%) com 1 M β-mercaptoetanol (BME) e fervido. Pro-teínas serão separadas em gel poliacrilamida-SDS 8% e sujei-tas a autorradiografia. A quantificação das autorradiografi-as resultantes será realizada usando um Fluor-S™ Multitmager(BioRad).

Exemplo 17 Mutagênese Sítio-Específica de DomíniosTardios

Mutações nas seqüências PKSP e YANL da proteína Mnos aminoácidos 216 e 219 e nos aminoácidos 232 e 235 foramintroduzidas por PCR para produzir M-A216A219 e M-A232A235, res-pectivamente. Iniciadores mutagênicos direcionados a sítioespecifico foram projetados para substituir os resíduos deprolina nas posições 216 e 219 e resíduos de tirosina e leu-cina nas posições 232 e 235, respectivamente, com alanina.Genes M mutantes adicionais foram construídos substituindoseqüências PTAP ou YPDL por YANL em posições do aminoácido232 a 235. A íntegra dos genes de cada DNA mutante da prote-ína M foi seqüenciada para verificar que nenhuma mutação a-dicional foi introduzida pelo protocolo de mutagênese. Muta-ções geradas são ilustradas na Figura 70.

Exemplo 18 Liberação de VLP das Células 293T

Este exemplo avalia os efeitos na liberação de partícula de proteínas VPS humanas mutantes dominantes nega-tivos disponíveis e se células epiteliais renais humanas(293T) podem suportar a liberação de VLPs de NDV.

Partículas VLP foram liberadas das células 293Tque expressam proteína M somente (painel do topo) ou células293T co-expressando proteínas NP, M, F-K115Q e HN (painel dabase). Figura 67, Painel A. Partículas liberadas das células293T que expressam proteína M somente foram muito heterogê-neas em relação à densidade (Figura 67, painel A, painel detopo), muito similar às partículas liberadas das células deaves que expressam proteína M somente (dados não mostrados).Ao contrário, VLPs liberadas das células 293T que expressamtodas as 4 principais proteínas estruturais tiveram densida-des mais homogêneas. Estas partículas foram ligeiramente me-nos densas (1,18 g/cc) do que o vírus autêntico (1,2 g/cc;(Lamb et al., In: Paramyxoviridae: The Viruses and Their Re-plication, Third edition ed, vol. 1. LippincottWilliams &Wilkins, Philadelphia (2001))) em função da ausência de RNAgenômico.

Estes resultados combinados mostram que as VLPs daproteína M e as VLPs completas foram liberadas das células293T. Entretanto, a eficiência de liberação de partículasdas células 293T, medida pelo percentual de proteína M mar-cada em pulso restante nas células depois uma longa "chase"não radioativa, foi inferior à liberação de VLP das célulasde aves (50% em relação a 84%, respectivamente, dados nãomostrados).

Exemplo 19: Mutantes de Proteína VPS Negativo Do-minante Inibem a Liberação de Partícula

Este exemplo foi projetado para determinar se ainibição da liberação de partícula foi em função somente dasobrexpressão de proteínas VPS negativo dominante.

Células 293T foram transfectadas com controle devetor, CHMP3 tipo selvagem, Vps4A tipo selvagem, AIPl tiposelvagem, CHMP3 negativo dominante (dn), Vps4A dn, e AIPldn.

As formas tipo selvagem de cada proteína VPS tevepouco efeito na liberação de partícula. A liberação de par-tícula da proteína M foi inibida por CHMP3-dn em cerca de90%. (Figura 68, Painéis AeB). Vps4A-E228Q inibiu a libe-ração de VLP da proteína M em cerca de 90% (Figura 68, Pai-néis CeD), e AIP-I-RFP inibiu a liberação de partícula em90% (Figura 68, Painéis E e F). As formas negativo dominantede CHMP3, Vps4A,e AIPlf mas não as formas tipo selvagem, i-nibiram a liberação de VLPs contendo todas as quatro proteí-nas virais. Figura 69.

Estes resultados combinados mostram que a inibiçãoda liberação de VLP não foi em função da sobrexpressão daproteína VPS, mas, em vez disto, foi em função do efeito es-pecífico das proteínas mutantes dn. Estes resultados supor-tam a conclusão de que um caminho VPS intacto facilita a li-beração de partícula da proteína M.

Exemplo 20: Mutações da Seqüência YANL Inibe Libe-ração de VLP

Este exemplo apresenta dados que mostram que o do-mínio L de uma proteína M do NDV desempenha um papel na ge-mulação da partícula. Por exemplo, a seqüência de uma prote-ína M do NDV tem duas possíveis seqüências do domínio L,PKSP e YANL, que são similares aos domínios L clássicos PTAPe YPXL, respectivamente (Freed, E. O., "Mechanisms of enve-loped vírus release" Virus Res 106:85-86 (2004)). Os dados aseguir mostram que induzindo mutações nestas seqüências dodomínio L, a liberação de VLP pode ser inibida.

Os resíduos de prolina na seqüência PKSP foramsubstituídos com alanina (M-A216A219) , e a tirosina e leucinana seqüência YANL foram substituídas com alanina (M-A232A235)(Figura 70, Painel A). Estas proteínas M mutantes foram ex-pressas tanto individualmente (Figura 70, Painel B, extra-tos) quanto em combinação com proteínas NP, F-K115Q e HN(Figura 70, Painel D, extratos). Partículas foram liberadasdas células que expressam a M-A2i6A2i9 mutante em níveis com-paráveis com as células que expressam proteína M tipo selva-gem. Figura 5, Painéis B-E.

Ao contrário, houve uma significativa redução departículas liberadas das células que expressam a M-A232A235mutante (Figura 70, Painel B) . Similarmente, a co-expressãoda proteína mutante M-A232A235 com as proteínas NP, F-K115Q eHN resultou em 80% de redução em partículas liberadas (Figu-ra 70, Painel D, compare raias 6 e 8 e Painel E) . Quantida-des de VLPs liberadas das células que co-expressam a proteí-na mutante M-A216A219 com proteínas NP, F-K115Q e HN foramcomparáveis aos níveis do tipo selvagem (Figura 70, PainelD, raias 6 e 7).

Para determinar se a inibição da liberação de par-tícula pela mutação da seqüência YANL foi em função da eli-minação da atividade do domínio L ou de defeitos na confor-mação da proteína M, a seqüência YANL foi substituída sepa-radamente com duas seqüências do domínio L clássicas conhe-cidas, YPDL e PTAP (Morita et ai., "Retrovirus budding" AnnuRev Cell Dev Biol 20:395-425 (2004); Strack et al.,"AI Pl / ALIX is a binding partner for HIV-I p6 and EIAV p9functioning in virus budding " Cell 114:689-699 (2003)).

Tanto a seqüência YPDL quanto a seqüência PTAP su-portaram a liberação das partículas da proteína M do NDV.Figura 705, Painéis B & C. As quantidades de partículas Ii-beradas das proteína M do NDV que contém os motivos YPDL ePTAP substituídos foram comparáveis com os níveis do tiposelvagem. Estes resultados indicam fortemente que a seqüên-cia YANL na posição 232 a 235 na proteína M do NDV funcionacomo um domínio L.

Partículas retrovirais que têm uma proteína gagcom um domínio L YPXL, contêm AIPl (Strack et al. ,"AIPl/ALIX is a binding parceiro for HIV-I ρβ and EIAV p9functioning in virus budding" Cell 114:689-699 (2003)) e po-de representar um polipeptídeo com um tamanho aproximado de100 kD nos géis de SDS-PAGE que contêm proteínas VLP do NDVou proteínas de vírion. AIPl foi incorporada em partículas eVLPs do NDV, desse modo, co-expressando proteína M com umAIPl com HA-tag tanto no N-terminal (HA-AIPl) quanto no C-terminal (AIPl-HA), ou com vetor somente. Partículas da pro-teína M foram liberadas tanto das células que expressam pro-teína M com vetor quanto das células que expressam proteínaMe também HA-tag AIPl. Figura 71, Painel A. A expressão deHA-AIPl e AIPl-HA foram em níveis comparáveis (Figura 71,painel A, gel do extrato IB, raias 2 e 3). Entretanto, so-mente AIPl-HA incorporado em VLPs (Figura 71, painel A, gelVLP IB raia 3). AIPl-HA também pode ser precipitado das VLPsrompidas purificadas. Figura 71, Painel B, direita.

Estes resultados demonstraram que AIPl é incorpo-rada em VLPs e sugere que AIPl pode estar interagindo diretaou indiretamente com a proteína M em partículas.

Exemplo 21: Co-Imunoprecipitação

VLPs purificadas foram incubadas em tampão TNE ge-lado (25 mM Tris HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA) con-tendo Triton X-100 1%, 2,5 mg/mL N-etilmaleimido por 15 mi-nutos. Anticorpo primário em excesso foi adicionado e VLPsforam incubadas em 4 °C durante a noite. Células Pansorbin,bloqueadas durante a noite em tampão TNE contendo Triton X-100 1% e 5 mg albumina sérica bovina (BSA) e então pré-lavadas em TNE contendo Triton X-100 1% e 1 mg/mL de BSA,foram adicionadas em excesso como determinado nos experimen-tos preliminares e a incubação foi continuada em 4 °C commistura constante por pelo menos 2 horas. Complexos imunoló-gicos foram coletados por centrifugação (10.000 rpm por 30segundos em uma microcentrifuga) e lavados três vezes em TNEgelado contendo Triton X-100 0,5%. Os complexos precipitadosforam ré-suspensos em tampão com amostra de gel.

Exemplo 22: Ensaio de Proteção por Protease

A digestão de protease da proteína M de extratoscelulares de ave e VLPs foi realizada adicionando 0,25, 0,5,1, 5, 10 e 20 yg de proteinase K por mL da amostra e incu-bando por 30 minutos no gelo. Em paralelo, VLPs também foramfeitas 0,5% em relação a Triton X-100 antes da incubação comproteinase K. Depois da digestão, fluoreto de fenilmetilsul-fonila (PMSF) (0,1 M) foi adicionado. Para a imunoprecipita-ção subseqüente, as misturas da reação foram feitas 1% emrelação ao Triton X-100 e 0.5% em relação ao deoxicolato desódio.

Exemplo 23: Microscopia de Imunofluorescência

Células de aves que cresceram em chapas de 35 mmcontendo coberturas de vidro foram transfectadas com dife-rentes combinações de DNAcs de NDV da forma supradescrita.Depois de 40 horas, núcleos foram manchados com 5 yg/mL41,6-Diamidino-2-fenilindola (DAPI) por 30 minutos em 37 °C.Células foram lavadas duas vezes com tampão de imunofluores-cência (IF) gelado (PBS contendo albumina sérica bovina 1%,azido de sódio 0,02%, e 5 nM CaCl2) , fixadas com paraformal-deido 2%, bloqueadas com tampão IF por 2 horas, e incubadaspor 1 hora em 4 °C em tampão IF contendo anticorpos policlo-nais contra proteínas HN e F.

Células foram lavadas duas vezes com tampão IF ge-lado, permeabilizadas com Triton X-100 0,05%, bloqueadas comtampão IF por pelo menos 2 horas e incubadas por 1 hora em 4°C em tampão IF contendo fluidos ascites purificados conten-do anticorpo monoclonal anti-proteína M (52-E5). Então, cé-lulas foram lavadas duas vezes com tampão gelado seguido porincubação por 1 hora em 4 °C em tampão IF contendo anticor-pos secundários IgG anti-coelho de cabra conjugado com fluo-resceina (Alexa® 488; Molecular Probes) e IgG anti-camundongo de cabra conjugado com rodamina (Alexa® 568; Mo-lecular Probes). Células foram lavadas com tampão IF gelado,montadas sobre lâminas usando um meio de montagem (Vectashi-eld®, Vetor Labs, Inc) para microscopia de imunofluorescên-cia. Imagens de fluorescência foram adquiridas usando um mi-croscópio de fluorescência Nikon e software Openlab® e pro-cessadas usando Adobe Photoshop®.

Exemplo 24: Proteína M Associada à Membrana

Este exemplo provê dados que confirmam os dados degradiente de sacarose sugerindo que a proteína M pode estarassociada com membranas pela incubação com uma protease.

VLPs e extratos celulares foram tanto deixados nãotratados (Figura 62, raia 1) quanto tratados com diferentesconcentrações de Proteinase K (raias 2 a 7). Da forma espe-rada, a proteína M em extratos celulares era sensível a bai-xas concentrações de protease (Figura 62 painel superior). Abanda inferior abaixo da proteína M é um produto da digestãode protease indicando que a proteína M tem um núcleo resis-tente a protease. Entretanto, proteínas M em VLPs foram am-plamente protegidas da digestão de protease (Figura 62, pai-nel do meio). Ao contrário, o rompimento da membrana da par-tícula com detergente resultou na digestão da proteína M(Figura 62, painel inferior).

Tomados juntos, estes resultados demonstraram queas VLPs da proteína M são partículas ligadas pela membrana.

Exemplo 25: Liberação de VLP Mediada por Proteína

Este exemplo estende os dados relevantes à sufici-ência da proteína M para a liberação de VLP pelo estudo daliberação de VLPs na ausência de uma gene da proteína M.

Células foram transfectadas com todas as combina-ções possíveis de DNAcs NP, F e HN na ausência do gene M.Células que expressam qualquer combinação de proteínas semproteína M não liberaram VLPs. Figura 63. Além do mais, naausência de proteína M, proteínas NP, F e HN (expressas emcombinações em par) foram retidas em extratos celulares de-pois da "chase" de 8 horas (Figura 3, Painel A: raias 2, 4 e5, e Painel C).

Estes resultados sugerem fortemente que a libera-ção de VLP é mediada pela proteína M.Exemplo 26: Co-localização de Proteína M / Glico-proteína

Este exemplo explora adicionalmente o papel desem-penhado por cada proteína na montagem de VLP. Especificamen-te, a localização da membrana plasmática das proteínas M, Fe HN foi determinada por imunofluorescência.

Células transfectadas foram incubadas com proteínaanti-F ou anticorpos anti-proteína HN antes da permeabiliza-ção da célula para limitar a ligação de anticorpos na super-fície celular das proteínas F ou HN. Então, células forampermeabilizadas usando Triton X-IOO 0,05% e então incubadascom anticorpo específico da proteína M.

Células de controle transfectadas por vetor bemcomo células que expressam individualmente proteínas M, F-K115Q ou HN demonstraram que as proteínas F-K115Q e HN foramdistribuídas de forma difundida na superfície das células(Figura 64, Painel A). A proteína M exibiu mancha citoplás-mica difusa bem como estruturas pontuadas de vários tamanhos(Figura 64, Painel A; imagem anti-M e imagem mesclada). En-tretanto, a co-expressão tanto de proteína F quanto de pro-teína HN com proteína M teve pouco efeito na distribuição deproteína M, proteína F ou proteína HN. Adicionalmente, poucaou nenhuma co-localização de glicoproteínas F ou HN com pro-teína M foi observada. Figura 64, Painel B. Estas descober-tas correlacionam com a incorporação muito baixa de proteí-nas F ou HN em proteína M contendo VLPs depois co-expressãoem par.A co-expressão de proteína M com pelo menos duasoutras proteínas mudou ligeiramente a distribuição da prote-ína M. Por exemplo, a co-expressão da proteína M com as pro-teínas F e HN aumentou a co-localização de proteína M tantocom a proteína F quanto com a proteína HN. Figura 64, PainelC. Este resultado é consistente com uma maior incorporaçãode proteína HN, F ou NP quando duas proteínas são co-expressas com a proteína M.

Quando todas as quatro proteínas foram co-expressas, a distribuição de proteína M foi modificada paraestruturas mais pontuadas distribuído predominantemente aolongo das bordas das células. Adicionalmente, a maior partedas proteínas F ou HN sinaliza co-localizada com a proteínaM. Figura 64, Painel D. Embora não seja necessário entendero mecanismo da invenção, acredita-se que este resultado sejaconsistente com uma montagem mais ordenada de VLPs quandotodas as quatro proteínas são co-expressas.

No todo, estes resultados sugerem que a co-localização de proteínas virais é detectada com expressão detrês proteínas e é mais dramática quando as proteínas NP, M,F e HN são co-expressas. Estes resultados também sugerem quehá interações proteína-proteína específicas envolvidas namontagem de partículas.

Exemplo 27: Interações de Proteína Viral em VLP

Este exemplo provê a identificação de diversas in-terações de proteína específica envolvidas na montagem deVLP usando técnicas de co-imunoprecipitação.VLPs radioativamente marcadas formadas com dife-rentes combinações de proteínas foram solubilizadas em Tri-ton X-100 1% e as proteínas presentes foram precipitadas,separadamente, com coquetéis de anticorpos monoespecíficospara proteínas M, HN ou F. Proteínas também foram precipita-das com uma mistura de anticorpos com especificidades paratodas as proteínas a fim de precipitar o total de Proteínasem VLP (raia 6) .

Primeiro, cada coquetel de anticorpos precipitoutodas as proteínas das VLPs formadas com M, HN, F e NP, em-bora a eficiência de precipitação para cada proteína tenhavariado com a especificidade do anticorpo (Figura 65 , Pai-nel A). Embora não seja necessário entender o mecanismo dainvenção, acredita-se que estes resultados sejam consisten-tes com uma rede de interações entre todas as quatro proteí-nas de maneira tal que a precipitação de uma resultou naprecipitação das outras três proteínas.

Os resultados também sugeriram que proteínas indi-retamente ligadas à proteína precipitada foram menos efici-entemente precipitadas do que uma proteína diretamente liga-da a uma proteína precipitada. Por exemplo, anticorpo anti-proteína F precipitou NP muito eficientemente, mas proteínaM muito ineficientemente (raia 3). Esta observação sugereque pode haver uma ligação direta entre as proteínas F e NP,mas não entre a proteína Fea proteína M.

As interações de proteína em VLPs foram mais cla-ramente definidas pela precipitação de proteínas das VLPsformadas com todas as combinações das três proteínas. EmVLPs liberadas das células que expressam proteínas M, F-K115Q e HN, anti-proteina F precipitou somente proteína F etraços de proteína HN (Figura 65, Painel B, raia 3) . Esteresultado indica que a proteína F não complexa diretamentecom a proteína M.

Anticorpo anti-proteina HN co-precipitou proteínaM e proteína HN (Figura 65, painel B, raia 4). Igualmente,anticorpo anti-proteina M co-precipitou proteína HN e prote-ína M (Figura 65, painel B, raia 5). Estes resultados suge-rem fortemente que a proteína M interage com a proteína HNmas não com a proteína F.

VLPs também foram liberadas contendo proteínas NP,M e F-K115Q. Anticorpo anti-proteina F co-precipitou proteí-nas NP e F, mas não proteína M. (Figura 65, painel C, raia3). Anticorpo anti-proteina M co-precipitou proteínas NP eM, mas não proteína F (Figura 65, painel C, raia 4) . Estasobservações indicam que a proteína M interage diretamentecom NP e que a proteína F interage com NP e confirma que asproteínas FeM não interagem.

Embora não seja necessário entender o mecanismo dainvenção, acredita-se que anticorpo anti-proteina M não pre-cipita indiretamente quantidades detectáveis de proteína Fem virtude de uma ineficiente precipitação de proteína NPpoder diminuir as quantidades de proteína F precipitadas aníveis muito baixos. Alternativamente, interações NP-NP exi-gidas para precipitar proteína F com anticorpo anti-proteinaM pode ser rompida por Iise de VLP. Por exemplo, quando VLPscontendo NP, M e HN foram usado, complexos formado com anti-corpo anti-proteina HN continham proteínas NP e M bem comoproteína HN (Figura 65, painel D, raia 3). Além do mais, an-ticorpo anti-proteína M precipitou proteínas NP e HN (Figura65, painel D, raia 4). Estas observações são consistentescom a conclusão de que a proteína M interage tanto com aproteína NP quanto com a proteína HN. Percebe-se adicional-mente que, em uma modalidade, a proteína HN e a proteína NPpodem interagir.

No todo, os resultados da co-imunoprecipitação deproteínas in VLPs bem como os resultados dos estudos de co-localização celular provêem uma base racional para a incor-poração de proteínas virais em VLPs e sugerem que as intera-ções de proteína específica estão envolvidas na montagem deuma partícula semelhante ao vírus do NDV.

Claims

1. Método, CARACTERIZADO pelo fato de que compre-ende :a) forneceri) um vetor de expressão compreendendo seqüênciasde DNA que codificam uma proteína matriz da doença de New-castle,ii) uma célula capaz de ser transfectada pelo ditovetor,b) transfectar a dita célula com o dito vetor emcondições de maneira tal que partículas semelhantes ao vírusda doença de Newcastle sejam geradas.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que adicionalmente compreende aetapa c) coletar as ditas partículas semelhantes à vírus demaneira a criar uma preparação de partículas livre de célu-las.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2,CARACTERIZADO pelo fato de que adicionalmente compreende aetapa d) administrar uma vacina que compreende a dita prepa-ração de partículas a uma galinha.

4. Método, de acordo com a reivindicação 2,CARACTERIZADO pelo fato de que a dita célula é parte de umacultura celular e a dita coleta compreende obter as ditaspartículas do sobrenadante da dita cultura.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4,CARACTERIZADO pelo fato de que a dita cultura celular com-preende células de aves.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o dito vetor adicionalmentecompreende seqüências de DNA que codificam proteínas do ví-rus da doença de Newcastle adicionais selecionadas do grupoque consiste em uma proteína de nucleocapsídeo, uma proteínade fusão e uma proteína hemaglutinina-neuraminidase.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que as ditas partículas são li-vres de DNA viral da doença de Newcastle.

8. Célula transfectada, CARACTERIZADA pelo fato deque é de acordo com a reivindicação 1.

9. Preparação de partículas, CARACTERIZADO pelofato de que são criadas de acordo com a reivindicação 2.

10. Método, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:a) forneceri) uma vacina compreendendo partículas semelhantesao vírus da doença de Newcastle, as ditas partículas compre-endendo uma proteína matriz do vírus da doença de Newcastle,ii) um hospedeiro suscetível à doença de Newcastle,b) imunizar o dito hospedeiro com a dita vacina emcondições de maneira que anticorpos direcionados à dita par-tícula semelhante à vírus sejam produzidos.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10,CARACTERIZADO pelo fato de que o dito hospedeiro é selecio-nado do grupo que consiste em ave, murino e humano.

12. Método, de acordo com a reivindicação 10,CARACTERIZADO pelo fato de que as ditas partículas adicio-nalmente compreendem uma ou mais proteínas do vírus da doen-ça de Newcastle adicionais selecionadas do grupo que consis-te em uma proteína de nucleocapsídeo, uma proteína de fusãoe uma proteína hemaglutinina-neuraminidase.

13. Vacina, CARACTERIZADA pelo fato de que compre-ende partículas semelhantes ao vírus da doença de Newcastle,as ditas partículas compreendendo uma proteína matriz do ví-rus de doença de Newcastle.

14. Vacina, de acordo com a reivindicação 13,CARACTERIZADA pelo fato de que as ditas partículas são li-vres de DNA viral da doença de Newcastle.

15. Vacina, de acordo com a reivindicação 13,CARACTERIZADA pelo fato de que as ditas partículas adicio-nalmente compreendem uma ou mais proteínas virais seleciona-das do grupo que consiste em proteína de fusão, proteína denucleocapsídeo e uma proteína hemaglutinina-neuraminidase.