CN111100183B - 制备溶液渗透性目的蛋白沉淀物及从宿主细胞中分离纯化目的蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了制备溶液渗透性目的蛋白沉淀物及从宿主细胞中分离纯化目的蛋白的方法,属于蛋白纯化技术领域。本发明通过用沉淀盐和透析盐冲洗含有目的蛋白的沉淀物,获得了具有溶液渗透性的目的蛋白沉淀物。本发明分离纯化目的蛋白的方法是利用辛酸、尿囊素和TREN粒子处理含有目的蛋白的宿主细胞收集物,获得的澄清收集液经过滤后,加入含有聚乙二醇和NaCl的缓冲液或者是含有硫酸铵和NaCl的缓冲液进行初步沉淀目的蛋白,利用沉淀盐和高浓度透析盐对蛋白沉淀物冲洗,获得具有溶液渗透性的目的蛋白沉淀物,通过色谱层析进一步纯化得高纯度目的蛋白。该方法纯化效果好,成本低,适用于蛋白纯化过程。
Description
技术领域
本发明涉及制备溶液渗透性目的蛋白沉淀物及从宿主细胞中分离纯化目的蛋白的方法,属于蛋白纯化技术领域。
背景技术
蛋白选择性沉淀是一种常见的蛋白纯化方法,该方法也应用于IgG抗体纯化。所以,IgG抗体可以通过置于高浓度盐或非离子型有机聚合物中进行选择性沉淀。分离这种蛋白沉淀的一代方法需要离心使蛋白沉淀,实现与上清液的分离。切相流过滤方法也被应用于蛋白沉淀处理(M.Kuczewski et al.,Biotechnol.J.,6(2011)56-65;Ghosh,R et al.,J.Chromatogr.A 1107(2006)104-109),但是该方法存在一些弊端,因为理想的纯化方法,沉淀应该在纯化过程中具有一直保持连续且均匀地再悬浮能力。而且,因为固体成分比例一直低于40%,致使利用冲洗方式除去可溶性杂质过程中使用的液体体积量变大。上述这些问题可以采用死端过滤方法改善,然而典型的蛋白沉淀物往往是粘稠的,呈污泥状,容易造成滤膜堵塞。因此,洗液倾向于在沉淀物旁边、裂缝或浅点流过而非穿过蛋白沉淀物,导致冲洗是无效的,蛋白纯化的目的也无法实现。
利用辛酸处理含IgG蛋白制剂来共沉淀宿主蛋白和病毒等杂质可以解决上述提到的问题(Brodsky et al.,Biotechnol.Bioeng.109(2012)2589-2598)。在这样的体系中,沉淀物中仍存在粘性的残基,会堵塞设备/薄膜的表面。
发明内容
为解决现有蛋白纯化过程中由于含有目的蛋白的沉淀物粘稠度高,会堵塞设备/薄膜表面而导致蛋白损失,以及为获得高纯度目的蛋白利用造价昂贵的亲和层析柱进行蛋白纯化问题,本发明提供了一种制备溶液渗透性目的蛋白沉淀物及从宿主细胞中分离纯化目的蛋白的方法,采用的技术方案如下:
本发明的目的在于提供一种制备具有溶液渗透性的目的蛋白沉淀物的方法,该方法是用沉淀盐和透析盐冲洗含有目的蛋白的沉淀物,获得具有溶液渗透性的目的蛋白沉淀物;其中:所述沉淀盐选自硫酸铵、硫酸钠、柠檬酸钠、柠檬酸钾和磷酸钾中的一种或几种的混合物;所述透析盐选自氯化钠、氯化钾、醋酸钠、醋酸钾、硫氰酸钠、硫氰酸钾、醋酸镁、氯化镁和盐酸胍中的一种或几种混合物。
优选地,所述沉淀盐和透析盐是以二者的混合物冲洗目的蛋白或者是先用沉淀盐冲洗目的蛋白沉淀物、再用透析盐冲洗目的蛋白沉淀物或者是先用透析盐冲洗目的蛋白沉淀物、再用沉淀盐冲洗目的蛋白沉淀物。
更优选地,步骤3)所述透析盐的浓度选自以下范围中的任意值:(1)0.1M~透析盐的饱和浓度,(2)0.5~1M;(3)1~2M;(4)2~4M。
本发明所述含有目的蛋白的沉淀物是通过将含有目的蛋白的宿主细胞收集物进行初步纯化获得的含有目的蛋白的沉淀物。
本发明还提供了一种从含有目的蛋白的宿主细胞中分离纯化目的蛋白的方法,该方法包括如下步骤:
1)将含有目的蛋白的宿主细胞回收后离心,收集沉淀物得宿主细胞离心沉淀物,用辛酸溶液溶解宿主细胞离心沉淀物,溶解后加入尿囊素固体,经搅拌处理后加入TREN粒子,孵育过夜后离心除去固体颗粒,然后进行深度过滤,收集滤液;
2)向步骤1)所得滤液中加入含有聚乙二醇和NaCl的缓冲液或含有硫酸铵和NaCl的缓冲液进行初步沉淀,获得含有目的蛋白的沉淀物;
3)将含有目的蛋白的沉淀物置于滤膜上,利用沉淀盐和透析盐对步骤2)所得含有目的蛋白的沉淀物进行冲洗,除去可溶性的杂质蛋白,获得具有溶液渗透性的目的蛋白沉淀物;所述沉淀盐选自硫酸铵、硫酸钠、柠檬酸钠、柠檬酸钾和磷酸钾中的一种或几种的混合物;所述透析盐选自氯化钠、氯化钾、醋酸钠、醋酸钾、硫氰酸钠、硫氰酸钾、醋酸镁、氯化镁和盐酸胍中的一种或几种混合物;
4)利用色谱层析进一步纯化,获得高纯度目的蛋白。
优选地,步骤1)所述辛酸溶液的质量浓度为0.1%~0.5%。
更优选地,步骤1)所述辛酸溶液的质量浓度为0.4%~0.5%。
优选地,步骤1)中加入尿囊素固体至尿囊素的终浓度为1%(质量)。
优选地,步骤1)所述TREN粒子的添加量为5%(体积)。
优选地,步骤2)所述聚乙二醇的分子量为1000Da~10000Da。
优选地,步骤2)所述聚乙二醇的浓度为15%~20%(体积)。
更优选地,步骤2)所述聚乙二醇的分子量为1000Da,2000Da,4000Da,6000Da或8000Da。
更优选地,步骤3)所述透析盐的浓度选自以下范围中的任意值:(1)0.1M~透析盐的饱和浓度,(2)0.5~1M;(3)1~2M;(4)2~4M。
优选地,步骤3)所述沉淀盐为硫酸铵,透析盐为氯化钠。
更优选地,步骤3)所述沉淀盐为2M硫酸铵,透析盐为0.5M氯化钠。
优选地,步骤3)所述沉淀盐和透析盐是以二者的混合物冲洗目的蛋白或先用沉淀盐冲洗目的蛋白沉淀物、再用透析盐冲洗目的蛋白沉淀物或先用透析盐冲洗目的蛋白沉淀物、再用沉淀盐冲洗目的蛋白沉淀物。
优选地,步骤4)所述利用色谱层析进一步纯化之前还包括二次沉淀的步骤;所述二次沉淀是将步骤3)获得的具有溶液渗透性的目的蛋白沉淀物溶解后利用沉淀盐进行二次沉淀;所述沉淀盐选自硫酸铵、硫酸钠、柠檬酸钠、柠檬酸钾和磷酸钾中的一种或几种的混合物。
更优选地,二次沉淀是利用2M硫酸铵溶液进行的。
优选地,色谱层析为负电荷分子筛或疏水层析或混合层析。
本发明较优方法是分离纯化目的蛋白的方法是利用辛酸、尿囊素和TREN粒子处理含有目的蛋白的宿主细胞收集物,获得的澄清收集液经过滤后,加入含有聚乙二醇和NaCl的缓冲液或者是含有硫酸铵和NaCl的缓冲液进行初步沉淀目的蛋白,利用沉淀盐和高浓度透析盐对蛋白沉淀物进行冲洗除杂,可获得具有溶液渗透性的目的蛋白沉淀物,冲洗后的蛋白沉淀物,经盐析二次沉淀以及色谱层析进一步纯化,最终可以得到高纯度的目的蛋白。
本发明中目的蛋白可以为一种抗体,如IgG抗体。
本发明步骤2)中采用低浓度氯化钠,如0.5M,用于蛋白稳定,防止蛋白聚集。
本发明有益效果:
本发明首次发现利用沉淀盐和透析盐一起或先后冲洗含有目的蛋白的沉淀物,可以去除含有目的蛋白的沉淀物中的粘性残基,获得的目的蛋白沉淀物具有溶液渗透性,不堵塞过滤设备或滤膜,因此用沉淀盐和透析盐一起或先后冲洗含有目的蛋白的沉淀物可以获得具有溶液渗透性的目的蛋白沉淀物。此外,具有溶液渗透性的目的蛋白沉淀物经冲洗后,可同时除去可溶性的杂质蛋白,从而提高目的蛋白的纯度,并减少了后续的纯化步骤。
现有蛋白纯化过程中,在层析纯化之前获得的蛋白沉淀物通常溶解在PBS溶液中。层析过程中对蛋白溶液的电导率(即盐浓度)和pH要求极为严苛,而不同的层析方法所需要的电导率和pH具有很大差异。因此在进行后续的层析纯化之前,溶解好的蛋白沉淀物通常需要进行平衡缓冲液置换,因此需要至少更换一次缓冲液。而本发明方法在用沉淀盐和透析盐冲洗沉淀后获得的目的蛋白,具有溶液渗透性,在去除杂质蛋白的同时使得获得的沉淀物可以直接溶解在平衡缓冲液中,用于负电荷分子筛或疏水层析或混合层析的后续操作步骤,因此无需更换缓冲液。
本发明的纯化方法基于获得的溶液渗透性目的蛋白沉淀物展开的,由于在沉淀盐和透析盐冲洗过程中去除了大部分可溶性杂质蛋白,因此后续纯化过程中再结合廉价低效的硫酸铵二次沉淀方法即可获得高纯度的目的蛋白,与现在常用的昂贵但高效的蛋白亲和层析相比,本发明方法的纯化效果更好,成本更低,具有极高的经济效益。
深度过滤是比滤膜过滤更有效的过滤方式,但是深度过滤后利用阴离子交换层析进行蛋白纯化会导致目的蛋白损失率较高,本发明方法中通过采用TREN粒子孵育代替阴离子交换层析可以明显减少目的蛋白的损失。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明,但本发明不受实施例的限制。
以下实施例以IgG抗体为例进行说明。以下实施例中所用的TREN粒子的英文名称为TREN particles(Workbeads TREN 40high),其中TREN的英文名称为Tris(2-aminoethyl)amine,中文名称为三(2-氨乙基)胺。以下实施例中Hepes缓冲液和磷酸钠缓冲液是蛋白纯化过程中常用的溶剂。
实施例1
本发明提供了一种利用透析盐和沉淀盐制备具有溶液渗透性的目的蛋白沉淀物的方法,该方法按照如下步骤进行:
含有IgG单克隆抗体的宿主细胞经10000rpm离心30min,收集沉淀物。配制质量浓度为0.5%的辛酸溶液,用0.5%辛酸溶液溶解宿主细胞离心沉淀物。溶解后向上述溶解后的混合物中加入尿囊素,使尿囊素在上述溶解后的混合物中的最终质量浓度为1%。混合物室温搅拌2小时,搅拌期间不需要调节pH和盐浓度。按照5%(体积)的添加量加入TREN粒子,室温孵育过夜。之后混合物利用深度过滤滤去固体颗粒。在获得的滤液中加入硫酸铵固体至终浓度2.0M,添加硫酸铵固体过程中持续搅拌,将获得的混合物置于微滤盘上过滤,滤掉可溶性杂质蛋白,目的蛋白以沉淀物形式留在滤膜上。在过滤15%左右体积时,滤膜发生阻塞。
在上述蛋白纯化过程中,经过深度过滤获得的滤液中加入硫酸铵固体至终浓度2.0M,同时加入NaCl固体至终浓度0.5M,添加过程中持续搅拌,混合物置于微滤盘上过滤,滤掉可溶性杂质蛋白,发现整个过滤过程不会发生滤膜阻塞现象,可无需更换滤膜完成过滤。
实施例2
本发明提供了一种结合辛酸、尿囊素、深度过滤、透析盐和沉淀盐冲洗以及负电荷分子筛的蛋白纯化方法,该方法按照如下步骤进行:
含有IgG单克隆抗体的宿主细胞经10000rpm离心30min,收集沉淀物。配制质量浓度为0.5%的辛酸溶液,用0.5%辛酸溶液溶解宿主细胞离心沉淀物。溶解后向上述溶解后的混合物中加入尿囊素,使尿囊素在上述溶解后的混合物中的最终质量浓度为1%。混合物室温搅拌2小时,搅拌期间不需要调节pH和盐浓度。按照5%(体积)的添加量加入TREN粒子,室温孵育过夜。10000rpm离心30min,收集上清液。上清液利用深度过滤进一步去除固体杂质。获得的样品利用含有800mM NaCl和15%(v/v)PEG-6000的Hepes缓冲液(50mM,pH 7.0)进行初步沉淀,然后利用含有2M硫酸铵和0.5M NaCl的Hepes缓冲液(50mM,pH 7.0)进行冲洗。获得的沉淀物用含100mM NaCl的Hepes缓冲液(50mM,pH 7.0)重新溶解。获得样品用一种负电荷分子筛-UNOsphere Q层析柱进一步纯化,其中,色谱柱利用50mM Tris,pH 8.25平衡缓冲液进行平衡。实验结果:宿主蛋白经离心后从176244ppm减少到1758ppm,经过深度过滤后减少到135ppm。聚集体经深度过滤后含量低于0.01%。之后样品经过PEG-6000沉淀、NaCl和硫酸铵混合液冲洗以及再溶解后,宿主蛋白杂质低至1ppm。样品经过UNOsphere Q层析柱纯化后,宿主蛋白和聚集体均未检测到。
实施例3
本发明在实施例2的基础上提供了一种包含二次沉淀步骤的蛋白纯化的方法,该方法按照如下步骤进行:
含有IgG单克隆抗体的宿主细胞经10000rpm离心30min,收集沉淀物。配制质量浓度为0.5%的辛酸溶液,用0.5%辛酸溶液溶解宿主细胞离心沉淀物。溶解后向上述溶解后的混合物中加入尿囊素,使尿囊素在上述溶解后的混合物中的最终质量浓度为1%。混合物室温搅拌2小时,搅拌期间不需要调节pH和盐浓度。按照5%(体积)的添加量加入TREN粒子,室温孵育过夜。10000rpm离心30min,收集上清液。上清液利用深度过滤进一步去除固体杂质(同实施例2)。滤液利用含有800mM NaCl和15%(v/v)PEG-6000的Hepes缓冲液(50mM,pH7.0)进行初步沉淀(同实施例2),然后利用含有2M硫酸铵和0.5M NaCl的Hepes缓冲液(50mM,pH 7.0)进行冲洗。获得的沉淀物转移到含2M硫酸铵的Hepes缓冲液(50mM,pH 7.0)进行二次沉淀。沉淀物重新溶解后经UNOsphere Q层析柱(平衡缓冲液为50mM Tris,pH8.25)纯化(同实施例2)。实验结果:样品经过二次沉淀并重新溶解后检测发现宿主蛋白减少到5.9ppm,聚集体不可检测(低于0.05%)。经过UNOsphere Q层析柱纯化后宿主蛋白减少到低于1ppm。这个结果突显了这种廉价低效的分离方法可以实现比现存所有纯化方法中最高效的方法-蛋白A亲和层析更好的纯化结果。
实施例4
本发明提供了一种廉价低效硫酸铵实现高效蛋白纯化的的方法,该方法按照如下步骤进行:
含有IgG单克隆抗体的宿主细胞经10000rpm离心30min,收集沉淀物。配制质量浓度为0.5%的辛酸溶液,用0.5%辛酸溶液溶解宿主细胞离心沉淀物。溶解后向上述溶解后的混合物中加入尿囊素,使尿囊素在上述溶解后的混合物中的最终质量浓度为1%。混合物室温搅拌2小时,搅拌期间不需要调节pH和盐浓度。按照5%(体积)的添加量加入TREN粒子,室温孵育过夜。10000rpm离心30min,收集上清液。上清液利用深度过滤进一步去除固体杂质(同实施例2)。滤液利用2.0M硫酸铵、0.5M NaCl和50mM磷酸钠混合液(pH 7.0)沉淀,然后利用含有2M硫酸铵和0.5M NaCl的Hepes缓冲液(50mM,pH 7.0)进行冲洗。获得的沉淀物重新溶解后经UNOsphere Q层析柱(平衡缓冲液为50mM Tris,pH 8.25)纯化(同实施例2)。实验结果:经辛酸-尿囊素-TREN粒子处理后,宿主蛋白从最初287655ppm减少到987ppm,聚集体未检测到,抗体轻链和重链片段从10.4%减少到0.6%。经硫酸铵沉淀后,宿主蛋白减少到76ppm,抗体轻链和重链片段未检测到。经UNOsphere Q层析柱纯化后宿主蛋白减少到低于1ppm。这个结果提供了一种方法使得现存的低效硫酸铵沉淀方法能获得比仅利用高效蛋白A亲和层析更好的纯化效果。
为说明本发明方法所能够获得的效果,进行了如下实验:
1、不同浓度的辛酸结合阴离子交换柱对于目的蛋白-单克隆抗体IgG纯化的影响
本实验考察了不同浓度的辛酸对于目的蛋白IgG纯化效果的影响,具体方法如下:
含有IgG单克隆抗体的宿主细胞经10000rpm离心30min,收集沉淀物。配制质量浓度分别为0.1%,0.2%,0.3%,0.4%和0.5%的辛酸溶液,用获得的辛酸溶液溶解宿主细胞离心沉淀物中。溶解后向上述溶解后的混合物中加入尿囊素,使尿囊素在上述溶解后的混合物中的最终质量浓度为1%。混合物室温搅拌2小时,搅拌期间不需要调节pH和盐浓度。搅拌后混合物经0.22μm滤膜过滤。其中,经过4%辛酸溶液处理的混合物滤液经阴离子交换层析进一步纯化(阴离子交换柱结合粒子包括Tris(2-aminoethyl)amine(TREN,三(2-氨乙基)胺)、亚氨基二乙酸(IDA)和丁基配体,结合粒子体积是样品体积的5%)。
实验结果:
1、宿主蛋白经过0.1%,0.2%,0.3%,0.4%和0.5%辛酸溶液处理后从最初的242888ppm分别减少到233318ppm,193400ppm,57519ppm,38602ppm和42666ppm。
2、IgG片段,包括自由轻链和二聚轻链,经0.3%,0.4%和0.5%辛酸溶液处理后从最初的12.2%分别减少到5.3%,3.4%和3.6%;而经过0.1%和0.2%辛酸处理的IgG片段没有减少。
3、聚集体经过0.1%,0.2%,0.3%辛酸处理后从最初的1.28%分别减少到1.22%,0.87%和0.31%,而经过0.4%和0.5%辛酸处理后不可检测(低于0.05%)。
4、经过0.1%,0.2%,0.3%,0.4%和0.5%辛酸溶液处理后,IgG回收率分别为99%,99%,95%,99%和95%。
5、经过阴离子交换层析纯化后,经0.4%辛酸处理的宿主蛋白从38602ppm减少到4205ppm,减少了98%,而相应的抗体纯度提高到99%以上,另含有1%的IgG片段,聚集体不可检测,IgG回收率为99%。
综上可知:辛酸浓度对目的蛋白纯化后宿主蛋白、轻链杂质、聚集体、回收率均有影响。结果表明0.4%~0.5%(质量浓度)辛酸处理后,目的蛋白纯化效果最好,且0.4%和0.5%的纯化效果相当。
2、不同过滤方式对目的蛋白纯化的影响
本实验将深度过滤与滤膜过滤两种过滤方式对于目的蛋白纯度的影响进行了比较,设置了实验组1和对照例1,具体方法为:
实验例1:含有IgG单克隆抗体的宿主细胞经10000rpm离心30min,收集沉淀物。配制质量浓度为0.4%的辛酸溶液,用0.4%辛酸溶液溶解宿主细胞离心沉淀物中。溶解后向上述溶解后的混合物中加入尿囊素,使尿囊素在上述溶解后的混合物中的最终质量浓度为1%。混合物室温搅拌2小时,搅拌期间不需要调节pH和盐浓度。搅拌后混合物利用二级阴离子交换深度过滤方式进行过滤。滤液经阴离子交换层析进一步纯化(阴离子交换柱结合粒子包括Tris(2-aminoethyl)amine(TREN,三(2-氨乙基)胺)、亚氨基二乙酸(IDA)和丁基配体,结合粒子体积是样品体积的5%)。
对照例1:本对照例与实验组1的区别在于:经过辛酸、尿囊素处理后的混合物利用0.22μm滤膜过滤,而不是利用二级阴离子交换深度过滤方式过滤。其他所有步骤均与实施例1相同。
对照例1实验结果为:宿主蛋白经过0.22μm滤膜过滤后从242888ppm减少到38602ppm,聚集体从1.28%下降到不可检测(低于0.05%),轻链杂质从12.2%下降到3.4%;后续经过阴离子交换层析纯化后,宿主蛋白从38602ppm减少到4205ppm,抗体损失了1%。
实验例1实验结果:宿主蛋白经过二级阴离子交换深度过滤后从176244ppm下降到9173ppm,减少了19倍,聚集体从2.03%下降到不可检测(低于0.05%),轻链杂质从12%下降到1%;后续经过阴离子交换层析纯化后,宿主蛋白从9173ppm减少到3594ppm,与对照例1中的4205ppm相比,性能提升有限。但是,经过深度过滤后损失了10%的抗体。
综上可知:与0.22μm滤膜过滤方式相比,经过深度过滤处理的宿主蛋白含量明显降低,聚集体和轻链杂质明显减少,说明深度过滤是比0.22μm滤膜更有效的过滤方式。但是经过后续的阴离子交换层析纯化后,前期经过深度过滤处理的蛋白损失率高达10%,而经过0.22μm滤膜处理的蛋白损失率仅为1%。
3、TREN粒子孵育代替阴离子交换层析
由于深度过滤后利用阴离子交换层析进行蛋白纯化导致蛋白损失率较高,因此本实验采用TREN粒子孵育代替阴离子交换层析,具体方法如下:
含有IgG单克隆抗体的宿主细胞经10000rpm离心30min,收集沉淀物。配制质量浓度为0.5%的辛酸溶液,用0.5%辛酸溶液溶解宿主细胞离心沉淀物。溶解后向上述溶解后的混合物中加入尿囊素,使尿囊素在上述溶解后的混合物中的最终质量浓度为1%。混合物室温搅拌2小时,搅拌期间不需要调节pH和盐浓度。按照5%(体积)的添加量加入TREN粒子,室温孵育过夜。之后一半体积的混合物利用深度过滤方式进行过滤,另一半体积的混合物经0.22μm滤膜过滤。
实验结果:经过0.22μm滤膜过滤后宿主蛋白从176244ppm减少到1758ppm,减少了100倍,聚集体从3.03%减少到0.83%,抗体片段从11.8%减少到1.23%,抗体回收率达90%;经过深度过滤后宿主蛋白减少到135ppm,聚集体未检测到,抗体回收率达85%。
实验结论:采用TREN粒子孵育的方法可以减少目的蛋白的损失,而且与0.22μm滤膜过滤方式相比,深度过滤后杂质蛋白明显减少,抗体回收率两种方式接近,因此将采用TREN粒子孵育与深度过滤相结合的方式进行目的蛋白纯化。
以上所有实施例中,提到的方法可以结合其他纯化方法以获得更高的纯度。其他纯化方法包括但不限于IgG常用的纯化方法,比如蛋白A或其他形式的亲和层析,阴离子交换层析,阳离子交换层析,疏水层析以及混合模式层析方法;沉淀方法包括非离子型聚合物(如聚乙二醇)沉淀、盐析沉淀(如硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、柠檬酸钠及柠檬酸钾);以及其他结晶和两相萃取方法。
以上所述仅为本发明的实施例,并非因此限制本发明的专利范围,凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换,或直接或间接运用在其他相关的技术领域,均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (5)
1.一种从含有目的蛋白的宿主细胞中分离纯化目的蛋白的方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)将含有目的蛋白的宿主细胞回收后离心,收集沉淀物得宿主细胞离心沉淀物,用辛酸溶液溶解宿主细胞离心沉淀物,溶解后加入尿囊素固体,经搅拌处理后加入TREN粒子,孵育过夜后离心除去固体颗粒,然后进行深度过滤,收集滤液;
2)向步骤1)所得滤液中加入含有聚乙二醇和NaCl的缓冲液或者是含有硫酸铵和NaCl的缓冲液进行初步沉淀,获得含有目的蛋白的沉淀物;
3)将含有目的蛋白的沉淀物置于滤膜上,利用沉淀盐和透析盐对步骤2)所得含有目的蛋白的沉淀物进行冲洗,除去可溶性的杂质蛋白,获得具有溶液渗透性的目的蛋白沉淀物;所述沉淀盐为2M的硫酸铵,所述透析盐为0.5M的氯化钠;所述沉淀盐和透析盐是以二者的混合物冲洗目的蛋白;
4)利用色谱层析进一步纯化,获得高纯度目的蛋白,所述目的蛋白是抗体。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤1)所述辛酸溶液的质量浓度为0.1%~0.5%;步骤1)中加入尿囊素固体至尿囊素的终浓度为1%(质量);步骤1)所述TREN粒子的添加量为5%(体积)。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤1)所述辛酸溶液的质量浓度为0.4%~0.5%;步骤1)中加入尿囊素固体至尿囊素的终浓度为1%(质量);步骤1)所述TREN粒子的添加量为5%(体积)。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤2)所述聚乙二醇的分子量为1000Da~10000Da;步骤2)所述聚乙二醇的浓度为15%~20%(体积)。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤4)所述利用色谱层析进一步纯化之前还包括二次沉淀的步骤;所述二次沉淀是将步骤3)获得的具有溶液渗透性的目的蛋白沉淀物溶解后利用沉淀盐进行二次沉淀;所述沉淀盐选自硫酸铵、硫酸钠、柠檬酸钠、柠檬酸钾和磷酸钾中的一种或几种的混合物。
Priority Applications (1)
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