JP4458679B2 - 流動床を利用するクロマトグラフ法 - Google Patents
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Description
【０００１】
技術分野
本発明は、少なくとも２回連続の段階（段階１および段階２）が、上方へ向かう流れの使用により、流動床様式であるという段階手順がある、液体クロマトグラフィーを行うための新たな方法に関する。
【０００２】
本発明の様々な様式に関しては、ＳＥ ９８０３８１３−６およびＳＥ ９８０３７３７−７から派生した同時係属国際特許出願に言及されている。この国際特許出願に記載されている内容は、本発明の一部を構成する。
【０００３】
背景技術
液体クロマトグラフ法は、充填または流動床の形態での粒子物質上で行われる。その方法は、典型的には、以下のタイプ（ｂ）による少なくとも１回の段階、および残りのタイプの段階（ａ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ）から選択される１つ以上の機能的段階を含む：
ａ）粒子を、捕捉／結合のために粒子を調整する液体で平衡化すること；
ｂ）液体試料中に存在する１つ以上の化合物を粒子により捕捉すること；
ｃ）１つ以上の該化合物が結合するようになった粒子を洗浄すること；
ｄ）１つ以上の該化合物の少なくとも１つを粒子から解離すること；
ｅ）粒子を清浄すること；および
ｆ）粒子を再生すること。
【０００４】
捕捉段階（タイプｂ）は、選択された段階と一緒に、ある特定のクロマトグラフ法での実際の手順を定義する。実際の手順では、上記（ａ−ｆ）に概略を述べた段階以外の段階もあり得る。典型的な手順は、ことによると、与えられた手順に特別な段階を挿入することもあるが、
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ（ａ）、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ（ａ）……
という手順を含んでなる。ｆ（ａ）は、段階ａおよび段階ｆが同時に起こり得ること、およびクロマトグラフ法が循環式であり得ることを意味する。
【０００５】
各々の段階では、粒子を、水性または非水性である適当な液体（溶液／緩衝液）で処理する。
【０００６】
「捕捉」という用語には、化合物が粒子に結合するようになることが含まれる。その結合は、親和性結合、共有結合の形成、粒子内での閉じ込め等によって起こり得る。親和性の例は、生体親和性、イオン相互作用、疎水的相互作用等である。捕捉された化合物は、精製すべき化合物、または別の化合物から分離する、もしくは捕捉段階で使用する液体から除去するのが望ましい混在物であり得る。
【０００７】
解離段階で使用する液体は、典型的には、捕捉された化合物を解離する物質、例えば、適当なpＨを与える緩衝液、適当なイオン強度を与える塩、粒子上での捕捉された化合物と親和性リガンド／構造との間の結合を競合的に阻害する物質等を含む。「解離」という用語には、親和性結合、共有結合の切断による解離等が含まれる。共有結合は、化学反応により、または酵素により切断することができる。
【０００８】
ある段階で使用する液体は、ある段階の間、連続的に、または段階的に変更することができる。例えば、グラジエントの助けによる解離は、充填床での溶離には典型的であるが、流動床では稀である（Ｓhiloachら，Ｓep. Ｓci. Ｔechn. ３４（１）（１９９９）２９−４０）。別の例は、洗浄段階の間に洗浄溶液を変更することである。
【０００９】
充填床では、解離段階は、典型的には、１つ以上の副段階から成り得る。例えば、捕捉段階は、粒子へ別々に結合する２つ以上の化合物の捕捉を意味し得る。放出に関して、その化合物は、別の条件および別の組成の液体を必要とし得る。
【００１０】
複数の段階は、完全に、または部分的に同時に起こり得る。例えば、再生段階は、主として、次のサイクルの方法で使用する粒子の再生に関係するが、次に行う平衡化段階と同時に行われる。捕捉段階は、化合物が単に遅延することを意味してもよく、解離段階が同時に進行していることを示唆する。混在物が粒子により捕捉され、精製すべき化合物の通過との組合わせで行われ得る場合には、解離が清浄段階で行われ得る。
【００１１】
清浄段階は、しばしば、cip(＝その場での清浄(cleaning in place))と呼ばれる。cip段階は、通常、使用する液体中にＮaＯＨのような高濃度の溶質を含んでなる。これは、清浄用の液体が、しばしば、実際の手順で最高密度を有することを意味する。
【００１２】
各々の段階は、上方または下方へのいずれかであり得る垂直の流れでの流動または充填床様式で行われ得る。流れの方向は、別の段階の間に転換され得る。プラグフローは、しばしば、クロマトグラフィーで、特に捕捉段階で有利なものである。
【００１３】
同じ、または別の容器を、実際の手順の様々な段階に使用することができる。
【００１４】
様々な段階の間、粒子を、当業界で知られている容器に入れる。ＷＯ ９５２０４２７（Ａmersham Ｐharmacia Ｂiotech ＡＢ）、ＷＯ ９２１８２３７（Ａmersham Ｐharmacia Ｂiotech ＡＢ）、ＳＥ ９８０３８１３−６およびＳＥ ９８０３７３７−７から派生した我々の同時係属国際特許出願等を参照されたい。適当な容器は、流入口末端および流出口末端を有する。その容器は、典型的には、流出口を頂部側で垂直に上方へ向け、そして流入口を底部側で垂直に下方へ向けて、流出口とは垂直に置く。それはまた、逆にもできる。流入口および流出口の機能は、各々、容器内への１つ以上の開口部を含んでなり得る。
【００１５】
背景の刊行物
連続的段階で使用する液体の密度差は、流動床精製のモデル実験で予め使用されている。これらの実験には、小規模の流動床処理用の洗浄溶液中に様々な濃度のグリセロールが含まれている。その目的は、吸着／捕捉段階に適用する溶液に比べて、洗浄溶液の粘度、可能ならば、密度も増大させることである。ＤraegerおよびＣhase，Ｂioseparation ２（１９９１）６７−８０；Ｃhaseら，Ｊ. Ｃhromatog. ５９７（１９９２）１２９−１４５；Ｃhaseら，第６回 Ｅuropean Ｃongress of Ｂiotechnology（ＥＣＢ ６），Ｆlorence，Ｉtaly，１９９３年６月１３−１７日；Ｃhase，ＴＩＢＴＥＣＨ １２（１９９４）２９６−３０３；Ｃhangら，Ｂiotechn. Ｂioengin. ４８（１９９５）３５５−３６６；およびＣhangら，Ｂiotechn. Ｂioengin. ４９（１９９６）２０４−２１６を参照されたい。その論文は、グリセロールを加えることにより生ずる粘度により、その後の溶離（解離）段階には不利な点が幾つかあること、およびこれらの不利な点は、その後の解離段階を充填床様式で行うことにより回避できることを論じている。
【００１６】
流動床クロマトグラフィーでは、密度を増大させた液体は、しばしば、平衡化段階から捕捉段階へと移行する場合に使用されている（試料は、しばしば、比較的濃い。）。
【００１７】
最近では、グラジエント溶離が流動床クロマトグラフィーに適用されている。Ｓhiloachら，Ｓep. Ｓci. Ｔechn. ３４（１）（１９９９）２９−４０を参照されたい。
【００１８】
先行技術の欠点
上に定義した実際の手順の解離段階では、使用する液体は、捕捉された化合物を粒子から解離する物質を含む。これは、液体の密度が解離段階の間に増大される傾向にあることを意味する。床を上方への流れにより流動化する場合、解離した化合物を含む液体は、解離液の先端が上方へと上昇すると同時に、下方へと移送される傾向にある。その結果は、解離した化合物の希釈と解離した化合物のその後の処理で取り扱うべき液体の容積の何倍もの好ましくない増大である。
【００１９】
洗浄液は、比較的薄くあり得る。洗浄液が前段階の液体の密度より低い密度を有するならば、洗浄段階の乱れおよび効率低下が生ずる。これは、捕捉段階で使用する液体が、多くの場合、比較的濃いことから、捕捉段階へと連続する洗浄段階に関して特に著しい。
【００２０】
これらの欠点は、このタイプのアダプターを有する容器に比べて、可動性の流出口アダプターを有していない容器でより著しい。
【００２１】
本発明
本発明は、除去すべき１つ以上の化合物の少なくとも１つを、試料と接触させる粒子で捕捉することにより、それらを含む液体試料を処理する方法である。その方法は、粒子を流動化する、少なくとも２回連続の段階（段階１および段階２）の部分的手順を含んでなる、上に定義した実際の手順を含んでなる。段階１は、段階２よりも先行する。
【００２２】
此の度、この種類の部分的手順に関して上述した欠点は、流動床段階で使用する液体の密度が連続的流動床段階で使用する液体の密度より低いならば、最小限となり得ることが完全に認識された。
【００２３】
その方法の特性を決定する特徴は、段階２で使用する液体（液体２）の密度が段階１で使用する液体（液体１）の密度より高いことである。２段階の間、床を流動化状態に保つ。密度を増大させた液体を２回連続の段階に使用するという事実は、液体１を液体２と入れ替えて、その段階を同じ容器で行うことを意味する。
【００２４】
「２段階の間、床を流動化状態に保つ」という表現は、段階１と２との間、プラグフローを本質的には維持しなければならないことを意味する。これは、実質的には、２段階で定義された全体時間の間、プレート数が５以上、好ましくは１０以上または２０以上でなければならないことを意味する。プレート数は、ＷＯ ９７１７１３２の実験部分に記載されているように測定することができる。
【００２５】
段階ａで使用する液体の密度は、流動床に適用する液体の密度であり、すなわち、段階ａの間に起こり得る密度変更は含まれない。
【００２６】
段階１および段階２に加えて、使用する実際の手順には１つ以上の付加的段階が存在し得る。これらの特別な段階は、平衡化段階、捕捉段階、洗浄段階、解離段階、清浄段階および再生段階の中から選択され得て、いずれの他の段階も利用可能であり得る。１つ以上ないし全部までのそのような特別な段階は、段階１および２を含んでなる部分的手順と同じ容器で行うのが好ましい流動化様式であり得る。流動化様式で行わない段階は、充填床様式で行うことになっている。充填床様式で行う典型的な段階は、解離段階および再生段階および平衡化段階および再生／平衡化段階の組合わせである。充填床様式段階は、この種類の床に関して一般的に知られている上方または下方へのいずれかの流れで行うことができる。段階１は、流動床段階へと、または段階１と２が一緒になって、密度を増大させた液体を利用する手順をなす、連続的流動床段階の手順へと連続し得る。同様に、段階２は、その後の即時型流動床段階、または段階１と２が一緒になって、密度を増大させた液体を利用する手順をなす、流動床段階のその後の即時型手順を有し得る。
【００２７】
本発明の概念は、例えば、上記ａ−ｆの中から選択される、少なくとも１回の段階１および段階２が機能的段階である場合に適用可能であるのが好ましい。段階１と段階２が両方とも機能的段階である部分的手順の例は、次の通りである。
【００２８】
【表１】
【００２９】
表は、段階２が段階１に比べて増大された密度を有するよう液体を選択すると仮定する。
【００３０】
密度減少段階：より濃い液体がより薄い液体の前にくる流動床段階を有するという特徴は、濃い粘性液、例えば、捕捉液を扱う場合に利点を有し得る。これらの場合、密度をさらに増大させるのは困難であり得る。これは、より薄い液体の領域（液体１、段階１）、例えば、「洗浄溶液」を設けて、床を通した後、次の段階（段階２）で、液体（液体２）の密度を増大させることにより克服される。欠点は、床の乱れの危険性が増大するが、その床を出る液体は、どうしても、液体１より前に使用する濃い液体より薄いことである。例えば、液体２は、「洗浄」溶液に比べて増大された密度をもつ、真の洗浄液であり得る。段階１よりも先行する段階に関しては、この原理が段階ａ−ｆのいずれにも適用可能となり得るが、特に、捕捉段階である段階１に適用可能となり得る。
【００３１】
段階１から段階２へと移行する場合の密度の増大には、密度を増大させる物質を、段階１で使用する液体（「洗浄」溶液）に加えることが含まれる。これらの物質は、化合物の粒子への結合を減少させなければならない。典型的な物質は、炭水化物構造を有する非荷電化合物のような、非荷電可溶性化合物である。以下を参照されたい。
【００３２】
段階２を使用して、先行する段階（段階１）および連続的段階（段階３）で使用する液体を、使用する容器で物理的に分けて保つことができる。この変更態様では、段階１および３は、上記の段階ａ−ｆから選択され得る。本発明の原理を適用することにより、段階２で使用する液体は、段階１および段階３の密度の中間の密度を有する。本発明のこの変更態様は、特に、段階１が解離段階である場合に有用である。解離段階の間、使用する液体の密度は増大し、これにより、試料の希釈および容積の増大が順次生ずる。従って、可能ならば、別の解離剤により、および／または同じ解離剤を含む、より高い密度を有する液体により、解離段階の後、すなわち、清浄段階の前、または次の化合物を解離する前に、より濃い液体を直ちに溶離するのが有利となり得る。この変更態様の段階２で使用する液体は、段階１で使用する液体と同じものであり得るが、密度を高める物質を加える。この物質は、液体１での解離剤と同じものであっても、それとは違うものであってもよい。密度を高める物質に関する他の選択肢は、グリセロール、他の炭水化物、塩などである。
【００３３】
充填床様式段階は、その後の段階の液体の密度を下げる必要性があるのならば、実際の手順に挿入することができる。例えば、ある段階の後、密度をさらに増大させるのは適切ではあり得ず、または実用的ではあり得ない。この充填様式床段階の使用は、本発明のサイクルによる方法を作成する、簡単で実用的な方法を与える。この種類の充填床様式段階で使用する液体は、最も近い周囲の段階で使用する２つの液体より少ない密度であるのが好ましい。ある段階に関する液体の密度を減少させたら、密度を増大させる液体を連続的段階で使用することができる。原則的には、上記の段階ａ−ｆはいずれも、この節に記載する充填床様式で行うことができる。典型的な充填床様式段階に関しては、上記を参照されたい。
【００３４】
サイクル法を可能とする他の方法は、段階１での液体が十分低い密度を有するという条件で、上記の表での部分的手順VIを使用することである。これは、実際には、乱れた床がこの段階で許容されなければならないことを意味する。
【００３５】
優れた利点は、段階１が洗浄または解離段階である場合に達せられる。
【００３６】
密度の増大は、使用する液体に可溶性であって、その液体に対して密度を増大させる効果を有する物質の濃度を増大させることにより達成され得る。水性液体に関して、物質の典型的な例は、ハロゲン化物（典型的には、塩化物）、リン酸塩、硫酸塩等といったような塩類、例えば、その可溶性金属およびアンモニウム塩類、並びに可溶性炭化水素のような非荷電物質、例えば、グリセロールおよび他の単糖類またはオリゴ糖類である。有機化合物に関しては、液体に加える場合に密度の増大を与えるよう、それらは、概して、その液体より高い密度を有するべきである。典型的には、それらは、例えば、４個以上の炭素原子をもつ炭化水素のような、炭素数が３以上を表わす、比較的大きい分子量を有するべきである。
【００３７】
伴われる段階での化合物と粒子との間の結合を望ましくない方法で妨げないよう、密度を増大させる物質を選択するのが重要である。解離段階よりも先行する段階では、その物質は、その段階で、またはその後のいずれかの他の解離段階で意図する解離のための解離剤として作用し得るべきではない。解離段階では、その物質は、意図する解離を妨害し得るべきではない。
【００３８】
２回連続の流動床段階の間に必要とされる相対的密度差は、様々な要因、例えば、所望の理論的プレート数に依存する。この数は、分配器設計が含まれるカラム設計に順次依存する。これまでに達成された我々の結果は、密度の相対的増大は、流動／拡張床での３５より多い理論的プレートに対応するプラグフローに対して、システムを最適化する場合、２回連続の流動床段階の間に１／１０００程低くなり得ることを示唆する。そこで、各々の連続的流動床段階に関する相対的密度増加は、（例えば、上に定義した段階ａ−ｆから選択される）直前に先行する流動床段階で使用する液体の密度の１／１０００以上または１／１００以上または１／１０以上といったように、１／１００００以上であり得る。使用するシステムにより、理論的プレート数は、液体に関する相対的密度差が２回連続の流動床段階の間で十分高いという条件で、５まで減らすことができる。そこで、例えば、１５以上および３５以上といったように、５以上の理論的プレートを流動床で与えるシステムを使用することができる。
【００３９】
密度の増大は、しばしば、粘度の増大により達せられる。幾つかの物質は、粘度を増大させる能力を他のものより著しく有する。これは、流動床システムで好ましくない効果を有し得る。従って、２つの流動床段階の間に流動する液体の密度を増大させる場合には、著しく粘度を増大させる物質から、あまり著しくは粘度を増大させない物質に転換するのが有益となり得る。
【００４０】
絶対数(absolute figures)では、使用する液体の密度は、密度を増大させる物質を何ら加えていない、純粋な液体より上でなければならない。上限は、粒子の密度により、および／または密度を増大させる物質に関する費用のような実用的考慮により決定される。水性液体に関して、これは、連続的流動床段階のための液体の密度を０.９８〜１.２０または１.５０ｇ／cm３、好ましくは１.００〜１.１５ｇ／cm３の間隔内で変更し得ることを意味する。下限の０.９８ｇ／cm３は、水混和性有機溶媒、例えば、メタノール、エタノール等といったような、密度を減少させる物質を加えることができるという事実の説明となる。例えば、１.２０ｇ／cm３以上の密度をもつ、より重い粒子の使用により、密度間隔の上限は、可能性を持って、もっと上に広げることができ、従って、より濃い液体を使用することができるだろう。これは、本発明により２回連続の流動床段階で使用する水性液体が、０より少し上から始まって、少なくとも０.５２ｇ／cm３に至るまでの範囲に、好ましくは、少なくとも０.２２ｇ／cm３の密度差を有し得ることを意味する。類似の範囲は、非水性液体を使用することを選択する場合に設定され得る。
【００４１】
粒子の密度は、１.０５ｇ／cm３以上、好ましくは１.１４ｇ／cm３以上、それどころか、１.３０ｇ／cm３以上といったように、１.２０ｇ／cm３以上となり得る。５−６ｇ／cm３の上限を予想することができる。適当な粒子は、ＷＯ ９２１８２３７（Ａmersham Ｐharmacia Ｂiotech ＡＢ）；ＷＯ ９７１７１３２（Ａmersham Ｐharmacia Ｂiotech ＡＢ）；ＷＯ ９８３３５７２（Ａmersham Ｐharmacia Ｂiotech ＡＢ）；およびＷＯ ９２００７９９（Ｋem−Ｅn−Ｔek／Ｕpfront Ｃhromatography Ａ／Ｓ）に記載されている。適当な粒子は、しばしば、密度を高める物質として無機物質を含む。適当な粒子はまた、合成ポリマーも含み得る。ポリマーは、純粋な合成ポリマー、半合成ポリマーおよびバイオポリマーに分類することができる。合成ポリマーは、アクリルアミド、メタクリルアミド、アクリル酸ヒドロキシアルキル、メタクリル酸ヒドロキシアルキル、スチレン、ジビニルベンゼン等の中から選択される単量体単位を有し得る。半合成ポリマーは、例えば、橋かけバイオポリマーおよびそのコポリマー、並びにバイオポリマーを起源とする構造を示すグラフトポリマーを含んでなる。バイオポリマーは、デキストラン、アガロース、セルロース、デンプンおよびプルランといったような多糖類を含んでなる。流動床適用に使用することが十分知られている粒子は、Ｓtreamline（Ａmersham Ｐharmacia Ｂiotech ＡＢ，Ｕppsala，Ｓweden）という商標の下に販売されており、密度を増大させる物質、しばしば、無機物質と、親水性有機物質、典型的には、ポリマー物質を両方とも含んでなる粒子群に属する。
【００４２】
伴われる様々な段階に関するプロセス温度は、中でも、使用する液体および捕捉すべき化合物に依存する。水溶液に関して、そのプロセス温度は、０℃から、例えば、７０−９０℃までとなり得るが、実用的考慮に関して、その温度は、しばしば、０−５０℃の間隔である。他の液体に関しては、他の範囲を適用する。
【００４３】
本発明の方法は、その最大使用を比較的大きな生産性の方法に有する。これは、使用する流速が、少なくとも７０−３０００cm／時間、好ましくは８０−９０cm／時間以上となるべきであることを意味する。容器は、典型的には、少なくとも１５cmといったように、少なくとも１０cmの辺を有する正方形の面積に対応する断面積を有するべきである。ここでいう断面積は、粒子を流動化する液体の流れに垂直である。
【００４４】
上に論じたように、実際の手順は、可能ならば、粒子に比べて流れを逆にすることにより、充填床様式で行うのが最もよい段階を１つ以上含んでなり得る。伝統的な容器中、段階ａから流動様式で始めることにより、これは、粒子を「充填床」に沈殿させた後、上方または下方への流れを容器に通して適用することにより達せられ得る。他のものは、床様式をする場合に１８０℃傾ける傾斜可能な容器を利用する。ＳＥ ９８０３８１３−６およびＳＥ ９８０３７３７−７から派生する我々の同時係属国際特許出願の図７ａ−ｂを参照されたい。このタイプの流れの方向の変更は、特に、粒子を再生すべき場合、例えば、次に行う同じ方法で使用すべき場合に価値があり得る。その利点は、清浄段階では、しばしば、最高密度をもつ液体を使用するが、組合わせた再生／平衡化段階では、低密度の液体を利用するという事実から得られる。例えば、傾斜することによっての、充填床様式段階のための他のものは、解離段階の間の少ないプレート数を許容させて、その段階を、流動する条件下、先行する段階に比べて低い密度を有する液体で行うためのものであり得る。上記を参照されたい。
【００４５】
従って、充填床段階は、設計した装置で流動床段階と組合わせることができる。ＳＥ９８０３８１３−６およびＳＥ９８０３７３７−７からの優先権をもつ同時係属国際特許出願を参照されたい。故に、本発明の方法の完全な実際の手順は、連続的流動床段階の間、捕集器配置を分配器配置からある一定の距離で維持する、１つの共通の容器装置で行うことができる。好ましいタイプの容器には、捕集器および分配器配置が固定して取り付けられていてもよい。これは、その完全な手順をまた、例えば、ＷＯ９５２０４２７（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ）およびＷＯ９２１８２３７（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ）に記載されているような、可動性の流出口アダプターを有する容器でも行い得ることを除外しない。様々な容器が流動床段階および充填床段階に各々ささげられた容器のシステムをどちらも除外しない（ＳＥ９８０３８１３−６およびＳＥ９８０３７３７−７から派生する同時係属国際特許出願での図８−１０を参照されたい。）。
【００４６】
液体に関する上述の密度範囲は、実際のプロセス温度で測定される密度をいう。粒子に関して、その密度は、使用する純粋な液体、例えば、水に浸漬した、湿った状態での粒子をいう。プレート数は、ＷＯ ９７１７１３２に記載されている方法により得られたプレート数をいう。
【００４７】
本発明を使用することができる適用
本発明は、主として、液体クロマトグラフィー技術に使用する。例は、サイズ排除（ゲル透過）クロマトグラフィー、および吸着技術、および粒子と、液体から除去すべき化合物との間の共有結合の形成を伴う技術である。吸着技術はまた、親和性クロマトグラフィーとも呼ばれる。重要な変更態様は、イオン交換クロマトグラフィー、および生体親和性、疎水的相互作用(ＨＩＣ)、キレート相互作用等といったような、他の親和性の原理に基づいた技術である。吸着を生ずる粒子上の構造は、しばしば、親和性リガンドまたは親和性構造と呼ばれている。
【００４８】
粒子上に捕捉すべき化合物は、イオン、例えば、金属イオン、並びに無機および有機化合物、例えば、タンパク質、炭水化物、脂質、アミノ酸、ホルモン等といったような生体分子であり得る。タンパク質の場合、それらは、インビトロでの翻訳により、宿主細胞（例えば、細菌、酵母、哺乳動物、植物および昆虫細胞）で、またはトランスジェニック哺乳類およびトランスジェニック鳥類、例えば、セキセイインコといったようなトランスジェニック動物で、組換え的に産生され得る。特に、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ等でのヒトタンパク質の産生を挙げることができる。重要なタンパク質は、血液凝固因子、免疫グロブリン、ＡＴＩＩＩ、α１−抗トリプシン、血清アルブミン等といったような、天然およひ組換え型の血漿タンパク質；ラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼといったような乳清タンパク質；酵素；成長ホルモン、インスリン等といったようなペプチドまたはタンパク質ホルモン；エリスロポイエチン；例えば、減感作療法でワクチンまたは薬剤として使用すべきタンパク質抗原およびそれらのフラグメント；並びに療法上重要なものである他のタンパク質である。血液凝固因子のうち、ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ等を挙げることができる。免疫グロブリンのうち、フラグメントおよびその融合型が含まれる、様々な形態のモノクローナル抗体（ＩgＡ、ＩgＤ、ＩgＥ、ＩgＧ、ＩgＭ）を挙げることができる。洗浄粉末で、および清浄を意図する他の組成物で使用する工業用酵素のような工業用酵素は、可能性のある重要なものである。
【００４９】
流動床に適用すべき試料は、捕捉段階で粒子に結合させる化合物を含む液体である。これには、発酵ブロス、並びに哺乳動物および他の脊椎動物、および無脊椎動物(evertebrate)といったような動物から得られる他の生体液が含まれる。特に、それには、上に論じたトランスジェニック動物が含まれる。動物由来の具体的な体液は、血液、血清、尿、乳汁（乳清が含まれる）等、および粘着および／または粒状成分と一緒に、上に論じた生体分子を含む他の試料である。
【００５０】
原試料は、捕捉段階で適用する前に、多数の前処理段階を受け得る。前処理段階は、希釈、濃縮、脱塩、特定成分の除去、遠心分離、濾過、透析、限外濾過、pＨ調節等であり得る。典型的な手順は、試料を、平衡化段階で使用する緩衝液と同じ条件を与える緩衝液で希釈することである。他の手順は、粒子を、試料により与えられる条件に平衡化することである。これらの手順は、典型的には、原試料の適当な前処理後に行う。
【００５１】
本発明は、食品産業、水の精製および水の脱イオン化、薬物製造、金属精錬等といったような、多くの様々な技術分野内での使用を見出す。
【００５２】
本明細書中に記載する、密度差を使用する具体的で重要な態様は、ある化合物を、動物、特にトランスジェニック動物の体液より得られる試料から後処理することである。この態様では、その方法は、それ自体で、上に定義した特有の特徴をもつ、実際の段階手順を含んでなる。関係のある体液およびそれらの起源を上に論じた。関係のある体液は、主として、粒状および／または粘着成分を含み、および／または多少なりとも非常に粘性である体液、例えば、血液、血清、血漿、乳汁、乳清等である。その化合物は、上に論じたのと同じものである。
【００５３】
本発明の好ましい様式は、ＳＥ ９８０３８１３−６およびＳＥ ９８０３７３７−７から派生した同時係属国際特許出願に記載されている容器およびシステムを利用する。
【００５４】
ここに、本発明を実験部分で説明する。付記する特許請求の範囲により、本発明をさらに定義する。
【００５５】
実験部分
液体流動床に後から流入する液体の間での混合を防ぐ際に密度差を使用する試験 この試験の背景は、全ての操作段階の間ずっと、床の不安定性（混合、チャネリング等）により性能を落とすことなく、カラムを拡張様式で操作し得るべきであろうことである。その理論は、液体の密度が、２つの異なる液体を流動床で混合するかしないかどうかの重要な要因となることであって、液体の粘度ではなかった。これは、より軽い液体を含む拡張床カラムへとポンプ注入する重い液体（液体の均等な分配）が２つの液体の間にくっきりとした境界を作り出して、混合が全く起こらないことを意味する。これに反して、軽い液体を重い液体へとポンプ注入すると、ひどい混合が生ずる。液体から液体へと密度を増大させることを使用することにより、混合は全く起こらず、それによって、緩衝液の消費が最小限となる。
【００５６】
実験
現存の分配器設計を備えた従来のカラム（直径２００mmおよび長さ１０００mm）を使用した（メッシュを備えた多孔プレート；Ｓtreamlone，Ａmersham Ｐharmacia Ｂiotech ＡＢ，Ｕppsala，Ｓweden）。この実験では、Ｓtreamlone ＤＥＡＥゲルを使用した。次の順番で、５つの異なる液体を底部から頂部へとカラムに（３００cm／時間で）ポンプ注入した。
【００５７】
【表２】
【００５８】
その結果は、流動床の存在下での異なる液体の間のくっきりとした境界であり、それによって、液体の混合は全く起こらなかった。
【００５９】
この実験は、流動床の存在下でさえも、異なる液体の間に安定で混合しない挙動をもたらす場合に、液体の密度が支配的要因となることを証明した。
技術分野
本発明は、少なくとも２回連続の段階（段階１および段階２）が、上方へ向かう流れの使用により、流動床様式であるという段階手順がある、液体クロマトグラフィーを行うための新たな方法に関する。
【０００２】
本発明の様々な様式に関しては、ＳＥ ９８０３８１３−６およびＳＥ ９８０３７３７−７から派生した同時係属国際特許出願に言及されている。この国際特許出願に記載されている内容は、本発明の一部を構成する。
【０００３】
背景技術
液体クロマトグラフ法は、充填または流動床の形態での粒子物質上で行われる。その方法は、典型的には、以下のタイプ（ｂ）による少なくとも１回の段階、および残りのタイプの段階（ａ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ）から選択される１つ以上の機能的段階を含む：
ａ）粒子を、捕捉／結合のために粒子を調整する液体で平衡化すること；
ｂ）液体試料中に存在する１つ以上の化合物を粒子により捕捉すること；
ｃ）１つ以上の該化合物が結合するようになった粒子を洗浄すること；
ｄ）１つ以上の該化合物の少なくとも１つを粒子から解離すること；
ｅ）粒子を清浄すること；および
ｆ）粒子を再生すること。
【０００４】
捕捉段階（タイプｂ）は、選択された段階と一緒に、ある特定のクロマトグラフ法での実際の手順を定義する。実際の手順では、上記（ａ−ｆ）に概略を述べた段階以外の段階もあり得る。典型的な手順は、ことによると、与えられた手順に特別な段階を挿入することもあるが、
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ（ａ）、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ（ａ）……
という手順を含んでなる。ｆ（ａ）は、段階ａおよび段階ｆが同時に起こり得ること、およびクロマトグラフ法が循環式であり得ることを意味する。
【０００５】
各々の段階では、粒子を、水性または非水性である適当な液体（溶液／緩衝液）で処理する。
【０００６】
「捕捉」という用語には、化合物が粒子に結合するようになることが含まれる。その結合は、親和性結合、共有結合の形成、粒子内での閉じ込め等によって起こり得る。親和性の例は、生体親和性、イオン相互作用、疎水的相互作用等である。捕捉された化合物は、精製すべき化合物、または別の化合物から分離する、もしくは捕捉段階で使用する液体から除去するのが望ましい混在物であり得る。
【０００７】
解離段階で使用する液体は、典型的には、捕捉された化合物を解離する物質、例えば、適当なpＨを与える緩衝液、適当なイオン強度を与える塩、粒子上での捕捉された化合物と親和性リガンド／構造との間の結合を競合的に阻害する物質等を含む。「解離」という用語には、親和性結合、共有結合の切断による解離等が含まれる。共有結合は、化学反応により、または酵素により切断することができる。
【０００８】
ある段階で使用する液体は、ある段階の間、連続的に、または段階的に変更することができる。例えば、グラジエントの助けによる解離は、充填床での溶離には典型的であるが、流動床では稀である（Ｓhiloachら，Ｓep. Ｓci. Ｔechn. ３４（１）（１９９９）２９−４０）。別の例は、洗浄段階の間に洗浄溶液を変更することである。
【０００９】
充填床では、解離段階は、典型的には、１つ以上の副段階から成り得る。例えば、捕捉段階は、粒子へ別々に結合する２つ以上の化合物の捕捉を意味し得る。放出に関して、その化合物は、別の条件および別の組成の液体を必要とし得る。
【００１０】
複数の段階は、完全に、または部分的に同時に起こり得る。例えば、再生段階は、主として、次のサイクルの方法で使用する粒子の再生に関係するが、次に行う平衡化段階と同時に行われる。捕捉段階は、化合物が単に遅延することを意味してもよく、解離段階が同時に進行していることを示唆する。混在物が粒子により捕捉され、精製すべき化合物の通過との組合わせで行われ得る場合には、解離が清浄段階で行われ得る。
【００１１】
清浄段階は、しばしば、cip(＝その場での清浄(cleaning in place))と呼ばれる。cip段階は、通常、使用する液体中にＮaＯＨのような高濃度の溶質を含んでなる。これは、清浄用の液体が、しばしば、実際の手順で最高密度を有することを意味する。
【００１２】
各々の段階は、上方または下方へのいずれかであり得る垂直の流れでの流動または充填床様式で行われ得る。流れの方向は、別の段階の間に転換され得る。プラグフローは、しばしば、クロマトグラフィーで、特に捕捉段階で有利なものである。
【００１３】
同じ、または別の容器を、実際の手順の様々な段階に使用することができる。
【００１４】
様々な段階の間、粒子を、当業界で知られている容器に入れる。ＷＯ ９５２０４２７（Ａmersham Ｐharmacia Ｂiotech ＡＢ）、ＷＯ ９２１８２３７（Ａmersham Ｐharmacia Ｂiotech ＡＢ）、ＳＥ ９８０３８１３−６およびＳＥ ９８０３７３７−７から派生した我々の同時係属国際特許出願等を参照されたい。適当な容器は、流入口末端および流出口末端を有する。その容器は、典型的には、流出口を頂部側で垂直に上方へ向け、そして流入口を底部側で垂直に下方へ向けて、流出口とは垂直に置く。それはまた、逆にもできる。流入口および流出口の機能は、各々、容器内への１つ以上の開口部を含んでなり得る。
【００１５】
背景の刊行物
連続的段階で使用する液体の密度差は、流動床精製のモデル実験で予め使用されている。これらの実験には、小規模の流動床処理用の洗浄溶液中に様々な濃度のグリセロールが含まれている。その目的は、吸着／捕捉段階に適用する溶液に比べて、洗浄溶液の粘度、可能ならば、密度も増大させることである。ＤraegerおよびＣhase，Ｂioseparation ２（１９９１）６７−８０；Ｃhaseら，Ｊ. Ｃhromatog. ５９７（１９９２）１２９−１４５；Ｃhaseら，第６回 Ｅuropean Ｃongress of Ｂiotechnology（ＥＣＢ ６），Ｆlorence，Ｉtaly，１９９３年６月１３−１７日；Ｃhase，ＴＩＢＴＥＣＨ １２（１９９４）２９６−３０３；Ｃhangら，Ｂiotechn. Ｂioengin. ４８（１９９５）３５５−３６６；およびＣhangら，Ｂiotechn. Ｂioengin. ４９（１９９６）２０４−２１６を参照されたい。その論文は、グリセロールを加えることにより生ずる粘度により、その後の溶離（解離）段階には不利な点が幾つかあること、およびこれらの不利な点は、その後の解離段階を充填床様式で行うことにより回避できることを論じている。
【００１６】
流動床クロマトグラフィーでは、密度を増大させた液体は、しばしば、平衡化段階から捕捉段階へと移行する場合に使用されている（試料は、しばしば、比較的濃い。）。
【００１７】
最近では、グラジエント溶離が流動床クロマトグラフィーに適用されている。Ｓhiloachら，Ｓep. Ｓci. Ｔechn. ３４（１）（１９９９）２９−４０を参照されたい。
【００１８】
先行技術の欠点
上に定義した実際の手順の解離段階では、使用する液体は、捕捉された化合物を粒子から解離する物質を含む。これは、液体の密度が解離段階の間に増大される傾向にあることを意味する。床を上方への流れにより流動化する場合、解離した化合物を含む液体は、解離液の先端が上方へと上昇すると同時に、下方へと移送される傾向にある。その結果は、解離した化合物の希釈と解離した化合物のその後の処理で取り扱うべき液体の容積の何倍もの好ましくない増大である。
【００１９】
洗浄液は、比較的薄くあり得る。洗浄液が前段階の液体の密度より低い密度を有するならば、洗浄段階の乱れおよび効率低下が生ずる。これは、捕捉段階で使用する液体が、多くの場合、比較的濃いことから、捕捉段階へと連続する洗浄段階に関して特に著しい。
【００２０】
これらの欠点は、このタイプのアダプターを有する容器に比べて、可動性の流出口アダプターを有していない容器でより著しい。
【００２１】
本発明
本発明は、除去すべき１つ以上の化合物の少なくとも１つを、試料と接触させる粒子で捕捉することにより、それらを含む液体試料を処理する方法である。その方法は、粒子を流動化する、少なくとも２回連続の段階（段階１および段階２）の部分的手順を含んでなる、上に定義した実際の手順を含んでなる。段階１は、段階２よりも先行する。
【００２２】
此の度、この種類の部分的手順に関して上述した欠点は、流動床段階で使用する液体の密度が連続的流動床段階で使用する液体の密度より低いならば、最小限となり得ることが完全に認識された。
【００２３】
その方法の特性を決定する特徴は、段階２で使用する液体（液体２）の密度が段階１で使用する液体（液体１）の密度より高いことである。２段階の間、床を流動化状態に保つ。密度を増大させた液体を２回連続の段階に使用するという事実は、液体１を液体２と入れ替えて、その段階を同じ容器で行うことを意味する。
【００２４】
「２段階の間、床を流動化状態に保つ」という表現は、段階１と２との間、プラグフローを本質的には維持しなければならないことを意味する。これは、実質的には、２段階で定義された全体時間の間、プレート数が５以上、好ましくは１０以上または２０以上でなければならないことを意味する。プレート数は、ＷＯ ９７１７１３２の実験部分に記載されているように測定することができる。
【００２５】
段階ａで使用する液体の密度は、流動床に適用する液体の密度であり、すなわち、段階ａの間に起こり得る密度変更は含まれない。
【００２６】
段階１および段階２に加えて、使用する実際の手順には１つ以上の付加的段階が存在し得る。これらの特別な段階は、平衡化段階、捕捉段階、洗浄段階、解離段階、清浄段階および再生段階の中から選択され得て、いずれの他の段階も利用可能であり得る。１つ以上ないし全部までのそのような特別な段階は、段階１および２を含んでなる部分的手順と同じ容器で行うのが好ましい流動化様式であり得る。流動化様式で行わない段階は、充填床様式で行うことになっている。充填床様式で行う典型的な段階は、解離段階および再生段階および平衡化段階および再生／平衡化段階の組合わせである。充填床様式段階は、この種類の床に関して一般的に知られている上方または下方へのいずれかの流れで行うことができる。段階１は、流動床段階へと、または段階１と２が一緒になって、密度を増大させた液体を利用する手順をなす、連続的流動床段階の手順へと連続し得る。同様に、段階２は、その後の即時型流動床段階、または段階１と２が一緒になって、密度を増大させた液体を利用する手順をなす、流動床段階のその後の即時型手順を有し得る。
【００２７】
本発明の概念は、例えば、上記ａ−ｆの中から選択される、少なくとも１回の段階１および段階２が機能的段階である場合に適用可能であるのが好ましい。段階１と段階２が両方とも機能的段階である部分的手順の例は、次の通りである。
【００２８】
【表１】
表は、段階２が段階１に比べて増大された密度を有するよう液体を選択すると仮定する。
【００３０】
密度減少段階：より濃い液体がより薄い液体の前にくる流動床段階を有するという特徴は、濃い粘性液、例えば、捕捉液を扱う場合に利点を有し得る。これらの場合、密度をさらに増大させるのは困難であり得る。これは、より薄い液体の領域（液体１、段階１）、例えば、「洗浄溶液」を設けて、床を通した後、次の段階（段階２）で、液体（液体２）の密度を増大させることにより克服される。欠点は、床の乱れの危険性が増大するが、その床を出る液体は、どうしても、液体１より前に使用する濃い液体より薄いことである。例えば、液体２は、「洗浄」溶液に比べて増大された密度をもつ、真の洗浄液であり得る。段階１よりも先行する段階に関しては、この原理が段階ａ−ｆのいずれにも適用可能となり得るが、特に、捕捉段階である段階１に適用可能となり得る。
【００３１】
段階１から段階２へと移行する場合の密度の増大には、密度を増大させる物質を、段階１で使用する液体（「洗浄」溶液）に加えることが含まれる。これらの物質は、化合物の粒子への結合を減少させなければならない。典型的な物質は、炭水化物構造を有する非荷電化合物のような、非荷電可溶性化合物である。以下を参照されたい。
【００３２】
段階２を使用して、先行する段階（段階１）および連続的段階（段階３）で使用する液体を、使用する容器で物理的に分けて保つことができる。この変更態様では、段階１および３は、上記の段階ａ−ｆから選択され得る。本発明の原理を適用することにより、段階２で使用する液体は、段階１および段階３の密度の中間の密度を有する。本発明のこの変更態様は、特に、段階１が解離段階である場合に有用である。解離段階の間、使用する液体の密度は増大し、これにより、試料の希釈および容積の増大が順次生ずる。従って、可能ならば、別の解離剤により、および／または同じ解離剤を含む、より高い密度を有する液体により、解離段階の後、すなわち、清浄段階の前、または次の化合物を解離する前に、より濃い液体を直ちに溶離するのが有利となり得る。この変更態様の段階２で使用する液体は、段階１で使用する液体と同じものであり得るが、密度を高める物質を加える。この物質は、液体１での解離剤と同じものであっても、それとは違うものであってもよい。密度を高める物質に関する他の選択肢は、グリセロール、他の炭水化物、塩などである。
【００３３】
充填床様式段階は、その後の段階の液体の密度を下げる必要性があるのならば、実際の手順に挿入することができる。例えば、ある段階の後、密度をさらに増大させるのは適切ではあり得ず、または実用的ではあり得ない。この充填様式床段階の使用は、本発明のサイクルによる方法を作成する、簡単で実用的な方法を与える。この種類の充填床様式段階で使用する液体は、最も近い周囲の段階で使用する２つの液体より少ない密度であるのが好ましい。ある段階に関する液体の密度を減少させたら、密度を増大させる液体を連続的段階で使用することができる。原則的には、上記の段階ａ−ｆはいずれも、この節に記載する充填床様式で行うことができる。典型的な充填床様式段階に関しては、上記を参照されたい。
【００３４】
サイクル法を可能とする他の方法は、段階１での液体が十分低い密度を有するという条件で、上記の表での部分的手順VIを使用することである。これは、実際には、乱れた床がこの段階で許容されなければならないことを意味する。
【００３５】
優れた利点は、段階１が洗浄または解離段階である場合に達せられる。
【００３６】
密度の増大は、使用する液体に可溶性であって、その液体に対して密度を増大させる効果を有する物質の濃度を増大させることにより達成され得る。水性液体に関して、物質の典型的な例は、ハロゲン化物（典型的には、塩化物）、リン酸塩、硫酸塩等といったような塩類、例えば、その可溶性金属およびアンモニウム塩類、並びに可溶性炭化水素のような非荷電物質、例えば、グリセロールおよび他の単糖類またはオリゴ糖類である。有機化合物に関しては、液体に加える場合に密度の増大を与えるよう、それらは、概して、その液体より高い密度を有するべきである。典型的には、それらは、例えば、４個以上の炭素原子をもつ炭化水素のような、炭素数が３以上を表わす、比較的大きい分子量を有するべきである。
【００３７】
伴われる段階での化合物と粒子との間の結合を望ましくない方法で妨げないよう、密度を増大させる物質を選択するのが重要である。解離段階よりも先行する段階では、その物質は、その段階で、またはその後のいずれかの他の解離段階で意図する解離のための解離剤として作用し得るべきではない。解離段階では、その物質は、意図する解離を妨害し得るべきではない。
【００３８】
２回連続の流動床段階の間に必要とされる相対的密度差は、様々な要因、例えば、所望の理論的プレート数に依存する。この数は、分配器設計が含まれるカラム設計に順次依存する。これまでに達成された我々の結果は、密度の相対的増大は、流動／拡張床での３５より多い理論的プレートに対応するプラグフローに対して、システムを最適化する場合、２回連続の流動床段階の間に１／１０００程低くなり得ることを示唆する。そこで、各々の連続的流動床段階に関する相対的密度増加は、（例えば、上に定義した段階ａ−ｆから選択される）直前に先行する流動床段階で使用する液体の密度の１／１０００以上または１／１００以上または１／１０以上といったように、１／１００００以上であり得る。使用するシステムにより、理論的プレート数は、液体に関する相対的密度差が２回連続の流動床段階の間で十分高いという条件で、５まで減らすことができる。そこで、例えば、１５以上および３５以上といったように、５以上の理論的プレートを流動床で与えるシステムを使用することができる。
【００３９】
密度の増大は、しばしば、粘度の増大により達せられる。幾つかの物質は、粘度を増大させる能力を他のものより著しく有する。これは、流動床システムで好ましくない効果を有し得る。従って、２つの流動床段階の間に流動する液体の密度を増大させる場合には、著しく粘度を増大させる物質から、あまり著しくは粘度を増大させない物質に転換するのが有益となり得る。
【００４０】
絶対数(absolute figures)では、使用する液体の密度は、密度を増大させる物質を何ら加えていない、純粋な液体より上でなければならない。上限は、粒子の密度により、および／または密度を増大させる物質に関する費用のような実用的考慮により決定される。水性液体に関して、これは、連続的流動床段階のための液体の密度を０.９８〜１.２０または１.５０ｇ／cm３、好ましくは１.００〜１.１５ｇ／cm３の間隔内で変更し得ることを意味する。下限の０.９８ｇ／cm３は、水混和性有機溶媒、例えば、メタノール、エタノール等といったような、密度を減少させる物質を加えることができるという事実の説明となる。例えば、１.２０ｇ／cm３以上の密度をもつ、より重い粒子の使用により、密度間隔の上限は、可能性を持って、もっと上に広げることができ、従って、より濃い液体を使用することができるだろう。これは、本発明により２回連続の流動床段階で使用する水性液体が、０より少し上から始まって、少なくとも０.５２ｇ／cm３に至るまでの範囲に、好ましくは、少なくとも０.２２ｇ／cm３の密度差を有し得ることを意味する。類似の範囲は、非水性液体を使用することを選択する場合に設定され得る。
【００４１】
粒子の密度は、１.０５ｇ／cm３以上、好ましくは１.１４ｇ／cm３以上、それどころか、１.３０ｇ／cm３以上といったように、１.２０ｇ／cm３以上となり得る。５−６ｇ／cm３の上限を予想することができる。適当な粒子は、ＷＯ ９２１８２３７（Ａmersham Ｐharmacia Ｂiotech ＡＢ）；ＷＯ ９７１７１３２（Ａmersham Ｐharmacia Ｂiotech ＡＢ）；ＷＯ ９８３３５７２（Ａmersham Ｐharmacia Ｂiotech ＡＢ）；およびＷＯ ９２００７９９（Ｋem−Ｅn−Ｔek／Ｕpfront Ｃhromatography Ａ／Ｓ）に記載されている。適当な粒子は、しばしば、密度を高める物質として無機物質を含む。適当な粒子はまた、合成ポリマーも含み得る。ポリマーは、純粋な合成ポリマー、半合成ポリマーおよびバイオポリマーに分類することができる。合成ポリマーは、アクリルアミド、メタクリルアミド、アクリル酸ヒドロキシアルキル、メタクリル酸ヒドロキシアルキル、スチレン、ジビニルベンゼン等の中から選択される単量体単位を有し得る。半合成ポリマーは、例えば、橋かけバイオポリマーおよびそのコポリマー、並びにバイオポリマーを起源とする構造を示すグラフトポリマーを含んでなる。バイオポリマーは、デキストラン、アガロース、セルロース、デンプンおよびプルランといったような多糖類を含んでなる。流動床適用に使用することが十分知られている粒子は、Ｓtreamline（Ａmersham Ｐharmacia Ｂiotech ＡＢ，Ｕppsala，Ｓweden）という商標の下に販売されており、密度を増大させる物質、しばしば、無機物質と、親水性有機物質、典型的には、ポリマー物質を両方とも含んでなる粒子群に属する。
【００４２】
伴われる様々な段階に関するプロセス温度は、中でも、使用する液体および捕捉すべき化合物に依存する。水溶液に関して、そのプロセス温度は、０℃から、例えば、７０−９０℃までとなり得るが、実用的考慮に関して、その温度は、しばしば、０−５０℃の間隔である。他の液体に関しては、他の範囲を適用する。
【００４３】
本発明の方法は、その最大使用を比較的大きな生産性の方法に有する。これは、使用する流速が、少なくとも７０−３０００cm／時間、好ましくは８０−９０cm／時間以上となるべきであることを意味する。容器は、典型的には、少なくとも１５cmといったように、少なくとも１０cmの辺を有する正方形の面積に対応する断面積を有するべきである。ここでいう断面積は、粒子を流動化する液体の流れに垂直である。
【００４４】
上に論じたように、実際の手順は、可能ならば、粒子に比べて流れを逆にすることにより、充填床様式で行うのが最もよい段階を１つ以上含んでなり得る。伝統的な容器中、段階ａから流動様式で始めることにより、これは、粒子を「充填床」に沈殿させた後、上方または下方への流れを容器に通して適用することにより達せられ得る。他のものは、床様式をする場合に１８０℃傾ける傾斜可能な容器を利用する。ＳＥ ９８０３８１３−６およびＳＥ ９８０３７３７−７から派生する我々の同時係属国際特許出願の図７ａ−ｂを参照されたい。このタイプの流れの方向の変更は、特に、粒子を再生すべき場合、例えば、次に行う同じ方法で使用すべき場合に価値があり得る。その利点は、清浄段階では、しばしば、最高密度をもつ液体を使用するが、組合わせた再生／平衡化段階では、低密度の液体を利用するという事実から得られる。例えば、傾斜することによっての、充填床様式段階のための他のものは、解離段階の間の少ないプレート数を許容させて、その段階を、流動する条件下、先行する段階に比べて低い密度を有する液体で行うためのものであり得る。上記を参照されたい。
【００４５】
従って、充填床段階は、設計した装置で流動床段階と組合わせることができる。ＳＥ９８０３８１３−６およびＳＥ９８０３７３７−７からの優先権をもつ同時係属国際特許出願を参照されたい。故に、本発明の方法の完全な実際の手順は、連続的流動床段階の間、捕集器配置を分配器配置からある一定の距離で維持する、１つの共通の容器装置で行うことができる。好ましいタイプの容器には、捕集器および分配器配置が固定して取り付けられていてもよい。これは、その完全な手順をまた、例えば、ＷＯ９５２０４２７（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ）およびＷＯ９２１８２３７（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ）に記載されているような、可動性の流出口アダプターを有する容器でも行い得ることを除外しない。様々な容器が流動床段階および充填床段階に各々ささげられた容器のシステムをどちらも除外しない（ＳＥ９８０３８１３−６およびＳＥ９８０３７３７−７から派生する同時係属国際特許出願での図８−１０を参照されたい。）。
【００４６】
液体に関する上述の密度範囲は、実際のプロセス温度で測定される密度をいう。粒子に関して、その密度は、使用する純粋な液体、例えば、水に浸漬した、湿った状態での粒子をいう。プレート数は、ＷＯ ９７１７１３２に記載されている方法により得られたプレート数をいう。
【００４７】
本発明を使用することができる適用
本発明は、主として、液体クロマトグラフィー技術に使用する。例は、サイズ排除（ゲル透過）クロマトグラフィー、および吸着技術、および粒子と、液体から除去すべき化合物との間の共有結合の形成を伴う技術である。吸着技術はまた、親和性クロマトグラフィーとも呼ばれる。重要な変更態様は、イオン交換クロマトグラフィー、および生体親和性、疎水的相互作用(ＨＩＣ)、キレート相互作用等といったような、他の親和性の原理に基づいた技術である。吸着を生ずる粒子上の構造は、しばしば、親和性リガンドまたは親和性構造と呼ばれている。
【００４８】
粒子上に捕捉すべき化合物は、イオン、例えば、金属イオン、並びに無機および有機化合物、例えば、タンパク質、炭水化物、脂質、アミノ酸、ホルモン等といったような生体分子であり得る。タンパク質の場合、それらは、インビトロでの翻訳により、宿主細胞（例えば、細菌、酵母、哺乳動物、植物および昆虫細胞）で、またはトランスジェニック哺乳類およびトランスジェニック鳥類、例えば、セキセイインコといったようなトランスジェニック動物で、組換え的に産生され得る。特に、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ等でのヒトタンパク質の産生を挙げることができる。重要なタンパク質は、血液凝固因子、免疫グロブリン、ＡＴＩＩＩ、α１−抗トリプシン、血清アルブミン等といったような、天然およひ組換え型の血漿タンパク質；ラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼといったような乳清タンパク質；酵素；成長ホルモン、インスリン等といったようなペプチドまたはタンパク質ホルモン；エリスロポイエチン；例えば、減感作療法でワクチンまたは薬剤として使用すべきタンパク質抗原およびそれらのフラグメント；並びに療法上重要なものである他のタンパク質である。血液凝固因子のうち、ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ等を挙げることができる。免疫グロブリンのうち、フラグメントおよびその融合型が含まれる、様々な形態のモノクローナル抗体（ＩgＡ、ＩgＤ、ＩgＥ、ＩgＧ、ＩgＭ）を挙げることができる。洗浄粉末で、および清浄を意図する他の組成物で使用する工業用酵素のような工業用酵素は、可能性のある重要なものである。
【００４９】
流動床に適用すべき試料は、捕捉段階で粒子に結合させる化合物を含む液体である。これには、発酵ブロス、並びに哺乳動物および他の脊椎動物、および無脊椎動物(evertebrate)といったような動物から得られる他の生体液が含まれる。特に、それには、上に論じたトランスジェニック動物が含まれる。動物由来の具体的な体液は、血液、血清、尿、乳汁（乳清が含まれる）等、および粘着および／または粒状成分と一緒に、上に論じた生体分子を含む他の試料である。
【００５０】
原試料は、捕捉段階で適用する前に、多数の前処理段階を受け得る。前処理段階は、希釈、濃縮、脱塩、特定成分の除去、遠心分離、濾過、透析、限外濾過、pＨ調節等であり得る。典型的な手順は、試料を、平衡化段階で使用する緩衝液と同じ条件を与える緩衝液で希釈することである。他の手順は、粒子を、試料により与えられる条件に平衡化することである。これらの手順は、典型的には、原試料の適当な前処理後に行う。
【００５１】
本発明は、食品産業、水の精製および水の脱イオン化、薬物製造、金属精錬等といったような、多くの様々な技術分野内での使用を見出す。
【００５２】
本明細書中に記載する、密度差を使用する具体的で重要な態様は、ある化合物を、動物、特にトランスジェニック動物の体液より得られる試料から後処理することである。この態様では、その方法は、それ自体で、上に定義した特有の特徴をもつ、実際の段階手順を含んでなる。関係のある体液およびそれらの起源を上に論じた。関係のある体液は、主として、粒状および／または粘着成分を含み、および／または多少なりとも非常に粘性である体液、例えば、血液、血清、血漿、乳汁、乳清等である。その化合物は、上に論じたのと同じものである。
【００５３】
本発明の好ましい様式は、ＳＥ ９８０３８１３−６およびＳＥ ９８０３７３７−７から派生した同時係属国際特許出願に記載されている容器およびシステムを利用する。
【００５４】
ここに、本発明を実験部分で説明する。付記する特許請求の範囲により、本発明をさらに定義する。
【００５５】
実験部分
液体流動床に後から流入する液体の間での混合を防ぐ際に密度差を使用する試験 この試験の背景は、全ての操作段階の間ずっと、床の不安定性（混合、チャネリング等）により性能を落とすことなく、カラムを拡張様式で操作し得るべきであろうことである。その理論は、液体の密度が、２つの異なる液体を流動床で混合するかしないかどうかの重要な要因となることであって、液体の粘度ではなかった。これは、より軽い液体を含む拡張床カラムへとポンプ注入する重い液体（液体の均等な分配）が２つの液体の間にくっきりとした境界を作り出して、混合が全く起こらないことを意味する。これに反して、軽い液体を重い液体へとポンプ注入すると、ひどい混合が生ずる。液体から液体へと密度を増大させることを使用することにより、混合は全く起こらず、それによって、緩衝液の消費が最小限となる。
【００５６】
実験
現存の分配器設計を備えた従来のカラム（直径２００mmおよび長さ１０００mm）を使用した（メッシュを備えた多孔プレート；Ｓtreamlone，Ａmersham Ｐharmacia Ｂiotech ＡＢ，Ｕppsala，Ｓweden）。この実験では、Ｓtreamlone ＤＥＡＥゲルを使用した。次の順番で、５つの異なる液体を底部から頂部へとカラムに（３００cm／時間で）ポンプ注入した。
【００５７】
【表２】
その結果は、流動床の存在下での異なる液体の間のくっきりとした境界であり、それによって、液体の混合は全く起こらなかった。
【００５９】
この実験は、流動床の存在下でさえも、異なる液体の間に安定で混合しない挙動をもたらす場合に、液体の密度が支配的要因となることを証明した。
Claims (18)
- 容器に含まれており、上方へ向かう液体の流れにより流動化した粒子を含んでなる流動床で少なくとも一部を行う液体クロマトグラフ法であって、
（ａ）１つ以上の試料化合物を粒子により捕捉する捕捉段階、及び
（ｂ）粒子を液体の流れが通っている流動床の形態とする洗浄及び／又は解離段階、
を含んでなり、床を流動化状態に維持しながら、洗浄又は解離段階（段階１）で使用する液体（液体１）の後、直ちに、液体１より高い密度を有する液体（液体２、段階２）が続くことを特徴とする方法。 - 液体２が、
（ａ）顕著な解離効果又は最終的な清浄効果を何ら有していないこと、及び
（ｂ）液体２に続く液体３（段階３）から解離した化合物を含む液体１を分離するのに使用すること
を特徴とする、請求項１に記載の方法。 - 液体１と２との間の密度差が、可溶性物質の濃度差、及び／又は可溶性物質の種差により起こることを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載の方法。
- 液体１が解離剤を含んでおり、捕捉された化合物の解離に使用すること、及び液体２が、解離剤以外の物質の存在により、液体１に比べて増大された密度を有することを特徴とする、請求項１乃至請求項３のいずれかに記載の方法。
- 容器が、少なくとも１０ｃｍの辺を有する正方形の面積に対応する断面積を有することを特徴とする、請求項１乃至請求項４のいずれかに記載の方法。
- （ａ）容器が流入口末端（分配器配置）及び流出口末端（捕集器配置＝流出口アダプター）を有すること、及び
（ｂ）少なくとも２回連続の流動床段階の間、流入口末端と流出口末端との間の距離を本質的には一定に保つこと、
を特徴とする、請求項１乃至請求項５のいずれかに記載の方法。 - （ａ）容器の分配器及び捕集器配置が固定して取り付けられているか、又は
（ｂ）流出口アダプターが流入口末端に対して可動性であること、
を特徴とする、請求項１乃至請求項６のいずれかに記載の方法。 - 容器中で行う、
（ａ）動物から得られる試料中の１つ以上の化合物を粒子に結合させる、少なくとも１回の捕捉段階、及び
（ｂ）該容器を通る上方への液体の流れにより床を流動化する、２回連続の段階（段階１及び段階２）、
を含んでなる実際の段階手順を有する液体クロマトグラフ法であって、段階２で使用する液体（液体２）が段階１で使用する液体（液体１）の密度より高い密度を有することを特徴とする方法。 - 段階１が解離段階であって、段階２が清浄段階であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
- 段階１が洗浄段階であって、段階２が解離段階であることを特徴とする、請求項８乃至請求項９のいずれかに記載の方法。
- 段階１が平衡化段階であって、段階２が捕捉段階であることを特徴とする、請求項８乃至請求項１０のいずれかに記載の方法。
- 段階１が密度減少段階であって、段階１に先行する段階において段階１で使用するより高い密度を有する液体が利用されることを特徴とする、請求項８乃至請求項１１のいずれかに記載の方法。
- 段階２が洗浄段階であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
- 充填床様式で行う解離段階があることを特徴とする、請求項８乃至請求項９、請求項１１乃至請求項１２のいずれかに記載の方法。
- 捕捉段階が流動床様式であることを特徴とする、請求項８乃至請求項１２のいずれかに記載の方法。
- 当該方法が循環プロセスであって、その各サイクルが、次のサイクルのための平衡化段階である再生段階で終わることを特徴とする、請求項８乃至請求項１４のいずれかに記載の方法。
- 解離段階、又は清浄段階もしくは再生／平衡化段階が充填床様式であることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
- 容器中で行う、
（ａ）培養した哺乳動物細胞から得られる１つ以上の化合物を含む試料を粒子に結合させる、少なくとも１回の捕捉段階、及び
（ｂ）該容器を通る上方への液体の流れにより床を流動化する、２回連続の段階（段階１及び段階２）、
を含んでなる実際の段階手順を有する液体クロマトグラフ法であって、段階２で使用する液体（液体２）が段階１で使用する液体（液体１）の密度より高い密度を有することを特徴とする方法。
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