JP4870263B2 - 生体物質の精製 - Google Patents
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Description
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、一般的に、１または複数の標的生体物質（例えば、選択されたタンパク質、抗体、抗原、凝固因子、糖タンパク質、およびホルモン）を、標的物質とは異なる分子量または他の物理的特性もしくは化学的特性を有する汚染物質を有する液体供給源から精製するための方法および装置に関する。ここで、精製は、クロスフロー濾過システムにおける連続したクロマトグラフィーおよびダイアフィルトレーション分離工程により行われる。
【０００２】
関連技術の説明
液体試料から物質を分離するために様々な精製方法が用いられてきた。沈殿、遠心分離、濾過、クロマトグラフィー、および蒸発の全てが、収率、時間消費、純度、および費用に関して様々な成功をおさめて用いられてきた。
【０００３】
生物学的精製の分野では、遠心分離、クロマトグラフィー、および濾過が、１０〜９０パーセントの収率および９５パーセントと高い純度で、液体試料から非常に価値のある物質を得るために特に有用であった。
【０００４】
遠心分離、クロマトグラフィー、および濾過の現在の使用では、収率と純度は逆の関係にあり、精製工程を１つ進むごとに、収率は著しく小さくなることが一般に理解されている。これらの遠心分離、クロマトグラフィー、および濾過の方法は高価であり、比較的遅く、清浄して再利用するのが非常に難しい装置を用いることもまたよく理解されている。
【０００５】
これに関する特定の問題の１つは、クロマトグラフィー樹脂の中を通じて不規則な流路が形成される傾向がある固定層クロマトグラフィーカラムの清浄である。カラムを完全に清浄しないと後のバッチを汚染する可能性があるので、これらの不規則な流路は、生体物質の精製において特定の問題を引き起こす。
【０００６】
一例は、イオン交換およびアフィニティクロマトグラフィーカラムによる血漿タンパク質の精製である。ウイルスを含まないと試験された１バッチの血漿が、後で、ウイルスに汚染されていると分かった場合、カラムからウイルスが確実に除去されていると判断することは、ほとんど不可能である。さらに、生物学的液体が細菌増殖を容易に助けるので、クロマトグラフィーカラムにおける単純な細菌汚染および生物増殖は、決して希なことではない。細菌生物および細菌により産生されるエンドトキシンは医薬品の無数のバッチを汚染し、かなりの財政上の損失と最終製品のレシピエントにおける有害反応をもたらしてきた。
【０００７】
この頻繁に観察され、清浄方法の確認に多数の問題を生じさせる「ネズミトンネル（ｒａｔ ｔｕｎｎｅｌ）」はまた、クロマトグラフィーカラムの容積および分解能のかなりの部分を駄目にする。
【０００８】
固定層クロマトグラフィーカラムの別の問題は、特に、アガロース（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａから市販されているＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ゲル）などの軟らかいゲルの場合での樹脂の圧縮である。このトンネル化と圧縮の共同する問題のために、多量の過剰な結合能を必要とすることでクロマトグラフィー費用はかなり高くなる。圧縮とトンネル化により引き起こされる別の問題は、純度の減少である。高い純度には、標的物質の均一な溶出が必要とされる。トンネル化と圧縮により、溶出液の均一な分布が妨げられ、標的産物に似た溶出プロフィールを有する汚染物質ならびに圧縮媒体にトラップされランダムに溶出される汚染物質から、標的物質は正確に分離されない。
【０００９】
モノクローナル抗体精製の場合、１０倍過剰な結合能でカラムに詰めることが一般的である。かなり流通されたシステムでは、３倍過剰な結合能でしか全標的産物を結合せず、それにより、クロマトグラフィー媒体の費用を１／３に減らすことが可能である。
【００１０】
トンネル化および圧縮を減少させる１つの一般的なアプローチは、流速を低減することによりカラムの運転圧を小さくすることである。流速の低減は樹脂圧縮を減少させるが、処理時間をかなり増加させ、多くの場合、方法の分解と収率に悪影響を及ぼす。
【００１１】
平行流濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）は、膜表面と平行に液体を押し出すことにより液体中の物質を分離するために様々な孔径の膜を利用する。この方法は、水および／または緩衝液に懸濁された物質の濃縮に有効であることが分かっているが、溶液中の化合物の精製に広く有用であることは分かっていなかった。この方法の第１の問題は、似た大きさの２つの粒子を分離できるほど孔径が十分に均一でないことである。さらに、液体混合物中の物質（特に、タンパク質および脂質）は膜表面に結合し（「ゲル層分極（ｇｅｌ ｌａｙｅｒ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）」と呼ばれる現象である）、有効孔径ならびに膜の界面化学を変化させる。
【００１２】
流動層クロマトグラフィーは、液体混合物から物質を分離する別の手段である。流動層クロマトグラフィーは、化学産業および石油産業においてより一般的に利用されている。流動層カラムは、一般的に、１０フィート以上の高さであり、直径が９〜１２インチである。医薬品用およびバイオプロセス用カラムは、通常、３フィート未満の高さであり、樹脂の圧縮特性に応じて１〜２４インチの一般範囲で広範囲な直径を有する。流動層の利点は、固定層クロマトグラフィーと比較して低圧での流速が速いことである。速い流速は、クロマトグラフィーによる分離にある特定の利点をもたらすが、この方法には、いくつかの欠点がある。この方法には、重力に対して中立の、または浮力を示す、より大きな直径の樹脂が必要である。これらの大きな１００〜３００ミクロン平均直径の樹脂は、固定層カラムで用いられる小さな１〜１００ミクロン樹脂より単位体積あたりの表面積が小さく、それに応じて、表面結合能が小さい。
【００１３】
表面積の損失を最小限にし、密度を減少させるために、流動層樹脂は、非常に小孔のある物質である。しかしながら、その多孔性の結果として、これらの樹脂粒子は非常に亀裂しやすく、それにより、カラムの入口および出口をブロックする小さな微粒子を生じる。
【００１４】
流動層の最も重大な問題は混合である。カラムはいずれの固定混合手段も含まないので、この層は、エアジェットにより、またはカラムを通して分離しようとする液体を高流速で再利用することにより従来どおり混合される。高流速と制限された混合により、産物を樹脂から溶出する間に必要とされる均一な相変化が阻害される。
【００１５】
前記の当該分野での不備の結果として、複合液体供給源から生物学的標的物質を精製するための迅速で均一な時間効率および費用効率の高いシステムが、どうしても必要とされる。望ましいことに、このようなシステムは、前記の様々な先行技術の分離技術に固有の問題を克服している。望ましいことに、このようなシステムは容易に拡大縮小可能であり、研究室におけるミリリットルから、生物薬剤生産においてよく遭遇する数千リットルまでの供給材料の体積を処理するのに適応可能である。最後に、望ましいことに、このようなシステムは、様々な性質の複数の液体供給源（粘性の複合溶液を含む）と共に用いることができる。
【００１６】
発明の概要
本発明は、有利な収率、産物純度、時間効率および費用効率で精製するために、１または複数のクロスフローフィルター要素と１または複数の種類のクロマトグラフィー樹脂を組み合わせて用いる精製方法に関する。
【００１７】
本発明の実施で用いられる１または複数のクロスフローフィルターモジュールは、例えば、中空繊維フィルター、スパイラルフィルター、プレートフィルターおよびフレームフィルター、カセットフィルター、攪拌セル（ｓｔｉｒ ｃｅｌｌ）、管状フィルター、セラミックフィルターなどのクロスフローフィルターを含む任意の適切な型でよい。
【００１８】
本発明の方法は、１または複数の標的生体物質（例えば、選択されたタンパク質、抗体、抗原、凝固因子、糖タンパク質、およびホルモン）を、標的物質とは異なる分子量あるいは他の物理的特性または化学的特性を有する汚染物質を有する液体供給源から精製することを含む。ここで、連続したクロマトグラフィーおよびダイアフィルトレーション分離工程がクロスフロー濾過システムにおいて達成される。
【００１９】
本発明の精製方法を用いると、タンパク質、抗体、成長ホルモン、および他の生物学的に重要な物質が、複合液体供給源（例えば、血漿、血漿画分、乳、初乳、チーズ乳清、細胞培養液および組織培養液、ならびに組織ホモジネートおよび細胞ホモジネート）から高収率かつ迅速に単離される。
【００２０】
さらに、本発明の方法を従来の精製方法に適用して、従来の分離の収率を増大させ、このような精製に用いられるアフィニティ媒体および／または濾過媒体ならびに装置表面の再利用および汚染除去を可能にするように、従来の方法を適切にきれいにすることができる。
【００２１】
さらに詳細に述べると、本発明は、１つの態様では、標的物質を液体供給源から精製する方法に関する。このような方法は、１つの実施態様では、
１）液体供給源をクロマトグラフィー樹脂と接触させる工程と、
２）樹脂が、標的物質の所望の画分を結合できるのに十分な接触時間で、液体供給源をクロマトグラフィー樹脂とインキュベートする工程と、
３）クロスフローフィルターシステムにおいてクロマトグラフィー樹脂を再循環させる工程であって、ここで、
ａ）クロマトグラフィー樹脂を濃縮し、ダイアフィルトレーションにより、汚染物質を、クロマトグラフィー樹脂に結合した標的物質から分離する工程と、
ｂ）標的物質を前記クロマトグラフィー樹脂から溶出する工程と、
ｃ）ダイアフィルトレーションにより、標的物質をクロマトグラフィー樹脂から分離する工程が行われる工程と、
４）標的物質を回収する工程と、
５）任意に、標的物質を濃縮する工程を含む。
【００２２】
前記精製方法は、(ａ)存在し、かつ後の工程において孔またはオリフィスを詰まらせる可能性のある、どんな望ましくない微粒子も除去するために液体供給源を清澄化する工程と、(ｂ)液体供給源をクロマトグラフィー樹脂と接触させる工程が最も効率的に進行できるように、液体供給源を濃縮または希釈する工程を、任意に、最初にさらに含んでもよい。これらの工程は、選択された量の液体を前記システムに添加することにより、後のインキュベーション工程での使用に望ましい濃度の清澄化された液体供給源を得る、クロスフロー濾過により行われることが好ましい。
【００２３】
本発明の精製方法は、さらなる標的物質の単離につながる追加工程をさらに含んでもよい。これらの追加工程では、クロマトグラフィー樹脂の濃縮およびダイアフィルトレーションにより生じた透過液を、溶出前に、第２のクロマトグラフィー樹脂または一連のクロマトグラフィー樹脂に通過させ、工程（１）〜（４）を繰り返してもよい。あるいは、またはさらに、標的物質の収率を増大させるために、本発明の精製方法では、前記工程３（ａ）からのダイアフィルトレートに対して工程（１）〜（４）をさらに繰り返してもよい。
【００２４】
前記精製方法は、１または複数のクロマトグラフィー分離工程において、アフィニティリガンドが結合した堅い球状セルロースビーズを含むクロマトグラフィー樹脂を都合よく使用してもよい。
【００２５】
本発明の方法は、別の態様では、免疫グロブリンを液体供給源から精製する方法を含む。前記方法は、
液体供給源をクロマトグラフィー樹脂と接触させる工程であって、前記クロマトグラフィー樹脂は、堅い無孔性球状ビーズに結合したプロテインＡを含む工程と、
樹脂が、免疫グロブリンの所望の画分を結合できるのに十分な接触時間で、液体供給源をクロマトグラフィー樹脂とインキュベートする工程と、
クロスフローフィルターシステムにおいてクロマトグラフィー樹脂を再循環させる工程であって、ここで、
クロマトグラフィー樹脂を濃縮し、ダイアフィルトレーションにより、汚染物質を、クロマトグラフィー樹脂に結合した免疫グロブリンから分離する工程と、
免疫グロブリンをクロマトグラフィー樹脂から溶出する工程と、
ダイアフィルトレーションにより、免疫グロブリンをクロマトグラフィー樹脂から回収する工程が行われる工程と、
任意に、免疫グロブリンを濃縮する工程を含む。
【００２６】
さらなる態様では、本発明は、標的物質を液体供給源から分離および濃縮するための精製装置を含む。このような装置は、
固相クロマトグラフィー樹脂材料を保持し、選択的に、液体を第１のリザーバに流入出させるために構築および整列された第１のリザーバと、
第１のリザーバに配置された固相クロマトグラフィー樹脂材料と、
液体を透過液と残留液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）の流れに分離するための第１のクロスフロー濾過モジュールであって、液体を第１のクロスフロー濾過モジュールに流入させ、透過液と残留液の流れを第１のクロスフロー濾過モジュールから流出させるための手段が設けられた第１のクロスフロー濾過モジュールと、
透過液の流れを捕捉および保持し、選択的に、液体を第２のリザーバに流入出させるために構築および整列された第２のリザーバと、
液体の流れを濃縮するための第２のクロスフロー濾過モジュールであって、液体を第２のクロスフロー濾過モジュールに流入させ、透過液と残留液の流れを第２のクロスフロー濾過モジュールから流出させるための手段が設けられた第２のクロスフロー濾過モジュールと、
濃縮された液体の流れを第２のクロスフロー濾過モジュールから捕捉するために構築および適合された収集容器と、
補給液を第１のリザーバおよび第２のリザーバに供給し、
液体供給源を、クロマトグラフィー樹脂が充填された第１のリザーバに選択的に流入させて、スラリーを形成し、
第１のリザーバからのスラリーを第１のクロスフロー濾過モジュールに再循環させ、透過液と残留液の流れを第１のリザーバに戻すことにより、液体供給源をクロマトグラフィー樹脂とインキュベートし、
スラリーを濃縮し、ダイアフィルトレーションにより汚染物質をスラリーから分離し、標的物質をクロマトグラフィー樹脂から溶出し、ダイアフィルトレーションにより標的物質をクロマトグラフィー樹脂から分離するために適合された流路（ｆｌｏｗ ｐａｔｈｗａｙ）中で、クロスフローフィルターにおいてスラリーを再循環させ、
標的物質を第２のリザーバにおいて捕捉し、
標的物質を第２のリザーバから第２のクロスフロー濾過モジュールに流すことにより、標的物質を濃縮し、
濃縮された標的物質を、第２のクロスフロー濾過モジュールの流路から収集容器に回収するために構築および整列されたコンジット、バルブ、およびポンプ手段とを備える。
【００２７】
前記装置の好ましい実施態様では、第１および第２のリザーバに、適切な処理温度を維持するためのサーマルジャケットが設けられる。
【００２８】
別の態様では、本発明は、標的物質を有する液体を精製する方法に関する。前記方法は、液体を、標的物質を結合するクロマトグラフィー樹脂と接触させる工程と、溶出条件下で、標的物質を結合したクロマトグラフィー樹脂をクロスフロー濾過して、標的物質を含む濾液を回収する工程とを含む。
【００２９】
このような方法を、以下：
ワクチンまたはワクチン成分を生成するための液体の分離、
血漿または血漿画分のその構成部分への分離、
初乳（ｃｌｏｓｔｒｕｍ）のその構成部分への分離、
乳のその構成部分への分離、
乳清のその構成部分への分離、
発酵液のその構成部分への分離、
昆虫細胞培養液のその構成部分への分離、
ウイルス培養液のその構成部分への分離、
細菌、酵母、菌類、昆虫細胞、または動物細胞の免疫グロブリン含有培養物からの免疫グロブリンの分離、
血清からの免疫グロブリンの分離、
血漿または血漿画分からの免疫グロブリンの分離、
全血からの免疫グロブリンの分離、
乳からの免疫グロブリンの分離、
初乳（ｃｌｏｓｔｒｕｍ）からの免疫グロブリンの分離、
乳清からの免疫グロブリンの分離、
腹水からの免疫グロブリンの分離、
全血からの凝固因子の分離、
血漿からの凝固因子の分離、
血清からの凝固因子の分離、
細菌、酵母、菌類、昆虫細胞、または動物細胞の凝固因子含有培養物からの凝固因子の分離、
乳からの凝固因子の分離、
乳清からの凝固因子の分離、
初乳（ｃｌｏｓｔｒｕｍ）からの凝固因子の分離、
腹水からの凝固因子の分離、
細菌、酵母、菌類、昆虫細胞、または動物細胞のタンパク質含有培養物からのタンパク質の分離、
細菌、酵母、菌類、昆虫細胞、または動物細胞の抗原含有培養物からの抗原の分離、
抗原含有ウイルス培養物からの抗原の分離、
細菌、酵母、菌類、昆虫細胞、または動物細胞のホルモン含有培養物からのホルモンの分離、
血清からのホルモンの分離、
血漿または血漿画分からのホルモンの分離、
全血からのホルモンの分離、
血漿からのホルモンの分離、
血清からのホルモンの分離、
乳からのホルモンの分離、
乳清からのホルモンの分離、
初乳（ｃｌｏｓｔｒｕｍ）からのホルモンの分離、
腹水からのホルモンの分離、
組織からのホルモンの分離、
ウイルス培養物からの糖タンパク質の分離、
細菌、酵母、菌類、昆虫細胞、または動物細胞の糖タンパク質含有培養物からの糖タンパク質の分離、
血清からの糖タンパク質の分離、
血漿または血漿画分からの糖タンパク質の分離、
全血からの糖タンパク質の分離、
血漿からの糖タンパク質の分離、
血清からの糖タンパク質の分離、
乳からの糖タンパク質の分離、
乳清からの糖タンパク質の分離、
初乳（ｃｌｏｓｔｒｕｍ）からの糖タンパク質の分離、
腹水からの糖タンパク質の分離、および
組織からの糖タンパク質の分離、
からなる群から選択される分離を行うために実施することができる。
【００３０】
本発明のさらなる態様は、バイオリアクタ、クロマトグラフィー樹脂リザーバ、第１のクロスフロー濾過モジュール、第２のクロスフロー濾過モジュール、および第３のクロスフロー濾過モジュールを備える分離システムにおいて液体を分離する方法に関する。このような方法は、第１のクロスフロー濾過モジュールにおいてバイオリアクタの灌流液を清澄化して透過液を得ることと、透過液をクロマトグラフィー樹脂リザーバに流すことと、クロマトグラフィー樹脂および透過液を、濃縮、ダイアフィルトレーション、および溶出用の第２のクロスフロー濾過モジュールに流して溶出物を得ること、前記溶出物を、濃縮およびダイアフィルトレーション用の第３のクロスフロー濾過モジュールに流すことを含む。
【００３１】
本発明は、別の態様では、少なくとも１つの標的物質を、生物活性汚染物質を含有する液体供給源から精製する方法に関する。前記方法は、
液体供給源をクロマトグラフィー樹脂と接触させる工程と、
液体供給源に由来する少なくとも１つの標的物質をクロマトグラフィー樹脂に結合させるのに十分な接触時間で、液体供給源をクロマトグラフィー樹脂とインキュベートする工程と、
クロスフローフィルターにおいてクロマトグラフィー樹脂を再循環させる工程であって、ここで、
ダイアフィルトレーションによりクロマトグラフィー樹脂を濃縮する工程と、
標的物質をクロマトグラフィー樹脂から溶出する工程と、
ダイアフィルトレーションにより標的物質をクロマトグラフィー樹脂から分離する工程が行われる工程と、
標的物質を回収する工程と、
任意に、標的物質を濃縮する工程を含み、
前記方法の間に生物活性汚染物質を不活性化することをさらに含む。
【００３２】
本発明の別の態様は、標的物質を、このような標的物質を含有する液体供給源から精製するための方法に関する。前記方法は、
液体供給源をクロマトグラフィー樹脂と接触させることと、
少なくとも１つのクロスフローフィルターにおいてクロマトグラフィー樹脂を再循環させることとであって、ここで、
平行流濾過により、標的物質およびクロマトグラフィー樹脂を液体供給源中で濃縮する工程と、
樹脂を保持し、かつ樹脂に結合しない種を通過させるのに有効な膜を備えるフィルターにおいて、クロマトグラフィー樹脂をダイアフィルトレーションする工程と、
樹脂を保持し、かつ標的物質を通過させるのに有効な溶出膜と接触させることにより、標的物質をクロマトグラフィー樹脂から溶出する工程が行われることと、
標的物質を回収するダイアフィルトレーションにより、標的物質をクロマトグラフィー樹脂から分離することと、
任意に、標的物質を濃縮することを含む。
【００３３】
別の態様では、本発明は、標的物質を、標的物質と１または複数のウイルス種を含有する液体供給源から精製するための方法に関する。このような方法は、
液体供給源を、１または複数のウイルス種に対する１または複数のウイルス不活性薬と接触させることと、
濾過において標的物質の少なくとも９０重量％を濃縮するのに有効な膜を備える平行流フィルターにおいて平行流濾過により、液体供給源中の標的物質を濃縮することと、
液体供給源をクロマトグラフィー樹脂と接触させることと、
標的物質の所望の画分を結合するのに十分な接触時間で、液体供給源をクロマトグラフィー樹脂とインキュベートすることと、
クロスフローフィルターにおいてクロマトグラフィー樹脂を再循環させることとであって、ここで、
クロマトグラフィー樹脂を濃縮し、樹脂を保持し、かつ樹脂に結合しない種を通過させるのに有効な膜を備えるフィルターにおけるダイアフィルトレーションにより、汚染物質を、クロマトグラフィー樹脂に結合した標的物質から分離する工程と、
樹脂を保持し、かつ標的物質を通過させるのに有効な溶出膜と接触させることにより、標的物質をクロマトグラフィー樹脂から溶出する工程と、
ダイアフィルトレーションにより、標的物質をクロマトグラフィー樹脂から分離する工程が行われることと、
標的物質を回収することと、
任意に、例えば、標的物質の少なくとも９０重量％を含む濃縮物を得るのに濃縮膜と接触させることにより、標的物質を濃縮することを含む。
【００３４】
別の態様では、本発明は、ユニバーサル血漿（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｌａｓｍａ）を、血清学的Ａ群抗体および／またはＢ群抗体を含有する血液から製造する方法に関する。前記方法は、血清学的Ａ群抗体および／またはＢ群抗体を含有する血液を、対応するＡ群抗原および／またはＢ群抗原を含むクロマトグラフィー樹脂と接触させることと、抗体が消耗された血液産物をユニバーサル血漿として回収することを含む。
【００３５】
本発明の非常に多くの他の態様、特徴、および例示的な実施態様は、以下の開示および添付の特許請求の範囲から、さらに完全に明らかになるだろう。
【００３６】
発明の詳細な説明およびその好ましい実施態様
定義、材料、および設備
本発明の説明では、以下で定義するような、いくつかの用語を使用する。
【００３７】
本明細書中で用いる「液体供給源」は、存在する他の物質から精製しようとする、少なくとも１つの、ことによると２つ以上の、価値のある生体物質または産物を含有する液体を意味する。本発明の実施において、液体供給源は、例えば、水溶液、有機溶媒系、または水溶液／有機溶媒の混合物もしくは溶液でもよい。液体供給源は、多数の生物学的分子（例えば、タンパク質、抗体、ホルモン、およびウイルス）ならびに小分子（例えば、塩、糖、脂質など））を含有する複合混合物または溶液であることが多い。生物起源の代表的な液体供給源は、水溶液または水性懸濁液として始めてもよいが、初期の分離工程（例えば、溶媒沈殿、抽出など）で用いられる有機溶媒を含んでもよい。本発明の精製方法に適した価値のある生体物質を含有する可能性のある液体供給源の例として、バイオリアクタからの培養上清、ホモジナイズされた細胞懸濁液、血漿、血漿画分、乳、初乳、およびチーズ乳清が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
本明細書中の用語「標的物質」は、液体供給源から精製しようとする１または複数の所望の産物を意味する。標的物質は、一般的に、価値のある生物学的産物（例えば、免疫グロブリン、凝固因子、ワクチン、抗原、抗体、選択されたタンパク質または糖タンパク質、ペプチド、酵素など）である。標的物質は、懸濁物質として、または溶解状態で液体供給源に存在してもよい。便宜のために、本明細書中では用語「標的物質」を単数形で用いるが、副産物として共に、または別個の回収成分として別々に（例えば、連続的に）精製しようとする１を超える物質を意味してもよいことが理解されるべきである。
【００３９】
「汚染物質」は、標的物質とは異なり、望ましくは、１または複数の最終標的物質産物から除去される、液体供給源中の材料を意味する。代表的な汚染物質として、核酸、タンパク質、ペプチド、エンドトキシン、ウイルスなどが挙げられる。本発明の方法の実施により除去することができる汚染物質は、所望の産物とは異なる１または複数の性質（例えば、分子量、電荷、様々なリガンドに対する特異的親和性など）を有する。多くの汚染物質は生物活性があり、その除去は、精製産物をその最終用途に使用できるために絶対必要である。さらに、後の使用で、汚染物質が標的産物に及ぼすことがある有害な影響のために、ある特定の汚染物質を、極めて低いレベルまで、好ましくは検出不可能なレベルまで精製装置から除去しなければならない。本発明の方法は、以下でさらに詳細に説明するように、非常に効率的な汚染除去を可能にする。
【００４０】
本明細書中の「クロスフローフィルター」は、多孔性フィルター要素を備える、ある種類のフィルターモジュールまたはフィルターカセットを意味する。液体培地の選択された１または複数の成分をフィルター要素に透過させるために、フィルター要素の表面を横断して、濾過しようとする液体培地を平行流で流す。クロスフローフィルターでは、液体培地の流れによりフィルター要素（分離膜表面）に及ぼされる剪断力が、フィルター要素表面上の固体蓄積に抵抗するのに役立つ。クロスフローフィルターとして、精密濾過、限外濾過、ナノ濾過、および逆浸透フィルターシステムが挙げられる。クロスフローフィルターは、適切な積み重なった配置の多数のフィルターシート（濾過膜）を備えてもよい。ここで、例えば、フィルターシートは透過液シートと残留液シートと互い違いになり、濾過しようとする液体がフィルターシートを横断して流れる場合、不透過種（例えば、フィルターシートの孔径より大きな直径の固体または高分子量種）は保持され、残留液の流れに入り、液体と透過種はフィルターシートを通過して拡散し、透過液の流れに入る。本発明の実施では、クロスフロー濾過は好ましい分離方法である。このような濾過に有用なクロスフローフィルターモジュールおよびクロスフローフィルターカセットは、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ ＳＲＴ，Ｉｎｃ．(Ｃａｒｙ，Ｎｏｒｔｈ．Ｃａｒｏｌｉｎａ．)から市販されている。このような種類の適切なクロスフローフィルターモジュールおよびクロスフローフィルターカセットは、本発明の発明者らの以下の米国特許：１９８９年９月１９日に発行された米国特許第４，８６７，８７６号，「フィルタープレート、フィルタープレート要素、およびそれを備えるフィルター（Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｔｅ，Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｔｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ，ａｎｄ Ｆｉｌｔｅｒ Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ Ｓａｍｅ）」；１９８９年１１月２１日に発行された米国特許第４，８８２，０５０号，同名称；１９９０年９月１１日に発行された米国特許第５，０３４，１２４号，同名称；１９９１年７月２３日に発行された米国特許第５，０３４，１２４号，同名称；１９９１年９月１７日に発行された米国特許第５，０４９，２６８号，同名称；１９９３年８月３日に発行された米国特許第５，２３２，５８９号，「フィルター要素および支持体（Ｆｉｌｔｅｒ Ｅｌｅｍｅｎｔ ａｎｄ Ｓｕｐｐｏｒｔ）」；１９９４年８月３０日に発行された米国特許第５，３４２，５１７号，「フィルターカセット製品（Ｆｉｌｔｅｒ Ｃａｓｓｅｔｔｅ Ａｒｔｉｃｌｅ）」；１９９７年１月１４日に発行された米国特許第５，５９３，５８０号，同名称；および１９９９年２月９日に発行された米国特許第５，８６８，９３０号，同名称に様々に記載されている。これらの全ての開示は、それぞれの全体が本明細書中に参考として援用される。
【００４１】
本明細書中の「クロマトグラフィー樹脂」は、液体供給源の１または複数の成分を選択的または優先的に結合する固相を意味する。本発明の実施において、このような「クロマトグラフィー樹脂」は、アフィニティ樹脂、イオン交換樹脂、およびイオン捕捉樹脂として一般的に説明される樹脂グループのいずれかから選択することができる。これらの樹脂には、目的の物質を液体供給源から選択的または優先的に捕捉する化学的性質または結合リガンドがあることのみを必要とする。有用なクロマトグラフィー樹脂は、一般的に、支持体と、目的の標的物質に対して選択的または優先的な結合能をもたらす、支持体に結合した１または複数のリガンドを含む。説明に役立つ例のために、有用な支持体として、多糖（例えば、アガロースおよびセルロース）、有機重合体（例えば、ポリアクリルアミド、メタクリル酸メチル、およびポリスチレン−ジビニルベンゼン共重合体（例えば、Ｒｏｈｍ＆Ｈａａｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａから市販されているＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）樹脂））が挙げられる。用語「樹脂」は、クロマトグラフィー分野で一般的に用いられているが、シリカおよびガラスなどの無機支持体材料にも有用性があるので、有機基質だけが樹脂基質の用途に適していることを意味しないことが本明細書中では意図されることを理解すべきである。本発明の実施において、樹脂は、だいたい球状のビーズの形であってもよく、あるいは、役立つように、樹脂は、他の規則的な形状または不規則な形状を有する微粒子または分割された形であってもよい。樹脂は多孔性でも無孔性でもよく、樹脂は、圧縮可能でも圧縮不可能でもよい。好ましい樹脂は、精製方法に用いられる条件（ポンプ輸送、クロスフロー濾過、温度、ｐＨ、および使用液体の他の側面を含む）に対して物理学的および化学的に復元力がある。本発明の実施において使用する樹脂は、規則的なだいたい球状の形状、無孔性、および圧縮不可能であることが好ましい。
【００４２】
「アフィニティリガンド」は、液体供給源の成分に、この成分の結合部位との特異的な相互作用により選択的または優先的に結合する部分を意味する。本発明の実施において、アフィニティリガンドは、一般的に、樹脂などの固相に固定化される。本発明の方法に有用なクロマトグラフィー樹脂を形成するために樹脂支持体に結合することができるアフィニティリガンドの例として、プロテインＡおよびプロテインＡアナログ（免疫グロブリンに選択的に結合する）；色素；抗原（関連する抗体の精製に有用である）；抗体（抗原精製用）；基質または基質アナログ（酵素精製用）などが挙げられる。アフィニティリガンドおよびアフィニティリガンドを固体支持体材料に結合する方法は、精製分野で周知である。例えば、参考教科書であるＡｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ），Ｐａｕｌ Ｍａｔｅｊｔｓｃｈｕｋ（編），Ｉｒｌ Ｐｒ：１９９７、およびＡｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｈｅｒｂｅｒｔ Ｓｃｈｏｔｔ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：１９９７を参照のこと。
【００４３】
「アフィニティクロマトグラフィー樹脂」または「アフィニティ樹脂」は、固体支持体または支持層と、その表面に結合したアフィニティリガンドを含むクロマトグラフィー樹脂を意味する。適切なアフィニティクロマトグラフィー樹脂の例示的な限定しない例として、ビーズ表面にアフィニティリガンドが結合した球状ビーズが挙げられる。ここで、ビーズは、セルロース、ポリ−スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、ポリメチルメタクリレート、または他の適切な材料で形成されている。本発明の実施において、クロスフロー濾過モジュールを通るポンプ輸送および再循環に耐える一方、構造完全性を維持することができる（例えば、孔を詰まらせる微粒子を生じる著しい破損を起こさない）堅いビーズが好ましい。アフィニティリガンドが結合した堅い無孔性セルロースビーズが特に好ましい。例示的な特に好ましい実施態様は、例えば、当該分野で周知の方法により、適切なアフィニティリガンド（例えば、プロテインＡ）に共有結合することができる「Ｏｒｂｉｃｅｌｌ（登録商標）」ビーズ（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｉｇｈｌａｎｄ Ｐａｒｋ，ＩＬ．から市販されている）を用いる。
【００４４】
「イオン交換クロマトグラフィー樹脂」または「イオン交換樹脂」は、正電荷または負電荷を有するリガンドが共有結合している、従って、イオン交換樹脂を接触させた溶液中のイオンと交換することができる遊離対イオンを有する固体支持体を意味する。
【００４５】
「陽イオン交換樹脂」は、負に荷電したリガンドが共有結合している、従って、樹脂を接触させた溶液中の陽イオンと交換するための遊離陽イオンを有するイオン交換樹脂を意味する。様々な陽イオン交換樹脂（例えば、共有結合した基がカルボン酸塩またはスルホン酸塩である陽イオン交換樹脂）が当該分野で周知である。市販されている陽イオン交換樹脂として、ＣＭＣ−セルロース、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）、およびＦａｓｔ Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）が挙げられる（後ろ２つはＰｈａｒｍａｃｉａから市販されている）。
【００４６】
「陰イオンイオン交換樹脂」は、正に荷電した基（例えば、第４級アミノ基）が共有結合しているイオン交換樹脂を意味する。市販されている陰イオン交換樹脂として、ＤＥＡＥセルロース、ＱＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）、およびＦａｓｔ Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）が挙げられる（後ろ２つはＰｈａｒｍａｃｉａから市販されている）。
【００４７】
本明細書中の「透析液」または「透析緩衝液」または「ダイアフィルトレート」は全て、汚染物質を標的物質−クロマトグラフィー樹脂複合体から除去するダイアフィルトレーション工程で用いられる液体を意味する。適切な透析液は、結合した標的物質を樹脂から著しく解離させることなく、汚染物質のクロマトグラフィー樹脂への非特異的結合を妨げるように作用することにより、汚染物質を樹脂から除去するのを助ける。透析液は、水と同じくらい単純であってもよく、多成分溶媒混合物（例えば、８０％ヘキサン、１５％アセトニトリル、および５％イソプロパノールを含有する溶媒混合物（ここで全てのパーセントは体積によるものであり、混合物の全体積に基づいている））と同じくらい複雑であってもよい。１を超える透析液を連続して使用してもよく、例えば、この連続透析液は、クロマトグラフィー樹脂と非特異的に会合する様々な種類の汚染物質を解離および除去するように設計された、様々な性質（例えば、ｐＨ値、伝導率、溶媒濃度などの）を有する。選択されたタンパク質（例えば、免疫グロブリン）の精製に有用な透析液の一例は、水性緩衝化０．４Ｍ ＮａＣｌ溶液である。
【００４８】
本明細書中で使用する「洗浄液」または「洗浄緩衝液」は、透析液または透析緩衝液と同義であり、すなわち、汚染物質を、標的物質が結合したクロマトグラフィー樹脂から洗い流すために用いられる液体である。
【００４９】
本明細書中の「溶出液」または「溶出緩衝液」は、汚染物質がクロマトグラフィー樹脂から取り除かれた後に、標的物質をクロマトグラフィー樹脂から解離するために用いられる液体を意味する。溶出液は、標的物質を不可逆的に変性することなく標的物質を解離するように働く。代表的な溶出液はクロマトグラフィー分野で周知であり、さらに高濃度の塩、遊離アフィニティリガンドもしくはアナログ、またはクロマトグラフィー樹脂からの標的物質の解離を促進する他の物質を有してもよい。「溶出条件」は、（変性していない）標的物質をクロマトグラフィー樹脂から解離させる、標的物質が結合したクロマトグラフィー樹脂に課せられる処理条件（例えば、標的物質が結合したクロマトグラフィー樹脂を溶出液または溶出緩衝液と接触させて、このような解離を生じる条件）を意味する。
【００５０】
本明細書中の「清澄化液」または「清澄化緩衝液」は、精製方法が完了した後に、クロマトグラフィー樹脂を洗浄するために用いられる液体を意味する。清澄化液は、界面活性剤、ウイルス不活性薬、または比較的高い濃度の塩を含有してもよく、精製方法中に用いられる液体より高いまたは低いｐＨを有してもよい。この目的は、クロマトグラフィー樹脂を再利用する準備ができるようにするために、クロマトグラフィー樹脂を完全に汚染除去することである。代表的な清澄化液は、クロマトグラフィー分野で周知である。
【００５１】
本明細書中の「貯蔵液」または「貯蔵緩衝液」は、クロマトグラフィー樹脂が使用していない間に懸濁される液体を意味する。貯蔵液はまた、緩衝化イオンに加えて、殺菌剤または他の防腐剤を含有してもよい。このような貯蔵液は、クロマトグラフィー分野で周知である。
【００５２】
精製方法
図１は、本発明の実施において標的物質を精製するために使用し得る一般スキームを示すものであり、以下に詳細に記載する。はじめに、供給液体は、必要であれば、（ａ）清澄化して、潜在的緩衝粒子を除去し、（ｂ）以後の精製工程に必要であれば濃縮または希釈する。供給液体が、粒子を十分に含まずおよび／または本来供給された形態で適切な能である場合、これらの工程（ａ）および（ｂ）のいずれか一方または両方を省略することができる。
【００５３】
次いで、供給液体を、（１）選択的または優先的に標的物質に結合するクロマトグラフィー樹脂に接触している第１の貯蔵槽に移す。供給液体を、（２）所望の高百分率の標的物質のクロマトグラフィー樹脂への結合を導くのに十分な接触時間でクロマトグラフィー樹脂とともにインキュベートし、得られる樹脂−標的複合体を形成させる。インキュベーションの間、樹脂と標的物質との間の接触を十分に確実にするように透過物が再循環して貯蔵槽に戻るクロスフロー濾過を含む適切な手段によって供給液体を攪拌する。
【００５４】
樹脂を、（３）クロスフロー濾過を介して再循環する。該クロスフロー濾過では、（ａ）樹脂を濃縮し；（ｂ）樹脂−標的複合体を妨害せずに樹脂から非特異的結合成分を解離するために選択された第１のダイアフィルトレーション液体に対して樹脂をダイアフィルトレーションし；（ｃ）特定の樹脂−標的複合体を解離させるために選択された第２のダイアフィルトレーション液体による処置によって目的の物質を樹脂から溶出させ；（ｄ）該標的物をダイアフィルトレーションにより樹脂から取り出す。標的物質を含有するダイアフィルトレーションを（４）第２の貯蔵槽に捕獲し；標的物質を有用な濃度に濃縮する。
【００５５】
以後の工程において使用される分離クロスフローフィルターモジュールのポアサイズよりも平均直径が大きい粒状混入物を供給液体から除去するために、随意的な第１の清澄化工程が実施される。必要とされる第１の清澄化工程は、クロマトグラフィー樹脂スラリー中の粒状物質の濃縮を回避し、さらに該工程は、精製方法の後半の工程中に粒状混入物が溶解して精製された標的物質に混入することを防止する。
【００５６】
精製分野において周知の方法、例えば、遠心分離、重力分離、沈殿、フロキュレーション式沈降、デカンテーション、通常の濾過、篩い分け、吸収、吸着およびタンジェント流濾過によって清澄化工程を達成することができる。あるいは、供給液体は、すでにこの工程が不必要であるほど十分に清浄であり得る。
【００５７】
図２は、クロスフロー濾過および以後の精製工程のための清澄化された供給液体の貯蔵槽への移送によって供給液体を清澄化するための系２０の流れ図の略図を示す。図２では、供給液体を、代表的には導管２２を介して、発酵槽またはバイオリアクター２１由来の上清もしくは懸濁液を、供給液体を適切な温度に保持するための熱ジャケット２４を具備する貯蔵槽２３へ搬送している。ポンプ２８を稼働させ、バルブ３０および３２を閉じた状態にし、さらなる濾過サイクルのために保持物を貯蔵槽２４に戻すために必要に応じてバルブ３１を開けて、導管２４、２５、および２６を介するクロスフロー濾過モジュール２７を介して、供給液体を貯蔵槽２３から循環させる。導管２９を介して仕上げ緩衝液を貯蔵槽２３に添加する。導管３３を介して透過物（清澄化された供給液体）を第２の貯蔵槽３４に搬送し、ここで、該透過物は以後の工程のために保持される。貯蔵槽３４はまた、清澄化された供給液体を適切な温度に保持するための熱ジャケット３５を具備する。使用後、系をパージして洗浄する場合、バルブ３０および３２を開けて、導管３６および３７は洗浄液を適切なドレインおよび／または回収手段に搬送する。
【００５８】
次いで、図２に記載の貯蔵槽３４において供給液体を適切なクロマトグラフィー樹脂に接触させる。すでに（随意的に清澄化された）供給液体を含有する貯蔵槽にクロマトグラフィー樹脂を添加することが可能であるか、あるいはクロマトグラフィー樹脂を貯蔵槽に投入してその後供給液体を添加するか、またはクロマトグラフィー樹脂と供給液体とを適切な方法、例えば、バッチ、半バッチもしくは連続方法で接触させてもよい。
【００５９】
この工程で使用するために適切なクロマトグラフィー樹脂は、ビーズであっても他の粒子の形態であってもよく、また標的物質に結合可能な最終的に分割される形態であってもよい。ビーズは分離フィルターのポアサイズより約１．５〜１０倍大きい直径を有するサイズであるのが好ましい。クロマトグラフィー樹脂は、アフィニティ、イオン交換およびイオン捕獲樹脂として一般に記載される樹脂の群のいずれかから選択することができ、そのようなタイプの広範な樹脂は市販されている。樹脂は、目的の物質を捕獲する化学基またはリガンド化学基を有し、標的物質を樹脂に結合させる。
【００６０】
特に有用なクロマトグラフィー樹脂は、約１．０〜１，０００ミクロンのサイズの範囲であり、非特異的結合に対しては低い親和性を有する、一様な球状、非多孔性、剛性、非凝集性粒子の形態で提供される。本発明の１つの特定の好ましい実施態様において、クロマトグラフィー樹脂は、１〜３ミクロンの直径を有するセルロースビーズを含み、該ビーズの表面にはプロテインＡリガンドが共有結合している。そのようなビーズは、組織培養物およびマウス腹水からモノクローナル抗体を精製するのに極めて有用である。そのようなタイプのビーズは、商品名「Ｏｒｂｉｃｅｌｌ（登録商標）」でＡｃｃｕｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ， Ｉｎｃ．（Ｈｉｇｈｌａｎｄ Ｐａｒｋ， Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）より市販されている。
【００６１】
図３は、そのようなＯｒｂｉｃｅｌｌ（登録商標）ビーズの表面および断面を示しており、該ビーズの表面積は大きいが内部に孔を有さないため、その結果、標準的な多孔性ビーズ３とは対照的に該ビーズは高い機械的強度を有する。Ｏｒｂｉｃｅｌｌ（登録商標）ビーズの強度および剛性が高いため、該ビーズはクロスフローフィルターを介する再循環に特に適している。何故なら、該ビーズは、フィルターのポアを詰まらせる可能性があるより小さな粒子に分解する傾向がなく、また該ビーズは、圧縮して不規則な流路を形成する傾向がないからである。そのようなＯｒｂｉｃｅｌｌ（登録商標）ビーズに対応する特徴を有する他のタイプのビーズは市販されており、本発明の実施において有用に使用される。
【００６２】
図４は、先行技術の生体分離において使用されるタイプの多孔性ビーズ５とは反対に、Ｏｒｂｉｃｅｌｌ（登録商標）ビーズを使用する場合に存在するより簡単な流路を概略的に示す。そのような先行技術の多孔性ビーズは、それらの弾性ならびにポンピングの延長および再循環条件下での破壊に対する耐性について本発明の実施において好適に使用される非多孔性ビーズよりもそれらの物性に有利な面が少ない。非多孔性ビーズのさらなる有益性は、混入物が孔に捕捉されて溶出工程中に溶出し、標的物質の純度を低下させるようなことがないことである。
【００６３】
次に、図５では、図２の上記の最初の処理後にクロマトグラフィー樹脂−供給源スラリーを貯蔵槽３４内で適切な接触時間だけ接触させる。インキュベーションの簡単な方法は、スラリーを含有する貯蔵槽３４を攪拌または振盪することを伴い得る。本発明の好ましい実施態様では、分離クロスフローフィルターモジュール４２を横切るポンプ３８の稼働下でライン３６を介して、および（バルブ４９に接続しているドレインライン４７を有する）ライン４０を介して、樹脂／液体スラリーを再循環させ、フィルター４２を清潔に保つのに十分な容量流速で、背圧バルブ４６を有するライン４４を介するフィルターモジュール４２から貯蔵槽３４へ液体を再循環させる。浸透物は、ライン５０から開口バルブ５８を通りライン５６を介して貯蔵槽３４へ戻され、貯蔵槽内の液体に適切な接触またはインキュベーション時間を提供する。
【００６４】
貯蔵槽３４内の好ましい接触（インキュベーション）時間は、使用する特定のクロマトグラフィー樹脂および結合部位が標的物質に結合する場合の該樹脂の濃度、ならびにビーズおよび標的物質の相対濃度に依存する。化学基の反応時間はリガンドにより変動するが、標的物質に対する利用可能な結合部位の濃度が高いほど、好適なインキュベーション時間は短くなる。標的物質より１．２〜１０倍高い濃度で、さまざまなアプリケーションにおいて過剰な樹脂を最適にすることができることが考慮される。該方法を最適化する場合にさらに考慮することは、液体に懸濁される樹脂の濃度である。（結合された樹脂および液体物質の全重量に基づく重量で）１〜６４％の範囲にある樹脂は、有利に利用することができ、約１０〜約５０％の樹脂濃度（同基準で）が最適と見なされている。
【００６５】
熱ジャケット３５（または他の熱輸送手段、例えば、貯蔵槽３４中の液体容積中の配置された加熱コイル、貯蔵槽の外部の再循環ヒーターであって、該熱輸送手段を介して液体が貯蔵槽から流動し、ヒーターユニット内で適切な温度に加熱され、そして貯蔵槽の液体容積に戻される上記熱輸送手段）によるインキュベーション工程中に温度が制御され、適切な温度を有する液体および樹脂混合物が提供されて、標的物質の活性が保存される。そのような目的に適切な温度は、当該分野の範囲内で、過度の実験を行うことなく容易に決定することができる。
【００６６】
クロマトグラフィー樹脂との接触のために供給液体を貯蔵槽に輸送すること（上記の工程（１））および供給液体をクロマトグラフィー樹脂とともにインキュベーションすること（上記の工程（２））は、樹脂を含まない等量の液体を取り出しながら供給液体をクロマトグラフィー樹脂に同時に添加することによって、同時に達成することができる。本発明の本実施態様における制御要素は、標的物質がクロマトグラフィー樹脂に本質的に完全に結合することを可能にするのに十分な程度に、貯蔵槽内の供給液体の残留時間が長いことである。この目的は、分離クロスフローフィルターモジュール４２を介して容易に達成される。浸出された供給液体容積に等しい透過流はバルブ６６を有するライン６４においてループから取り出される。過剰の透過物はバルブ５８を含有するライン５６で樹脂貯蔵槽に送られ戻される。
【００６７】
混入物および過剰の液体は、分離クロスフローフィルターモジュール４２によって分離され、すでに標的物質に結合しているクロマトグラフィー樹脂から透析分離される。樹脂スラリーは、分離のためにクロスフローフィルターモジュールを横切って再循環し、保持液体は貯蔵槽に戻される。透過物液体は、（１）ドレイン（バルブ５４を含有するライン５２による）；（２）以後の樹脂を含有する第２の貯蔵槽（示さず）（バルブ６６を含有するライン６４による）；（３）非依存的処理工程のうち１つ以上に方向付けられる。樹脂は、約０．１〜約６４体積％の範囲の濃度に濃縮することができる。本発明の１つの好ましい実施態様では、樹脂は約５０体積％に濃縮される。
【００６８】
クロマトグラフィー樹脂を洗浄するのに必要な洗浄緩衝液の容積は、懸濁液中の樹脂の濃度に依存する。例えば、樹脂スラリーが１００リットルの１％樹脂溶液である場合、樹脂を洗浄するのに必要な容積は１０倍の１，０００リットルである。樹脂スラリーが１０リットルの１０％樹脂溶液であれば、必要な容積は１００リットルである。
【００６９】
クロスフローフィルターモジュールにおける流速に対する樹脂濃度の影響のため、クロマトグラフィー樹脂を洗浄するのに必要な時間も懸濁液中の樹脂の濃度に依存する。例えば、樹脂スラリーが１０リットルの２５％樹脂溶液である場合、透過速度は１００ Ｌ／ｍ２−ｈであり得る。樹脂スラリーが５リットルの４０％樹脂溶液である場合、透過速度は僅か１０ Ｌ／ｍ２−ｈであり得る。従って、１．０ ｍ２クロスフローフィルターモジュールを使用して１０倍の洗浄緩衝液でクロマトグラフィー樹脂スラリーを洗浄するのに必要な時間は、２０％懸濁液では１時間であり、４０％懸濁液では５時間の洗浄時間が必要である。
【００７０】
樹脂の濃縮後に、適切な透析液を貯蔵槽３４に添加することによって、ダイアフィルトレーションが開始される。適切な透析液（または「ダイアフィルトレーション物」もしくは「透析緩衝液」）は、結合した標的物質の樹脂からの有意な解離を引き起こすことなくクロマトグラフィー樹脂に対する混入物の非特異的結合を妨害するように作用することによって、樹脂から混入物を除去するのに役立つ。透析液は簡単なものでは水があり、または複雑なものでは複数の溶媒の混合物、例えば、８０％ヘキサン、１５％アセトニトリルおよび５％イソプロパノール溶液などがあり得る。
【００７１】
このダイアフィルトレーション工程中の透析緩衝液の交換回数は、好ましくは３〜２５の範囲である。透析緩衝液の好ましい交換回数は、分離クロスフローフィルターモジュール４２および標的産物の所望される純度に関連して混入物の保持特性に基づく。最終的な微量の混入物を樹脂スラリーから除去するための透析緩衝液の交換（ダイアフィルトレーション）は、透過速度と同じ流速で仕上げ透析緩衝液をスラリー貯蔵槽に添加することによって達成される。この手順は、レベル制御、充填セル、または流量メーターを使用することによって、容易に自動化することができる。緩衝液の交換の程度は、樹脂スラリー貯蔵槽に添加された緩衝液の累積容積を樹脂スラリーの出発容積で除した割合として規定される容積置換によって測定される。添加した緩衝液を伴う本来の上清の交換または希釈の程度は、幾何学的な機能である。本発明の例示的実施態様のために、上清の希釈および容積置換の表を以下に示す。
【００７２】
【表１】
【００７３】
随意的分離クロスフローフィルターモジュール４２は、好ましくは、クロマトグラフィー樹脂ビーズの平均直径より１．５〜１０倍小さい膜ポアサイズを有する。分離クロスフローフィルターモジュールのチャンネル高は、望ましくは、クロマトグラフィー樹脂ビーズの平均直径より１．２〜１０倍大きく、フィルターモジュールの申し分のないクリアランスおよび効率的な流体力学的挙動を提供する。分離クロスフローフィルターモジュールの極めて好ましいデザインは、保持チャンネルに対して一様な分布を有する開口チャンネルモジュールである。本発明の１つの好ましい実施態様において、クロマトグラフィー樹脂ビーズは約１〜３ミクロンの平均直径を有し、クロスフローフィルターは約０．６ミクロンの平均ポアサイズを伴うフィルターエレメントを有し、保持チャンネルの高さは０．５ ｍｍである。この目的に適切なクロスフローフィルターモジュールは、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ ＳＲＴ， Ｉｎｃ． （Ｃａｒｙ， ＮＣ）より市販されている。
【００７４】
本発明の方法の１つの実施態様において、ダイアフィルトレーション工程由来の透過物は、（バルブ６６を伴うドレインライン６４を含有する）ライン５０、バルブ６２およびライン６０を通過して、出発物質からの物質の第２の分離を生じる第２の樹脂を含有するさらなる貯蔵槽６８に達する。
【００７５】
例えば、特定の抗原に対する免疫グロブリンは、それぞれが特定のウイルス抗原に連結される一連のアフィニティクロマトグラフィー樹脂を使用することによって、血漿から連続的に精製される。もう１つの例示的実施例では、それぞれ場標的化されたタンパク質に結合するリガンドに連結される一連の特異的クロマトグラフィー樹脂を使用することによって、乳清から連続的に乳タンパク質が分離される。これらのリガンドはイオン交換体、免疫グロブリン、天然タンパク質、または標的化されたタンパク質に選択的もしくは優先的に結合するアフィニティリガンドであり得、樹脂に連結され得る。さらなるもう１つの例示的実施例では、標的化されたタンパク質に対する抗体と連結される樹脂を使用することによって、血漿タンパク質が全血漿または血漿画分から連続的に精製される。
【００７６】
混入物を除去するためのダイアフィルトレーションの後、標的物質が溶出され、クロマトグラフィー樹脂から回収される。溶出のために使用される特異的化学基は、クロマトグラフィー樹脂−標的物質相互作用の性質および強度に依存する。溶出および回収手順は、上記のダイアフィルトレーション工程に類似する。クロマトグラフィー樹脂から標的物質を解離する適切な溶出液は、透過速度に等しい速度で、所望される収量が得られるまで樹脂スラリー貯蔵槽（例えば、ライン４８における貯蔵槽３４）に添加される。イオン濃度の上昇は、伝導率メーターを使用して容易に監視することができ、イオン濃度は時間とともに特定の速度で増加するため、クロマトグラフィー樹脂がイオン交換樹脂である場合、この手順は極めて有用である。クロマトグラフィー樹脂がアフィニティ樹脂である場合、はじめに濃縮された形態の溶出緩衝液を樹脂スラリー貯蔵槽に添加して、ダイアフィルトレーション緩衝液から溶出緩衝液への移行を増強することが有用である。
【００７７】
例えば、タンパク質Ａ樹脂からモノクローナル抗体を溶出させる場合、測定された容量の１．０ Ｍグリシン緩衝液を添加することによって、樹脂スラリーのｐＨは適切な値、例えば、ｐＨ ２．５のオーダーまで低下する。次いで、樹脂スラリーを１０容量の０．１ Ｍグリシン緩衝液に対してダイアフィルトレーションする。
【００７８】
溶出工程の改変は、異なるポアサイズのクロスフローフィルターモジュールを使用することを含む。例えば、クロマトグラフィー樹脂から血漿タンパク質を溶出させる場合、クロスフロー膜を、任意の混入ウイルスまたは早期のダイアフィルトレーション工程３（ａ）中に取り出されなかったタンパク質−ウイルス複合体を保持する膜に交換することが有用である。
【００７９】
そのような改変（図６を参照のこと）のための第１のクロスフローフィルターは８３であり、第２のフィルターは４２であり得る。樹脂スラリーは、最初に濃縮され、閉められたバルブ５７および開口されたバルブ８１を伴うライン４０を介するポンプ３８によるクロスフローフィルター８３を介してダイアフィルトレーションされる。フィルター８３から、開口バルブ９１および閉められたバルブ４６の直前のライン８９を介してダイアフィルトレーションされたスラリーが流動され、貯蔵槽３４に戻される。この工程の浸透物はドレインに流動することができるかまたはライン９３および開口バルブ９９を介して以後の精製に流動することができる。溶出工程のために、溶出した透過物がさらに目の細かいフィルター４２を介して流動し、開口バルブ６２およびライン６０を介して貯蔵槽６８に達することができるように、バルブ８１および９１は閉じられ、バルブ５７および４６は開口される。フィルターモジュール８３は、バルブ９９を含有するライン９３、およびバルブ８７を含有するライン８５に接続し、フィルターモジュールからの透過物の流動を適応させるか、または（濾過される液体からのフィルターエレメントの対向側面に対して同流もしくは逆流で）もう１つの質量移行液の通過を適応させ、質量移行勾配および保持流体の内外への粒状種の流動を最大にする。
【００８０】
ダイアフィルトレーションおよび溶出操作は、図６に示す第１の貯蔵槽３４において全てを実施することができ、次いで、標的物質を含有する得られる透過物は、最終処置（例えば、該貯蔵槽の緩衝化）または他の処置のために第２の貯蔵槽６８に通過され、クロスフローフィルター８２においてさらなる濾過が実施され、最終的に回収容器８０に回収される。そのような配列において、ライン９３における第１のクロスフローフィルターモジュール８３由来の透過物は、利用される緩衝液の量を最大にするためにナノフィルターなどのもう１つのクロスフローフィルターを介して循環され得る。
【００８１】
従って、多くの代替的装置の配列を構成、配列および操作し、さまざまな実施態様において本発明の分離方法を実施することできることが理解されよう。
【００８２】
本発明のもう１の例示的実施態様では、イオン交換樹脂から乳タンパク質が溶出され、イオン交換はより高価なアフィニティ樹脂の特異性を有さないという事実のため、サイズ分離を生じる異なるポアサイズの分離交差モジュールを使用することによって純度の高いタンパク質製品が回収される。
【００８３】
例示的に示される図６は、そのようの目的のために使用される異なるポアサイズの２つのクロスフローフィルターモジュールを使用する精製系を示す。図６の系では、図５に関連して系に対応番号を付し、同じ番号のエレメントは構成、配列および操作が対応する。しかし、図６に見られるように、系は、フィルターモジュール４２に並行流関係で多岐管集配されるもう１つのクロスフローフィルターモジュール８３を含み、フィルター４２から流動制御バルブ５７を含有するライン５５が分岐し、第２のフィルター８３モジュールからバルブ８１を含有するライン４０およびバルブ９１を含有するライン８９に結合する。
【００８４】
第２のフィルターモジュール由来の透過物が選択的に排液および／または示されるように貯蔵槽３４に再循環されるか、あるいは質量移行液が同流または逆流関係で通過することができ、液流がクロスフローフィルターモジュールの質量移行エレメントの対向側面に対して濾過されるように、第２のフィルターモジュールもまた、バルブ８７を含有するライン８５に接続され、順にバルブ９７および９９を含有するライン９５に連絡する。
【００８５】
図６に示される一般的な再配列および配置を有する系の特定の実施態様では、フィルターモジュール４２は、０．０４ミクロンの平均ポアサイズを有するフィルター（膜）エレメントを含有し得、フィルターモジュール８３は、０．６ミクロンの平均ポアサイズを有するフィルター（膜）エレメントを含有し得る。本発明の実施において使用されるフィルターモジュールにおけるフィルターエレメントのタイプおよび特徴は広範に変動することが認識され、またこのことは同様に当業者に理解され、そのような目的に適切な市販のフィルターエレメントを使用して容易に実施されるであろう。
【００８６】
溶出標的物質（例えば、タンパク質またはペプチド）は、望ましくは適切な条件（例えば、温度、ｐＨ、および塩濃度）下で貯蔵槽に捕獲されることに注意することは重要である。ｐＨを増減することおよび純粋生成物の不活性化および消失を回避するために温度を低下させることは必要であり得る。例えば、タンパク質Ａ樹脂から溶出した免疫グロブリンは、Ｔｒｉｓ緩衝液を含有する温度制御された貯蔵槽中に、ｐＨ８、４℃〜１０℃で回収するべきであり、これらはｐＨを上昇させて中性にし、そして免疫グロブリンの変性を回避するために溶出物を冷却する。
【００８７】
以下の使用のための装置を用意するために、標的物質が溶出され、捕獲貯蔵槽に移された後、溶出緩衝液を清浄緩衝液に切り換え、続いて、クロマトグラフィー樹脂が再使用のために準備されるように保存緩衝液に切り換えられる。この工程中は、浸透物がドレインに方向付けられる。
【００８８】
次いで、捕獲貯蔵槽に捕捉された溶出標的物質は、さらなるクロスフローフィルターモジュールまたは沈殿、凍結乾燥、エバポレーション、もしくは遠心分離などの溶出緩衝液を除去するための他の適切な工程によって濃縮され得る。好ましい実施態様では、クロスフローフィルターモジュールを使用する。フィルター媒体は、好ましくは標的物質の平均半径よりも小さく、標的物質が適切な程度で濃縮され得、混入イオンがダイアフィルトレーションによって除去されるように溶出緩衝液のイオンより大きなポアサイズを有する。
【００８９】
例えば、タンパク質Ａ樹脂から精製および溶出されたＩｇＧを濃縮し、３０，０００分子量膜を使用してダイアフィルトレーションし、溶出緩衝液の塩を排除することができる。そのような交差濾過モジュールは、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ ＳＲＴ， Ｉｎｃ． （Ｃａｒｙ， ＮＣ）より市販されている。
【００９０】
上記の方法は、標的生体物質の精製において広範な有用性を有する。供給液体は、血清；血漿および血漿画分；全血；乳；初乳；清乳；細菌、酵母、菌類、昆虫もしくは動物細胞または組織培養液および組織均質化物を含む広範な物質から選択することができる。標的物質は、濾過精製適応可能でかつクロマトグラフィー樹脂に選択的または優先的に結合し得る極めて広範な生体物質から選択することができ、これらには、タンパク質、糖タンパク質、ホルモン、抗原、抗体、凝固因子、免疫グロブリン、および酵素が含まれるが、これらに限定されない。クロマトグラフィー樹脂は、標的物質の特徴の基づいて選択され、よく理解されている広範な範囲のイオン交換およびアフィニティリガンドは当業者に利用可能であり、本明細書において開示および教示された内容に基づいて当該分野の範囲で容易時実施される。
【００９１】
例えば、本発明の方法は、血清、血漿および血漿画分、全血、乳、初乳、および清乳より選択される供給液体からＩｇＧを精製するのに有用である。凝固因子は血漿、全血、血清および組織培養物から精製することができる。
【００９２】
本発明の方法は、血漿および組織培養液体などの供給液体からＩｇＧを精製するのに費用および時間的効果を提供することが実証されている。
【００９３】
本発明の特定の態様は、上記において一般的に記載されるように供給液体を処理してそれから精製された標的物質を回収することに関するが、ここで、供給液体は、混入物として生物学的に有害な混入物、例えば、細菌種、ウイルス種、抗原種などを含み得る。本発明は、供給液体の処置、またはそのような混入物を不活化し、非有害にするための他の方法もしくは該方法における精製流を考慮する。例えば、混入物はウイルス種、例えば、ＨＩＶ、肝炎ウイルスなどを含み得、該混入物の不活化は、殺ウイルス処置を含み得る。
【００９４】
従って、本発明は、特定の態様において、少なくとも１つの標的物質を、生物活性汚染物質を含有する液体供給源から精製する方法であって、前記方法は、
前記液体供給源をクロマトグラフィー樹脂と接触させる工程と、
前記液体供給源に由来する少なくとも１つの標的物質を前記クロマトグラフィー樹脂に結合させるのに十分な接触時間で、前記液体供給源を前記クロマトグラフィー樹脂とインキュベートする工程と、
クロスフローフィルター（例えば、１つのクロスフローフィルターまたは１を超えるクロスフローフィルター）において前記クロマトグラフィー樹脂を再循環させる工程であって、ここで、
前記クロマトグラフィー樹脂を濃縮およびダイアフィルトレーションする工程と、
前記標的物質を前記クロマトグラフィー樹脂から溶出する工程と、
ダイアフィルトレーションにより前記標的物質を前記クロマトグラフィー樹脂から分離する工程が行われる工程と、
前記標的物質を回収する工程と、
任意に、前記標的物質を濃縮する工程を含み、
前記方法の間に前記生物活性汚染物質を不活性化することをさらに含む、方法に関する。
【００９５】
そのような不活化は、例えば、該方法の最初の工程として、もしくは供給液体とクロマトグラフィー樹脂とのインキュベーション中、（不活化剤を、濾過操作中の流れ含有する標的物質に添加することによる）クロスフロー濾過処理中、または他の任意の適切な方法で生体活性混入物を不活化剤に接触させることを含み得る。不活性化剤は、任意の適切な形態、例えば、１以上の標的物質に結合するために画分されているクロマトグラフィー樹脂ビーズ上の結合種、または不活化剤のみを結合して有しているビーズ上の結合種であって、ここで、不活化種−結合ビーズは、不活化種−結合ビーズおよび１以上の標的物質に結合するために画分されているビーズの両方を含む全体集団の集団成分を含む、結合種として誘導することができる。
【００９６】
ウイルス種に対する不活化剤は任意の適切な薬剤であり得る。本明細書において使用される用語「薬剤」は、広範に構成されることを意図し、任意の抗ウイルス分子、ウイルス種を非生物化または非感染化する複合体形成剤または捕獲剤、ウイルス転写阻害剤、殺ウイルス処理（暴露）条件などを含む。具体的な例としては、ヨード、塩素、溶媒−界面活性剤組成物、および紫外線または他の殺ウイルス放射線暴露が挙げられる。ウイルス捕獲剤の使用については、供給液体のウイルスを捕獲するためにウイルス受容体種を使用することができる。特定のウイルス捕獲剤の１つのクラスは、シアル酸またはノイラミン酸（ｎｏｎｕｌｏｓａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ）例えば、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコシルノイラミン酸、Ｎ，Ｏ７−ジアセチルノイラミン酸、Ｎ，Ｏ４−ジアセチルノイラミン酸、およびＮ，Ｏ，Ｏ−トリアセチルノイラミン酸などを含む。従って、クロマトグラフィー樹脂は、マイクロビーズ結合捕獲剤種を伴うマイクロビーズ、例えば、ビーズ上にシアル酸を有する画分されたマイクロビーズを含み得る。
【００９７】
さらなる特定の態様において、本発明は、標的物質を、前記標的物質と１または複数のウイルス種を含有する液体供給源から精製するための方法であって、該方法は、
前記液体供給源を、前記１または複数のウイルス種に対する１または複数のウイルス不活性薬と接触させることと、
平行流濾過において前記標的物質の少なくとも９０重量％を濃縮するのに有効な膜を備える平行流フィルターにおける平行流濾過により、液体供給源中の前記標的物質を濃縮することと、
前記液体供給源をクロマトグラフィー樹脂と接触させることと、
前記標的物質の所望の画分を結合するのに十分な接触時間で、前記液体供給源を前記クロマトグラフィー樹脂とインキュベートすることと、
クロスフローフィルターにおいて前記クロマトグラフィー樹脂を再循環させることであって、ここで、
前記クロマトグラフィー樹脂を濃縮し、前記樹脂を保持し、かつ前記樹脂に結合しない種を通過させるのに有効な膜を備えるフィルターにおけるダイアフィルトレーションにより、汚染物質を、前記クロマトグラフィー樹脂に結合した標的物質から分離する工程と、
前記樹脂を保持し、かつ前記標的物質を通過させるのに有効な溶出膜と接触させることにより、前記標的物質を前記クロマトグラフィー樹脂から溶出する工程と、
ダイアフィルトレーションにより、前記標的物質を前記クロマトグラフィー樹脂から分離する工程が行われることと、
前記標的物質を回収することと、
任意に、前記標的物質を、例えば、９０重量％の標的物質を含む濃縮物を回収するのに効率的な濃縮膜と接触させることによって、濃縮することを含む。
【００９８】
本発明の範囲内にあるもう１つの方法の改変体は、標的物質を、前記標的物質を含有する液体供給源から精製するための方法であって、該方法は、
前記液体供給源をクロマトグラフィー樹脂と接触させることと、
少なくとも１つのクロスフローフィルターにおいて前記クロマトグラフィー樹脂を再循環させることであって、ここで、
平行流濾過により、前記液体供給源中の前記標的物質およびクロマトグラフィー樹脂を濃縮する工程と、
前記樹脂を保持し、かつ前記樹脂に結合しない種を通過させるのに有効な膜を備えるフィルターにおいて前記クロマトグラフィー樹脂をダイアフィルトレーションする工程と、
前記樹脂を保持し、かつ前記標的物質を通過させるのに有効な溶出膜と接触させることにより、前記標的物質を前記クロマトグラフィー樹脂から溶出する工程と、
ダイアフィルトレーションにより、前記標的物質を前記クロマトグラフィー樹脂から分離する工程が行われることと、
前記標的物質を回収することと、
任意に、前記標的物質を濃縮することを含む。
【００９９】
上記の方法では、供給液体は、１以上の病原性生物を含有し得、該方法は、そのような場合において、さらに、供給液体とそのような１以上の病原性生物に対するウイルス不活化剤とを接触させる工程を含む。
【０１００】
もう１つの態様および用途において、本発明は、Ａ型および／またはＢ型血液抗体を含有する血液から普遍的血漿を製造する方法であって、Ａ型および／またはＢ型血液抗体を含有する血液を対応するＡ型および／またはＢ型抗原と接触させ、普遍的血漿として抗体涸渇血液産物を回収することを含む方法に関する。
【０１０１】
クロマトグラフィー樹脂は、Ｓｃｈｗａｒｔｚの米国特許第４，８２８，９８４号（１９８９年５月９日付「擬態細胞の組成、合成および使用」）またはＳｃｈｗａｒｔｚの米国特許第４，７７４，１８９号（１９８８年９月２７日付「染色された細胞を擬態する蛍光較正マイクロビーズ」）の実施例に記載のようなタイプのマイクロビーズを含み得る（これらの文献の開示内容は、それらの全体が本明細書において参考として援用される）。Ｓｃｈｗａｒｔｚの米国特許第４，７７４，１８９号は、抗原種によって画分されたマイクロビーズについて記載しており、ここで、抗原種は、その分子上の１級アミンによってビーズ上の表面のエポキシ基を介してマイクロビーズに結合する。
【０１０２】
上記の方法で抗体涸渇血液産物を普遍的血漿として回収することは、上記でより具体的に記載されているような本発明のさまざまな濃縮／溶出／タンジェント濾過技術を使用して実施することができる。
【０１０３】
本発明の特徴および利点については、以下の非制限的実施例を参考にして、より詳細に表される。
【０１０４】
実施例１．粗ヒト血漿からのＩｇＧの精製
図５において略図で示される装置を使用し、本発明の方法により、粗ヒト血漿からＩｇＧを精製した。
【０１０５】
図７は、そのような精製の有効性を評価するために実施したＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す。レーン７０１は、既知の分子量を有するいくつかのペプチドを含有する較正サンプルである。レーン７０２および７０３は、クロスフロークロマトグラフィーによる５倍希釈後のそれぞれ２０μＬおよび４０μＬのサンプルである。レーン７０４および７０５は、ダイアフィルトレーション後のクロマトグラフィー樹脂ビーズの上清のそれぞれ２０μＬおよび４０μＬのサンプルである。レーン７０６および７０７は、それぞれレーン７０２および７０４で使用した物質のβ−メルカプトエタノール消化の４０μＬのサンプルである。
【０１０６】
実施例２．組織培養液からのＩｇＧの精製
図５において略図で示される装置を使用し、組織培養液からＩｇＧを精製した。ＴＲＩＰＯＲＴフィルターモジュール（Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ ＳＲＴ， Ｉｎｃ．， Ｃａｒｙ， ＮＣ）を使用して、組織培養液（５０μｇ／ｍＬの濃度でＩｇＧを有する２０．０ Ｌの組織培養物）を濾過によって清澄化した。透過物を、Ｏｂｉｃｅｌｌ（登録商標）−タンパク質Ａビーズ（Ａｃｃｃｕｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ， Ｌｔｄ．， Ｈｉｇｈｌａｎｄ Ｐａｒｋ， ＩＬ）の懸濁液を含有する容器へ方向付けた。ＴＲＩＰＯＲＴフィルターモジュールを介する全体的な再循環を、１５分間、大気温度で行うことによって、培養液およびビーズの懸濁液をインキュベーとした。懸濁液を５倍濃縮し、次いで、０．４ Ｍ ＮａＣｌで１０倍ダイアフィルトレーションした。透過物ラインを、中和緩衝液を含有するクエンチング容器に移動させ、透析緩衝液を酸性溶出緩衝液に変更することによって、結合ＩｇＧの溶出を実施した。中和された濃縮物を濃縮し、次いで、１０倍にダイアフィルトレーションして、酸性中和中に形成した低分子の塩を除去した。最終収量は、１０ ｍｇ／ｍＬの濃度の約１００ ｍＬの精製されたＩｇＧであった。全処理時間は、７５分間であり、精製されたＩｇＧの収率は９０〜９４％であった。
【０１０７】
図８は、上記の精製の有個性を評価するために実施したＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。レーン８０１は、既知の分子量を有するいくつかのペプチドを含有する較正サンプルである。レーン８０２および８０３は、本実施例の方法の第１の試験由来の精製されたＩｇＧのそれぞれ２０μＬおよび４０μＬのサンプルである。レーン８０４および８０５は、本実施例の方法の第２の試験由来の精製されたＩｇＧのそれぞれ２０μＬおよび４０μＬのサンプルである。レーン８０６および８０７は、本精製方法において出発物質として使用される馴化培地のそれぞれ２０μＬおよび４０μＬのサンプルである。レーン８０８および８０９は、それぞれ第１および第２の試験由来の精製されたＩｇＧのβ−メルカプトエタノール消化の４０μＬのサンプルである。レーン８１０は、馴化培地出発物質のβ−メルカプトエタノール消化の４０μＬのサンプルである。
【０１０８】
本明細書では、さまざまな例示的特徴、態様および実施態様を参考にして本発明を説明してきたが、具体的に示されかつ記載されているこれらの内容以外にも、本発明では改変、変更および他の実施態様が受け入れられることが理解されよう。従って、本発明は、添付の請求項の範囲内においてそのようなすべての代替的改変、変更および他の実施態様を含むことが広範に解釈され、考慮される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 クロスフロー濾過に基づく装置を用いた、本発明の１つの実施態様による精製方法の大まかな計画を示す図である。
【図２】 後で精製工程にかけようとする液体供給源を清澄化するのに有用な装置の概略図である。
【図３】 標準的な先行技術の多孔性ビーズと比較した、クロマトグラフィー樹脂に用いられるＯｒｂｉｃｅｌｌ（登録商標）ビーズの微細形態を示す図である。
【図４】 標準的な先行技術の多孔性ビーズの周囲と、そのビーズを通過する流路と比較した、Ｏｒｂｉｃｅｌｌ（登録商標）ビーズ周囲の流路の概略図である。
【図５】 本発明の方法のクロスフロークロマトグラフィー精製、溶出、回収、および濃縮工程を実施するのに有用な装置の概略図である。本発明の１つの実施態様では、クロスフローフィルターモジュールが用いられる。
【図６】 本発明の方法のクロスフロークロマトグラフィー精製、溶出、回収、および濃縮工程を実施するのに有用な代替装置の概略図である。本発明の別の実施態様では、第１のクロスフローフィルターモジュールとは多孔度が異なる第２のクロスフローフィルターモジュールがさらに用いられる。
【図７】 本発明の方法により未処理ヒト血漿から精製されたＩｇＧ試料のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す図である。
【図８】 本発明の方法により細胞培地から精製されたＩｇＧ試料のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す図である。
発明の背景
発明の分野
本発明は、一般的に、１または複数の標的生体物質（例えば、選択されたタンパク質、抗体、抗原、凝固因子、糖タンパク質、およびホルモン）を、標的物質とは異なる分子量または他の物理的特性もしくは化学的特性を有する汚染物質を有する液体供給源から精製するための方法および装置に関する。ここで、精製は、クロスフロー濾過システムにおける連続したクロマトグラフィーおよびダイアフィルトレーション分離工程により行われる。
【０００２】
関連技術の説明
液体試料から物質を分離するために様々な精製方法が用いられてきた。沈殿、遠心分離、濾過、クロマトグラフィー、および蒸発の全てが、収率、時間消費、純度、および費用に関して様々な成功をおさめて用いられてきた。
【０００３】
生物学的精製の分野では、遠心分離、クロマトグラフィー、および濾過が、１０〜９０パーセントの収率および９５パーセントと高い純度で、液体試料から非常に価値のある物質を得るために特に有用であった。
【０００４】
遠心分離、クロマトグラフィー、および濾過の現在の使用では、収率と純度は逆の関係にあり、精製工程を１つ進むごとに、収率は著しく小さくなることが一般に理解されている。これらの遠心分離、クロマトグラフィー、および濾過の方法は高価であり、比較的遅く、清浄して再利用するのが非常に難しい装置を用いることもまたよく理解されている。
【０００５】
これに関する特定の問題の１つは、クロマトグラフィー樹脂の中を通じて不規則な流路が形成される傾向がある固定層クロマトグラフィーカラムの清浄である。カラムを完全に清浄しないと後のバッチを汚染する可能性があるので、これらの不規則な流路は、生体物質の精製において特定の問題を引き起こす。
【０００６】
一例は、イオン交換およびアフィニティクロマトグラフィーカラムによる血漿タンパク質の精製である。ウイルスを含まないと試験された１バッチの血漿が、後で、ウイルスに汚染されていると分かった場合、カラムからウイルスが確実に除去されていると判断することは、ほとんど不可能である。さらに、生物学的液体が細菌増殖を容易に助けるので、クロマトグラフィーカラムにおける単純な細菌汚染および生物増殖は、決して希なことではない。細菌生物および細菌により産生されるエンドトキシンは医薬品の無数のバッチを汚染し、かなりの財政上の損失と最終製品のレシピエントにおける有害反応をもたらしてきた。
【０００７】
この頻繁に観察され、清浄方法の確認に多数の問題を生じさせる「ネズミトンネル（ｒａｔ ｔｕｎｎｅｌ）」はまた、クロマトグラフィーカラムの容積および分解能のかなりの部分を駄目にする。
【０００８】
固定層クロマトグラフィーカラムの別の問題は、特に、アガロース（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａから市販されているＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ゲル）などの軟らかいゲルの場合での樹脂の圧縮である。このトンネル化と圧縮の共同する問題のために、多量の過剰な結合能を必要とすることでクロマトグラフィー費用はかなり高くなる。圧縮とトンネル化により引き起こされる別の問題は、純度の減少である。高い純度には、標的物質の均一な溶出が必要とされる。トンネル化と圧縮により、溶出液の均一な分布が妨げられ、標的産物に似た溶出プロフィールを有する汚染物質ならびに圧縮媒体にトラップされランダムに溶出される汚染物質から、標的物質は正確に分離されない。
【０００９】
モノクローナル抗体精製の場合、１０倍過剰な結合能でカラムに詰めることが一般的である。かなり流通されたシステムでは、３倍過剰な結合能でしか全標的産物を結合せず、それにより、クロマトグラフィー媒体の費用を１／３に減らすことが可能である。
【００１０】
トンネル化および圧縮を減少させる１つの一般的なアプローチは、流速を低減することによりカラムの運転圧を小さくすることである。流速の低減は樹脂圧縮を減少させるが、処理時間をかなり増加させ、多くの場合、方法の分解と収率に悪影響を及ぼす。
【００１１】
平行流濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）は、膜表面と平行に液体を押し出すことにより液体中の物質を分離するために様々な孔径の膜を利用する。この方法は、水および／または緩衝液に懸濁された物質の濃縮に有効であることが分かっているが、溶液中の化合物の精製に広く有用であることは分かっていなかった。この方法の第１の問題は、似た大きさの２つの粒子を分離できるほど孔径が十分に均一でないことである。さらに、液体混合物中の物質（特に、タンパク質および脂質）は膜表面に結合し（「ゲル層分極（ｇｅｌ ｌａｙｅｒ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）」と呼ばれる現象である）、有効孔径ならびに膜の界面化学を変化させる。
【００１２】
流動層クロマトグラフィーは、液体混合物から物質を分離する別の手段である。流動層クロマトグラフィーは、化学産業および石油産業においてより一般的に利用されている。流動層カラムは、一般的に、１０フィート以上の高さであり、直径が９〜１２インチである。医薬品用およびバイオプロセス用カラムは、通常、３フィート未満の高さであり、樹脂の圧縮特性に応じて１〜２４インチの一般範囲で広範囲な直径を有する。流動層の利点は、固定層クロマトグラフィーと比較して低圧での流速が速いことである。速い流速は、クロマトグラフィーによる分離にある特定の利点をもたらすが、この方法には、いくつかの欠点がある。この方法には、重力に対して中立の、または浮力を示す、より大きな直径の樹脂が必要である。これらの大きな１００〜３００ミクロン平均直径の樹脂は、固定層カラムで用いられる小さな１〜１００ミクロン樹脂より単位体積あたりの表面積が小さく、それに応じて、表面結合能が小さい。
【００１３】
表面積の損失を最小限にし、密度を減少させるために、流動層樹脂は、非常に小孔のある物質である。しかしながら、その多孔性の結果として、これらの樹脂粒子は非常に亀裂しやすく、それにより、カラムの入口および出口をブロックする小さな微粒子を生じる。
【００１４】
流動層の最も重大な問題は混合である。カラムはいずれの固定混合手段も含まないので、この層は、エアジェットにより、またはカラムを通して分離しようとする液体を高流速で再利用することにより従来どおり混合される。高流速と制限された混合により、産物を樹脂から溶出する間に必要とされる均一な相変化が阻害される。
【００１５】
前記の当該分野での不備の結果として、複合液体供給源から生物学的標的物質を精製するための迅速で均一な時間効率および費用効率の高いシステムが、どうしても必要とされる。望ましいことに、このようなシステムは、前記の様々な先行技術の分離技術に固有の問題を克服している。望ましいことに、このようなシステムは容易に拡大縮小可能であり、研究室におけるミリリットルから、生物薬剤生産においてよく遭遇する数千リットルまでの供給材料の体積を処理するのに適応可能である。最後に、望ましいことに、このようなシステムは、様々な性質の複数の液体供給源（粘性の複合溶液を含む）と共に用いることができる。
【００１６】
発明の概要
本発明は、有利な収率、産物純度、時間効率および費用効率で精製するために、１または複数のクロスフローフィルター要素と１または複数の種類のクロマトグラフィー樹脂を組み合わせて用いる精製方法に関する。
【００１７】
本発明の実施で用いられる１または複数のクロスフローフィルターモジュールは、例えば、中空繊維フィルター、スパイラルフィルター、プレートフィルターおよびフレームフィルター、カセットフィルター、攪拌セル（ｓｔｉｒ ｃｅｌｌ）、管状フィルター、セラミックフィルターなどのクロスフローフィルターを含む任意の適切な型でよい。
【００１８】
本発明の方法は、１または複数の標的生体物質（例えば、選択されたタンパク質、抗体、抗原、凝固因子、糖タンパク質、およびホルモン）を、標的物質とは異なる分子量あるいは他の物理的特性または化学的特性を有する汚染物質を有する液体供給源から精製することを含む。ここで、連続したクロマトグラフィーおよびダイアフィルトレーション分離工程がクロスフロー濾過システムにおいて達成される。
【００１９】
本発明の精製方法を用いると、タンパク質、抗体、成長ホルモン、および他の生物学的に重要な物質が、複合液体供給源（例えば、血漿、血漿画分、乳、初乳、チーズ乳清、細胞培養液および組織培養液、ならびに組織ホモジネートおよび細胞ホモジネート）から高収率かつ迅速に単離される。
【００２０】
さらに、本発明の方法を従来の精製方法に適用して、従来の分離の収率を増大させ、このような精製に用いられるアフィニティ媒体および／または濾過媒体ならびに装置表面の再利用および汚染除去を可能にするように、従来の方法を適切にきれいにすることができる。
【００２１】
さらに詳細に述べると、本発明は、１つの態様では、標的物質を液体供給源から精製する方法に関する。このような方法は、１つの実施態様では、
１）液体供給源をクロマトグラフィー樹脂と接触させる工程と、
２）樹脂が、標的物質の所望の画分を結合できるのに十分な接触時間で、液体供給源をクロマトグラフィー樹脂とインキュベートする工程と、
３）クロスフローフィルターシステムにおいてクロマトグラフィー樹脂を再循環させる工程であって、ここで、
ａ）クロマトグラフィー樹脂を濃縮し、ダイアフィルトレーションにより、汚染物質を、クロマトグラフィー樹脂に結合した標的物質から分離する工程と、
ｂ）標的物質を前記クロマトグラフィー樹脂から溶出する工程と、
ｃ）ダイアフィルトレーションにより、標的物質をクロマトグラフィー樹脂から分離する工程が行われる工程と、
４）標的物質を回収する工程と、
５）任意に、標的物質を濃縮する工程を含む。
【００２２】
前記精製方法は、(ａ)存在し、かつ後の工程において孔またはオリフィスを詰まらせる可能性のある、どんな望ましくない微粒子も除去するために液体供給源を清澄化する工程と、(ｂ)液体供給源をクロマトグラフィー樹脂と接触させる工程が最も効率的に進行できるように、液体供給源を濃縮または希釈する工程を、任意に、最初にさらに含んでもよい。これらの工程は、選択された量の液体を前記システムに添加することにより、後のインキュベーション工程での使用に望ましい濃度の清澄化された液体供給源を得る、クロスフロー濾過により行われることが好ましい。
【００２３】
本発明の精製方法は、さらなる標的物質の単離につながる追加工程をさらに含んでもよい。これらの追加工程では、クロマトグラフィー樹脂の濃縮およびダイアフィルトレーションにより生じた透過液を、溶出前に、第２のクロマトグラフィー樹脂または一連のクロマトグラフィー樹脂に通過させ、工程（１）〜（４）を繰り返してもよい。あるいは、またはさらに、標的物質の収率を増大させるために、本発明の精製方法では、前記工程３（ａ）からのダイアフィルトレートに対して工程（１）〜（４）をさらに繰り返してもよい。
【００２４】
前記精製方法は、１または複数のクロマトグラフィー分離工程において、アフィニティリガンドが結合した堅い球状セルロースビーズを含むクロマトグラフィー樹脂を都合よく使用してもよい。
【００２５】
本発明の方法は、別の態様では、免疫グロブリンを液体供給源から精製する方法を含む。前記方法は、
液体供給源をクロマトグラフィー樹脂と接触させる工程であって、前記クロマトグラフィー樹脂は、堅い無孔性球状ビーズに結合したプロテインＡを含む工程と、
樹脂が、免疫グロブリンの所望の画分を結合できるのに十分な接触時間で、液体供給源をクロマトグラフィー樹脂とインキュベートする工程と、
クロスフローフィルターシステムにおいてクロマトグラフィー樹脂を再循環させる工程であって、ここで、
クロマトグラフィー樹脂を濃縮し、ダイアフィルトレーションにより、汚染物質を、クロマトグラフィー樹脂に結合した免疫グロブリンから分離する工程と、
免疫グロブリンをクロマトグラフィー樹脂から溶出する工程と、
ダイアフィルトレーションにより、免疫グロブリンをクロマトグラフィー樹脂から回収する工程が行われる工程と、
任意に、免疫グロブリンを濃縮する工程を含む。
【００２６】
さらなる態様では、本発明は、標的物質を液体供給源から分離および濃縮するための精製装置を含む。このような装置は、
固相クロマトグラフィー樹脂材料を保持し、選択的に、液体を第１のリザーバに流入出させるために構築および整列された第１のリザーバと、
第１のリザーバに配置された固相クロマトグラフィー樹脂材料と、
液体を透過液と残留液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）の流れに分離するための第１のクロスフロー濾過モジュールであって、液体を第１のクロスフロー濾過モジュールに流入させ、透過液と残留液の流れを第１のクロスフロー濾過モジュールから流出させるための手段が設けられた第１のクロスフロー濾過モジュールと、
透過液の流れを捕捉および保持し、選択的に、液体を第２のリザーバに流入出させるために構築および整列された第２のリザーバと、
液体の流れを濃縮するための第２のクロスフロー濾過モジュールであって、液体を第２のクロスフロー濾過モジュールに流入させ、透過液と残留液の流れを第２のクロスフロー濾過モジュールから流出させるための手段が設けられた第２のクロスフロー濾過モジュールと、
濃縮された液体の流れを第２のクロスフロー濾過モジュールから捕捉するために構築および適合された収集容器と、
補給液を第１のリザーバおよび第２のリザーバに供給し、
液体供給源を、クロマトグラフィー樹脂が充填された第１のリザーバに選択的に流入させて、スラリーを形成し、
第１のリザーバからのスラリーを第１のクロスフロー濾過モジュールに再循環させ、透過液と残留液の流れを第１のリザーバに戻すことにより、液体供給源をクロマトグラフィー樹脂とインキュベートし、
スラリーを濃縮し、ダイアフィルトレーションにより汚染物質をスラリーから分離し、標的物質をクロマトグラフィー樹脂から溶出し、ダイアフィルトレーションにより標的物質をクロマトグラフィー樹脂から分離するために適合された流路（ｆｌｏｗ ｐａｔｈｗａｙ）中で、クロスフローフィルターにおいてスラリーを再循環させ、
標的物質を第２のリザーバにおいて捕捉し、
標的物質を第２のリザーバから第２のクロスフロー濾過モジュールに流すことにより、標的物質を濃縮し、
濃縮された標的物質を、第２のクロスフロー濾過モジュールの流路から収集容器に回収するために構築および整列されたコンジット、バルブ、およびポンプ手段とを備える。
【００２７】
前記装置の好ましい実施態様では、第１および第２のリザーバに、適切な処理温度を維持するためのサーマルジャケットが設けられる。
【００２８】
別の態様では、本発明は、標的物質を有する液体を精製する方法に関する。前記方法は、液体を、標的物質を結合するクロマトグラフィー樹脂と接触させる工程と、溶出条件下で、標的物質を結合したクロマトグラフィー樹脂をクロスフロー濾過して、標的物質を含む濾液を回収する工程とを含む。
【００２９】
このような方法を、以下：
ワクチンまたはワクチン成分を生成するための液体の分離、
血漿または血漿画分のその構成部分への分離、
初乳（ｃｌｏｓｔｒｕｍ）のその構成部分への分離、
乳のその構成部分への分離、
乳清のその構成部分への分離、
発酵液のその構成部分への分離、
昆虫細胞培養液のその構成部分への分離、
ウイルス培養液のその構成部分への分離、
細菌、酵母、菌類、昆虫細胞、または動物細胞の免疫グロブリン含有培養物からの免疫グロブリンの分離、
血清からの免疫グロブリンの分離、
血漿または血漿画分からの免疫グロブリンの分離、
全血からの免疫グロブリンの分離、
乳からの免疫グロブリンの分離、
初乳（ｃｌｏｓｔｒｕｍ）からの免疫グロブリンの分離、
乳清からの免疫グロブリンの分離、
腹水からの免疫グロブリンの分離、
全血からの凝固因子の分離、
血漿からの凝固因子の分離、
血清からの凝固因子の分離、
細菌、酵母、菌類、昆虫細胞、または動物細胞の凝固因子含有培養物からの凝固因子の分離、
乳からの凝固因子の分離、
乳清からの凝固因子の分離、
初乳（ｃｌｏｓｔｒｕｍ）からの凝固因子の分離、
腹水からの凝固因子の分離、
細菌、酵母、菌類、昆虫細胞、または動物細胞のタンパク質含有培養物からのタンパク質の分離、
細菌、酵母、菌類、昆虫細胞、または動物細胞の抗原含有培養物からの抗原の分離、
抗原含有ウイルス培養物からの抗原の分離、
細菌、酵母、菌類、昆虫細胞、または動物細胞のホルモン含有培養物からのホルモンの分離、
血清からのホルモンの分離、
血漿または血漿画分からのホルモンの分離、
全血からのホルモンの分離、
血漿からのホルモンの分離、
血清からのホルモンの分離、
乳からのホルモンの分離、
乳清からのホルモンの分離、
初乳（ｃｌｏｓｔｒｕｍ）からのホルモンの分離、
腹水からのホルモンの分離、
組織からのホルモンの分離、
ウイルス培養物からの糖タンパク質の分離、
細菌、酵母、菌類、昆虫細胞、または動物細胞の糖タンパク質含有培養物からの糖タンパク質の分離、
血清からの糖タンパク質の分離、
血漿または血漿画分からの糖タンパク質の分離、
全血からの糖タンパク質の分離、
血漿からの糖タンパク質の分離、
血清からの糖タンパク質の分離、
乳からの糖タンパク質の分離、
乳清からの糖タンパク質の分離、
初乳（ｃｌｏｓｔｒｕｍ）からの糖タンパク質の分離、
腹水からの糖タンパク質の分離、および
組織からの糖タンパク質の分離、
からなる群から選択される分離を行うために実施することができる。
【００３０】
本発明のさらなる態様は、バイオリアクタ、クロマトグラフィー樹脂リザーバ、第１のクロスフロー濾過モジュール、第２のクロスフロー濾過モジュール、および第３のクロスフロー濾過モジュールを備える分離システムにおいて液体を分離する方法に関する。このような方法は、第１のクロスフロー濾過モジュールにおいてバイオリアクタの灌流液を清澄化して透過液を得ることと、透過液をクロマトグラフィー樹脂リザーバに流すことと、クロマトグラフィー樹脂および透過液を、濃縮、ダイアフィルトレーション、および溶出用の第２のクロスフロー濾過モジュールに流して溶出物を得ること、前記溶出物を、濃縮およびダイアフィルトレーション用の第３のクロスフロー濾過モジュールに流すことを含む。
【００３１】
本発明は、別の態様では、少なくとも１つの標的物質を、生物活性汚染物質を含有する液体供給源から精製する方法に関する。前記方法は、
液体供給源をクロマトグラフィー樹脂と接触させる工程と、
液体供給源に由来する少なくとも１つの標的物質をクロマトグラフィー樹脂に結合させるのに十分な接触時間で、液体供給源をクロマトグラフィー樹脂とインキュベートする工程と、
クロスフローフィルターにおいてクロマトグラフィー樹脂を再循環させる工程であって、ここで、
ダイアフィルトレーションによりクロマトグラフィー樹脂を濃縮する工程と、
標的物質をクロマトグラフィー樹脂から溶出する工程と、
ダイアフィルトレーションにより標的物質をクロマトグラフィー樹脂から分離する工程が行われる工程と、
標的物質を回収する工程と、
任意に、標的物質を濃縮する工程を含み、
前記方法の間に生物活性汚染物質を不活性化することをさらに含む。
【００３２】
本発明の別の態様は、標的物質を、このような標的物質を含有する液体供給源から精製するための方法に関する。前記方法は、
液体供給源をクロマトグラフィー樹脂と接触させることと、
少なくとも１つのクロスフローフィルターにおいてクロマトグラフィー樹脂を再循環させることとであって、ここで、
平行流濾過により、標的物質およびクロマトグラフィー樹脂を液体供給源中で濃縮する工程と、
樹脂を保持し、かつ樹脂に結合しない種を通過させるのに有効な膜を備えるフィルターにおいて、クロマトグラフィー樹脂をダイアフィルトレーションする工程と、
樹脂を保持し、かつ標的物質を通過させるのに有効な溶出膜と接触させることにより、標的物質をクロマトグラフィー樹脂から溶出する工程が行われることと、
標的物質を回収するダイアフィルトレーションにより、標的物質をクロマトグラフィー樹脂から分離することと、
任意に、標的物質を濃縮することを含む。
【００３３】
別の態様では、本発明は、標的物質を、標的物質と１または複数のウイルス種を含有する液体供給源から精製するための方法に関する。このような方法は、
液体供給源を、１または複数のウイルス種に対する１または複数のウイルス不活性薬と接触させることと、
濾過において標的物質の少なくとも９０重量％を濃縮するのに有効な膜を備える平行流フィルターにおいて平行流濾過により、液体供給源中の標的物質を濃縮することと、
液体供給源をクロマトグラフィー樹脂と接触させることと、
標的物質の所望の画分を結合するのに十分な接触時間で、液体供給源をクロマトグラフィー樹脂とインキュベートすることと、
クロスフローフィルターにおいてクロマトグラフィー樹脂を再循環させることとであって、ここで、
クロマトグラフィー樹脂を濃縮し、樹脂を保持し、かつ樹脂に結合しない種を通過させるのに有効な膜を備えるフィルターにおけるダイアフィルトレーションにより、汚染物質を、クロマトグラフィー樹脂に結合した標的物質から分離する工程と、
樹脂を保持し、かつ標的物質を通過させるのに有効な溶出膜と接触させることにより、標的物質をクロマトグラフィー樹脂から溶出する工程と、
ダイアフィルトレーションにより、標的物質をクロマトグラフィー樹脂から分離する工程が行われることと、
標的物質を回収することと、
任意に、例えば、標的物質の少なくとも９０重量％を含む濃縮物を得るのに濃縮膜と接触させることにより、標的物質を濃縮することを含む。
【００３４】
別の態様では、本発明は、ユニバーサル血漿（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｌａｓｍａ）を、血清学的Ａ群抗体および／またはＢ群抗体を含有する血液から製造する方法に関する。前記方法は、血清学的Ａ群抗体および／またはＢ群抗体を含有する血液を、対応するＡ群抗原および／またはＢ群抗原を含むクロマトグラフィー樹脂と接触させることと、抗体が消耗された血液産物をユニバーサル血漿として回収することを含む。
【００３５】
本発明の非常に多くの他の態様、特徴、および例示的な実施態様は、以下の開示および添付の特許請求の範囲から、さらに完全に明らかになるだろう。
【００３６】
発明の詳細な説明およびその好ましい実施態様
定義、材料、および設備
本発明の説明では、以下で定義するような、いくつかの用語を使用する。
【００３７】
本明細書中で用いる「液体供給源」は、存在する他の物質から精製しようとする、少なくとも１つの、ことによると２つ以上の、価値のある生体物質または産物を含有する液体を意味する。本発明の実施において、液体供給源は、例えば、水溶液、有機溶媒系、または水溶液／有機溶媒の混合物もしくは溶液でもよい。液体供給源は、多数の生物学的分子（例えば、タンパク質、抗体、ホルモン、およびウイルス）ならびに小分子（例えば、塩、糖、脂質など））を含有する複合混合物または溶液であることが多い。生物起源の代表的な液体供給源は、水溶液または水性懸濁液として始めてもよいが、初期の分離工程（例えば、溶媒沈殿、抽出など）で用いられる有機溶媒を含んでもよい。本発明の精製方法に適した価値のある生体物質を含有する可能性のある液体供給源の例として、バイオリアクタからの培養上清、ホモジナイズされた細胞懸濁液、血漿、血漿画分、乳、初乳、およびチーズ乳清が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
本明細書中の用語「標的物質」は、液体供給源から精製しようとする１または複数の所望の産物を意味する。標的物質は、一般的に、価値のある生物学的産物（例えば、免疫グロブリン、凝固因子、ワクチン、抗原、抗体、選択されたタンパク質または糖タンパク質、ペプチド、酵素など）である。標的物質は、懸濁物質として、または溶解状態で液体供給源に存在してもよい。便宜のために、本明細書中では用語「標的物質」を単数形で用いるが、副産物として共に、または別個の回収成分として別々に（例えば、連続的に）精製しようとする１を超える物質を意味してもよいことが理解されるべきである。
【００３９】
「汚染物質」は、標的物質とは異なり、望ましくは、１または複数の最終標的物質産物から除去される、液体供給源中の材料を意味する。代表的な汚染物質として、核酸、タンパク質、ペプチド、エンドトキシン、ウイルスなどが挙げられる。本発明の方法の実施により除去することができる汚染物質は、所望の産物とは異なる１または複数の性質（例えば、分子量、電荷、様々なリガンドに対する特異的親和性など）を有する。多くの汚染物質は生物活性があり、その除去は、精製産物をその最終用途に使用できるために絶対必要である。さらに、後の使用で、汚染物質が標的産物に及ぼすことがある有害な影響のために、ある特定の汚染物質を、極めて低いレベルまで、好ましくは検出不可能なレベルまで精製装置から除去しなければならない。本発明の方法は、以下でさらに詳細に説明するように、非常に効率的な汚染除去を可能にする。
【００４０】
本明細書中の「クロスフローフィルター」は、多孔性フィルター要素を備える、ある種類のフィルターモジュールまたはフィルターカセットを意味する。液体培地の選択された１または複数の成分をフィルター要素に透過させるために、フィルター要素の表面を横断して、濾過しようとする液体培地を平行流で流す。クロスフローフィルターでは、液体培地の流れによりフィルター要素（分離膜表面）に及ぼされる剪断力が、フィルター要素表面上の固体蓄積に抵抗するのに役立つ。クロスフローフィルターとして、精密濾過、限外濾過、ナノ濾過、および逆浸透フィルターシステムが挙げられる。クロスフローフィルターは、適切な積み重なった配置の多数のフィルターシート（濾過膜）を備えてもよい。ここで、例えば、フィルターシートは透過液シートと残留液シートと互い違いになり、濾過しようとする液体がフィルターシートを横断して流れる場合、不透過種（例えば、フィルターシートの孔径より大きな直径の固体または高分子量種）は保持され、残留液の流れに入り、液体と透過種はフィルターシートを通過して拡散し、透過液の流れに入る。本発明の実施では、クロスフロー濾過は好ましい分離方法である。このような濾過に有用なクロスフローフィルターモジュールおよびクロスフローフィルターカセットは、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ ＳＲＴ，Ｉｎｃ．(Ｃａｒｙ，Ｎｏｒｔｈ．Ｃａｒｏｌｉｎａ．)から市販されている。このような種類の適切なクロスフローフィルターモジュールおよびクロスフローフィルターカセットは、本発明の発明者らの以下の米国特許：１９８９年９月１９日に発行された米国特許第４，８６７，８７６号，「フィルタープレート、フィルタープレート要素、およびそれを備えるフィルター（Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｔｅ，Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｔｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ，ａｎｄ Ｆｉｌｔｅｒ Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ Ｓａｍｅ）」；１９８９年１１月２１日に発行された米国特許第４，８８２，０５０号，同名称；１９９０年９月１１日に発行された米国特許第５，０３４，１２４号，同名称；１９９１年７月２３日に発行された米国特許第５，０３４，１２４号，同名称；１９９１年９月１７日に発行された米国特許第５，０４９，２６８号，同名称；１９９３年８月３日に発行された米国特許第５，２３２，５８９号，「フィルター要素および支持体（Ｆｉｌｔｅｒ Ｅｌｅｍｅｎｔ ａｎｄ Ｓｕｐｐｏｒｔ）」；１９９４年８月３０日に発行された米国特許第５，３４２，５１７号，「フィルターカセット製品（Ｆｉｌｔｅｒ Ｃａｓｓｅｔｔｅ Ａｒｔｉｃｌｅ）」；１９９７年１月１４日に発行された米国特許第５，５９３，５８０号，同名称；および１９９９年２月９日に発行された米国特許第５，８６８，９３０号，同名称に様々に記載されている。これらの全ての開示は、それぞれの全体が本明細書中に参考として援用される。
【００４１】
本明細書中の「クロマトグラフィー樹脂」は、液体供給源の１または複数の成分を選択的または優先的に結合する固相を意味する。本発明の実施において、このような「クロマトグラフィー樹脂」は、アフィニティ樹脂、イオン交換樹脂、およびイオン捕捉樹脂として一般的に説明される樹脂グループのいずれかから選択することができる。これらの樹脂には、目的の物質を液体供給源から選択的または優先的に捕捉する化学的性質または結合リガンドがあることのみを必要とする。有用なクロマトグラフィー樹脂は、一般的に、支持体と、目的の標的物質に対して選択的または優先的な結合能をもたらす、支持体に結合した１または複数のリガンドを含む。説明に役立つ例のために、有用な支持体として、多糖（例えば、アガロースおよびセルロース）、有機重合体（例えば、ポリアクリルアミド、メタクリル酸メチル、およびポリスチレン−ジビニルベンゼン共重合体（例えば、Ｒｏｈｍ＆Ｈａａｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａから市販されているＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）樹脂））が挙げられる。用語「樹脂」は、クロマトグラフィー分野で一般的に用いられているが、シリカおよびガラスなどの無機支持体材料にも有用性があるので、有機基質だけが樹脂基質の用途に適していることを意味しないことが本明細書中では意図されることを理解すべきである。本発明の実施において、樹脂は、だいたい球状のビーズの形であってもよく、あるいは、役立つように、樹脂は、他の規則的な形状または不規則な形状を有する微粒子または分割された形であってもよい。樹脂は多孔性でも無孔性でもよく、樹脂は、圧縮可能でも圧縮不可能でもよい。好ましい樹脂は、精製方法に用いられる条件（ポンプ輸送、クロスフロー濾過、温度、ｐＨ、および使用液体の他の側面を含む）に対して物理学的および化学的に復元力がある。本発明の実施において使用する樹脂は、規則的なだいたい球状の形状、無孔性、および圧縮不可能であることが好ましい。
【００４２】
「アフィニティリガンド」は、液体供給源の成分に、この成分の結合部位との特異的な相互作用により選択的または優先的に結合する部分を意味する。本発明の実施において、アフィニティリガンドは、一般的に、樹脂などの固相に固定化される。本発明の方法に有用なクロマトグラフィー樹脂を形成するために樹脂支持体に結合することができるアフィニティリガンドの例として、プロテインＡおよびプロテインＡアナログ（免疫グロブリンに選択的に結合する）；色素；抗原（関連する抗体の精製に有用である）；抗体（抗原精製用）；基質または基質アナログ（酵素精製用）などが挙げられる。アフィニティリガンドおよびアフィニティリガンドを固体支持体材料に結合する方法は、精製分野で周知である。例えば、参考教科書であるＡｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ），Ｐａｕｌ Ｍａｔｅｊｔｓｃｈｕｋ（編），Ｉｒｌ Ｐｒ：１９９７、およびＡｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｈｅｒｂｅｒｔ Ｓｃｈｏｔｔ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：１９９７を参照のこと。
【００４３】
「アフィニティクロマトグラフィー樹脂」または「アフィニティ樹脂」は、固体支持体または支持層と、その表面に結合したアフィニティリガンドを含むクロマトグラフィー樹脂を意味する。適切なアフィニティクロマトグラフィー樹脂の例示的な限定しない例として、ビーズ表面にアフィニティリガンドが結合した球状ビーズが挙げられる。ここで、ビーズは、セルロース、ポリ−スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、ポリメチルメタクリレート、または他の適切な材料で形成されている。本発明の実施において、クロスフロー濾過モジュールを通るポンプ輸送および再循環に耐える一方、構造完全性を維持することができる（例えば、孔を詰まらせる微粒子を生じる著しい破損を起こさない）堅いビーズが好ましい。アフィニティリガンドが結合した堅い無孔性セルロースビーズが特に好ましい。例示的な特に好ましい実施態様は、例えば、当該分野で周知の方法により、適切なアフィニティリガンド（例えば、プロテインＡ）に共有結合することができる「Ｏｒｂｉｃｅｌｌ（登録商標）」ビーズ（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｉｇｈｌａｎｄ Ｐａｒｋ，ＩＬ．から市販されている）を用いる。
【００４４】
「イオン交換クロマトグラフィー樹脂」または「イオン交換樹脂」は、正電荷または負電荷を有するリガンドが共有結合している、従って、イオン交換樹脂を接触させた溶液中のイオンと交換することができる遊離対イオンを有する固体支持体を意味する。
【００４５】
「陽イオン交換樹脂」は、負に荷電したリガンドが共有結合している、従って、樹脂を接触させた溶液中の陽イオンと交換するための遊離陽イオンを有するイオン交換樹脂を意味する。様々な陽イオン交換樹脂（例えば、共有結合した基がカルボン酸塩またはスルホン酸塩である陽イオン交換樹脂）が当該分野で周知である。市販されている陽イオン交換樹脂として、ＣＭＣ−セルロース、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）、およびＦａｓｔ Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）が挙げられる（後ろ２つはＰｈａｒｍａｃｉａから市販されている）。
【００４６】
「陰イオンイオン交換樹脂」は、正に荷電した基（例えば、第４級アミノ基）が共有結合しているイオン交換樹脂を意味する。市販されている陰イオン交換樹脂として、ＤＥＡＥセルロース、ＱＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）、およびＦａｓｔ Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）が挙げられる（後ろ２つはＰｈａｒｍａｃｉａから市販されている）。
【００４７】
本明細書中の「透析液」または「透析緩衝液」または「ダイアフィルトレート」は全て、汚染物質を標的物質−クロマトグラフィー樹脂複合体から除去するダイアフィルトレーション工程で用いられる液体を意味する。適切な透析液は、結合した標的物質を樹脂から著しく解離させることなく、汚染物質のクロマトグラフィー樹脂への非特異的結合を妨げるように作用することにより、汚染物質を樹脂から除去するのを助ける。透析液は、水と同じくらい単純であってもよく、多成分溶媒混合物（例えば、８０％ヘキサン、１５％アセトニトリル、および５％イソプロパノールを含有する溶媒混合物（ここで全てのパーセントは体積によるものであり、混合物の全体積に基づいている））と同じくらい複雑であってもよい。１を超える透析液を連続して使用してもよく、例えば、この連続透析液は、クロマトグラフィー樹脂と非特異的に会合する様々な種類の汚染物質を解離および除去するように設計された、様々な性質（例えば、ｐＨ値、伝導率、溶媒濃度などの）を有する。選択されたタンパク質（例えば、免疫グロブリン）の精製に有用な透析液の一例は、水性緩衝化０．４Ｍ ＮａＣｌ溶液である。
【００４８】
本明細書中で使用する「洗浄液」または「洗浄緩衝液」は、透析液または透析緩衝液と同義であり、すなわち、汚染物質を、標的物質が結合したクロマトグラフィー樹脂から洗い流すために用いられる液体である。
【００４９】
本明細書中の「溶出液」または「溶出緩衝液」は、汚染物質がクロマトグラフィー樹脂から取り除かれた後に、標的物質をクロマトグラフィー樹脂から解離するために用いられる液体を意味する。溶出液は、標的物質を不可逆的に変性することなく標的物質を解離するように働く。代表的な溶出液はクロマトグラフィー分野で周知であり、さらに高濃度の塩、遊離アフィニティリガンドもしくはアナログ、またはクロマトグラフィー樹脂からの標的物質の解離を促進する他の物質を有してもよい。「溶出条件」は、（変性していない）標的物質をクロマトグラフィー樹脂から解離させる、標的物質が結合したクロマトグラフィー樹脂に課せられる処理条件（例えば、標的物質が結合したクロマトグラフィー樹脂を溶出液または溶出緩衝液と接触させて、このような解離を生じる条件）を意味する。
【００５０】
本明細書中の「清澄化液」または「清澄化緩衝液」は、精製方法が完了した後に、クロマトグラフィー樹脂を洗浄するために用いられる液体を意味する。清澄化液は、界面活性剤、ウイルス不活性薬、または比較的高い濃度の塩を含有してもよく、精製方法中に用いられる液体より高いまたは低いｐＨを有してもよい。この目的は、クロマトグラフィー樹脂を再利用する準備ができるようにするために、クロマトグラフィー樹脂を完全に汚染除去することである。代表的な清澄化液は、クロマトグラフィー分野で周知である。
【００５１】
本明細書中の「貯蔵液」または「貯蔵緩衝液」は、クロマトグラフィー樹脂が使用していない間に懸濁される液体を意味する。貯蔵液はまた、緩衝化イオンに加えて、殺菌剤または他の防腐剤を含有してもよい。このような貯蔵液は、クロマトグラフィー分野で周知である。
【００５２】
精製方法
図１は、本発明の実施において標的物質を精製するために使用し得る一般スキームを示すものであり、以下に詳細に記載する。はじめに、供給液体は、必要であれば、（ａ）清澄化して、潜在的緩衝粒子を除去し、（ｂ）以後の精製工程に必要であれば濃縮または希釈する。供給液体が、粒子を十分に含まずおよび／または本来供給された形態で適切な能である場合、これらの工程（ａ）および（ｂ）のいずれか一方または両方を省略することができる。
【００５３】
次いで、供給液体を、（１）選択的または優先的に標的物質に結合するクロマトグラフィー樹脂に接触している第１の貯蔵槽に移す。供給液体を、（２）所望の高百分率の標的物質のクロマトグラフィー樹脂への結合を導くのに十分な接触時間でクロマトグラフィー樹脂とともにインキュベートし、得られる樹脂−標的複合体を形成させる。インキュベーションの間、樹脂と標的物質との間の接触を十分に確実にするように透過物が再循環して貯蔵槽に戻るクロスフロー濾過を含む適切な手段によって供給液体を攪拌する。
【００５４】
樹脂を、（３）クロスフロー濾過を介して再循環する。該クロスフロー濾過では、（ａ）樹脂を濃縮し；（ｂ）樹脂−標的複合体を妨害せずに樹脂から非特異的結合成分を解離するために選択された第１のダイアフィルトレーション液体に対して樹脂をダイアフィルトレーションし；（ｃ）特定の樹脂−標的複合体を解離させるために選択された第２のダイアフィルトレーション液体による処置によって目的の物質を樹脂から溶出させ；（ｄ）該標的物をダイアフィルトレーションにより樹脂から取り出す。標的物質を含有するダイアフィルトレーションを（４）第２の貯蔵槽に捕獲し；標的物質を有用な濃度に濃縮する。
【００５５】
以後の工程において使用される分離クロスフローフィルターモジュールのポアサイズよりも平均直径が大きい粒状混入物を供給液体から除去するために、随意的な第１の清澄化工程が実施される。必要とされる第１の清澄化工程は、クロマトグラフィー樹脂スラリー中の粒状物質の濃縮を回避し、さらに該工程は、精製方法の後半の工程中に粒状混入物が溶解して精製された標的物質に混入することを防止する。
【００５６】
精製分野において周知の方法、例えば、遠心分離、重力分離、沈殿、フロキュレーション式沈降、デカンテーション、通常の濾過、篩い分け、吸収、吸着およびタンジェント流濾過によって清澄化工程を達成することができる。あるいは、供給液体は、すでにこの工程が不必要であるほど十分に清浄であり得る。
【００５７】
図２は、クロスフロー濾過および以後の精製工程のための清澄化された供給液体の貯蔵槽への移送によって供給液体を清澄化するための系２０の流れ図の略図を示す。図２では、供給液体を、代表的には導管２２を介して、発酵槽またはバイオリアクター２１由来の上清もしくは懸濁液を、供給液体を適切な温度に保持するための熱ジャケット２４を具備する貯蔵槽２３へ搬送している。ポンプ２８を稼働させ、バルブ３０および３２を閉じた状態にし、さらなる濾過サイクルのために保持物を貯蔵槽２４に戻すために必要に応じてバルブ３１を開けて、導管２４、２５、および２６を介するクロスフロー濾過モジュール２７を介して、供給液体を貯蔵槽２３から循環させる。導管２９を介して仕上げ緩衝液を貯蔵槽２３に添加する。導管３３を介して透過物（清澄化された供給液体）を第２の貯蔵槽３４に搬送し、ここで、該透過物は以後の工程のために保持される。貯蔵槽３４はまた、清澄化された供給液体を適切な温度に保持するための熱ジャケット３５を具備する。使用後、系をパージして洗浄する場合、バルブ３０および３２を開けて、導管３６および３７は洗浄液を適切なドレインおよび／または回収手段に搬送する。
【００５８】
次いで、図２に記載の貯蔵槽３４において供給液体を適切なクロマトグラフィー樹脂に接触させる。すでに（随意的に清澄化された）供給液体を含有する貯蔵槽にクロマトグラフィー樹脂を添加することが可能であるか、あるいはクロマトグラフィー樹脂を貯蔵槽に投入してその後供給液体を添加するか、またはクロマトグラフィー樹脂と供給液体とを適切な方法、例えば、バッチ、半バッチもしくは連続方法で接触させてもよい。
【００５９】
この工程で使用するために適切なクロマトグラフィー樹脂は、ビーズであっても他の粒子の形態であってもよく、また標的物質に結合可能な最終的に分割される形態であってもよい。ビーズは分離フィルターのポアサイズより約１．５〜１０倍大きい直径を有するサイズであるのが好ましい。クロマトグラフィー樹脂は、アフィニティ、イオン交換およびイオン捕獲樹脂として一般に記載される樹脂の群のいずれかから選択することができ、そのようなタイプの広範な樹脂は市販されている。樹脂は、目的の物質を捕獲する化学基またはリガンド化学基を有し、標的物質を樹脂に結合させる。
【００６０】
特に有用なクロマトグラフィー樹脂は、約１．０〜１，０００ミクロンのサイズの範囲であり、非特異的結合に対しては低い親和性を有する、一様な球状、非多孔性、剛性、非凝集性粒子の形態で提供される。本発明の１つの特定の好ましい実施態様において、クロマトグラフィー樹脂は、１〜３ミクロンの直径を有するセルロースビーズを含み、該ビーズの表面にはプロテインＡリガンドが共有結合している。そのようなビーズは、組織培養物およびマウス腹水からモノクローナル抗体を精製するのに極めて有用である。そのようなタイプのビーズは、商品名「Ｏｒｂｉｃｅｌｌ（登録商標）」でＡｃｃｕｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ， Ｉｎｃ．（Ｈｉｇｈｌａｎｄ Ｐａｒｋ， Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）より市販されている。
【００６１】
図３は、そのようなＯｒｂｉｃｅｌｌ（登録商標）ビーズの表面および断面を示しており、該ビーズの表面積は大きいが内部に孔を有さないため、その結果、標準的な多孔性ビーズ３とは対照的に該ビーズは高い機械的強度を有する。Ｏｒｂｉｃｅｌｌ（登録商標）ビーズの強度および剛性が高いため、該ビーズはクロスフローフィルターを介する再循環に特に適している。何故なら、該ビーズは、フィルターのポアを詰まらせる可能性があるより小さな粒子に分解する傾向がなく、また該ビーズは、圧縮して不規則な流路を形成する傾向がないからである。そのようなＯｒｂｉｃｅｌｌ（登録商標）ビーズに対応する特徴を有する他のタイプのビーズは市販されており、本発明の実施において有用に使用される。
【００６２】
図４は、先行技術の生体分離において使用されるタイプの多孔性ビーズ５とは反対に、Ｏｒｂｉｃｅｌｌ（登録商標）ビーズを使用する場合に存在するより簡単な流路を概略的に示す。そのような先行技術の多孔性ビーズは、それらの弾性ならびにポンピングの延長および再循環条件下での破壊に対する耐性について本発明の実施において好適に使用される非多孔性ビーズよりもそれらの物性に有利な面が少ない。非多孔性ビーズのさらなる有益性は、混入物が孔に捕捉されて溶出工程中に溶出し、標的物質の純度を低下させるようなことがないことである。
【００６３】
次に、図５では、図２の上記の最初の処理後にクロマトグラフィー樹脂−供給源スラリーを貯蔵槽３４内で適切な接触時間だけ接触させる。インキュベーションの簡単な方法は、スラリーを含有する貯蔵槽３４を攪拌または振盪することを伴い得る。本発明の好ましい実施態様では、分離クロスフローフィルターモジュール４２を横切るポンプ３８の稼働下でライン３６を介して、および（バルブ４９に接続しているドレインライン４７を有する）ライン４０を介して、樹脂／液体スラリーを再循環させ、フィルター４２を清潔に保つのに十分な容量流速で、背圧バルブ４６を有するライン４４を介するフィルターモジュール４２から貯蔵槽３４へ液体を再循環させる。浸透物は、ライン５０から開口バルブ５８を通りライン５６を介して貯蔵槽３４へ戻され、貯蔵槽内の液体に適切な接触またはインキュベーション時間を提供する。
【００６４】
貯蔵槽３４内の好ましい接触（インキュベーション）時間は、使用する特定のクロマトグラフィー樹脂および結合部位が標的物質に結合する場合の該樹脂の濃度、ならびにビーズおよび標的物質の相対濃度に依存する。化学基の反応時間はリガンドにより変動するが、標的物質に対する利用可能な結合部位の濃度が高いほど、好適なインキュベーション時間は短くなる。標的物質より１．２〜１０倍高い濃度で、さまざまなアプリケーションにおいて過剰な樹脂を最適にすることができることが考慮される。該方法を最適化する場合にさらに考慮することは、液体に懸濁される樹脂の濃度である。（結合された樹脂および液体物質の全重量に基づく重量で）１〜６４％の範囲にある樹脂は、有利に利用することができ、約１０〜約５０％の樹脂濃度（同基準で）が最適と見なされている。
【００６５】
熱ジャケット３５（または他の熱輸送手段、例えば、貯蔵槽３４中の液体容積中の配置された加熱コイル、貯蔵槽の外部の再循環ヒーターであって、該熱輸送手段を介して液体が貯蔵槽から流動し、ヒーターユニット内で適切な温度に加熱され、そして貯蔵槽の液体容積に戻される上記熱輸送手段）によるインキュベーション工程中に温度が制御され、適切な温度を有する液体および樹脂混合物が提供されて、標的物質の活性が保存される。そのような目的に適切な温度は、当該分野の範囲内で、過度の実験を行うことなく容易に決定することができる。
【００６６】
クロマトグラフィー樹脂との接触のために供給液体を貯蔵槽に輸送すること（上記の工程（１））および供給液体をクロマトグラフィー樹脂とともにインキュベーションすること（上記の工程（２））は、樹脂を含まない等量の液体を取り出しながら供給液体をクロマトグラフィー樹脂に同時に添加することによって、同時に達成することができる。本発明の本実施態様における制御要素は、標的物質がクロマトグラフィー樹脂に本質的に完全に結合することを可能にするのに十分な程度に、貯蔵槽内の供給液体の残留時間が長いことである。この目的は、分離クロスフローフィルターモジュール４２を介して容易に達成される。浸出された供給液体容積に等しい透過流はバルブ６６を有するライン６４においてループから取り出される。過剰の透過物はバルブ５８を含有するライン５６で樹脂貯蔵槽に送られ戻される。
【００６７】
混入物および過剰の液体は、分離クロスフローフィルターモジュール４２によって分離され、すでに標的物質に結合しているクロマトグラフィー樹脂から透析分離される。樹脂スラリーは、分離のためにクロスフローフィルターモジュールを横切って再循環し、保持液体は貯蔵槽に戻される。透過物液体は、（１）ドレイン（バルブ５４を含有するライン５２による）；（２）以後の樹脂を含有する第２の貯蔵槽（示さず）（バルブ６６を含有するライン６４による）；（３）非依存的処理工程のうち１つ以上に方向付けられる。樹脂は、約０．１〜約６４体積％の範囲の濃度に濃縮することができる。本発明の１つの好ましい実施態様では、樹脂は約５０体積％に濃縮される。
【００６８】
クロマトグラフィー樹脂を洗浄するのに必要な洗浄緩衝液の容積は、懸濁液中の樹脂の濃度に依存する。例えば、樹脂スラリーが１００リットルの１％樹脂溶液である場合、樹脂を洗浄するのに必要な容積は１０倍の１，０００リットルである。樹脂スラリーが１０リットルの１０％樹脂溶液であれば、必要な容積は１００リットルである。
【００６９】
クロスフローフィルターモジュールにおける流速に対する樹脂濃度の影響のため、クロマトグラフィー樹脂を洗浄するのに必要な時間も懸濁液中の樹脂の濃度に依存する。例えば、樹脂スラリーが１０リットルの２５％樹脂溶液である場合、透過速度は１００ Ｌ／ｍ２−ｈであり得る。樹脂スラリーが５リットルの４０％樹脂溶液である場合、透過速度は僅か１０ Ｌ／ｍ２−ｈであり得る。従って、１．０ ｍ２クロスフローフィルターモジュールを使用して１０倍の洗浄緩衝液でクロマトグラフィー樹脂スラリーを洗浄するのに必要な時間は、２０％懸濁液では１時間であり、４０％懸濁液では５時間の洗浄時間が必要である。
【００７０】
樹脂の濃縮後に、適切な透析液を貯蔵槽３４に添加することによって、ダイアフィルトレーションが開始される。適切な透析液（または「ダイアフィルトレーション物」もしくは「透析緩衝液」）は、結合した標的物質の樹脂からの有意な解離を引き起こすことなくクロマトグラフィー樹脂に対する混入物の非特異的結合を妨害するように作用することによって、樹脂から混入物を除去するのに役立つ。透析液は簡単なものでは水があり、または複雑なものでは複数の溶媒の混合物、例えば、８０％ヘキサン、１５％アセトニトリルおよび５％イソプロパノール溶液などがあり得る。
【００７１】
このダイアフィルトレーション工程中の透析緩衝液の交換回数は、好ましくは３〜２５の範囲である。透析緩衝液の好ましい交換回数は、分離クロスフローフィルターモジュール４２および標的産物の所望される純度に関連して混入物の保持特性に基づく。最終的な微量の混入物を樹脂スラリーから除去するための透析緩衝液の交換（ダイアフィルトレーション）は、透過速度と同じ流速で仕上げ透析緩衝液をスラリー貯蔵槽に添加することによって達成される。この手順は、レベル制御、充填セル、または流量メーターを使用することによって、容易に自動化することができる。緩衝液の交換の程度は、樹脂スラリー貯蔵槽に添加された緩衝液の累積容積を樹脂スラリーの出発容積で除した割合として規定される容積置換によって測定される。添加した緩衝液を伴う本来の上清の交換または希釈の程度は、幾何学的な機能である。本発明の例示的実施態様のために、上清の希釈および容積置換の表を以下に示す。
【００７２】
【表１】
随意的分離クロスフローフィルターモジュール４２は、好ましくは、クロマトグラフィー樹脂ビーズの平均直径より１．５〜１０倍小さい膜ポアサイズを有する。分離クロスフローフィルターモジュールのチャンネル高は、望ましくは、クロマトグラフィー樹脂ビーズの平均直径より１．２〜１０倍大きく、フィルターモジュールの申し分のないクリアランスおよび効率的な流体力学的挙動を提供する。分離クロスフローフィルターモジュールの極めて好ましいデザインは、保持チャンネルに対して一様な分布を有する開口チャンネルモジュールである。本発明の１つの好ましい実施態様において、クロマトグラフィー樹脂ビーズは約１〜３ミクロンの平均直径を有し、クロスフローフィルターは約０．６ミクロンの平均ポアサイズを伴うフィルターエレメントを有し、保持チャンネルの高さは０．５ ｍｍである。この目的に適切なクロスフローフィルターモジュールは、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ ＳＲＴ， Ｉｎｃ． （Ｃａｒｙ， ＮＣ）より市販されている。
【００７４】
本発明の方法の１つの実施態様において、ダイアフィルトレーション工程由来の透過物は、（バルブ６６を伴うドレインライン６４を含有する）ライン５０、バルブ６２およびライン６０を通過して、出発物質からの物質の第２の分離を生じる第２の樹脂を含有するさらなる貯蔵槽６８に達する。
【００７５】
例えば、特定の抗原に対する免疫グロブリンは、それぞれが特定のウイルス抗原に連結される一連のアフィニティクロマトグラフィー樹脂を使用することによって、血漿から連続的に精製される。もう１つの例示的実施例では、それぞれ場標的化されたタンパク質に結合するリガンドに連結される一連の特異的クロマトグラフィー樹脂を使用することによって、乳清から連続的に乳タンパク質が分離される。これらのリガンドはイオン交換体、免疫グロブリン、天然タンパク質、または標的化されたタンパク質に選択的もしくは優先的に結合するアフィニティリガンドであり得、樹脂に連結され得る。さらなるもう１つの例示的実施例では、標的化されたタンパク質に対する抗体と連結される樹脂を使用することによって、血漿タンパク質が全血漿または血漿画分から連続的に精製される。
【００７６】
混入物を除去するためのダイアフィルトレーションの後、標的物質が溶出され、クロマトグラフィー樹脂から回収される。溶出のために使用される特異的化学基は、クロマトグラフィー樹脂−標的物質相互作用の性質および強度に依存する。溶出および回収手順は、上記のダイアフィルトレーション工程に類似する。クロマトグラフィー樹脂から標的物質を解離する適切な溶出液は、透過速度に等しい速度で、所望される収量が得られるまで樹脂スラリー貯蔵槽（例えば、ライン４８における貯蔵槽３４）に添加される。イオン濃度の上昇は、伝導率メーターを使用して容易に監視することができ、イオン濃度は時間とともに特定の速度で増加するため、クロマトグラフィー樹脂がイオン交換樹脂である場合、この手順は極めて有用である。クロマトグラフィー樹脂がアフィニティ樹脂である場合、はじめに濃縮された形態の溶出緩衝液を樹脂スラリー貯蔵槽に添加して、ダイアフィルトレーション緩衝液から溶出緩衝液への移行を増強することが有用である。
【００７７】
例えば、タンパク質Ａ樹脂からモノクローナル抗体を溶出させる場合、測定された容量の１．０ Ｍグリシン緩衝液を添加することによって、樹脂スラリーのｐＨは適切な値、例えば、ｐＨ ２．５のオーダーまで低下する。次いで、樹脂スラリーを１０容量の０．１ Ｍグリシン緩衝液に対してダイアフィルトレーションする。
【００７８】
溶出工程の改変は、異なるポアサイズのクロスフローフィルターモジュールを使用することを含む。例えば、クロマトグラフィー樹脂から血漿タンパク質を溶出させる場合、クロスフロー膜を、任意の混入ウイルスまたは早期のダイアフィルトレーション工程３（ａ）中に取り出されなかったタンパク質−ウイルス複合体を保持する膜に交換することが有用である。
【００７９】
そのような改変（図６を参照のこと）のための第１のクロスフローフィルターは８３であり、第２のフィルターは４２であり得る。樹脂スラリーは、最初に濃縮され、閉められたバルブ５７および開口されたバルブ８１を伴うライン４０を介するポンプ３８によるクロスフローフィルター８３を介してダイアフィルトレーションされる。フィルター８３から、開口バルブ９１および閉められたバルブ４６の直前のライン８９を介してダイアフィルトレーションされたスラリーが流動され、貯蔵槽３４に戻される。この工程の浸透物はドレインに流動することができるかまたはライン９３および開口バルブ９９を介して以後の精製に流動することができる。溶出工程のために、溶出した透過物がさらに目の細かいフィルター４２を介して流動し、開口バルブ６２およびライン６０を介して貯蔵槽６８に達することができるように、バルブ８１および９１は閉じられ、バルブ５７および４６は開口される。フィルターモジュール８３は、バルブ９９を含有するライン９３、およびバルブ８７を含有するライン８５に接続し、フィルターモジュールからの透過物の流動を適応させるか、または（濾過される液体からのフィルターエレメントの対向側面に対して同流もしくは逆流で）もう１つの質量移行液の通過を適応させ、質量移行勾配および保持流体の内外への粒状種の流動を最大にする。
【００８０】
ダイアフィルトレーションおよび溶出操作は、図６に示す第１の貯蔵槽３４において全てを実施することができ、次いで、標的物質を含有する得られる透過物は、最終処置（例えば、該貯蔵槽の緩衝化）または他の処置のために第２の貯蔵槽６８に通過され、クロスフローフィルター８２においてさらなる濾過が実施され、最終的に回収容器８０に回収される。そのような配列において、ライン９３における第１のクロスフローフィルターモジュール８３由来の透過物は、利用される緩衝液の量を最大にするためにナノフィルターなどのもう１つのクロスフローフィルターを介して循環され得る。
【００８１】
従って、多くの代替的装置の配列を構成、配列および操作し、さまざまな実施態様において本発明の分離方法を実施することできることが理解されよう。
【００８２】
本発明のもう１の例示的実施態様では、イオン交換樹脂から乳タンパク質が溶出され、イオン交換はより高価なアフィニティ樹脂の特異性を有さないという事実のため、サイズ分離を生じる異なるポアサイズの分離交差モジュールを使用することによって純度の高いタンパク質製品が回収される。
【００８３】
例示的に示される図６は、そのようの目的のために使用される異なるポアサイズの２つのクロスフローフィルターモジュールを使用する精製系を示す。図６の系では、図５に関連して系に対応番号を付し、同じ番号のエレメントは構成、配列および操作が対応する。しかし、図６に見られるように、系は、フィルターモジュール４２に並行流関係で多岐管集配されるもう１つのクロスフローフィルターモジュール８３を含み、フィルター４２から流動制御バルブ５７を含有するライン５５が分岐し、第２のフィルター８３モジュールからバルブ８１を含有するライン４０およびバルブ９１を含有するライン８９に結合する。
【００８４】
第２のフィルターモジュール由来の透過物が選択的に排液および／または示されるように貯蔵槽３４に再循環されるか、あるいは質量移行液が同流または逆流関係で通過することができ、液流がクロスフローフィルターモジュールの質量移行エレメントの対向側面に対して濾過されるように、第２のフィルターモジュールもまた、バルブ８７を含有するライン８５に接続され、順にバルブ９７および９９を含有するライン９５に連絡する。
【００８５】
図６に示される一般的な再配列および配置を有する系の特定の実施態様では、フィルターモジュール４２は、０．０４ミクロンの平均ポアサイズを有するフィルター（膜）エレメントを含有し得、フィルターモジュール８３は、０．６ミクロンの平均ポアサイズを有するフィルター（膜）エレメントを含有し得る。本発明の実施において使用されるフィルターモジュールにおけるフィルターエレメントのタイプおよび特徴は広範に変動することが認識され、またこのことは同様に当業者に理解され、そのような目的に適切な市販のフィルターエレメントを使用して容易に実施されるであろう。
【００８６】
溶出標的物質（例えば、タンパク質またはペプチド）は、望ましくは適切な条件（例えば、温度、ｐＨ、および塩濃度）下で貯蔵槽に捕獲されることに注意することは重要である。ｐＨを増減することおよび純粋生成物の不活性化および消失を回避するために温度を低下させることは必要であり得る。例えば、タンパク質Ａ樹脂から溶出した免疫グロブリンは、Ｔｒｉｓ緩衝液を含有する温度制御された貯蔵槽中に、ｐＨ８、４℃〜１０℃で回収するべきであり、これらはｐＨを上昇させて中性にし、そして免疫グロブリンの変性を回避するために溶出物を冷却する。
【００８７】
以下の使用のための装置を用意するために、標的物質が溶出され、捕獲貯蔵槽に移された後、溶出緩衝液を清浄緩衝液に切り換え、続いて、クロマトグラフィー樹脂が再使用のために準備されるように保存緩衝液に切り換えられる。この工程中は、浸透物がドレインに方向付けられる。
【００８８】
次いで、捕獲貯蔵槽に捕捉された溶出標的物質は、さらなるクロスフローフィルターモジュールまたは沈殿、凍結乾燥、エバポレーション、もしくは遠心分離などの溶出緩衝液を除去するための他の適切な工程によって濃縮され得る。好ましい実施態様では、クロスフローフィルターモジュールを使用する。フィルター媒体は、好ましくは標的物質の平均半径よりも小さく、標的物質が適切な程度で濃縮され得、混入イオンがダイアフィルトレーションによって除去されるように溶出緩衝液のイオンより大きなポアサイズを有する。
【００８９】
例えば、タンパク質Ａ樹脂から精製および溶出されたＩｇＧを濃縮し、３０，０００分子量膜を使用してダイアフィルトレーションし、溶出緩衝液の塩を排除することができる。そのような交差濾過モジュールは、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ ＳＲＴ， Ｉｎｃ． （Ｃａｒｙ， ＮＣ）より市販されている。
【００９０】
上記の方法は、標的生体物質の精製において広範な有用性を有する。供給液体は、血清；血漿および血漿画分；全血；乳；初乳；清乳；細菌、酵母、菌類、昆虫もしくは動物細胞または組織培養液および組織均質化物を含む広範な物質から選択することができる。標的物質は、濾過精製適応可能でかつクロマトグラフィー樹脂に選択的または優先的に結合し得る極めて広範な生体物質から選択することができ、これらには、タンパク質、糖タンパク質、ホルモン、抗原、抗体、凝固因子、免疫グロブリン、および酵素が含まれるが、これらに限定されない。クロマトグラフィー樹脂は、標的物質の特徴の基づいて選択され、よく理解されている広範な範囲のイオン交換およびアフィニティリガンドは当業者に利用可能であり、本明細書において開示および教示された内容に基づいて当該分野の範囲で容易時実施される。
【００９１】
例えば、本発明の方法は、血清、血漿および血漿画分、全血、乳、初乳、および清乳より選択される供給液体からＩｇＧを精製するのに有用である。凝固因子は血漿、全血、血清および組織培養物から精製することができる。
【００９２】
本発明の方法は、血漿および組織培養液体などの供給液体からＩｇＧを精製するのに費用および時間的効果を提供することが実証されている。
【００９３】
本発明の特定の態様は、上記において一般的に記載されるように供給液体を処理してそれから精製された標的物質を回収することに関するが、ここで、供給液体は、混入物として生物学的に有害な混入物、例えば、細菌種、ウイルス種、抗原種などを含み得る。本発明は、供給液体の処置、またはそのような混入物を不活化し、非有害にするための他の方法もしくは該方法における精製流を考慮する。例えば、混入物はウイルス種、例えば、ＨＩＶ、肝炎ウイルスなどを含み得、該混入物の不活化は、殺ウイルス処置を含み得る。
【００９４】
従って、本発明は、特定の態様において、少なくとも１つの標的物質を、生物活性汚染物質を含有する液体供給源から精製する方法であって、前記方法は、
前記液体供給源をクロマトグラフィー樹脂と接触させる工程と、
前記液体供給源に由来する少なくとも１つの標的物質を前記クロマトグラフィー樹脂に結合させるのに十分な接触時間で、前記液体供給源を前記クロマトグラフィー樹脂とインキュベートする工程と、
クロスフローフィルター（例えば、１つのクロスフローフィルターまたは１を超えるクロスフローフィルター）において前記クロマトグラフィー樹脂を再循環させる工程であって、ここで、
前記クロマトグラフィー樹脂を濃縮およびダイアフィルトレーションする工程と、
前記標的物質を前記クロマトグラフィー樹脂から溶出する工程と、
ダイアフィルトレーションにより前記標的物質を前記クロマトグラフィー樹脂から分離する工程が行われる工程と、
前記標的物質を回収する工程と、
任意に、前記標的物質を濃縮する工程を含み、
前記方法の間に前記生物活性汚染物質を不活性化することをさらに含む、方法に関する。
【００９５】
そのような不活化は、例えば、該方法の最初の工程として、もしくは供給液体とクロマトグラフィー樹脂とのインキュベーション中、（不活化剤を、濾過操作中の流れ含有する標的物質に添加することによる）クロスフロー濾過処理中、または他の任意の適切な方法で生体活性混入物を不活化剤に接触させることを含み得る。不活性化剤は、任意の適切な形態、例えば、１以上の標的物質に結合するために画分されているクロマトグラフィー樹脂ビーズ上の結合種、または不活化剤のみを結合して有しているビーズ上の結合種であって、ここで、不活化種−結合ビーズは、不活化種−結合ビーズおよび１以上の標的物質に結合するために画分されているビーズの両方を含む全体集団の集団成分を含む、結合種として誘導することができる。
【００９６】
ウイルス種に対する不活化剤は任意の適切な薬剤であり得る。本明細書において使用される用語「薬剤」は、広範に構成されることを意図し、任意の抗ウイルス分子、ウイルス種を非生物化または非感染化する複合体形成剤または捕獲剤、ウイルス転写阻害剤、殺ウイルス処理（暴露）条件などを含む。具体的な例としては、ヨード、塩素、溶媒−界面活性剤組成物、および紫外線または他の殺ウイルス放射線暴露が挙げられる。ウイルス捕獲剤の使用については、供給液体のウイルスを捕獲するためにウイルス受容体種を使用することができる。特定のウイルス捕獲剤の１つのクラスは、シアル酸またはノイラミン酸（ｎｏｎｕｌｏｓａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ）例えば、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコシルノイラミン酸、Ｎ，Ｏ７−ジアセチルノイラミン酸、Ｎ，Ｏ４−ジアセチルノイラミン酸、およびＮ，Ｏ，Ｏ−トリアセチルノイラミン酸などを含む。従って、クロマトグラフィー樹脂は、マイクロビーズ結合捕獲剤種を伴うマイクロビーズ、例えば、ビーズ上にシアル酸を有する画分されたマイクロビーズを含み得る。
【００９７】
さらなる特定の態様において、本発明は、標的物質を、前記標的物質と１または複数のウイルス種を含有する液体供給源から精製するための方法であって、該方法は、
前記液体供給源を、前記１または複数のウイルス種に対する１または複数のウイルス不活性薬と接触させることと、
平行流濾過において前記標的物質の少なくとも９０重量％を濃縮するのに有効な膜を備える平行流フィルターにおける平行流濾過により、液体供給源中の前記標的物質を濃縮することと、
前記液体供給源をクロマトグラフィー樹脂と接触させることと、
前記標的物質の所望の画分を結合するのに十分な接触時間で、前記液体供給源を前記クロマトグラフィー樹脂とインキュベートすることと、
クロスフローフィルターにおいて前記クロマトグラフィー樹脂を再循環させることであって、ここで、
前記クロマトグラフィー樹脂を濃縮し、前記樹脂を保持し、かつ前記樹脂に結合しない種を通過させるのに有効な膜を備えるフィルターにおけるダイアフィルトレーションにより、汚染物質を、前記クロマトグラフィー樹脂に結合した標的物質から分離する工程と、
前記樹脂を保持し、かつ前記標的物質を通過させるのに有効な溶出膜と接触させることにより、前記標的物質を前記クロマトグラフィー樹脂から溶出する工程と、
ダイアフィルトレーションにより、前記標的物質を前記クロマトグラフィー樹脂から分離する工程が行われることと、
前記標的物質を回収することと、
任意に、前記標的物質を、例えば、９０重量％の標的物質を含む濃縮物を回収するのに効率的な濃縮膜と接触させることによって、濃縮することを含む。
【００９８】
本発明の範囲内にあるもう１つの方法の改変体は、標的物質を、前記標的物質を含有する液体供給源から精製するための方法であって、該方法は、
前記液体供給源をクロマトグラフィー樹脂と接触させることと、
少なくとも１つのクロスフローフィルターにおいて前記クロマトグラフィー樹脂を再循環させることであって、ここで、
平行流濾過により、前記液体供給源中の前記標的物質およびクロマトグラフィー樹脂を濃縮する工程と、
前記樹脂を保持し、かつ前記樹脂に結合しない種を通過させるのに有効な膜を備えるフィルターにおいて前記クロマトグラフィー樹脂をダイアフィルトレーションする工程と、
前記樹脂を保持し、かつ前記標的物質を通過させるのに有効な溶出膜と接触させることにより、前記標的物質を前記クロマトグラフィー樹脂から溶出する工程と、
ダイアフィルトレーションにより、前記標的物質を前記クロマトグラフィー樹脂から分離する工程が行われることと、
前記標的物質を回収することと、
任意に、前記標的物質を濃縮することを含む。
【００９９】
上記の方法では、供給液体は、１以上の病原性生物を含有し得、該方法は、そのような場合において、さらに、供給液体とそのような１以上の病原性生物に対するウイルス不活化剤とを接触させる工程を含む。
【０１００】
もう１つの態様および用途において、本発明は、Ａ型および／またはＢ型血液抗体を含有する血液から普遍的血漿を製造する方法であって、Ａ型および／またはＢ型血液抗体を含有する血液を対応するＡ型および／またはＢ型抗原と接触させ、普遍的血漿として抗体涸渇血液産物を回収することを含む方法に関する。
【０１０１】
クロマトグラフィー樹脂は、Ｓｃｈｗａｒｔｚの米国特許第４，８２８，９８４号（１９８９年５月９日付「擬態細胞の組成、合成および使用」）またはＳｃｈｗａｒｔｚの米国特許第４，７７４，１８９号（１９８８年９月２７日付「染色された細胞を擬態する蛍光較正マイクロビーズ」）の実施例に記載のようなタイプのマイクロビーズを含み得る（これらの文献の開示内容は、それらの全体が本明細書において参考として援用される）。Ｓｃｈｗａｒｔｚの米国特許第４，７７４，１８９号は、抗原種によって画分されたマイクロビーズについて記載しており、ここで、抗原種は、その分子上の１級アミンによってビーズ上の表面のエポキシ基を介してマイクロビーズに結合する。
【０１０２】
上記の方法で抗体涸渇血液産物を普遍的血漿として回収することは、上記でより具体的に記載されているような本発明のさまざまな濃縮／溶出／タンジェント濾過技術を使用して実施することができる。
【０１０３】
本発明の特徴および利点については、以下の非制限的実施例を参考にして、より詳細に表される。
【０１０４】
実施例１．粗ヒト血漿からのＩｇＧの精製
図５において略図で示される装置を使用し、本発明の方法により、粗ヒト血漿からＩｇＧを精製した。
【０１０５】
図７は、そのような精製の有効性を評価するために実施したＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す。レーン７０１は、既知の分子量を有するいくつかのペプチドを含有する較正サンプルである。レーン７０２および７０３は、クロスフロークロマトグラフィーによる５倍希釈後のそれぞれ２０μＬおよび４０μＬのサンプルである。レーン７０４および７０５は、ダイアフィルトレーション後のクロマトグラフィー樹脂ビーズの上清のそれぞれ２０μＬおよび４０μＬのサンプルである。レーン７０６および７０７は、それぞれレーン７０２および７０４で使用した物質のβ−メルカプトエタノール消化の４０μＬのサンプルである。
【０１０６】
実施例２．組織培養液からのＩｇＧの精製
図５において略図で示される装置を使用し、組織培養液からＩｇＧを精製した。ＴＲＩＰＯＲＴフィルターモジュール（Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ ＳＲＴ， Ｉｎｃ．， Ｃａｒｙ， ＮＣ）を使用して、組織培養液（５０μｇ／ｍＬの濃度でＩｇＧを有する２０．０ Ｌの組織培養物）を濾過によって清澄化した。透過物を、Ｏｂｉｃｅｌｌ（登録商標）−タンパク質Ａビーズ（Ａｃｃｃｕｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ， Ｌｔｄ．， Ｈｉｇｈｌａｎｄ Ｐａｒｋ， ＩＬ）の懸濁液を含有する容器へ方向付けた。ＴＲＩＰＯＲＴフィルターモジュールを介する全体的な再循環を、１５分間、大気温度で行うことによって、培養液およびビーズの懸濁液をインキュベーとした。懸濁液を５倍濃縮し、次いで、０．４ Ｍ ＮａＣｌで１０倍ダイアフィルトレーションした。透過物ラインを、中和緩衝液を含有するクエンチング容器に移動させ、透析緩衝液を酸性溶出緩衝液に変更することによって、結合ＩｇＧの溶出を実施した。中和された濃縮物を濃縮し、次いで、１０倍にダイアフィルトレーションして、酸性中和中に形成した低分子の塩を除去した。最終収量は、１０ ｍｇ／ｍＬの濃度の約１００ ｍＬの精製されたＩｇＧであった。全処理時間は、７５分間であり、精製されたＩｇＧの収率は９０〜９４％であった。
【０１０７】
図８は、上記の精製の有個性を評価するために実施したＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。レーン８０１は、既知の分子量を有するいくつかのペプチドを含有する較正サンプルである。レーン８０２および８０３は、本実施例の方法の第１の試験由来の精製されたＩｇＧのそれぞれ２０μＬおよび４０μＬのサンプルである。レーン８０４および８０５は、本実施例の方法の第２の試験由来の精製されたＩｇＧのそれぞれ２０μＬおよび４０μＬのサンプルである。レーン８０６および８０７は、本精製方法において出発物質として使用される馴化培地のそれぞれ２０μＬおよび４０μＬのサンプルである。レーン８０８および８０９は、それぞれ第１および第２の試験由来の精製されたＩｇＧのβ−メルカプトエタノール消化の４０μＬのサンプルである。レーン８１０は、馴化培地出発物質のβ−メルカプトエタノール消化の４０μＬのサンプルである。
【０１０８】
本明細書では、さまざまな例示的特徴、態様および実施態様を参考にして本発明を説明してきたが、具体的に示されかつ記載されているこれらの内容以外にも、本発明では改変、変更および他の実施態様が受け入れられることが理解されよう。従って、本発明は、添付の請求項の範囲内においてそのようなすべての代替的改変、変更および他の実施態様を含むことが広範に解釈され、考慮される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 クロスフロー濾過に基づく装置を用いた、本発明の１つの実施態様による精製方法の大まかな計画を示す図である。
【図２】 後で精製工程にかけようとする液体供給源を清澄化するのに有用な装置の概略図である。
【図３】 標準的な先行技術の多孔性ビーズと比較した、クロマトグラフィー樹脂に用いられるＯｒｂｉｃｅｌｌ（登録商標）ビーズの微細形態を示す図である。
【図４】 標準的な先行技術の多孔性ビーズの周囲と、そのビーズを通過する流路と比較した、Ｏｒｂｉｃｅｌｌ（登録商標）ビーズ周囲の流路の概略図である。
【図５】 本発明の方法のクロスフロークロマトグラフィー精製、溶出、回収、および濃縮工程を実施するのに有用な装置の概略図である。本発明の１つの実施態様では、クロスフローフィルターモジュールが用いられる。
【図６】 本発明の方法のクロスフロークロマトグラフィー精製、溶出、回収、および濃縮工程を実施するのに有用な代替装置の概略図である。本発明の別の実施態様では、第１のクロスフローフィルターモジュールとは多孔度が異なる第２のクロスフローフィルターモジュールがさらに用いられる。
【図７】 本発明の方法により未処理ヒト血漿から精製されたＩｇＧ試料のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す図である。
【図８】 本発明の方法により細胞培地から精製されたＩｇＧ試料のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す図である。
Claims (16)
- 標的物質を液体供給源から精製する方法であって、前記方法は、
（ａ）第１のリザーバ中で前記液体供給源を無孔性タイプビーズを含むクロマトグラフィー樹脂と接触させることと、
（ｂ）前記樹脂が、標的物質の所望の画分を結合できるのに十分な接触時間で、前記液体供給源を前記クロマトグラフィー樹脂とインキュベートすることと、
（ｃ）少なくとも第１及び第２のクロスフローフィルターにおいて前記第１のリザーバからの前記クロマトグラフィー樹脂に結合した標的物質を再循環させることであって、前記第１及び第２のクロスフローフィルターモジュールは積み重なった配置の複数のフィルターシートを備え、前記フィルターシートは透過液シートと残留液シートと互い違いであり、前記残留液シートは、前記クロマトグラフィー樹脂の直径より１．２〜１０倍の高さを有する残留液チャンネルを含み、前記クロスフローフィルターの各々は異なる孔サイズのフィルターシートを有し、ここで、
ｉ）前記第１のクロスフローフィルターでの３〜２５回の複数回ダイアフィルトレーション工程により、前記クロマトグラフィー樹脂を濃縮し、汚染物質（contaminants）を前記クロマトグラフィー樹脂に結合した標的物質から分離する工程であって、前記クロマトグラフィー樹脂に結合した標的物質は、さらなるダイアフィルトレーション工程のために前記第１のリザーバへ再導入するために前記残留液チャンネル中に保持され、透過液は、前記汚染物質及び未結合の標的物質を含む、工程と、
ｉｉ）前記第１のクロスフローフィルターを介する複数回ダイアフィルトレーション工程によってクロマトグラフィー樹脂を濃縮した後、前記第１のリザーバに溶出液を添加することにより、前記標的物質を前記クロマトグラフィー樹脂から溶出する工程と、
ｉｉｉ）第２のクロスフローフィルターでのダイアフィルトレーションにより前記標的物質を前記クロマトグラフィー樹脂から分離する工程が行われることと、
（ｄ）前記標的物質を回収することと、
を含む、方法。 - 前記液体供給源を最初に清澄化することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
- 粒子状物質を除去するためにクロスフロー濾過により最初に清澄化を行う、請求項２に記載の方法。
- 妨害物質を除去するためにクロスフロー濾過により最初に清澄化を行う、請求項２に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー樹脂の濃縮およびダイアフィルトレーションにより生じた透過液を、溶出前に、さらなる精製工程にかけることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
- 前記溶出された標的物質を、さらなる精製のために第２のクロマトグラフィー樹脂と接触させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー樹脂は、プロテインＡ、プロテインＡアナログ、抗体、細菌抗原、ウイルス抗原、および色素からなる群から選択される１または複数のリガンド種を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記標的物質は免疫グロブリンである、請求項１に記載の方法。
- 前記液体供給源は、血清、血漿、血漿画分、全血、乳、初乳、乳清、細胞液、組織培養液、および組織ホモジネートからなる群から選択される１または複数の液体を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記液体供給源は、血漿、全血、血清、および組織培養物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
- 前記標的物質は、ワクチン、凝固因子、免疫グロブリン、抗原、抗体、タンパク質、糖タンパク質、ペプチド、酵素からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー樹脂は、アフィニティクロマトグラフィー樹脂およびイオン交換樹脂からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー樹脂は、アフィニティクロマトグラフィー樹脂を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記アフィニティクロマトグラフィー樹脂は、アフィニティリガンドに結合した堅い無孔性セルロースビーズを含む、請求項１３に記載の方法。
- 前記アフィニティリガンドは、プロテインＡおよびプロテインＡアナログからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
- 以下：ワクチンまたはワクチン成分を生成するための液体の分離、
細菌、酵母、菌類、昆虫細胞、または動物細胞の免疫グロブリン含有培養物からの免疫グロブリンの分離、
血清からの免疫グロブリンの分離、
血漿または血漿画分からの免疫グロブリンの分離、
全血からの免疫グロブリンの分離、
乳からの免疫グロブリンの分離、
初乳（clostrum）からの免疫グロブリンの分離、
乳清からの免疫グロブリンの分離、
腹水からの免疫グロブリンの分離、
全血からの凝固因子の分離、
血漿からの凝固因子の分離、
血清からの凝固因子の分離、
細菌、酵母、菌類、昆虫細胞、または動物細胞の凝固因子含有培養物からの凝固因子の分離、
乳からの凝固因子の分離、
乳清からの凝固因子の分離、
初乳（clostrum）からの凝固因子の分離、
腹水からの凝固因子の分離、
細菌、酵母、菌類、昆虫細胞、または動物細胞のタンパク質含有培養物からのタンパク質の分離、
細菌、酵母、菌類、昆虫細胞、または動物細胞の抗原含有培養物からの抗原の分離、
抗原含有ウイルス培養物からの抗原の分離、
細菌、酵母、菌類、昆虫細胞、または動物細胞のホルモン含有培養物からのホルモンの分離、
血清からのホルモンの分離、
血漿または血漿画分からのホルモンの分離、
全血からのホルモンの分離、
血漿からのホルモンの分離、
血清からのホルモンの分離、
乳からのホルモンの分離、
乳清からのホルモンの分離、
初乳（clostrum）からのホルモンの分離、
腹水からのホルモンの分離、
組織からのホルモンの分離、
ウイルス培養物からの糖タンパク質の分離、
細菌、酵母、菌類、昆虫細胞、または動物細胞の糖タンパク質含有培養物からの糖タンパク質の分離、
血清からの糖タンパク質の分離、
血漿または血漿画分からのからの糖タンパク質の分離、
全血からの糖タンパク質の分離、血漿からの糖タンパク質の分離、
血清からの糖タンパク質の分離、
乳からの糖タンパク質の分離、乳清からの糖タンパク質の分離、
初乳（clostrum）からの糖タンパク質の分離、
腹水からの糖タンパク質の分離、および
組織からの糖タンパク質の分離、
からなる群から選択される分離を行うために実施される、請求項１に記載の方法。
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