JP4870263B2 - 生体物質の精製 - Google Patents
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Description
発明の背景
発明の分野
本発明は、一般的に、1または複数の標的生体物質(例えば、選択されたタンパク質、抗体、抗原、凝固因子、糖タンパク質、およびホルモン)を、標的物質とは異なる分子量または他の物理的特性もしくは化学的特性を有する汚染物質を有する液体供給源から精製するための方法および装置に関する。ここで、精製は、クロスフロー濾過システムにおける連続したクロマトグラフィーおよびダイアフィルトレーション分離工程により行われる。
【0002】
関連技術の説明
液体試料から物質を分離するために様々な精製方法が用いられてきた。沈殿、遠心分離、濾過、クロマトグラフィー、および蒸発の全てが、収率、時間消費、純度、および費用に関して様々な成功をおさめて用いられてきた。
【0003】
生物学的精製の分野では、遠心分離、クロマトグラフィー、および濾過が、10〜90パーセントの収率および95パーセントと高い純度で、液体試料から非常に価値のある物質を得るために特に有用であった。
【0004】
遠心分離、クロマトグラフィー、および濾過の現在の使用では、収率と純度は逆の関係にあり、精製工程を1つ進むごとに、収率は著しく小さくなることが一般に理解されている。これらの遠心分離、クロマトグラフィー、および濾過の方法は高価であり、比較的遅く、清浄して再利用するのが非常に難しい装置を用いることもまたよく理解されている。
【0005】
これに関する特定の問題の1つは、クロマトグラフィー樹脂の中を通じて不規則な流路が形成される傾向がある固定層クロマトグラフィーカラムの清浄である。カラムを完全に清浄しないと後のバッチを汚染する可能性があるので、これらの不規則な流路は、生体物質の精製において特定の問題を引き起こす。
【0006】
一例は、イオン交換およびアフィニティクロマトグラフィーカラムによる血漿タンパク質の精製である。ウイルスを含まないと試験された1バッチの血漿が、後で、ウイルスに汚染されていると分かった場合、カラムからウイルスが確実に除去されていると判断することは、ほとんど不可能である。さらに、生物学的液体が細菌増殖を容易に助けるので、クロマトグラフィーカラムにおける単純な細菌汚染および生物増殖は、決して希なことではない。細菌生物および細菌により産生されるエンドトキシンは医薬品の無数のバッチを汚染し、かなりの財政上の損失と最終製品のレシピエントにおける有害反応をもたらしてきた。
【0007】
この頻繁に観察され、清浄方法の確認に多数の問題を生じさせる「ネズミトンネル(rat tunnel)」はまた、クロマトグラフィーカラムの容積および分解能のかなりの部分を駄目にする。
【0008】
固定層クロマトグラフィーカラムの別の問題は、特に、アガロース(例えば、Pharmaciaから市販されているSepharose(登録商標)ゲル)などの軟らかいゲルの場合での樹脂の圧縮である。このトンネル化と圧縮の共同する問題のために、多量の過剰な結合能を必要とすることでクロマトグラフィー費用はかなり高くなる。圧縮とトンネル化により引き起こされる別の問題は、純度の減少である。高い純度には、標的物質の均一な溶出が必要とされる。トンネル化と圧縮により、溶出液の均一な分布が妨げられ、標的産物に似た溶出プロフィールを有する汚染物質ならびに圧縮媒体にトラップされランダムに溶出される汚染物質から、標的物質は正確に分離されない。
【0009】
モノクローナル抗体精製の場合、10倍過剰な結合能でカラムに詰めることが一般的である。かなり流通されたシステムでは、3倍過剰な結合能でしか全標的産物を結合せず、それにより、クロマトグラフィー媒体の費用を1/3に減らすことが可能である。
【0010】
トンネル化および圧縮を減少させる1つの一般的なアプローチは、流速を低減することによりカラムの運転圧を小さくすることである。流速の低減は樹脂圧縮を減少させるが、処理時間をかなり増加させ、多くの場合、方法の分解と収率に悪影響を及ぼす。
【0011】
平行流濾過(tangential flow filtration)は、膜表面と平行に液体を押し出すことにより液体中の物質を分離するために様々な孔径の膜を利用する。この方法は、水および/または緩衝液に懸濁された物質の濃縮に有効であることが分かっているが、溶液中の化合物の精製に広く有用であることは分かっていなかった。この方法の第1の問題は、似た大きさの2つの粒子を分離できるほど孔径が十分に均一でないことである。さらに、液体混合物中の物質(特に、タンパク質および脂質)は膜表面に結合し(「ゲル層分極(gel layer polarization)」と呼ばれる現象である)、有効孔径ならびに膜の界面化学を変化させる。
【0012】
流動層クロマトグラフィーは、液体混合物から物質を分離する別の手段である。流動層クロマトグラフィーは、化学産業および石油産業においてより一般的に利用されている。流動層カラムは、一般的に、10フィート以上の高さであり、直径が9〜12インチである。医薬品用およびバイオプロセス用カラムは、通常、3フィート未満の高さであり、樹脂の圧縮特性に応じて1〜24インチの一般範囲で広範囲な直径を有する。流動層の利点は、固定層クロマトグラフィーと比較して低圧での流速が速いことである。速い流速は、クロマトグラフィーによる分離にある特定の利点をもたらすが、この方法には、いくつかの欠点がある。この方法には、重力に対して中立の、または浮力を示す、より大きな直径の樹脂が必要である。これらの大きな100〜300ミクロン平均直径の樹脂は、固定層カラムで用いられる小さな1〜100ミクロン樹脂より単位体積あたりの表面積が小さく、それに応じて、表面結合能が小さい。
【0013】
表面積の損失を最小限にし、密度を減少させるために、流動層樹脂は、非常に小孔のある物質である。しかしながら、その多孔性の結果として、これらの樹脂粒子は非常に亀裂しやすく、それにより、カラムの入口および出口をブロックする小さな微粒子を生じる。
【0014】
流動層の最も重大な問題は混合である。カラムはいずれの固定混合手段も含まないので、この層は、エアジェットにより、またはカラムを通して分離しようとする液体を高流速で再利用することにより従来どおり混合される。高流速と制限された混合により、産物を樹脂から溶出する間に必要とされる均一な相変化が阻害される。
【0015】
前記の当該分野での不備の結果として、複合液体供給源から生物学的標的物質を精製するための迅速で均一な時間効率および費用効率の高いシステムが、どうしても必要とされる。望ましいことに、このようなシステムは、前記の様々な先行技術の分離技術に固有の問題を克服している。望ましいことに、このようなシステムは容易に拡大縮小可能であり、研究室におけるミリリットルから、生物薬剤生産においてよく遭遇する数千リットルまでの供給材料の体積を処理するのに適応可能である。最後に、望ましいことに、このようなシステムは、様々な性質の複数の液体供給源(粘性の複合溶液を含む)と共に用いることができる。
【0016】
発明の概要
本発明は、有利な収率、産物純度、時間効率および費用効率で精製するために、1または複数のクロスフローフィルター要素と1または複数の種類のクロマトグラフィー樹脂を組み合わせて用いる精製方法に関する。
【0017】
本発明の実施で用いられる1または複数のクロスフローフィルターモジュールは、例えば、中空繊維フィルター、スパイラルフィルター、プレートフィルターおよびフレームフィルター、カセットフィルター、攪拌セル(stir cell)、管状フィルター、セラミックフィルターなどのクロスフローフィルターを含む任意の適切な型でよい。
【0018】
本発明の方法は、1または複数の標的生体物質(例えば、選択されたタンパク質、抗体、抗原、凝固因子、糖タンパク質、およびホルモン)を、標的物質とは異なる分子量あるいは他の物理的特性または化学的特性を有する汚染物質を有する液体供給源から精製することを含む。ここで、連続したクロマトグラフィーおよびダイアフィルトレーション分離工程がクロスフロー濾過システムにおいて達成される。
【0019】
本発明の精製方法を用いると、タンパク質、抗体、成長ホルモン、および他の生物学的に重要な物質が、複合液体供給源(例えば、血漿、血漿画分、乳、初乳、チーズ乳清、細胞培養液および組織培養液、ならびに組織ホモジネートおよび細胞ホモジネート)から高収率かつ迅速に単離される。
【0020】
さらに、本発明の方法を従来の精製方法に適用して、従来の分離の収率を増大させ、このような精製に用いられるアフィニティ媒体および/または濾過媒体ならびに装置表面の再利用および汚染除去を可能にするように、従来の方法を適切にきれいにすることができる。
【0021】
さらに詳細に述べると、本発明は、1つの態様では、標的物質を液体供給源から精製する方法に関する。このような方法は、1つの実施態様では、
1)液体供給源をクロマトグラフィー樹脂と接触させる工程と、
2)樹脂が、標的物質の所望の画分を結合できるのに十分な接触時間で、液体供給源をクロマトグラフィー樹脂とインキュベートする工程と、
3)クロスフローフィルターシステムにおいてクロマトグラフィー樹脂を再循環させる工程であって、ここで、
a)クロマトグラフィー樹脂を濃縮し、ダイアフィルトレーションにより、汚染物質を、クロマトグラフィー樹脂に結合した標的物質から分離する工程と、
b)標的物質を前記クロマトグラフィー樹脂から溶出する工程と、
c)ダイアフィルトレーションにより、標的物質をクロマトグラフィー樹脂から分離する工程が行われる工程と、
4)標的物質を回収する工程と、
5)任意に、標的物質を濃縮する工程を含む。
【0022】
前記精製方法は、(a)存在し、かつ後の工程において孔またはオリフィスを詰まらせる可能性のある、どんな望ましくない微粒子も除去するために液体供給源を清澄化する工程と、(b)液体供給源をクロマトグラフィー樹脂と接触させる工程が最も効率的に進行できるように、液体供給源を濃縮または希釈する工程を、任意に、最初にさらに含んでもよい。これらの工程は、選択された量の液体を前記システムに添加することにより、後のインキュベーション工程での使用に望ましい濃度の清澄化された液体供給源を得る、クロスフロー濾過により行われることが好ましい。
【0023】
本発明の精製方法は、さらなる標的物質の単離につながる追加工程をさらに含んでもよい。これらの追加工程では、クロマトグラフィー樹脂の濃縮およびダイアフィルトレーションにより生じた透過液を、溶出前に、第2のクロマトグラフィー樹脂または一連のクロマトグラフィー樹脂に通過させ、工程(1)〜(4)を繰り返してもよい。あるいは、またはさらに、標的物質の収率を増大させるために、本発明の精製方法では、前記工程3(a)からのダイアフィルトレートに対して工程(1)〜(4)をさらに繰り返してもよい。
【0024】
前記精製方法は、1または複数のクロマトグラフィー分離工程において、アフィニティリガンドが結合した堅い球状セルロースビーズを含むクロマトグラフィー樹脂を都合よく使用してもよい。
【0025】
本発明の方法は、別の態様では、免疫グロブリンを液体供給源から精製する方法を含む。前記方法は、
液体供給源をクロマトグラフィー樹脂と接触させる工程であって、前記クロマトグラフィー樹脂は、堅い無孔性球状ビーズに結合したプロテインAを含む工程と、
樹脂が、免疫グロブリンの所望の画分を結合できるのに十分な接触時間で、液体供給源をクロマトグラフィー樹脂とインキュベートする工程と、
クロスフローフィルターシステムにおいてクロマトグラフィー樹脂を再循環させる工程であって、ここで、
クロマトグラフィー樹脂を濃縮し、ダイアフィルトレーションにより、汚染物質を、クロマトグラフィー樹脂に結合した免疫グロブリンから分離する工程と、
免疫グロブリンをクロマトグラフィー樹脂から溶出する工程と、
ダイアフィルトレーションにより、免疫グロブリンをクロマトグラフィー樹脂から回収する工程が行われる工程と、
任意に、免疫グロブリンを濃縮する工程を含む。
【0026】
さらなる態様では、本発明は、標的物質を液体供給源から分離および濃縮するための精製装置を含む。このような装置は、
固相クロマトグラフィー樹脂材料を保持し、選択的に、液体を第1のリザーバに流入出させるために構築および整列された第1のリザーバと、
第1のリザーバに配置された固相クロマトグラフィー樹脂材料と、
液体を透過液と残留液(retentate)の流れに分離するための第1のクロスフロー濾過モジュールであって、液体を第1のクロスフロー濾過モジュールに流入させ、透過液と残留液の流れを第1のクロスフロー濾過モジュールから流出させるための手段が設けられた第1のクロスフロー濾過モジュールと、
透過液の流れを捕捉および保持し、選択的に、液体を第2のリザーバに流入出させるために構築および整列された第2のリザーバと、
液体の流れを濃縮するための第2のクロスフロー濾過モジュールであって、液体を第2のクロスフロー濾過モジュールに流入させ、透過液と残留液の流れを第2のクロスフロー濾過モジュールから流出させるための手段が設けられた第2のクロスフロー濾過モジュールと、
濃縮された液体の流れを第2のクロスフロー濾過モジュールから捕捉するために構築および適合された収集容器と、
補給液を第1のリザーバおよび第2のリザーバに供給し、
液体供給源を、クロマトグラフィー樹脂が充填された第1のリザーバに選択的に流入させて、スラリーを形成し、
第1のリザーバからのスラリーを第1のクロスフロー濾過モジュールに再循環させ、透過液と残留液の流れを第1のリザーバに戻すことにより、液体供給源をクロマトグラフィー樹脂とインキュベートし、
スラリーを濃縮し、ダイアフィルトレーションにより汚染物質をスラリーから分離し、標的物質をクロマトグラフィー樹脂から溶出し、ダイアフィルトレーションにより標的物質をクロマトグラフィー樹脂から分離するために適合された流路(flow pathway)中で、クロスフローフィルターにおいてスラリーを再循環させ、
標的物質を第2のリザーバにおいて捕捉し、
標的物質を第2のリザーバから第2のクロスフロー濾過モジュールに流すことにより、標的物質を濃縮し、
濃縮された標的物質を、第2のクロスフロー濾過モジュールの流路から収集容器に回収するために構築および整列されたコンジット、バルブ、およびポンプ手段とを備える。
【0027】
前記装置の好ましい実施態様では、第1および第2のリザーバに、適切な処理温度を維持するためのサーマルジャケットが設けられる。
【0028】
別の態様では、本発明は、標的物質を有する液体を精製する方法に関する。前記方法は、液体を、標的物質を結合するクロマトグラフィー樹脂と接触させる工程と、溶出条件下で、標的物質を結合したクロマトグラフィー樹脂をクロスフロー濾過して、標的物質を含む濾液を回収する工程とを含む。
【0029】
このような方法を、以下:
ワクチンまたはワクチン成分を生成するための液体の分離、
血漿または血漿画分のその構成部分への分離、
初乳(clostrum)のその構成部分への分離、
乳のその構成部分への分離、
乳清のその構成部分への分離、
発酵液のその構成部分への分離、
昆虫細胞培養液のその構成部分への分離、
ウイルス培養液のその構成部分への分離、
細菌、酵母、菌類、昆虫細胞、または動物細胞の免疫グロブリン含有培養物からの免疫グロブリンの分離、
血清からの免疫グロブリンの分離、
血漿または血漿画分からの免疫グロブリンの分離、
全血からの免疫グロブリンの分離、
乳からの免疫グロブリンの分離、
初乳(clostrum)からの免疫グロブリンの分離、
乳清からの免疫グロブリンの分離、
腹水からの免疫グロブリンの分離、
全血からの凝固因子の分離、
血漿からの凝固因子の分離、
血清からの凝固因子の分離、
細菌、酵母、菌類、昆虫細胞、または動物細胞の凝固因子含有培養物からの凝固因子の分離、
乳からの凝固因子の分離、
乳清からの凝固因子の分離、
初乳(clostrum)からの凝固因子の分離、
腹水からの凝固因子の分離、
細菌、酵母、菌類、昆虫細胞、または動物細胞のタンパク質含有培養物からのタンパク質の分離、
細菌、酵母、菌類、昆虫細胞、または動物細胞の抗原含有培養物からの抗原の分離、
抗原含有ウイルス培養物からの抗原の分離、
細菌、酵母、菌類、昆虫細胞、または動物細胞のホルモン含有培養物からのホルモンの分離、
血清からのホルモンの分離、
血漿または血漿画分からのホルモンの分離、
全血からのホルモンの分離、
血漿からのホルモンの分離、
血清からのホルモンの分離、
乳からのホルモンの分離、
乳清からのホルモンの分離、
初乳(clostrum)からのホルモンの分離、
腹水からのホルモンの分離、
組織からのホルモンの分離、
ウイルス培養物からの糖タンパク質の分離、
細菌、酵母、菌類、昆虫細胞、または動物細胞の糖タンパク質含有培養物からの糖タンパク質の分離、
血清からの糖タンパク質の分離、
血漿または血漿画分からの糖タンパク質の分離、
全血からの糖タンパク質の分離、
血漿からの糖タンパク質の分離、
血清からの糖タンパク質の分離、
乳からの糖タンパク質の分離、
乳清からの糖タンパク質の分離、
初乳(clostrum)からの糖タンパク質の分離、
腹水からの糖タンパク質の分離、および
組織からの糖タンパク質の分離、
からなる群から選択される分離を行うために実施することができる。
【0030】
本発明のさらなる態様は、バイオリアクタ、クロマトグラフィー樹脂リザーバ、第1のクロスフロー濾過モジュール、第2のクロスフロー濾過モジュール、および第3のクロスフロー濾過モジュールを備える分離システムにおいて液体を分離する方法に関する。このような方法は、第1のクロスフロー濾過モジュールにおいてバイオリアクタの灌流液を清澄化して透過液を得ることと、透過液をクロマトグラフィー樹脂リザーバに流すことと、クロマトグラフィー樹脂および透過液を、濃縮、ダイアフィルトレーション、および溶出用の第2のクロスフロー濾過モジュールに流して溶出物を得ること、前記溶出物を、濃縮およびダイアフィルトレーション用の第3のクロスフロー濾過モジュールに流すことを含む。
【0031】
本発明は、別の態様では、少なくとも1つの標的物質を、生物活性汚染物質を含有する液体供給源から精製する方法に関する。前記方法は、
液体供給源をクロマトグラフィー樹脂と接触させる工程と、
液体供給源に由来する少なくとも1つの標的物質をクロマトグラフィー樹脂に結合させるのに十分な接触時間で、液体供給源をクロマトグラフィー樹脂とインキュベートする工程と、
クロスフローフィルターにおいてクロマトグラフィー樹脂を再循環させる工程であって、ここで、
ダイアフィルトレーションによりクロマトグラフィー樹脂を濃縮する工程と、
標的物質をクロマトグラフィー樹脂から溶出する工程と、
ダイアフィルトレーションにより標的物質をクロマトグラフィー樹脂から分離する工程が行われる工程と、
標的物質を回収する工程と、
任意に、標的物質を濃縮する工程を含み、
前記方法の間に生物活性汚染物質を不活性化することをさらに含む。
【0032】
本発明の別の態様は、標的物質を、このような標的物質を含有する液体供給源から精製するための方法に関する。前記方法は、
液体供給源をクロマトグラフィー樹脂と接触させることと、
少なくとも1つのクロスフローフィルターにおいてクロマトグラフィー樹脂を再循環させることとであって、ここで、
平行流濾過により、標的物質およびクロマトグラフィー樹脂を液体供給源中で濃縮する工程と、
樹脂を保持し、かつ樹脂に結合しない種を通過させるのに有効な膜を備えるフィルターにおいて、クロマトグラフィー樹脂をダイアフィルトレーションする工程と、
樹脂を保持し、かつ標的物質を通過させるのに有効な溶出膜と接触させることにより、標的物質をクロマトグラフィー樹脂から溶出する工程が行われることと、
標的物質を回収するダイアフィルトレーションにより、標的物質をクロマトグラフィー樹脂から分離することと、
任意に、標的物質を濃縮することを含む。
【0033】
別の態様では、本発明は、標的物質を、標的物質と1または複数のウイルス種を含有する液体供給源から精製するための方法に関する。このような方法は、
液体供給源を、1または複数のウイルス種に対する1または複数のウイルス不活性薬と接触させることと、
濾過において標的物質の少なくとも90重量%を濃縮するのに有効な膜を備える平行流フィルターにおいて平行流濾過により、液体供給源中の標的物質を濃縮することと、
液体供給源をクロマトグラフィー樹脂と接触させることと、
標的物質の所望の画分を結合するのに十分な接触時間で、液体供給源をクロマトグラフィー樹脂とインキュベートすることと、
クロスフローフィルターにおいてクロマトグラフィー樹脂を再循環させることとであって、ここで、
クロマトグラフィー樹脂を濃縮し、樹脂を保持し、かつ樹脂に結合しない種を通過させるのに有効な膜を備えるフィルターにおけるダイアフィルトレーションにより、汚染物質を、クロマトグラフィー樹脂に結合した標的物質から分離する工程と、
樹脂を保持し、かつ標的物質を通過させるのに有効な溶出膜と接触させることにより、標的物質をクロマトグラフィー樹脂から溶出する工程と、
ダイアフィルトレーションにより、標的物質をクロマトグラフィー樹脂から分離する工程が行われることと、
標的物質を回収することと、
任意に、例えば、標的物質の少なくとも90重量%を含む濃縮物を得るのに濃縮膜と接触させることにより、標的物質を濃縮することを含む。
【0034】
別の態様では、本発明は、ユニバーサル血漿(universal plasma)を、血清学的A群抗体および/またはB群抗体を含有する血液から製造する方法に関する。前記方法は、血清学的A群抗体および/またはB群抗体を含有する血液を、対応するA群抗原および/またはB群抗原を含むクロマトグラフィー樹脂と接触させることと、抗体が消耗された血液産物をユニバーサル血漿として回収することを含む。
【0035】
本発明の非常に多くの他の態様、特徴、および例示的な実施態様は、以下の開示および添付の特許請求の範囲から、さらに完全に明らかになるだろう。
【0036】
発明の詳細な説明およびその好ましい実施態様
定義、材料、および設備
本発明の説明では、以下で定義するような、いくつかの用語を使用する。
【0037】
本明細書中で用いる「液体供給源」は、存在する他の物質から精製しようとする、少なくとも1つの、ことによると2つ以上の、価値のある生体物質または産物を含有する液体を意味する。本発明の実施において、液体供給源は、例えば、水溶液、有機溶媒系、または水溶液/有機溶媒の混合物もしくは溶液でもよい。液体供給源は、多数の生物学的分子(例えば、タンパク質、抗体、ホルモン、およびウイルス)ならびに小分子(例えば、塩、糖、脂質など))を含有する複合混合物または溶液であることが多い。生物起源の代表的な液体供給源は、水溶液または水性懸濁液として始めてもよいが、初期の分離工程(例えば、溶媒沈殿、抽出など)で用いられる有機溶媒を含んでもよい。本発明の精製方法に適した価値のある生体物質を含有する可能性のある液体供給源の例として、バイオリアクタからの培養上清、ホモジナイズされた細胞懸濁液、血漿、血漿画分、乳、初乳、およびチーズ乳清が挙げられるが、これらに限定されない。
【0038】
本明細書中の用語「標的物質」は、液体供給源から精製しようとする1または複数の所望の産物を意味する。標的物質は、一般的に、価値のある生物学的産物(例えば、免疫グロブリン、凝固因子、ワクチン、抗原、抗体、選択されたタンパク質または糖タンパク質、ペプチド、酵素など)である。標的物質は、懸濁物質として、または溶解状態で液体供給源に存在してもよい。便宜のために、本明細書中では用語「標的物質」を単数形で用いるが、副産物として共に、または別個の回収成分として別々に(例えば、連続的に)精製しようとする1を超える物質を意味してもよいことが理解されるべきである。
【0039】
「汚染物質」は、標的物質とは異なり、望ましくは、1または複数の最終標的物質産物から除去される、液体供給源中の材料を意味する。代表的な汚染物質として、核酸、タンパク質、ペプチド、エンドトキシン、ウイルスなどが挙げられる。本発明の方法の実施により除去することができる汚染物質は、所望の産物とは異なる1または複数の性質(例えば、分子量、電荷、様々なリガンドに対する特異的親和性など)を有する。多くの汚染物質は生物活性があり、その除去は、精製産物をその最終用途に使用できるために絶対必要である。さらに、後の使用で、汚染物質が標的産物に及ぼすことがある有害な影響のために、ある特定の汚染物質を、極めて低いレベルまで、好ましくは検出不可能なレベルまで精製装置から除去しなければならない。本発明の方法は、以下でさらに詳細に説明するように、非常に効率的な汚染除去を可能にする。
【0040】
本明細書中の「クロスフローフィルター」は、多孔性フィルター要素を備える、ある種類のフィルターモジュールまたはフィルターカセットを意味する。液体培地の選択された1または複数の成分をフィルター要素に透過させるために、フィルター要素の表面を横断して、濾過しようとする液体培地を平行流で流す。クロスフローフィルターでは、液体培地の流れによりフィルター要素(分離膜表面)に及ぼされる剪断力が、フィルター要素表面上の固体蓄積に抵抗するのに役立つ。クロスフローフィルターとして、精密濾過、限外濾過、ナノ濾過、および逆浸透フィルターシステムが挙げられる。クロスフローフィルターは、適切な積み重なった配置の多数のフィルターシート(濾過膜)を備えてもよい。ここで、例えば、フィルターシートは透過液シートと残留液シートと互い違いになり、濾過しようとする液体がフィルターシートを横断して流れる場合、不透過種(例えば、フィルターシートの孔径より大きな直径の固体または高分子量種)は保持され、残留液の流れに入り、液体と透過種はフィルターシートを通過して拡散し、透過液の流れに入る。本発明の実施では、クロスフロー濾過は好ましい分離方法である。このような濾過に有用なクロスフローフィルターモジュールおよびクロスフローフィルターカセットは、North Carolina SRT,Inc.(Cary,North.Carolina.)から市販されている。このような種類の適切なクロスフローフィルターモジュールおよびクロスフローフィルターカセットは、本発明の発明者らの以下の米国特許:1989年9月19日に発行された米国特許第4,867,876号,「フィルタープレート、フィルタープレート要素、およびそれを備えるフィルター(Filter Plate,Filter Plate Element,and Filter Comprising Same)」;1989年11月21日に発行された米国特許第4,882,050号,同名称;1990年9月11日に発行された米国特許第5,034,124号,同名称;1991年7月23日に発行された米国特許第5,034,124号,同名称;1991年9月17日に発行された米国特許第5,049,268号,同名称;1993年8月3日に発行された米国特許第5,232,589号,「フィルター要素および支持体(Filter Element and Support)」;1994年8月30日に発行された米国特許第5,342,517号,「フィルターカセット製品(Filter Cassette Article)」;1997年1月14日に発行された米国特許第5,593,580号,同名称;および1999年2月9日に発行された米国特許第5,868,930号,同名称に様々に記載されている。これらの全ての開示は、それぞれの全体が本明細書中に参考として援用される。
【0041】
本明細書中の「クロマトグラフィー樹脂」は、液体供給源の1または複数の成分を選択的または優先的に結合する固相を意味する。本発明の実施において、このような「クロマトグラフィー樹脂」は、アフィニティ樹脂、イオン交換樹脂、およびイオン捕捉樹脂として一般的に説明される樹脂グループのいずれかから選択することができる。これらの樹脂には、目的の物質を液体供給源から選択的または優先的に捕捉する化学的性質または結合リガンドがあることのみを必要とする。有用なクロマトグラフィー樹脂は、一般的に、支持体と、目的の標的物質に対して選択的または優先的な結合能をもたらす、支持体に結合した1または複数のリガンドを含む。説明に役立つ例のために、有用な支持体として、多糖(例えば、アガロースおよびセルロース)、有機重合体(例えば、ポリアクリルアミド、メタクリル酸メチル、およびポリスチレン−ジビニルベンゼン共重合体(例えば、Rohm&Haas Chemical Co.,Philadelphia,Paから市販されているAmberlite(登録商標)樹脂))が挙げられる。用語「樹脂」は、クロマトグラフィー分野で一般的に用いられているが、シリカおよびガラスなどの無機支持体材料にも有用性があるので、有機基質だけが樹脂基質の用途に適していることを意味しないことが本明細書中では意図されることを理解すべきである。本発明の実施において、樹脂は、だいたい球状のビーズの形であってもよく、あるいは、役立つように、樹脂は、他の規則的な形状または不規則な形状を有する微粒子または分割された形であってもよい。樹脂は多孔性でも無孔性でもよく、樹脂は、圧縮可能でも圧縮不可能でもよい。好ましい樹脂は、精製方法に用いられる条件(ポンプ輸送、クロスフロー濾過、温度、pH、および使用液体の他の側面を含む)に対して物理学的および化学的に復元力がある。本発明の実施において使用する樹脂は、規則的なだいたい球状の形状、無孔性、および圧縮不可能であることが好ましい。
【0042】
「アフィニティリガンド」は、液体供給源の成分に、この成分の結合部位との特異的な相互作用により選択的または優先的に結合する部分を意味する。本発明の実施において、アフィニティリガンドは、一般的に、樹脂などの固相に固定化される。本発明の方法に有用なクロマトグラフィー樹脂を形成するために樹脂支持体に結合することができるアフィニティリガンドの例として、プロテインAおよびプロテインAアナログ(免疫グロブリンに選択的に結合する);色素;抗原(関連する抗体の精製に有用である);抗体(抗原精製用);基質または基質アナログ(酵素精製用)などが挙げられる。アフィニティリガンドおよびアフィニティリガンドを固体支持体材料に結合する方法は、精製分野で周知である。例えば、参考教科書であるAffinity Separations:A Practical Approach(Practical Approach Series),Paul Matejtschuk(編),Irl Pr:1997、およびAffinity Chromatography,Herbert Schott,Marcel Dekker,New York:1997を参照のこと。
【0043】
「アフィニティクロマトグラフィー樹脂」または「アフィニティ樹脂」は、固体支持体または支持層と、その表面に結合したアフィニティリガンドを含むクロマトグラフィー樹脂を意味する。適切なアフィニティクロマトグラフィー樹脂の例示的な限定しない例として、ビーズ表面にアフィニティリガンドが結合した球状ビーズが挙げられる。ここで、ビーズは、セルロース、ポリ−スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、ポリメチルメタクリレート、または他の適切な材料で形成されている。本発明の実施において、クロスフロー濾過モジュールを通るポンプ輸送および再循環に耐える一方、構造完全性を維持することができる(例えば、孔を詰まらせる微粒子を生じる著しい破損を起こさない)堅いビーズが好ましい。アフィニティリガンドが結合した堅い無孔性セルロースビーズが特に好ましい。例示的な特に好ましい実施態様は、例えば、当該分野で周知の方法により、適切なアフィニティリガンド(例えば、プロテインA)に共有結合することができる「Orbicell(登録商標)」ビーズ(Accurate Polymers,Inc.,Highland Park,IL.から市販されている)を用いる。
【0044】
「イオン交換クロマトグラフィー樹脂」または「イオン交換樹脂」は、正電荷または負電荷を有するリガンドが共有結合している、従って、イオン交換樹脂を接触させた溶液中のイオンと交換することができる遊離対イオンを有する固体支持体を意味する。
【0045】
「陽イオン交換樹脂」は、負に荷電したリガンドが共有結合している、従って、樹脂を接触させた溶液中の陽イオンと交換するための遊離陽イオンを有するイオン交換樹脂を意味する。様々な陽イオン交換樹脂(例えば、共有結合した基がカルボン酸塩またはスルホン酸塩である陽イオン交換樹脂)が当該分野で周知である。市販されている陽イオン交換樹脂として、CMC−セルロース、SP−Sephadex(登録商標)、およびFast S−Sepharose(登録商標)が挙げられる(後ろ2つはPharmaciaから市販されている)。
【0046】
「陰イオンイオン交換樹脂」は、正に荷電した基(例えば、第4級アミノ基)が共有結合しているイオン交換樹脂を意味する。市販されている陰イオン交換樹脂として、DEAEセルロース、QAE Sephadex(登録商標)、およびFast Q Sepharose(登録商標)が挙げられる(後ろ2つはPharmaciaから市販されている)。
【0047】
本明細書中の「透析液」または「透析緩衝液」または「ダイアフィルトレート」は全て、汚染物質を標的物質−クロマトグラフィー樹脂複合体から除去するダイアフィルトレーション工程で用いられる液体を意味する。適切な透析液は、結合した標的物質を樹脂から著しく解離させることなく、汚染物質のクロマトグラフィー樹脂への非特異的結合を妨げるように作用することにより、汚染物質を樹脂から除去するのを助ける。透析液は、水と同じくらい単純であってもよく、多成分溶媒混合物(例えば、80%ヘキサン、15%アセトニトリル、および5%イソプロパノールを含有する溶媒混合物(ここで全てのパーセントは体積によるものであり、混合物の全体積に基づいている))と同じくらい複雑であってもよい。1を超える透析液を連続して使用してもよく、例えば、この連続透析液は、クロマトグラフィー樹脂と非特異的に会合する様々な種類の汚染物質を解離および除去するように設計された、様々な性質(例えば、pH値、伝導率、溶媒濃度などの)を有する。選択されたタンパク質(例えば、免疫グロブリン)の精製に有用な透析液の一例は、水性緩衝化0.4M NaCl溶液である。
【0048】
本明細書中で使用する「洗浄液」または「洗浄緩衝液」は、透析液または透析緩衝液と同義であり、すなわち、汚染物質を、標的物質が結合したクロマトグラフィー樹脂から洗い流すために用いられる液体である。
【0049】
本明細書中の「溶出液」または「溶出緩衝液」は、汚染物質がクロマトグラフィー樹脂から取り除かれた後に、標的物質をクロマトグラフィー樹脂から解離するために用いられる液体を意味する。溶出液は、標的物質を不可逆的に変性することなく標的物質を解離するように働く。代表的な溶出液はクロマトグラフィー分野で周知であり、さらに高濃度の塩、遊離アフィニティリガンドもしくはアナログ、またはクロマトグラフィー樹脂からの標的物質の解離を促進する他の物質を有してもよい。「溶出条件」は、(変性していない)標的物質をクロマトグラフィー樹脂から解離させる、標的物質が結合したクロマトグラフィー樹脂に課せられる処理条件(例えば、標的物質が結合したクロマトグラフィー樹脂を溶出液または溶出緩衝液と接触させて、このような解離を生じる条件)を意味する。
【0050】
本明細書中の「清澄化液」または「清澄化緩衝液」は、精製方法が完了した後に、クロマトグラフィー樹脂を洗浄するために用いられる液体を意味する。清澄化液は、界面活性剤、ウイルス不活性薬、または比較的高い濃度の塩を含有してもよく、精製方法中に用いられる液体より高いまたは低いpHを有してもよい。この目的は、クロマトグラフィー樹脂を再利用する準備ができるようにするために、クロマトグラフィー樹脂を完全に汚染除去することである。代表的な清澄化液は、クロマトグラフィー分野で周知である。
【0051】
本明細書中の「貯蔵液」または「貯蔵緩衝液」は、クロマトグラフィー樹脂が使用していない間に懸濁される液体を意味する。貯蔵液はまた、緩衝化イオンに加えて、殺菌剤または他の防腐剤を含有してもよい。このような貯蔵液は、クロマトグラフィー分野で周知である。
【0052】
精製方法
図1は、本発明の実施において標的物質を精製するために使用し得る一般スキームを示すものであり、以下に詳細に記載する。はじめに、供給液体は、必要であれば、(a)清澄化して、潜在的緩衝粒子を除去し、(b)以後の精製工程に必要であれば濃縮または希釈する。供給液体が、粒子を十分に含まずおよび/または本来供給された形態で適切な能である場合、これらの工程(a)および(b)のいずれか一方または両方を省略することができる。
【0053】
次いで、供給液体を、(1)選択的または優先的に標的物質に結合するクロマトグラフィー樹脂に接触している第1の貯蔵槽に移す。供給液体を、(2)所望の高百分率の標的物質のクロマトグラフィー樹脂への結合を導くのに十分な接触時間でクロマトグラフィー樹脂とともにインキュベートし、得られる樹脂−標的複合体を形成させる。インキュベーションの間、樹脂と標的物質との間の接触を十分に確実にするように透過物が再循環して貯蔵槽に戻るクロスフロー濾過を含む適切な手段によって供給液体を攪拌する。
【0054】
樹脂を、(3)クロスフロー濾過を介して再循環する。該クロスフロー濾過では、(a)樹脂を濃縮し;(b)樹脂−標的複合体を妨害せずに樹脂から非特異的結合成分を解離するために選択された第1のダイアフィルトレーション液体に対して樹脂をダイアフィルトレーションし;(c)特定の樹脂−標的複合体を解離させるために選択された第2のダイアフィルトレーション液体による処置によって目的の物質を樹脂から溶出させ;(d)該標的物をダイアフィルトレーションにより樹脂から取り出す。標的物質を含有するダイアフィルトレーションを(4)第2の貯蔵槽に捕獲し;標的物質を有用な濃度に濃縮する。
【0055】
以後の工程において使用される分離クロスフローフィルターモジュールのポアサイズよりも平均直径が大きい粒状混入物を供給液体から除去するために、随意的な第1の清澄化工程が実施される。必要とされる第1の清澄化工程は、クロマトグラフィー樹脂スラリー中の粒状物質の濃縮を回避し、さらに該工程は、精製方法の後半の工程中に粒状混入物が溶解して精製された標的物質に混入することを防止する。
【0056】
精製分野において周知の方法、例えば、遠心分離、重力分離、沈殿、フロキュレーション式沈降、デカンテーション、通常の濾過、篩い分け、吸収、吸着およびタンジェント流濾過によって清澄化工程を達成することができる。あるいは、供給液体は、すでにこの工程が不必要であるほど十分に清浄であり得る。
【0057】
図2は、クロスフロー濾過および以後の精製工程のための清澄化された供給液体の貯蔵槽への移送によって供給液体を清澄化するための系20の流れ図の略図を示す。図2では、供給液体を、代表的には導管22を介して、発酵槽またはバイオリアクター21由来の上清もしくは懸濁液を、供給液体を適切な温度に保持するための熱ジャケット24を具備する貯蔵槽23へ搬送している。ポンプ28を稼働させ、バルブ30および32を閉じた状態にし、さらなる濾過サイクルのために保持物を貯蔵槽24に戻すために必要に応じてバルブ31を開けて、導管24、25、および26を介するクロスフロー濾過モジュール27を介して、供給液体を貯蔵槽23から循環させる。導管29を介して仕上げ緩衝液を貯蔵槽23に添加する。導管33を介して透過物(清澄化された供給液体)を第2の貯蔵槽34に搬送し、ここで、該透過物は以後の工程のために保持される。貯蔵槽34はまた、清澄化された供給液体を適切な温度に保持するための熱ジャケット35を具備する。使用後、系をパージして洗浄する場合、バルブ30および32を開けて、導管36および37は洗浄液を適切なドレインおよび/または回収手段に搬送する。
【0058】
次いで、図2に記載の貯蔵槽34において供給液体を適切なクロマトグラフィー樹脂に接触させる。すでに(随意的に清澄化された)供給液体を含有する貯蔵槽にクロマトグラフィー樹脂を添加することが可能であるか、あるいはクロマトグラフィー樹脂を貯蔵槽に投入してその後供給液体を添加するか、またはクロマトグラフィー樹脂と供給液体とを適切な方法、例えば、バッチ、半バッチもしくは連続方法で接触させてもよい。
【0059】
この工程で使用するために適切なクロマトグラフィー樹脂は、ビーズであっても他の粒子の形態であってもよく、また標的物質に結合可能な最終的に分割される形態であってもよい。ビーズは分離フィルターのポアサイズより約1.5〜10倍大きい直径を有するサイズであるのが好ましい。クロマトグラフィー樹脂は、アフィニティ、イオン交換およびイオン捕獲樹脂として一般に記載される樹脂の群のいずれかから選択することができ、そのようなタイプの広範な樹脂は市販されている。樹脂は、目的の物質を捕獲する化学基またはリガンド化学基を有し、標的物質を樹脂に結合させる。
【0060】
特に有用なクロマトグラフィー樹脂は、約1.0〜1,000ミクロンのサイズの範囲であり、非特異的結合に対しては低い親和性を有する、一様な球状、非多孔性、剛性、非凝集性粒子の形態で提供される。本発明の1つの特定の好ましい実施態様において、クロマトグラフィー樹脂は、1〜3ミクロンの直径を有するセルロースビーズを含み、該ビーズの表面にはプロテインAリガンドが共有結合している。そのようなビーズは、組織培養物およびマウス腹水からモノクローナル抗体を精製するのに極めて有用である。そのようなタイプのビーズは、商品名「Orbicell(登録商標)」でAccurate Polymers, Inc.(Highland Park, Illinois)より市販されている。
【0061】
図3は、そのようなOrbicell(登録商標)ビーズの表面および断面を示しており、該ビーズの表面積は大きいが内部に孔を有さないため、その結果、標準的な多孔性ビーズ3とは対照的に該ビーズは高い機械的強度を有する。Orbicell(登録商標)ビーズの強度および剛性が高いため、該ビーズはクロスフローフィルターを介する再循環に特に適している。何故なら、該ビーズは、フィルターのポアを詰まらせる可能性があるより小さな粒子に分解する傾向がなく、また該ビーズは、圧縮して不規則な流路を形成する傾向がないからである。そのようなOrbicell(登録商標)ビーズに対応する特徴を有する他のタイプのビーズは市販されており、本発明の実施において有用に使用される。
【0062】
図4は、先行技術の生体分離において使用されるタイプの多孔性ビーズ5とは反対に、Orbicell(登録商標)ビーズを使用する場合に存在するより簡単な流路を概略的に示す。そのような先行技術の多孔性ビーズは、それらの弾性ならびにポンピングの延長および再循環条件下での破壊に対する耐性について本発明の実施において好適に使用される非多孔性ビーズよりもそれらの物性に有利な面が少ない。非多孔性ビーズのさらなる有益性は、混入物が孔に捕捉されて溶出工程中に溶出し、標的物質の純度を低下させるようなことがないことである。
【0063】
次に、図5では、図2の上記の最初の処理後にクロマトグラフィー樹脂−供給源スラリーを貯蔵槽34内で適切な接触時間だけ接触させる。インキュベーションの簡単な方法は、スラリーを含有する貯蔵槽34を攪拌または振盪することを伴い得る。本発明の好ましい実施態様では、分離クロスフローフィルターモジュール42を横切るポンプ38の稼働下でライン36を介して、および(バルブ49に接続しているドレインライン47を有する)ライン40を介して、樹脂/液体スラリーを再循環させ、フィルター42を清潔に保つのに十分な容量流速で、背圧バルブ46を有するライン44を介するフィルターモジュール42から貯蔵槽34へ液体を再循環させる。浸透物は、ライン50から開口バルブ58を通りライン56を介して貯蔵槽34へ戻され、貯蔵槽内の液体に適切な接触またはインキュベーション時間を提供する。
【0064】
貯蔵槽34内の好ましい接触(インキュベーション)時間は、使用する特定のクロマトグラフィー樹脂および結合部位が標的物質に結合する場合の該樹脂の濃度、ならびにビーズおよび標的物質の相対濃度に依存する。化学基の反応時間はリガンドにより変動するが、標的物質に対する利用可能な結合部位の濃度が高いほど、好適なインキュベーション時間は短くなる。標的物質より1.2〜10倍高い濃度で、さまざまなアプリケーションにおいて過剰な樹脂を最適にすることができることが考慮される。該方法を最適化する場合にさらに考慮することは、液体に懸濁される樹脂の濃度である。(結合された樹脂および液体物質の全重量に基づく重量で)1〜64%の範囲にある樹脂は、有利に利用することができ、約10〜約50%の樹脂濃度(同基準で)が最適と見なされている。
【0065】
熱ジャケット35(または他の熱輸送手段、例えば、貯蔵槽34中の液体容積中の配置された加熱コイル、貯蔵槽の外部の再循環ヒーターであって、該熱輸送手段を介して液体が貯蔵槽から流動し、ヒーターユニット内で適切な温度に加熱され、そして貯蔵槽の液体容積に戻される上記熱輸送手段)によるインキュベーション工程中に温度が制御され、適切な温度を有する液体および樹脂混合物が提供されて、標的物質の活性が保存される。そのような目的に適切な温度は、当該分野の範囲内で、過度の実験を行うことなく容易に決定することができる。
【0066】
クロマトグラフィー樹脂との接触のために供給液体を貯蔵槽に輸送すること(上記の工程(1))および供給液体をクロマトグラフィー樹脂とともにインキュベーションすること(上記の工程(2))は、樹脂を含まない等量の液体を取り出しながら供給液体をクロマトグラフィー樹脂に同時に添加することによって、同時に達成することができる。本発明の本実施態様における制御要素は、標的物質がクロマトグラフィー樹脂に本質的に完全に結合することを可能にするのに十分な程度に、貯蔵槽内の供給液体の残留時間が長いことである。この目的は、分離クロスフローフィルターモジュール42を介して容易に達成される。浸出された供給液体容積に等しい透過流はバルブ66を有するライン64においてループから取り出される。過剰の透過物はバルブ58を含有するライン56で樹脂貯蔵槽に送られ戻される。
【0067】
混入物および過剰の液体は、分離クロスフローフィルターモジュール42によって分離され、すでに標的物質に結合しているクロマトグラフィー樹脂から透析分離される。樹脂スラリーは、分離のためにクロスフローフィルターモジュールを横切って再循環し、保持液体は貯蔵槽に戻される。透過物液体は、(1)ドレイン(バルブ54を含有するライン52による);(2)以後の樹脂を含有する第2の貯蔵槽(示さず)(バルブ66を含有するライン64による);(3)非依存的処理工程のうち1つ以上に方向付けられる。樹脂は、約0.1〜約64体積%の範囲の濃度に濃縮することができる。本発明の1つの好ましい実施態様では、樹脂は約50体積%に濃縮される。
【0068】
クロマトグラフィー樹脂を洗浄するのに必要な洗浄緩衝液の容積は、懸濁液中の樹脂の濃度に依存する。例えば、樹脂スラリーが100リットルの1%樹脂溶液である場合、樹脂を洗浄するのに必要な容積は10倍の1,000リットルである。樹脂スラリーが10リットルの10%樹脂溶液であれば、必要な容積は100リットルである。
【0069】
クロスフローフィルターモジュールにおける流速に対する樹脂濃度の影響のため、クロマトグラフィー樹脂を洗浄するのに必要な時間も懸濁液中の樹脂の濃度に依存する。例えば、樹脂スラリーが10リットルの25%樹脂溶液である場合、透過速度は100 L/m2−hであり得る。樹脂スラリーが5リットルの40%樹脂溶液である場合、透過速度は僅か10 L/m2−hであり得る。従って、1.0 m2クロスフローフィルターモジュールを使用して10倍の洗浄緩衝液でクロマトグラフィー樹脂スラリーを洗浄するのに必要な時間は、20%懸濁液では1時間であり、40%懸濁液では5時間の洗浄時間が必要である。
【0070】
樹脂の濃縮後に、適切な透析液を貯蔵槽34に添加することによって、ダイアフィルトレーションが開始される。適切な透析液(または「ダイアフィルトレーション物」もしくは「透析緩衝液」)は、結合した標的物質の樹脂からの有意な解離を引き起こすことなくクロマトグラフィー樹脂に対する混入物の非特異的結合を妨害するように作用することによって、樹脂から混入物を除去するのに役立つ。透析液は簡単なものでは水があり、または複雑なものでは複数の溶媒の混合物、例えば、80%ヘキサン、15%アセトニトリルおよび5%イソプロパノール溶液などがあり得る。
【0071】
このダイアフィルトレーション工程中の透析緩衝液の交換回数は、好ましくは3〜25の範囲である。透析緩衝液の好ましい交換回数は、分離クロスフローフィルターモジュール42および標的産物の所望される純度に関連して混入物の保持特性に基づく。最終的な微量の混入物を樹脂スラリーから除去するための透析緩衝液の交換(ダイアフィルトレーション)は、透過速度と同じ流速で仕上げ透析緩衝液をスラリー貯蔵槽に添加することによって達成される。この手順は、レベル制御、充填セル、または流量メーターを使用することによって、容易に自動化することができる。緩衝液の交換の程度は、樹脂スラリー貯蔵槽に添加された緩衝液の累積容積を樹脂スラリーの出発容積で除した割合として規定される容積置換によって測定される。添加した緩衝液を伴う本来の上清の交換または希釈の程度は、幾何学的な機能である。本発明の例示的実施態様のために、上清の希釈および容積置換の表を以下に示す。
【0072】
【表1】
【0073】
随意的分離クロスフローフィルターモジュール42は、好ましくは、クロマトグラフィー樹脂ビーズの平均直径より1.5〜10倍小さい膜ポアサイズを有する。分離クロスフローフィルターモジュールのチャンネル高は、望ましくは、クロマトグラフィー樹脂ビーズの平均直径より1.2〜10倍大きく、フィルターモジュールの申し分のないクリアランスおよび効率的な流体力学的挙動を提供する。分離クロスフローフィルターモジュールの極めて好ましいデザインは、保持チャンネルに対して一様な分布を有する開口チャンネルモジュールである。本発明の1つの好ましい実施態様において、クロマトグラフィー樹脂ビーズは約1〜3ミクロンの平均直径を有し、クロスフローフィルターは約0.6ミクロンの平均ポアサイズを伴うフィルターエレメントを有し、保持チャンネルの高さは0.5 mmである。この目的に適切なクロスフローフィルターモジュールは、North Carolina SRT, Inc. (Cary, NC)より市販されている。
【0074】
本発明の方法の1つの実施態様において、ダイアフィルトレーション工程由来の透過物は、(バルブ66を伴うドレインライン64を含有する)ライン50、バルブ62およびライン60を通過して、出発物質からの物質の第2の分離を生じる第2の樹脂を含有するさらなる貯蔵槽68に達する。
【0075】
例えば、特定の抗原に対する免疫グロブリンは、それぞれが特定のウイルス抗原に連結される一連のアフィニティクロマトグラフィー樹脂を使用することによって、血漿から連続的に精製される。もう1つの例示的実施例では、それぞれ場標的化されたタンパク質に結合するリガンドに連結される一連の特異的クロマトグラフィー樹脂を使用することによって、乳清から連続的に乳タンパク質が分離される。これらのリガンドはイオン交換体、免疫グロブリン、天然タンパク質、または標的化されたタンパク質に選択的もしくは優先的に結合するアフィニティリガンドであり得、樹脂に連結され得る。さらなるもう1つの例示的実施例では、標的化されたタンパク質に対する抗体と連結される樹脂を使用することによって、血漿タンパク質が全血漿または血漿画分から連続的に精製される。
【0076】
混入物を除去するためのダイアフィルトレーションの後、標的物質が溶出され、クロマトグラフィー樹脂から回収される。溶出のために使用される特異的化学基は、クロマトグラフィー樹脂−標的物質相互作用の性質および強度に依存する。溶出および回収手順は、上記のダイアフィルトレーション工程に類似する。クロマトグラフィー樹脂から標的物質を解離する適切な溶出液は、透過速度に等しい速度で、所望される収量が得られるまで樹脂スラリー貯蔵槽(例えば、ライン48における貯蔵槽34)に添加される。イオン濃度の上昇は、伝導率メーターを使用して容易に監視することができ、イオン濃度は時間とともに特定の速度で増加するため、クロマトグラフィー樹脂がイオン交換樹脂である場合、この手順は極めて有用である。クロマトグラフィー樹脂がアフィニティ樹脂である場合、はじめに濃縮された形態の溶出緩衝液を樹脂スラリー貯蔵槽に添加して、ダイアフィルトレーション緩衝液から溶出緩衝液への移行を増強することが有用である。
【0077】
例えば、タンパク質A樹脂からモノクローナル抗体を溶出させる場合、測定された容量の1.0 Mグリシン緩衝液を添加することによって、樹脂スラリーのpHは適切な値、例えば、pH 2.5のオーダーまで低下する。次いで、樹脂スラリーを10容量の0.1 Mグリシン緩衝液に対してダイアフィルトレーションする。
【0078】
溶出工程の改変は、異なるポアサイズのクロスフローフィルターモジュールを使用することを含む。例えば、クロマトグラフィー樹脂から血漿タンパク質を溶出させる場合、クロスフロー膜を、任意の混入ウイルスまたは早期のダイアフィルトレーション工程3(a)中に取り出されなかったタンパク質−ウイルス複合体を保持する膜に交換することが有用である。
【0079】
そのような改変(図6を参照のこと)のための第1のクロスフローフィルターは83であり、第2のフィルターは42であり得る。樹脂スラリーは、最初に濃縮され、閉められたバルブ57および開口されたバルブ81を伴うライン40を介するポンプ38によるクロスフローフィルター83を介してダイアフィルトレーションされる。フィルター83から、開口バルブ91および閉められたバルブ46の直前のライン89を介してダイアフィルトレーションされたスラリーが流動され、貯蔵槽34に戻される。この工程の浸透物はドレインに流動することができるかまたはライン93および開口バルブ99を介して以後の精製に流動することができる。溶出工程のために、溶出した透過物がさらに目の細かいフィルター42を介して流動し、開口バルブ62およびライン60を介して貯蔵槽68に達することができるように、バルブ81および91は閉じられ、バルブ57および46は開口される。フィルターモジュール83は、バルブ99を含有するライン93、およびバルブ87を含有するライン85に接続し、フィルターモジュールからの透過物の流動を適応させるか、または(濾過される液体からのフィルターエレメントの対向側面に対して同流もしくは逆流で)もう1つの質量移行液の通過を適応させ、質量移行勾配および保持流体の内外への粒状種の流動を最大にする。
【0080】
ダイアフィルトレーションおよび溶出操作は、図6に示す第1の貯蔵槽34において全てを実施することができ、次いで、標的物質を含有する得られる透過物は、最終処置(例えば、該貯蔵槽の緩衝化)または他の処置のために第2の貯蔵槽68に通過され、クロスフローフィルター82においてさらなる濾過が実施され、最終的に回収容器80に回収される。そのような配列において、ライン93における第1のクロスフローフィルターモジュール83由来の透過物は、利用される緩衝液の量を最大にするためにナノフィルターなどのもう1つのクロスフローフィルターを介して循環され得る。
【0081】
従って、多くの代替的装置の配列を構成、配列および操作し、さまざまな実施態様において本発明の分離方法を実施することできることが理解されよう。
【0082】
本発明のもう1の例示的実施態様では、イオン交換樹脂から乳タンパク質が溶出され、イオン交換はより高価なアフィニティ樹脂の特異性を有さないという事実のため、サイズ分離を生じる異なるポアサイズの分離交差モジュールを使用することによって純度の高いタンパク質製品が回収される。
【0083】
例示的に示される図6は、そのようの目的のために使用される異なるポアサイズの2つのクロスフローフィルターモジュールを使用する精製系を示す。図6の系では、図5に関連して系に対応番号を付し、同じ番号のエレメントは構成、配列および操作が対応する。しかし、図6に見られるように、系は、フィルターモジュール42に並行流関係で多岐管集配されるもう1つのクロスフローフィルターモジュール83を含み、フィルター42から流動制御バルブ57を含有するライン55が分岐し、第2のフィルター83モジュールからバルブ81を含有するライン40およびバルブ91を含有するライン89に結合する。
【0084】
第2のフィルターモジュール由来の透過物が選択的に排液および/または示されるように貯蔵槽34に再循環されるか、あるいは質量移行液が同流または逆流関係で通過することができ、液流がクロスフローフィルターモジュールの質量移行エレメントの対向側面に対して濾過されるように、第2のフィルターモジュールもまた、バルブ87を含有するライン85に接続され、順にバルブ97および99を含有するライン95に連絡する。
【0085】
図6に示される一般的な再配列および配置を有する系の特定の実施態様では、フィルターモジュール42は、0.04ミクロンの平均ポアサイズを有するフィルター(膜)エレメントを含有し得、フィルターモジュール83は、0.6ミクロンの平均ポアサイズを有するフィルター(膜)エレメントを含有し得る。本発明の実施において使用されるフィルターモジュールにおけるフィルターエレメントのタイプおよび特徴は広範に変動することが認識され、またこのことは同様に当業者に理解され、そのような目的に適切な市販のフィルターエレメントを使用して容易に実施されるであろう。
【0086】
溶出標的物質(例えば、タンパク質またはペプチド)は、望ましくは適切な条件(例えば、温度、pH、および塩濃度)下で貯蔵槽に捕獲されることに注意することは重要である。pHを増減することおよび純粋生成物の不活性化および消失を回避するために温度を低下させることは必要であり得る。例えば、タンパク質A樹脂から溶出した免疫グロブリンは、Tris緩衝液を含有する温度制御された貯蔵槽中に、pH8、4℃〜10℃で回収するべきであり、これらはpHを上昇させて中性にし、そして免疫グロブリンの変性を回避するために溶出物を冷却する。
【0087】
以下の使用のための装置を用意するために、標的物質が溶出され、捕獲貯蔵槽に移された後、溶出緩衝液を清浄緩衝液に切り換え、続いて、クロマトグラフィー樹脂が再使用のために準備されるように保存緩衝液に切り換えられる。この工程中は、浸透物がドレインに方向付けられる。
【0088】
次いで、捕獲貯蔵槽に捕捉された溶出標的物質は、さらなるクロスフローフィルターモジュールまたは沈殿、凍結乾燥、エバポレーション、もしくは遠心分離などの溶出緩衝液を除去するための他の適切な工程によって濃縮され得る。好ましい実施態様では、クロスフローフィルターモジュールを使用する。フィルター媒体は、好ましくは標的物質の平均半径よりも小さく、標的物質が適切な程度で濃縮され得、混入イオンがダイアフィルトレーションによって除去されるように溶出緩衝液のイオンより大きなポアサイズを有する。
【0089】
例えば、タンパク質A樹脂から精製および溶出されたIgGを濃縮し、30,000分子量膜を使用してダイアフィルトレーションし、溶出緩衝液の塩を排除することができる。そのような交差濾過モジュールは、North Carolina SRT, Inc. (Cary, NC)より市販されている。
【0090】
上記の方法は、標的生体物質の精製において広範な有用性を有する。供給液体は、血清;血漿および血漿画分;全血;乳;初乳;清乳;細菌、酵母、菌類、昆虫もしくは動物細胞または組織培養液および組織均質化物を含む広範な物質から選択することができる。標的物質は、濾過精製適応可能でかつクロマトグラフィー樹脂に選択的または優先的に結合し得る極めて広範な生体物質から選択することができ、これらには、タンパク質、糖タンパク質、ホルモン、抗原、抗体、凝固因子、免疫グロブリン、および酵素が含まれるが、これらに限定されない。クロマトグラフィー樹脂は、標的物質の特徴の基づいて選択され、よく理解されている広範な範囲のイオン交換およびアフィニティリガンドは当業者に利用可能であり、本明細書において開示および教示された内容に基づいて当該分野の範囲で容易時実施される。
【0091】
例えば、本発明の方法は、血清、血漿および血漿画分、全血、乳、初乳、および清乳より選択される供給液体からIgGを精製するのに有用である。凝固因子は血漿、全血、血清および組織培養物から精製することができる。
【0092】
本発明の方法は、血漿および組織培養液体などの供給液体からIgGを精製するのに費用および時間的効果を提供することが実証されている。
【0093】
本発明の特定の態様は、上記において一般的に記載されるように供給液体を処理してそれから精製された標的物質を回収することに関するが、ここで、供給液体は、混入物として生物学的に有害な混入物、例えば、細菌種、ウイルス種、抗原種などを含み得る。本発明は、供給液体の処置、またはそのような混入物を不活化し、非有害にするための他の方法もしくは該方法における精製流を考慮する。例えば、混入物はウイルス種、例えば、HIV、肝炎ウイルスなどを含み得、該混入物の不活化は、殺ウイルス処置を含み得る。
【0094】
従って、本発明は、特定の態様において、少なくとも1つの標的物質を、生物活性汚染物質を含有する液体供給源から精製する方法であって、前記方法は、
前記液体供給源をクロマトグラフィー樹脂と接触させる工程と、
前記液体供給源に由来する少なくとも1つの標的物質を前記クロマトグラフィー樹脂に結合させるのに十分な接触時間で、前記液体供給源を前記クロマトグラフィー樹脂とインキュベートする工程と、
クロスフローフィルター(例えば、1つのクロスフローフィルターまたは1を超えるクロスフローフィルター)において前記クロマトグラフィー樹脂を再循環させる工程であって、ここで、
前記クロマトグラフィー樹脂を濃縮およびダイアフィルトレーションする工程と、
前記標的物質を前記クロマトグラフィー樹脂から溶出する工程と、
ダイアフィルトレーションにより前記標的物質を前記クロマトグラフィー樹脂から分離する工程が行われる工程と、
前記標的物質を回収する工程と、
任意に、前記標的物質を濃縮する工程を含み、
前記方法の間に前記生物活性汚染物質を不活性化することをさらに含む、方法に関する。
【0095】
そのような不活化は、例えば、該方法の最初の工程として、もしくは供給液体とクロマトグラフィー樹脂とのインキュベーション中、(不活化剤を、濾過操作中の流れ含有する標的物質に添加することによる)クロスフロー濾過処理中、または他の任意の適切な方法で生体活性混入物を不活化剤に接触させることを含み得る。不活性化剤は、任意の適切な形態、例えば、1以上の標的物質に結合するために画分されているクロマトグラフィー樹脂ビーズ上の結合種、または不活化剤のみを結合して有しているビーズ上の結合種であって、ここで、不活化種−結合ビーズは、不活化種−結合ビーズおよび1以上の標的物質に結合するために画分されているビーズの両方を含む全体集団の集団成分を含む、結合種として誘導することができる。
【0096】
ウイルス種に対する不活化剤は任意の適切な薬剤であり得る。本明細書において使用される用語「薬剤」は、広範に構成されることを意図し、任意の抗ウイルス分子、ウイルス種を非生物化または非感染化する複合体形成剤または捕獲剤、ウイルス転写阻害剤、殺ウイルス処理(暴露)条件などを含む。具体的な例としては、ヨード、塩素、溶媒−界面活性剤組成物、および紫外線または他の殺ウイルス放射線暴露が挙げられる。ウイルス捕獲剤の使用については、供給液体のウイルスを捕獲するためにウイルス受容体種を使用することができる。特定のウイルス捕獲剤の1つのクラスは、シアル酸またはノイラミン酸(nonulosaminic acid)例えば、N−アセチルノイラミン酸、N−グリコシルノイラミン酸、N,O7−ジアセチルノイラミン酸、N,O4−ジアセチルノイラミン酸、およびN,O,O−トリアセチルノイラミン酸などを含む。従って、クロマトグラフィー樹脂は、マイクロビーズ結合捕獲剤種を伴うマイクロビーズ、例えば、ビーズ上にシアル酸を有する画分されたマイクロビーズを含み得る。
【0097】
さらなる特定の態様において、本発明は、標的物質を、前記標的物質と1または複数のウイルス種を含有する液体供給源から精製するための方法であって、該方法は、
前記液体供給源を、前記1または複数のウイルス種に対する1または複数のウイルス不活性薬と接触させることと、
平行流濾過において前記標的物質の少なくとも90重量%を濃縮するのに有効な膜を備える平行流フィルターにおける平行流濾過により、液体供給源中の前記標的物質を濃縮することと、
前記液体供給源をクロマトグラフィー樹脂と接触させることと、
前記標的物質の所望の画分を結合するのに十分な接触時間で、前記液体供給源を前記クロマトグラフィー樹脂とインキュベートすることと、
クロスフローフィルターにおいて前記クロマトグラフィー樹脂を再循環させることであって、ここで、
前記クロマトグラフィー樹脂を濃縮し、前記樹脂を保持し、かつ前記樹脂に結合しない種を通過させるのに有効な膜を備えるフィルターにおけるダイアフィルトレーションにより、汚染物質を、前記クロマトグラフィー樹脂に結合した標的物質から分離する工程と、
前記樹脂を保持し、かつ前記標的物質を通過させるのに有効な溶出膜と接触させることにより、前記標的物質を前記クロマトグラフィー樹脂から溶出する工程と、
ダイアフィルトレーションにより、前記標的物質を前記クロマトグラフィー樹脂から分離する工程が行われることと、
前記標的物質を回収することと、
任意に、前記標的物質を、例えば、90重量%の標的物質を含む濃縮物を回収するのに効率的な濃縮膜と接触させることによって、濃縮することを含む。
【0098】
本発明の範囲内にあるもう1つの方法の改変体は、標的物質を、前記標的物質を含有する液体供給源から精製するための方法であって、該方法は、
前記液体供給源をクロマトグラフィー樹脂と接触させることと、
少なくとも1つのクロスフローフィルターにおいて前記クロマトグラフィー樹脂を再循環させることであって、ここで、
平行流濾過により、前記液体供給源中の前記標的物質およびクロマトグラフィー樹脂を濃縮する工程と、
前記樹脂を保持し、かつ前記樹脂に結合しない種を通過させるのに有効な膜を備えるフィルターにおいて前記クロマトグラフィー樹脂をダイアフィルトレーションする工程と、
前記樹脂を保持し、かつ前記標的物質を通過させるのに有効な溶出膜と接触させることにより、前記標的物質を前記クロマトグラフィー樹脂から溶出する工程と、
ダイアフィルトレーションにより、前記標的物質を前記クロマトグラフィー樹脂から分離する工程が行われることと、
前記標的物質を回収することと、
任意に、前記標的物質を濃縮することを含む。
【0099】
上記の方法では、供給液体は、1以上の病原性生物を含有し得、該方法は、そのような場合において、さらに、供給液体とそのような1以上の病原性生物に対するウイルス不活化剤とを接触させる工程を含む。
【0100】
もう1つの態様および用途において、本発明は、A型および/またはB型血液抗体を含有する血液から普遍的血漿を製造する方法であって、A型および/またはB型血液抗体を含有する血液を対応するA型および/またはB型抗原と接触させ、普遍的血漿として抗体涸渇血液産物を回収することを含む方法に関する。
【0101】
クロマトグラフィー樹脂は、Schwartzの米国特許第4,828,984号(1989年5月9日付「擬態細胞の組成、合成および使用」)またはSchwartzの米国特許第4,774,189号(1988年9月27日付「染色された細胞を擬態する蛍光較正マイクロビーズ」)の実施例に記載のようなタイプのマイクロビーズを含み得る(これらの文献の開示内容は、それらの全体が本明細書において参考として援用される)。Schwartzの米国特許第4,774,189号は、抗原種によって画分されたマイクロビーズについて記載しており、ここで、抗原種は、その分子上の1級アミンによってビーズ上の表面のエポキシ基を介してマイクロビーズに結合する。
【0102】
上記の方法で抗体涸渇血液産物を普遍的血漿として回収することは、上記でより具体的に記載されているような本発明のさまざまな濃縮/溶出/タンジェント濾過技術を使用して実施することができる。
【0103】
本発明の特徴および利点については、以下の非制限的実施例を参考にして、より詳細に表される。
【0104】
実施例1.粗ヒト血漿からのIgGの精製
図5において略図で示される装置を使用し、本発明の方法により、粗ヒト血漿からIgGを精製した。
【0105】
図7は、そのような精製の有効性を評価するために実施したSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)を示す。レーン701は、既知の分子量を有するいくつかのペプチドを含有する較正サンプルである。レーン702および703は、クロスフロークロマトグラフィーによる5倍希釈後のそれぞれ20μLおよび40μLのサンプルである。レーン704および705は、ダイアフィルトレーション後のクロマトグラフィー樹脂ビーズの上清のそれぞれ20μLおよび40μLのサンプルである。レーン706および707は、それぞれレーン702および704で使用した物質のβ−メルカプトエタノール消化の40μLのサンプルである。
【0106】
実施例2.組織培養液からのIgGの精製
図5において略図で示される装置を使用し、組織培養液からIgGを精製した。TRIPORTフィルターモジュール(North Carolina SRT, Inc., Cary, NC)を使用して、組織培養液(50μg/mLの濃度でIgGを有する20.0 Lの組織培養物)を濾過によって清澄化した。透過物を、Obicell(登録商標)−タンパク質Aビーズ(Acccurate Polymer, Ltd., Highland Park, IL)の懸濁液を含有する容器へ方向付けた。TRIPORTフィルターモジュールを介する全体的な再循環を、15分間、大気温度で行うことによって、培養液およびビーズの懸濁液をインキュベーとした。懸濁液を5倍濃縮し、次いで、0.4 M NaClで10倍ダイアフィルトレーションした。透過物ラインを、中和緩衝液を含有するクエンチング容器に移動させ、透析緩衝液を酸性溶出緩衝液に変更することによって、結合IgGの溶出を実施した。中和された濃縮物を濃縮し、次いで、10倍にダイアフィルトレーションして、酸性中和中に形成した低分子の塩を除去した。最終収量は、10 mg/mLの濃度の約100 mLの精製されたIgGであった。全処理時間は、75分間であり、精製されたIgGの収率は90〜94%であった。
【0107】
図8は、上記の精製の有個性を評価するために実施したSDS−PAGE分析を示す。レーン801は、既知の分子量を有するいくつかのペプチドを含有する較正サンプルである。レーン802および803は、本実施例の方法の第1の試験由来の精製されたIgGのそれぞれ20μLおよび40μLのサンプルである。レーン804および805は、本実施例の方法の第2の試験由来の精製されたIgGのそれぞれ20μLおよび40μLのサンプルである。レーン806および807は、本精製方法において出発物質として使用される馴化培地のそれぞれ20μLおよび40μLのサンプルである。レーン808および809は、それぞれ第1および第2の試験由来の精製されたIgGのβ−メルカプトエタノール消化の40μLのサンプルである。レーン810は、馴化培地出発物質のβ−メルカプトエタノール消化の40μLのサンプルである。
【0108】
本明細書では、さまざまな例示的特徴、態様および実施態様を参考にして本発明を説明してきたが、具体的に示されかつ記載されているこれらの内容以外にも、本発明では改変、変更および他の実施態様が受け入れられることが理解されよう。従って、本発明は、添付の請求項の範囲内においてそのようなすべての代替的改変、変更および他の実施態様を含むことが広範に解釈され、考慮される。
【図面の簡単な説明】
【図1】 クロスフロー濾過に基づく装置を用いた、本発明の1つの実施態様による精製方法の大まかな計画を示す図である。
【図2】 後で精製工程にかけようとする液体供給源を清澄化するのに有用な装置の概略図である。
【図3】 標準的な先行技術の多孔性ビーズと比較した、クロマトグラフィー樹脂に用いられるOrbicell(登録商標)ビーズの微細形態を示す図である。
【図4】 標準的な先行技術の多孔性ビーズの周囲と、そのビーズを通過する流路と比較した、Orbicell(登録商標)ビーズ周囲の流路の概略図である。
【図5】 本発明の方法のクロスフロークロマトグラフィー精製、溶出、回収、および濃縮工程を実施するのに有用な装置の概略図である。本発明の1つの実施態様では、クロスフローフィルターモジュールが用いられる。
【図6】 本発明の方法のクロスフロークロマトグラフィー精製、溶出、回収、および濃縮工程を実施するのに有用な代替装置の概略図である。本発明の別の実施態様では、第1のクロスフローフィルターモジュールとは多孔度が異なる第2のクロスフローフィルターモジュールがさらに用いられる。
【図7】 本発明の方法により未処理ヒト血漿から精製されたIgG試料のSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す図である。
【図8】 本発明の方法により細胞培地から精製されたIgG試料のSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す図である。
Claims (16)
- 標的物質を液体供給源から精製する方法であって、前記方法は、
(a)第1のリザーバ中で前記液体供給源を無孔性タイプビーズを含むクロマトグラフィー樹脂と接触させることと、
(b)前記樹脂が、標的物質の所望の画分を結合できるのに十分な接触時間で、前記液体供給源を前記クロマトグラフィー樹脂とインキュベートすることと、
(c)少なくとも第1及び第2のクロスフローフィルターにおいて前記第1のリザーバからの前記クロマトグラフィー樹脂に結合した標的物質を再循環させることであって、前記第1及び第2のクロスフローフィルターモジュールは積み重なった配置の複数のフィルターシートを備え、前記フィルターシートは透過液シートと残留液シートと互い違いであり、前記残留液シートは、前記クロマトグラフィー樹脂の直径より1.2〜10倍の高さを有する残留液チャンネルを含み、前記クロスフローフィルターの各々は異なる孔サイズのフィルターシートを有し、ここで、
i)前記第1のクロスフローフィルターでの3〜25回の複数回ダイアフィルトレーション工程により、前記クロマトグラフィー樹脂を濃縮し、汚染物質(contaminants)を前記クロマトグラフィー樹脂に結合した標的物質から分離する工程であって、前記クロマトグラフィー樹脂に結合した標的物質は、さらなるダイアフィルトレーション工程のために前記第1のリザーバへ再導入するために前記残留液チャンネル中に保持され、透過液は、前記汚染物質及び未結合の標的物質を含む、工程と、
ii)前記第1のクロスフローフィルターを介する複数回ダイアフィルトレーション工程によってクロマトグラフィー樹脂を濃縮した後、前記第1のリザーバに溶出液を添加することにより、前記標的物質を前記クロマトグラフィー樹脂から溶出する工程と、
iii)第2のクロスフローフィルターでのダイアフィルトレーションにより前記標的物質を前記クロマトグラフィー樹脂から分離する工程が行われることと、
(d)前記標的物質を回収することと、
を含む、方法。 - 前記液体供給源を最初に清澄化することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 粒子状物質を除去するためにクロスフロー濾過により最初に清澄化を行う、請求項2に記載の方法。
- 妨害物質を除去するためにクロスフロー濾過により最初に清澄化を行う、請求項2に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー樹脂の濃縮およびダイアフィルトレーションにより生じた透過液を、溶出前に、さらなる精製工程にかけることをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記溶出された標的物質を、さらなる精製のために第2のクロマトグラフィー樹脂と接触させることをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー樹脂は、プロテインA、プロテインAアナログ、抗体、細菌抗原、ウイルス抗原、および色素からなる群から選択される1または複数のリガンド種を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記標的物質は免疫グロブリンである、請求項1に記載の方法。
- 前記液体供給源は、血清、血漿、血漿画分、全血、乳、初乳、乳清、細胞液、組織培養液、および組織ホモジネートからなる群から選択される1または複数の液体を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記液体供給源は、血漿、全血、血清、および組織培養物からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記標的物質は、ワクチン、凝固因子、免疫グロブリン、抗原、抗体、タンパク質、糖タンパク質、ペプチド、酵素からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー樹脂は、アフィニティクロマトグラフィー樹脂およびイオン交換樹脂からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー樹脂は、アフィニティクロマトグラフィー樹脂を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記アフィニティクロマトグラフィー樹脂は、アフィニティリガンドに結合した堅い無孔性セルロースビーズを含む、請求項13に記載の方法。
- 前記アフィニティリガンドは、プロテインAおよびプロテインAアナログからなる群から選択される、請求項14に記載の方法。
- 以下:ワクチンまたはワクチン成分を生成するための液体の分離、
細菌、酵母、菌類、昆虫細胞、または動物細胞の免疫グロブリン含有培養物からの免疫グロブリンの分離、
血清からの免疫グロブリンの分離、
血漿または血漿画分からの免疫グロブリンの分離、
全血からの免疫グロブリンの分離、
乳からの免疫グロブリンの分離、
初乳(clostrum)からの免疫グロブリンの分離、
乳清からの免疫グロブリンの分離、
腹水からの免疫グロブリンの分離、
全血からの凝固因子の分離、
血漿からの凝固因子の分離、
血清からの凝固因子の分離、
細菌、酵母、菌類、昆虫細胞、または動物細胞の凝固因子含有培養物からの凝固因子の分離、
乳からの凝固因子の分離、
乳清からの凝固因子の分離、
初乳(clostrum)からの凝固因子の分離、
腹水からの凝固因子の分離、
細菌、酵母、菌類、昆虫細胞、または動物細胞のタンパク質含有培養物からのタンパク質の分離、
細菌、酵母、菌類、昆虫細胞、または動物細胞の抗原含有培養物からの抗原の分離、
抗原含有ウイルス培養物からの抗原の分離、
細菌、酵母、菌類、昆虫細胞、または動物細胞のホルモン含有培養物からのホルモンの分離、
血清からのホルモンの分離、
血漿または血漿画分からのホルモンの分離、
全血からのホルモンの分離、
血漿からのホルモンの分離、
血清からのホルモンの分離、
乳からのホルモンの分離、
乳清からのホルモンの分離、
初乳(clostrum)からのホルモンの分離、
腹水からのホルモンの分離、
組織からのホルモンの分離、
ウイルス培養物からの糖タンパク質の分離、
細菌、酵母、菌類、昆虫細胞、または動物細胞の糖タンパク質含有培養物からの糖タンパク質の分離、
血清からの糖タンパク質の分離、
血漿または血漿画分からのからの糖タンパク質の分離、
全血からの糖タンパク質の分離、血漿からの糖タンパク質の分離、
血清からの糖タンパク質の分離、
乳からの糖タンパク質の分離、乳清からの糖タンパク質の分離、
初乳(clostrum)からの糖タンパク質の分離、
腹水からの糖タンパク質の分離、および
組織からの糖タンパク質の分離、
からなる群から選択される分離を行うために実施される、請求項1に記載の方法。
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