KR101974676B1 - 크로마토그래픽 정제 방법 및 장치 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 단지 3 개의 분리 유닛들만 필요로 하는 연속 크로마토그래피 프로세스에 적합한 방법 및 장치에 관한 것이다. 프로세스는 2 개의 크로마토그래픽 단계를 포함하는 2 단계 절차이다. 제 1 크로마토그래픽 단계 (포집) 는 2 개의 분리 유닛들에서 교번적으로, 순차적으로 수행되고, 제 2 크로마토그래픽 단계 (연마) 는 제 3 유닛에서 또한 순차적으로 수행된다.

Description

크로마토그래픽 정제 방법 및 장치{METHOD AND APPARATUS FOR CHROMATOGRAPHIC PURIFICATION}
본 발명은 단지 3 개의 분리 유닛들만 필요로 하는 연속 크로마토그래피 프로세스에 적합한 방법 및 장치에 관한 것이다. 프로세스는 2 개의 크로마토그래픽 단계를 포함하는 2 단계 절차이다. 제 1 크로마토그래픽 단계 (포집) 는 바람직하게 2 개의 분리 유닛들에서 교번적으로, 순차적으로 수행되고, 제 2 크로마토그래픽 단계 (연마) 는 제 3 유닛에서 또한 순차적으로 수행된다.
단백질의 대규모 경제적인 정제는 생명공학과 제약 산업에 점점 더 중요한 문제이다. 전형적으로, 단백질은 그 단백질에 대한 유전자를 포함한 재조합형 플라스미드의 삽입에 의해 목적 단백질을 생성하도록 조작된 포유류 또는 박테리아 세포계 중 어느 하나를 사용해 세포 배양에 의해 생성된다. 사용된 세포계는 생물이므로, 그것은 보통 동물 혈청의 조제물로부터 공급되는 당, 아미노산, 및 성장 인자를 함유한 복잡한 성장 배지와 함께 공급되어야 한다. 세포로 공급되는 화합물의 혼합물로부터 그리고 세포 자체의 부산물로부터 원하는 단백질을 인간 치료용으로 사용하기에 충분한 순도로 분리하는 것은 엄청난 도전과제를 제기한다.
세포 부스러기로부터 단백질 정제 절차는 초기에는 단백질의 발현 사이트에 의존한다. 일부 단백질은 세포로부터 주위의 성장 배지로 직접 분비되도록 되어있고; 다른 단백질은 세포 내에서 만들어진다. 후자의 단백질에 대해, 정제 프로세스의 제 1 단계는, 기계적 전단, 삼투압 충격, 또는 효소 처리를 포함한, 다양한 방법들에 의해 수행될 수 있는, 세포의 용해 (lysis) 를 포함한다. 이러한 분열 (disruption) 은 세포의 전체 내용물을 호모제네이트로 방출하고, 게다가 작은 크기 때문에 제거하기에 어려운 준세포 단편을 발생시킨다. 이것은 일반적으로 원심 분리에 의해 또는 여과에 의해 제거된다. 더 작은 규모일지라도, 단백질 생산 시행 중 세포의 자연 사망과 세포 내 호스트 세포 단백질의 방출로 인한 직접 분비된 단백질 때문에 동일한 문제점이 발생한다.
결과적으로, 현재 사용되는 전형적 정제 프로세스는 다음 단계들을 포함한다:
- 세포 내 단백질을 회수하는 세포 용해 또는 분비 단백질인 경우 배지로부터 단백질의 회수
- 목적 단백질을 함유한 정화된 샘플을 얻기 위해서 예컨대 분별 원심 분리 또는 여과를 사용한 세포 부스러기의 제거
- 샘플에서 다른 단백질과 다양한 다른 불순물로부터 목적 단백질을 분리하도록 다단계 프로세스에서 다양한 크로마토그래피 배지의 사용.
크로마토그래픽 기법은 전형적으로 단백질 혼합물을 그것의 전하, 소수성 정도, 또는 크기를 기반으로 분리한다. 여러 가지 상이한 크로마토그래피 수지는 이 기법 각각에 이용가능하여서, 포함된 특정 단백질로 정제 스킴의 정확한 맞춤을 허용한다. 이 분리 방법 각각의 본질은, 단백질이 다른 비율로 긴 탑을 내려오도록 되어서 그것이 추가로 탑으로 전달함에 따라 증가하는 물리적 분리를 달성하거나, 선택적으로 분리 배지에 부착된 후, 상이한 용매에 의해 차등적으로 용출될 수 있다는 것이다. 어떤 경우에, 불순물이 구체적으로 탑에 부착될 때 원하는 단백질이 불순물로부터 분리되고, 목적 단백질은 분리되지 않고, 즉 목적 단백질은 "관류 (flow-through)" 에 존재한다.
교환가능한 반대 이온의 이름을 따서 명명된 이온 교환 크로마토그래피는 이온화가능한 분자의 정제에 적용가능한 절차이다. 이온화된 분자는 고체상 지지 매트릭스에 부착된 반대로 대전된 분자를 갖는 대전된 군의 비특이적 정전기 상호작용을 기반으로 분리되어서, 고체상과 보다 강하게 상호작용하는 이온화된 분자를 지연시킨다. 각 유형의 이온화된 분자의 순 전하, 및 매트릭스에 대한 그것의 친화성은 대전된 군의 수, 각 군의 전하, 및 대전된 고체상 매트릭스와 상호작용에 대해 경쟁하는 분자의 성질에 따라 다르다. 이 차이는 이온 교환 크로마토그래피에 의한 다양한 분자 유형의 분해를 유발한다. 이온 교환 크로마토그래피를 사용하는 전형적 단백질 정제에서, 포유류 세포 배양에서처럼, 호스트 세포로부터 유도된 많은 단백질의 혼합물은 이온 교환 탑에 적용된다. 비바인딩 분자가 세척됨에 따라, 예로 고체상으로부터 비특이적으로 리테이닝되거나 지연된 이온화된 목적 단백질을 방출시키기 위해서 단계 또는 구배 모드로 pH, 반대 이온 농도 등을 바꾸고 그것을 상이한 전하 특징을 가지는 단백질로부터 분리함으로써 조건이 조절된다. 음이온 교환 크로마토그래피는 특정 분리 프로세스의 조건 및 pH 에서 고체상 매트릭스에 부착된 포지티브 대전된 분자와 상호작용을 위해 네거티브 반대 이온과 목적 음이온 분자의 경쟁을 포함한다. 반면에, 양이온 교환 크로마토그래피는 특정 분리 프로세스의 조건 및 pH 에서 고체상 매트릭스에 부착된 네거티브 대전된 분자에 대한 포지티브 반대 이온과 목적 양이온 분자의 경쟁을 포함한다. 혼합 모드 이온 교환 크로마토그래피는 동일한 단계에서 양이온 및 음이온 교환 크로마토그래픽 배지의 조합물 사용을 포함한다. 특히, "혼합 모드" 는 양이온 교환 및/또는 음이온 교환 및 소수성 상호작용 모이어티의 혼합물이 공유결합으로 부착된 고체상 지지 매트릭스를 지칭한다.
정제될 단백질과 고정화 포집제 사이의 특정한 구조 의존적인 (즉, 공간적으로 상보적인) 상호작용을 이용하는 친화성 크로마토그래피는 항체와 같은 일부 단백질을 위한 표준 정제 옵션이다. 예를 들어, 단백질 A 는 Fc 영역을 함유하는, 항체와 같은, 단백질의 친화성 크로마토그래피를 위한 유용한 흡착제이다. 단백질 A 는 항체의 Fc 영역에 높은 친화성 (약 10-8M ~ 인간 IgG) 을 가지고 바인딩되는 황색 포도상구균으로부터의 4 1kD 세포벽 단백질이다. 그것의 통상적인 사용에도 불구하고, 친화성 크로마토그래피는 특히 치료 단백질을 정제하는데 필요한 산업상 규모에서 많은 비용이 든다.
또한 크로마토그래픽 방법은 수산화인회석 크로마토그래피 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 이다.
그 결과, 전형적 정제 프로세스는 상이한 원심 분리 및 여과 단계뿐만 아니라 적어도 3 개의 크로마토그래픽 분리 기법, 예로 친화성 크로마토그래피 (AC), 겔 투과 크로마토그래피 (GPC), 이온 교환 크로마토그래피 (IEC), 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC), 역상 크로마토그래피 (RPC), 및 정상 크로마토그래피 (NPC) 를 포함한다. 보통 각각의 명명된 기법은 크로마토그래픽 분리 실시 전 샘플 조제를 이끄는 상이한 작동 (버퍼, pH, 전도율) 조건들을 요구한다. 하나의 정제 트레인에서 다양한 크로마토그래픽 모드의 직접 조합에 의해 정제 단계들 사이에 샘플 폴딩/조제 단계들을 제거함으로써 보다 효율적이고 경제적인 정제 프로세스가 달성될 수도 있다.
간단한 배치 (batch) 크로마토그래피 기법은 산업상 적용에 잘 받아들여지지만, 이 기술은 긴 프로세싱 시간과 높은 작동 비용 (예컨대, 다량의 용매, 값비싼 수지와 하드웨어) 때문에 많은 비용이 든다. 이 기법은 또한 작동 조건 (예컨대, 생성물 역가 (titer), 체류 시간 및 공급 비율 (80% 동적 바인딩 용량 값으로부터 시작하는 생성물 손실) 에 민감하다.
일부 대안적인 반연속 기술이 또한 개발되었고, 그것은 2 가지 또는 3 가지 상이한 크로마토그래피 모드를 연결하지만, 연속 공급을 가지는 것을 허용하지 않음을 의미한다.
WO 2011/037522 는 출구를 입구에 연결시키는 적어도 2 개의 분리 유닛을 포함하는 분리 시스템을 개시한다. 모든 탑들은 일렬로 연결된다.
WO 2011/017514 는 탱크 또는 버퍼 교환 단계를 유지할 필요없이 친화성 크로마토그래피 단계와 2 개의 이온 교환 크로마토그래피 단계의 조합을 개시한다.
그러나, 보다 효율적이고 경제적인 해결책이 여전히 필요하다.
놀랍게도, 분리 유닛들 (탑들) 의 연결을 가능하게 할 뿐만 아니라 연속 공급을 가능하게 하는 시스템을 발견하였다. 이것은 적어도 2 개의 포집 탑들을 제공함으로써 달성된다.
따라서, 본 발명은,
- 동일한 크로마토그래피 매트릭스를 둘다 가지는 2 개의 분리 유닛들 (A1 및 A2) 과, 상기 분리 유닛 (A1) 및 상기 분리 유닛 (A2) 의 상기 크로마토그래피 매트릭스와 상이한 크로마토그래피 매트릭스를 가지는 분리 유닛 (B) 으로서, 모든 분리 유닛들은 유체 입구와 유체 출구를 가져서, 상기 분리 유닛 (A1) 의 상기 유체 출구와 상기 분리 유닛 (B) 의 상기 유체 입구 사이에 적어도 유체 연결부가 있고, 그리고 상기 분리 유닛 (A2) 의 상기 유체 출구와 상기 분리 유닛 (B) 의 상기 유체 입구 사이에 유체 연결부가 있는 (도 2, 도 3 및 도 4 의 연결 라인 C-P), 상기 분리 유닛들,
- 분리 유닛 (A1) 의 유체 출구와 분리 유닛 (B) 의 유체 입구 사이의 유체 연통부와 분리 유닛 (A2) 의 유체 출구와 분리 유닛 (B) 의 유체 입구 사이의 유체 연통부 사이에서 스위칭하도록 허용하는 분리 유닛들 (A1, A2) 과 분리 유닛 (B) 사이의 유체 연결부 내 적어도 하나의 밸브,
- 적어도 2 개의 버퍼 리저버들 및 적어도 2 개의 펌프들로서, 상기 버퍼 리저버들은 분리 유닛들 (A1, A2) 의 입구들과 적어도 유체 연결되고, 상기 펌프들은 리저버들로부터 분리 유닛들로 액체를 수송하는데 사용되는, 상기 버퍼 리저버들 및 펌프들,
- 상기 분리 유닛들 (A1, A2) 의 입구와 유체 연결되는 샘플 용액 (샘플 공급물) 을 포함하는 리저버를 포함하는 장치에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 상기 분리 유닛들 (A1, A2) 은 친화성 크로마토그래피, 양이온 교환, 음이온 교환 크로마토그래피 매트릭스 또는 혼합 모드 양이온 교환 매트릭스를 갖는다.
다른 실시형태에서, 분리 유닛 (B) 은 양이온 교환, 혼합 모드 음이온 교환 또는 음이온 교환 크로마토그래피 매트릭스를 갖는다.
다른 실시형태에서, 분리 유닛 (B) 은 양이온 교환 및 음이온 교환 크로마토그래피 매트릭스 또는 양이온 및 혼합 모드 음이온 교환 매트릭스 또는 혼합 모드 양이온 교환 매트릭스 및 음이온 교환 매트릭스를 포함하는 매트릭스의 혼합물을 갖는다.
바람직한 실시형태에서, 분리 유닛 (A1, A2) 은 친화성 크로마토그래피 매트릭스를 가지고 분리 유닛 (B) 은 양이온 교환 크로마토그래피 매트릭스를 갖는다.
다른 바람직한 실시형태에서, 분리 유닛들 (A1, A2) 은 친화성 크로마토그래피 매트릭스를 가지고 분리 유닛 (B) 은 음이온 교환 또는 혼합 모드 음이온 교환 크로마토그래피 매트릭스를 갖는다.
다른 실시형태에서, 분리 유닛 (A1, A2) 은 친화성 크로마토그래피 매트릭스를 가지고 분리 유닛 (B) 은 음이온 교환 및 양이온 교환 크로마토그래피 매트릭스의 혼합물을 갖는다.
다른 실시형태에서, 분리 유닛 (A1, A2) 은 친화성 크로마토그래피 매트릭스를 가지고 분리 유닛 (B) 은 음이온 교환 및 혼합 모드 양이온 교환 크로마토그래피 매트릭스의 혼합물 또는 양이온 교환 및 혼합 모드 음이온 교환 크로마토그래피 매트릭스의 혼합물 또는 혼합 모드 양이온 교환 및 혼합 모드 음이온 교환 크로마토그래피 매트릭스의 혼합물을 갖는다.
다른 바람직한 실시형태에서, 분리 유닛 (A1, A2) 은 양이온 교환 또는 혼합 모드 양이온 교환 크로마토그래피 매트릭스를 가지고 분리 유닛 (B) 은 음이온 교환 또는 혼합 모드 음이온 교환 크로마토그래피 매트릭스를 갖는다.
다른 실시형태에서, 분리 유닛 (A1, A2) 은 음이온 교환 또는 혼합 모드 음이온 교환 크로마토그래피 매트릭스를 가지고 분리 유닛 (B) 은 양이온 교환 또는 혼합 모드 양이온 교환 크로마토그래피 매트릭스를 갖는다.
다른 바람직한 실시형태에서, 2 개의 분리 유닛 (A1, A2) 모두 분리 유닛 출구에 적어도 하나의 유체 선택 밸브를 가져서, 분리 유닛 (A1, A2) 의 출구에서 유체 선택 밸브의 적어도 하나의 채널은 (연결 라인을 통하여) 분리 유닛 (B) 의 입구와 연결되어, 분리 유닛 (A1) 과 분리 유닛 (B) 사이 및 분리 유닛 (A2) 과 분리 유닛 (B) 사이 유체 연통부의 제어 (시작 및 정지) 를 가능하게 한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 분리 유닛 (B) 은 분리 유닛 출구에 유체 선택 밸브를 갖는다.
다른 바람직한 실시형태에서, 분리 유닛 (A1, A2) 둘다 분리 유닛 입구에 적어도 하나의 유체 선택 밸브를 갖는다.
바람직한 실시형태에서, 장치는 분리 유닛 (A1) 의 유체 출구와 분리 유닛 (A2) 의 유체 입구 사이 연결 라인, 및 분리 유닛 (A2) 의 유체 출구와 분리 유닛 (A1) 의 유체 입구 사이 연결 라인 (도 2, 도 3 및 도 4 에서 연결 라인들 (F-F)) 을 더 포함하여서, 분리 유닛 (A1) 의 출구와 분리 유닛 (A2) 의 입구 사이 유체 연통뿐만 아니라 분리 유닛 (A2) 의 출구와 분리 유닛 (A1) 의 입구 사이 유체 연통을 가능하게 한다. 매우 바람직한 실시형태에서, 적어도 하나의 밸브는 분리 유닛 (A1) 의 출구와 분리 유닛 (A2) 의 입구 사이 연결 라인에 위치하고 적어도 하나의 밸브는 분리 유닛 (A2) 의 출구와 분리 유닛 (A1) 의 입구 사이 연결 라인에 위치한다. 전형적으로, 밸브는 분리 유닛 (A1, A2) 의 출구 가까이에 그리고/또는 분리 유닛 (A1, A2) 의 입구 가까이에 위치한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 장치는 분리 유닛 (A1) 의 유체 출구와 분리 유닛 (A2) 의 유체 입구 사이에 2 개의 연결 라인, 및 분리 유닛 (A2) 의 유체 출구와 분리 유닛 (A1) 의 유체 입구 사이에 2 개의 연결 라인 (도 4 에서 연결 라인들 (F-F, W-F)) 을 포함하여서, 분리 유닛 (A1) 의 출구와 분리 유닛 (A2) 의 입구 사이 유체 연통뿐만 아니라 분리 유닛 (A2) 의 출구와 분리 유닛 (A1) 의 입구 사이 유체 연통을 가능하게 한다. 매우 바람직한 실시형태에서, 밸브는 분리 유닛 (A1, A2) 의 입구와 출구 가까이에 위치하고 연결 라인은 이 밸브에서 시작한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 적어도 2 개의 버퍼 리저버는 분리 유닛 (A1, A2) 의 입구와 유체 연결된다. 하나 이상의 밸브 및/또는 부가적 유체 입구는 버퍼 리저버와 분리 유닛 (A1, A2) 의 입구 사이 연결 라인에 위치될 수도 있다.
다른 바람직한 실시형태에서, 장치는 분리 유닛 (A2, A1) 의 유체 입구 앞, 바람직하게 분리 유닛 (A2) 의 유체 출구와 분리 유닛 (A1) 의 유체 입구 사이 연결 라인 앞 및 분리 유닛 (A1) 의 유체 출구와 분리 유닛 (A2) 의 유체 입구 사이 연결 라인 앞에 하나 이상의 부가적 유체 입구를 더 포함한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 장치는 분리 유닛 (B) 의 유체 입구 앞에 부가적 유체 입구를 포함하고, 그것은 바람직하게 하나 이상의 리저버로 연결 라인이 분리 유닛 (A1, A2) 의 출구와 분리 유닛 (B) 의 입구 사이 연결 라인에서 분리 유닛 (B) 의 유체 입구 앞에 위치하는 것을 의미한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 장치는 3 개의 분리 유닛 중 하나의 입구와 적어도 유체 연결되는 바이러스 불활성화 버퍼를 구비한 부가적 리저버를 포함한다.
본 발명은 또한 샘플 중 한 가지 이상의 불순물로부터 타겟 분자를 정제하는 연속 방법에 관한 것으로, 이 방법은,
- 상기 샘플이 상기 타겟 분자를 분리 유닛 (A1) 에 바인딩시킬 수 있는 전도율 및 제 1 pH 로 있는 분리 유닛 (A1) 에 상기 샘플이 로딩되는 동안, 상기 분리 유닛 (A2) 은 적어도 부분적으로 상기 분리 유닛 (B) 과 유체 연통하여서 분리 유닛 (A2) 에 로딩된 상기 타겟 분자가 분리 유닛 (B) 으로 용출되고 상기 분리 유닛 (A2) 은 재평형화되고 상기 샘플이 상기 타겟 분자를 상기 분리 유닛 (A2) 에 바인딩시킬 수 있는 전도율 및 제 1 pH 로 있는 상기 분리 유닛 (A2) 에 상기 샘플이 로딩되는 동안, 상기 분리 유닛 (A1) 은 적어도 부분적으로 상기 분리 유닛 (B) 과 유체 연통하여서 상기 타겟 분자가 분리 유닛 (B) 으로 용출되고 상기 분리 유닛 (A1) 은 재평형화되도록 상기 분리 유닛들 (A1, A2) 에 상기 샘플을 교번적으로 로딩하는 단계,
- 상기 분리 유닛 (B) 의 유체 출구로부터 상기 타겟 분자를 회수하는 단계를 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 타겟 분자는 항체이다.
바람직한 실시형태에서, 샘플은 분리 유닛 (A1) 또는 분리 유닛 (A2) 중 어느 하나로 교번적으로 연속적으로 로딩된다.
다른 실시형태에서, 분리 유닛 (A1, A2) 은 바인드 및 용출 모드에서 가동되고 분리 유닛 (B) 은 관류 모드에서 가동된다.
다른 바람직한 실시형태에서, 분리 유닛 (A1) 으로 샘플을 로딩하는 동안 분리 유닛 (A1) 의 유체 출구는 분리 유닛 (A2) 의 유체 입구와 적어도 부분적으로 유체 연통하여서 분리 유닛 (A1) 으로부터 타겟 분자의 침출을 시작하는 포집물이 분리 유닛 (A2) 에 바인딩될 수 있도록 한다. 그리고, 분리 유닛 (A2) 으로 샘플을 로딩하는 동안 분리 유닛 (A2) 의 유체 출구는 바람직하게 분리 유닛 (A1) 의 유체 입구와 적어도 부분적으로 유체 연통하여서 분리 유닛 (A2) 으로부터 타겟 분자의 침출을 시작하는 포집물이 분리 유닛 (A1) 에 바인딩될 수 있도록 한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 분리 유닛 (A1) 으로부터 바인딩되지 않은 샘플을 세척하는 동안, 분리 유닛 (A2) 은 샘플 용액을 포함한 리저버 및 분리 유닛 (A1) 과 적어도 부분적으로 유체 연통한다. 그것은, 분리 유닛 (A2) 이 분리 유닛 (A1) 으로부터 용출된 바인딩되지 않은 샘플 및 리저버로부터 나온 샘플 용액으로 동시에 로딩되는 것을 의미한다.
분리 유닛 (A2) 으로부터 바인딩되지 않은 샘플을 세척하는 동안, 분리 유닛 (A1) 은 샘플 용액을 포함한 리저버 및 분리 유닛 (A2) 과 유체 연통한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 분리 유닛 (B) 이 분리 유닛 (A1) 과 유체 연통하면서, 그것은 또한 버퍼 리저버와 유체 연통한다.
그리고 분리 유닛 (B) 이 분리 유닛 (A2) 과 유체 연통하면서, 그것은 또한 버퍼 리저버와 유체 연통한다.
바람직한 실시형태에서, 타겟 분자를 유닛에 로딩한 후 바이러스 불활성화 버퍼가 분리 유닛 (A1, A2) 을 통하여 펌핑된다.
다른 실시형태에서, 분리 유닛 (B) 이 바인드/용출 모드에서 가동된다면, 타겟 분자를 유닛에 로딩한 후 바이러스 불활성화 버퍼가 분리 유닛 (B) 을 통하여 펌핑된다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 방법을 부여받는 샘플은 정화된 샘플이다. 그것은, 분리 유닛 (A1 또는 A2) 에 샘플을 로딩하기 전 다음: 원심 분리, 여과 및/또는 침강 중 하나 이상을 부여받음으로써 샘플이 정화되는 것을 의미한다. 매우 바람직한 실시형태에서, 샘플은 원심 분리, 여과 및/또는 침강에 의한 정화 전 침전제로 처리된다.
도 1 은 본 발명에 따른 장치의 바람직한 실시형태의 개략도로서, 2 개의 포집 분리 유닛 (CIEX), 하나의 연마 분리 유닛 (AIEX), 리저버 (CIP, VI, E.A, E.B, Dil., Feed, CIP, E.A, E.B) 뿐만 아니라 연결 라인, 밸브, 펌프 및 검출기를 나타낸다.
도 2, 도 3 및 도 4 는 본 발명에 따른 장치의 상이한 실시형태의 개략도로서, 도 2 는 주로 필수적 특징에 한정되지만 예컨대 분리 유닛 (B) 앞에 부가적 유체 입구 (입구 (C)) 를 가지는 구성을 나타나고, 도 3 은 분리 유닛 (A1) 의 출구와 분리 유닛 (A2) 의 입구 사이 유체 연결뿐만 아니라 분리 유닛 (A2) 의 출구와 분리 유닛 (A2) 의 입구 사이 유체 연결 (연결 라인 F-F) 을 부가적으로 포함하는 구성을 나타내고, 도 4 는 분리 유닛 (A1) 의 출구와 분리 유닛 (A2) 의 입구 사이 유체 연결뿐만 아니라 분리 유닛 (A2) 의 출구와 분리 유닛 (A1) 의 입구 사이 유체 연결을 허용하는 2 개의 연결 라인을 구비한 구성을 나타낸다 (연결 라인 F-F, 연결 라인 W-F).
도 5 는 3 개의 포집 분리 유닛 (A1, A2, A3) 및 2 개의 연마 분리 유닛 (B1, B2) 을 구비한 본 발명에 따른 장치의 실시형태를 나타낸다.
정의
본 발명을 상세히 설명하기 전, 본 발명은 특정한 조성 또는 프로세스 단계에 제한되지 않고, 이와 같이 달라질 수도 있음을 이해해야 한다. 본 명세서와 첨부된 청구항에 사용된 것처럼, 단수 형태의 부정관사와 정관사는 본문에서 명확히 달리 지시되지 않는 한 복수의 대상물을 포함하는 것에 주목해야 한다. 따라서, 예를 들어, "리간드" 에 대한 언급은 복수의 리간드를 포함하고 "항체" 에 대한 언급은 복수의 항체 등을 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 관련된 본 기술분야의 당업자가 통상적으로 이해하고 있는 바와 동일한 의미를 가지고 있다. 다음 용어들은 본원에 설명되는 바와 같이 본 발명을 위해 정의된다.
본원에 사용되는 것처럼 용어 "타겟 분자" 는, 샘플 중 하나 이상의 불순물로부터 격리, 분리 또는 정제될 임의의 분자, 물질 또는 그것의 화합물 또는 혼합물을 지칭한다. 바람직한 실시형태에서, 타겟 분자는 단백질 또는 2 가지 이상의 단백질의 혼합물이다. 매우 바람직한 실시형태에서, 타겟 분자는 항체이다.
용어 "항체" 는 항원에 특히 바인딩할 수 있는 능력을 가지는 단백질을 지칭한다. 전형적으로, 항체는 2 개의 무거운 체인과 2 개의 가벼운 체인으로 이루어진 기본 4-폴리펩티드 체인 구조를 가지고 있고, 상기 체인은 예를 들어 체인간 이황화물 본드에 의해 안정화된다. 항체는 단일클론 또는 다클론일 수도 있고 모노머 또는 폴리머 형태, 예를 들어, 펜타머 형태로 존재하는 IgM 항체 및/또는 모노머, 다이머 또는 멀티머 형태로 존재하는 IgA 항체로 존재할 수도 있다. 항체는 또한 다특이적 항체 (예컨대, 이중특이 항체), 및 그것이 리테이닝되기만 하면 항체 단편을 포함할 수도 있고 또는 리간드-특정 바인딩 도메인을 포함하도록 변경된다. 용어 "단편" 은 온전하거나 완전한 항체 또는 항체 체인보다 적은 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체 체인 부분 또는 부를 지칭한다. 단편은 온전하거나 완전한 항체 또는 항체 체인의 화학적 또는 효소 처리를 통하여 얻을 수 있다. 단편은 또한 재조합 수단에 의해 얻을 수 있다. 재조합형으로 생성될 때, 단편은 단독으로 발현되거나 융합 단백질로 불리는 더 큰 단백질의 부분으로 발현될 수도 있다. 예시적인 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fc 및/또는 Fv 단편을 포함한다. 예시적인 융합 단백질은 Fc 융합 단백질을 포함한다. 본 발명에 따르면 융합 단백질은 또한 용어 "항체" 에 의해 포함된다.
위에서 검토한 대로, 일부 실시형태에서, 항체는 단백질, 예컨대, 면역 글로불린을 함유한 Fc 영역이다. 일부 실시형태에서, 단백질을 함유한 Fc 영역은 다른 폴리펩티드 또는 그것의 단편에 융합된 면역 글로불린의 Fc 영역을 포함하는 재조합형 단백질이다. 예시적인 폴리펩티드는, 예컨대, 레닌; 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬을 포함하는 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 리포 단백질; α-1-항트립신; 인슐린 α-체인; 인슐린 β-체인; 프로인슐린; 여포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체 형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자, 예로 인자 ⅧC, 인자 Ⅸ, 조직 인자, 및 폰 빌레브란트 인자; 항응고 인자, 예로 단백질 C; 심방 나트륨 이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성제, 예로 우로키나제 또는 인간 뇨 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성제 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-α 및 -β; 엔케팔리나아제; RANTES (활성화에 대한 조절성, 정상적으로 T- 세포 발현성이며 분비성); 인간 대식세포 염증 단백질 (MIP- 1-α); 혈청 알부민, 예로 인간 혈청 알부민; 뮬러리안 억제 물질; 릴랙신 α-체인; 릴랙신 β-체인; 프로릴랙신; 쥐 성샘자극호르몬 연관된 펩티드; 미생물 단백질, 예로 β-락타마아제; DNase; IgE; 세포독성 T-림프구 연관된 항원 (CTLA) (예컨대, CTLA-4); 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자를 위한 수용체; 단백질 A 또는 단백질 D; 류머티즘 인자; 뼈 유도된 신경 영양성 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT- 6) 과 같은 신경 영양성 인자, 또는 NGF-β 와 같은 신경 성장 인자; 혈소판-유도된 성장 인자 (PDGF); 섬유아세포 성장 인자, 예로 αFGF 및 βFGF; 표피 성장 인자 (EGF); TGF-βl, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, 또는 TGF-β5 를 포함하는, TGF-알파 및 TGF-β 와 같은 형질 전환 성장 인자 (TGF); 인슐린 유사 성장 인자-I 및 -Ⅱ (IGF-I 및 IGF-Ⅱ); des(l-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린 유사 성장 인자 바인딩 단백질 (IGFBPs); CD 단백질, 예로 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD34, 및 CD40; 에리스로포이에틴; 뼈유도성 인자; 면역독소; 뼈 형성 단백질 (BMP); 인터페론, 예로 인터페론-α, -β, 및 -γ; 콜로니자극 인자 (CSFs), 예컨대, M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF; 인터류킨 (ILs), 예컨대, IL-I 내지 IL-IO; 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 촉진 인자; 예를 들어, AIDS 엔벨로프의 일부와 같은 바이러스성 항원; 수송 단백질; 귀소 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 인테그린, 예로 CDl Ia, CDl Ib, CDl Ic, CD 18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 종양 연관된 항원, 예로 HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 및 임의의 전술한 폴리펩티드의 단편 및/또는 변이체를 포함한다. 게다가, 본 발명에 따른 항체는 특히 임의의 전술한 폴리펩티드에 바인딩되는 임의의 단백질 또는 폴리펩티드, 단편 또는 그것의 변이체이다.
본원에 사용되는 것처럼, 달리 설명되지 않으면, 용어 "샘플" 은 타겟 분자를 함유한 임의의 조성물 또는 혼합물을 지칭한다. 샘플은 생물학적 또는 다른 소스로부터 유도될 수도 있다. 생물학적 소스는 식물 및 동물 세포, 조직 및 기관과 같은 진핵생물 및 원핵생물 소스를 포함한다. 샘플은 타겟 분자와 혼합된 것으로 발견되는 희석제, 버퍼, 세제, 및 오염 종, 부스러기 등을 또한 포함할 수도 있다. 샘플은 "부분적으로 정제" 될 수도 있고 (즉, 여과 단계와 같은 하나 이상의 정제 단계를 부여받음) 또는 타겟 분자를 생성하는 호스트 세포 또는 유기체로부터 직접 얻을 수도 있다 (예컨대, 샘플은 채취된 세포 배양 유체를 포함할 수도 있음).
본원에 사용되는 것처럼, 용어 "불순물" 또는 "오염 물질" 은, 본 발명의 프로세스를 사용해 하나 이상의 이질적인 (foreign) 또는 불쾌한 분자로부터 분리되고 있는 타겟 분자를 함유한 샘플에 존재할 수도 있는 DNA, RNA, 하나 이상의 호스트 세포 단백질, 내독소, 지질 및 하나 이상의 첨가제와 같은 생물학적 거대 분자를 포함하는 임의의 이질적인 또는 불쾌한 분자를 지칭한다. 부가적으로, 이러한 불순물은 본 발명의 방법 전에 발생할 수도 있는 단계에서 사용되는 임의의 시약을 포함할 수도 있다.
본원에서 교환적으로 사용되는 것처럼, 용어 "정제", "분리" 또는 "격리" 는 타겟 분자와 하나 이상의 불순물을 포함하는 조성 또는 샘플로부터 타겟 분자의 순도 정도를 증가시키는 것을 지칭한다. 전형적으로, 타겟 분자의 순도 정도는 조성물로부터 적어도 하나의 불순물을 (완전히 또는 부분적으로) 제거함으로써 증가된다.
본원에서 교환적으로 사용되는 것처럼, 용어 "관류 프로세스", "관류 모드", 및 "관류 크로마토그래피" 는, 적어도 하나의 잠재적 오염 물질 또는 불순물이 크로마토그래픽 수지 또는 배지에 바인딩하는 동안, 하나 이상의 오염 물질과 함께 샘플에 함유된 적어도 하나의 생성물 (예컨대, 단백질을 함유한 Fc 영역) 이 크로마토그래픽 수지 또는 배지를 통하여 유동하도록 된 생성물 분리 기법을 지칭한다. "관류 모드" 는 일반적으로 등용매 작동 (즉, 이동상의 조성이 바뀌지 않는 크로마토그래피 프로세스) 이다.
본원에 기술한 실시예에서 설명한 대로 주장된 방법에 따른 일부 실시형태에서, 본 방법은 예컨대 관류 모드로 수행되는 음이온 및/또는 양이온 교환 크로마토그래피 단계를 이용한다.
본원에서 교환적으로 사용되는 것처럼, 용어 "바인드 및 용출 모드" 및 "바인드 및 용출 프로세스" 는, 샘플 (예컨대, 단백질을 함유한 Fc 영역) 에 함유된 적어도 하나의 생성물 (타겟 분자) 은 크로마토그래픽 수지 또는 배지에 바인딩된 후 용출되는 생성물 분리 기법을 지칭한다.
본원에 사용되는 것처럼, 본원에 사용된 용어 "리저버" 는, 본 발명의 방법을 수행할 때 사용될 임의의 버퍼 또는 본 발명의 방법에 사용될 그 밖의 다른 액체를 저장하는데 사용될 수도 있는 임의의 컨테이너, 탱크 또는 백을 지칭한다. 부가적으로, "리저버" 는 프로세스 단계의 아웃풋 (예컨대, 탑으로부터 용출액) 을 수집하는데 사용되는 임의의 컨테이너, 탱크 또는 백이다.
본원에 사용되는 것처럼, 용어 "인라인 희석" 은, 많은 종래의 프로세스에서 전형적으로 유지 탱크의 사용에 대한 대안예인 버퍼 교환 단계 또는 인라인 용액 조건 조정을 지칭한다. 전형적인 인라인 희석에서, 2 가지 용액은 파이프 또는 혼합 용기, 여과 기기 또는 장치에서 용액 블렌딩을 사용해 이송 중 혼합되거나 적정될 수 있다. 예를 들어, 용액을 다른 저 전도율 용액과 블렌딩함으로써 전도율을 감소시키기 위해서 용액이 희석되도록 요구될 수도 있다. 버퍼 교환은 희석여과, 초여과 등과 같은 여과 기기의 도움으로 달성될 수 있다. 주장된 발명에 따른 일부 실시형태에서, 본 방법은 버퍼 교환 단계의 필요성을 없애는 개선된 단백질 정제 프로세스를 제공한다.
용어 "크로마토그래피" 는, 혼합물 중에 존재하는 다른 분자로부터 목적 분석물질 (예컨대, 타겟 분자) 을 분리하는 임의의 종류의 기법을 지칭한다. 보통, 혼합물의 개별 분자가 이동상의 영향하에 또는 바인드 및 용출 프로세스에서 고정 배지를 통하여 이동하는 비율의 차이 때문에 타겟 분자는 다른 분자와 분리된다.
용어 "매트릭스" 또는 "크로마토그래피 매트릭스" 는 본원에서 교환적으로 사용되고 분리 프로세스에서 혼합물 중 존재하는 다른 분자로부터 타겟 분자 (예컨대, 면역 글로불린과 같은 단백질을 함유한 Fc 영역) 를 분리하는 임의의 종류의 흡수제, 수지 또는 고체상을 지칭한다. 보통, 혼합물의 개별 분자가 이동상의 영향하에 또는 바인드 및 용출 프로세스에서 매트릭스를 통하여 이동하는 비율의 차이 때문에 타겟 분자는 다른 분자와 분리된다. 비제한적인 실시예들은, 탑 또는 카트리지 (cartriges) 에 놓일 수 있는 막뿐만 아니라 미립자, 모놀리식 또는 섬유 수지를 포함한다. 매트릭스를 형성하기 위한 재료의 예는 다당류 (예로, 아가로스 및 셀룰로오스); 및 다른 기계적으로 안정된 매트릭스, 예로 실리카 (예컨대, 제어된 기공 유리), 폴리(스티렌디비닐)벤젠, 폴리아크릴아미드, 세라믹 입자 및 전술한 임의의 물질의 유도체를 포함한다. 본 발명의 방법에 적합한 전형적 매트릭스 유형의 예로는 양이온 교환 수지, 친화성 수지, 음이온 교환 수지 또는 혼합 모드 수지가 있다.
"리간드" 는, 크로마토그래피 매트릭스에 부착되고 매트릭스의 바인딩 특성을 결정하는 관능기이다. "리간드" 의 예로는 이온 교환기, 소수성 상호작용기, 친수성 상호작용기, 황친화성 상호작용기, 금속 친화성기, 친화성기, 생체친화성기, 및 혼합 모드기 (전술한 것의 조합물) 를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에 사용될 수 있는 일부 바람직한 리간드는 강한 양이온 교환기, 예로 술포프로필, 술폰산; 강한 음이온 교환기, 예로 트리메틸암모늄 염화물; 약한 양이온 교환기, 예로 카르복실산; 약한 음이온 교환기, 예로 N5N 디에틸아미노 또는 DEAE; 소수성 상호작용기, 예로 페닐, 부틸, 프로필, 헥실; 및 친화성기, 예로 단백질 A, 단백질 G, 및 단백질 L 을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 "친화성 크로마토그래피" 는, 타겟 단백질 (예컨대, 목적 단백질 또는 항체를 함유한 Fc 영역) 이 타겟 단백질에 특정한 리간드에 특히 바인딩되는 단백질 분리 기법을 지칭한다. 이러한 리간드는 일반적으로 생물 특정 리간드로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 생물 특정 리간드 (예컨대, 단백질 A 또는 그것의 기능성 변이체) 는 크로마토그래피 매트릭스 재료에 공유결합으로 부착되고 용액이 크로마토그래피 매트릭스에 접촉함에 따라 용액 중 타겟 단백질에 접근가능하다. 타겟 단백질은 일반적으로 크로마토그래픽 단계 동안 생물 특정 리간드를 위한 특정한 바인딩 친화성을 리테이닝하고, 혼합물 중 다른 용질 및/또는 단백질은 뚜렷이 또는 특히 리간드에 바인딩하지 않는다. 고정화 리간드에 타겟 단백질의 바인딩은 오염 단백질 또는 단백질 불순물이 크로마토그래피 매트릭스를 통과할 수 있도록 허용하고 타겟 단백질은 고체상 재료에서 고정화 리간드에 특히 바인딩되어 유지된다. 특히 바인딩된 타겟 단백질은 그 후 적합한 조건 (예컨대, 낮은 pH, 높은 pH, 높은 염, 경쟁 리간드 등) 하에 고정화 리간드로부터 활성 형태로 제거되고, 앞서 탑을 통과하도록 허용된 오염 단백질 또는 단백질 불순물 없이, 용출 버퍼를 갖는 크로마토그래픽 탑을 통과한다. 임의의 성분은 각각의 특정 바인딩 단백질, 예컨대 항체를 정제하기 위한 리간드로서 사용될 수 있다. 하지만, 본 발명에 따른 다양한 방법에서, 단백질 A 는 타겟 단백질을 함유한 Fc 영역을 위한 리간드로서 사용된다. 타겟 단백질 (예컨대, 단백질을 함유한 Fc 영역) 의 생물 특정 리간드 (예컨대, 단백질 A) 로부터 용출 조건은 본 기술분야의 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 단백질 G 또는 단백질 L 또는 그것의 기능성 변이체는 생물 특정 리간드로서 사용될 수도 있다. 일부 실시형태에서, 단백질 A 와 같은 생물 특정 리간드는, 단백질을 함유한 Fc 영역으로 바인딩, 세척 또는 생물 특정 리간드/타겟 단백질 콘쥬게이트 재평형화를 위해 5 ~ 9 의 pH 범위에서 사용되고, 적어도 하나의 염을 함유한 약 4 이하의 pH 를 가지는 버퍼로 용출이 뒤따른다.
용어 "이온 교환" 및 "이온 교환 크로마토그래피" 는, 목적 용질 또는 분석물질이
혼합물 중 목적 용질 또는 분석물질 (예컨대, 타겟 단백질을 함유한 Fc 영역) 이 혼합물 중 용질 불순물 또는 오염 물질보다 더 많이 또는 더 적게 대전된 화합물과 비특이적으로 상호작용하도록 혼합물 중 목적 용질 또는 분석물질이 고체상 이온 교환 재료에 링크된 (예로 공유 부착에 의함) 대전 화합물과 상호작용하는 크로마토그래픽 프로세스를 지칭한다. 혼합물 중 오염 용질은 목적 용질보다 더 빠르게 또는 더 느리게 이온 교환 재료의 탑으로부터 용출되거나 목적 용질에 대해 수지에 바인딩되거나 수지로부터 차단된다. "이온 교환 크로마토그래피" 는 특히 양이온 교환, 음이온 교환, 및 혼합 모드 이온 교환 크로마토그래피를 포함한다. 예를 들어, 양이온 교환 크로마토그래피는 타겟 분자 (예컨대, 타겟 단백질을 함유한 Fc 영역) 를 바인딩한 후 용출 (양이온 교환 바인드 및 용출 크로마토그래피 또는 "CIEX") 될 수 있고, 또는 타겟 분자가 탑 (양이온 교환 관류 크로마토그래피 FT- CIEX) 을 "관류" 하는 동안 불순물을 지배적으로 바인딩할 수 있다. 음이온 교환 크로마토그래피는 타겟 분자 (예컨대, 타겟 단백질을 함유한 Fc 영역) 를 바인딩한 후 용출될 수 있고, 또는 타겟 분자가 탑을 "관류" 하는 동안 불순물을 지배적으로 바인딩할 수 있다. 일부 실시형태에서 그리고 본원에 설명한 예시에서 보여주는 것처럼, 음이온 교환 크로마토그래피 단계는 관류 모드로 수행된다.
구 "이온 교환 매트릭스" 는 네거티브 대전된 (즉, 양이온 교환 수지) 또는 포지티브 대전된 (즉, 음이온 교환 수지) 크로마토그래피 매트릭스를 지칭한다. 예컨대 공유 링크에 의해 하나 이상의 대전된 리간드를 매트릭스에 부착함으로써 전하가 제공될 수도 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 전하는 매트릭스의 고유 특성 (예컨대, 실리카의 경우, 전체 네거티브 전하를 가짐) 일 수도 있다.
"양이온 교환 매트릭스" 는, 네거티브하게 대전되어서 고체상을 통하여 또는 위로 통과하는 수용액 중 양이온과 교환을 위해 유리 양이온을 가지는 크로마토그래피 매트릭스를 지칭한다. 양이온 교환 수지를 형성하도록 고체상에 부착되는 네거티브 대전된 리간드는, 예컨대, 카르복실레이트 또는 술포네이트일 수도 있다. 상업적으로 이용가능한 양이온 교환 수지는 아가로스에 고정된 카르복시-메틸-셀룰로오스, 술포프로필 (SP) (예컨대, Pharmacia 로부터의 SP-SEPHAROSE FAST FLOW™ 또는 SP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCE™) 및 아가로스에 고정된 술포닐 (예컨대 Pharmacia 로부터의 S-SEPHAROSE FAST FLOW™) 을 포함한다. Fractogel® EMD SO3, Fractogel® EMD SE Highcap, Eshmuno ® S and Fractogel ® EMD COO (Merck) 가 바람직하다.
"혼합 모드" 매트릭스는 타겟 분자 및/또는 불순물과 상호작용할 수 있는 적어도 2 가지 유형의 기능성을 지니는 크로마토그래피 매트릭스이다. 이러한 기능성은 이온 교환기, 소수성 상호작용기, 친수성 상호작용기, 황친화성 상호작용기, 금속 친화성기, 친화성기 및 생체친화성기일 수 있다. 본 발명에서 사용될 바람직한 혼합 모드 매트릭스는 적어도 음이온 교환 및 양이온 교환기를 지니는 매트릭스 또는 혼합 모드 이온 교환 매트릭스이다. 일 실시형태에서, "적어도 2 가지 유형의 기능성을 지닌다" 는 것은, 적어도 2 가지 유형의 상이한 기능성을 가지고 공유 결합하여 변경된 한 가지 유형의 매트릭스가 제공되는 것을 의미한다. 혼합 모드 매트릭스는 각각 적어도 하나의 기능성을 가지는 2 개 이상의 상이한 매트릭스의 조합물로 만들어져서, 하나의 분리 유닛에 매트릭스를 조합함으로써 조합물이 실현되는 것이 또한 가능하다. 이 경우에, 혼합 모드 매트릭스는, 각각의 매트릭스가 적어도 하나의 기능성을 지니는, 2 개의 상이한 매트릭스의 혼합물일 수 있고, 예를 들어 분리 유닛에서 용이하게 혼합될 수 있는 흡수제 입자의 형태로 둘다 존재하는, 예컨대 양이온 교환 매트릭스와 음이온 교환 매트릭스의 혼합물일 수 있다. 샘플 액체가 양쪽 매트릭스를 통하여 유동하도록 제 1 매트릭스로 충전된 하나의 탑과 제 2 매트릭스로 충전된 다른 탑을 하나의 분리 유닛에 결합하는 것이 또한 가능하다.
"혼합 모드 이온 교환 매트릭스" 는, 양이온 및/또는 음이온 및 소수성 모이어티와 공유 결합하여 변경된 크로마토그래피 매트릭스를 지칭한다. 상업적으로 이용가능한 혼합 모드 이온 교환 수지는 약한 양이온 교환기, 낮은 농도의 음이온 교환기, 및 실리카 겔 고체상 지지 매트릭스에 부착된 소수성 리간드를 함유한 BAKERBOND ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) 이다. 혼합 모드 양이온 교환 매트릭스는 전형적으로 양이온 교환기 및 소수성 모이어티를 갖는다. 적합한 혼합 모드 양이온 교환 매트릭스는 Capto® MMC (GE Healthcare) 및 Eshmuno ® HCX (Merck) 이다.
혼합 모드 음이온 교환 매트릭스는 전형적으로 음이온 교환기 및 소수성 모이어티를 갖는다. 적합한 혼합 모드 음이온 교환 매트릭스는 Capto® Adhere (GE Healthcare) 이다.
용어 "음이온 교환 매트릭스" 는, 예컨대 4 차 아미노기와 같은 하나 이상의 포지티브 대전된 리간드가 부착된, 포지티브 대전된 크로마토그래피 매트릭스를 지칭하기 위해서 본원에서 사용된다. 상업적으로 이용가능한 음이온 교환 수지는 DEAE 셀룰로오스, QAE SEPHADEX™ 및 FAST Q SEPHAROSE™ (Pharmacia) 를 포함한다. 바람직한 재료는 Fractogel® EMD TMAE, Fractogel® EMD TMAE highcap, Eshmuno ® Q 및 Fractogel® EMD DEAE 이다.
용어 "단백질 A" 및 "Prot A" 는 본원에서 교환적으로 사용되고 천연 (native) 소스로부터 회수된 단백질 A, 합성하여 (예컨대, 펩티드 합성 또는 재조합형 기법에 의해) 생성된 단백질 A, 및 Fc 영역과 같은 CH2/CH3 영역을 가지는 단백질을 바인딩할 수 있는 능력을 리테이닝하는 변이체를 포함한다. 단백질 A 는 Repligen, Pharmacia 및 Fermatech 로부터 상업적으로 구입할 수 있다. 단백질 A 는 일반적으로 크로마토그래피 매트릭스에 고정된다. 용어 "ProA" 는 또한 친화성 크로마토그래피 매트릭스 또는 단백질 A 가 공유결합으로 부착된 크로마토그래픽 고체 지지 매트릭스를 포함한 탑을 지칭한다.
본 발명에 따른 방법에 사용되는 단백질 A 의 기능성 유도체, 단편 또는 변이체가 쥐 IgG2a 또는 인간 IgGl 의 Fc 영역에 대해 적어도 K=IO"8M, 바람직하게 K=IO"9M 의 바인딩 상수로 특징지을 수도 있다. 바인딩 상수에 대한 이런 값에 부합하는 상호작용은 본문에서 "고 친화성 바인딩" 으로 칭한다. 바람직하게, 단백질 A 의 이런 기능성 유도체 또는 변이체는 IgG 바인딩 기능성을 리테이닝하는 천연 도메인 E, D, A, B, C 또는 상기 천연 도메인의 조작된 돌연변이체에서 선택된 야생형 단백질 A 의 기능성 IgG 바인딩 도메인의 적어도 일부를 포함한다.
또한, 단일 지점 부착을 허용하도록 조작된 단백질 A 유도체 또는 변이체는 주장된 방법에서 친화성 크로마토그래피 단계에 또한 사용될 수도 있다.
일반적으로, 단일 지점 부착은, 단일 공유결합 본드를 통하여 단백질 모이어티가 단백질 A 친화성 크로마토그래피의 크로마토그래픽 지지 재료에 부착되는 것을 의미한다. 이런 단일 지점 부착은, 단백질 접힘의 외주연에서 N- 또는 C-말단 등에 가깝게, 즉 루프에서, 노출된 아미노산 위치에 배치된 적합한 반응성 잔기의 사용에 의해 또한 발생할 수도 있다. 적합한 반응기로는 예컨대 술프히드릴 또는 아미노 관능기가 있다.
용어 "친화성 크로마토그래피 매트릭스" 는 친화성 크로마토그래피에 적합한 리간드를 지닌 크로마토그래피 매트릭스를 지칭하기 위해서 본원에 사용된다. 전형적으로, 리간드 (예컨대, 단백질 A 또는 그것의 기능성 변이체) 는 크로마토그래피 매트릭스 재료에 공유결합으로 부착되고 용액이 크로마토그래피 매트릭스에 접촉함에 따라 용액 중 타겟 분자에 접근가능하다. 친화성 크로마토그래피 매트릭스의 한 가지 예로는 단백질A 매트릭스가 있다.
본원에 사용되는 것처럼, 타겟 분자 (예컨대, 단백질을 함유한 Fc 영역) 와 매트릭스에 부착된 리간드 (예컨대, 고체상 매트릭스 또는 수지에 바인딩된 단백질 A) 사이의 상호작용을 설명하는 용어 "바인딩" 은, 바인딩 사이트에서 정전력, 수소 본딩, 소수력, 및/또는 반데르발스 힘으로 결합된 바인딩 사이트에서 예컨대 단백질 및 리간드 구조의 공간 상보성의 조합된 효과를 통하여 리간드로 타겟 분자의 일반적 가역 바인딩을 지칭한다. 일반적으로, 공간 상보성이 더 클수록 그리고 바인딩 사이트에서 다른 힘이 더 강할수록, 각각의 리간드에 대한 단백질의 바인딩 특이성이 더 클 것이다. 특정한 바인딩의 비제한적인 예는 항체-항원 바인딩, 효소 기질 바인딩, 효소-공동인자 바인딩, 금속 이온 킬레이트화, DNA 바인딩 단백질-DNA 바인딩, 조절 단백질-단백질 상호작용 등을 포함한다. 이상적으로, 친화성 크로마토그래피에서 유리 용액에서 약 10"4 ~ 10"8 M 의 친화성을 가지고 특정한 바인딩이 발생한다.
용어 "세제" 는, 이온 및 비이온 계면활성제, 예로 폴리소르베이트 (예컨대 폴리소르베이트 20 또는 80); 폴록사머 (예컨대 폴록사머 188); Triton; 도데실 황산나트륨 (SDS); 로럴 황산나트륨; 옥틸 글리코시드나트륨; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일-, 또는 스테아릴-술포베타인; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-사르코신; 리놀레일-, 미리스틸-, 또는 세틸-베타인; 라우로아미도프로필-, 코카마이도프로필-, 리놀레아미도프로필-, 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 이소스테아르아미도프로필-베타인 (예컨대, 라우로아미도프로필); 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 이소스테아르아미도프로필-디메틸아민; 나트륨 메틸 코코일-, 또는 이나트륨 메틸 올레일-타우레이트; 및 MONAQU AT™ 시리즈 (Mona Industries, Inc., Paterson, N. J.) 를 지칭한다. 유용한 세제로는 폴리소르베이트, 예로 폴리소르베이트 20 (TWEEN 20®.) 또는 폴리소르베이트 80 (TWEEN 80®.) 또는 다양한 산, 예로 옥탄산이 있다.
"버퍼" 는 산-염기 콘쥬게이트 성분의 작용에 의한 pH 변화에 저항하는 용액이다. 예를 들어 버퍼의 원하는 pH 에 따라 이용될 수 있는 다양한 버퍼가 버퍼로 설명된다. Calbiochem Corporation 의 Gueffroy, D. 편집, 생물학적 시스템에서 버퍼의 조제 및 사용 가이드 (1975). 버퍼의 비제한적인 예로는 MES, MOPS, MOPSO, 트리스, HEPES, 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 숙시네이트, 및 암모늄 버퍼뿐만 아니라 이것의 조합물을 포함한다.
본 발명에 따르면, 용어 "버퍼" 또는 "용매" 는 분리 유닛을 로딩, 세척, 용출 및 재평형화하는데 사용되는 임의의 액체 조성에 사용된다.
분리 유닛에 "로딩" 할 때 버퍼는 타겟 분자 (예컨대, 타겟 단백질을 함유한 Fc 영역) 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 샘플 또는 조성을 크로마토그래피 탑 (예컨대, 친화성 탑 또는 이온 교환 탑) 에 로딩하는데 사용된다. 이상적으로 모든 불순물이 바인딩되지 않고 탑을 관류하는 동안 타겟 분자가 크로마토그래피 매트릭스에 바인딩되도록 버퍼는 전도율 및/또는 pH 를 갖는다.
타겟 분자를 "관류" 하도록 분리 유닛에 "로딩" 할 때, 버퍼는 타겟 분자 (예컨대, 타겟 단백질을 함유한 Fc 영역) 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 샘플 또는 조성을 크로마토그래피 탑 (예컨대, 친화성 탑 또는 이온 교환 탑) 에 로딩하는데 사용된다. 이상적으로 모든 불순물이 탑에 바인딩되는 동안 타겟 분자가 크로마토그래피 매트릭스에 바인딩되지 않고 탑을 관류하도록 버퍼는 전도율 및/또는 pH 를 갖는다.
용어 "재평형화" 는 타겟 분자를 로딩하기 전 크로마토그래피 매트릭스를 재평형화하는 버퍼의 사용을 지칭한다. 전형적으로, 로딩 버퍼는 재평형화를 위해 사용된다.
크로마토그래피 매트릭스를 "세척" 한다는 것은, 매트릭스를 통하여 또는 위로 적절한 버퍼를 통과시키는 것을 의미한다. 전형적으로 세척은 타겟 분자를 용출하기 전 매트릭스로부터 약하게 바인딩된 오염 물질을 제거하는데 사용된다.
이 경우에, 전형적으로, 세척 버퍼 및 로딩 버퍼는 동일하다. 바이러스 불활성화 버퍼가 사용되는 경우, 그것은 타겟 분자를 용출하기 전 특정 현 바이러스를 불활성화하는데 사용된다. 이 경우에, 전형적으로, 바이러스 비활성화 버퍼는 그것이 세제(들)를 함유할 수도 있고 또는 상이한 특성 (pH/전도율/염 및 그것의 양) 을 가질 수도 있으므로 로딩 버퍼와 상이하다.
크로마토그래피 매트릭스로부터 분자 (예컨대, 목적 폴리펩티드 또는 불순물) 를 "용출" 시킨다는 것은, 버퍼가 크로마토그래피 수지에서 리간드 사이트에 대해 목적 분자와 경쟁하도록 용액 조건을 바꾸어줌으로써 크로마토그래피 매트릭스로부터 분자를 제거하는 것을 의미한다. 비제한적인 예로는, 버퍼가 이온 교환 재료에서 대전된 사이트에 대해 분자와 경쟁하도록 이온 교환 재료를 둘러싸는 버퍼의 이온 강도를 바꾸어줌으로써 이온 교환 수지로부터 분자를 용출하는 것이다.
본원에서 교환적으로 사용되는 것처럼, 용어 "바이러스 불활성화" 또는 "VI" 는, 바이러스가 세포를 감염시키지 못하도록 할 수도 있고 또는 물리 화학적 수단을 통하여 바이러스 기능을 억제할 수도 있는 임의의 프로세스를 지칭한다. 전형적인 바이러스 불활성화 방법은, 낮은 pH 처리 (예컨대, pH 4.5 미만, 4.0 미만 또는 3.8 미만), 열 처리, 계면활성제를 이용한 처리 및 복사 (예컨대, 자외선 노출) 를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 바이러스 불활성화 방법은 레트로바이러스를 향한 것이다.
특정 실시형태에서, 낮은 pH 조건은 이러한 조건이 전형적으로 바이러스 지질 엔벨로프를 분열시킴에 따라 바이러스 불활성화에 사용되어서, 바이러스를 불활성화시킨다.
특정 실시형태에서, 임의의 계면활성제는 그것이 전형적으로 바이러스를 분열시킴에 따라 바이러스 불활성화에 사용되어서, 바이러스를 불활성화시킨다 (Tween, Triton X-100, SDS 유사).
본 발명에 따르면, "분리 유닛" 은 크로마토그래픽 분리 단계가 수행될 수 있는 장비이다. 분리 유닛은 전형적으로 흡수제 매트릭스로 충전되는 크로마토그래피 탑 또는 크로마토그래피 카트리지이다. 크로마토그래피 탑은 본 기술분야의 당업자에게 공지되어 있다. 크로마토그래피 탑은 전형적으로 유체-입구 및 유체-출구를 위한 단부 피팅을 구비한 탑 튜브를 포함한다. 탑 튜브는 적합한 크로마토그래피 매트릭스로 충전된다.
본 발명에 따르면, "연속" 프로세스는 배치 모드로 가동되지 않는 프로세스이다. 본 발명에 따른 연속 프로세스에서, 새로운 샘플은 사이에 단지 짧은 브레이크만 가지고 또는 바람직하게 브레이크 없이 분리 유닛 (A1) 또는 분리 유닛 (A2) 중 어느 하나에서 한번 분리 유닛 (A1 또는 A2) 으로 로딩될 뿐만 아니라 교번적으로 순차적으로 로딩된다.
본 발명에 따른 "순차적" 은 2 회 또는 2 회 초과이다.
본 발명에 따르면, "연결 라인" 은 그곳을 통하여 액체를 유동시키기에 적합한 임의의 튜브, 호스, 파이프 또는 채널이다. 연결 라인은 하나 이상의 밸브에 의해 차단될 수 있다. 연결 라인은 직선형 또는 분지형일 수도 있다.
본 발명에 따르면, 장치의 두 부품이 "유체 연결" 되어 있다면, 그것은 액체가 하나의 부품으로부터 다른 부품으로 유동할 수 있도록 장치의 두 부품 사이에 연결 라인이 있음을 의미한다. 이 연결 라인은 직접적일 수 있고 그것은 하나 이상의 밸브, 분리 유닛 또는 장치의 다른 부품에 의해 차단될 수 있다. 용어 "유체 연결" 은 영구적인 유체 연결을 포함하지만 그것은 또한 영구적이지는 않지만 연결 라인을 통한 액체의 유동이 필요할 때마다 개시되고 정지될 수 있도록 예컨대 하나 이상의 밸브에 의해 차단되는 연결 라인으로 만들어진 유체 연결을 포함한다. 전형적으로, 유체 연결되는 장치 부품의 대부분은 영구적이지 않은 유체 연결을 갖는다. 예를 들어, 버퍼 리저버가 분리 유닛과 유체 연결되어 있다면 이것은 탑으로 버퍼의 유동이 필요하다면 실현될 수 있지만 전형적으로 필요할 때 액체 유동이 정지될 수 있고 필요할 때 개시될 수 있도록 리저버와 분리 유닛 사이의 연결 라인에 적어도 하나의 밸브가 위치해 있음을 의미한다.
액체 연결되는 장치의 두 부품 사이에서 액체 유동이 실제로 실현되어서 두 부품 사이의 연결 라인을 통하여 액체가 유동하고 있다면, 이 두 부품은 "유체 연통" 된다. 그 결과, 본 발명에 따른 "유체 연통" 은, 연결 라인으로 액체를 유동시킴으로써 "유체 연결" 이 실제로 사용되는 상태를 설명한다. 시스템의 두 부품이 부분적으로 유체 연통된다면 그것은 유체 연통이 영구적이지 않고 액체가 하나의 부품으로부터 다른 부품으로 영구히 유동하지 않고 시간 중 단지 일부동안 유동하는 것을 의미한다. 전형적으로, 시스템의 두 부품 사이에서 액체의 유동은 액체 유동의 방향을 정하는 밸브의 보조로 개시 및/또는 정지된다.
"유체 입구" 또는 "입구" 는 액체 도입을 가능하게 하는 임의의 수단이다. 분리 유닛 입구는, 예를 들어, 연결 라인이 연결될 수 있는 크로마토그래피 탑의 단부 피팅이다. 입구는 또한 연결 라인에 액체의 도입을 제공하는 밸브일 수 있다. 입구는 또한 연결 라인의 단부일 수 있다.
"출구" 또는 "유체 출구" 는 액체의 인출을 가능하게 하는 임의의 수단이다. 분리 유닛 출구는, 예를 들어, 연결 라인이 연결될 수 있는 크로마토그래피 탑의 단부 피팅이다. 출구는 또한 연결 라인에 액체의 도입을 제공하는 밸브일 수 있다. 출구는 또한 연결 라인의 단부일 수 있다.
"유체 선택 밸브" 는 임의의 연결된 유체 및 시스템 부품간 선택적으로 유체 연통을 가능하게 하는 임의의 수단이다. 유체 선택 밸브는, 예를 들어, 분리 유닛 입구 앞의 밸브이고, 선택된 라인과 분리 유닛 입구 사이의 유체 연통을 가능하게 할 수 있는 연결 라인이 상기 밸브에 연결될 수 있고 선택적으로 정해질 수 있다. 유체 선택 밸브는, 예를 들어, 분리 유닛 출구 뒤의 밸브이고, 선택된 라인과 분리 유닛 출구 사이의 유체 연통을 가능하게 할 수 있는 연결 라인이 상기 밸브에 연결될 수 있고 선택적으로 정해질 수 있다. 유체 선택 밸브는 또한 연결 라인에 액체의 도입을 제공하는 밸브일 수 있다. 유체 선택 밸브는 또한 연결 라인의 단부일 수 있다.
"용매 선택 밸브" 는, 임의의 연결된 용매 리저버와 시스템 부품 사이에 선택적으로 유체 연통을 가능하게 하는 유체 선택 밸브이다. 용매 선택 밸브는, 예를 들어, 용매 펌프 앞의 밸브이고, 선택된 용매와 펌프 사이에 유체 연통을 가능하게 할 수 있는 연결 라인이 용매 리저버로부터 상기 밸브에 연결될 수 있고 선택적으로 정해질 수 있다.
"유체 선택 밸브" 와 "용매 선택 밸브" 는 동일한 유형 또는 상이한 유형일 수 있다.
용매 전달 시스템은 액체의 전달을 가능하게 하는 시스템이다. 전형적으로, 장치의 용매 전달 시스템은 적어도 하나의 리저버, 및 리저버로부터 리저버와 액체 연결되는 장치의 다른 부품까지 액체를 수송하는 적어도 하나의 펌프를 포함한다. 액체가 리저버로부터 분리 유닛에 이송될 때마다 이것은 펌프의 보조로 수행되는 것이 본 기술분야의 당업자에게 공지되어 있다. 펌프는 2 개 이상의 리저버로부터 나온 2 개 이상의 액체 스트림을 혼합하는데 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명은 처음으로 단지 3 개의 분리 유닛들만 필요로 하는 연속 크로마토그래피 프로세스에 적합한 방법 및 장치를 제공한다. 상기 프로세스는 2 개의 크로마토그래픽 단계를 포함하는 2 단계 절차이다. 장치가 3 개의 분리 유닛을 가지면, 제 1 크로마토그래픽 단계 (포집) 는 2 개의 분리 유닛에서 교번적으로, 순차적으로 수행되고, 제 2 크로마토그래픽 단계 (연마) 는 제 3 분리 유닛에서 또한 순차적으로 수행된다. 동일한 크로마토그래피 매트릭스를 가지는 2 개의 제 1 분리 유닛은 교번적으로 샘플로 로딩된다. 그것은, 유닛 중 하나가 샘플로 로딩되는 동안, 동시에, 다른 유닛이 타겟 분자의 평형화, 세척, 용출 등과 같은 다른 프로세스 단계를 부여받을 수 있음을 의미한다. 2 개의 제 1 유닛의 매트릭스와 상이한 크로마토그래피 매트릭스를 가지는 제 3 분리 유닛은 2 개의 제 1 유닛으로부터 용출되는 타겟 분자를 공급받는다. 2 개의 제 1 유닛이 순차적으로 로딩됨에 따라, 그것은 또한 순차적으로 용출된다. 그것은, 하나의 유닛이 로딩되는 동안, - 이미 로딩된 - 다른 유닛이 선택적으로 세척된 후 바람직하게 제 3 유닛으로 직접 공급을 허용하는 용출 버퍼를 갖는 이 유닛으로부터 타겟 분자가 용출되는 것을 의미한다.
제 3 유닛에서 제 2 크로마토그래픽 분리를 수행했을 때, 정제된 타겟 분자는 그 후 제 3 유닛의 유체 출구로부터 회수될 수 있다.
본 발명에 따른 방법 및 장치는 제 1 디멘션 분리 유닛의 높은 로딩을 허용하여서 높은 동적 바인딩 용량과 더 빠른 처리량을 유발하여서 체류 시간을 단축시킨다.
또한, 본 발명에 따른 방법 및 장치는 전형적으로 부가적 컨디셔닝 없이 제 1 분리 디멘션 (포집) 과 제 2 분리 디멘션 (연마) 을 연결하는 것이 가능한데, 왜냐하면 포집된 생성물은 제 2 (연마) 디멘션에 맞는 조건에서 제 1 디멘션으로부터 바람직하게 용출되기 때문이다.
본 발명에 따른 방법은, 개념 및 기술적 해결책 변화없이, 상이한 크로마토그래픽 모드, 예컨대 AIEX 연마와 조합된 CIEX 포집, CIEX 연마와 조합된 Prot A 포집 및 CIEX 연마와 조합된 AIEX 포집에 적용될 수 있다. 따라서, 그것은 경제적일뿐만 아니라, 광범위한 타겟 분자 (예컨대, 2 ~ 14 로부터 pi 를 가지는 생물약제 분자) 의 정제에 적합한 양호한 정제 기술이다.
바람직한 실시형태에서, 분리 유닛 (A1, A2) 은 친화성 크로마토그래피 매트릭스를 가지고 분리 유닛 (B) 은 양이온 교환 크로마토그래피 매트릭스를 갖는다.
다른 바람직한 실시형태에서, 분리 유닛 (A1, A2) 은 친화성 크로마토그래피 매트릭스를 가지고 분리 유닛 (B) 은 음이온 교환 크로마토그래피 매트릭스를 갖는다.
다른 바람직한 실시형태에서, 분리 유닛 (A1, A2) 은 양이온 교환 크로마토그래피 매트릭스를 가지고 분리 유닛 (B) 은 음이온 교환 크로마토그래피 매트릭스를 갖는다.
다른 실시형태에서, 분리 유닛 (A1, A2) 은 음이온 교환 크로마토그래피 매트릭스를 가지고 분리 유닛 (B) 은 양이온 교환 크로마토그래피 매트릭스를 갖는다.
다른 실시형태에서, 분리 유닛 (A1, A2) 은 친화성 크로마토그래피 매트릭스를 가지고 분리 유닛 (B) 은 혼합 모드 크로마토그래피 매트릭스를 갖는다.
다른 실시형태에서, 분리 유닛 (A1, A2) 은 친화성 크로마토그래피 매트릭스를 가지고 분리 유닛 (B) 은 혼합 모드 양이온 및 음이온 교환 크로마토그래피 매트릭스 또는 혼합 모드 음이온 및 양이온 교환 크로마토그래피 매트릭스 또는 혼합 모드 양이온 및 혼합 모드 음이온 교환 크로마토그래피 매트릭스를 갖는다.
다른 실시형태에서, 분리 유닛 (A1, A2) 은 양이온 교환 매트릭스를 가지고 분리 유닛 (B) 은 혼합 모드 크로마토그래피 매트릭스를 갖는다.
본 발명에 따른 장치의 개략도는 도 2 에 나타나 있다. 도 2 에서, 분리 유닛 (A1, A2) 의 출구와 분리 유닛 (B) 의 입구 사이 연결 라인은 연결 라인 (C-P) 으로 명명된다.
본 발명에 따른 장치는 3 개의 분리 유닛, 동일한 크로마토그래피 매트릭스를 가지는 2 개의 포집 분리 유닛 (A1, A2) 및 하나의 연마 분리 유닛 (B) 을 포함한다. 분리 유닛 외에 장치는 전형적으로 적어도 2 개의 펌프, 하나 이상의 밸브, 액체 연결부, 및 리저버를 포함한다. 그것은 부가적으로 필터 유닛, 검출 유닛 또는 크로마토그래픽 분리 절차에 필요하거나 적합할 수도 있는 다른 장비를 포함할 수도 있다.
본 발명에 따른 장치는 종래의 크로마토그래피 시스템이거나 일회용 시스템일 수 있다. 그것은 탑, 밸브, 리저버 및 크로마토그래피 시스템에 전형적으로 사용되는 다른 장비를 포함한다. 분리 유닛은, 예를 들어, 각각의 크로마토그래피 매트릭스로 충전되고 용매 입구 및 출구를 위한 적합한 단부 피팅을 가지는 스테인리스 강 탑, 플라스틱 탑 또는 유리 탑일 수도 있다.
일부 실시형태에서 본 발명에 따른 장치는 3 개 초과의 분리 유닛을 포함할 수도 있고, 예를 들어, 그것은 동일한 크로마토그래피 매트릭스를 가지는 3 개 또는 4 개의 포집 분리 유닛, 및 동일한 크로마토그래피 매트릭스를 가지지만 포집 분리 유닛의 매트릭스와 상이한 크로마토그래피 매트릭스를 가지는 2 개 또는 3 개의 연마 분리 유닛을 가질 수도 있다. 예시적인 실시형태에서, 그것은
- 2 개의 연마 분리 유닛 (B1, B2) 과 조합되는 2 개의 포집 분리 유닛 (A1, A2)
- 1 개의 연마 분리 유닛 (B) 과 조합되는 3 개의 포집 분리 유닛 (A1, A2, A3)
- 2 개의 연마 분리 유닛 (B1, B2) 과 조합되는 3 개의 포집 분리 유닛 (A1, A2, A3) 을 가질 수도 있다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 장치는 5 개의 분리 유닛, 동일한 크로마토그래피 매트릭스를 가지는 3 개의 포집 분리 유닛 (A1, A2, A3), 및 2 개의 연마 분리 유닛 (B1, B2) 을 갖는다.
분리 유닛 (A1) 의 유체 출구 또는 분리 유닛 (A2) 의 유체 출구 또는 분리 유닛 (A3) 의 유체 출구 중 어느 하나가 분리 유닛 (B1) 의 입구 또는 분리 유닛 (B2) 의 입구와 유체 연통될 수 있도록 보장하기 위해서, 적어도 하나의 밸브가 분리 유닛 (A1, A2, A3) 의 유체 출구와 분리 유닛 (B1, B2) 의 유체 입구 사이에 위치한다. 바람직하게, 각각의 분리 유닛 (A1, A2, A3) 의 출구 뒤에 밸브가 위치하여서, 분리 유닛 (B1) 의 입구 또는 분리 유닛 (B2) 의 입구와 유체 연통을 가능하게 한다. 장치는 또한 적어도 2 개의 버퍼 리저버 및 용매 전달 시스템으로도 불리는 적어도 2 개의 펌프를 포함하고, 이것은 예컨대 타겟 분자의 로딩, 세척 및 용출에 필요한 버퍼의 저장 및 공급을 제공한다. 전형적으로, 분리 유닛 (A1, A2, A3) 은 적어도 하나의 버퍼 리저버에 연결된 적어도 하나의 유체 입구를 가지고 분리 유닛 (B1, B2) 은 적어도 하나의 버퍼 리저버에 연결된 적어도 하나의 유체 입구를 갖는다. 전형적으로, 분리 유닛 (B1, B2) 은 적어도 하나의 유체 출구를 갖는다.
매우 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 장치는 3 개의 분리 유닛, 동일한 크로마토그래피 매트릭스를 가지는 2 개의 포집 분리 유닛 (A1, A2) 및 하나의 연마 분리 유닛 (B) 을 갖는다.
하기에서 장치 및 방법의 설명은 동일한 크로마토그래피 매트릭스를 가지는 2 개의 포집 분리 유닛 (A1, A2) 및 하나의 연마 분리 유닛 (B) 을 구비한 장치에 초점이 맞추어진다. 이것은 한정하려는 것이 아니라 설명을 보다 포괄적으로 하기 위한 것이다. 본 기술분야의 당업자는 전술한 바와 같은 3 개 유닛을 초과하는 유닛을 구비한 시스템을 또한 설명할 수 있다.
분리 유닛 (A1) 의 유체 출구 또는 분리 유닛 (A2) 의 유체 출구 중 어느 하나가 분리 유닛 (B) 의 입구와 유체 연통할 수 있도록 보장하기 위해서, 적어도 하나의 밸브가 분리 유닛 (A1, A2) 의 유체 출구와 분리 유닛 (B) 의 유체 입구 사이에 위치한다.
장치는 또한 적어도 2 개의 버퍼 리저버, 및 용매 전달 시스템으로도 불리는 적어도 2 개의 펌프를 포함하고, 이것은 예컨대 타겟 분자의 로딩, 세척 및 용출에 필요한 버퍼의 저장 및 공급을 제공한다. 전형적으로, 각각의 크로마토그래픽 단계를 위해, 하나의 로딩 버퍼와 하나의 용출 버퍼가 필요하다.
본 발명의 일 실시형태에서, 장치는 바인딩 및 용출 버퍼를 위한 2 개의 버퍼 리저버, 버퍼 (A) 를 위한 하나의 리저버와 버퍼 (B) 를 위한 하나의 리저버를 단지 포함한다. 버퍼 (A) 는, 분리 유닛 (A1/A2) 에서 타겟 분자가 포집되는 조건을 제공하는 제 1 디멘션을 위한 로딩 및 따라서 바인딩 버퍼이다. 게다가, 버퍼 (A) 는, 분리 유닛 (B) 으로부터 타겟 분자가 용출되는 조건을 제공하는 제 2 디멘션을 위한 용출 버퍼이다. 버퍼 (B) 는, 제 1 디멘션 (분리 유닛 (A1/A2)) 을 위한 용출 버퍼이고 제 2 디멘션 (분리 유닛 (B)) 을 위한 바인딩 버퍼이다.
다른 실시형태에서, 장치는 제자리에서 세정, 바이러스 불활성화 등을 하는 다른 버퍼를 위한 부가적 리저버를 포함할 수 있다.
전형적으로, 리저버와 분리 유닛은 연결 라인, 밸브 및 펌프를 통하여 연결된다. 펌프 앞에서 용매 선택을 위한 바람직한 용매 선택 밸브는 펌프에 직접 연결될 수 있는 6 개의 용매 입구와 1 개의 용매 출구를 가지는 밸브이다. 연동 펌프, 등용매 조건 펌프, 용매 기울기 조건 펌프, 고압 펌프 등, 저압 펌프 등을 포함하는, 용매 유동을 보장하는 임의의 펌프가 사용될 수 있다. 시스템 부품 입구 앞에 유체 도입을 선택하기 위한 바람직한 유체 선택 밸브는 시스템 부품 입구에 연결될 수 있는 6 개의 유체 입구와 1 개의 출구를 가지는 밸브이다. 시스템 부품 출구 뒤 유체 인출을 선택하기 위한 바람직한 유체 선택 밸브는 시스템 부품 출구에 연결될 수 있는 6 개의 유체 출구와 1 개의 입구를 가지는 밸브이다.
바람직한 일 실시형태에서, 장치는 분리 유닛 (A1) 의 출구와 분리 유닛 (A2) 의 입구 사이와 그 반대에서 액체 연결을 가능하게 하는 2 개의 포집 분리 유닛 (A1, A2) 간 연결 라인을 부가적으로 포함한다. 이 실시형태의 개략도는 도 3 에 나타나 있고, 여기에서 부가적 연결 라인은 연결 라인 (F-F) 으로 명명된다. 이 구성은 (막 재평형화되어 포집 준비가 된) 제 2 분리 유닛에서 (로딩 말에) 제 1 포집 분리 유닛으로부터 침출된 생성물의 포집을 가능하게 한다. 이것은 타겟 분자의 손실 없이 더 높은 처리량과 바인딩 용량을 사용할 수 있도록 한다.
바람직한 실시형태에서, 용매 전달 시스템은, 임의의 선택된 포집 분리 유닛으로 연속 샘플 공급을 보장하기 위해서, 2 개의 포집 분리 유닛 (A1, A2) 사이 연결 라인, 바람직하게 샘플 용매 전달 시스템에 연결된다.
다른 바람직한 실시형태에서, 장치는 하나 이상의 검출기를 더 포함한다. 검출기는 탑 사이 샘플 이송 제어, 샘플 품질 분석, 모니터링 등을 위해 사용될 수 있다. 검출기는 적합한 곳 어디에나 위치할 수 있고, 전형적으로 그것은 분리 유닛의 유체 입구 앞 및/또는 유체 출구 뒤에 위치한다. 적합한 검출기의 예로는 pH 검출기, UV 검출기, 적외선 검출기 또는 전도율 측정 검출기가 있다.
바람직하게, 검출기는 모든 분리 유닛의 유체 입구 앞과 유체 출구 뒤에 위치한다. 이 구성은 분리 유닛들 사이 샘플 이송 제어를 보장한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 장치는 컴퓨터 시스템을 더 포함한다. 검출기뿐만 아니라 펌프 및 밸브가 컴퓨터 시스템에 연결된다. 이 컴퓨터 시스템은 펌프, 밸브 및 검출기의 제어를 가능하게 한다. 바람직하게, 컴퓨터 시스템은, 장치가 부분적으로 또는 완전히 자동화된 모드로 사용될 수 있도록 하는 소프트웨어와 알고리즘을 포함한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 바람직하게 하나 이상의 리저버로 연결 라인을 의미하는 부가적 유체 입구는 분리 유닛 (B) 의 유체 입구 앞에 위치한다. 도 2, 도 3 및 도 4 에서, 이 부가적 입구는 입구 (C) 로 명명된다. 전형적으로, 부가적 유체 입구는 분리 유닛 (A1, A2) 의 출구 뒤와 분리 유닛 (B) 의 유체 입구 앞에 위치한다. 바람직하게, 그것은 분리 유닛 (A1, A2) 의 출구와 분리 유닛 (B) 의 유체 입구 사이 연결 라인에 위치하는 밸브 뒤와 분리 유닛 (B) 의 유체 입구 앞에 위치한다. 이것은, 분리 유닛 (B) 이 분리 유닛 (A1, A2) 으로부터 용출액을 공급받을 수 있을 뿐만 아니라 예컨대 인라인 희석, 용출, 평형화, 제자리에서 세정, 바이러스 불활성화 등을 위한 부가적 버퍼 또는 시약을 공급받을 수 있도록 보장한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 장치는 제자리에서 세정하기 위한 부가적 리저버를 더 포함한다. 제자리 세정 (CIP) 은 본 기술분야의 당업자에게 공지된 기술이다. 제자리 세정은 크로마토그래피 매트릭스로부터 매우 단단히 바인딩되고, 침전되거나 변성된 물질을 제거하는 것이다. 이러한 오염 물질이 크로마토그래피 매트릭스로부터 제거되지 않는다면, 그것은 탑의 크로마토그래픽 특성에 영향을 미쳐서, 바인딩 용량을 감소시키고 후속 가동시 떨어져 나와 사이클 사이에서 오염 물질 또는 생성물의 캐리오버 (carryover) 를 유발한다. 표준 CIP 프로토콜은 전형적으로 다음과 같은 성분을 포함하는 수성 버퍼의 1 ~ 3 개의 탑 체적으로 1 ~ 5 번의 세척을 포함한다:
- 6 M 염산 구아니딘
- 10 mM ~ 500 mM NaOH
- 10 mM ~ 500 mM NaOH 및 1 M NaCl,
- 50 mM NaOH 및 1 M Na2SO4,
- 150 mM 인산 용액,
- 6 M 요소,
- 20% 에탄올,
- 20% 에탄올 및 0.5 M 아세트산,
- 20% 에탄올 및 2 M 아세트산,
- 1% Tween 또는 Triton® 계면활성제 X-100 등.
NaOH 와 같은 성분의 농도, 탑에서 CIP 버퍼의 접촉 시간뿐만 아니라 CIP 수행 빈도가 본 기술분야의 당업자에 의해 조정 및 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 장치는 바람직하게 CIP 버퍼를 포함한 적어도 하나의 리저버를 갖는다. CIP 버퍼는 적합하다면 모든 분리 유닛의 CIP 를 위해 사용될 수 있다. 그 후, CIP 버퍼의 유동이 각각의 탑에 독립적으로 향할 수 있도록 버퍼 리저버는 모든 분리 유닛과 액체 연결된다. 다른 실시형태에서, 장치는 2 개의 상이한 CIP 버퍼를 구비한 2 개의 리저버를 포함한다. 하나의 리저버는 분리 유닛 (A1, A2) 에 유체 연결되어서, 분리 유닛 (A1) 및 분리 유닛 (A2) 으로 유동이 독립적으로 실현될 수 있고, 다른 리저버는 분리 유닛 (B) 과 유체 연결된다. 제자리 세정시 세척은 각각의 분리 사이클 후 수행될 수 있다. 전형적으로, CIP 는 샘플, 및 분리 유닛을 오염시킬 수도 있는 오염 물질의 양과 유형에 따라 모든 제 2, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6, 제 7, 제 8, 제 9 또는 제 10 분리 사이클 후 수행된다. 본 기술분야의 당업자는, CIP 가 생략될 수 있고 또는 일회용 시스템에 대해 극적으로 단순화될 수 있다는 사실을 알고 있다.
다른 바람직한 실시형태에서, 장치는 바이러스 불활성화 (VI) 를 위한 부가적 리저버를 포함한다.
생물약제 화합물에서 바이러스 레벨이 FDA 에 의해 조정되므로 불순물 정제, 특히 바이러스 비활성화 및 제거는 생물약제 화합물 생성에 주요 역할을 하고 있다. 부가적 정제 단계에서 바이러스 불활성화를 수행할 수 있고, 생물약제 화합물에 따라, 예컨대 용매/세제 불활성화, 저온 살균, 산성 pH 불활성화 또는 UV 불활성화에 의해 바이러스 불활성화가 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 장치와 본 발명에 따른 절차를 사용할 때, 정제 프로세스에 바이러스 불활성화를 또한 포함할 수 있음이 발견되었다. 이를 위해, 분리 유닛 (A1, A2) 또는 분리 유닛 (B) 또는 모든 분리 유닛 중 어느 하나는 바이러스 불활성화 버퍼를 포함한 부가적 리저버와 유체 연결된다. 그 후, 타겟 분자가 상기 분리 유닛의 매트릭스에 바인딩되는 동안 바이러스 불활성화가 일어나는 분리 유닛을 통하여 바이러스 불활성화 버퍼는 유동한다. 바람직하게, 분리 유닛은 낮은 pH 또는 세제 바이러스 불활성화 중 어느 하나 또는 양자를 위해 리저버와 연결되고, 바람직하게 바이러스 불활성화 단계는 양이온 교환 매트릭스에서 수행된다. 바이러스 불활성화가 포집 유닛 (A1, A2) 에서 수행된다면, 분리 유닛 (A1) 및 분리 유닛 (A2) 으로 유동이 독립적으로 실현될 수 있도록 바이러스 불활성화 버퍼를 포함한 리저버는 분리 유닛 (A1, A2) 과 유체 연결된다. 바이러스 불활성화가 연마 유닛 (B) 에서 수행된다면, 바이러스 불활성화 버퍼를 포함한 리저버는 분리 유닛 (B) 과 유체 연결된다. 통합된 저 pH 바이러스 불활성화에 적합한 버퍼는 산성 pH 를 가지는 버퍼, 바람직하게 3 ~ 4 사이의 pH 를 가지는 버퍼이다. 적합한 버퍼의 예로는 아세테이트, 글리신 등이 있다. 통합된 계면활성제 바이러스 불활성화에 적합한 버퍼는 적어도 하나의 계면활성제 또는 세제를 가지는 버퍼이다. 적합한 세제의 예로는 옥탄산, Tween 또는 Triton 계면활성제 X-100 이 있다. 타겟 분자가 "탑" 에 있는 동안, 즉 그것이 분리 유닛의 매트릭스에 바인딩되어 있는 동안 바이러스 불활성화 단계를 수행하면, 크로마토그래피 단계 이외에 전형적으로 수행되는 풀 (pool) 에서 바이러스 불활성화가 회피되므로 정제 단계의 전체 수를 감소시킨다.
바람직한 실시형태에서, 장치는 풀링을 위한 어떤 리저버도 포함하지 않는다. 공지된 크로마토그래픽 분리 절차에서, 제 1 탑으로부터 용출되고 타겟 분자를 함유하는 흔히 모든 분획물은, 그것이 제 2 크로마토그래피 탑에 로딩되기 전 먼저 풀링된다. 본 발명의 방법과 장치는 이러한 풀링이 필요하지 않은 구성을 제공하는 것으로 발견되었다. 바람직하게, 로딩 및 세척 후, 타겟 분자가 분리 유닛 (A1 또는 A2) 으로부터 용출될 때, 타겟 분자를 함유한 모든 용리제는 직접적으로, 풀링없이 분리 유닛 (B) 의 입구로 향하고 분리 유닛 (B) 에 로딩된다. 이것은 부가적으로 정제 프로세스의 속도를 높인다. 이를 위해, 어떤 리저버도 유체 연결을 차단하지 않으면서 분리 유닛 (A1, A2) 은 분리 유닛 (B) 과 유체 연결된다. 이것은, 장치가 단지 전술한 대로 바인딩 및 용출을 위한 2 개의 버퍼 리저버를 포함한다면 특히 바람직하다. 분리 모드가 2 개 초과의 버퍼 사용을 필요로 한다면, 인라인 희석 및 버퍼 교환에 사용될 수 있는 (전술한 대로) 분리 유닛 (B) 의 유체 입구 앞에 부가적 유체 입구를 도입함으로써 풀링이 또한 회피될 수 있다.
일 실시형태에서, 장치는 친화성 크로마토그래피 매트릭스를 구비한 2 개의 분리 유닛 및 이온 교환, 바람직하게 양이온 교환 매트릭스를 구비한 1 개의 분리 유닛을 포함한다. 적합한 친화성 매트릭스로는 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L 또는 단백질 r 관능기 (예컨대, Prosep® Highcap (Merck Millipore), Prosep® Ultra Plus (Merck Millipore), Poros® Prot A(l_ife Technologies), A650F (Tosoh), MabSelect® Sure (GE) 를 가지는 매트릭스가 있다. 적합한 양이온 교환 매트릭스로는 Pharmacia 로부터의 술포프로필, 술폰산 (Fractogel EMD ®SO3, Fractogel EMD ® SE highcap (Merck) Eshmuno® S (Merck) SP-SEPHAROSE FAST FLOW™ 또는 SP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCE™ 과 같은 강한 양이온 교환기를 가지지만 이에 제한되지 않는 매트릭스가 있고, 또는 Fractogel ® EMD 카르복시 (Merck) 과 같은 카르복실산처럼 약한 양이온 교환기를 가지지만 이에 제한되지 않는 매트릭스가 있다.
다른 실시형태에서, 장치는 양이온 교환 매트릭스를 구비한 2 개의 분리 유닛, 및 음이온 교환 매트릭스를 구비한 1 개의 분리 유닛을 포함한다.
적합한 양이온 교환 매트릭스로는 술포프로필, 술폰산과 같은 강한 양이온 교환기를 가지지만 이에 제한되지 않는 매트릭스가 있고, 또는 카르복실산과 같은 약한 양이온 교환기를 가지지만 이에 제한되지 않는 매트릭스가 있고, 이것은 위에서 언급된 것들이다.
적합한 음이온 교환 매트릭스로는 4 차 아미노기와 같은 하나 이상의 포지티브 대전된 리간드를 가지지만 이에 제한되지 않는 매트릭스이다.
상업적으로 이용가능한 음이온 교환 수지는 DEAE 셀룰로오스, QAE SEPHADEX™ 및 FAST Q SEPHAROSE™ (Pharmacia), Fractogel® TMAE (M), Fractogel® TMAE HC (M) 또는 Eshmuno® Q (Merck) 를 포함한다.
다른 실시형태에서, 장치는 음이온 교환 매트릭스를 구비한 2 개의 분리 유닛, 및 양이온 교환 매트릭스를 구비한 하나의 분리 유닛을 포함한다. 적합한 양이온 교환 매트릭스 및 음이온 교환 매트릭스는 위에서 열거되었다.
모든 실시형태에서, 또한 혼합 모드 매트릭스는 이온 교환 매트릭스뿐만 아니라 그것의 조합물 대신에 사용될 수 있다. 그 예로는, 음이온 교환 및 소수성 기능성의 조합물 (Capto Adhere (GE Healthcare)) 또는 양이온 교환 및 소수성 기능성의 조합물, 예로 Capto ™ MMC (GE Healthcare), Eshmuno® HCX (Merck KGaA), POROS®XS (Applied Biosystems) 가 있다.
도 1 은 본 발명에 따른 장치의 바람직한 실시형태를 나타낸다. 분리 유닛 (A1, A2) 은 "CIEX" 로 불리고, 이 2 개의 분리 유닛이 동일한 크로마토그래피 매트릭스, 예컨대 양이온 교환 수지를 가지는 것을 보여준다. 분리 유닛 (B) 은 AIEX 로 불리고, 이 분리 유닛이 음이온 교환 크로마토그래피 매트릭스를 가질 수도 있음을 제안한다. 전도율 검출기 ("Cond.") 는 모든 3 개의 탑의 유체 입구 앞에 위치한다. UV 및 pH 검출기 ("UV, pH") 는 모든 3 개의 탑의 유체 출구에 위치한다. 분리 유닛 (A1, A2) 은 제자리 세정 ("CIP"), 바이러스 불활성화 ("VI"), 로딩 버퍼 ("E.A"), 용출 버퍼 ("E.B"), 희석 버퍼 ("Dil.") 및 샘플 공급 ("Feed") 을 위한 6 개의 리저버와 연결된다. 분리 유닛 (B) 은 제자리 세정 ("CIP"), 로딩 버퍼 ("E.A"), 용출 버퍼 ("E.B") 를 위한 3 개의 리저버에 연결된다. 바람직하게, 분리 유닛 (A1/A2) 에 사용된 용출 버퍼는 분리 유닛 (B) 에 사용된 로딩 버퍼와 동일하거나 그 반대도 가능하다. 리저버와 탑은 연결 라인을 통하여 연결된다. 바람직하게, 모든 연결 라인들은 액체 유동을 제어할 수 있도록 밸브에 의해 적어도 한번 차단된다. 액체 수송은 펌프의 보조로 실현된다.
본 발명은 또한 타겟 분자와 하나 이상의 불순물을 포함하는 샘플로부터 타겟 분자의 연속 정제 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 각각의 본 발명의 장치에서 수행된다. 적합한 장치의 개략도는 도 2, 도 3 및 도 4 에 나타나 있다. 본 방법은 순차적으로 반복하는 단계들을 포함한다. 제 1 크로마토그래픽 디멘션을 위한 분리 유닛 (A1, A2) 은 연속적으로, 순차적으로 샘플을 로딩받아서, 샘플이 분리 유닛 (A1) 에 로딩되는 동안, 분리 유닛 (A2) 은 적어도 부분적으로 분리 유닛 (B) 과 유체 연통하여서 타겟 분자가 분리 유닛 (B) 으로 용출되고 분리 유닛 (A2) 은 재평형화되고 샘플이 분리 유닛 (A2) 에 로딩되는 동안, 분리 유닛 (A1) 은 분리 유닛 (B) 과 적어도 부분적으로 유체 연통하여서 타겟 분자가 분리 유닛 (B) 으로 용출되고 분리 유닛 (A1) 은 재평형화된다.
게다가, 제 2 크로마토그래피 단계는 분리 유닛 (B) 에서 일어나서 분리 유닛 (B) 의 유체 출구로부터 정제된 타겟 분자의 회수를 이끈다.
본 발명의 방법이 연속 모드로 작동하도록 보장하기 위해서, 2 개의 크로마토그래픽 분리 단계의 속도가 조정될 필요가 있다. 전형적으로, 제 2 크로마토그래픽 단계에서는 분리 유닛 (B) 에서 로딩, 크로마토그래픽 분리 및 재평형화는 분리 유닛 (A1, A2) 에서 로딩, 크로마토그래픽 분리 및 재평형화보다 신속하여서 분리 유닛 (A1) 또는 분리 유닛 (A2) 중 어느 하나로부터 타겟 분자가 용출될 때마다 분리 유닛 (B) 은 새로운 로딩을 위한 준비를 한다. 그렇지 않으면, 분리 유닛 (B) 이 로딩을 위한 준비를 할 때까지 분리 유닛 (A1 또는 A2) 으로부터 타겟 분자의 용출이 지연되고 또는 제 2 분리 유닛 (B2) 이 시스템으로 통합될 수도 있다.
본 발명에 따른 방법을 수행할 때 분리 유닛 (A1/A2) 으로부터 분리 유닛 (B) 으로 타겟 분자를 용출시키는 것은, 타겟 분자를 함유한 전체 분획물 또는 분획물의 단지 일부가 분리 유닛 (B) 에 로딩될 수 있음을 의미한다. 불순물의 양을 줄이기 위해서 매우 적은 불순물을 함유한 분리 유닛 (B) 에 타겟 분자를 함유한 분획물의 단지 일부만 로딩하는 것이 바람직할 수 있다. 제 1 분리 단계 후 타겟 분자의 순도 및 다른 특성을 분석하기 위해서 프로세스 제어시 타겟 분자 분획물의 일부를 제거하는 것이 또한 가능하다.
하기에서 예시적인 실시형태가 또한 설명된다. 장치의 구성요소의 라벨링은 도 2 에 사용된 라벨링을 나타낸다.
A) 양자의 크로마토그래피 단계 (포집 및 연마) 에서 타겟 분자는 각각의 분리 유닛의 매트릭스에 바인딩되는 실시형태 (바인드-바인드 모드):
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 방법은 다음에 의해 수행된다:
a) 입구 (A; 예컨대, 용매 전달 시스템) 를 통하여 분리 유닛 (A1; 예컨대, 양이온 교환 재료) 에 샘플을 공급하는 것으로서, 샘플은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A1) 에 바인딩될 수 있고 바인딩되지 않은 분자가 출구 (A1-W) 를 통하여 인출될 수 있는 제 1 pH 및 전도율로 있고, 분리 유닛 (A2; 예컨대 양이온 교환 재료) 은 제 1 pH 에서 버퍼 (A) 로 바인딩된 타겟 분자의 세척, 제 2 pH 에서 버퍼 (B) 로 바인딩된 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (A) 로 분리 유닛 (A2) 의 재평형화를 위해 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (A2) 을 출구 (A2-W) 와 연결하는 동안 세척 및 재평형화 단계가 수행되고, 타겟 분자를 분리 유닛 (B) 으로 직접 이송하기 위해서 연결 라인 (C-P) 을 통하여 분리 유닛 (A2) 을 분리 유닛 (B; 예컨대 음이온 교환 배지) 과 연결하는 동안 용출 단계가 수행되고, 타겟 분자가 분리 유닛 (B) 에 바인딩될 수 있도록 하는 조건에서 분리 유닛 (A2) 으로부터 타겟 분자의 공급, 그 후 버퍼 (B) 로 세척, 버퍼 (A) 로 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (B) 로 재평형화시키기 위해 분리 유닛 (B) 은 입구 (C; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-W) 와 연결하는 동안 공급, 세척 및 재평형화 단계가 수행되고 정제된 타겟 분자 (예컨대 항체) 를 인출하기 위해서 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-P) 와 연결하는 동안 용출 단계가 수행된다.
b) 입구 (A; 예컨대 용매 전달 시스템) 를 통하여 분리 유닛 (A2; 예컨대 양이온 교환 재료) 에 샘플을 공급하는 것으로서, 샘플은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A2; 예컨대 양이온 교환 배지) 에 바인딩될 수 있고 바인딩되지 않은 분자가 출구 (A2-W) 를 통하여 인출될 수 있는 제 1 pH 및 전도율로 있고, 분리 유닛 (A1; 예컨대 양이온 교환 재료) 은 제 1 pH 에서 버퍼 (A) 로 바인딩된 타겟 분자의 세척, 제 2 pH 에서 버퍼 (B) 로 바인딩된 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (A) 로 분리 유닛 (A) 의 재평형화를 위해 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (A1) 을 출구 (A1-W) 와 연결하는 동안 세척 및 재평형화 단계가 수행되고, 타겟 분자를 분리 유닛 (B) 으로 직접 이송하기 위해서 연결 라인 (C-P) 을 통하여 분리 유닛 (A1) 을 분리 유닛 (B; 예컨대 음이온 교환 배지) 과 연결하는 동안 명명된 용출 단계가 수행되고, 타겟 분자가 분리 유닛 (B) 에 바인딩될 수 있도록 하는 조건에서 분리 유닛 (A1) 으로부터 타겟 분자의 공급, 그 후 버퍼 (B) 로 세척, 버퍼 (A) 로 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (B) 로 재평형화시키기 위해 분리 유닛 (B) 은 입구 (C; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-W) 와 연결하는 동안 공급, 세척 및 재평형화 단계가 수행되고 정제된 타겟 분자 (예컨대 항체) 를 인출하기 위해서 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-P) 와 연결하는 동안 용출 단계가 수행된다.
바람직하게 연속 모드를 위해, 단계 a) 와 단계 b) 가 적어도 2 번 반복된다.
바람직한 실시형태에서, 로딩 끝에, 상당한 손실 없이 특히 다량의 바인딩된 타겟 분자에 도달하도록 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A2) 에 바인딩될 수 있도록 하는 제 1 pH 및 전도율로 있는 샘플을 입구 (B, 예컨대 용매 전달 시스템) 를 통하여 분리 유닛 (A2; 예컨대 양이온 교환 재료) 으로 공급하는 동안, 즉 로딩이 거의 끝났을 때, 분리 유닛 (A2) 의 출구는 연결 라인 (F-F) 을 통하여 분리 유닛 (A1) 의 입구와 연결되어서 분리 유닛 (A2) 으로부터 타겟 분자의 침출을 개시하는 포집물이 분리 유닛 (A1) 에 바인딩될 수 있도록 한다. 분리 유닛 (A2) 으로부터 타겟 분자의 너무 많은 침출이 검출되자마자, 샘플 공급은 분리 유닛 (A2) 에서 분리 유닛 (A1) 으로 스위칭된다. 한편, 분리 유닛 (A1) 에서 타겟 분자는 세척되고 분리 유닛 (B) 으로 용출된다. 분리 유닛 (A1) 의 재평형화 후 그것의 입구는 분리 유닛 (A2) 의 출구에 연결되어서 분리 유닛 (A1) 으로부터 타겟 분자의 침출 개시가 분리 유닛 (A2) 에 바인딩되도록 보장한다.
2 개의 분리 유닛 (A1, A2) 의 이런 특정한 중간 연결은 매우 다량의 타겟 분자를 분리 유닛 (A1, A2) 에 로딩함으로써 시간을 절약하는 유일한 가능성을 제공한다. 공지된 크로마토그래피 시스템에서, 전형적으로, 탑은 약 60 ~ 80% 의 동적 바인딩 용량까지 로딩된다. 2 개의 분리 유닛 (A1, A2) 의 특정한 중간 연결을 갖는 본 발명에 따른 장치 및 방법은 80% 초과 동적 바인딩 용량까지, 바람직하게 타겟 분자의 손실 없이 80 ~ 95% 동적 바인딩 용량까지 분리 유닛 (A1, A2) 을 로딩할 수 있는 가능성을 제공한다. 크로마토그래피 배지의 동적 바인딩 용량은, 바인딩되지 않은 단백질의 상당한 브레이크스루 (breakthrough) 가 발생하기 전 배지가 실제 유동 조건 하에 바인딩할 타겟 분자의 양이다.
샘플이 분리 유닛 (A1) 에 로딩된다면, 특히 로딩이 거의 완료되고 타겟 분자가 분리 유닛 밖으로 침출되기 시작할 때, 분리 유닛 (A1) 의 출구는 분리 유닛 (A2) 의 입구에 연결될 수 있어서 그렇지 않으면 다시 샘플 공급물에 수집되어 넣어야 하는 타겟 분자가 분리 유닛 (A2) 에 직접 공급된다. 본 기술분야의 당업자는, 분리 유닛 (A1) 으로 샘플 공급을 중단하고 분리 유닛 (A2) 으로 샘플 공급을 스위칭하는 최고의 시점이 언제인지 결정할 수 있다. 동시에 또한 분리 유닛 (A1) 의 출구와 분리 유닛 (A2) 의 입구 연결이 차단되고 분리 유닛 (A2) 이 샘플 공급물을 추가로 로딩받는 동안, 분리 유닛 (A1) 은 세척된 후 분리 유닛 (B) 의 입구와 연결되어서 타겟 분자를 분리 유닛 (B) 으로 용출시킨다. 분리 유닛 (A1) 의 재평형화 후 그것은 다시 분리 유닛 (A2) 의 출구에 연결되어서 샘플 로딩 끝에 분리 유닛 (A2) 으로부터 침출될 수도 있는 타겟 분자를 포집한다.
이 실시형태에 적합한 장치의 개략도는 도 3 에 나타나 있다. 도 3 에 나타낸 개략도에 따른 장치를 사용하면, 본 발명의 방법은 예를 들어 다음과 같이 수행될 수 있다:
a) 입구 (B; 예컨대, 용매 전달 시스템) 를 통하여 분리 유닛 (A1; 예컨대, 양이온 교환 재료) 에 샘플을 공급하는 것으로서, 샘플은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A1) 에 바인딩될 수 있고 바인딩되지 않은 분자가 출구 (A1-W) 를 통하여 인출될 수 있는 제 1 pH 및 전도율로 있고, 분리 유닛 (A2; 예컨대 양이온 교환 재료) 은 제 1 pH 에서 버퍼 (A) 로 바인딩된 타겟 분자의 세척, 제 2 pH 에서 버퍼 (B) 로 바인딩된 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (A) 로 분리 유닛 (A2) 의 재평형화를 위해 입구 (A; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (A2) 을 출구 (A2-W) 와 연결하는 동안 세척 및 재평형화 단계가 수행되고, 타겟 분자를 분리 유닛 (B) 으로 직접 이송하기 위해서 연결 라인 (C-P) 을 통하여 분리 유닛 (A2) 을 분리 유닛 (B; 예컨대 음이온 교환 배지) 과 연결하는 동안 용출 단계가 수행되고, 타겟 분자가 분리 유닛 (B) 에 바인딩될 수 있도록 하는 조건에서 분리 유닛 (A2) 으로부터 타겟 분자의 공급, 그 후 버퍼 (B) 로 세척, 버퍼 (A) 로 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (B) 로 재평형화시키기 위해 분리 유닛 (B) 은 입구 (C; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-W) 와 연결하는 동안 공급, 세척 및 재평형화 단계가 수행되고 정제된 타겟 분자 (예컨대 항체) 를 인출하기 위해서 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-P) 와 연결하는 동안 용출 단계가 수행된다.
b) 로딩이 분리 유닛 (A1) 에서 거의 끝났을 때, 그것은 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 를 통하여 추가로 로딩되고 샘플은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A1) 에 바인딩될 수 있도록 하는 제 1 pH 및 전도율로 있고 바인딩되지 않은 타겟 분자는 연결 라인 (F-F) 을 통하여 직접 분리 유닛 (A2) 으로 이송되고 바인딩되지 않은 분자는 출구 (A2-W) 를 통하여 인출될 수 있도록 한다. 동시에, 분리 유닛 (B) 은 재평형화를 위해 입구 (C) 에 연결된다.
c) 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 를 통하여 분리 유닛 (A2; 예컨대 양이온 교환 재료) 에 샘플을 공급하는 것으로서, 조성물은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A2; 예컨대 양이온 교환 배지) 에 바인딩될 수 있고 바인딩되지 않은 분자가 출구 (A2-W) 를 통하여 인출될 수 있는 제 1 pH 및 전도율로 있고, 분리 유닛 (A1; 예컨대 양이온 교환 재료) 은 제 1 pH 에서 버퍼 (A) 로 바인딩된 타겟 분자의 세척, 제 2 pH 에서 버퍼 (B) 로 바인딩된 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (A) 로 분리 유닛 (A) 의 재평형화를 위해 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (A1) 을 출구 (A1-W) 와 연결하는 동안 세척 및 재평형화 단계가 수행되고, 타겟 분자를 분리 유닛 (B) 으로 직접 이송하기 위해서 연결 라인 (C-P) 을 통하여 분리 유닛 (A1) 을 분리 유닛 (B; 예컨대 음이온 교환 배지) 과 연결하는 동안 명명된 용출 단계가 수행되고, 타겟 분자가 분리 유닛 (B) 에 바인딩될 수 있도록 하는 조건에서 분리 유닛 (A1) 으로부터 타겟 분자의 공급, 버퍼 (B) 로 세척, 버퍼 (A) 로 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (B) 로 재평형화시키기 위해 분리 유닛 (B) 은 입구 (C; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-W) 와 연결하는 동안 공급, 세척 및 재평형화 단계가 수행되고 정제된 타겟 분자 (예컨대 항체) 를 인출하기 위해서 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-P) 와 연결하는 동안 용출 단계가 수행된다.
d) 로딩이 분리 유닛 (A2) 에서 거의 끝났을 때, 그것은 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 를 통하여 추가로 로딩되고 샘플은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A2) 에 바인딩될 수 있도록 하는 제 1 pH 및 전도율로 있고 바인딩되지 않은 타겟 분자는 연결 라인 (F-F) 을 통하여 직접 분리 유닛 (A2) 으로 이송되고 바인딩되지 않은 분자는 출구 (A2-W) 를 통하여 인출될 수 있도록 한다. 동시에, 분리 유닛 (B) 은 재평형화를 위해 입구 (C) 에 연결된다.
연속 모드에 대해 바람직하게, 단계 a) 내지 단계 d) 는 적어도 2 회 반복된다.
세척 중 흔히 바인딩되지 않은 타겟 분자의 용출로부터 기인하는 타겟 분자의 손실이 본 발명에 따른 방법을 수행하는 다음 방식에 의해 감소될 수 있음을 발견하였다:
바람직한 실시형태에서, 분리 유닛 (A2 또는 A1 각각) 이 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 를 통하여 다량의 바인딩된 타겟 분자에 로딩된 후, 세척 중 바인딩되지 않은 타겟 분자는 분리 유닛 (A1) 으로 세척되어서 상당한 손실 없이 바인딩되지 않은 타겟 분자를 이송한다. 그것은 로딩이 완료되었을 때, 분리 유닛 (A2) 의 출구가 예컨대 연결 라인 (W-F) 을 통하여 분리 유닛 (A1) 의 입구와 연결되어서, 분리 유닛 (A2) 으로부터 세척된 타겟 분자의 포집물이 분리 유닛 (A1; 도 4 참조) 에 바인딩될 수 있도록 하는 것을 의미한다. 분리 유닛 (A2) 으로부터 너무 적은 타겟 분자가 검출되자마자, 유체 연통은 차단되고 분리 유닛 (A2) 출구는 출구 위치 (A2-W) 로 스위칭되어서 바인딩되지 않은 분자를 인출한다. 한편, 분리 유닛 (A2) 에서 타겟 분자가 추가로 세척되어 분리 유닛 (B) 으로 용출됨에 따라 타겟 분자는 분리 유닛 (A1) 에 추가로 로딩된다. 분리 유닛 (A2) 의 재평형화 후 그것의 입구는 분리 유닛 (A1) 의 출구에 연결되어서 분리 유닛 (A1) 으로부터 타겟 분자의 침출 개시가 분리 유닛 (A2) 에 바인딩되도록 보장한다.
2 개의 분리 유닛 (A1, A2) 의 이런 특정한 중간 연결은 분리 유닛을 세척함으로써 시간을 절약하고 타겟 분자 손실을 회피하는 유일한 가능성을 제공한다. 공지된 크로마토그래피 시스템에서, 전형적으로, 탑 세척 분획물은 회수되어 폐기되거나 공급 리저버로 다시 수집된다. 본 발명에 따른 장치 및 방법은 이 바람직한 정제 프로세스를 사용함으로써 바람직하게 총 타겟 분자 손실의 2 ~ 3% 까지 낮은 타겟 분자 손실로 분리 유닛 (A1, A2) 을 세척할 수 있는 가능성을 제공한다.
이 실시형태에 적합한 장치의 개략도는 도 4 에 나타나 있다. 도 4 에 나타낸 개략도에 따른 장치를 사용했을 때, 본 발명의 방법은 예를 들어 다음과 같이 수행될 수 있다:
a) 입구 (B; 예컨대, 용매 전달 시스템) 를 통하여 분리 유닛 (A1; 예컨대, 양이온 교환 재료) 에 샘플을 공급하는 것으로서, 샘플은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A1) 에 바인딩될 수 있고 바인딩되지 않은 분자가 출구 (A1-W) 를 통하여 인출될 수 있는 제 1 pH 및 전도율로 있고, 분리 유닛 (A2; 예컨대 양이온 교환 재료) 은 제 1 pH 에서 버퍼 (A) 로 바인딩된 타겟 분자의 세척, 제 2 pH 에서 버퍼 (B) 로 바인딩된 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (A) 로 분리 유닛 (A2) 의 재평형화를 위해 입구 (A; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (A2) 을 출구 (A2-W) 와 연결하는 동안 세척 및 재평형화 단계가 수행되고, 타겟 분자를 분리 유닛 (B) 으로 직접 이송하기 위해서 연결 라인 (C-P) 을 통하여 분리 유닛 (A2) 을 분리 유닛 (B; 예컨대 음이온 교환 배지) 과 연결하는 동안 용출 단계가 수행되고, 타겟 분자가 분리 유닛 (B) 에 바인딩될 수 있도록 하는 조건에서 분리 유닛 (A2) 으로부터 타겟 분자의 공급, 그 후 버퍼 (B) 로 세척, 버퍼 (A) 로 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (B) 로 재평형화시키기 위해 분리 유닛 (B) 은 입구 (C; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-W) 와 연결하는 동안 공급, 세척 및 재평형화 단계가 수행되고 정제된 타겟 분자 (예컨대 항체) 를 인출하기 위해서 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-P) 와 연결하는 동안 용출 단계가 수행된다.
b) 로딩이 분리 유닛 (A1) 에서 거의 끝났을 때, 그것은 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 를 통하여 추가로 로딩되고 샘플은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A1) 에 바인딩될 수 있도록 하는 제 1 pH 및 전도율로 있고 바인딩되지 않은 타겟 분자는 연결 라인 (F-F) 을 통하여 직접 분리 유닛 (A2) 으로 이송되고 바인딩되지 않은 분자는 출구 (A2-W) 를 통하여 인출될 수 있도록 한다. 동시에, 분리 유닛 (B) 은 재평형화를 위해 입구 (C) 에 연결된다.
c) 분리 유닛 (A1) 의 로딩이 완료될 때, 분리 유닛 (A1) 을 연결 라인 (W-F) 으로 분리 유닛 (A2) 과 연결하면서 분리 유닛 (A1) 으로부터 바인딩되지 않은 타겟 분자가 입구 (A) 를 사용해 세척되고, 그것은 입구 (B) 를 통하여 로딩된다. 분리 유닛 (A1) 으로부터 너무 적은 타겟 분자가 검출되자마자, 연결이 차단되고 분리 유닛 (A1) 출구는 출구 위치 (A1-W) 로 스위칭되어서 바인딩되지 않은 분자를 인출하고, 한편 타겟 분자는 분리 유닛 (A2) 에 추가로 로딩되고 바인딩되지 않은 분자는 출구 (A2-W) 를 통하여 인출된다.
d) 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 를 통하여 분리 유닛 (A2; 예컨대 양이온 교환 재료) 에 샘플을 공급하는 것으로서, 조성물은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A2; 예컨대 양이온 교환 배지) 에 바인딩될 수 있고 바인딩되지 않은 분자가 출구 (A2-W) 를 통하여 인출될 수 있는 제 1 pH 및 전도율로 있고, 분리 유닛 (A1; 예컨대 양이온 교환 재료) 은 제 1 pH 에서 버퍼 (A) 로 바인딩된 타겟 분자의 세척, 제 2 pH 에서 버퍼 (B) 로 바인딩된 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (A) 로 분리 유닛 (A) 의 재평형화를 위해 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (A1) 을 출구 (A1-W) 와 연결하는 동안 세척 및 재평형화 단계가 수행되고, 타겟 분자를 분리 유닛 (B) 으로 직접 이송하기 위해서 연결 라인 (C-P) 을 통하여 분리 유닛 (A1) 을 분리 유닛 (B; 예컨대 음이온 교환 배지) 과 연결하는 동안 명명된 용출 단계가 수행되고, 타겟 분자가 분리 유닛 (B) 에 바인딩될 수 있도록 하는 조건에서 분리 유닛 (A1) 으로부터 타겟 분자의 공급, 버퍼 (B) 로 세척, 버퍼 (A) 로 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (B) 로 재평형화시키기 위해 분리 유닛 (B) 은 입구 (C; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-W) 와 연결하는 동안 공급, 세척 및 재평형화 단계가 수행되고 정제된 타겟 분자 (예컨대 항체) 를 인출하기 위해서 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-P) 와 연결하는 동안 용출 단계가 수행된다.
e) 로딩이 분리 유닛 (A2) 에서 거의 끝났을 때, 그것은 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 를 통하여 추가로 로딩되고 샘플은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A2) 에 바인딩될 수 있도록 하는 제 1 pH 및 전도율로 있고 바인딩되지 않은 타겟 분자는 연결 라인 (F-F) 을 통하여 직접 분리 유닛 (A1) 으로 이송되고 바인딩되지 않은 분자는 출구 (A1-W) 를 통하여 인출될 수 있도록 한다. 동시에, 분리 유닛 (B) 은 재평형화를 위해 입구 (C) 에 연결된다.
f) 분리 유닛 (A2) 의 로딩이 완료될 때, 분리 유닛 (A2) 을 연결 라인 (W-F) 으로 분리 유닛 (A1) 과 연결하면서 분리 유닛 (A2) 으로부터 바인딩되지 않은 타겟 분자가 입구 (A) 를 사용해 세척되고, 그것은 입구 (B) 를 통하여 로딩된다. 분리 유닛 (A2) 으로부터 너무 적은 타겟 분자가 검출되자마자, 연결이 차단되고 분리 유닛 (A2) 출구는 출구 위치 (A2-W) 로 스위칭되어서 바인딩되지 않은 분자를 인출하고, 한편 타겟 분자는 분리 유닛 (A1) 에 추가로 로딩되고 바인딩되지 않은 분자는 출구 (A1-W) 를 통하여 인출된다.
연속 모드를 위해 바람직하게, 단계 a) 내지 단계 f) 는 적어도 2 번 반복된다.
B) 제 1 크로마토그래피 단계 (포집) 에서 타겟 분자가 각각의 분리 유닛의 매트릭스에 바인딩되고 제 2 크로마토그래픽 단계 (연마) 에서 불순물이 바인딩되는 동안 (바인드-관류 모드) 타겟 분자가 매트릭스에 약하게 바인딩되거나 바인딩되지 않는 실시형태:
일 실시형태에서, 제 1 크로마토그래픽 디멘션을 위한 분리 유닛 (A1, A2) 은 샘플로 연속적으로, 순차적으로 로딩되어서 샘플이 분리 유닛 (A1) 에 로딩되는 동안, 분리 유닛 (A2) 은 분리 유닛 (B) 과 적어도 부분적으로 유체 연결되어서 타겟 분자는 분리 유닛 (B) 으로 용출되고 분리 유닛 (A2) 은 재평형화되고 샘플이 분리 유닛 (A2) 에 로딩되는 동안, 분리 유닛 (A1) 은 분리 유닛 (B) 과 적어도 부분적으로 유체 연결되어서 타겟 분자는 분리 유닛 (B) 으로 용출되고 분리 유닛 (A1) 은 재평형화된다.
게다가, 관류 모드에서 제 2 크로마토그래피 단계는 분리 유닛 (B) 에서 일어나서 분리 유닛 (B) 의 유체 출구로부터 정제된 타겟 분자의 회수를 이끈다.
본 발명의 방법이 연속 모드로 작동하도록 보장하기 위해서, 바인드-용출 크로마토그래픽 분리 단계의 용출 조건은 분리 유닛 (B) 에서 수행된 관류 단계를 위한 로딩 조건으로 조정될 필요가 있다. 전형적으로, 분리 유닛 (B) 에서 타겟 분자의 약한 바인딩 조건 또는 바인딩되지 않은 조건을 조정하기 위해서, 분리 유닛 (B) 에 로딩하기에 적합한 조건하에 분리 유닛 (A1, A2) 으로부터 타겟 분자를 용출할 수 없다면, 입구 (C) 가 사용될 수도 있다. 최적의 일정한 약한 바인딩 또는 비바인딩 성능을 얻기 위해서, pH 및 전도율과 같은 일정한 용액 특성이 필요하다. 이것은, 예컨대 인라인 희석 또는 버퍼 교환에 의해 입구 (C) 를 통하여 분리 유닛 (A1 또는 A2) 으로부터 용출하는 타겟 분자를 컨디셔닝하는 동안 수행된다.
간혹, 생물약제 생성물 정제는 매우 유사한 불순물로부터 타겟 분자의 분리를 포함하고 약한 이온 교환 크로마토그래피와 같은 민감한 분리 방법이 요구된다. 본 발명의 방법에 대해, 바인드 용출 모드에서 친화성 분리를 수행하고, 타겟 단백질에 대한 약한 바인딩 또는 비바인딩 조건 (관류) 에서 음이온 교환 크로마토그래피를 수행할 수 있다. 이것은 매우 강력한 도구인 것으로 보였다. 특히, 이 관류 연마를 위한 여러 매트릭스의 조합은 양이온 교환 또는 음이온 교환 또는 소수성 기능성 및 그것의 혼합물과 같은 여러 가지 상이한 기능성에 의해 흡착 불순물을 통하여 요구되는 생성물 순도에 도달할 수 있도록 한다.
관류 크로마토그래피 단계를 위해 활성탄과 같은 매우 약한 이온 교환 매트릭스 또는 약한 혼합 모드 매트릭스를 또한 사용할 수 있다. 탄소질 재료, 활성탄 및 관류 정제 프로세스에서 그것의 사용에 대한 추가 세부사항은 미국 가특허 출원 제 61/575349 호에서 발견될 수 있고, 이 출원은 본원에 참조로 원용된다. 하기에서 예시적인 실시형태가 추가 설명된다. 장치의 구성요소의 라벨링은 도 2 에서 사용된 라벨링을 나타낸다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 방법은 다음에 의해 수행된다:
a) 입구 (B; 예컨대, 용매 전달 시스템) 를 통하여 분리 유닛 (A1; 예컨대, 양이온 교환 재료 또는 친화성 재료) 에 샘플을 공급하는 것으로서, 샘플은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A1) 에 바인딩될 수 있고 바인딩되지 않은 분자가 출구 (A1-W) 를 통하여 인출될 수 있는 제 1 pH 및 전도율로 있고, 분리 유닛 (A2; 예컨대 양이온 교환 재료 또는 친화성 재료) 은 제 1 pH 에서 버퍼 (A) 로 바인딩된 타겟 분자의 세척, 제 2 pH 에서 버퍼 (B) 로 바인딩된 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (A) 로 분리 유닛 (A2) 의 재평형화를 위해 입구 (A; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (A2) 을 출구 (A2-W) 와 연결하는 동안 세척 및 재평형화 단계가 수행되고, 타겟 분자를 분리 유닛 (B) 으로 직접 이송하기 위해서 연결 라인 (C-P) 을 통하여 분리 유닛 (A2) 을 분리 유닛 (B; 예컨대 음이온 교환 배지 또는 혼합 모드 배지) 과 연결하는 동안 용출 단계가 수행되고, 타겟 분자가 분리 유닛 (B) 에 약하게 바인딩되거나 바인딩되지 않을 수 있도록 하는 조건에서 분리 유닛 (A2) 으로부터 타겟 분자의 공급, 그 후 버퍼 (B) 로 분리 유닛 (B) 재평형화시키기 위해 분리 유닛 (B) 은 입구 (C; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-W) 와 연결하는 동안 재평형화 단계가 수행되고 정제된 타겟 분자 (예컨대 항체) 를 인출하기 위해서 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-P) 와 연결하는 동안 공급 단계가 수행된다.
b) 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 를 통하여 분리 유닛 (A2; 예컨대 양이온 교환 재료 또는 친화성 재료) 에 샘플을 공급하는 것으로서, 조성물은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A2; 예컨대 양이온 교환 배지 또는 친화성 재료) 에 바인딩될 수 있고 바인딩되지 않은 분자가 출구 (A2-W) 를 통하여 인출될 수 있는 제 1 pH 및 전도율로 있고, 분리 유닛 (A1; 예컨대 양이온 교환 재료 또는 친화성 재료) 은 제 1 pH 에서 버퍼 (A) 로 바인딩된 타겟 분자의 세척, 제 2 pH 에서 버퍼 (B) 로 바인딩된 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (A) 로 분리 유닛 (A) 의 재평형화를 위해 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (A1) 을 출구 (A1-W) 와 연결하는 동안 세척 및 재평형화 단계가 수행되고, 타겟 분자를 분리 유닛 (B) 으로 직접 이송하기 위해서 연결 라인 (C-P) 을 통하여 분리 유닛 (A1) 을 분리 유닛 (B; 예컨대 음이온 교환 배지 또는 혼합 모드 배지) 과 연결하는 동안 명명된 용출 단계가 수행되고, 타겟 분자가 분리 유닛 (B) 에 약하게 바인딩되거나 바인딩되지 않을 수 있도록 하는 조건에서 분리 유닛 (A1) 으로부터 타겟 분자의 공급, 그 후 버퍼 (B) 로 분리 유닛 (B) 을 재평형화시키기 위해 분리 유닛 (B) 은 입구 (C; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-W) 와 연결하는 동안 재평형화 단계가 수행되고 정제된 타겟 분자 (예컨대 항체) 를 인출하기 위해서 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-P) 와 연결하는 동안 공급 단계가 수행된다.
바람직하게 연속 모드를 위해, 단계 a) 와 단계 b) 가 적어도 2 번 반복된다.
바람직한 실시형태에서, 로딩 끝에, 상당한 손실 없이 특히 다량의 바인딩된 타겟 분자에 도달하도록 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A2) 에 바인딩될 수 있도록 하는 제 1 pH 및 전도율로 있는 조성물을 입구 (B, 예컨대 용매 전달 시스템) 를 통하여 분리 유닛 (A2; 예컨대 양이온 교환 재료 또는 친화성 재료) 으로 공급하는 동안, 즉 로딩이 거의 끝났을 때, 분리 유닛 (A2) 의 출구는 연결 라인 (F-F) 을 통하여 분리 유닛 (A1) 의 입구와 연결되어서 분리 유닛 (A2) 으로부터 타겟 분자의 침출을 시작하는 포집물이 분리 유닛 (A1) 에 바인딩될 수 있도록 한다 (도 3 참조). 분리 유닛 (A2) 으로부터 타겟 분자의 너무 많은 침출이 검출되자마자, 샘플 공급은 분리 유닛 (A2) 에서 분리 유닛 (A1) 으로 스위칭된다. 한편, 분리 유닛 (A1) 에서 타겟 분자는 세척되고 분리 유닛 (B) 으로 용출된다. 분리 유닛 (A1) 의 재평형화 후 그것의 입구는 분리 유닛 (A2) 의 출구에 연결되어서 분리 유닛 (A1) 으로부터 타겟 분자의 침출 개시가 분리 유닛 (A2) 에 바인딩되도록 보장한다.
2 개의 분리 유닛 (A1, A2) 의 이런 특정한 중간 연결은 매우 다량의 타겟 분자를 분리 유닛 (A1, A2) 에 로딩함으로써 시간을 절약하는 유일한 가능성을 제공한다. 공지된 크로마토그래피 시스템에서, 전형적으로, 탑은 약 60 ~ 80% 의 동적 바인딩 용량까지 로딩된다. 본 발명에 따른 장치 및 방법은 80% 초과 동적 바인딩 용량까지, 바람직하게 80 ~ 95% 동적 바인딩 용량까지 분리 유닛 (A1, A2) 을 로딩할 수 있는 가능성을 제공한다.
이 실시형태에 적합한 장치의 개략도는 도 3 에 나타나 있다. 도 3 에 나타낸 개략도에 따른 장치를 사용하여, 본 발명의 방법은 예를 들어 다음과 같이 수행될 수 있다:
a) 입구 (B; 예컨대, 용매 전달 시스템) 를 통하여 분리 유닛 (A1; 예컨대, 양이온 교환 재료 또는 친화성 재료) 에 샘플을 공급하는 것으로서, 샘플은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A1) 에 바인딩될 수 있고 바인딩되지 않은 분자가 출구 (A1-W) 를 통하여 인출될 수 있는 제 1 pH 및 전도율로 있고, 분리 유닛 (A2; 예컨대 양이온 교환 재료) 은 제 1 pH 에서 버퍼 (A) 로 바인딩된 타겟 분자의 세척, 제 2 pH 에서 버퍼 (B) 로 바인딩된 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (A) 로 분리 유닛 (A2) 의 재평형화를 위해 입구 (A; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (A2) 을 출구 (A2-W) 와 연결하는 동안 세척 및 재평형화 단계가 수행되고, 타겟 분자를 분리 유닛 (B) 으로 직접 이송하기 위해서 연결 라인 (C-P) 을 통하여 분리 유닛 (A2) 을 분리 유닛 (B; 예컨대 음이온 교환 배지 또는 혼합 모드 배지) 과 연결하는 동안 용출 단계가 수행되고, 타겟 분자가 분리 유닛 (B) 에 약하게 바인딩되거나 바인딩되지 않을 수 있도록 하는 조건에서 분리 유닛 (A2) 으로부터 타겟 분자의 공급, 그 후 버퍼 (B) 로 분리 유닛 (B) 을 재평형화시키기 위해 분리 유닛 (B) 은 입구 (C; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-W) 와 연결하는 동안 재평형화 단계가 수행되고 정제된 타겟 분자 (예컨대 항체) 를 인출하기 위해서 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-P) 와 연결하는 동안 공급 단계가 수행된다.
b) 로딩이 분리 유닛 (A1) 에서 거의 끝났을 때, 그것은 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 를 통하여 추가로 로딩되고 샘플은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A1) 에 바인딩될 수 있도록 하는 제 1 pH 및 전도율로 있고 바인딩되지 않은 타겟 분자는 연결 라인 (F-F) 을 통하여 직접 분리 유닛 (A2) 으로 이송되고 바인딩되지 않은 분자는 출구 (A2-W) 를 통하여 인출될 수 있도록 한다. 동시에, 분리 유닛 (B) 은 재평형화를 위해 입구 (C) 에 연결된다.
c) 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 를 통하여 분리 유닛 (A2; 예컨대 양이온 교환 재료 또는 친화성 재료) 에 샘플을 공급하는 것으로서, 조성물은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A2; 예컨대 양이온 교환 배지 또는 친화성 재료) 에 바인딩될 수 있고 바인딩되지 않은 분자가 출구 (A2-W) 를 통하여 인출될 수 있는 제 1 pH 및 전도율로 있고, 분리 유닛 (A1; 예컨대 양이온 교환 재료 또는 친화성 재료) 은 제 1 pH 에서 버퍼 (A) 로 바인딩된 타겟 분자의 세척, 제 2 pH 에서 버퍼 (B) 로 바인딩된 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (A) 로 분리 유닛 (A) 의 재평형화를 위해 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (A1) 을 출구 (A1-W) 와 연결하는 동안 세척 및 재평형화 단계가 수행되고, 타겟 분자를 분리 유닛 (B) 으로 직접 이송하기 위해서 연결 라인 (C-P) 을 통하여 분리 유닛 (A1) 을 분리 유닛 (B; 예컨대 음이온 교환 배지 또는 혼합 모드 배지) 과 연결하는 동안 명명된 용출 단계가 수행되고, 타겟 분자가 분리 유닛 (B) 에 약하게 바인딩되거나 바인딩되지 않을 수 있도록 하는 조건에서 분리 유닛 (A1) 으로부터 타겟 분자의 공급, 그 후 버퍼 (B) 로 분리 유닛 (B) 을 재평형화시키기 위해 분리 유닛 (B) 은 입구 (C; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-W) 와 연결하는 동안 재평형화 단계가 수행되고 정제된 타겟 분자 (예컨대 항체) 를 인출하기 위해서 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-P) 와 연결하는 동안 공급 단계가 수행된다.
d) 로딩이 분리 유닛 (A2) 에서 거의 끝났을 때, 그것은 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 를 통하여 추가로 로딩되고 샘플은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A2) 에 바인딩될 수 있도록 하는 제 1 pH 및 전도율로 있고 바인딩되지 않은 타겟 분자는 연결 라인 (F-F) 을 통하여 직접 분리 유닛 (A1) 으로 이송되고 바인딩되지 않은 분자는 출구 (A1-W) 를 통하여 인출될 수 있도록 한다. 동시에, 분리 유닛 (B) 은 재평형화를 위해 입구 (C) 에 연결된다.
연속 모드에 대해 바람직하게, 단계 a) 내지 단계 d) 는 적어도 2 회 반복된다.
바람직한 실시형태에서, 분리 유닛 (A2; 예컨대 양이온 교환 재료 또는 친화성 재료) 이 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 를 통하여 상당한 손실 없이 특히 다량의 바인딩된 타겟 분자에 로딩될 때, 조성물은 타겟 분자 (예컨대, 항체) 가 분리 유닛 (A2) 에 바인딩될 수 있도록 하는 제 1 pH 및 전도율로 있고, 바인딩되지 않은 타겟 분자는 분리 유닛 (A1) 으로 세척되어서 상당한 손실 없이 바인딩되지 않은 타겟 분자를 이송한다. 그것은 로딩이 완료되었을 때, 분리 유닛 (A2) 의 출구가 연결 라인 (W-F) 을 통하여 분리 유닛 (A1) 의 입구와 연결되어서, 분리 유닛 (A2) 으로부터 세척된 타겟 분자의 포집물이 분리 유닛 (A1; 도 4 참조) 에 바인딩될 수 있도록 하는 것을 의미한다. 분리 유닛 (A2) 으로부터 너무 적은 타겟 분자가 검출되자마자, 연결이 차단되고 분리 유닛 (A2) 출구는 출구 위치 (A2-W) 로 스위칭되어서 바인딩되지 않은 분자를 인출한다. 한편, 분리 유닛 (A2) 에서 타겟 분자가 추가로 세척되어 분리 유닛 (B) 으로 용출됨에 따라 타겟 분자는 분리 유닛 (A1) 에 추가로 로딩된다. 분리 유닛 (A2) 의 재평형화 후 그것의 입구는 분리 유닛 (A1) 의 출구에 연결되어서 분리 유닛 (A1) 으로부터 타겟 분자의 침출 개시가 분리 유닛 (A2) 에 바인딩되도록 보장한다.
2 개의 분리 유닛 (A1, A2) 의 이런 특정한 중간 연결은 분리 유닛을 세척함으로써 시간을 절약하고 타겟 분자 손실을 회피하는 유일한 가능성을 제공한다. 공지된 크로마토그래피 시스템에서, 전형적으로, 탑 세척 분획물은 회수되어 폐기되거나 공급 리저버로 다시 수집된다. 본 발명에 따른 장치 및 방법은 이 바람직한 정제 프로세스에서 바람직하게 총 타겟 분자 손실의 2 ~ 3% 까지 낮은 타겟 분자 손실로 분리 유닛 (A1, A2) 을 세척할 수 있는 가능성을 제공한다.
이 실시형태에 적합한 장치의 개략도는 도 4 에 나타나 있다. 도 4 에 나타낸 개략도에 따른 장치를 사용했을 때, 본 발명의 방법은 예를 들어 다음과 같이 수행될 수 있다:
a) 입구 (B; 예컨대, 용매 전달 시스템 또는 친화성 재료) 를 통하여 분리 유닛 (A1; 예컨대, 양이온 교환 재료) 에 샘플을 공급하는 것으로서, 샘플은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A1) 에 바인딩될 수 있고 바인딩되지 않은 분자가 출구 (A1-W) 를 통하여 인출될 수 있는 제 1 pH 및 전도율로 있고, 분리 유닛 (A2; 예컨대 양이온 교환 재료 또는 친화성 재료) 은 제 1 pH 에서 버퍼 (A) 로 바인딩된 타겟 분자의 세척, 제 2 pH 에서 버퍼 (B) 로 바인딩된 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (A) 로 분리 유닛 (A2) 의 재평형화를 위해 입구 (A; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (A2) 을 출구 (A2-W) 와 연결하는 동안 세척 및 재평형화 단계가 수행되고, 타겟 분자를 분리 유닛 (B) 으로 직접 이송하기 위해서 연결 라인 (C-P) 을 통하여 분리 유닛 (A2) 을 분리 유닛 (B; 예컨대 음이온 교환 배지) 과 연결하는 동안 용출 단계가 수행되고, 타겟 분자가 분리 유닛 (B) 에 약하게 바인딩되거나 바인딩되지 않을 수 있도록 하는 조건에서 분리 유닛 (A2) 으로부터 타겟 분자를 공급하고, 버퍼 (B) 로 분리 유닛 (B) 을 재평형화시키기 위해 분리 유닛 (B) 은 입구 (C; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-W) 와 연결하는 동안 재평형화 단계가 수행되고 정제된 타겟 분자 (예컨대 항체) 를 인출하기 위해서 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-P) 와 연결하는 동안 공급 단계가 수행된다.
b) 로딩이 분리 유닛 (A1) 에서 거의 끝났을 때, 그것은 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 를 통하여 추가로 로딩되고 샘플은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A1) 에 바인딩될 수 있도록 하는 제 1 pH 및 전도율로 있고 바인딩되지 않은 타겟 분자는 연결 라인 (F-F) 을 통하여 직접 분리 유닛 (A2) 으로 이송되고 바인딩되지 않은 분자는 출구 (A2-W) 를 통하여 인출될 수 있도록 한다. 동시에, 분리 유닛 (B) 은 재평형화를 위해 입구 (C) 에 연결된다.
c) 분리 유닛 (A1) 의 로딩이 완료될 때, 분리 유닛 (A1) 을 연결 라인 (W-F) 으로 분리 유닛 (A2) 과 연결하면서 분리 유닛 (A1) 으로부터 바인딩되지 않은 타겟 분자가 입구 (A) 를 사용해 세척되고, 그것은 입구 (B) 를 통하여 로딩된다. 분리 유닛 (A1) 으로부터 너무 적은 타겟 분자가 검출되자마자, 연결이 차단되고 분리 유닛 (A1) 출구는 출구 위치 (A1-W) 로 스위칭되어서 바인딩되지 않은 분자를 인출하고, 한편 타겟 분자는 분리 유닛 (A2) 에 추가로 로딩되고 바인딩되지 않은 분자는 출구 (A2-W) 를 통하여 인출된다.
d) 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 를 통하여 분리 유닛 (A2; 예컨대 양이온 교환 재료) 에 샘플을 공급하는 것으로서, 조성물은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A2; 예컨대 양이온 교환 배지) 에 바인딩될 수 있고 바인딩되지 않은 분자가 출구 (A2-W) 를 통하여 인출될 수 있는 제 1 pH 및 전도율로 있고, 분리 유닛 (A1; 예컨대 양이온 교환 재료) 은 제 1 pH 에서 버퍼 (A) 로 바인딩된 타겟 분자의 세척, 제 2 pH 에서 버퍼 (B) 로 바인딩된 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (A) 로 분리 유닛 (A) 의 재평형화를 위해 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (A1) 을 출구 (A1-W) 와 연결하는 동안 세척 및 재평형화 단계가 수행되고, 타겟 분자를 분리 유닛 (B) 으로 직접 이송하기 위해서 연결 라인 (C-P) 을 통하여 분리 유닛 (A1) 을 분리 유닛 (B; 예컨대 음이온 교환 배지) 과 연결하는 동안 명명된 용출 단계가 수행되고, 타겟 분자가 분리 유닛 (B) 에 약하게 바인딩되거나 바인딩되지 않을 수 있도록 하는 조건에서 분리 유닛 (A1) 으로부터 타겟 분자를 공급한 후, 버퍼 (B) 로 분리 유닛 (B) 을 재평형화시키기 위해 분리 유닛 (B) 은 입구 (C; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-W) 와 연결하는 동안 재평형화 단계가 수행되고 정제된 타겟 분자 (예컨대 항체) 를 인출하기 위해서 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-P) 와 연결하는 동안 공급 단계가 수행된다.
e) 로딩이 분리 유닛 (A2) 에서 거의 끝났을 때, 그것은 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 를 통하여 추가로 로딩되고 샘플은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A2) 에 바인딩될 수 있도록 하는 제 1 pH 및 전도율로 있고 바인딩되지 않은 타겟 분자는 연결 라인 (F-F) 을 통하여 직접 분리 유닛 (A1) 으로 이송되고 바인딩되지 않은 분자는 출구 (A1-W) 를 통하여 인출될 수 있도록 한다. 동시에, 분리 유닛 (B) 은 재평형화를 위해 입구 (C) 에 연결된다.
f) 분리 유닛 (A2) 의 로딩이 완료될 때, 분리 유닛 (A2) 을 연결 라인 (W-F) 으로 분리 유닛 (A1) 과 연결하면서 분리 유닛 (A2) 으로부터 바인딩되지 않은 타겟 분자가 입구 (A) 를 사용해 세척되고, 그것은 입구 (B) 를 통하여 로딩된다. 분리 유닛 (A2) 으로부터 너무 적은 타겟 분자가 검출되자마자, 연결이 차단되고 분리 유닛 (A2) 출구는 출구 위치 (A2-W) 로 스위칭되어서 바인딩되지 않은 분자를 인출하고, 한편 타겟 분자는 분리 유닛 (A1) 에 추가로 로딩되고 바인딩되지 않은 분자는 출구 (A1-W) 를 통하여 인출된다.
연속 모드를 위해 바람직하게, 단계 a) 내지 단계 f) 는 적어도 2 번 반복된다.
본 발명의 방법에서, pH 종속 바인딩 및 용출을 위해 제공되는 바람직하게 버퍼가 사용되는 것을 발견하였다. 로딩 버퍼의 pH 와 상이한 pH 를 갖는 용출 버퍼를 사용할 때 분리 유닛 (A1, A2) 으로부터 특히 타겟 분자의 용출이 보다 효율적이고 더 빠르다는 것을 발견하였다. 다시 말해서, 로딩 버퍼의 pH 와 상이한 pH 를 갖는 용출 버퍼를 사용할 때 용출 프로파일이 더 유리하다. pH 구배에 의한 용출이 특히 바람직하다. pH 종속 바인딩 및 용출에 적합한 버퍼는 본 기술분야의 당업자에게 공지되어 있다. 적합한 버퍼 조합물의 예로는 PBS-글리신, 아세테이트-TRIS 등이 있다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 방법은 단지 2 가지 로딩 및 용출 버퍼, 즉 버퍼 (A) 및 버퍼 (B) 의 사용을 포함하여서, 버퍼 (A) 는 타겟 분자가 분리 유닛 (A1/A2) 에서 포획되는 조건을 제공하는 제 1 디멘션을 위한 로딩 버퍼이다. 게다가, 버퍼 (A) 는 타겟 분자가 분리 유닛 (B) 으로부터 용출되는 조건을 제공하는 제 2 디멘션을 위한 용출 버퍼이다. 버퍼 (B) 는 제 1 디멘션을 위한 용출 버퍼이고 (분리 유닛 (A1/A2)), 제 2 디멘션을 위한 포집 버퍼이다 (분리 유닛 B).
분리 유닛 (A1, A2) 이 Prot A 매트릭스와 같은 친화성 크로마토그래피 매트릭스를 갖는다면, 바인딩 버퍼 (버퍼 (A)) 는 전형적으로 6 ~ 8 의 pH 를 가지고 10 mM ~ 2 M 의 염 농도 (전형적인 염은 포스페이트, 아세테이트, 염화물 등임) 를 갖는다. 6.8 ~ 7.3 의 pH 와 50 mM ~ 1 M 의 염 농도를 가지는 바인딩 버퍼가 바람직하다. 용출 버퍼는 전형적으로 2 ~ 5 의 pH 를 가지고 20 mM ~ 200 mM 의 염 농도 (전형적인 염은 글리신, 아세테이트 등임) 를 갖는다. 2.5 ~ 4.5 의 pH 와 20 mM ~ 50 mM 의 염 농도를 가지는 용출 버퍼가 바람직하다. 예를 들어 용출 버퍼가 4 의 pH 를 갖는다면 분리 유닛 (A1, A2) 의 Prot A 매트릭스로부터 타겟 분자를 용출하기에 적합한 이 버퍼는 양이온 교환 매트릭스를 가지는 분리 유닛 (B) 에 타겟 분자를 로딩하기에 또한 적합하다.
분리 유닛 (A1, A2) 이 양이온 교환 매트릭스를 갖는다면, 바인딩 버퍼는 전형적으로 4 ~ 7 의 pH 와 10 mM ~ 300 mM 의 염 농도 (전형적인 염은 포스페이트, 아세테이트, NaCl 등임) 를 갖는다. 4.5 ~ 6 의 pH 와 20 mM ~ 100 mM 의 염 농도를 갖는 바인딩 버퍼가 바람직하다. 용출 버퍼는 전형적으로 7 ~ 10 의 pH 와 10 mM ~ 300 mM 의 염 농도 (전형적인 염은 TRIS, PBS, NaCl 임) 를 갖는다. 8 ~ 9 의 pH 와 10 mM ~ 150 mM 의 염 농도를 갖는 용출 버퍼가 바람직하다. 예를 들어 용출 버퍼가 8.5 의 pH 를 갖는다면 분리 유닛 (A1, A2) 의 양이온 교환 매트릭스로부터 타겟 분자를 용출하기에 적합한 이 버퍼는 음이온 교환 매트릭스를 가지는 분리 유닛 (B) 에 타겟 분자를 로딩하기에 또한 적합하다.
분리 유닛 (A1, A2) 이 음이온 교환 매트릭스를 갖는다면, 바인딩 버퍼는 전형적으로 7 ~ 10 의 pH 와 10 mM ~ 300 mM 의 염 농도 (전형적인 염은 TRIS, PBS, NaCl 임) 를 갖는다. 7.5 ~ 9.5 의 pH 와 10 mM ~ 300 mM 의 염 농도를 갖는 바인딩 버퍼가 바람직하다. 용출 버퍼는 전형적으로 4 ~ 7 의 pH 와 10 mM ~ 100 mM 의 염 농도 (전형적인 염은 PBS, 아세테이트, NaCl 등임) 를 갖는다. 4.5 ~ 6.5 의 pH 와 10 mM ~ 100 mM 의 염 농도를 갖는 용출 버퍼가 바람직하다. 예를 들어 용출 버퍼가 5.5 의 pH 를 갖는다면 분리 유닛 (A1, A2) 의 음이온 교환 매트릭스로부터 타겟 분자를 용출하기에 적합한 이 버퍼는 양이온 교환 매트릭스를 가지는 분리 유닛 (B) 에 타겟 분자를 로딩하기에 또한 적합하다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 방법을 부여받는 샘플은 정화된 샘플이다. 그것은 샘플을 분리 유닛 (A1 또는 A2) 에 로딩하기 전 샘플이 정화 단계를 부여받는다는 것을 의미한다.
정화 단계는 타겟 분자로부터 하나 이상의 가용성 및/또는 불용성 불순물을 분리하도록 되어있다. 예를 들어 세포 및 세포 부스러기와 같은 불용성 불순물이 샘플로부터 제거되어서 다른 가용성 불순물뿐만 아니라 용액 중 타겟 분자를 함유한 정화된 유체를 발생시킨다. 정화 단계는 다음과 같은 원심 분리, 침강 및/또는 여과, 바람직하게 접선 유동 여과 또는 심층 (depth) 여과 중 하나 이상을 단독으로 또는 임의의 조합으로 포함할 수도 있다. 바람직하게, 정화 단계는 원심 분리를 포함하지 않고 단지 여과 및/또는 침강을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 여과는 심층 여과이다.
일부 실시형태에서, 심층 필터는 하나 이상의 불용성 불순물을 제거하는데 사용된다. 심층 필터는 딱 배지의 표면에서보다는 배지 전체에 걸쳐 입자를 리테이닝하도록 다공성 여과 배지를 사용하는 필터이다. 통상적인 종류의 이러한 심층 필터는, 복잡하고 구불구불한 미로의 유동 채널을 형성하도록 본딩된 (또는 달리 고정된) 섬유의 랜덤 매트릭스를 포함하는 필터이다. 이 필터에서 입자 분리는 일반적으로 섬유 매트릭스의 엔트랩먼트 (entrapment) 또는 흡착으로부터 유발된다. 세포 배양 부용 (broths) 및 다른 공급원료의 바이오프로세싱을 위해 가장 빈번하게 사용되는 심층 필터 배지는 보통 셀룰로오스 섬유, DE (규조토) 와 같은 필터 에이드, 및 포지티브 대전된 수지 바인더로 이루어진다.
다공성 심층 필터가 이방성이라면 미립자 불순물의 일차 제거에 특히 양호한 결과가 달성될 수 있음을 발견하였다. 일부 실시형태에서, 기공은 약 25 ㎛ 를 초과하는 공칭 기공 크기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 심층 필터는 적어도 부직 섬유의 2 그레이드 층을 포함하고, 그레이드 층은 약 0.3 cm ~ 약 3 cm 의 총 두께를 가지고 있다.
일부 실시형태에서, 심층 필터는 부직 섬유의 그레이드 층, 셀룰로오스, 및 규조토의 복합물을 포함한다. 부직 섬유는 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리에스테르, 나일론 또는 그것의 혼합물을 포함한다.
예시적인 심층 필터는 본원에 참조로 원용된 미국 가특허 출원 제 61/571994 호에서 찾아볼 수도 있다.
일부 실시형태에서, 원심 분리 및/또는 접선 유동 여과 단계는 심층 여과 단계 전에 수행될 수도 있다. 대안적으로, 심층 여과 단계는 원심 분리 및/또는 접선 유동 여과 단계 필요없이 수행될 수도 있다.
일 실시형태에서, 원심 분리 및/또는 여과 및/또는 침강에 의한 정화 전에, 샘플로부터 원치 않는 오염 물질을 침전시켜 제거하기 위해서 샘플은 침전 조성물로 전처리된다. 침전 조성물은 샘플로부터 HCP, DNA, 호르몬 등과 같은 오염 물질을 침전시킬 수 있는 침전제를 적어도 포함한다. 침전제는 수성 및/또는 가용성 상태로부터 비수성 및/또는 불용성 상태로 화합물의 침전을 초래하거나 용액으로부터 미세 입자를 집괴 및 접합시켜서, 액체상으로부터의 침강 및 용액 탁도 감소를 유발한다.
적합한 침전제의 예로는 유기 산 (예컨대 옥탄산), 무기 산 (예컨대 HCl), 산성을 향하여 pH 를 실질적으로 낮추는 다른 산성제, 염 (예컨대, 벤조산 나트륨, 콜산 나트륨, 디옥시콜산 나트륨 등), 다른 1 가 염 또는 산성 배지에서 침전하는 유기 산이 있다. 침전제의 다른 예로는 카프릴산과 같은 짧은 체인의 지방산이 있다. 마일드한 산성 조건에서, IgG 가 침전되지 않는 동안 카프릴산과 같은 짧은 체인 지방산의 첨가는 전형적으로 비 IgG 단백질을 침전시킨다.
다른 적합한 침전제로는 고분자전해질 폴리머 (예컨대, 본원에 참조로 원용되는, 국제 PCT 특허 출원 제 WO2008/091740 호 참조) 가 있다.
바람직한 실시형태에서, 자극 반응성 폴리머는 하나 이상의 불순물을 침전시키는데 사용된다. 이러한 자극 반응성 폴리머의 예로는, 본원에 참조로 원용된, 예컨대 미국 공개 제 20080255027 호, 제 20090036651 호, 제 20090232737 호 및 제 20110020327 호에서 발견될 수 있다. 자극 반응성 폴리머는 pH, 온도 및/또는 염 농도와 같은 임의의 세트의 프로세스 조건 하에 수성 기반 용매에서 일반적으로 가용성이고 이러한 조건 중 하나 이상이 변할 때 불용성으로 되고 그 후 침전된다. 예시적인 자극 반응성 폴리머는 폴리알릴아민, 벤질기로 개질된 폴리알릴아민 또는 폴리비닐아민 및 벤질기로 개질된 폴리비닐아민을 포함하지만, 이에 제한되지 않고, 자극제는 포스페이트 또는 시트레이트이다.
침전 조성물은 세제 (Triton X-100, Triton X-114, NP-40, Tween-20, OTD, SDS, CHAPS, 및/또는 폴리에틸렌글리콜 (PEG) (PEG-1000, PEG 10000) 및/또는 폴리비닐 알코올 및/또는 고분자전해질을 더 포함할 수도 있다.
그 후, 침전된 오염 물질은 분리 유닛으로 샘플을 로딩하기 전 정화에 의해 샘플로부터 제거된다.
바람직한 실시형태에서, 정화된 샘플을 제공하는 원심 분리 단계 없이 침전 후 심층 여과가 뒤따른다.
바람직한 실시형태에서, 샘플의 정화는 그것의 지속기간의 적어도 일부동안 본 발명의 방법에 따라 크로마토그래픽 정제와 동시에 수행된다. 다시 말해서, 전체 샘플 체적이 정화되도록 대기하기 위해서 정화 후 타겟 분자를 포함한 액체 샘플은 풀 탱크에 저장되지 않고 정화 프로세스로부터 정화된 샘플이 발생되자마자 그것은 본 발명의 방법을 위한 샘플 용액으로서 연속적으로 사용되고 분리 유닛 (A1 또는 A2) 에 로딩된다.
그 결과, 또한 정화된 샘플 용액을 사용할 때 본 발명의 방법은 샘플 용액의 전체 체적을 저장할 수 있는 풀 탱크의 사용을 필요로 하지 않는다. 바람직하게 풀 탱크가 사용되지 않거나 샘플 용액의 총 체적의 25% 미만, 바람직하게 10% 미만을 저장할 수 있는 풀 탱크만 사용된다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 부가적 관류 정제 단계는 분리 유닛 (B) 에서 제 2 크로마토그래픽 단계를 수행한 후 수행될 수도 있다. 이를 위해, 분리 유닛 (B) 의 출구는 하나 이상의 부가적 분리 유닛과 유체 연결된다. 하나 이상의 밸브는 분리 유닛 (B) 의 출구와 제 1 부가적 분리 유닛의 입구 사이 및/또는 선택적으로 다음 부가적 분리 유닛들 (전형적으로 직렬로 연결됨) 사이의 연결 라인에 위치하여서 인라인 희석 및/또는 버퍼 교환의 가능성을 보장한다. 부가적 관류 기기의 매트릭스는 전형적으로
- 활성탄
- 양이온 교환
- 혼합 모드
- 크기 배제
- 음이온 교환으로부터 선택된다.
본 발명에 따른 방법으로 유발되는 정제된 타겟 분자는, 용액을 포함한 타겟 분자가 원하는 농도에서 원하는 버퍼가 되도록 살균 및 제제되는 제제/살균/농도 단계와 같은 부가적 프로세스 단계를 추가로 부여받을 수 있다.
하기에 본 발명에 따른 방법의 추가 실시형태가 기재된다:
CIEX 포집 및 AIEX 연마를 포함하는 예시적인 절차에서, 본 발명에 따른 방법은 다음에 의해 수행된다:
a) 입구 (A; 예컨대, 용매 전달 시스템) 를 통하여 분리 유닛 (A1; 예컨대, 양이온 교환 재료) 에 샘플을 공급하는 것으로서, 샘플은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A1; 예컨대 양이온 교환 배지) 에 바인딩될 수 있고 바인딩되지 않은 분자가 출구 (A1-W) 를 통하여 인출될 수 있는 제 1 pH 및 전도율로 있고, 분리 유닛 (A2; 예컨대 양이온 교환 재료) 은 제 1 pH 에서 버퍼 (A) 로 바인딩된 타겟 분자의 세척, 제 2 pH 에서 버퍼 (B) 로 바인딩된 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (A) 로 분리 유닛 (A1) 을 재평형화시키는 단계를 위해 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결되고, 분리 유닛 (A2) 을 출구 (A2-W) 와 연결하는 동안 명명된 세척 및 재평형화 단계가 수행되고, 타겟 분자를 분리 유닛 (B) 으로 이송하기 위해서 직접 분리 유닛 (A2) 을 분리 유닛 (B; 예컨대 음이온 교환 배지) 과 연결하는 동안 명명된 용출 단계가 수행되고, 타겟 분자가 분리 유닛 (B) 에 바인딩될 수 있도록 하는 조건에서 분리 유닛 (A2) 으로부터 타겟 분자의 공급, 버퍼 (B) 로 세척, 버퍼 (A) 로 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (B) 로 재평형화시키는 단계를 위해 분리 유닛 (B) 은 입구 (C; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결되고, 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-W) 와 연결하는 동안 공급, 세척 및 재평형화 단계가 수행되고 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-P) 와 연결하는 동안 용출 단계가 수행되어서 정제된 타겟 분자 (예컨대 항체) 를 인출시킨다.
b) 입구 (A; 예컨대 용매 전달 시스템) 를 통하여 분리 유닛 (A1; 예컨대 양이온 교환 재료) 에 샘플을 공급하는 것으로서, 분리 유닛 (A1) 으로부터 타겟 분자의 침출을 개시하는 포집물이 분리 유닛 (A2) 에 바인딩될 수 있도록 하기 위해서 분리 유닛 (A1) 을 분리 유닛 (A2) 과 직접 연결하는 동안 상당한 손실 없이 다량의 바인딩된 타겟 분자로 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A1) 에 바인딩될 수 있도록 하는 제 1 pH 및 전도율로 조성물이 존재하고 분리 유닛 (A2) 은 바인딩되지 않은 분자를 인출하기 위해서 출구 (A2-W) 와 연결되고, 분리 유닛 (B) 을 출구 (B=W) 와 연결하는 동안 예컨대 분리 유닛 (B) 의 재평형화를 위해 분리 유닛 (B) 은 입구 (C; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다.
c) 입구 (A; 예컨대, 용매 전달 시스템) 를 통하여 분리 유닛 (A2; 예컨대, 양이온 교환 배지) 에 조성물을 공급하는 것으로서, 조성물은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A2; 예컨대 양이온 교환 배지) 에 바인딩될 수 있고 바인딩되지 않은 분자가 출구 (B) 를 통하여 인출될 수 있는 제 1 pH 및 전도율로 있고, 분리 유닛 (A1; 예컨대 양이온 교환 재료) 은 제 1 pH 에서 버퍼 (A) 로 바인딩된 타겟 분자의 세척, 제 2 pH 에서 버퍼 (B) 로 바인딩된 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (A) 로 분리 유닛 (A1) 을 재평형화시키는 단계를 위해 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결되고, 분리 유닛 (A1) 을 출구 (A1-W) 와 연결하는 동안 명명된 세척 및 재평형화 단계가 수행되고, 타겟 분자를 분리 유닛 (B) 으로 이송하기 위해서 직접 분리 유닛 (A1) 을 분리 유닛 (B; 예컨대 음이온 교환 배지) 과 연결하는 동안 명명된 용출 단계가 수행되고, 타겟 분자가 분리 유닛 (B) 에 바인딩될 수 있도록 하는 조건에서 분리 유닛 (A1) 으로부터 타겟 분자의 공급, 버퍼 (B) 로 세척, 버퍼 (A) 로 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (B) 로 재평형화시키는 단계를 위해 분리 유닛 (B) 은 입구 (C; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결되고, 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-W) 와 연결하는 동안 공급, 세척 및 재평형화 단계가 수행되고 정제된 타겟 분자 (예컨대 항체) 를 인출하기 위해서 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-P) 와 연결하는 동안 용출 단계가 수행된다.
d) 입구 (A; 예컨대 용매 전달 시스템) 를 통하여 분리 유닛 (A2; 예컨대 양이온 교환 재료) 에 조성물을 공급하는 것으로서, 분리 유닛 (A2) 으로부터 타겟 분자의 침출을 개시하는 포집물이 분리 유닛 (A1) 에 바인딩될 수 있도록 하기 위해서 분리 유닛 (A2) 을 분리 유닛 (A1) 과 직접 연결하는 동안 상당한 손실 없이 다량의 바인딩된 타겟 분자로 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A2) 에 바인딩될 수 있도록 하는 제 1 pH 및 전도율로 조성물이 존재하고 분리 유닛 (A1) 은 바인딩되지 않은 분자를 인출하기 위해서 출구 (A1-W) 와 연결되고, 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-W) 와 연결하는 동안 예컨대 분리 유닛 (B) 의 재평형화 단계, 음이온 교환 재료에 용출 항체를 바인딩시키도록 제 3 버퍼로 용출 항체 용액을 인라인 희석시키는 단계를 위해 분리 유닛 (B) 은 입구 (C; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다.
바람직하게, 단계 a) 내지 단계 d) 는 순차적으로 수행되고, 그것은 단계들이 동일한 순서로 2 회 이상 수행된다는 것을 의미한다.
일 실시형태에서, 본 방법은 CIEX 포집, 높은 처리량 및 AIEX 연마를 포함한다.
CIEX 포집, 높은 처리량 및 AIEX 연마를 포함하는 예시적인 절차에서, 본 발명에 따른 방법은 다음에 의해 수행된다:
a) 입구 (B; 예컨대, 용매 전달 시스템) 를 통하여 분리 유닛 (A1; 예컨대, 양이온 교환 재료) 에 샘플을 공급하는 것으로서, 샘플은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A1) 에 바인딩될 수 있고 바인딩되지 않은 분자가 출구 (A1-W) 를 통하여 인출될 수 있는 제 1 pH 및 전도율로 있고, 분리 유닛 (A2; 예컨대 양이온 교환 재료) 은 제 1 pH 에서 버퍼 (A) 로 바인딩된 타겟 분자의 세척, 제 2 pH 에서 버퍼 (B) 로 바인딩된 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (A) 로 분리 유닛 (A2) 의 재평형화를 위해 입구 (A; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (A2) 을 출구 (A2-W) 와 연결하는 동안 세척 및 재평형화 단계가 수행되고, 타겟 분자를 분리 유닛 (B) 으로 직접 이송하기 위해서 연결 라인 (C-P) 을 통하여 분리 유닛 (A2) 을 분리 유닛 (B; 예컨대 음이온 교환 배지) 과 연결하는 동안 용출 단계가 수행되고, 타겟 분자가 분리 유닛 (B) 에 바인딩될 수 있도록 하는 조건에서 분리 유닛 (A2) 으로부터 타겟 분자의 공급, 그 후 버퍼 (B) 로 세척, 버퍼 (A) 로 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (B) 로 재평형화시키기 위해 분리 유닛 (B) 은 입구 (C; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-W) 와 연결하는 동안 공급, 세척 및 재평형화 단계가 수행되고 정제된 타겟 분자 (예컨대 항체) 를 인출하기 위해서 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-P) 와 연결하는 동안 용출 단계가 수행된다.
b) 로딩이 분리 유닛 (A1) 에서 거의 끝났을 때, 그것은 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 를 통하여 추가로 로딩되고 샘플은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A1) 에 바인딩될 수 있도록 하는 제 1 pH 및 전도율로 있고 바인딩되지 않은 타겟 분자는 연결 라인 (F-F) 을 통하여 직접 분리 유닛 (A2) 으로 이송되고 바인딩되지 않은 분자는 출구 (A2-W) 를 통하여 인출될 수 있도록 한다. 동시에, 분리 유닛 (B) 은 재평형화를 위해 입구 (C) 에 연결된다.
c) 분리 유닛 (A1) 의 로딩이 끝났을 때, 분리 유닛 (A1) 을 연결 라인 (W-F) 으로 분리 유닛 (A2) 과 연결하면서 분리 유닛 (A1) 으로부터 바인딩되지 않은 타겟 분자가 입구 (A) 를 사용해 세척되고, 그것은 입구 (B) 를 통하여 로딩된다. 분리 유닛 (A1) 으로부터 너무 적은 타겟 분자가 검출되자마자, 연결이 차단되고 유닛 (A1) 출구는 출구 위치 (A1-W) 로 스위칭되어서 바인딩되지 않은 분자를 인출하고, 한편 타겟 분자는 분리 유닛 (A2) 에 추가로 로딩되고 바인딩되지 않은 분자는 출구 (A2-W) 를 통하여 인출된다.
d) 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 를 통하여 분리 유닛 (A2; 예컨대 양이온 교환 재료) 에 샘플을 공급하는 것으로서, 조성물은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A2; 예컨대 양이온 교환 배지) 에 바인딩될 수 있고 바인딩되지 않은 분자가 출구 (A2-W) 를 통하여 인출될 수 있는 제 1 pH 및 전도율로 있고, 분리 유닛 (A1; 예컨대 양이온 교환 재료) 은 제 1 pH 에서 버퍼 (A) 로 바인딩된 타겟 분자의 세척, 제 2 pH 에서 버퍼 (B) 로 바인딩된 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (A) 로 분리 유닛 (A) 의 재평형화를 위해 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (A1) 을 출구 (A1-W) 와 연결하는 동안 세척 및 재평형화 단계가 수행되고, 타겟 분자를 분리 유닛 (B) 으로 직접 이송하기 위해서 연결 라인 (C-P) 을 통하여 분리 유닛 (A1) 을 분리 유닛 (B; 예컨대 음이온 교환 배지) 과 연결하는 동안 명명된 용출 단계가 수행되고, 타겟 분자가 분리 유닛 (B) 에 바인딩될 수 있도록 하는 조건에서 분리 유닛 (A1) 으로부터 타겟 분자의 공급, 버퍼 (B) 로 세척, 버퍼 (A) 로 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (B) 로 재평형화시키기 위해 분리 유닛 (B) 은 입구 (C; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-W) 와 연결하는 동안 공급, 세척 및 재평형화 단계가 수행되고 정제된 타겟 분자 (예컨대 항체) 를 인출하기 위해서 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-P) 와 연결하는 동안 용출 단계가 수행된다.
e) 로딩이 분리 유닛 (A2) 에서 거의 끝났을 때, 그것은 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 를 통하여 추가로 로딩되고 샘플은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A2) 에 바인딩될 수 있도록 하는 제 1 pH 및 전도율로 있고 바인딩되지 않은 타겟 분자는 연결 라인 (F-F) 을 통하여 직접 분리 유닛 (A1) 으로 이송되고 바인딩되지 않은 분자는 출구 (A1-W) 를 통하여 인출될 수 있도록 한다. 동시에, 분리 유닛 (B) 은 재평형화를 위해 입구 (C) 에 연결된다.
f) 분리 유닛 (A2) 의 로딩이 완료될 때, 분리 유닛 (A2) 을 연결 라인 (W-F) 으로 분리 유닛 (A1) 과 연결하면서 분리 유닛 (A2) 으로부터 바인딩되지 않은 타겟 분자가 입구 (A) 를 사용해 세척되고, 그것은 입구 (B) 를 통하여 로딩된다. 분리 유닛 (A2) 으로부터 너무 적은 타겟 분자가 검출되자마자, 연결이 차단되고 분리 유닛 (A2) 출구는 출구 위치 (A2-W) 로 스위칭되어서 바인딩되지 않은 분자를 인출하고, 한편 타겟 분자는 분리 유닛 (A1) 에 추가로 로딩되고 바인딩되지 않은 분자는 출구 (A1-W) 를 통하여 인출된다.
바람직하게, 단계 a) 내지 단계 f) 는 순차적으로 수행되고, 그것은 단계들이 2 회 이상 동일한 순서로 수행되는 것을 의미한다.
일 실시형태에서, 본 방법은 CIEX 포집, 바이러스 불활성화 및 AIEX 연마 (바인드 및 용출 또는 관류) 를 포함한다.
CIEX 포집, 바이러스 불활성화 및 AIEX 연마를 포함하는 예시적인 절차에서, 본 발명에 따른 방법은 다음에 의해 수행된다:
a) 입구 (A; 예컨대, 용매 전달 시스템) 를 통하여 분리 유닛 (A1; 예컨대, 양이온 교환 재료) 에 조성물을 공급하는 것으로서, 조성물은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A1; 예컨대 양이온 교환 배지) 에 바인딩될 수 있고 바인딩되지 않은 분자가 출구 (A1-W) 를 통하여 인출될 수 있는 제 1 pH 및 전도율로 있고, 분리 유닛 (A2; 예컨대 양이온 교환 재료) 은 제 1 pH 에서 버퍼 (A) 로 바인딩된 타겟 분자의 세척, 제 2 pH 에서 버퍼 (C) 로 바이러스 불활성화, 제 3 pH 에서 버퍼 (B) 로 바인딩된 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (A) 로 분리 유닛 (A2) 을 재평형화시키는 단계를 위해 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결되고, 분리 유닛 (A2) 을 출구 (A2-W) 와 연결하는 동안 명명된 세척, 바이러스 불활성화 및 재평형화 단계가 수행되고, 타겟 분자를 분리 유닛 (B) 으로 이송하기 위해서 직접 분리 유닛 (A2) 을 분리 유닛 (B; 예컨대 음이온 교환 배지) 과 연결하는 동안 명명된 용출 단계가 수행되고, 타겟 분자가 분리 유닛 (B) 에 바인딩될 수 있도록 하는 조건에서 분리 유닛 (A2) 으로부터 타겟 분자의 공급, 버퍼 (B) 로 세척, 버퍼 (A) 로 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (B) 로 재평형화시키는 단계를 위해 분리 유닛 (B) 은 입구 (C; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결되고, 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-W) 와 연결하는 동안 공급, 세척 및 재평형화 단계가 수행되고 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-P) 와 연결하는 동안 용출 단계가 수행되어서 정제된 타겟 분자 (예컨대 항체) 를 인출시킨다.
b) 입구 (A; 예컨대, 용매 전달 시스템) 를 통하여 분리 유닛 (A2; 예컨대, 양이온 교환 재료) 에 조성물을 공급하는 것으로서, 조성물은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A2; 예컨대 양이온 교환 배지) 에 바인딩될 수 있고 바인딩되지 않은 분자가 출구 (A2-W) 를 통하여 인출될 수 있는 제 1 pH 및 전도율로 있고, 분리 유닛 (A1; 예컨대 양이온 교환 재료) 은 제 1 pH 에서 버퍼 (A) 로 바인딩된 타겟 분자의 세척, 제 2 pH 에서 버퍼 (C) 로 바이러스 불활성화, 제 3 pH 에서 버퍼 (B) 로 바인딩된 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (A) 로 분리 유닛 (A1) 을 재평형화시키는 단계를 위해 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결되고, 분리 유닛 (A1) 을 출구 (A1-W) 와 연결하는 동안 명명된 세척, 바이러스 불활성화 및 재평형화 단계가 수행되고, 타겟 분자를 분리 유닛 (B) 으로 이송하기 위해서 직접 분리 유닛 (A1) 을 분리 유닛 (B; 예컨대 음이온 교환 배지) 과 연결하는 동안 명명된 용출 단계가 수행되고, 타겟 분자가 분리 유닛 (B) 에 바인딩될 수 있도록 하는 조건에서 분리 유닛 (A1) 으로부터 타겟 분자의 공급, 버퍼 (B) 로 세척, 버퍼 (A) 로 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (B) 로 재평형화시키는 단계를 위해 분리 유닛 (B) 은 입구 (C; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결되고, 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-W) 와 연결하는 동안 공급, 세척 및 재평형화 단계가 수행되고 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-P) 와 연결하는 동안 용출 단계가 수행되어서 정제된 타겟 분자 (예컨대 항체) 를 인출시킨다.
바람직하게, 단계 a) 및 단계 b) 는 순차적으로 수행되고, 그것은 단계들이 2 회 이상 동일한 순서로 수행되는 것을 의미한다.
일 실시형태에서, 본 방법은 CIEX 포집, 높은 처리량, 바이러스 불활성화 및 AIEX 연마를 포함한다. CIEX 포집, 높은 처리량, 바이러스 불활성화 및 AIEX 연마를 포함하는 예시적인 절차에서, 본 발명에 따른 방법은 다음에 의해 수행된다:
a) 입구 (B; 예컨대, 용매 전달 시스템) 를 통하여 분리 유닛 (A1; 예컨대, 양이온 교환 재료) 에 샘플을 공급하는 것으로서, 샘플은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A1) 에 바인딩될 수 있고 바인딩되지 않은 분자가 출구 (A1-W) 를 통하여 인출될 수 있는 제 1 pH 및 전도율로 있고, 분리 유닛 (A2; 예컨대 양이온 교환 재료) 은 제 1 pH 에서 버퍼 (A) 로 바인딩된 타겟 분자의 세척, 바이러스 불활성화 버퍼로 바이러스 불활성화 단계, 제 2 pH 에서 버퍼 (B) 로 바인딩된 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (A) 로 분리 유닛 (A2) 의 재평형화를 위해 입구 (A; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (A2) 을 출구 (A2-W) 와 연결하는 동안 세척, 바이러스 불활성화 및 재평형화 단계가 수행되고, 타겟 분자를 분리 유닛 (B) 으로 직접 이송하기 위해서 연결 라인 (C-P) 을 통하여 분리 유닛 (A2) 을 분리 유닛 (B; 예컨대 음이온 교환 배지) 과 연결하는 동안 용출 단계가 수행되고, 타겟 분자가 분리 유닛 (B) 에 바인딩될 수 있도록 하는 조건에서 분리 유닛 (A2) 으로부터 타겟 분자의 공급, 그 후 버퍼 (B) 로 세척, 버퍼 (A) 로 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (B) 로 재평형화시키기 위해 분리 유닛 (B) 은 입구 (C; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-W) 와 연결하는 동안 공급, 세척 및 재평형화 단계가 수행되고 정제된 타겟 분자 (예컨대 항체) 를 인출하기 위해서 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-P) 와 연결하는 동안 용출 단계가 수행된다.
b) 로딩이 분리 유닛 (A1) 에서 거의 끝났을 때, 그것은 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 를 통하여 추가로 로딩되고 샘플은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A1) 에 바인딩될 수 있도록 하는 제 1 pH 및 전도율로 있고 바인딩되지 않은 타겟 분자는 연결 라인 (F-F) 을 통하여 직접 분리 유닛 (A2) 으로 이송되고 바인딩되지 않은 분자는 출구 (A2-W) 를 통하여 인출될 수 있도록 한다. 동시에, 분리 유닛 (B) 은 재평형화를 위해 입구 (C) 에 연결된다.
c) 분리 유닛 (A1) 의 로딩이 끝났을 때, 분리 유닛 (A1) 을 연결 라인 (W-F) 으로 분리 유닛 (A2) 과 연결하면서 분리 유닛 (A1) 으로부터 바인딩되지 않은 타겟 분자가 입구 (A) 를 사용해 세척되고, 그것은 입구 (B) 를 통하여 로딩된다. 분리 유닛 (A1) 으로부터 너무 적은 타겟 분자가 검출되자마자, 연결이 차단되고 분리 유닛 (A1) 출구는 출구 위치 (A1-W) 로 스위칭되어서 바인딩되지 않은 분자를 인출하고, 한편 타겟 분자는 분리 유닛 (A2) 에 추가로 로딩되고 바인딩되지 않은 분자는 출구 (A2-W) 를 통하여 인출된다.
d) 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 를 통하여 분리 유닛 (A2; 예컨대 양이온 교환 재료) 에 샘플을 공급하는 것으로서, 조성물은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A2; 예컨대 양이온 교환 배지) 에 바인딩될 수 있고 바인딩되지 않은 분자가 출구 (A2-W) 를 통하여 인출될 수 있는 제 1 pH 및 전도율로 있고, 분리 유닛 (A1; 예컨대 양이온 교환 재료) 은 제 1 pH 에서 버퍼 (A) 로 바인딩된 타겟 분자의 세척, 바이러스 불활성화 버퍼로 바이러스 불활성화 단계, 제 2 pH 에서 버퍼 (B) 로 바인딩된 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (A) 로 분리 유닛 (A1) 의 재평형화를 위해 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (A1) 을 출구 (A1-W) 와 연결하는 동안 세척, 바이러스 불활성화 및 재평형화 단계가 수행되고, 타겟 분자를 분리 유닛 (B) 으로 직접 이송하기 위해서 연결 라인 (C-P) 을 통하여 분리 유닛 (A1) 을 분리 유닛 (B; 예컨대 음이온 교환 배지) 과 연결하는 동안 용출 단계가 수행되고, 타겟 분자가 분리 유닛 (B) 에 바인딩될 수 있도록 하는 조건에서 분리 유닛 (A1) 으로부터 타겟 분자의 공급, 버퍼 (B) 로 세척, 버퍼 (A) 로 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (B) 로 재평형화시키기 위해 분리 유닛 (B) 은 입구 (C; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-W) 와 연결하는 동안 공급, 세척 및 재평형화 단계가 수행되고 정제된 타겟 분자 (예컨대 항체) 를 인출하기 위해서 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-P) 와 연결하는 동안 용출 단계가 수행된다.
e) 로딩이 분리 유닛 (A2) 에서 거의 끝났을 때, 그것은 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 를 통하여 추가로 로딩되고 샘플은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A2) 에 바인딩될 수 있도록 하는 제 1 pH 및 전도율로 있고 바인딩되지 않은 타겟 분자는 연결 라인 (F-F) 을 통하여 직접 분리 유닛 (A1) 으로 이송되고 바인딩되지 않은 분자는 출구 (A1-W) 를 통하여 인출될 수 있도록 한다. 동시에, 분리 유닛 (B) 은 재평형화를 위해 입구 (C) 에 연결된다.
f) 분리 유닛 (A2) 의 로딩이 완료될 때, 분리 유닛 (A2) 을 연결 라인 (W-F) 으로 분리 유닛 (A1) 과 연결하면서 분리 유닛 (A2) 으로부터 바인딩되지 않은 타겟 분자가 입구 (A) 를 사용해 세척되고, 그것은 입구 (B) 를 통하여 로딩된다. 분리 유닛 (A2) 으로부터 너무 적은 타겟 분자가 검출되자마자, 연결이 차단되고 분리 유닛 (A2) 출구는 출구 위치 (A2-W) 로 스위칭되어서 바인딩되지 않은 분자를 인출하고, 한편 타겟 분자는 분리 유닛 (A1) 에 추가로 로딩되고 바인딩되지 않은 분자는 출구 (A1-W) 를 통하여 인출된다.
바람직하게, 단계 a) 내지 단계 f) 는 순차적으로 수행되고, 그것은 단계들이 2 회 이상 동일한 순서로 수행되는 것을 의미한다.
일 실시형태에서, 본 방법은 ProtA 포집, CIEX 연마 (바인드 및 용출), 및 바이러스 불활성화를 포함한다. ProtA 포집, CIEX 연마 (바인드 및 용출), 및 바이러스 불활성화를 포함하는 예시적인 절차에서, 본 발명에 따른 방법은 다음 단계들을 수행함으로써 수행된다:
a) 입구 (A; 예컨대, 용매 전달 시스템) 를 통하여 분리 유닛 (A1; 예컨대, ProtA 탑 친화성 매트릭스) 에 조성물을 공급하는 것으로서, 조성물은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A1) 에 바인딩될 수 있고 바인딩되지 않은 분자가 출구 (A1-W) 를 통하여 인출될 수 있는 제 1 pH 및 전도율로 있고, 분리 유닛 (A2; 예컨대 ProtA 재료) 은 제 1 pH 에서 버퍼 (A) 로 바인딩된 타겟 분자의 세척, 제 2 pH 에서 버퍼 (B) 로 바인딩된 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (A) 로 분리 유닛 (A1) 을 재평형화시키는 단계를 위해 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결되고, 분리 유닛 (A2) 을 출구 (A2-W) 와 연결하는 동안 명명된 세척 및 재평형화 단계가 수행되고, 타겟 분자를 분리 유닛 (B) 으로 직접 이송하기 위해서 분리 유닛 (A2) 을 분리 유닛 (B; 예컨대 양이온 교환 배지) 과 연결하는 동안 명명된 용출 단계가 수행되고, 타겟 분자가 분리 유닛 (B) 에 바인딩될 수 있도록 하는 조건에서 분리 유닛 (A2) 으로부터 타겟 분자의 공급, 버퍼 (B) 로 세척, 버퍼 (C) 로 바이러스 불활성화, 버퍼 (A) 로 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (B) 로 재평형화시키는 단계를 위해 분리 유닛 (B) 은 입구 (C; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결되고, 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-W) 와 연결하는 동안 공급, 세척, 바이러스 불활성화 및 재평형화 단계가 수행되고 정제된 타겟 분자 (예컨대 항체) 를 인출하기 위해서 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-P) 와 연결하는 동안 용출 단계가 수행된다.
b) 입구 (A; 예컨대 용매 전달 시스템) 를 통하여 분리 유닛 (A1; 예컨대 양이온 교환 재료) 에 조성물을 공급하는 것으로서, 분리 유닛 (A1) 으로부터 타겟 분자의 침출을 개시하는 포집물이 분리 유닛 (A2) 에 바인딩될 수 있도록 하기 위해서 분리 유닛 (A1) 을 분리 유닛 (A2) 과 직접 연결하는 동안 상당한 손실 없이 다량의 바인딩된 타겟 분자로 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A1) 에 바인딩될 수 있도록 하는 제 1 pH 및 전도율로 조성물이 존재하고 분리 유닛 (A2) 은 바인딩되지 않은 분자를 인출하기 위해서 출구 (A2-W) 와 연결되고, 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-W) 와 연결하는 동안 예컨대 분리 유닛 (B) 의 재평형화를 위해 분리 유닛 (B) 은 입구 (C; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다.
c) 입구 (A; 예컨대, 용매 전달 시스템) 를 통하여 분리 유닛 (A2; 예컨대, ProtA 재료) 에 조성물을 공급하는 것으로서, 조성물은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A2; 예컨대 ProtA 배지) 에 바인딩될 수 있고 바인딩되지 않은 분자가 출구 (A2-W) 를 통하여 인출될 수 있는 제 1 pH 및 전도율로 있고, 분리 유닛 (A1; 예컨대 친화성 재료) 은 제 1 pH 에서 버퍼 (A) 로 바인딩된 타겟 분자의 세척, 제 2 pH 에서 버퍼 (B) 로 바인딩된 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (A) 로 분리 유닛 (A1) 을 재평형화시키는 단계를 위해 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결되고, 분리 유닛 (A1) 을 출구 (A) 와 연결하는 동안 명명된 세척 및 재평형화 단계가 수행되고, 타겟 분자를 분리 유닛 (B) 으로 이송하기 위해서 직접 분리 유닛 (A1) 을 분리 유닛 (B; 예컨대 양이온 교환 배지) 과 연결하는 동안 명명된 용출 단계가 수행되고, 타겟 분자가 분리 유닛 (B) 에 바인딩될 수 있도록 하는 조건에서 분리 유닛 (A1) 으로부터 타겟 분자의 공급, 버퍼 (B) 로 세척, 제 3 pH 에서 버퍼 (C) 로 바이러스 불활성화, 버퍼 (A) 로 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (B) 로 재평형화시키는 단계를 위해 분리 유닛 (B) 은 입구 (C; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결되고, 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-W) 와 연결하는 동안 공급, 세척, 바이러스 불활성화 및 재평형화 단계가 수행되고 정제된 타겟 분자 (예컨대 항체) 를 인출하기 위해서 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-P) 와 연결하는 동안 용출 단계가 수행된다.
d) 입구 (A; 예컨대 용매 전달 시스템) 를 통하여 분리 유닛 (A2; 예컨대 친화성 재료) 에 조성물을 공급하는 것으로서, 분리 유닛 (A2) 으로부터 타겟 분자의 침출을 개시하는 포집물이 분리 유닛 (A1) 에 바인딩될 수 있도록 하기 위해서 분리 유닛 (A2) 을 분리 유닛 (A1) 과 직접 연결하는 동안 상당한 손실 없이 다량의 바인딩된 타겟 분자로 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A2) 에 바인딩될 수 있도록 하는 제 1 pH 및 전도율로 조성물이 존재하고 분리 유닛 (A1) 은 바인딩되지 않은 분자를 인출하기 위해서 출구 (A1-W) 와 연결되고, 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-W) 와 연결하는 동안 예컨대 분리 유닛 (B) 의 재평형화를 위해 분리 유닛 (B) 은 입구 (C; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다.
바람직하게, 단계 a) 내지 단계 d) 는 순차적으로 수행되고, 그것은 단계들이 동일한 순서로 2 회 이상 수행되는 것을 의미한다.
일 실시형태에서, 본 방법은 ProtA 포집, 높은 처리량 및 CIEX 연마를 포함한다. ProtA 포집, 높은 처리량 및 CIEX 연마를 포함하는 예시적인 절차에서, 본 발명에 따른 방법은 다음에 의해 수행된다:
a) 입구 (B; 예컨대, 용매 전달 시스템) 를 통하여 분리 유닛 (A1; 예컨대, ProtA 친화성 매트릭스) 에 샘플을 공급하는 것으로서, 샘플은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A1) 에 바인딩될 수 있고 바인딩되지 않은 분자가 출구 (A1-W) 를 통하여 인출될 수 있는 제 1 pH 및 전도율로 있고, 분리 유닛 (A2; 예컨대 ProtA 친화성 매트릭스) 은 제 1 pH 에서 버퍼 (A) 로 바인딩된 타겟 분자의 세척, 바이러스 불활성화 버퍼로 바이러스 불활성화 단계, 제 2 pH 에서 버퍼 (B) 로 바인딩된 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (A) 로 분리 유닛 (A2) 의 재평형화를 위해 입구 (A; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (A2) 을 출구 (A2-W) 와 연결하는 동안 세척, 바이러스 불활성화 및 재평형화 단계가 수행되고, 타겟 분자를 분리 유닛 (B) 으로 직접 이송하기 위해서 연결 라인 (C-P) 을 통하여 분리 유닛 (A2) 을 분리 유닛 (B; 예컨대 양이온 교환 배지) 과 연결하는 동안 용출 단계가 수행되고, 타겟 분자가 분리 유닛 (B) 에 바인딩될 수 있도록 하는 조건에서 분리 유닛 (A2) 으로부터 타겟 분자의 공급, 그 후 버퍼 (B) 로 세척, 버퍼 (A) 로 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (B) 로 재평형화시키기 위해 분리 유닛 (B) 은 입구 (C; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-W) 와 연결하는 동안 공급, 세척 및 재평형화 단계가 수행되고 정제된 타겟 분자 (예컨대 항체) 를 인출하기 위해서 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-P) 와 연결하는 동안 용출 단계가 수행된다.
b) 로딩이 분리 유닛 (A1) 에서 거의 끝났을 때, 그것은 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 를 통하여 추가로 로딩되고 샘플은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A1) 에 바인딩될 수 있도록 하는 제 1 pH 및 전도율로 있고 바인딩되지 않은 타겟 분자는 연결 라인 (F-F) 을 통하여 직접 분리 유닛 (A2) 으로 이송되고 바인딩되지 않은 분자는 출구 (A2-W) 를 통하여 인출될 수 있도록 한다. 동시에, 분리 유닛 (B) 은 재평형화를 위해 입구 (C) 에 연결된다.
c) 분리 유닛 (A1) 의 로딩이 끝났을 때, 분리 유닛 (A1) 을 연결 라인 (W-F) 으로 분리 유닛 (A2) 과 연결하면서 분리 유닛 (A1) 으로부터 바인딩되지 않은 타겟 분자가 입구 (A) 를 사용해 세척되고, 그것은 입구 (B) 를 통하여 로딩된다. 분리 유닛 (A1) 으로부터 너무 적은 타겟 분자가 검출되자마자, 연결이 차단되고 분리 유닛 (A1) 출구는 출구 위치 (A1-W) 로 스위칭되어서 바인딩되지 않은 분자를 인출하고, 한편 타겟 분자는 분리 유닛 (A2) 에 추가로 로딩되고 바인딩되지 않은 분자는 출구 (A2-W) 를 통하여 인출된다.
d) 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 를 통하여 분리 유닛 (A2; 예컨대 ProtA 친화성 매트릭스) 에 샘플을 공급하는 것으로서, 조성물은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A2; 예컨대 ProtA 친화성 매트릭스) 에 바인딩될 수 있고 바인딩되지 않은 분자가 출구 (A2-W) 를 통하여 인출될 수 있는 제 1 pH 및 전도율로 있고, 분리 유닛 (A1; 예컨대 ProtA 친화성 매트릭스) 은 제 1 pH 에서 버퍼 (A) 로 바인딩된 타겟 분자의 세척, 바이러스 불활성화 버퍼로 바이러스 불활성화 단계, 제 2 pH 에서 버퍼 (B) 로 바인딩된 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (A) 로 분리 유닛 (A2) 의 재평형화를 위해 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (A1) 을 출구 (A1-W) 와 연결하는 동안 세척, 바이러스 불활성화 및 재평형화 단계가 수행되고, 타겟 분자를 분리 유닛 (B) 으로 직접 이송하기 위해서 연결 라인 (C-P) 을 통하여 분리 유닛 (A1) 을 분리 유닛 (B; 예컨대 양이온 교환 배지) 과 연결하는 동안 용출 단계가 수행되고, 타겟 분자가 분리 유닛 (B) 에 바인딩될 수 있도록 하는 조건에서 분리 유닛 (A1) 으로부터 타겟 분자의 공급, 버퍼 (B) 로 세척, 버퍼 (A) 로 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (B) 로 재평형화시키기 위해 분리 유닛 (B) 은 입구 (C; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-W) 와 연결하는 동안 공급, 세척 및 재평형화 단계가 수행되고 정제된 타겟 분자 (예컨대 항체) 를 인출하기 위해서 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-P) 와 연결하는 동안 용출 단계가 수행된다.
e) 로딩이 분리 유닛 (A2) 에서 거의 끝났을 때, 그것은 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 를 통하여 추가로 로딩되고 샘플은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A2) 에 바인딩될 수 있도록 하는 제 1 pH 및 전도율로 있고 바인딩되지 않은 타겟 분자는 연결 라인 (F-F) 을 통하여 직접 분리 유닛 (A1) 으로 이송되고 바인딩되지 않은 분자는 출구 (A1-W) 를 통하여 인출될 수 있도록 한다. 동시에, 분리 유닛 (B) 은 재평형화를 위해 입구 (C) 에 연결된다.
f) 분리 유닛 (A2) 의 로딩이 완료될 때, 분리 유닛 (A2) 을 연결 라인 (W-F) 으로 분리 유닛 (A1) 과 연결하면서 분리 유닛 (A2) 으로부터 바인딩되지 않은 타겟 분자가 입구 (A) 를 사용해 세척되고, 그것은 입구 (B) 를 통하여 로딩된다. 분리 유닛 (A2) 으로부터 너무 적은 타겟 분자가 검출되자마자, 연결이 차단되고 분리 유닛 (A2) 출구는 출구 위치 (A2-W) 로 스위칭되어서 바인딩되지 않은 분자를 인출하고, 한편 타겟 분자는 분리 유닛 (A1) 에 추가로 로딩되고 바인딩되지 않은 분자는 출구 (A1-W) 를 통하여 인출된다.
바람직하게, 단계 a) 내지 단계 f) 는 순차적으로 수행되고, 그것은 단계들이 2 회 이상 동일한 순서로 수행되는 것을 의미한다.
일 실시형태에서, 본 방법은 바인드-용출 모드에서 ProtA 포집, 높은 처리량 및 관류 모드에서 혼합 모드 연마를 포함한다. ProtA 포집, 높은 처리량 및 혼합 모드 연마를 포함하는 예시적인 절차에서, 본 발명에 따른 방법은 다음에 의해 수행된다:
a) 입구 (B; 예컨대, 용매 전달 시스템) 를 통하여 분리 유닛 (A1; 예컨대, ProtA 친화성 매트릭스) 에 샘플을 공급하는 것으로서, 샘플은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A1) 에 바인딩될 수 있고 바인딩되지 않은 분자가 출구 (A1-W) 를 통하여 인출될 수 있는 제 1 pH 및 전도율로 있고, 분리 유닛 (A2; 예컨대 ProtA 친화성 매트릭스) 은 제 1 pH 에서 버퍼 (A) 로 바인딩된 타겟 분자의 세척, 바이러스 불활성화 버퍼로 바이러스 불활성화 단계, 제 2 pH 에서 버퍼 (B) 로 바인딩된 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (A) 로 분리 유닛 (A2) 의 재평형화를 위해 입구 (A; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (A2) 을 출구 (A2-W) 와 연결하는 동안 세척, 바이러스 불활성화 및 재평형화 단계가 수행되고, 타겟 분자를 분리 유닛 (B) 으로 직접 이송하기 위해서 연결 라인 (C-P) 을 통하여 분리 유닛 (A2) 을 분리 유닛 (B; 예컨대 혼합 모드 배지) 과 연결하는 동안 용출 단계가 수행되고, 타겟 분자가 분리 유닛 (B) 에 약하게 바인딩되거나 바인딩되지 않을 수 있도록 하는 조건에서 분리 유닛 (A2) 으로부터 타겟 분자의 공급, 그 후 버퍼 (B) 로 재평형화시키기 위해 분리 유닛 (B) 은 입구 (C; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-W) 와 연결하는 동안 재평형화 단계가 수행되고 정제된 타겟 분자 (예컨대 항체) 를 인출하기 위해서 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-P) 와 연결하는 동안 공급 단계가 수행된다.
b) 로딩이 분리 유닛 (A1) 에서 거의 끝났을 때, 그것은 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 를 통하여 추가로 로딩되고 샘플은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A1) 에 바인딩될 수 있도록 하는 제 1 pH 및 전도율로 있고 바인딩되지 않은 타겟 분자는 연결 라인 (F-F) 을 통하여 직접 분리 유닛 (A2) 으로 이송되고 바인딩되지 않은 분자는 출구 (A2-W) 를 통하여 인출될 수 있도록 한다. 동시에, 분리 유닛 (B) 은 재평형화를 위해 입구 (C) 에 연결된다.
c) 분리 유닛 (A1) 의 로딩이 끝났을 때, 분리 유닛 (A1) 을 연결 라인 (W-F) 으로 분리 유닛 (A2) 과 연결하면서 분리 유닛 (A1) 으로부터 바인딩되지 않은 타겟 분자가 입구 (A) 를 사용해 세척되고, 그것은 입구 (B) 를 통하여 로딩된다. 분리 유닛 (A1) 으로부터 너무 적은 타겟 분자가 검출되자마자, 연결이 차단되고 분리 유닛 (A1) 출구는 출구 위치 (A1-W) 로 스위칭되어서 바인딩되지 않은 분자를 인출하고, 한편 타겟 분자는 분리 유닛 (A2) 에 추가로 로딩되고 바인딩되지 않은 분자는 출구 (A2-W) 를 통하여 인출된다.
d) 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 를 통하여 분리 유닛 (A2; 예컨대 ProtA 친화성 매트릭스) 에 샘플을 공급하는 것으로서, 조성물은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A2; 예컨대 ProtA 친화성 매트릭스) 에 바인딩될 수 있고 바인딩되지 않은 분자가 출구 (A2-W) 를 통하여 인출될 수 있는 제 1 pH 및 전도율로 있고, 분리 유닛 (A1; 예컨대 ProtA 친화성 매트릭스) 은 제 1 pH 에서 버퍼 (A) 로 바인딩된 타겟 분자의 세척, 바이러스 불활성화 버퍼로 바이러스 불활성화 단계, 제 2 pH 에서 버퍼 (B) 로 바인딩된 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (A) 로 분리 유닛 (A2) 의 재평형화를 위해 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (A1) 을 출구 (A1-W) 와 연결하는 동안 세척, 바이러스 불활성화 및 재평형화 단계가 수행되고, 타겟 분자를 분리 유닛 (B) 으로 직접 이송하기 위해서 연결 라인 (C-P) 을 통하여 분리 유닛 (A1) 을 분리 유닛 (B; 예컨대 양이온 교환 배지) 과 연결하는 동안 용출 단계가 수행되고, 타겟 분자가 분리 유닛 (B) 에 약하게 바인딩되거나 바인딩되지 않을 수 있도록 하는 조건에서 분리 유닛 (A1) 으로부터 타겟 분자의 공급, 그 후 버퍼 (B) 로 재평형화시키기 위해 분리 유닛 (B) 은 입구 (C; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-W) 와 연결하는 동안 재평형화 단계가 수행되고 정제된 타겟 분자 (예컨대 항체) 를 인출하기 위해서 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-P) 와 연결하는 동안 공급 단계가 수행된다.
e) 로딩이 분리 유닛 (A2) 에서 거의 끝났을 때, 그것은 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 를 통하여 추가로 로딩되고 샘플은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A2) 에 바인딩될 수 있도록 하는 제 1 pH 및 전도율로 있고 바인딩되지 않은 타겟 분자는 연결 라인 (F-F) 을 통하여 직접 분리 유닛 (A1) 으로 이송되고 바인딩되지 않은 분자는 출구 (A1-W) 를 통하여 인출될 수 있도록 한다. 동시에, 분리 유닛 (B) 은 재평형화를 위해 입구 (C) 에 연결된다.
f) 분리 유닛 (A2) 의 로딩이 완료될 때, 분리 유닛 (A2) 을 연결 라인 (W-F) 으로 분리 유닛 (A1) 과 연결하면서 분리 유닛 (A2) 으로부터 바인딩되지 않은 타겟 분자가 입구 (A) 를 사용해 세척되고, 그것은 입구 (B) 를 통하여 로딩된다. 분리 유닛 (A2) 으로부터 너무 적은 타겟 분자가 검출되자마자, 연결이 차단되고 분리 유닛 (A2) 출구는 출구 위치 (A2-W) 로 스위칭되어서 바인딩되지 않은 분자를 인출하고, 한편 타겟 분자는 분리 유닛 (A1) 에 추가로 로딩되고 바인딩되지 않은 분자는 출구 (A1-W) 를 통하여 인출된다.
바람직하게, 단계 a) 내지 단계 f) 는 순차적으로 수행되고, 그것은 단계들이 2 회 이상 동일한 순서로 수행되는 것을 의미한다.
일 실시형태에서, 본 방법은 AIEX 포집, 높은 처리량, CIEX 연마 (바인드 및 용출) 및 바이러스 불활성화를 포함한다. AIEX 포집, 높은 처리량, CIEX 연마 (바인드 및 용출) 및 바이러스 불활성화를 포함하는 예시적인 절차에서, 본 발명에 따른 방법은 다음에 의해 수행된다:
a) 입구 (B; 예컨대, 용매 전달 시스템) 를 통하여 분리 유닛 (A1; 예컨대, 음이온 교환 재료) 에 샘플을 공급하는 것으로서, 샘플은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A1) 에 바인딩될 수 있고 바인딩되지 않은 분자가 출구 (A1-W) 를 통하여 인출될 수 있는 제 1 pH 및 전도율로 있고, 분리 유닛 (A2; 예컨대 음이온 교환 재료) 은 제 1 pH 에서 버퍼 (A) 로 바인딩된 타겟 분자의 세척, 제 2 pH 에서 버퍼 (B) 로 바인딩된 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (A) 로 분리 유닛 (A2) 의 재평형화를 위해 입구 (A; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (A2) 을 출구 (A2-W) 와 연결하는 동안 세척 및 재평형화 단계가 수행되고, 타겟 분자를 분리 유닛 (B) 으로 직접 이송하기 위해서 연결 라인 (C-P) 을 통하여 분리 유닛 (A2) 을 분리 유닛 (B; 예컨대 양이온 교환 배지) 과 연결하는 동안 용출 단계가 수행되고, 타겟 분자가 분리 유닛 (B) 에 바인딩될 수 있도록 하는 조건에서 분리 유닛 (A2) 으로부터 타겟 분자의 공급, 그 후 버퍼 (B) 로 세척, 바이러스 불활성화 버퍼를 이용한 바이러스 불활성화 단계, 버퍼 (A) 로 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (B) 로 재평형화시키기 위해 분리 유닛 (B) 은 입구 (C; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-W) 와 연결하는 동안 공급, 세척, 바이러스 불활성화 및 재평형화 단계가 수행되고 정제된 타겟 분자 (예컨대 항체) 를 인출하기 위해서 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-P) 와 연결하는 동안 용출 단계가 수행된다.
b) 로딩이 분리 유닛 (A1) 에서 거의 끝났을 때, 그것은 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 를 통하여 추가로 로딩되고 샘플은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A1) 에 바인딩될 수 있도록 하는 제 1 pH 및 전도율로 있고 바인딩되지 않은 타겟 분자는 연결 라인 (F-F) 을 통하여 직접 분리 유닛 (A2) 으로 이송되고 바인딩되지 않은 분자는 출구 (A2-W) 를 통하여 인출될 수 있도록 한다. 동시에, 분리 유닛 (B) 은 재평형화를 위해 입구 (C) 에 연결된다.
c) 분리 유닛 (A1) 의 로딩이 끝났을 때, 분리 유닛 (A1) 을 연결 라인 (W-F) 으로 분리 유닛 (A2) 과 연결하면서 분리 유닛 (A1) 으로부터 바인딩되지 않은 타겟 분자가 입구 (A) 를 사용해 세척되고, 그것은 입구 (B) 를 통하여 로딩된다. 분리 유닛 (A1) 으로부터 너무 적은 타겟 분자가 검출되자마자, 연결이 차단되고 분리 유닛 (A1) 출구는 출구 위치 (A1-W) 로 스위칭되어서 바인딩되지 않은 분자를 인출하고, 한편 타겟 분자는 분리 유닛 (A2) 에 추가로 로딩되고 바인딩되지 않은 분자는 출구 (A2-W) 를 통하여 인출된다.
d) 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 를 통하여 분리 유닛 (A2; 예컨대 음이온 교환 재료) 에 샘플을 공급하는 것으로서, 조성물은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A2; 예컨대 음이온 교환 재료) 에 바인딩될 수 있고 바인딩되지 않은 분자가 출구 (A2-W) 를 통하여 인출될 수 있는 제 1 pH 및 전도율로 있고, 분리 유닛 (A1; 예컨대 음이온 교환 재료) 은 제 1 pH 에서 버퍼 (A) 로 바인딩된 타겟 분자의 세척, 제 2 pH 에서 버퍼 (B) 로 바인딩된 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (A) 로 분리 유닛 (A2) 의 재평형화를 위해 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 타겟 분자를 분리 유닛 (B) 으로 직접 이송하기 위해서 연결 라인 (C-P) 을 통하여 분리 유닛 (A2) 을 분리 유닛 (B; 예컨대 양이온 교환 배지) 과 연결하는 동안 세척 및 재평형화 단계가 수행되고, 타겟 분자를 분리 유닛 (B) 에 바인딩시킬 수 있는 조건에서 분리 유닛 (A1) 으로부터 타겟 분자의 공급, 버퍼 (B) 로 세척, 바이러스 불활성화 버퍼로 바이러스 불활성화 단계, 버퍼 (A) 로 타겟 분자의 용출 및 버퍼 (B) 로 재평형화시키기 위해 분리 유닛 (B) 은 입구 (C: 예컨대 용매 전달 시스템) 와 연결된다. 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-W) 와 연결하는 동안 공급, 세척, 바이러스 불활성화 및 재평형화 단계가 수행되고 정제된 타겟 분자 (예컨대 항체) 를 인출하기 위해서 분리 유닛 (B) 을 출구 (B-P) 와 연결하는 동안 용출 단계가 수행된다.
e) 로딩이 분리 유닛 (A2) 에서 거의 끝났을 때, 그것은 입구 (B; 예컨대 용매 전달 시스템) 를 통하여 추가로 로딩되고 샘플은 타겟 분자 (예컨대 항체) 가 분리 유닛 (A2) 에 바인딩될 수 있도록 하는 제 1 pH 및 전도율로 있고 바인딩되지 않은 타겟 분자는 연결 라인 (F-F) 을 통하여 직접 분리 유닛 (A1) 으로 이송되고 바인딩되지 않은 분자는 출구 (A1-W) 를 통하여 인출될 수 있도록 한다. 동시에, 분리 유닛 (B) 은 재평형화를 위해 입구 (C) 에 연결된다.
f) 분리 유닛 (A2) 의 로딩이 완료될 때, 분리 유닛 (A2) 을 연결 라인 (W-F) 으로 분리 유닛 (A1) 과 연결하면서 분리 유닛 (A2) 으로부터 바인딩되지 않은 타겟 분자가 입구 (A) 를 사용해 세척되고, 그것은 입구 (B) 를 통하여 로딩된다. 분리 유닛 (A2) 으로부터 너무 적은 타겟 분자가 검출되자마자, 연결이 차단되고 분리 유닛 (A2) 출구는 출구 위치 (A2-W) 로 스위칭되어서 바인딩되지 않은 분자를 인출하고, 한편 타겟 분자는 분리 유닛 (A1) 에 추가로 로딩되고 바인딩되지 않은 분자는 출구 (A1-W) 를 통하여 인출된다.
바람직하게, 단계 a) 내지 단계 f) 는 순차적으로 수행되고, 그것은 단계들이 2 회 이상 동일한 순서로 수행되는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 장치와 방법은 처음으로 항체와 같은 타겟 분자의 정제를 위해 시간 절약 2 단계 크로마토그래픽 절차 가능성을 제공한다. 독특한 선택성이 필요하다면, 예컨대 친화성 포집 및 양이온 교환 연마를 사용해 절차가 수행되고, 친화성 흡수제를 오히려 피해야 한다면, 양이온 포집 및 음이온 연마 또는 음이온 포집 및 양이온 연마를 사용하는 이온 교환 크로마토그래피로 친화성 크로마토그래피 단계 (Prot A) 의 교환을 통하여 정제 프로세스가 수행된다. 이것은 보다 긴 수지 사용 시간, 제자리 세정, 저렴한 수지의 장점을 가지고 다중 생물약제 화합물에 적용가능하다.
탑에서의 바이러스 불활성화를 통한 현재 정제 프로세스 최적화는 프로세싱 시간을 단축시킬 수 있도록 한다. 흔히, 프로세싱 시간은 시간의 1/2 이하로 감소된다.
상기 및 하기에 인용된 모든 출원, 특허와 공개, 2011 년 10 월 4 일에 출원된 대응하는 EP 출원 EP 11008021.5, 및 2012 년 6 월 29 일에 출원된 대응하는 미국 가출원 61/666,338 의 전체 내용은 참조로 본원에 원용된다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 실제적 적용을 나타낸다.
1.
(분석용 SEC 에 따라) 용액 중 모든 성분의 17% 의 분획물을 구성하는 0.9 ㎎/㎖ 단일클론 항체를 가지는 단일클론 항체 세포 배양 용액이 하기 조건 하에 제 1 모드 (분리 유닛 (A1, A2) 과 유사) 에서 EshmunoTM S 수지에서, 제 2 모드 (분리 유닛 (B) 과 유사) 에서 CaptoTM Adhere 에서 정제되었고, HCP 양은 600000 ng/mg 항체 (면역효소 분석 SP 2/0 에 따름) 이었다. 크로마토그래피 조건: 제 1 모드 - 33.5 ㎖ 의 EshmunoTM S 수지가 16 x 150 mm 탑에 패킹되었고; 탑은 그 후 30 ㎖/분 (1000 cm/hr) 에서 pH 4.5 의 20mM NaCl 을 함유한 25 mM 포스페이트 버퍼로 평형화되었다. 제 2 모드 - 33.5 ㎖ 의 CaptoTM Adhere 수지가 16 x 150 mm 탑에 패킹되었고; 탑은 그 후 15 ㎖/분 (500cm/hr) 에서 pH 9 의 20mM NaCl 을 함유한 50 mM TRIS 버퍼로 평형화되었다. 샘플을 조제하기 위해서: 단일클론 항체 세포 배양 용액은 물과 1:2 로 희석되었고, 0.5% 카프릴산이 첨가되고 10 분 동안 교반되었다. 형성된 침전물은 다른 20 분 동안 침강하도록 허용되었다. 얻어진 용액은 0.45 ㎛ 필터를 통하여 여과되었고, pH 5.5, 약 6 mS/cm 의 전도율로 적정되었다. 3000 ㎖ 샘플은 EshmunoTM S 탑에 로딩되었고 탑은 그 후 25 mM 아세테이트, pH 4.6 으로 세척되었다. 그 후, 탑은 25 mM 포스페이트, pH 6.3 으로 세척되었다. 유량은 그 후 300 cm/hr (10 ㎖/분) 로 감소되었고 항체는 CaptoTM Adhere 탑에 50mM TRIS, 20mM NaCl, pH 약 7.5 (cond. 약 3.3 mS/cm) 로 선형 구배시 10 개의 탑 체적으로 용출되었다. 50mM TRIS 버퍼를 이용한 인라인 희석은 용출 용액의 pH 값을 8.5 로 증가시키는데 사용되었다. 그러면, CaptoTM Adhere 탑은 그 후 50mM TRIS 버퍼, pH 8.5 로 세척되었고, 항체는 10 mM 시트르산, 10 mM 포스페이트 및 20mM NaCl, pH 3.5 로 선형 구배시 10 개의 탑 체적으로 용출되었다. 용출된 분획물은 (분석용 SEC 에 따라) 모든 성분의 99.9% 를 구성하는 3.2 ㎎/㎖ 항체를 함유하였고, (면역효소 분석 SP 2/0 에 따라) HCP 양은 33 ng/mg 항체이었다. 용출 후, 양쪽 탑은 1M NaCl 로, 그 후 1 M NaOH 로 스트리핑되었다.
2. 양이온 포집 + 음이온 관류
(분석용 SEC 에 따라) 용액 중 모든 성분의 17% 의 분획물을 구성하는 0.9 ㎎/㎖ 단일클론 항체를 가지는 단일클론 항체 세포 배양 용액이 하기 조건 하에 제 1 모드 (분리 유닛 (A1, A2) 과 유사) 에서 EshmunoTM S 수지에서, 제 2 모드 (분리 유닛 (B) 과 유사) 에서 FractogelTM TMAE (M) 에서 정제되었고, HCP 양은 600000 ng/mg 항체 (면역효소 분석 SP 2/0 에 따름) 이었다. 크로마토그래피 조건: 제 1 모드 - 33.5 ㎖ 의 EshmunoTM S 수지가 16 x 150 mm 탑에 패킹되었고; 탑은 그 후 30 ㎖/분 (1000 cm/hr) 에서 pH 4.5 의 20mM NaCl 을 함유한 25 mM 포스페이트 버퍼로 평형화되었다. 제 2 모드 - 33.5 ㎖ 의 FractogelTM TMAE (M) 수지가 16 x 150 mm 탑에 패킹되었고; 탑은 그 후 15 ㎖/분 (500cm/hr) 에서 pH 8.6 의 20mM NaCl 을 함유한 50 mM TRIS 버퍼로 평형화되었다. 샘플을 조제하기 위해서: 단일클론 항체 세포 배양 용액은 물과 1:2 로 희석되었고, 0.5% 카프릴산이 첨가되고 10 분 동안 교반되었다. 형성된 침전물은 다른 20 분 동안 침강하도록 허용되었다. 얻어진 용액은 0.45 ㎛ 필터를 통하여 여과되었고, pH 5.5, 약 6 mS/cm 의 전도율로 적정되었다. 3000 ㎖ 샘플은 EshmunoTM S 탑에 로딩되었고 탑은 그 후 25 mM 아세테이트, pH 4.6 으로 세척되었다. 그 후, 탑은 25 mM 포스페이트, pH 6.3 으로 세척되었다. 유량은 그 후 300 cm/hr (10 ㎖/분) 로 감소되었고 항체는 FractogelTM TMAE (M) 탑에 100mM TRIS, 20mM NaCl, pH 약 8.5 (cond. 약 4.6 mS/cm) 로 10 개의 탑 체적으로 용출되었다. 100mM TRIS 버퍼를 이용한 인라인 희석은 용출 용액의 pH 값을 8.6 으로 유지하는데 사용되었다. 그러면, FractogelTM TMAE (M) 탑은 그 후 50mM TRIS 버퍼, pH 8.5 로 세척되었고, 나머지 항체는 2 개의 탑 체적으로 세척되었다. 관류 분획물은 (분석용 SEC 에 따라) 모든 성분의 99.9% 를 구성하는 2.8 ㎎/㎖ 항체를 함유하였고, (면역효소 분석 SP 2/0 에 따라) HCP 양은 33 ng/mg 항체이었다. EshmunoTM S 에 대한 용출 및 FractogelTM TMAE (M) 탑에 대한 세척 후, 양쪽 탑은 1M NaCl 로, 그 후 1 M NaOH 로 스트리핑되었다.
3. ProtA 포집 + 양이온 연마
(분석용 SEC 에 따라) 용액 중 모든 성분의 17% 의 분획물을 구성하는 0.9 ㎎/㎖ 단일클론 항체를 가지는 단일클론 항체 세포 배양 용액이 하기 조건 하에 제 1 모드 (분리 유닛 (A1, A2) 과 유사) 에서 Prosep® Ultra Plus 수지에서, 제 2 모드 (분리 유닛 (B) 과 유사) 에서 EshmunoTM S 에서 정제되었고, HCP 양은 600000 ng/mg 항체 (면역효소 분석 SP 2/0 에 따름) 이었다. 크로마토그래피 조건: 제 1 모드 - 33.5 ㎖ 의 Prosep® Ultra Plus 수지가 16 x 150 mm 탑에 패킹되었고; 탑은 그 후 30 ㎖/분 (1000 cm/hr) 에서 pH 7.2 의 20mM NaCl 을 함유한 25 mM 포스페이트 버퍼로 평형화되었다. 제 2 모드 - 33.5 ㎖ 의 EshmunoTM S 수지가 16 x 150 mm 탑에 패킹되었고; 탑은 그 후 30 ㎖/분 (1000cm/hr) 에서 pH 4.0 의 20mM NaCl 을 함유한 10 mM 글리신 버퍼로 평형화되었다. 샘플을 조제하기 위해서: 단일클론 항체 세포 배양 용액은 0.45 ㎛ 필터를 통하여 여과되었고 pH 7.2, 약 16 mS/cm 의 전도율로 적정되었다. 1500 ㎖ 샘플은 Prosep® Ultra Plus 탑에 로딩되었고 탑은 그 후 pH 7.2 의 20 mM NaCl 을 함유한 25 mM 포스페이트 버퍼로 세척되었다. 유량은 그 후 300 cm/hr (10 ㎖/분) 로 감소되었고 항체는 EshmunoTM S 탑에 pH 약 5.0 (cond. 약 3.6 mS/cm) 의 20mM NaCl 을 함유한 10mM 글리신 버퍼로 10 개의 탑 체적으로 용출되었다. 10mM 글리신 버퍼를 이용한 인라인 희석은 용출 용액의 pH 값을 약 5.5 로 유지하는데 사용되었다. 그러면, EshmunoTM S 탑은 그 후 10mM 글리신 버퍼, pH 4.0 으로 세척되었고, 항체는 pH 7.2 의 20mM NaCl 을 함유한 25 mM 포스페이트 버퍼로 선형 구배시 10 개의 탑 체적으로 용출되었다. 용출 분획물은 (분석용 SEC 에 따라) 모든 성분의 99.9% 를 구성하는 4.5 ㎎/㎖ 항체를 함유하였고, (면역효소 분석 SP 2/0 에 따라) HCP 양은 40 ng/mg 항체이었다. 용출 후, Prosep Ultra Plus 탑은 0.15M 의 H3PO4 로 스트리핑되었고, EshmunoTM S 탑은 1M NaCl 및 그 후 1 M NaOH 로 스트리핑되었다.
4. ProtA 포집 + 혼합된 이온 교환 관류
(분석용 SEC 에 따라) 용액 중 모든 성분의 10% 의 분획물을 구성하는 1.25 ㎎/㎖ 단일클론 항체를 가지는 단일클론 항체 세포 배양 용액이 하기 조건 하에 제 1 모드 (분리 유닛 (A1, A2) 과 유사) 에서 Prosep®-vA 고용량 수지에서, 제 2 모드 (분리 유닛 (B) 과 유사) 에서 EshmunoTM S 및 Fractogel® TMAE Hicap 에서 정제되었고, HCP 양은 250000 ng/mg 항체 (면역효소 분석 CHO 에 따름) 이었다. 크로마토그래피 조건: 제 1 모드 - 17.3 ㎖ 의 Prosep®-vA 고용량 수지가 16 x 8.6 mm 탑에 패킹되었고; 탑은 그 후 30 ㎖/분 (1000 cm/hr) 에서 pH 7.0 의 20mM NaCl 을 함유한 25 mM TRIS 버퍼로 평형화되었다. 제 2 모드 - 16.75 ㎖ 의 EshmunoTM S 수지가 16 x 75 mm 탑에 패킹되었고 16.75 ㎖ 의 Fractogel® TMAE Hicap 수지는 16 x 75 mm 탑에 패킹되어, 양쪽 탑을 하나의 분리 유닛에 결합하고; 이 분리 유닛은 그 후 30 ㎖/분 (1000cm/hr) 에 pH 7.4 의 20mM NaCl 을 함유한 25 mM TRIS 버퍼로 평형화되었다. 샘플을 조제하기 위해서: 단일클론 항체 세포 배양 용액은 0.8 ㎛ 와 0.2 ㎛ 공극을 가지는 심층 필터를 통하여 여과되었고 pH 7.2, 약 18 mS/cm 의 전도율로 적정되었다. 220 ㎖ 샘플은 Prosep®-vA 고용량 탑에 로딩되었고 탑은 그 후 pH 7.2 의 500 mM NaCl 을 함유한 25 mM TRIS 버퍼로 세척되었다. 유량은 그 후 300 cm/hr (10 ㎖/분) 로 감소되었고 항체는 EshmunoTM S/Fractogel® TMAE Hicap 탑에 pH 약 4.0 (cond. 약 3.6 mS/cm) 의 20mM NaCl 을 함유한 10mM 글리신 버퍼로 10 개의 탑 체적으로 용출되었다. 100mM TRIS 버퍼를 이용한 인라인 희석은 용출 용액의 pH 값을 약 7.4 로 유지하는데 사용되었다. 관류 분획물은 (분석용 SEC 에 따라) 모든 성분의 99.9% 를 구성하는 5.67 ㎎/㎖ 항체를 함유하였고, (면역효소 분석 CHO 에 따라) HCP 양은 50 ng/mg 미만의 항체이었다. 용출 후, Prosep®-vA 고용량 탑은 0.15M 의 H3PO4 로 스트리핑되었고, EshmunoTM S/Fractogel® TMAE Hicap 탑은 1M NaCl 및 그 후 1 M NaOH 로 스트리핑되었다.
5. ProtA 포집 + 혼합 모드 관류
(분석용 SEC 에 따라) 용액 중 모든 성분의 10% 의 분획물을 구성하는 1.25 ㎎/㎖ 단일클론 항체를 가지는 단일클론 항체 세포 배양 용액이 하기 조건 하에 제 1 모드 (분리 유닛 (A1, A2) 과 유사) 에서 Prosep®-vA 고용량 수지에서, 제 2 모드 (분리 유닛 (B) 과 유사) 에서 EshmunoTM S 및 Fractogel® TMAE Hicap 에서 정제되었고, HCP 양은 250000 ng/mg 항체 (면역효소 분석 CHO 에 따름) 이었다. 크로마토그래피 조건: 제 1 모드 - 17.3 ㎖ 의 Prosep®-vA 고용량 수지가 16 x 8.6 mm 탑에 패킹되었고; 탑은 그 후 30 ㎖/분 (1000 cm/hr) 에서 pH 7.0 의 20mM NaCl 을 함유한 25 mM TRIS 버퍼로 평형화되었다. 제 2 모드 - 16.75 ㎖ 의 CaptoTM Adhere 수지가 16 x 75 mm 탑에 패킹되었고 16.75 ㎖ 의 CaptoTM MMC 수지는 16 x 75 mm 탑에 패킹되어, 양쪽 탑을 하나의 분리 유닛에 결합하고; 이 분리 유닛은 그 후 30 ㎖/분 (1000cm/hr) 에 pH 7.4 의 50mM NaCl 을 함유한 25 mM TRIS 버퍼로 평형화되었다. 샘플을 조제하기 위해서: 단일클론 항체 세포 배양 용액은 0.8 ㎛ 와 0.2 ㎛ 공극을 가지는 심층 필터를 통하여 여과되었고 pH 7.2, 약 18 mS/cm 의 전도율로 적정되었다. 220 ㎖ 샘플은 Prosep®-vA 고용량 탑에 로딩되었고 탑은 그 후 pH 7.2 의 500 mM NaCl 을 함유한 25 mM TRIS 버퍼로 세척되었다. 유량은 그 후 300 cm/hr (10 ㎖/분) 로 감소되었고 항체는 CaptoTM Adhere/ CaptoTM MMC 탑에 pH 약 4.0 (cond. 약 7.6 mS/cm) 의 50mM NaCl 을 함유한 50mM 글리신 버퍼로 10 개의 탑 체적으로 용출되었다. 100mM TRIS 버퍼를 이용한 인라인 희석은 용출 용액의 pH 값을 약 7.2 로 유지하는데 사용되었다. 관류 분획물은 (분석용 SEC 에 따라) 모든 성분의 99.9% 를 구성하는 6.15 ㎎/㎖ 항체를 함유하였고, (면역효소 분석 CHO 에 따라) HCP 양은 30 ng/mg 미만의 항체이었다. 용출 후, Prosep®-vA 고용량 탑은 0.15M 의 H3PO4 로 스트리핑되었고, CaptoTM Adhere/ CaptoTM MMC 탑은 1M NaCl 및 그 후 1 M NaOH 로 스트리핑되었다.

Claims (15)

  1. - 동일한 크로마토그래피 매트릭스를 둘다 가지는 2 개의 분리 유닛들 (A1 및 A2) 과, 상기 분리 유닛 (A1) 및 상기 분리 유닛 (A2) 의 상기 크로마토그래피 매트릭스와 상이한 크로마토그래피 매트릭스를 가지는 분리 유닛 (B) 으로서, 모든 분리 유닛들은 유체 입구와 유체 출구를 가져서, 상기 분리 유닛 (A1) 의 상기 유체 출구와 상기 분리 유닛 (B) 의 상기 유체 입구 사이에 적어도 유체 연결부가 있고, 그리고 상기 분리 유닛 (A2) 의 상기 유체 출구와 상기 분리 유닛 (B) 의 상기 유체 입구 사이에 유체 연결부가 있는, 상기 분리 유닛들,
    - 상기 분리 유닛 (A1) 및 상기 분리 유닛 (A2) 과 상기 분리 유닛 (B) 사이의 상기 유체 연결부에서 상기 분리 유닛 (A1) 의 상기 유체 출구와 상기 분리 유닛 (B) 의 상기 유체 입구 사이의 유체 연통부와 상기 분리 유닛 (A2) 의 상기 유체 출구와 상기 분리 유닛 (B) 의 상기 유체 입구 사이의 유체 연통부 사이에서 스위칭하도록 허용하는 적어도 하나의 밸브,
    - 적어도 2 개의 버퍼 리저버들 및 적어도 2 개의 펌프들로서, 상기 버퍼 리저버들은 상기 분리 유닛들 (A1, A2) 의 유체 입구들과 적어도 유체 연결되고,
    상기 펌프들은 상기 리저버들로부터 상기 분리 유닛들 (A1, A2) 로 액체를 수송하는데 사용되는, 상기 버퍼 리저버들 및 상기 펌프들,
    - 상기 분리 유닛 (A1) 및 상기 분리 유닛 (A2) 의 상기 유체 입구들과 유체 연결되는 샘플 용액을 포함한 리저버를 포함하는, 크로마토그래픽 정제 장치.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 분리 유닛 (A1) 및 상기 분리 유닛 (A2) 은 친화성 크로마토그래피, 양이온 교환, 혼합 모드 양이온 교환 또는 음이온 교환 크로마토그래피 매트릭스를 가지는 것을 특징으로 하는, 크로마토그래픽 정제 장치.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 분리 유닛 (B) 은 양이온 교환, 혼합 모드 음이온 교환 또는 음이온 교환 크로마토그래피 매트릭스를 가지는 것을 특징으로 하는, 크로마토그래픽 정제 장치.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 분리 유닛 (A1) 및 상기 분리 유닛 (A2) 은 친화성 크로마토그래피 매트릭스를 가지고 상기 분리 유닛 (B) 은 양이온 교환, 혼합 모드 음이온 교환 또는 음이온 교환 크로마토그래피 매트릭스를 가지는 것을 특징으로 하는, 크로마토그래픽 정제 장치.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 분리 유닛 (A1) 및 상기 분리 유닛 (A2) 은 양이온 교환 또는 혼합 모드 양이온 교환 크로마토그래피 매트릭스를 가지고, 상기 분리 유닛 (B) 은 음이온 교환 또는 혼합 모드 음이온 교환 크로마토그래피 매트릭스를 가지는 것을 특징으로 하는, 크로마토그래픽 정제 장치.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 크로마토그래픽 정제 장치는 상기 분리 유닛 (A1) 의 상기 유체 출구와 상기 분리 유닛 (A2) 의 상기 유체 입구 사이의 연결 라인, 및 상기 분리 유닛 (A2) 의 상기 유체 출구와 상기 분리 유닛 (A1) 의 상기 유체 입구 사이의 연결 라인을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 크로마토그래픽 정제 장치.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 크로마토그래픽 정제 장치는 상기 분리 유닛 (A1) 의 상기 유체 출구 및 상기 분리 유닛 (A2) 의 상기 유체 출구와 상기 분리 유닛 (B) 의 상기 유체 입구 사이의 연결 라인에 유체 입구를 포함하는 것을 특징으로 하는, 크로마토그래픽 정제 장치.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 크로마토그래픽 정제 장치는 3 개의 분리 유닛들 중 하나의 상기 분리 유닛의 상기 유체 입구와 적어도 유체 연결되는 바이러스 불활성화 버퍼를 구비한 부가적 리저버를 포함하는 것을 특징으로 하는, 크로마토그래픽 정제 장치.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 크로마토그래픽 정제 장치는 3 개의 분리 유닛들 중 하나의 상기 분리 유닛의 상기 유체 입구와 적어도 유체 연결되는 제자리 세정 (CIP) 버퍼를 구비한 적어도 하나의 부가적 리저버를 포함하는 것을 특징으로 하는, 크로마토그래픽 정제 장치.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 항에 따른 크로마토그래픽 정제 장치를 사용해 샘플 중 한 가지 이상의 불순물로부터 타겟 분자를 정제하는 방법으로서,
    - 상기 샘플이 상기 타겟 분자를 분리 유닛 (A1) 에 바인딩시킬 수 있는 전도율 및 제 1 pH 로 있는 분리 유닛 (A1) 에 상기 샘플이 로딩되는 동안, 상기 분리 유닛 (A2) 은 그 시간의 적어도 일부 동안 상기 분리 유닛 (B) 과 유체 연통하여서 분리 유닛 (A2) 에 로딩된 상기 타겟 분자가 분리 유닛 (B) 에 용출되고 상기 분리 유닛 (A2) 은 재평형화되고 상기 샘플이 상기 타겟 분자를 상기 분리 유닛 (A2) 으로 바인딩시킬 수 있는 전도율 및 제 1 pH 로 있는 상기 분리 유닛 (A2) 에 상기 샘플이 로딩되는 동안, 상기 분리 유닛 (A1) 은 그 시간의 적어도 일부 동안 상기 분리 유닛 (B) 과 유체 연통하여서 상기 분리 유닛 (A1) 에 로딩된 상기 타겟 분자가 분리 유닛 (B) 으로 용출되고 상기 분리 유닛 (A1) 은 재평형화되도록 상기 분리 유닛들 (A1, A2) 에 상기 샘플을 교번적으로 로딩하는 단계,
    - 상기 분리 유닛 (B) 의 상기 유체 출구로부터 상기 타겟 분자를 회수하는 단계를 포함하는, 샘플 중 한 가지 이상의 불순물로부터 타겟 분자를 정제하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 타겟 분자는 항체인 것을 특징으로 하는, 샘플 중 한 가지 이상의 불순물로부터 타겟 분자를 정제하는 방법.
  12. 제 10 항에 있어서,
    상기 분리 유닛 (A1) 으로 상기 샘플을 로딩하는 동안 분리 유닛 (A1) 으로부터 타겟 분자의 침출을 시작하는 포집물이 분리 유닛 (A2) 에 바인딩될 수 있도록 상기 분리 유닛 (A1) 의 상기 유체 출구는 그 시간의 적어도 일부 동안 상기 분리 유닛 (A2) 의 상기 유체 입구와 유체 연통하고, 상기 분리 유닛 (A2) 으로 상기 샘플을 로딩하는 동안 분리 유닛 (A2) 으로부터 타겟 분자의 침출을 시작하는 포집물이 상기 분리 유닛 (A1) 에 바인딩될 수 있도록 상기 분리 유닛 (A2) 의 상기 유체 출구는 그 시간의 적어도 일부 동안 상기 분리 유닛 (A1) 의 상기 유체 입구와 유체 연통하는 것을 특징으로 하는, 샘플 중 한 가지 이상의 불순물로부터 타겟 분자를 정제하는 방법.
  13. 제 10 항에 있어서,
    상기 분리 유닛 (A1) 에 상기 타겟 분자를 로딩한 후, 상기 분리 유닛 (A1) 을 통하여 바이러스 불활성화 버퍼가 공급되고,
    상기 분리 유닛 (A2) 에 상기 타겟 분자를 로딩한 후, 상기 분리 유닛 (A2) 을 통하여 바이러스 불활성화 버퍼가 공급되는 것을 특징으로 하는, 샘플 중 한 가지 이상의 불순물로부터 타겟 분자를 정제하는 방법.
  14. 제 10 항에 있어서,
    상기 분리 유닛 (A1) 으로부터 바인딩되지 않은 샘플을 세척하는 동안, 상기 분리 유닛 (A2) 은 그 시간의 적어도 일부 동안 샘플 용액을 포함한 상기 리저버 및 분리 유닛 (A1) 과 유체 연통하고, 상기 분리 유닛 (A2) 으로부터 바인딩되지 않은 샘플을 세척하는 동안, 상기 분리 유닛 (A1) 은 그 시간의 적어도 일부 동안 샘플 용액을 포함한 상기 리저버 및 분리 유닛 (A2) 과 유체 연통하는 것을 특징으로 하는, 샘플 중 한 가지 이상의 불순물로부터 타겟 분자를 정제하는 방법.
  15. 제 10 항에 있어서,
    상기 샘플은 정화된 샘플인 것을 특징으로 하는, 샘플 중 한 가지 이상의 불순물로부터 타겟 분자를 정제하는 방법.
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