JP2006125856A - 液体クロマトグラフィー装置 - Google Patents
液体クロマトグラフィー装置 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2006125856A JP2006125856A JP2004310673A JP2004310673A JP2006125856A JP 2006125856 A JP2006125856 A JP 2006125856A JP 2004310673 A JP2004310673 A JP 2004310673A JP 2004310673 A JP2004310673 A JP 2004310673A JP 2006125856 A JP2006125856 A JP 2006125856A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- column
- component
- components
- trap
- detector
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims abstract description 46
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 38
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 23
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 19
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 18
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 61
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 24
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 description 19
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 17
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 8
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 6
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- -1 for example Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000000252 photodiode array detection Methods 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000010206 sensitivity analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
- G01N30/08—Preparation using an enricher
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
- G01N30/38—Flow patterns
- G01N30/46—Flow patterns using more than one column
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/74—Optical detectors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/78—Detectors specially adapted therefor using more than one detector
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
- G01N2030/027—Liquid chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
- G01N30/08—Preparation using an enricher
- G01N2030/085—Preparation using an enricher using absorbing precolumn
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
- G01N30/38—Flow patterns
- G01N30/46—Flow patterns using more than one column
- G01N30/468—Flow patterns using more than one column involving switching between different column configurations
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
【課題】第一の分析カラムで分離し、濃縮した成分と第二の分析カラムで分離した成分とが同一であることを確実に、且つ、容易に判定可能な液体クロマトグラフィー装置を提供すること。
【解決手段】第一の移動相により導かれた試料中の成分を分離する第一の分析カラムと、前記成分を検出する第一の検出手段と、前記第一の検出手段で検出された成分を分画して分取部に保持する分画用流路と、前記分取部に保持された成分をトラップカラムに送り出して前記成分をトラップカラムに捕捉させて濃縮せしめるトラップ用流路と、第二の移動相により前記トラップカラムから溶出させられた前記トラップカラムに捕捉・濃縮された成分を分離する第二の分析カラムと、前記第二の分析カラムで分離された成分を検出する第二の検出手段とを備えた液体クロマトグラフィー装置において、第一および第二の検出手段が、フォトダイオードアレイ検出器、赤外検出器、放射性同位体検出器または蛍光検出器であることを特徴とする液体クロマトグラフィー装置。
【選択図】図１。
【解決手段】第一の移動相により導かれた試料中の成分を分離する第一の分析カラムと、前記成分を検出する第一の検出手段と、前記第一の検出手段で検出された成分を分画して分取部に保持する分画用流路と、前記分取部に保持された成分をトラップカラムに送り出して前記成分をトラップカラムに捕捉させて濃縮せしめるトラップ用流路と、第二の移動相により前記トラップカラムから溶出させられた前記トラップカラムに捕捉・濃縮された成分を分離する第二の分析カラムと、前記第二の分析カラムで分離された成分を検出する第二の検出手段とを備えた液体クロマトグラフィー装置において、第一および第二の検出手段が、フォトダイオードアレイ検出器、赤外検出器、放射性同位体検出器または蛍光検出器であることを特徴とする液体クロマトグラフィー装置。
【選択図】図１。
Description
本発明は、液体クロマトグラフィー装置に関する。
複数の成分を含む試料中の成分を第一の分析カラムにより分離し、前記成分を第一の紫外光検出器（以下、ＵＶ検出器と略記する。）により検出し、前記成分をトラップカラムに捕捉して濃縮し、これを第二の分析カラムに送り出して分離し、第二のＵＶ検出器により検出する液体クロマトグラフィー装置が知られている（例えば特許文献１および２参照。）。
このような液体クロマトグラフィー装置では、ＵＶ検出器を用いていることから、紫外領域に吸収を有する非常に多くの化合物を濃縮対象の成分とすることが可能であり、しかも検出感度も高いため、濃縮対象の成分が微量であっても、濃縮操作が可能で、第二の分析カラムにおいて高感度分析が可能となっている。
しかしながら、第一の分析カラムと第二の分析カラムの種類やそれぞれの移動相の組成等が異なっている場合には、第一のＵＶ検出器により検出された成分と第二のＵＶ検出器により検出された成分の保持時間が異なるため、それらが同一成分であるかを確実に同定することは難しかった。また、高感度であるため、例えばバックグランド成分、夾雑成分、分画用流路内に残存した成分等の濃縮対象の成分以外の成分が第二のＵＶ検出器で検出されることもあり、第二のＵＶ検出器で検出された複数の成分のうち、どの成分が、目的とする濃縮対象の成分であるかを同定することは困難であった。さらには、目的とする濃縮対象の成分によって、トラップカラムに捕捉されない場合もあり、そのような場合には、第二のＵＶ検出器で検出された成分を目的とする濃縮対象の成分と誤って同定してしまうことがあった。
このような状況のもと、本発明者らは、第一の分析カラムで分離し、濃縮した成分と第二の分析カラムで分離した成分とが同一であることを確実に、且つ、容易に判定可能な液体クロマトグラフィー装置を開発すべく検討したところ、第一および第二の検出手段として、フォトダイオードアレイ検出器、赤外光検出器、放射性同位体検出器または蛍光検出器を用いることにより、バックグランド成分、夾雑成分、分画用流路内に残存した成分等の影響なく、第一の分析カラムで分離し、濃縮された目的成分と第二の分析カラムで分離した成分とが同一であることを確実に、且つ、容易に判定できることを見出し、本発明に至った。
すなわち、本発明は、
１．第一の移動相により導かれた試料中の成分を分離する第一の分析カラムと、
前記成分を検出する第一の検出手段と、前記第一の検出手段で検出された成分を分画して分取部に保持する分画用流路と、前記分取部に保持された成分をトラップカラムに送り出して前記成分をトラップカラムに捕捉させて濃縮せしめるトラップ用流路と、第二の移動相により前記トラップカラムから溶出させられた前記トラップカラムに捕捉・濃縮された成分を分離する第二の分析カラムと、前記第二の分析カラムで分離された成分を検出する第二の検出手段とを備えた液体クロマトグラフィー装置において、第一および第二の検出手段が、フォトダイオードアレイ検出器、赤外検出器、放射性同位体検出器または蛍光検出器であることを特徴とする液体クロマトグラフィー装置；
２．トラップカラムが複数設けられ、前記トラップ用流路の一つのトラップカラムに成分を捕捉させて濃縮せしめる捕捉・濃縮動作と、他のトラップカラムから捕捉された成分を溶出させる溶出動作を同時に行うための流路切替え機構とを備えてなる前項１に記載の液体クロマトグラフィー装置；
３．第一および第二の検出手段が、少なくとも二種の検出器からなり、そのうちの一種が、フォトダイオードアレイ検出器、赤外光検出器、放射性同位体検出器または蛍光検出器であり、もう一種が、紫外光検出器である前項１または２に記載の液体クロマトグラフィー装置；
４．分取部に保持された成分を、希釈液により希釈しながらトラップカラムに送り出す前項１または２に記載の液体クロマトグラフィー装置；
５．第一の分析カラムで分離された成分を分画し、希釈液とともに分取部に保持する前項１または２に記載の液体クロマトグラフィー装置等を提供するものである。
１．第一の移動相により導かれた試料中の成分を分離する第一の分析カラムと、
前記成分を検出する第一の検出手段と、前記第一の検出手段で検出された成分を分画して分取部に保持する分画用流路と、前記分取部に保持された成分をトラップカラムに送り出して前記成分をトラップカラムに捕捉させて濃縮せしめるトラップ用流路と、第二の移動相により前記トラップカラムから溶出させられた前記トラップカラムに捕捉・濃縮された成分を分離する第二の分析カラムと、前記第二の分析カラムで分離された成分を検出する第二の検出手段とを備えた液体クロマトグラフィー装置において、第一および第二の検出手段が、フォトダイオードアレイ検出器、赤外検出器、放射性同位体検出器または蛍光検出器であることを特徴とする液体クロマトグラフィー装置；
２．トラップカラムが複数設けられ、前記トラップ用流路の一つのトラップカラムに成分を捕捉させて濃縮せしめる捕捉・濃縮動作と、他のトラップカラムから捕捉された成分を溶出させる溶出動作を同時に行うための流路切替え機構とを備えてなる前項１に記載の液体クロマトグラフィー装置；
３．第一および第二の検出手段が、少なくとも二種の検出器からなり、そのうちの一種が、フォトダイオードアレイ検出器、赤外光検出器、放射性同位体検出器または蛍光検出器であり、もう一種が、紫外光検出器である前項１または２に記載の液体クロマトグラフィー装置；
４．分取部に保持された成分を、希釈液により希釈しながらトラップカラムに送り出す前項１または２に記載の液体クロマトグラフィー装置；
５．第一の分析カラムで分離された成分を分画し、希釈液とともに分取部に保持する前項１または２に記載の液体クロマトグラフィー装置等を提供するものである。
本発明の液体クロマトグラフィー装置は、第一および第二の検出手段として、フォトダイオードアレイ検出器、赤外光検出器、放射性同位体検出器または蛍光検出器が用いられているため、バックグランド成分、夾雑成分、分画用流路内に残存した成分等の影響なく、第一の検出手段で検出した目的成分と第二の検出手段で検出した成分とが同一であるかどうかを確実に、且つ、容易に判定できる。
以下、図面を参照しながら、本発明を詳細に説明する。図１に、本発明の液体クロマトグラフィー装置の一つの実施態様を示した。図１に示した液体クロマトグラフィー装置は、第一および第二の検出手段として、フォトダイオードアレイ検出器（以下、ＰＤＡ検出器と略記する。）を用い、一つのトラップカラムを備えた液体クロマトグラフィー装置である。
送液ポンプ２ａおよび２ｂは、有機溶媒、水等の移動相として使用され得る溶媒を送液可能なものであればよい。かかる送液ポンプは、流量を任意に設定することができるものが好ましい。
送液ポンプ２ａの上流側に、流路Ｌ１により切替えバルブ１０が接続されており、切替えバルブ１０と第一の移動相を構成する有機溶媒４ａとは、流路Ｌ２で接続されている。流路Ｌ２の途中にはオンラインデガッサ８が設けられている。オンラインデガッサ８は、流路内を流れる有機溶媒４ａおよび希釈液６ａ中への気泡の噛み込みを防止する機能を有するものであり、安定した送液状態を保つ点で設けておくことが好ましい。また、切替えバルブ１０には、希釈液６ａとの流路Ｌ３が接続されている。切替えバルブ１０を切替えることにより、流路Ｌ１と流路Ｌ２とを接続したり、流路Ｌ１と流路Ｌ３とを接続したりするようになっている。
同様に、送液ポンプ２ｂの上流側には、流路Ｌ４により切替えバルブ１０が接続され、切替えバルブ１０と第一の移動相を構成する水４ｂとが流路Ｌ５で、切替えバルブ１０と搬送液６ｂとが流路Ｌ６でそれぞれ接続されている。さらに、流路Ｌ５およびＬ６の途中に、オンラインデガッサ８が設けられている。切替えバルブ１０を切替えることにより、流路Ｌ４とＬ５とを接続したり、流路Ｌ４とＬ６とを接続したりするようになっている。なお、図１に示す実施態様では、第一の移動相を構成する有機溶媒４ａと希釈液６ａとを、切替えバルブ１０を介して、送液ポンプ２ａにより送液するようになっているが、切替えバルブ１０を介することなく、それぞれを送液する送液ポンプを設けてもよい。また、第一の移動相を構成する水４ｂと搬送液６ｂについても、同様に、切替えバルブ１０を介することなく、それぞれを送液する送液ポンプを設けてもよい。
希釈液６ａは、後述する分取部２５ａ〜２５ｅから押し出された成分を希釈しながらトラップカラム３０へ送り出す液であり、搬送液６ｂは、後述する分取部２５ａ〜２５ｅに保持された成分をトラップカラム３０に押し出す液であり、それぞれ同じ溶媒であってもよいし、異なる溶媒であってもよく、第一の移動相を構成する有機溶媒４ａおよび水４ｂ、成分等に応じて、トラップカラム３０への成分の吸着効率を高めるような溶媒を選択することが好ましい。また、かかる希釈液６ａおよび搬送液６ｂとしては、不揮発性塩等の緩衝剤を含まない水もしくは水溶液も使用することができる。緩衝剤を含む第一の移動相を用いた場合に、かかる緩衝剤を含まない搬送液を用いることにより、成分をトラップカラムへ捕捉・濃縮させる際に、脱塩処理を行うことができる。
送液ポンプ２ａおよび２ｂの下流側の流路Ｌ７およびＬ８は、切替えバルブ１２を介して両流路を流れる液を混合するミキサ１４に接続されており、ミキサ１４で混合された溶液の流路が、試料注入部であるオートサンプラ１６を介して第一の分析カラム１８に接続されている。
送液ポンプ２ａおよび２ｂの流量は、試料、第一の分析カラム等に応じて適宜選択すればよく、それぞれの送液ポンプの流量は一定であってもよいし、それぞれ独立に、経時的に変化させてもよい。なお、図１に示した実施態様では、第一の移動相を構成する有機溶媒４ａと水４ｂとを２つの送液ポンプで送液し、ミキサ１４で混合し、所定の組成の第一の移動相を調製し、第一の分析カラム１８に送液するようにしているが、あらかじめ有機溶媒４ａと水４ｂを所定の割合で混合しておき、一つの送液ポンプにより送液するようにしてもよい。また、第一の移動相の組成も、有機溶媒と水との混合溶液に限らず、単独の有機溶媒としてもよいし、異なる二種の有機溶媒の混合溶液としてもよく、試料やその成分、分析カラム等に応じて適宜選択すればよい。また、試料中の成分の分離をよくするため、不揮発性塩等の緩衝剤が溶解した緩衝溶液等を第一の移動相を構成する溶媒として用いてもよい。
本発明において、試料とは、濃縮したい成分を含むものであればよく、あらゆる形態の試料を意味し、試料成分自体、試料成分含有製剤等を溶液にしたものの他、例えば、血液、血漿、尿等を媒体とした試料成分等も挙げることができる。
第一の分析カラム１８としては、順相カラム、逆相カラム、イオン交換カラム、アフィニティカラム、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）カラム等種々のカラムが使用でき、分離しようとする試料中の成分に応じて、適宜選択すればよい。かかる分析カラムの内径や長さも特に制限されない。
第一の分析カラム１８の下流側には、第一の検出手段であるＰＤＡ検出器２０が接続され、第一の分析カラム１８で分離された試料中の成分がＰＤＡ検出器２０で検出されるようになっている。ＰＤＡ検出器は、紫外領域（約１９０〜約４００ｎｍ）から可視領域（約３００〜約８００ｎｍ）の各波長の吸光スペクトルを連続的に検出する検出器であり、第一の分析カラム１８で分離された成分の、紫外領域から可視領域の種々の波長における吸光スペクトルが取得できる。検出された吸光スペクトルは、記憶手段（図示しない）に記憶される。
図１に示した液体クロマトグラフィー装置では、ＰＤＡ検出器が用いられているが、ＰＤＡ検出器に代えて、赤外検出器（以下、ＩＲ検出器と略記する。）、放射性同位体検出器（以下、ＲＩ検出器と略記する。）または蛍光検出器を用いることができる。濃縮したい成分が、赤外領域に特徴的な吸収を持つ場合にはＩＲ検出器を、濃縮したい成分が、放射性同位体を含む化合物である場合にはＲＩ検出器を、濃縮したい成分が、蛍光を持つ化合物でラベル化されている場合には蛍光検出器を用いることにより、確実に、且つ、より容易に成分を同定することができる。
ＰＤＡ検出器２０には、切替えバルブ２２を介して、分画用流路２４が接続されている。分画用流路２４は、２つの分配バルブ２６ａおよび２６ｂとの間に分取部を有した流路を複数、並列に備え、切替えバルブ２２と、流路Ｌ９およびＬ１０により接続されており、第一の分析カラム１８で分離された成分が、分配バルブの分配操作により分画され、分画された成分が移動相とともに、分取部２５ａ〜２５ｅに保持されるようになっている。切替えバルブ２２には、ドレインへつながる流路Ｌ２２も接続されている。図１では、分取部は５つ設けられているが、その数は制限されない。
切替えバルブ１２と切替えバルブ２２との間には２つの流路Ｌ１１およびＬ１２が接続されており、一方の流路Ｌ１１は、途中で分岐してトラップ用流路に接続されている。トラップ用流路は、前記分取部２５ａ〜２５ｅに保持された成分をトラップカラムに送り出して前記成分をトラップカラムに捕捉させて濃縮せしめる流路であり、一つのトラップカラム３０が設けられている。トラップカラム３０は、切替えバルブ２８と、流路Ｌ１６およびＬ１７でそれぞれ接続されている。前記流路Ｌ１１から分岐した流路Ｌ１３は切替えバルブ２８に接続されており、該切替えバルブ２８には、トラップカラム３０に捕捉・濃縮された成分を分離する第二の分析カラム３２と第二の分析カラム３２で分離された成分を検出する第二の検出手段であるＰＤＡ検出器３３が設けられている。
トラップカラム３０としては、通常その内径が、前記第一の分析カラム１８の内径よりも小さいカラムが用いられ、第一の分析カラム１８の内径にもよるが、通常０．０３〜６ｍｍの内径のカラムが使用される。また、トラップカラム３０としては、例えば筒状部材内に充填剤を充填した充填型カラム、モノリス型カラム等を用いることができる。充填型カラムをトラップカラムとして用いる場合には、トラップカラム内の圧力を小さくするという点で、その粒径が１０〜６０μｍである充填剤が充填された充填型カラムを用いることが好ましい。また、トラップカラム３０の長さは特に制限されないが、通常は１０〜１００ｍｍ程度である。
第二の分析カラム３２としては、トラップカラム３０から溶出した成分をさらに高濃度に濃縮するという観点から、例えばミクロカラムやナノカラム等の内径０．０３〜０．３ｍｍのカラムを用いることが好ましい。第二の分析カラム３２の長さは、通常１０〜３０ｃｍである。
トラップカラム３０から溶出した成分が、第二の検出手段であるＰＤＡ検出器３３で検出され、該成分の、紫外領域から可視領域の種々の波長における吸光スペクトルが取得できる。検出された吸光スペクトルは、記憶手段（図示しない）に記憶され、記憶手段に記憶された前記ＰＤＡ検出器２０で検出された吸光スペクトルとＰＤＡ検出器３３で検出された吸光スペクトルとを比較することにより、同一の成分であるか否かが同定される。ＰＤＡ検出器は、紫外領域から可視領域の種々の波長における吸光スペクトルが取得できるため、単一波長における吸光スペクトルが取得可能な紫外光検出器よりもより詳細なスペクトル情報を得ることができ、成分の同定が容易となる。
切替えバルブ２８には、第二の移動相を構成する有機溶媒３８ａおよび水３８ｂを供給するための送液ポンプ３６ａおよび３６ｂが、ミキサ４０を介して接続されている。有機溶媒３８ａおよび水３８ｂと送液ポンプ３６ａおよび３６ｂとを接続する流路には、オンラインデガッサ３９が設けられている。また、切替えバルブ２８には、ドレインへの排出流路が接続されている。
第二の移動相は、トラップカラム３０からの成分の溶出をより容易にするため、成分やトラップカラム３０に応じて適宜決めればよい。また、第二の移動相は、トラップカラム３０に捕捉・濃縮された成分を溶出させるものであるため、成分の分離をよくするための不揮発性塩等の緩衝剤等を用いなくてもよい。
第一の分析カラム１８およびトラップカラム３０は、カラムオーブン４１中に設けられており、略一定の温度に保持されている。図１に示した実施態様では、第一の分析カラム１８およびトラップカラム３０が一つのカラムオーブンに設けられているが、それぞれのカラムごとにカラムオーブンを設けてもよい。また、第二の分析カラム３２も、前記カラムオーブン４１もしくは図示しない別のカラムオーブン中に設けられ、略一定の温度に保持されている。
続いて、本発明の一実施態様である液体クロマトグラフィー装置の動作について説明する。図１は、試料中の成分の分離工程および分離された成分の分画工程が行われている状態を示しており、かかる工程で使用される流路が太線で、液の流れが矢印で表わされている。図２は、成分のトラップカラムへの捕捉・濃縮工程が行われている状態を示しており、図１と同様に、かかる工程で使用される流路が太線で、液の流れが矢印で表わされている。図３は、トラップカラムに捕捉・濃縮されていた成分の第二の分析カラムによる分離工程が行われている状態を示しており、図１および２と同様に、かかる工程で使用される流路が太線で、液の流れが矢印で表わされている。
まず、試料中の成分の分離工程および分離された成分の分画工程が行われている状態について、図１に基づいて説明する。
＜試料中の成分の分離工程＞
切替えバルブ１０が操作され、流路Ｌ１と流路Ｌ２とが接続されるとともに、流路Ｌ４と流路Ｌ５とが接続される。送液ポンプ２ａおよび２ｂが起動されると、有機溶媒４ａおよび水４ｂがそれぞれ送液ポンプ２ａおよび２ｂにより送液され、それぞれ流路Ｌ７およびＬ８を通り、切替えバルブ１２を経てミキサ１４で混合され、第一の移動相となり、オートサンプラ１６を経て第一の分析カラム１８に送液される。試料をオートサンプラ１６により注入すると、注入された試料は第一の移動相により第一の分析カラム１８に導かれ、試料中の成分が、第一の分析カラム１８で分離される。
切替えバルブ１０が操作され、流路Ｌ１と流路Ｌ２とが接続されるとともに、流路Ｌ４と流路Ｌ５とが接続される。送液ポンプ２ａおよび２ｂが起動されると、有機溶媒４ａおよび水４ｂがそれぞれ送液ポンプ２ａおよび２ｂにより送液され、それぞれ流路Ｌ７およびＬ８を通り、切替えバルブ１２を経てミキサ１４で混合され、第一の移動相となり、オートサンプラ１６を経て第一の分析カラム１８に送液される。試料をオートサンプラ１６により注入すると、注入された試料は第一の移動相により第一の分析カラム１８に導かれ、試料中の成分が、第一の分析カラム１８で分離される。
＜分離された成分の分画工程＞
分離された成分は第一の分析カラム１８から溶出していき、ＰＤＡ検出器２０で検出され、切替えバルブ２２を経て、流路Ｌ９を通り、分画用流路２４へ流れる。ＰＤＡ検出器２０で成分が検出されると、その検出信号に応じて分配バルブ２６ａおよび２６ｂとが働き、分画用流路２４内の分取部２５ａ〜２５ｅのうちのいずれかが選択され、分離された成分を分画し、選択された分取部に分画された成分が第一の移動相とともに保持される。ＰＤＡ検出器２０で検出されたスペクトルは、記憶手段（図示しない）に記憶される。図１では、分取部２５ｅが選択され、成分が分取部２５ｅに分画されている。第一の検出器２０で成分が検出される毎に分配バルブ２６ａおよび２６ｂが切替えられ、分画用流路２４内のいずれかの分取部が選択され、分離された成分毎に分画動作が行われ、分画された成分が第一の移動相とともに選択された分取部に保持される。第一の分析カラム１８から流出する第一の移動相により分画用流路２４の分取部に保持されなかったものは、分配バルブ２６ｂ、流路Ｌ１０、切替えバルブ２２、流路Ｌ２２を経て、ドレインから排出される。
分離された成分は第一の分析カラム１８から溶出していき、ＰＤＡ検出器２０で検出され、切替えバルブ２２を経て、流路Ｌ９を通り、分画用流路２４へ流れる。ＰＤＡ検出器２０で成分が検出されると、その検出信号に応じて分配バルブ２６ａおよび２６ｂとが働き、分画用流路２４内の分取部２５ａ〜２５ｅのうちのいずれかが選択され、分離された成分を分画し、選択された分取部に分画された成分が第一の移動相とともに保持される。ＰＤＡ検出器２０で検出されたスペクトルは、記憶手段（図示しない）に記憶される。図１では、分取部２５ｅが選択され、成分が分取部２５ｅに分画されている。第一の検出器２０で成分が検出される毎に分配バルブ２６ａおよび２６ｂが切替えられ、分画用流路２４内のいずれかの分取部が選択され、分離された成分毎に分画動作が行われ、分画された成分が第一の移動相とともに選択された分取部に保持される。第一の分析カラム１８から流出する第一の移動相により分画用流路２４の分取部に保持されなかったものは、分配バルブ２６ｂ、流路Ｌ１０、切替えバルブ２２、流路Ｌ２２を経て、ドレインから排出される。
一方で、送液ポンプ３６ａおよび３６ｂも起動され、第二の移動相を構成する有機溶媒３８ａおよび水３８ｂがそれぞれ送液ポンプ３６ａおよび３６ｂにより送液され、ミキサ４０で混合され、第二の移動相となり、切替えバルブ２８を経て、トラップカラム３０に送液され、コンディショニングが行われるようになっている。
次に、成分のトラップカラムへの捕捉・濃縮工程が行われている状態について、図２に基づいて説明する。
＜成分のトラップカラムへの捕捉・濃縮工程＞
切替えバルブ１０が操作され、流路Ｌ１と流路Ｌ３とが接続されるとともに、流路Ｌ４と流路Ｌ６とが接続される。送液ポンプ２ａおよび２ｂにより希釈液６ａおよび搬送液６ｂが送液され、搬送液６ｂは、流路Ｌ６、Ｌ４およびＬ８を通り、切替えバルブ１２、流路Ｌ１２、さらに切替えバルブ２２を経て、流路Ｌ１０へ導かれる。分配バルブ２６ａおよび２６ｂが操作され、分画された成分が保持された分取部のうちの一つが選択され、搬送液６ｂが、分配バルブ２６ｂから選択された分取部を通り、前記分取部に保持されていた成分と第一の移動相とともに、分配バルブ２６ａ、流路Ｌ９、切替えバルブ２２、流路Ｌ１１、流路Ｌ１３、切替えバルブ２８、流路Ｌ１６を通り、トラップカラム３０へ導かれる。一方、希釈液６ａは、流路Ｌ３、Ｌ１およびＬ７を通り、切替えバルブ１２を経て、流路Ｌ１１を通り、前記選択された分取部に保持されていた成分、第一の移動相および搬送液６ｂの流れと合流し、トラップカラム３０へ導かれる。トラップカラム３０に導かれた成分は、トラップカラム３０に捕捉され、濃縮される。トラップカラム３０を経た第一の移動相と希釈液６ａと搬送液６ｂは、流路Ｌ１７を通り、切替えバルブ２８を経てドレインから排出される。
切替えバルブ１０が操作され、流路Ｌ１と流路Ｌ３とが接続されるとともに、流路Ｌ４と流路Ｌ６とが接続される。送液ポンプ２ａおよび２ｂにより希釈液６ａおよび搬送液６ｂが送液され、搬送液６ｂは、流路Ｌ６、Ｌ４およびＬ８を通り、切替えバルブ１２、流路Ｌ１２、さらに切替えバルブ２２を経て、流路Ｌ１０へ導かれる。分配バルブ２６ａおよび２６ｂが操作され、分画された成分が保持された分取部のうちの一つが選択され、搬送液６ｂが、分配バルブ２６ｂから選択された分取部を通り、前記分取部に保持されていた成分と第一の移動相とともに、分配バルブ２６ａ、流路Ｌ９、切替えバルブ２２、流路Ｌ１１、流路Ｌ１３、切替えバルブ２８、流路Ｌ１６を通り、トラップカラム３０へ導かれる。一方、希釈液６ａは、流路Ｌ３、Ｌ１およびＬ７を通り、切替えバルブ１２を経て、流路Ｌ１１を通り、前記選択された分取部に保持されていた成分、第一の移動相および搬送液６ｂの流れと合流し、トラップカラム３０へ導かれる。トラップカラム３０に導かれた成分は、トラップカラム３０に捕捉され、濃縮される。トラップカラム３０を経た第一の移動相と希釈液６ａと搬送液６ｂは、流路Ｌ１７を通り、切替えバルブ２８を経てドレインから排出される。
続いて、トラップカラムに捕捉・濃縮された成分の第二の分析カラムによる分離工程が行われている状態について図３に基づいて説明する。
＜トラップカラムに捕捉・濃縮されていた成分の第二の分析カラムによる分離工程＞
第二の移動相を構成する有機溶媒３８ａおよび水３８ｂが、オンラインデガッサ３９を経て、気泡が除去された状態で、それぞれ送液ポンプ３６ａおよび３６ｂにより送液され、ミキサ４０で混合され、第二の移動相となって、切替えバルブ２８を経て、流路Ｌ１６を通り、トラップカラム３０に導かれる。トラップカラム３０にすでに捕捉され濃縮された成分は、第二の移動相により溶出し、溶出した成分は第二の移動相とともに、流路Ｌ１７を通り、切替えバルブ２８を経て、第二の分析カラム３２へ導かれ、第二の分析カラム３２で分離される。分離された成分は、第二の検出器であるＰＤＡ検出器３３で検出され、吸収スペクトルが取得される。取得された吸収スペクトルは、記憶手段（図示しない）に記憶される。ＰＤＡ検出器を用いることにより、各成分について、紫外領域から可視領域の任意の波長における吸収スペクトルを取得することが可能となり、前記ＰＤＡ検出器２０で検出され、得られた吸収スペクトルとＰＤＡ検出器３３で検出され、得られた吸収スペクトルを比較することにより、第一の分析カラムで分離し、トラップカラムに濃縮した成分と第二の分析カラムで分離した成分とが同一であるか否かが確実に、且つ、容易に判断できる。また、ＰＤＡ検出器に代えて、ＩＲ検出器、ＲＩ検出器または蛍光検出器を用いることによっても、特徴的な赤外吸収を検出したり、放射性同位体を含んでいたり、蛍光を持つ化合物でラベル化されていたりする化合物を確実に、且つ、容易に検出でき、スペクトルを比較することができるため、第一の分析カラムで分離し、トラップカラムに濃縮した成分と第二の分析カラムで分離した成分とが同一であるか否かが確実に、且つ、容易に判断できる。
第二の移動相を構成する有機溶媒３８ａおよび水３８ｂが、オンラインデガッサ３９を経て、気泡が除去された状態で、それぞれ送液ポンプ３６ａおよび３６ｂにより送液され、ミキサ４０で混合され、第二の移動相となって、切替えバルブ２８を経て、流路Ｌ１６を通り、トラップカラム３０に導かれる。トラップカラム３０にすでに捕捉され濃縮された成分は、第二の移動相により溶出し、溶出した成分は第二の移動相とともに、流路Ｌ１７を通り、切替えバルブ２８を経て、第二の分析カラム３２へ導かれ、第二の分析カラム３２で分離される。分離された成分は、第二の検出器であるＰＤＡ検出器３３で検出され、吸収スペクトルが取得される。取得された吸収スペクトルは、記憶手段（図示しない）に記憶される。ＰＤＡ検出器を用いることにより、各成分について、紫外領域から可視領域の任意の波長における吸収スペクトルを取得することが可能となり、前記ＰＤＡ検出器２０で検出され、得られた吸収スペクトルとＰＤＡ検出器３３で検出され、得られた吸収スペクトルを比較することにより、第一の分析カラムで分離し、トラップカラムに濃縮した成分と第二の分析カラムで分離した成分とが同一であるか否かが確実に、且つ、容易に判断できる。また、ＰＤＡ検出器に代えて、ＩＲ検出器、ＲＩ検出器または蛍光検出器を用いることによっても、特徴的な赤外吸収を検出したり、放射性同位体を含んでいたり、蛍光を持つ化合物でラベル化されていたりする化合物を確実に、且つ、容易に検出でき、スペクトルを比較することができるため、第一の分析カラムで分離し、トラップカラムに濃縮した成分と第二の分析カラムで分離した成分とが同一であるか否かが確実に、且つ、容易に判断できる。
なお、図１〜図３では、分画用流路２４内の分取部２５ａ〜２５ｅに保持された成分を、希釈液６ａおよび搬送液６ｂで希釈し、押し出しながらトラップカラム３０へ導くようにしているが、分画された成分を、搬送液６ｂとともに分取部２５ａ〜２５ｅに保持するようにしてもよい。
続いて、本発明の別の実施態様である液体クロマトグラフィー装置の動作について、図４〜図６に基づいて説明する。図４〜図６に示す液体クロマトグラフィー装置は、トラップカラムが２つ並列に設けられるとともに、流路切替え機構が設けられた液体クロマトグラフィー装置である。図１に示した液体クロマトグラフィー装置では、一つのトラップカラムで、成分の捕捉・濃縮動作と成分の溶出動作が交互に行われるため、溶出しきれず、トラップカラム内に成分が残存した場合には、次に捕捉・濃縮しようとする成分と混ざり合う可能性があるため、例えば成分の溶出動作に要する時間を延ばす等の必要が生じる場合があるが、図４に示す液体クロマトグラフィー装置では、トラップカラムが２つ並列に設けられているため、成分を捕捉・濃縮させるトラップカラムを代えることができるため、より効率的に処理できる。
図４は、試料中の成分の分離工程および分離された成分の分画工程が行われている状態を示しており、かかる工程で使用される流路が太線で、液の流れが矢印で表わされている。図５および図６は、成分のトラップカラムへの捕捉・濃縮工程とトラップカラムに捕捉・濃縮されていた成分の溶出・第二の分析カラムでの分析工程が同時に行われている状態を示しており、かかる工程で使用される流路が太線で、液の流れが矢印で表わされている。
図４に示した試料中の成分の分離工程および分離された成分の分画工程が行われている状態については、前記図１に示した状態について説明したと同様の動作が行われている。
次に、成分の別のトラップカラムへの捕捉・濃縮工程とトラップカラムに捕捉・濃縮されていた成分の溶出・取り出し工程が同時に行われている状態について、図５に基づいて説明する。
＜成分のトラップカラムへの捕捉・濃縮工程＞
切替えバルブ１０が操作され、流路Ｌ１と流路Ｌ３とが接続されるとともに、流路Ｌ４と流路Ｌ６とが接続される。送液ポンプ２ａおよび２ｂにより希釈液６ａおよび搬送液６ｂが送液され、搬送液６ｂは、流路Ｌ６、Ｌ４およびＬ８を通り、切替えバルブ１２、流路Ｌ１２、さらに切替えバルブ２２を経て、流路Ｌ１０へ導かれる。分配バルブ２６ａおよび２６ｂが操作され、分画された成分が保持された分取部のうちの一つが選択され、搬送液６ｂが、分配バルブ２６ｂから選択された分取部を通り、前記分取部に保持されていた成分と第一の移動相とともに、分配バルブ２６ａ、流路Ｌ９、切替えバルブ２２、流路Ｌ１１、流路Ｌ１３、切替えバルブ２８ｂ、流路Ｌ１７を通り、トラップカラム３０ｂへ導かれる。一方、希釈液６ａは、流路Ｌ３、Ｌ１およびＬ７を通り、切替えバルブ１２を経て、流路Ｌ１１を通り、前記選択された分取部に保持されていた成分、第一の移動相および搬送液６ｂの流れと合流し、トラップカラム３０ｂへ導かれる。トラップカラム３０ｂに導かれた成分は、トラップカラム３０ｂに捕捉され、濃縮される。トラップカラム３０ｂを経た第一の移動相と希釈液６ａと搬送液６ｂは、流路Ｌ１６を通り、切替えバルブ２８ａ、流路Ｌ２３を経てドレインから排出される。
切替えバルブ１０が操作され、流路Ｌ１と流路Ｌ３とが接続されるとともに、流路Ｌ４と流路Ｌ６とが接続される。送液ポンプ２ａおよび２ｂにより希釈液６ａおよび搬送液６ｂが送液され、搬送液６ｂは、流路Ｌ６、Ｌ４およびＬ８を通り、切替えバルブ１２、流路Ｌ１２、さらに切替えバルブ２２を経て、流路Ｌ１０へ導かれる。分配バルブ２６ａおよび２６ｂが操作され、分画された成分が保持された分取部のうちの一つが選択され、搬送液６ｂが、分配バルブ２６ｂから選択された分取部を通り、前記分取部に保持されていた成分と第一の移動相とともに、分配バルブ２６ａ、流路Ｌ９、切替えバルブ２２、流路Ｌ１１、流路Ｌ１３、切替えバルブ２８ｂ、流路Ｌ１７を通り、トラップカラム３０ｂへ導かれる。一方、希釈液６ａは、流路Ｌ３、Ｌ１およびＬ７を通り、切替えバルブ１２を経て、流路Ｌ１１を通り、前記選択された分取部に保持されていた成分、第一の移動相および搬送液６ｂの流れと合流し、トラップカラム３０ｂへ導かれる。トラップカラム３０ｂに導かれた成分は、トラップカラム３０ｂに捕捉され、濃縮される。トラップカラム３０ｂを経た第一の移動相と希釈液６ａと搬送液６ｂは、流路Ｌ１６を通り、切替えバルブ２８ａ、流路Ｌ２３を経てドレインから排出される。
＜トラップカラムに捕捉・濃縮されていた成分の溶出・取り出し工程＞
一方で、第二の移動相を構成する有機溶媒３８ａおよび水３８ｂが、オンラインデガッサ３９を経て、気泡が除去された状態で、それぞれ送液ポンプ３６ａおよび３６ｂにより送液され、ミキサ４０で混合され、第二の移動相となって、切替えバルブ２８ａを経て、流路Ｌ１４を通り、トラップカラム３０ａに導かれる。トラップカラム３０ａにすでに捕捉され濃縮された成分は、第二の移動相により溶出し、溶出した成分は第二の移動相とともに、流路Ｌ１５を通り、切替えバルブ２８ｂを経て、第二の分析カラム３２へ導かれ、第二の分析カラム３２で分離される。分離された成分は、第二の検出器であるＰＤＡ検出器３３で検出され、吸収スペクトルが取得される。取得された吸収スペクトルは、記憶手段（図示しない）に記憶される。ＰＤＡ検出器を用いることにより、各成分について、紫外領域から可視領域の任意の波長における吸収スペクトルを取得することが可能となり、前記ＰＤＡ検出器２０で検出され、得られた吸収スペクトルとＰＤＡ検出器３３で検出され、得られた吸収スペクトルを比較することにより、第一の分析カラムで分離し、トラップカラムに濃縮した成分と第二の分析カラムで分離した成分とが同一であるか否かが確実に、且つ、容易に判断できる。また、ＰＤＡ検出器に代えて、ＩＲ検出器、ＲＩ検出器または蛍光検出器を用いることによっても、特徴的な赤外吸収を検出したり、放射性同位体を含んでいたり、蛍光を持つ化合物でラベル化されていたりする化合物を確実に、且つ、容易に検出でき、スペクトルを比較することができるため、第一の分析カラムで分離し、トラップカラムに濃縮した成分と第二の分析カラムで分離した成分とが同一であるか否かが確実に、且つ、容易に判断できる。
一方で、第二の移動相を構成する有機溶媒３８ａおよび水３８ｂが、オンラインデガッサ３９を経て、気泡が除去された状態で、それぞれ送液ポンプ３６ａおよび３６ｂにより送液され、ミキサ４０で混合され、第二の移動相となって、切替えバルブ２８ａを経て、流路Ｌ１４を通り、トラップカラム３０ａに導かれる。トラップカラム３０ａにすでに捕捉され濃縮された成分は、第二の移動相により溶出し、溶出した成分は第二の移動相とともに、流路Ｌ１５を通り、切替えバルブ２８ｂを経て、第二の分析カラム３２へ導かれ、第二の分析カラム３２で分離される。分離された成分は、第二の検出器であるＰＤＡ検出器３３で検出され、吸収スペクトルが取得される。取得された吸収スペクトルは、記憶手段（図示しない）に記憶される。ＰＤＡ検出器を用いることにより、各成分について、紫外領域から可視領域の任意の波長における吸収スペクトルを取得することが可能となり、前記ＰＤＡ検出器２０で検出され、得られた吸収スペクトルとＰＤＡ検出器３３で検出され、得られた吸収スペクトルを比較することにより、第一の分析カラムで分離し、トラップカラムに濃縮した成分と第二の分析カラムで分離した成分とが同一であるか否かが確実に、且つ、容易に判断できる。また、ＰＤＡ検出器に代えて、ＩＲ検出器、ＲＩ検出器または蛍光検出器を用いることによっても、特徴的な赤外吸収を検出したり、放射性同位体を含んでいたり、蛍光を持つ化合物でラベル化されていたりする化合物を確実に、且つ、容易に検出でき、スペクトルを比較することができるため、第一の分析カラムで分離し、トラップカラムに濃縮した成分と第二の分析カラムで分離した成分とが同一であるか否かが確実に、且つ、容易に判断できる。
次に、成分の別のトラップカラムへの捕捉・濃縮工程とトラップカラムに捕捉・濃縮されていた成分の溶出・第二の分析カラムでの分析工程が同時に行われている状態について、図６に基づいて説明する。
図５に示す上記したトラップカラム３０ａからの成分の溶出工程とトラップカラム３０ｂへの成分の捕捉・濃縮工程とが終了すると、図６に示すように、分配バルブ２６ａおよび２６ｂが切替えられ、別の分画された成分が保持されている分取部２５ｄが選択される。さらに、切替えバルブ２８ａおよび２８ｂが切替えられ、分取部２５ｄに保持された成分が、第一の移動相、希釈液６ａおよび搬送液６ｂとともに切替えバルブ２８ｂを経て、流路Ｌ１５を通り、トラップカラム３０ａに導かれ、トラップカラム３０ａに成分が捕捉され、濃縮される。一方で、トラップカラム３０ｂに捕捉され、濃縮されていた成分は、切替えバルブ２８ａを経て、流路Ｌ１６を通った第二の移動相により溶出し、溶出した成分は第二の移動相とともに、流路Ｌ１７を通り、切替えバルブ２８ｂを経て、第二の分析カラム３２へ導かれ、第二の分析カラム３２で分離される。分離された成分は、第二の検出器であるＰＤＡ検出器３３で検出され、吸収スペクトルが取得される。取得された吸収スペクトルは、記憶手段（図示しない）に記憶される。ＰＤＡ検出器を用いることにより、各成分について、紫外領域から可視領域の任意の波長における吸収スペクトルを取得することが可能となり、前記ＰＤＡ検出器２０で検出され、得られた吸収スペクトルとＰＤＡ検出器３３で検出され、得られた吸収スペクトルを比較することにより、第一の分析カラムで分離し、トラップカラムに濃縮した成分と第二の分析カラムで分離した成分とが同一であるか否かが確実に、且つ、容易に判断できる。
このように、図４〜図６に示した液体クロマトグラフィー装置では、第一の分析カラムで分離し、トラップカラムに濃縮した成分と第二の分析カラムで分離した成分とが同一であるか否かが確実に、且つ、容易に判断できるだけでなく、トラップカラムを複数有し、トラップ用流路の一つのトラップカラムに成分を捕捉させて濃縮せしめる捕捉・濃縮動作と、他のトラップカラムから捕捉された成分を溶出させる溶出動作を同時に行うための流路切替え機構を備えていることから、トラップカラムにおける成分の捕捉・濃縮動作と別のトラップカラムに捕捉・濃縮されていた成分の溶出動作を同時に、また連続的に行うことができるため、処理効率も向上する。
また、第二の分析カラムで分析された成分は、オートサンプラ１６から注入された試料と比較すると、濃縮された状態になっているため、試料中に含まれる成分の量がわずかであっても、第二の分析カラムで分析された成分を、例えば質量分析、ＮＭＲ等で分析することにより、高感度のデータを取得することができ、測定効率も向上する。しかも、不揮発性塩等の緩衝剤を含む第一の移動相を用いた場合には、不揮発性塩等の緩衝剤を含まない希釈液や搬送液を用いることにより、脱塩処理も同時に行うことができるため、不揮発性塩等の緩衝剤の影響を受けやすい質量分析等に適した前記緩衝剤を実質的に含まない分析サンプルを調製することもできる。そのため、質量分析装置や核磁気共鳴装置をＰＤＡ検出器３３の後方に接続し、オンライン分析を行うこともできる。
続いて、本発明のさらに別の実施態様である液体クロマトグラフィー装置について、図７〜図９に基づいて説明する。図７〜図９に示した液体クロマトグラフィー装置は、図４〜図６に示した液体クロマトグラフィー装置と同様に、トラップカラムが２つ並列に設けられるとともに、流路切替え機構が設けられており、さらに、第一の検出手段として、二種の検出器、ＵＶ検出器２０ａとＩＲ検出器２０ｂとが、第二の検出手段として、二種の検出器、ＵＶ検出器３３ａとＩＲ検出器３３ｂとが、それぞれ設けられた液体クロマトグラフィー装置である。このように第一および第二の検出手段として、少なくとも二種の検出器からなり、その一種がＵＶ検出器で、もう一種がＰＤＡ検出器、ＩＲ検出器、ＲＩ検出器または蛍光検出器である液体クロマトグラフィー装置では、二種の検出器で成分の同定を行うため、より多くの情報を得ることができ、より確実に成分の同定を行うことができる。
図７は、試料中の成分の分離工程および分離された成分の分画工程が行われている状態を示しており、かかる工程で使用される流路が太線で、液の流れが矢印で表わされている。図８および図９は、成分のトラップカラムへの捕捉・濃縮工程とトラップカラムに捕捉・濃縮されていた成分の溶出・第二の分析カラムでの分析工程が同時に行われている状態を示しており、かかる工程で使用される流路が太線で、液の流れが矢印で表わされている。図７に示した試料中の成分の分離工程および分離された成分の分画工程が行われている状態については、前記図１や図４に示した状態について説明したと同様の動作が行われ、各成分について、ＵＶスペクトルとＩＲスペクトルが取得できる。図８および図９に示した成分のトラップカラムへの捕捉・濃縮工程とトラップカラムに捕捉・濃縮されていた成分の溶出・第二の分析カラムでの分析工程が同時に行われている状態については、前記図２〜図３および図５〜図６に示した状態について説明したと同様の動作が行われ、捕捉・濃縮された成分について、ＵＶスペクトルとＩＲスペクトルが取得され、第一の検出手段で取得されたＵＶスペクトルおよびＩＲスペクトルと第二の検出手段で取得されたＵＶスペクトルおよびＩＲスペクトルとが比較され、成分の同定が行われる。
なお、図４〜図９に示した実施態様では、トラップカラムが２つ並列に設けられているが、複数のトラップカラムを２組並列に設けることもできる。これにより、トラップ用流路の一つのトラップカラムに成分を捕捉させて濃縮せしめる捕捉・濃縮動作と、他のトラップカラムから捕捉された成分を溶出させる溶出動作を同時に行うことができる。
また、図１〜図９に示した実施態様では、切替えバルブ１０を設けて、送液ポンプ２ａおよび２ｂにより、第一の移動相を構成する有機溶媒４ａおよび水４ｂと、希釈液６ａおよび搬送液６ｂとを、切替えて送液し、同じ流路を通り、分画用流路２４へ送液されるようになっているが、希釈液６ａおよび搬送液６ｂを送液する送液ポンプを別途設けるとともに、希釈液６ａおよび搬送液６ｂが、第一の移動相を構成する有機溶媒４ａおよび水４ｂが流れる流路とは異なる流路を通るようにして、分画用流路２４へ送液するようにすることにより、試料中の成分の分離および分離された成分の分画工程と成分の溶出・取り出し工程もしくは成分の第二の分析カラムでの分析工程と、成分のトラップカラムへの捕捉・濃縮および濃縮された成分の溶出・取り出しもしくは第二の分析カラムでの分析工程とを同時に行うようにすることもできる。
２ａ，２ｂ，３６ａ，３６ｂ 送液ポンプ
４ａ 第一の移動相を構成する有機溶媒
４ｂ 第一の移動相を構成する水
６ａ 希釈液
６ｂ 搬送液
８，３９ オンラインデガッサ
１０，１２，２２，２８ａ，２８ｂ 切替えバルブ
１４，４０ ミキサ
１６ オートサンプラ
１８ 第一の分析カラム
２０ ＰＤＡ検出器
２０ａ ＵＶ検出器
２０ｂ ＩＲ検出器
２４ 分画用流路
２５ａ〜２５ｅ 分取部
２６ａ，２６ｂ 分配バルブ
３０，３０ａ，３０ｂ トラップカラム
３２ 第二の分析カラム
３３ ＰＤＡ検出器
３３ａ ＵＶ検出器
３３ｂ ＩＲ検出器
３８ａ 第二の移動相を構成する有機溶媒
３８ｂ 第二の移動相を構成する水
４１ カラムオーブン
Ｌ１〜Ｌ１７，Ｌ２２〜Ｌ２３ 流路
４ａ 第一の移動相を構成する有機溶媒
４ｂ 第一の移動相を構成する水
６ａ 希釈液
６ｂ 搬送液
８，３９ オンラインデガッサ
１０，１２，２２，２８ａ，２８ｂ 切替えバルブ
１４，４０ ミキサ
１６ オートサンプラ
１８ 第一の分析カラム
２０ ＰＤＡ検出器
２０ａ ＵＶ検出器
２０ｂ ＩＲ検出器
２４ 分画用流路
２５ａ〜２５ｅ 分取部
２６ａ，２６ｂ 分配バルブ
３０，３０ａ，３０ｂ トラップカラム
３２ 第二の分析カラム
３３ ＰＤＡ検出器
３３ａ ＵＶ検出器
３３ｂ ＩＲ検出器
３８ａ 第二の移動相を構成する有機溶媒
３８ｂ 第二の移動相を構成する水
４１ カラムオーブン
Ｌ１〜Ｌ１７，Ｌ２２〜Ｌ２３ 流路
Claims (5)
- 第一の移動相により導かれた試料中の成分を分離する第一の分析カラムと、
前記成分を検出する第一の検出手段と、
前記第一の検出手段で検出された成分を分画して分取部に保持する分画用流路と、
前記分取部に保持された成分をトラップカラムに送り出して前記成分をトラップカラムに捕捉させて濃縮せしめるトラップ用流路と、
第二の移動相により前記トラップカラムから溶出させられた前記トラップカラムに捕捉・濃縮された成分を分離する第二の分析カラムと、
前記第二の分析カラムで分離された成分を検出する第二の検出手段とを備えた液体クロマトグラフィー装置において、
第一および第二の検出手段が、フォトダイオードアレイ検出器、赤外検出器、放射性同位体検出器または蛍光検出器であることを特徴とする液体クロマトグラフィー装置。 - トラップカラムが複数設けられ、前記トラップ用流路の一つのトラップカラムに成分を捕捉させて濃縮せしめる捕捉・濃縮動作と、他のトラップカラムから捕捉された成分を溶出させる溶出動作を同時に行うための流路切替え機構とを備えてなる請求項１に記載の液体クロマトグラフィー装置。
- 第一および第二の検出手段が、少なくとも二種の検出器からなり、そのうちの一種が、フォトダイオードアレイ検出器、赤外光検出器、放射性同位体検出器または蛍光検出器であり、もう一種が、紫外光検出器である請求項１または２に記載の液体クロマトグラフィー装置。
- 分取部に保持された成分を、希釈液により希釈しながらトラップカラムに送り出す請求項１または２に記載の液体クロマトグラフィー装置。
- 第一の分析カラムで分離された成分を分画し、希釈液とともに分取部に保持する請求項１または２に記載の液体クロマトグラフィー装置。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004310673A JP2006125856A (ja) | 2004-10-26 | 2004-10-26 | 液体クロマトグラフィー装置 |
| DE112005002632T DE112005002632T5 (de) | 2004-10-26 | 2005-10-20 | Flüssigchromatograph |
| US11/718,073 US20080044309A1 (en) | 2004-10-26 | 2005-10-20 | Liquid Chromatograph |
| PCT/JP2005/019325 WO2006046468A1 (ja) | 2004-10-26 | 2005-10-20 | 液体クロマトグラフィー装置 |
| GB0708434A GB2433901B (en) | 2004-10-26 | 2007-05-01 | Liquid chromatography apparatus comprising dual columns, dual detectors, and a component trap |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004310673A JP2006125856A (ja) | 2004-10-26 | 2004-10-26 | 液体クロマトグラフィー装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2006125856A true JP2006125856A (ja) | 2006-05-18 |
Family
ID=36227708
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004310673A Pending JP2006125856A (ja) | 2004-10-26 | 2004-10-26 | 液体クロマトグラフィー装置 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20080044309A1 (ja) |
| JP (1) | JP2006125856A (ja) |
| DE (1) | DE112005002632T5 (ja) |
| GB (1) | GB2433901B (ja) |
| WO (1) | WO2006046468A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20140072162A (ko) * | 2011-10-04 | 2014-06-12 | 메르크 파텐트 게엠베하 | 크로마토그래픽 정제 방법 및 장치 |
| JP2019502129A (ja) * | 2016-01-15 | 2019-01-24 | コリア ユニバーシティ リサーチ アンド ビジネス ファウンデーションＫｏｒｅａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ | 非連続的試料分画統合デバイス及びこれを備えた二重オンライン多次元液体クロマトグラフィーシステム |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102014226481B3 (de) * | 2014-12-18 | 2016-06-02 | Siemens Aktiengesellschaft | Gaschromatograph |
| DE102016121515A1 (de) * | 2016-11-10 | 2018-05-17 | Dionex Softron Gmbh | Verfahren zum Einführen einer Probe in eine Trennsäule und entsprechendes System |
| DE102016121519B4 (de) * | 2016-11-10 | 2019-07-11 | Dionex Softron Gmbh | System und Verfahren zum Verbinden von Komponenten, insbesondere in der HPLC |
| JP6790963B2 (ja) * | 2017-03-30 | 2020-11-25 | 株式会社島津製作所 | 液体クロマトグラフ |
| US10041914B1 (en) * | 2017-06-02 | 2018-08-07 | Shimadzu Corporation | Degassing device |
| US20210405001A1 (en) * | 2017-08-17 | 2021-12-30 | Daylight Solutions, Inc. | Liquid analyzer system with on-line analysis of samples |
| US11119079B2 (en) * | 2017-08-17 | 2021-09-14 | Daylight Solutions, Inc. | Liquid chromatography analyzer system with on-line analysis of eluting fractions |
| CN111051875B (zh) * | 2017-09-14 | 2022-06-28 | 株式会社岛津制作所 | 液相色谱仪 |
| CN108037233B (zh) * | 2017-12-28 | 2024-05-03 | 大连博迈科技发展有限公司 | 基于同一检测器的全在线检测的多维液相色谱分离系统 |
| JPWO2020105661A1 (ja) * | 2018-11-20 | 2021-09-30 | 株式会社日立ハイテク | 複数のクロマトグラフを有する分析装置及びその制御方法 |
| EP3969177A4 (en) * | 2019-05-17 | 2022-12-14 | Illumina Inc | LINEAR PERISTALTIC PUMPS FOR USE WITH FLUID CARTRIDGES |
| DE102019123373A1 (de) * | 2019-08-30 | 2021-03-04 | Dionex Softron Gmbh | Verfahren und System für zweidimensionale Chromatografie |
Citations (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57139647A (en) * | 1981-02-23 | 1982-08-28 | Shimadzu Corp | Chromatograph detecting device |
| JPS58216953A (ja) * | 1982-06-10 | 1983-12-16 | Shimadzu Corp | 糖類の分析法及びその装置 |
| JPS593242A (ja) * | 1982-06-29 | 1984-01-09 | Shimadzu Corp | クロマトグラフ−フ−リエ変換型分光光度計 |
| JPS5954961A (ja) * | 1982-09-22 | 1984-03-29 | Hitachi Ltd | 陰イオンモニタ装置 |
| JPS60200166A (ja) * | 1984-03-26 | 1985-10-09 | Hitachi Ltd | 液体クロマトグラムの同定方法 |
| JPS6130861U (ja) * | 1984-07-28 | 1986-02-24 | 三菱重工業株式会社 | イオンクロマトグラフサンプリング装置 |
| JPS61161452A (ja) * | 1985-01-11 | 1986-07-22 | Hitachi Ltd | 液体クロマトグラフ |
| JPS61294363A (ja) * | 1985-06-21 | 1986-12-25 | Fuji Photo Film Co Ltd | ラジオクロマトグラフ解析方法およびラジオクロマトグラフ解析装置 |
| JPH01244342A (ja) * | 1988-03-26 | 1989-09-28 | Shimadzu Corp | 液体クロマトグラフ |
| JPH01263538A (ja) * | 1988-04-14 | 1989-10-20 | Japan Spectroscopic Co | 液体クロマトグラフ専用蛍光分光検出器 |
| JPH03175355A (ja) * | 1989-09-12 | 1991-07-30 | Eisai Co Ltd | 高速液体クロマトグラフィー質量分析における移動相の変換方法と装置 |
| JPH04110750A (ja) * | 1990-08-31 | 1992-04-13 | Shimadzu Corp | 赤外分光光度計用液体フローセル |
| JPH04221759A (ja) * | 1990-12-21 | 1992-08-12 | Shimadzu Corp | 高速液体クロマトグラフ |
| JPH0735738A (ja) * | 1993-07-19 | 1995-02-07 | Hamamatsu Photonics Kk | ラジオクロマトグラフィ用検出器 |
| JP2004205358A (ja) * | 2002-12-25 | 2004-07-22 | Shimadzu Corp | 液体クロマトグラフ |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1001263B1 (en) * | 1998-05-26 | 2010-05-05 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Hplc apparatus for fractioning and preparing sample for nmr spectrometry and method of changing mobile phase |
| EP1333382A1 (de) * | 2002-01-30 | 2003-08-06 | Agilent Technologies, Inc. (a Delaware corporation) | Verfahren zur Bearbeitung von Messdaten und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens |
| US6802967B2 (en) * | 2002-03-06 | 2004-10-12 | Shimadzu Corporation | Multi-dimension liquid chromatography separation system |
| JP3816883B2 (ja) * | 2003-03-06 | 2006-08-30 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 液体クロマトグラフ質量分析装置 |
-
2004
- 2004-10-26 JP JP2004310673A patent/JP2006125856A/ja active Pending
-
2005
- 2005-10-20 DE DE112005002632T patent/DE112005002632T5/de not_active Withdrawn
- 2005-10-20 US US11/718,073 patent/US20080044309A1/en not_active Abandoned
- 2005-10-20 WO PCT/JP2005/019325 patent/WO2006046468A1/ja active Application Filing
-
2007
- 2007-05-01 GB GB0708434A patent/GB2433901B/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57139647A (en) * | 1981-02-23 | 1982-08-28 | Shimadzu Corp | Chromatograph detecting device |
| JPS58216953A (ja) * | 1982-06-10 | 1983-12-16 | Shimadzu Corp | 糖類の分析法及びその装置 |
| JPS593242A (ja) * | 1982-06-29 | 1984-01-09 | Shimadzu Corp | クロマトグラフ−フ−リエ変換型分光光度計 |
| JPS5954961A (ja) * | 1982-09-22 | 1984-03-29 | Hitachi Ltd | 陰イオンモニタ装置 |
| JPS60200166A (ja) * | 1984-03-26 | 1985-10-09 | Hitachi Ltd | 液体クロマトグラムの同定方法 |
| JPS6130861U (ja) * | 1984-07-28 | 1986-02-24 | 三菱重工業株式会社 | イオンクロマトグラフサンプリング装置 |
| JPS61161452A (ja) * | 1985-01-11 | 1986-07-22 | Hitachi Ltd | 液体クロマトグラフ |
| JPS61294363A (ja) * | 1985-06-21 | 1986-12-25 | Fuji Photo Film Co Ltd | ラジオクロマトグラフ解析方法およびラジオクロマトグラフ解析装置 |
| JPH01244342A (ja) * | 1988-03-26 | 1989-09-28 | Shimadzu Corp | 液体クロマトグラフ |
| JPH01263538A (ja) * | 1988-04-14 | 1989-10-20 | Japan Spectroscopic Co | 液体クロマトグラフ専用蛍光分光検出器 |
| JPH03175355A (ja) * | 1989-09-12 | 1991-07-30 | Eisai Co Ltd | 高速液体クロマトグラフィー質量分析における移動相の変換方法と装置 |
| JPH04110750A (ja) * | 1990-08-31 | 1992-04-13 | Shimadzu Corp | 赤外分光光度計用液体フローセル |
| JPH04221759A (ja) * | 1990-12-21 | 1992-08-12 | Shimadzu Corp | 高速液体クロマトグラフ |
| JPH0735738A (ja) * | 1993-07-19 | 1995-02-07 | Hamamatsu Photonics Kk | ラジオクロマトグラフィ用検出器 |
| JP2004205358A (ja) * | 2002-12-25 | 2004-07-22 | Shimadzu Corp | 液体クロマトグラフ |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20140072162A (ko) * | 2011-10-04 | 2014-06-12 | 메르크 파텐트 게엠베하 | 크로마토그래픽 정제 방법 및 장치 |
| KR101974676B1 (ko) | 2011-10-04 | 2019-05-02 | 메르크 파텐트 게엠베하 | 크로마토그래픽 정제 방법 및 장치 |
| JP2019502129A (ja) * | 2016-01-15 | 2019-01-24 | コリア ユニバーシティ リサーチ アンド ビジネス ファウンデーションＫｏｒｅａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ | 非連続的試料分画統合デバイス及びこれを備えた二重オンライン多次元液体クロマトグラフィーシステム |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20080044309A1 (en) | 2008-02-21 |
| DE112005002632T5 (de) | 2008-07-17 |
| GB2433901A (en) | 2007-07-11 |
| WO2006046468A1 (ja) | 2006-05-04 |
| GB0708434D0 (en) | 2007-06-06 |
| GB2433901B (en) | 2010-01-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2006046468A1 (ja) | 液体クロマトグラフィー装置 | |
| US8305581B2 (en) | Methods and apparatus for analyzing samples and collecting sample fractions | |
| US8621915B2 (en) | Apparatus and methods for multidimensional analysis | |
| JP5833925B2 (ja) | 並行スクリーニングの超臨界流体クロマトグラフィ | |
| JP3719407B2 (ja) | 分取液体クロマトグラフ | |
| US11331596B2 (en) | Multi-dimensional chromatographic system for analyzing multiple sample components | |
| US8314934B2 (en) | Methods and apparatus for analyzing samples and collecting sample fractions | |
| US7682506B2 (en) | IC system including sample pretreatment and using a single pump | |
| EP1455185A1 (en) | Liquid chromatograph mass spectrometer | |
| US20170010243A1 (en) | Multiple column chromatographic system and methods of use | |
| KR20210141308A (ko) | 액체크로마토그래피에 의한 분석 물질의 검출 감도 향상을 위한 온라인 시스템 및 이를 이용한 분석 방법 | |
| EP1666878A1 (en) | Liquid chromatographic apparatus | |
| US20210387192A1 (en) | Purity detection of separated sample portion as basis for a positive or negative decision concerning further separation | |
| JP2005099015A (ja) | 液体クロマトグラフィー装置 | |
| JP2006275873A (ja) | 液体クロマトグラフィー装置 | |
| JP4258409B2 (ja) | オンライン型複合分析装置 | |
| JP2002107349A (ja) | ガスクロマトグラフ装置、及び二酸化炭素中芳香族炭化水素の分析方法 | |
| JP2003066020A (ja) | 分析システム | |
| Sandra et al. | Hyphenated Systems in which Supercritical Fluids Play a Key Role | |
| AU2013203558A1 (en) | Methods and apparatus for analyzing samples and collecting sample fractions | |
| JPS62195554A (ja) | ガスクロマトグラフ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070516 |
|
| RD05 | Notification of revocation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7425 Effective date: 20080131 |
|
| RD05 | Notification of revocation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7425 Effective date: 20080514 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100518 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100720 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20101221 |