JP2019502129A - 非連続的試料分画統合デバイス及びこれを備えた二重オンライン多次元液体クロマトグラフィーシステム - Google Patents

非連続的試料分画統合デバイス及びこれを備えた二重オンライン多次元液体クロマトグラフィーシステム Download PDF

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Abstract

【解決手段】非連続的試料分画統合ユニット及びこれを備えた二重オンライン多機能液体クロマトグラフィー装置が開示される。本発明の一実施例による非連続的試料分画統合ユニットは、分析対象となる試料を供給する試料供給モジュール；及び試料供給モジュールに連結され、試料を連続的に受け、試料供給モジュールから試料を受ける総試料供給時間を複数に均等分割した単位試料供給時間を設定し、複数の単位試料供給時間のそれぞれを複数に均等分割した単位分画区間を設定した後、それぞれの単位試料供給時間内の対応する単位分画区間の間に受けた試料を統合的に貯蔵して複数の分画試料を獲得する試料分画モジュールを含む。【選択図】 図３

Description

本発明は、非連続的試料分画統合デバイス及びこれを備えた二重オンライン多機能液体クロマトグラフィーシステムに関し、より詳しくは、試料の複雑性を低減するとともに分画試料の均一性を高める非連続的試料分画統合デバイス及びこれを備えた二重オンライン多機能液体クロマトグラフィーシステムに関する。
生体内で特定条件の下で発現した全てのタンパク質を総体的に研究する学問であるプロテオミクス（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）において、液体クロマトグラフィーシステムと質量分析技術を組み合わせた方法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）が非常に重要な技術として台頭している。
このうちでもタンパク質を小さな単位体であるペプチドに加水分解して分析するボトムアッププロテオミクス（ｂｏｔｔｏｍ−ｕｐ ｏｒ ｓｈｏｔｇｕｎ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）方式が広く使われている。
ボトムアッププロテオミクス方法はその有用さが証明されたが、不可避的に試料の複雑性を引き起こす。例えば、およそ２万個の誘電体から発現されたタンパク質をペプチドに加水分解したとき、数千万種以上のペプチドが得られる。また、生体内タンパク質は広い範囲の濃度ダイナミックレンジ（１０１０）を有する。したがって、このような試料の複雑性を解決し、効果的なタンパク体分析を行うためには高分解能を有する分離方法を必要とする。
このような問題点を解決するための技術として、二次元液体クロマトグラフィー技術がある。これは互いに異なる二つの分離方法を統合して使用するものである。
二次元液体クロマトグラフィーの成否を決定する二つの要素がある。一つ目は各分離方法の分離効率であり、二つ目は分離直交性（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｉｔｙ）である。
分離直交性とは、各分離方法によって試料混合物を互いに異なる方式によって、すなわち互いに異なる物理化学的特性によって分離されなければならないというものである。
近年多く開発されて使われる二次元分離方法の一つは、試料を塩基性のｐＨ条件の下で疎水性の程度によって分画した後、分離された分画試料を酸性のｐＨ条件の下で疎水性の程度によって再度分離するものである（二次元逆相液体クロマトグラフィー−逆相液体クロマトグラフィー、２Ｄ ＲＰ−ＲＰＬＣ）。
基本的に疎水性によって二度分離をすることは分離直交性を有すると言えないが、互いに異なるｐＨ条件でペプチドは固有のアミノ酸配列によって互いに異なる電荷分布を有することになるので、同じペプチドであっても互いに異なる程度の疎水性を有することになる。これにより、２Ｄ ＲＰ−ＲＰＬＣ方法が分離直交性を有することになる。
しかし、２Ｄ ＲＰ−ＲＰＬＣ方法が完全な分離直交性を有することはできない。図１はｐＨ１０でＲＰＬＣ分離を行った後、各分画試料に対してさらにｐＨ２．６でＲＰＬＣ分離を行い、質量分析装置で分析した後、同定されたペプチドの分布を各分離方法の溶出時間での分布を示したものである。図１を見ると、ペプチドが現れていない部分が多く見える。これは２Ｄ ＲＰ−ＲＰＬＣ方法が二次元分離の分離空間を全て使うことができなかったことを意味する。
このような問題点を解決するために開発された方法が分画後非連続的統合技術である。図２ａを参照して、分画後非連続的統合技術は、塩基性のｐＨ条件の下でＲＰＬＣ分離を行うとき、溶出された順によって９６個（１番〜９６番）に分けた後、さらに２４個の分画試料に統合する。この時、連続的に統合するものではなく１番から２４番までを２４個の分画試料として作った後、さらに２５番を１番目の分画試料に統合して２６番を２番目の分画試料に統合する。このようにしたとき、１番目の分画試料には１、２５、４９、７３番が、２番目の分画試料には２、２６、５０、７４番が、最後の２４番目の分画試料には２４、４８、７２、９６番が統合される。このような方式で非連続的な統合を行ったとき、図２ｂに示すように、二次元分離の全分離空間を使うことができるようになる。
このような分画後非連続的統合技術によって２Ｄ ＲＰ−ＲＰＬＣ技術の分離空間を全て活用して分離直交性を確保することになる。
しかし、このような統合過程を研究者が直接遂行しなければならないため、人力と時間が多く必要となる。また、オフライン方式で得られた分画試料を酸性のｐＨ条件の下でＬＣ−ＭＳ／ＭＳ実験を行うためには、分画試料の体積を減らし、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ実験が可能な溶媒にさらに溶かすなどの多くの処理段階を必要とし、この過程で試料の損失が発生することがあり、実験の再現性にも影響を与えることがある。よって、このような過程が試料注入後に全て自動で行われる液体クロマトグラフィーシステムに対する開発が必要とされる。
Ｍ Ｇｉｌａｒ ｅｔ ａｌ、 Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ、２００５、７７、６４２６−６４３４ Ｊ． Ｍ． Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ、Ｓｃｉ． Ｒｅｐ． ５、１８１８９；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１８１８９（２０１５）
したがって、本発明が解決しようとする技術的課題は、試料の複雑性を低減するとともに分画試料の均一性を高める非連続的試料分画統合過程を自動化することで、分画再現性を向上させ、試料の損失を防止することができる非連続的試料分画統合デバイス及びこれを備えた二重オンライン多機能液体クロマトグラフィーシステムを提供することである。
本発明の一側面によれば、分析対象となる試料を供給する試料供給モジュール；及び前記試料供給モジュールに連結されて前記試料を連続的に受け、前記試料供給モジュールから前記試料を受ける総試料供給時間を複数に均等分割した単位試料供給時間を設定し、複数の単位試料供給時間のそれぞれを複数に均等分割した単位分画区間を設定した後、それぞれの単位試料供給時間内の対応する単位分画区間の間に受けた前記試料を統合的に貯蔵して複数の分画試料を獲得する試料分画モジュールを含む非連続的試料分画統合デバイスが提供されることができる。
前記試料分画モジュールは、前記試料供給モジュールに連結され、前記試料が流入する第１分画バルブ；前記第１分画バルブと隣り合って設けられる第２分画バルブ；及び一端が前記第１分画バルブに連結され、他端が前記第２分画バルブに連結されるとともに前記単位試料供給時間内の複数の単位分画区間の数に対応して複数が設けられ、それぞれの前記単位試料供給時間内の対応する前記単位分画区間の間に受けた前記試料を順次統合的に貯蔵する分画試料貯蔵ループを含むことができる。
前記第１分画バルブは、前記試料供給モジュールから前記試料が流入する分画試料流入ポート；前記分画試料流入ポートと隣り合って設けられ、前記複数の分画試料貯蔵ループの一端にそれぞれ連結される複数の第１分画試料貯蔵ループ連結ポート；及び前記単位分画区間に対応して前記分画試料流入ポートと前記複数の第１分画試料貯蔵ループ連結ポートのいずれか一つを互いに連通するように連結する第１連結バーを含み、前記第２分画バルブは、前記複数の分画試料貯蔵ループの他端がそれぞれ連結される複数の第２分画試料貯蔵ループ連結ポート；前記複数の第２分画試料貯蔵ループ連結ポートと隣り合って設けられ、前記複数の分画試料貯蔵ループのいずれか一つの他端に連結され、前記分画試料が排出される分画試料排出ポート；及び前記単位分画区間に対応して前記分画試料排出ポートと前記複数の第２分画試料貯蔵ループ連結ポートのいずれか一つを互いに連通するように連結する第２連結バーを含むことができる。
前記試料供給モジュールは、第１溶媒を供給する第１ポンプと試料注入器が連結される第１試料供給バルブ；及び前記第１試料供給バルブに連結され、前記第１試料供給バルブから前記試料を受けて前記分画試料流入ポートに供給する第２試料供給バルブを含むことができる。
前記第１試料供給バルブは、前記試料注入器に連結される第１試料流入ポート；前記第１試料流入ポートと隣り合って設けられる第１試料排出ポート；前記第１ポンプに連結される第１溶媒流入ポート；前記第１溶媒流入ポートと隣り合って設けられ、前記第２試料供給バルブに連結される第１溶媒排出ポート；及び試料貯蔵ループの両端がそれぞれ連結される第１試料貯蔵ループ連結ポートと第２試料貯蔵ループ連結ポートを含み、前記第１試料貯蔵ループ連結ポートと前記第２試料貯蔵ループ連結ポートのそれぞれが前記第１試料流入ポートと前記第１試料排出ポートに連結された状態で前記試料が前記試料貯蔵ループに貯蔵され、前記第１試料貯蔵ループ連結ポートと前記第２試料貯蔵ループ連結ポートのそれぞれが前記第１溶媒流入ポートと前記第１溶媒排出ポートに連結された状態で前記試料貯蔵ループに前記第１溶媒を注入して前記試料を前記第２試料供給バルブに供給することができる。
前記第２試料供給バルブは、前記第１溶媒排出ポートに連結される第２試料流入ポート；前記第２試料流入ポートと隣り合って設けられ、前記分画試料流入ポートに連結される第２試料排出ポート；及び前記第２試料流入ポートと前記第２試料排出ポートに両端がそれぞれ連結され、前記第２試料排出ポートに前記試料が溶出される試料分離カラムを含み、前記試料分離カラムから溶出された前記試料は前記分画試料流入ポートに供給されることができる。
本発明のほかの側面によると、分析対象となる試料を連続的に受け、前記試料を受ける総試料供給時間を複数に均等分割した単位試料供給時間を設定し、複数の単位試料供給時間のそれぞれを複数に均等分割した単位分画区間を設定した後、それぞれの単位試料供給時間内の対応する単位分画区間の間に受けた前記試料を統合的に貯蔵して獲得した複数の分画試料を供給する非連続的試料分画統合デバイス；第１逆相液体クロマトグラフィーカラムと第２逆相液体クロマトグラフィーカラムが連結され、前記第１逆相液体クロマトグラフィーカラムと連結される第１固相抽出カラムと前記第２逆相液体クロマトグラフィーカラムと連結される第２固相抽出カラムを備えた二重カラムバルブ；及び前記非連続的試料分画統合デバイスと前記二重カラムバルブの間に設けられ、前記非連続的試料分画統合デバイスから順次供給される前記分画試料を交互に前記第１固相抽出カラムと前記第１逆相液体クロマトグラフィーカラムに又は前記第２固相抽出カラムと前記第２逆相液体クロマトグラフィーカラムに供給するカラム選択モジュールを含む二重オンライン多機能液体クロマトグラフィーシステムが提供されることができる。
前記非連続的試料分画統合デバイスは、前記試料を供給する試料供給モジュール；及び前記試料供給モジュールに連結され、前記試料供給モジュールから前記試料を連続的に受けて複数の分画試料を獲得し、前記カラム選択モジュールに前記複数の分画試料を順次供給する試料分画モジュールを含むことができる。
前記試料分画モジュールは、前記試料供給モジュールに連結され、前記試料が流入する第１分画バルブ；前記第１分画バルブと隣り合って設けられる第２分画バルブ；及び一端が前記第１分画バルブに連結され、他端が前記第２分画バルブに連結されるとともに前記単位試料供給時間内の複数の単位分画区間の数に対応して複数が設けられ、それぞれの前記単位試料供給時間内の対応する前記単位分画区間の間に受けた前記試料を順次統合的に貯蔵する複数の分画試料貯蔵ループを含むことができる。
前記第１分画バルブは、前記試料供給モジュールから前記試料が流入する第１分画試料流入ポート；前記第１分画試料流入ポートと隣り合って設けられ、前記複数の分画試料貯蔵ループの一端がそれぞれ連結される複数の第１分画試料貯蔵ループ連結ポート；及び前記単位分画区間に対応して前記分画試料流入ポートと前記複数の第１分画試料貯蔵ループ連結ポートのいずれか一つを互いに連通するように連結する第１連結バーを含み、前記第２分画バルブは、前記複数の分画試料貯蔵ループの他端がそれぞれ連結される複数の第２分画試料貯蔵ループ連結ポート；前記複数の第２分画試料貯蔵ループ連結ポートと隣り合って設けられ、前記複数の分画試料貯蔵ループのいずれか一つの他端が連結され、前記分画試料が排出される第１分画試料排出ポート；及び前記単位分画区間に対応して前記第１分画試料排出ポートと前記複数の第２分画試料貯蔵ループ連結ポートのいずれか一つを互いに連通するように連結する第２連結バーを含むことができる。
前記試料供給モジュールは、試料注入器に連結される第１試料流入ポートと、前記第１試料流入ポートと隣り合って設けられる第１試料排出ポートと、第１ポンプに連結される第１溶媒流入ポートと、前記第１溶媒流入ポートと隣り合って設けられる第１溶媒排出ポートと、試料貯蔵ループの両端がそれぞれ連結される第１試料貯蔵ループ連結ポート及び第２試料貯蔵ループ連結ポートとを備えた第１試料供給バルブ；及び前記第１溶媒排出ポートに連結される第２試料流入ポートと、前記第２試料流入ポートと隣り合って設けられ、前記第１分画試料流入ポートに連結される第２試料排出ポートと、前記第２試料流入ポートと前記第２試料排出ポートに両端がそれぞれ連結され、前記第２試料排出ポートに前記試料が溶出される試料分離カラムとを備えた第２試料供給バルブを含むことができる。
前記カラム選択モジュールは、前記第１分画試料排出ポートに連結され、前記複数の分画試料を前記第１固相抽出カラム又は前記第２固相抽出カラムに交互に供給する経路を提供し、前記第１固相抽出カラムと前記第１逆相液体クロマトグラフィーカラム又は前記第２固相抽出カラムと前記第２逆相液体クロマトグラフィーカラムを交互に平衡化するカラム平衡化バルブ；及び前記カラム平衡化バルブに連結され、前記複数の分画試料を受けて前記第１固相抽出カラム又は前記第２固相抽出カラムに交互に供給し、前記第１固相抽出カラムから前記第１逆相液体クロマトグラフィーカラムに前記分画試料が溶出されるとか又は前記第２固相抽出カラムから前記第２逆相液体クロマトグラフィーカラムに前記分画試料が溶出されるようにするカラム選択バルブを含むことができる。
前記カラム平衡化バルブは、前記第１分画試料排出ポートと第２溶媒を供給する第２ポンプに連結される第２分画試料流入ポート；第３溶媒を供給する第３ポンプに連結され、前記第３溶媒が流入する第３溶媒流入ポート；前記第２分画試料流入ポートと隣り合って設けられ、前記第２分画試料流入ポートと前記第３溶媒流入ポートに選択的に連結される第２分画試料排出ポート；及び前記第３溶媒流入ポートと隣り合って設けられ、前記第２分画試料流入ポートと前記第３溶媒流入ポートに選択的に連結される第３溶媒排出ポートを含み、前記第２分画試料流入ポートと前記第３溶媒排出ポートが連結された状態で前記第２溶媒が注入された前記分画試料が前記カラム選択バルブを通じて前記第１固相抽出カラム又は前記第２固相抽出カラムに供給され、前記第３溶媒流入ポートと前記第３溶媒排出ポートが連結された状態で前記第３溶媒が前記カラム選択バルブを通じて前記第１固相抽出カラムと前記第１逆相液体クロマトグラフィーカラム又は前記第２固相抽出カラムと前記第２逆相液体クロマトグラフィーカラムを交互に平衡化することができる。
前記カラム選択バルブは、前記第３溶媒排出ポートに連結され、前記分画試料又は前記第３溶媒が流入する分画試料及び第３溶媒流入ポート；第４溶媒を供給する第４ポンプに連結され、前記第４溶媒が流入する第４溶媒流入ポート；前記分画試料及び第３溶媒流入ポートと隣り合って設けられ、前記分画試料及び第３溶媒流入ポートと前記第４溶媒流入ポートに選択的に連結される分画試料及び第３溶媒排出ポート；及び前記第４溶媒流入ポートと隣り合って設けられ、前記分画試料及び第３溶媒流入ポートと前記第４溶媒流入ポートに選択的に連結される第４溶媒排出ポートを含み、前記分画試料及び第３溶媒流入ポートと前記分画試料及び第３溶媒排出ポートが連結されて前記分画試料が前記第１固相抽出カラムに供給された後、前記第４溶媒流入ポートと前記分画試料及び第３溶媒排出ポートが連結された状態で前記第４溶媒が前記分画試料を前記第１固相抽出カラムから前記第１逆相液体クロマトグラフィーカラムに溶出し、前記分画試料及び第３溶媒流入ポートと前記第４溶媒排出ポートが連結された状態で前記第３溶媒が前記第２固相抽出カラムと前記第２逆相液体クロマトグラフィーカラムを平衡化し、前記分画試料及び第３溶媒流入ポートと前記第４溶媒排出ポートが連結されて前記分画試料が前記第２固相抽出カラムに供給された後、前記第４溶媒流入ポートと前記第４溶媒排出ポートが連結された状態で前記第４溶媒が前記分画試料を前記第２固相抽出カラムから前記第２逆相液体クロマトグラフィーカラムに溶出し、前記分画試料及び第３溶媒流入ポートと前記分画試料及び第３溶媒排出トートが連結された状態で前記第３溶媒が前記第１固相抽出カラムと前記第１逆相液体クロマトグラフィーカラムを平衡化することができる。
前記二重カラムバルブは、前記第１固相抽出カラムの両端にそれぞれ連結される第１固相抽出カラム連結ポートと第１固相抽出カラム経路ポート；前記分画試料及び第３溶媒排出ポートと連結されるとともに前記第１固相抽出カラム連結ポートと前記第１固相抽出カラム経路ポートに選択的に連結される第１固相抽出カラム流入ポート；前記第１逆相液体クロマトグラフィーカラムに連結され、前記第１固相抽出カラム連結ポートに連結又は連結解除される第１逆相液体クロマトグラフィーカラムポート；前記第２固相抽出カラムの両端にそれぞれ連結される第２固相抽出カラム連結ポートと第２固相抽出カラム経路ポート；前記第４溶媒排出ポートと連結されるとともに前記第２固相抽出カラム連結ポートと前記第２固相抽出カラム経路ポートに選択的に連結される第２固相抽出カラム流入ポート；及び前記第２逆相液体クロマトグラフィーカラムに連結され、前記第２固相抽出カラム連結ポートに連結又は連結解除される第２逆相液体クロマトグラフィーカラムポートを含むことができる。
前記二重カラムバルブは、前記第１固相抽出カラム経路ポートと隣り合って設けられ、前記第１固相抽出カラム経路ポートに連結又は連結解除される第１排出ポート；及び前記第１排出ポートと隣り合って設けられ、前記第２固相抽出カラム経路ポートに連結又は連結解除される第２排出ポートをさらに含むことができる。
本発明の実施例はそれぞれの単位試料供給時間内の対応する単位分画区間の間に供給された試料を統合的に貯蔵して複数の分画試料が自動で得られる非連続的試料分画統合デバイスを備えることで、試料の複雑性を低めるとともに分画試料の均一性を高め、分画再現性を向上させることができ、さらに試料の損失を防止することができる。
ｐＨ１０でＲＰＬＣ分離を行った後、各分画試料に対してさらにｐＨ２．６でＲＰＬＣ分離を行い、質量分析装置を用いて分析した後、同定したペプチドの分布を示す図である。 試料を分画後に非連続的に統合する技術を説明するための図である。 本発明の一実施例による二重オンライン多機能液体クロマトグラフィーシステムにおいて、第１分画試料の獲得動作を示す図である。 本発明の一実施例による二重オンライン多機能液体クロマトグラフィーシステムにおいて、第２分画試料の獲得動作を示す図である。 本発明の一実施例による二重オンライン多機能液体クロマトグラフィーシステムにおいて、第１０分画試料の獲得動作を示す図である。 本発明の一実施例による二重オンライン多機能液体クロマトグラフィーシステムにおいて、第１分画試料を第１固相抽出カラムに供給する動作を示す図である。 本発明の一実施例による二重オンライン多機能液体クロマトグラフィーシステムにおいて、第１分画試料を第１逆相液体クロマトグラフィーカラムに供給し、第２固相抽出カラムと第２逆相液体クロマトグラフィーカラムを平衡化する動作を示す図である。 本発明の一実施例による二重オンライン多機能液体クロマトグラフィーシステムにおいて、第２分画試料を第２固相抽出カラムに供給する動作を示す図である。 本発明の一実施例による二重オンライン多機能液体クロマトグラフィーシステムにおいて、第２分画試料を第２逆相液体クロマトグラフィーカラムに供給し、第１固相抽出カラムと第１逆相液体クロマトグラフィーカラムを平衡化する動作を示す図である。
本発明と本発明の動作の利点及び本発明の実施によって達成される目的を充分に理解するために、本発明の好適な実施例を例示する添付図面及び添付図面に記載された内容が参照される。
以下、添付図面に基づいて本発明の好適な実施例を説明することによって本発明を詳細に説明する。各図に提示した同じ参照符号は同じ部材を示す。
図３は本発明の一実施例による二重オンライン多機能液体クロマトグラフィーシステムにおいて、第１分画試料の獲得動作を示す図、図４は本発明の一実施例による二重オンライン多機能液体クロマトグラフィーシステムにおいて、第２分画試料の獲得動作を示す図、図５は本発明の一実施例による二重オンライン多機能液体クロマトグラフィーシステムにおいて、第１０分画試料の獲得動作を示す図、図６は本発明の一実施例による二重オンライン多機能液体クロマトグラフィーシステムにおいて、第１分画試料を第１固相抽出カラムに供給する動作を示す図、図７は本発明の一実施例による二重オンライン多機能液体クロマトグラフィーシステムにおいて、第１分画試料を第１逆相液体クロマトグラフィーカラムに供給し、第２固相抽出カラムと第２逆相液体クロマトグラフィーカラムを平衡化する動作を示す図、図８は本発明の一実施例による二重オンライン多機能液体クロマトグラフィーシステムにおいて、第２分画試料を第２固相抽出カラムに供給する動作を示す図、図９は本発明の一実施例による二重オンライン多機能液体クロマトグラフィーシステムにおいて、第２分画試料を第２逆相液体クロマトグラフィーカラムに供給し、第１固相抽出カラムと第１逆相液体クロマトグラフィーカラムを平衡化する動作を示す図である。
図３〜図５を参照して、本発明の一実施例による二重オンライン多機能液体クロマトグラフィーシステム１００は、分析対象となる試料を連続的に受けて複数の分画試料を獲得して供給する非連続的試料分画統合デバイス２００と、第１逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ１と第２逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ２が連結され、第１逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ１と連結される第１固相抽出カラムＳＰＥ１と第２逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ２と連結される第２固相抽出カラムＳＰＥ２を備えた二重カラムバルブ４００と、非連続的試料分画統合デバイス２００と二重カラムバルブ４００の間に設けられ、非連続的試料分画統合デバイス２００から順次供給される複数の分画試料を交互に第１固相抽出カラムＳＰＥ１と第１逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ１又は第２固相抽出カラムＳＰＥ２と第２逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ２に供給するカラム選択モジュール３００とを含む。
図３〜図５を参照して、本実施例による非連続的試料分画統合デバイス２００は試料注入器Ｓから連続的に受けた試料から複数の分画試料を獲得する役目を行う。
以下、本実施例による複数の分画試料について説明する。
まず、試料を受ける総試料供給時間を複数に均等分割した単位試料供給時間を設定する。そして、複数の単位試料供給時間のそれぞれを複数に均等分割した単位分画区間を設定する。そして、複数の分画試料はそれぞれの単位試料供給時間内の対応する単位分画区間の間に受けた試料を統合的に貯蔵して獲得する。
例えば、総試料供給時間が１００分である場合、総試料供給時間を５個に均等分割した単位試料供給時間はそれぞれ２０分間隔である。すなわち、第１単位試料供給時間は０〜２０分であり、第２〜第５単位試料供給時間はそれぞれ２０〜４０分、４０〜６０分、６０〜８０分、８０〜１００分に相当する。
そして、第１〜第５単位試料供給時間は１０個に均等分割した単位分画区間を有することができる。例えば、第１単位試料空間時間の間に第１単位分画区間は０〜２分であり、第２〜第１０単位分画区間はそれぞれ２〜４分、４〜６分、６〜８分、８〜１０分、１０〜１２分、１２〜１４分、１４〜１６分、１６〜１８分、１８〜２０分に相当する。そして、第２単位試料空間時間の間に第１単位分画区間は２０〜２２分であり、第２〜第１０単位分画区間はそれぞれ２２〜２４分、２４〜２６分、２６〜２８分、２８〜３０分、３０〜３２分、３２〜３４分、３４〜３６分、３６〜３８分、３８〜４０分に相当する。
本実施例は第１〜第５単位試料供給時間内の対応する第１〜第１０単位分画区間の間に受けた試料を統合的に貯蔵して複数の分画試料を得るものである。例えば、第１単位試料供給時間〜第５単位試料供給時間内の第１単位分画区間（すなわち、０〜２分、２０〜２２分、４０〜４２分、６０〜６２分、８０〜８２分）に供給される試料を統合的に貯蔵して第１分画試料を得るものである。第２分画試料〜第１０分画試料は第１分画試料を獲得する過程と同様であるので、それについての詳細な説明は省略する。
また、本実施例では総試料供給時間を１００分に設定し、第１〜第５単位試料供給時間に設定し、それぞれの単位試料供給時間を１０個の単位分画区間に設定した。しかし、本発明の権利範囲はこれに限定されるものではなく、総試料供給時間、単位試料供給時間及び単位分画区間は多様な設定が可能である。
本実施例による非連続的試料分画統合デバイス２００は、試料を供給する試料供給モジュール２１０と、試料供給モジュール２１０に連結され、試料供給モジュール２１０から試料を連続的に受けて複数の分画試料を獲得し、カラム選択モジュール３００に複数の分画試料を順次供給する試料分画モジュール２５０とを含む。
本実施例による試料供給モジュール２１０は試料を連続的に試料分画モジュール２５０に供給する役目を行う。
試料供給モジュール２１０は、第１溶媒を供給する第１ポンプＰ１と試料注入器Ｓが連結される第１試料供給バルブ２２０と、第１試料供給バルブ２２０に連結され、第１試料供給バルブ２２０から試料を受けて試料分画モジュール２５０に供給する第２試料供給バルブ２４０とを含む。
第１試料供給バルブ２２０は、試料注入器Ｓから試料を受けて試料貯蔵ループ２２１に貯蔵した後、第１ポンプＰ１から第１溶媒を受け、試料貯蔵ループ２２１に貯蔵された試料を第２試料供給バルブ２４０に供給する役目を行う。
このために、第１試料供給バルブ２２０は、試料注入器Ｓに連結される第１試料流入ポート２２２と、第１試料流入ポート２２２と隣り合って設けられる第１試料排出ポート２２３と、第１ポンプＰ１に連結される第１溶媒流入ポート２２６と、第１溶媒流入ポート２２６と隣り合って設けられ、第２試料供給バルブ２４０に連結される第１溶媒排出ポート２２７と、試料貯蔵ループ２２１の両端がそれぞれ連結される第１試料貯蔵ループ連結ポート２２４及び第２試料貯蔵ループ連結ポート２２５とを含む。
図示されていないが、試料貯蔵ループ２２１の両端にそれぞれ連結された第１試料貯蔵ループ連結ポート２２４と第２試料貯蔵ループ連結ポート２２５がそれぞれ第１試料流入ポート２２２と第１試料排出ポート２２３に連結された状態で試料注入器Ｓを通じて試料が第１試料流入ポート２２２に供給され、試料貯蔵ループ２２１に連続的に貯蔵される。
そして、第１試料貯蔵ループ連結ポート２２４と第２試料貯蔵ループ連結ポート２２５がそれぞれ第１溶媒流入ポート２２６と第１溶媒排出ポート２２７に連結された状態で第１ポンプＰ１を通じて第１溶媒流入ポート２２６に第１溶媒を注入し、試料貯蔵ループ２２１に貯蔵された試料を第２試料供給バルブ２４０に連続的に供給する。このとき、第１ポンプＰ１は、１０ｍＭ重炭酸トリエチルアンモニウム水溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ（ＴＥＡＢ） ｉｎ ｗａｔｅｒ）であるＡ溶液９９％と１０ｍＭ重炭酸トリエチルアンモニウムアセトニトリル溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ（ＴＥＡＢ） ｉｎ ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）であるＢ溶液１％が混合された溶液であって、ｐｈ７．５の第１溶媒を第１溶媒流入ポート２２６に供給する。
また、第２試料供給バルブ２４０は、第１試料供給バルブ２２０から供給された試料を試料分離カラム２４３に連続的に注入し、試料分離カラム２４３に注入された試料を試料分画モジュール２５０に連続的に供給する役目を行う。
第２試料供給バルブ２４０は、第１溶媒排出ポート２２７に連結される第２試料流入ポート２４１と、第２試料流入ポート２４１と隣り合って設けられ、第１分画試料流入ポート２６１に連結される第２試料排出ポート２４２と、第２試料流入ポート２４１と第２試料排出ポート２４２に両端がそれぞれ連結され、第２試料排出ポート２４２に試料が分離溶出される試料分離カラム２４３とを含む。
試料貯蔵ループ２２１に貯蔵された試料は第１溶媒によって第１溶媒排出ポート２２７と第２試料流入ポート２４１を通じて試料分離カラム２４３に注入される。そして、試料分離カラム２４３に注入された試料は第１ポンプＰ１から供給される第１溶媒によって分離溶出された後、第２試料排出ポート２４２に沿って後述する試料分画モジュール２５０に供給される。この時、第１ポンプＰ１は１０ｍＭ重炭酸トリエチルアンモニウム水溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ（ＴＥＡＢ） ｉｎ ｗａｔｅｒ）であるＡ溶液が９９％から５０％に減少し、１０ｍＭ重炭酸トリエチルアンモニウムアセトニトリル溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ（ＴＥＡＢ） ｉｎ ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）であるＢ溶液が１％から５０％に増加する混合溶液である第１溶媒を第１溶媒流入ポート２２６に供給する。このように、第１溶媒のＢ溶液の濃度を次第に増加させて試料分離カラム２４３から試料が容易に溶出されるようにする。
本実施例による試料分画モジュール２５０は試料供給モジュール２１０から連続的に供給された試料から１０個の分画試料を獲得する役目を行う。
試料分画モジュール２５０は、試料供給モジュール２１０に連結され、試料が流入する第１分画バルブ２６０と、第１分画バルブ２６０と隣り合って設けられる第２分画バルブ２８０と、一端が第１分画バルブ２６０に連結され、他端が第２分画バルブ２８０に連結される複数の分画試料貯蔵ループ２８４ａ〜２８４ｊとを含む。
本実施例において、それぞれの単位試料供給時間は１０個の単位分画区間を有するので、分画試料貯蔵ループ２８４ａ〜２８４ｊは単位試料供給時間内の対応する単位分画区間の数に対応するように１０個が備えられる。
そして、第１分画バルブ２６０は、第２試料排出ポート２４２から試料が流入する第１分画試料流入ポート２６１と、第１分画試料流入ポート２６１と隣り合って設けられ、複数の分画試料貯蔵ループ２８４ａ〜２８４ｊの一端にそれぞれ連結される複数の第１分画試料貯蔵ループ連結ポート２６２と、単位分画区間に対応して第１分画試料流入ポート２６１と複数の第１分画試料貯蔵ループ連結ポート２６２のいずれか一つを互いに連通するように連結する第１連結バー２６３とを含む。本実施例において、第１分画試料貯蔵ループ連結ポート２６２は１０個の分画試料貯蔵ループ２８４ａ〜２８４ｊの数に対応して１０個が備えられる。
また、第２分画バルブ２８０は、複数の分画試料貯蔵ループ２８４ａ〜２８４ｊの他端がそれぞれ連結される複数の第２分画試料貯蔵ループ連結ポート２８２と、複数の第２分画試料貯蔵ループ連結ポート２８２と隣り合って設けられ、複数の分画試料貯蔵ループ２８４ａ〜２８４ｊのいずれか一つの他端に連結され、分画試料が排出される第１分画試料排出ポート２８１と、単位分画区間に対応して第１分画試料排出ポート２８１と複数の第２分画試料貯蔵ループ連結ポート２８２のいずれか一つを互いに連通するように連結する第２連結バー２８３とを含む。本実施例において、第２分画試料貯蔵ループ連結ポート２８２は１０個の分画試料貯蔵ループ２８４ａ〜２８４ｊの数に対応して１０個が備えられる。
まず、第１単位試料供給時間（０〜２０分）内の第１単位分画区間〜第１０単位分画区間で第１〜第１０分画試料を獲得する過程を説明すると以下のとおりである。
図３に示すように、第１単位分画区間（０〜２分）で第１分画試料を獲得する動作は以下のとおりである。
第１連結バー２６３は複数の第１分画試料貯蔵ループ連結ポート２６２のうち第１分画試料貯蔵ループ２８４ａの一端に連結された第１分画試料貯蔵ループ連結ポート２６２に連結され、第２連結バー２８３は複数の第２分画試料貯蔵ループ連結ポート２８２のうち第１分画試料貯蔵ループ２８４ａの他端に連結された第２分画試料貯蔵ループ連結ポート２８２に連結される。
そして、第１溶媒排出ポート２２７と第２試料流入ポート２４１が連結された状態で第１ポンプＰ１から第１溶媒を試料分離カラム２４３に供給して試料分離カラム２４３で試料を分離溶出させ、試料分離カラム２４３で分離溶出された試料を第２試料排出ポート２４２を通じて第１分画試料流入ポート２６１を経て第１分画試料貯蔵ループ２８４ａに供給して貯蔵する。
また、図４に示すように、第２単位分画区間（２〜４分）で第２分画試料を獲得する動作は以下のとおりである。
第１連結バー２６３は複数の第１分画試料貯蔵ループ連結ポート２６２のうち第２分画試料貯蔵ループ２８４ｂの一端に連結された第１分画試料貯蔵ループ連結ポート２６２に連結され、第２連結バー２８３は複数の第２分画試料貯蔵ループ連結ポート２８２のうち第２分画試料貯蔵ループ２８４ｂの他端に連結された第２分画試料貯蔵ループ連結ポート２８２に連結される。
そして、第１溶媒排出ポート２２７と第２試料流入ポート２４１が連結された状態で第１ポンプＰ１から第１溶媒を試料分離カラム２４３に供給して試料分離カラム２４３で試料を分離溶出させ、試料分離カラム２４３で分離溶出された試料を第２試料排出ポート２４２を通じて第１分画試料流入ポート２６１を経て第２分画試料貯蔵ループ２８４ｂに供給して貯蔵する。
また、図５に示すように、第１０単位分画区間（１８〜２０分）で第１０分画試料を獲得する動作は以下のとおりである。
第１連結バー２６３は複数の第１分画試料貯蔵ループ連結ポート２６２のうち第１０分画試料貯蔵ループ２８４ｊの一端に連結された第１分画試料貯蔵ループ連結ポート２６２に連結され、第２連結バー２８３は複数の第２分画試料貯蔵ループ連結ポート２８２のうち第１０分画試料貯蔵ループ２８４ｊの他端に連結された第２分画試料貯蔵ループ連結ポート２８２に連結される。
そして、第１溶媒排出ポート２２７と第２試料流入ポート２４１が連結された状態で第１ポンプＰ１から第１溶媒を試料分離カラム２４３に供給して試料分離カラム２４３で試料を分離溶出させ、試料分離カラム２４３で分離溶出された試料を第２試料排出ポート２４２を通じて第１分画試料流入ポート２６１を経て第１０分画試料貯蔵ループ２８４ｊに供給して貯蔵する。
そして、第２〜第５単位試料供給時間（２０〜４０分、４０〜６０分、６０〜８０分、８０〜１００分）に対して、それぞれ前述した第１単位試料供給時間（０〜２０分）内の第１単位分画区間〜第１０単位分画区間で第１〜第１０分画試料を獲得する過程を繰り返すことにより、第１〜第１０分画試料を獲得することができる。例えば、第１単位試料供給時間〜第５単位試料供給時間内の第１単位分画区間（すなわち、０〜２分、２０〜２２分、４０〜４２分、６０〜６２分、８０〜８２分）に供給される試料を統合的に貯蔵して第１分画試料が得られる。
一方、前述した試料分画モジュール２５０で獲得した第１〜第１０分画試料に対する分離分析のために、第１〜第１０分画試料を第１逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ１又は第２逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ２に供給する。
このために、本実施例によるカラム選択モジュール３００は、試料分画モジュール２５０から順次供給される第１〜第１０分画試料を交互に、後述する二重カラムバルブ４００に備えられた第１固相抽出カラムＳＰＥ１と第１逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ１又は第２固相抽出カラムＳＰＥ２と第２逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ２に供給する役目を行う。
また、カラム選択モジュール３００は、第１〜第１０分画試料を第１固相抽出カラムＳＰＥ１と第１逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ１又は第２固相抽出カラムＳＰＥ２と第２逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ２のいずれか一つに供給して分画試料に対する分離分析過程を行ううちに第１逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ１又は第２固相抽出カラムＳＰＥ２と第２逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ２の残りの一つに対する平衡化過程を同時に行う役目を行う。
このようなカラム選択モジュール３００は、第１分画試料排出ポート２８１に連結され、複数の分画試料を第１固相抽出カラムＳＰＥ１又は第２固相抽出カラムＳＰＥ２に交互に供給する経路を提供し、第１固相抽出カラムＳＰＥ１と第１逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ１又は第２固相抽出カラムＳＰＥ２と第２逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ２を交互に平衡化するカラム平衡化バルブ３１０と、カラム平衡化バルブ３１０に連結され、複数の分画試料を受けて第１固相抽出カラムＳＰＥ１又は第２固相抽出カラムＳＰＥ２に交互に供給し、第１固相抽出カラムＳＰＥ１から第１逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ１に分画試料が分離溶出されるか第２固相抽出カラムＳＰＥ２から第２逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ２に分画試料が分離溶出されるようにするカラム選択バルブ３３０とを含む。
本実施例によるカラム平衡化バルブ３１０は、第１〜第１０分画試料が交互に第１固相抽出カラムＳＰＥ１又は第２固相抽出カラムＳＰＥ２に供給される経路を提供する役目を行う。
カラム平衡化バルブ３１０は、第１分画試料排出ポート２８１と第２溶媒を供給する第２ポンプＰ２に連結される第２分画試料流入ポート３１１と、第３溶媒を供給する第３ポンプＰ３に連結され、第３溶媒が流入する第３溶媒流入ポート３１３と、第２分画試料流入ポート３１１と隣り合って設けられ、第２分画試料流入ポート３１１と第３溶媒流入ポート３１３に選択的に連結される第２分画試料排出ポート３１２と、第３溶媒流入ポート３１３と隣り合って設けられ、第２分画試料流入ポート３１１と第３溶媒流入ポート３１３に選択的に連結される第３溶媒排出ポート３３４とを含む。
図６を参照して、第２分画試料流入ポート３１１は第１分画試料排出ポート２８１と連結され、第２分画試料流入ポート３１１が第３溶媒排出ポート３３４と連結された状態で第１分画試料貯蔵ループ２８４ａに貯蔵された第１分画試料が後述する二重選択バルブの第１固相抽出カラムＳＰＥ１に供給される。また、図８を参照して、第２分画試料流入ポート３１１は第１分画試料排出ポート２８１と連結され、第２分画試料流入ポート３１１が第３溶媒排出ポート３３４と連結された状態で第２分画試料貯蔵ループ２８４ｂに貯蔵された第２分画試料が後述する二重選択バルブの第２固相抽出カラムＳＰＥ２に供給される。
前記のように、第１〜第１０分画試料貯蔵ループ２８４ａ〜２８４ｊに貯蔵された第１〜第１０分画試料は第１分画試料排出ポート２８１と第２分画試料流入ポート３１１と第３溶媒排出ポート３３４と連結された状態で第１固相抽出カラムＳＰＥ１又は第２固相抽出カラムＳＰＥ２に交互に供給されることができる。
このとき、第１〜第１０分画試料貯蔵ループ２８４ａ〜２８４ｊから排出される第１〜第１０分画試料は第１分画試料排出ポート２８１と第２分画試料流入ポート３１１を連結するライン上に配置された第２ポンプＰ２を通じて第２溶媒を受ける。ここで、第２ポンプＰ２は０．２％トリフルオロ酢酸水溶液（０．２％ Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＴＦＡ） ｉｎ ｗａｔｅｒ）である第２溶媒を供給する。そして、第１ポンプＰ１は１０ｍＭ重炭酸トリエチルアンモニウム水溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ（ＴＥＡＢ） ｉｎ ｗａｔｅｒ）であるＡ溶液９９％と１０ｍＭ重炭酸トリエチルアンモニウムアセトニトリル溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ（ＴＥＡＢ） ｉｎ ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）であるＢ溶液１％が混合された溶液である第１溶媒を第１溶媒流入ポート２２６に供給する。また、第１ポンプＰ１から供給される第１溶媒と第２ポンプＰ２から供給される第２溶媒の流量の比は１：９であり得る。
これは、第１固相抽出カラムＳＰＥ１又は第２固相抽出カラムＳＰＥ２に供給される第１〜第１０分画試料に第２溶媒を注入して第１〜第１０分画試料を希釈して酸性化させることで、第１〜第１０分画試料が第１固相抽出カラムＳＰＥ１又は第２固相抽出カラムＳＰＥ２で遺失されることを防止して有機溶媒の組成を低めるためである。
そして、図７を参照して、第１逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ１に貯蔵された第１分画試料に対する分離分析過程を行ううちに第３溶媒流入ポート３１３と第３溶媒排出ポート３３４が連結された状態で第３溶媒がカラム選択バルブ３３０を通じて第２固相抽出カラムＳＰＥ２と第２逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ２を平衡化する。また、図９を参照して、第２逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ２に貯蔵された第２分画試料に対する分離分析過程を行ううちに第３溶媒流入ポート３１３と第３溶媒排出ポート３３４が連結された状態で第３溶媒がカラム選択バルブ３３０を通じて第１固相抽出カラムＳＰＥ１と第１逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ１を平衡化する。
本実施例において、第３溶媒は０．１％ギ酸水溶液（０．１％ Ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｗａｔｅｒ）が使用されているが、これに限定されず、第１固相抽出カラムＳＰＥ１と第１逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ１及び第２固相抽出カラムＳＰＥ２と第２逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ２を平衡化することができる水溶性溶液であればどのようなものであっても使用可能である。
本実施例によるカラム選択バルブ３３０は、カラム平衡化バルブ３１０から複数の分画試料を受け、複数の分画試料を交互に第１固相抽出カラムＳＰＥ１又は第２固相抽出カラムＳＰＥ２に供給する役目を行う。また、カラム選択バルブ３３０は、第４溶媒を第１固相抽出カラムＳＰＥ１に供給して、第１固相抽出カラムＳＰＥ１から第１逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ１に分画試料が溶出されるようにするか、又は第２固相抽出カラムＳＰＥ２に供給して、第２固相抽出カラムＳＰＥ２から第２逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ２に分画試料が溶出されるようにする役目を行う。
カラム選択バルブ３３０は、第３溶媒排出ポート３３４に連結され、分画試料又は第３溶媒が流入する分画試料及び第３溶媒流入ポート３３１と、第４溶媒を供給する第４ポンプＰ４に連結され、第４溶媒が流入する第４溶媒流入ポート３３３と、分画試料及び第３溶媒流入ポート３３１と隣り合って設けられ、分画試料及び第３溶媒流入ポート３３１と第４溶媒流入ポート３３３に選択的に連結される分画試料及び第３溶媒排出ポート３３２と、第４溶媒流入ポート３３３と隣り合って設けられ、分画試料及び第３溶媒流入ポート３３１と第４溶媒流入ポート３３３に選択的に連結される第４溶媒排出ポート３３４とを含む。
第２固相抽出カラムＳＰＥ２と第２逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ２を平衡化する動作を説明すると、図６に示すように、分画試料及び第３溶媒排出ポート３３２と分画試料及び第３溶媒流入ポート３３１と第３溶媒排出ポート３３４と第２分画試料流入ポート３１１が連結された状態で第１分画試料が第１固相抽出カラムＳＰＥ１に供給される。そして、図７に示すように、第４溶媒流入ポート３３３と分画試料及び第３溶媒排出ポート３３２が連結された状態で第４溶媒が第１分画試料を第１固相抽出カラムＳＰＥ１から第１逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ１に溶出され、分画試料及び第３溶媒流入ポート３３１と第４溶媒排出ポート３３４と第３溶媒排出ポート３３４が連結された状態で第３溶媒が第２固相抽出カラムＳＰＥ２と第２逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ２に流入して第２固相抽出カラムＳＰＥ２と第２逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ２を平衡化する。
本実施例において、第４ポンプＰ４は０．１％ギ酸水溶液（０．１％ Ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｗａｔｅｒ）であるＣ溶液が９９％から６０％に減少し、０．１％ギ酸アセトニトリル溶液（０．１％ Ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ａｃｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）であるＤ溶液が１％から４０％に増加する混合溶液である第４溶媒を第４溶媒流入ポート３３３に供給する。このように、第４溶媒のＤ溶液の濃度を次第に増加させて、第１固相抽出カラムＳＰＥ１で第１分画試料が容易に溶出されるようにするか又は第２固相抽出カラムＳＰＥ２で第２分画試料が容易に溶出されるようにする。
また、第１固相抽出カラムＳＰＥ１と第１逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ１を平衡化する動作を説明すると、図８に示すように、第４溶媒排出ポート３３４と分画試料及び第３溶媒流入ポート３３１と第３溶媒排出ポート３３４と第２分画試料流入ポート３１１が連結された状態で第２分画試料が第２固相抽出カラムＳＰＥ２に供給された後、図９に示すように、第４溶媒流入ポート３３３と第４溶媒排出ポート３３４が連結された状態で第４溶媒が第２分画試料を第２固相抽出カラムＳＰＥ２から第２逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ２に溶出され、分画試料及び第３溶媒流入ポート３３１と分画試料及び第３溶媒排出ポート３３２が連結された状態で第３溶媒が第１固相抽出カラムＳＰＥ１と第１逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ１に流入して第１固相抽出カラムＳＰＥ１と第１逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ１を平衡化する。
一方、本実施例による二重カラムバルブ４００は第１逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ１又は第２逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ２のいずれか一つで分画試料に対する分離分析が進行されるうちに他のカラムに対する平衡化を行うようにする役目を行う。
二重カラムバルブ４００は、第１逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ１に連結される第１固相抽出カラムＳＰＥ１と第２逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ２に連結される第２固相抽出カラムＳＰＥ２を含む。分画試料は第１固相抽出カラムＳＰＥ１を通じて第１逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ１に又は第２固相抽出カラムＳＰＥ２を通じて第２逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ２に供給される。
そして、二重カラムバルブ４００は第１〜第１０分画試料が交互に第１逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ１又は第２逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ２に供給されるようにし、また第１逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ１又は第２逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ２のいずれか一つで分画試料に対する分離分析が進行されるうちに同時に他のカラムに対する平衡化がなされるようにするカラム選択バルブ３３０と流体連通する。
このために、二重カラムバルブ４００は、第１固相抽出カラムＳＰＥ１の両端にそれぞれ連結される第１固相抽出カラム連結ポート４１２及び第１固相抽出カラム経路ポート４１３と、分画試料及び第３溶媒排出ポート３３２と連結されるとともに第１固相抽出カラム連結ポート４１２と第１固相抽出カラム経路ポート４１３に選択的に連結される第１固相抽出カラム流入ポート４１１と、第１逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ１に連結され、第１固相抽出カラム連結ポート４１２に連結又は連結解除される第１逆相液体クロマトグラフィーカラムポート４１４と、第２固相抽出カラムＳＰＥ２の両端にそれぞれ連結される第２固相抽出カラム連結ポート４３２及び第２固相抽出カラム経路ポート４３３と、第４溶媒排出ポート３３４と連結されるとともに第２固相抽出カラム連結ポート４３２と第２固相抽出カラム経路ポート４３３に選択的に連結される第２固相抽出カラム流入ポート４３１と、第２逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ２に連結され、第２固相抽出カラム連結ポート４３２に連結又は連結解除される第２逆相液体クロマトグラフィーカラムポート４３４とを含む。
図６を参照して、第１固相抽出カラムＳＰＥ１に第１分画試料が供給される動作を説明する。第１固相抽出カラム連結ポート４１２と第１固相抽出カラム流入ポート４１１と分画試料及び第３溶媒排出ポート３３２と分画試料及び第３溶媒流入ポート３３１と第３溶媒排出ポート３３４が連結された状態で第１分画試料が第１固相抽出カラムＳＰＥ１に供給される。そして、二重カラムバルブ４００は、第１固相抽出カラム経路ポート４１３と隣り合って設けられ、第１固相抽出カラム経路ポート４１３に連結又は連結解除される第１排出ポート４５１をさらに含み、第１分画試料が第１固相抽出カラムＳＰＥ１に供給されて濃縮される場合、塩は第１排出ポート４５１を通じて外部に排出される。
そして、図７を参照して、第１逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ１に第１分画試料を注入して第１分画試料に対する分離分析を進めるため、第１逆相液体クロマトグラフィーカラムポート４１４と第１固相抽出カラム連結ポート４１２と第１固相抽出カラム経路ポート４１３と第１固相抽出カラム流入ポート４１１が連結された状態で第４溶媒が第４溶媒流入ポート３３３と分画試料及び第３溶媒排出ポート３３２に沿って第１固相抽出カラムＳＰＥ１に流入して第１固相抽出カラムＳＰＥ１で第１分画試料を溶出し、第１分画試料を第１逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ１に供給する。また、第１分画試料に対する分離分析と同時に第２固相抽出カラムＳＰＥ２と第２逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ２を平衡化するため、第２逆相液体クロマトグラフィーカラムポート４３４と第２固相抽出カラム連結ポート４３２と第２固相抽出カラム経路ポート４３３と第２固相抽出カラム流入ポート４３１が連結された状態で第３溶媒が分画試料及び第３溶媒流入ポート３３１と第４溶媒排出ポート３３４に沿って第２固相抽出カラムＳＰＥ２と第２逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ２に流入して第２固相抽出カラムＳＰＥ２と第２逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ２を平衡化する。
また、図８を参照して、第２固相抽出カラムＳＰＥ２に第２分画試料が供給される動作を説明する。第２固相抽出カラム連結ポート４３２と第２固相抽出カラム流入ポート４３１と第４溶媒排出ポート３３４と分画試料及び第３溶媒流入ポート３３１と第３溶媒排出ポート３３４が連結された状態で第２分画試料が第２固相抽出カラムＳＰＥ２に供給される。そして、二重カラムバルブ４００は、第２固相抽出カラム経路ポート４３３と隣り合って設けられ、第２固相抽出カラム経路ポート４３３に連結又は連結解除される第２排出ポート４５３をさらに含み、第２分画試料が第２固相抽出カラムＳＰＥ２に供給されて濃縮される場合、塩は第２排出ポート４５３を通じて外部に排出される。
そして、図９を参照して、第２逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ２に第２分画試料を注入して第２分画試料に対する分離分析を進めるため、第２逆相液体クロマトグラフィーカラムポート４３４と第２固相抽出カラム連結ポート４３２と第２固相抽出カラム経路ポート４３３と第２固相抽出カラム流入ポート４３１が連結された状態で第４溶媒が第４溶媒流入ポート３３３と第４溶媒排出ポート３３４に沿って第２固相抽出カラムＳＰＥ２に流入して第２固相抽出カラムＳＰＥ２で第２分画試料を溶出させて、第２分画試料を第２逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ２に供給する。
また、第２分画試料に対する分離分析と同時に第１固相抽出カラムＳＰＥ１と第１逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ１を平衡化するため、第１逆相液体クロマトグラフィーカラムポート４１４と第１固相抽出カラム連結ポート４１２と第１固相抽出カラム経路ポート４１３と第１固相抽出カラム流入ポート４１１が連結された状態で第３溶媒が分画試料及び第３溶媒流入ポート３３１と分画試料及び第３溶媒排出ポート３３２に沿って第１固相抽出カラムＳＰＥ１と第１逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ１に流入して第１固相抽出カラムＳＰＥ１と第１逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ１を平衡化する。
前記のような方式で第３〜第１０分画試料を交互に第１固相抽出カラムＳＰＥ１と第１逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ１に又は第２固相抽出カラムＳＰＥ２と第２逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ２に供給して分離分析を行うとともに第１固相抽出カラムＳＰＥ１と第１逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ１又は第２固相抽出カラムＳＰＥ２と第２逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ２に対する平衡化を行うことができる。
このように、本発明は記載した実施例に限定されるものではなく、本発明の思想及び範囲を逸脱しない範疇内で多様に修正又は変形することができるのは当該技術分野で通常の知識を有する者にとって明らかである。したがって、このような修正例又は変形例は本発明の特許請求の範囲に属するものであると言える。
本発明は試料の複雑性を低減するとともに分画試料の均一性を高める非連続的試料分画統合過程を自動化することにより、分画再現性が向上し、試料の損失を防止することができる。
本発明は、非連続的試料分画統合デバイス及びこれを備えた二重オンライン多次元液体クロマトグラフィーシステムに関し、より詳しくは、試料の複雑性を低減するとともに分画試料の均一性を高める非連続的試料分画統合デバイス及びこれを備えた二重オンライン 多次元液体クロマトグラフィーシステムに関する。
したがって、本発明が解決しようとする技術的課題は、試料の複雑性を低減するとともに分画試料の均一性を高める非連続的試料分画統合過程を自動化することで、分画再現性を向上させ、試料の損失を防止することができる非連続的試料分画統合デバイス及びこれを備えた二重オンライン多次元液体クロマトグラフィーシステムを提供することである。
本発明のほかの側面によると、分析対象となる試料を連続的に受け、前記試料を受ける総試料供給時間を複数に均等分割した単位試料供給時間を設定し、複数の単位試料供給時間のそれぞれを複数に均等分割した単位分画区間を設定した後、それぞれの単位試料供給時間内の対応する単位分画区間の間に受けた前記試料を統合的に貯蔵して獲得した複数の分画試料を供給する非連続的試料分画統合デバイス；第１逆相液体クロマトグラフィーカラムと第２逆相液体クロマトグラフィーカラムが連結され、前記第１逆相液体クロマトグラフィーカラムと連結される第１固相抽出カラムと前記第２逆相液体クロマトグラフィーカラムと連結される第２固相抽出カラムを備えた二重カラムバルブ；及び前記非連続的試料分画統合デバイスと前記二重カラムバルブの間に設けられ、前記非連続的試料分画統合デバイスから順次供給される前記分画試料を交互に前記第１固相抽出カラムと前記第１逆相液体クロマトグラフィーカラムに又は前記第２固相抽出カラムと前記第２逆相液体クロマトグラフィーカラムに供給するカラム選択モジュールを含む二重オンライン多次元液体クロマトグラフィーシステムが提供されることができる。
ｐＨ１０でＲＰＬＣ分離を行った後、各分画試料に対してさらにｐＨ２．６でＲＰＬＣ分離を行い、質量分析装置を用いて分析した後、同定したペプチドの分布を示す図である。 試料を分画後に非連続的に統合する技術を説明するための図である。 本発明の一実施例による二重オンライン多次元液体クロマトグラフィーシステムにおいて、第１分画試料の獲得動作を示す図である。 本発明の一実施例による二重オンライン多次元液体クロマトグラフィーシステムにおいて、第２分画試料の獲得動作を示す図である。 本発明の一実施例による二重オンライン多次元液体クロマトグラフィーシステムにおいて、第１０分画試料の獲得動作を示す図である。 本発明の一実施例による二重オンライン多次元液体クロマトグラフィーシステムにおいて、第１分画試料を第１固相抽出カラムに供給する動作を示す図である。 本発明の一実施例による二重オンライン多次元液体クロマトグラフィーシステムにおいて、第１分画試料を第１逆相液体クロマトグラフィーカラムに供給し、第２固相抽出カラムと第２逆相液体クロマトグラフィーカラムを平衡化する動作を示す図である。 本発明の一実施例による二重オンライン多次元液体クロマトグラフィーシステムにおいて、第２分画試料を第２固相抽出カラムに供給する動作を示す図である。 本発明の一実施例による二重オンライン多次元液体クロマトグラフィーシステムにおいて、第２分画試料を第２逆相液体クロマトグラフィーカラムに供給し、第１固相抽出カラムと第１逆相液体クロマトグラフィーカラムを平衡化する動作を示す図である。
図３は本発明の一実施例による二重オンライン多次元液体クロマトグラフィーシステムにおいて、第１分画試料の獲得動作を示す図、図４は本発明の一実施例による二重オンライン多次元液体クロマトグラフィーシステムにおいて、第２分画試料の獲得動作を示す図、図５は本発明の一実施例による二重オンライン多次元液体クロマトグラフィーシステムにおいて、第１０分画試料の獲得動作を示す図、図６は本発明の一実施例による二重オンライン多次元液体クロマトグラフィーシステムにおいて、第１分画試料を第１固相抽出カラムに供給する動作を示す図、図７は本発明の一実施例による二重オンライン多次元液体クロマトグラフィーシステムにおいて、第１分画試料を第１逆相液体クロマトグラフィーカラムに供給し、第２固相抽出カラムと第２逆相液体クロマトグラフィーカラムを平衡化する動作を示す図、図８は本発明の一実施例による二重オンライン多次元液体クロマトグラフィーシステムにおいて、第２分画試料を第２固相抽出カラムに供給する動作を示す図、図９は本発明の一実施例による二重オンライン多次元液体クロマトグラフィーシステムにおいて、第２分画試料を第２逆相液体クロマトグラフィーカラムに供給し、第１固相抽出カラムと第１逆相液体クロマトグラフィーカラムを平衡化する動作を示す図である。
図３〜図５を参照して、本発明の一実施例による二重オンライン多次元液体クロマトグラフィーシステム１００は、分析対象となる試料を連続的に受けて複数の分画試料を獲得して供給する非連続的試料分画統合デバイス２００と、第１逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ１と第２逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ２が連結され、第１逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ１と連結される第１固相抽出カラムＳＰＥ１と第２逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ２と連結される第２固相抽出カラムＳＰＥ２を備えた二重カラムバルブ４００と、非連続的試料分画統合デバイス２００と二重カラムバルブ４００の間に設けられ、非連続的試料分画統合デバイス２００から順次供給される複数の分画試料を交互に第１固相抽出カラムＳＰＥ１と第１逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ１又は第２固相抽出カラムＳＰＥ２と第２逆相液体クロマトグラフィーカラムＣＯＬ２に供給するカラム選択モジュール３００とを含む。

Claims (16)

  1. 分析対象となる試料を供給する試料供給モジュール；及び
    前記試料供給モジュールに連結されて前記試料を連続的に受け、前記試料供給モジュールから前記試料を受ける総試料供給時間を複数に均等分割した単位試料供給時間を設定し、複数の単位試料供給時間のそれぞれを複数に均等分割した単位分画区間を設定した後、それぞれの単位試料供給時間内の対応する単位分画区間の間に受けた前記試料を統合的に貯蔵して複数の分画試料を獲得する試料分画モジュールを含む、非連続的試料分画統合デバイス。
  2. 前記試料分画モジュールは、
    前記試料供給モジュールに連結され、前記試料が流入する第１分画バルブ；
    前記第１分画バルブと隣り合って設けられる第２分画バルブ；及び
    一端が前記第１分画バルブに連結され、他端が前記第２分画バルブに連結されるとともに前記単位試料供給時間内の複数の単位分画区間の数に対応して複数が設けられ、それぞれの前記単位試料供給時間内の対応する前記単位分画区間の間に受けた前記試料を順次統合的に貯蔵する分画試料貯蔵ループを含む、請求項１に記載の非連続的試料分画統合デバイス。
  3. 前記第１分画バルブは、
    前記試料供給モジュールから前記試料が流入する分画試料流入ポート；
    前記分画試料流入ポートと隣り合って設けられ、前記複数の分画試料貯蔵ループの一端にそれぞれ連結される複数の第１分画試料貯蔵ループ連結ポート；及び
    前記単位分画区間に対応して前記分画試料流入ポートと前記複数の第１分画試料貯蔵ループ連結ポートのいずれか一つを互いに連通するように連結する第１連結バーを含み、
    前記第２分画バルブは、
    前記複数の分画試料貯蔵ループの他端がそれぞれ連結される複数の第２分画試料貯蔵ループ連結ポート；
    前記複数の第２分画試料貯蔵ループ連結ポートと隣り合って設けられ、前記複数の分画試料貯蔵ループのいずれか一つの他端に連結され、前記分画試料が排出される分画試料排出ポート；及び
    前記単位分画区間に対応して前記分画試料排出ポートと前記複数の第２分画試料貯蔵ループ連結ポートのいずれか一つを互いに連通するように連結する第２連結バーを含む、請求項２に記載の非連続的的試料分画統合デバイス。
  4. 前記試料供給モジュールは、
    第１溶媒を供給する第１ポンプと試料注入器が連結される第１試料供給バルブ；及び
    前記第１試料供給バルブに連結され、前記第１試料供給バルブから前記試料を受けて前記分画試料流入ポートに供給する第２試料供給バルブを含む、請求項３に記載の非連続的試料分画統合デバイス。
  5. 前記第１試料供給バルブは、
    前記試料注入器に連結される第１試料流入ポート；
    前記第１試料流入ポートと隣り合って設けられる第１試料排出ポート；
    前記第１ポンプに連結される第１溶媒流入ポート；
    前記第１溶媒流入ポートと隣り合って設けられ、前記第２試料供給バルブに連結される第１溶媒排出ポート；及び
    試料貯蔵ループの両端がそれぞれ連結される第１試料貯蔵ループ連結ポートと第２試料貯蔵ループ連結ポートを含み、
    前記第１試料貯蔵ループ連結ポートと前記第２試料貯蔵ループ連結ポートのそれぞれが前記第１試料流入ポートと前記第１試料排出ポートに連結された状態で前記試料が前記試料貯蔵ループに貯蔵され、
    前記第１試料貯蔵ループ連結ポートと前記第２試料貯蔵ループ連結ポートのそれぞれが前記第１溶媒流入ポートと前記第１溶媒排出ポートに連結された状態で前記試料貯蔵ループに前記第１溶媒を注入して前記試料を前記第２試料供給バルブに供給する、請求項４に記載の非連続的試料分画統合デバイス。
  6. 前記第２試料供給バルブは、
    前記第１溶媒排出ポートに連結される第２試料流入ポート；
    前記第２試料流入ポートと隣り合って設けられ、前記分画試料流入ポートに連結される第２試料排出ポート；及び
    前記第２試料流入ポートと前記第２試料排出ポートに両端がそれぞれ連結され、前記第２試料排出ポートに前記試料が溶出される試料分離カラムを含み、
    前記試料分離カラムから溶出された前記試料は前記分画試料流入ポートに供給される、請求項５に記載の非連続的試料分画統合デバイス。
  7. 分析対象となる試料を連続的に受け、前記試料を受ける総試料供給時間を複数に均等分割した単位試料供給時間を設定し、複数の単位試料供給時間のそれぞれを複数に均等分割した単位分画区間を設定した後、それぞれの単位試料供給時間内の対応する単位分画区間の間に受けた前記試料を統合的に貯蔵して獲得した複数の分画試料を供給する非連続的試料分画統合デバイス；
    第１逆相液体クロマトグラフィーカラムと第２逆相液体クロマトグラフィーカラムが連結され、前記第１逆相液体クロマトグラフィーカラムと連結される第１固相抽出カラムと前記第２逆相液体クロマトグラフィーカラムと連結される第２固相抽出カラムを備えた二重カラムバルブ；及び
    前記非連続的試料分画統合デバイスと前記二重カラムバルブの間に設けられ、前記非連続的試料分画統合デバイスから順次供給される前記分画試料を交互に前記第１固相抽出カラムと前記第１逆相液体クロマトグラフィーカラムに又は前記第２固相抽出カラムと前記第２逆相液体クロマトグラフィーカラムに供給するカラム選択モジュールを含む、二重オンライン多機能液体クロマトグラフィーシステム。
  8. 前記非連続的試料分画統合デバイスは、
    前記試料を供給する試料供給モジュール；及び
    前記試料供給モジュールに連結され、前記試料供給モジュールから前記試料を連続的に受けて複数の分画試料を獲得し、前記カラム選択モジュールに前記複数の分画試料を順次供給する試料分画モジュールを含む、請求項７に記載の二重オンライン多機能液体クロマトグラフィーシステム。
  9. 前記試料分画モジュールは、
    前記試料供給モジュールに連結され、前記試料が流入する第１分画バルブ；
    前記第１分画バルブと隣り合って設けられる第２分画バルブ；及び
    一端が前記第１分画バルブに連結され、他端が前記第２分画バルブに連結されるとともに前記単位試料供給時間内の複数の単位分画区間の数に対応して複数が設けられ、それぞれの前記単位試料供給時間内の対応する前記単位分画区間の間に受けた前記試料を順次統合的に貯蔵する複数の分画試料貯蔵ループを含む、請求項８に記載の二重オンライン多機能液体クロマトグラフィーシステム。
  10. 前記第１分画バルブは、
    前記試料供給モジュールから前記試料が流入する第１分画試料流入ポート；
    前記第１分画試料流入ポートと隣り合って設けられ、前記複数の分画試料貯蔵ループの一端がそれぞれ連結される複数の第１分画試料貯蔵ループ連結ポート；及び
    前記単位分画区間に対応して前記分画試料流入ポートと前記複数の第１分画試料貯蔵ループ連結ポートのいずれか一つを互いに連通するように連結する第１連結バーを含み、
    前記第２分画バルブは、
    前記複数の分画試料貯蔵ループの他端がそれぞれ連結される複数の第２分画試料貯蔵ループ連結ポート；
    前記複数の第２分画試料貯蔵ループ連結ポートと隣り合って設けられ、前記複数の分画試料貯蔵ループのいずれか一つの他端が連結され、前記分画試料が排出される第１分画試料排出ポート；及び
    前記単位分画区間に対応して前記第１分画試料排出ポートと前記複数の第２分画試料貯蔵ループ連結ポートのいずれか一つを互いに連通するように連結する第２連結バーを含む、請求項９に記載の二重オンライン多機能液体クロマトグラフィーシステム。
  11. 前記試料供給モジュールは、
    試料注入器に連結される第１試料流入ポートと、前記第１試料流入ポートと隣り合って設けられる第１試料排出ポートと、第１ポンプに連結される第１溶媒流入ポートと、前記第１溶媒流入ポートと隣り合って設けられる第１溶媒排出ポートと、試料貯蔵ループの両端がそれぞれ連結される第１試料貯蔵ループ連結ポート及び第２試料貯蔵ループ連結ポートとを備えた第１試料供給バルブ；及び
    前記第１溶媒排出ポートに連結される第２試料流入ポートと、前記第２試料流入ポートと隣り合って設けられ、前記第１分画試料流入ポートに連結される第２試料排出ポートと、前記第２試料流入ポートと前記第２試料排出ポートに両端がそれぞれ連結され、前記第２試料排出ポートに前記試料が溶出される試料分離カラムとを備えた第２試料供給バルブを含む、請求項１０に記載の二重オンライン多機能液体クロマトグラフィーシステム。
  12. 前記カラム選択モジュールは、
    前記第１分画試料排出ポートに連結され、前記複数の分画試料を前記第１固相抽出カラム又は前記第２固相抽出カラムに交互に供給する経路を提供し、前記第１固相抽出カラムと前記第１逆相液体クロマトグラフィーカラム又は前記第２固相抽出カラムと前記第２逆相液体クロマトグラフィーカラムを交互に平衡化するカラム平衡化バルブ；及び
    前記カラム平衡化バルブに連結され、前記複数の分画試料を受けて前記第１固相抽出カラム又は前記第２固相抽出カラムに交互に供給し、前記第１固相抽出カラムから前記第１逆相液体クロマトグラフィーカラムに前記分画試料が溶出されるとか又は前記第２固相抽出カラムから前記第２逆相液体クロマトグラフィーカラムに前記分画試料が溶出されるようにするカラム選択バルブを含む、請求項１０に記載の二重オンライン多機能液体クロマトグラフィーシステム。
  13. 前記カラム平衡化バルブは、
    前記第１分画試料排出ポートと第２溶媒を供給する第２ポンプに連結される第２分画試料流入ポート；
    第３溶媒を供給する第３ポンプに連結され、前記第３溶媒が流入する第３溶媒流入ポート；
    前記第２分画試料流入ポートと隣り合って設けられ、前記第２分画試料流入ポートと前記第３溶媒流入ポートに選択的に連結される第２分画試料排出ポート；及び
    前記第３溶媒流入ポートと隣り合って設けられ、前記第２分画試料流入ポートと前記第３溶媒流入ポートに選択的に連結される第３溶媒排出ポートを含み、
    前記第２分画試料流入ポートと前記第３溶媒排出ポートが連結された状態で前記第２溶媒が注入された前記分画試料が前記カラム選択バルブを通じて前記第１固相抽出カラム又は前記第２固相抽出カラムに供給され、
    前記第３溶媒流入ポートと前記第３溶媒排出ポートが連結された状態で前記第３溶媒が前記カラム選択バルブを通じて前記第１固相抽出カラムと前記第１逆相液体クロマトグラフィーカラム又は前記第２固相抽出カラムと前記第２逆相液体クロマトグラフィーカラムを交互に平衡化する、請求項１２に記載の二重オンライン多機能液体クロマトグラフィーシステム。
  14. 前記カラム選択バルブは、
    前記第３溶媒排出ポートに連結され、前記分画試料又は前記第３溶媒が流入する分画試料及び第３溶媒流入ポート；
    第４溶媒を供給する第４ポンプに連結され、前記第４溶媒が流入する第４溶媒流入ポート；
    前記分画試料及び第３溶媒流入ポートと隣り合って設けられ、前記分画試料及び第３溶媒流入ポートと前記第４溶媒流入ポートに選択的に連結される分画試料及び第３溶媒排出ポート；及び
    前記第４溶媒流入ポートと隣り合って設けられ、前記分画試料及び第３溶媒流入ポートと前記第４溶媒流入ポートに選択的に連結される第４溶媒排出ポートを含み、
    前記分画試料及び第３溶媒流入ポートと前記分画試料及び第３溶媒排出ポートが連結されて前記分画試料が前記第１固相抽出カラムに供給された後、前記第４溶媒流入ポートと前記分画試料及び第３溶媒排出ポートが連結された状態で前記第４溶媒が前記分画試料を前記第１固相抽出カラムから前記第１逆相液体クロマトグラフィーカラムに溶出し、前記分画試料及び第３溶媒流入ポートと前記第４溶媒排出ポートが連結された状態で前記第３溶媒が前記第２固相抽出カラムと前記第２逆相液体クロマトグラフィーカラムを平衡化し、前記分画試料及び第３溶媒流入ポートと前記第４溶媒排出ポートが連結されて前記分画試料が前記第２固相抽出カラムに供給された後、前記第４溶媒流入ポートと前記第４溶媒排出ポートが連結された状態で前記第４溶媒が前記分画試料を前記第２固相抽出カラムから前記第２逆相液体クロマトグラフィーカラムに溶出し、前記分画試料及び第３溶媒流入ポートと前記分画試料及び第３溶媒排出トートが連結された状態で前記第３溶媒が前記第１固相抽出カラムと前記第１逆相液体クロマトグラフィーカラムを平衡化する、請求項１３に記載の二重オンライン多機能液体クロマトグラフィーシステム。
  15. 前記二重カラムバルブは、
    前記第１固相抽出カラムの両端にそれぞれ連結される第１固相抽出カラム連結ポートと第１固相抽出カラム経路ポート；
    前記分画試料及び第３溶媒排出ポートと連結されるとともに前記第１固相抽出カラム連結ポートと前記第１固相抽出カラム経路ポートに選択的に連結される第１固相抽出カラム流入ポート；
    前記第１逆相液体クロマトグラフィーカラムに連結され、前記第１固相抽出カラム連結ポートに連結又は連結解除される第１逆相液体クロマトグラフィーカラムポート；
    前記第２固相抽出カラムの両端にそれぞれ連結される第２固相抽出カラム連結ポートと第２固相抽出カラム経路ポート；
    前記第４溶媒排出ポートと連結されるとともに前記第２固相抽出カラム連結ポートと前記第２固相抽出カラム経路ポートに選択的に連結される第２固相抽出カラム流入ポート；及び
    前記第２逆相液体クロマトグラフィーカラムに連結され、前記第２固相抽出カラム連結ポートに連結又は連結解除される第２逆相液体クロマトグラフィーカラムポートを含む、請求項１４に記載の二重オンライン多機能液体クロマトグラフィーシステム。
  16. 前記二重カラムバルブは、
    前記第１固相抽出カラム経路ポートと隣り合って設けられ、前記第１固相抽出カラム経路ポートに連結又は連結解除される第１排出ポート；及び
    前記第１排出ポートと隣り合って設けられ、前記第２固相抽出カラム経路ポートに連結又は連結解除される第２排出ポートをさらに含む、請求項１５に記載の二重オンライン多機能液体クロマトグラフィーシステム。
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