WO2017122911A1 - 비연속적 시료 분획 및 통합유닛과 이를 구비한 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치 - Google Patents

비연속적 시료 분획 및 통합유닛과 이를 구비한 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치 Download PDF

Info

Publication number
WO2017122911A1
WO2017122911A1 PCT/KR2016/012395 KR2016012395W WO2017122911A1 WO 2017122911 A1 WO2017122911 A1 WO 2017122911A1 KR 2016012395 W KR2016012395 W KR 2016012395W WO 2017122911 A1 WO2017122911 A1 WO 2017122911A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sample
fraction
solvent
port
column
Prior art date
Application number
PCT/KR2016/012395
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
이상원
이한겨레
Original Assignee
고려대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 고려대학교 산학협력단 filed Critical 고려대학교 산학협력단
Priority to US16/070,100 priority Critical patent/US20190017974A1/en
Priority to CN202111466527.XA priority patent/CN114235994A/zh
Priority to EP16885222.6A priority patent/EP3404408B1/en
Priority to JP2018536832A priority patent/JP6723365B2/ja
Priority to CN201680078937.8A priority patent/CN108603864A/zh
Publication of WO2017122911A1 publication Critical patent/WO2017122911A1/ko
Priority to US17/512,160 priority patent/US11982652B2/en

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/34—Control of physical parameters of the fluid carrier of fluid composition, e.g. gradient
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/16—Injection
    • G01N30/20—Injection using a sampling valve
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/60—Construction of the column
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/80—Fraction collectors
    • G01N30/82—Automatic means therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/89—Inverse chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
    • B01D15/24—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to the treatment of the fractions to be distributed
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/32—Bonded phase chromatography
    • B01D15/325—Reversed phase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
    • G01N2030/027—Liquid chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N2030/062—Preparation extracting sample from raw material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/16—Injection
    • G01N30/20—Injection using a sampling valve
    • G01N2030/201—Injection using a sampling valve multiport valves, i.e. having more than two ports
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/16—Injection
    • G01N30/20—Injection using a sampling valve
    • G01N2030/202—Injection using a sampling valve rotary valves
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/16—Injection
    • G01N30/20—Injection using a sampling valve
    • G01N2030/207—Injection using a sampling valve with metering cavity, e.g. sample loop
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/38—Flow patterns
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/38—Flow patterns
    • G01N30/46—Flow patterns using more than one column
    • G01N30/461—Flow patterns using more than one column with serial coupling of separation columns
    • G01N30/463—Flow patterns using more than one column with serial coupling of separation columns for multidimensional chromatography

Definitions

  • the present invention relates to a non-continuous sample fraction and integrated unit and a dual on-line multifunctional liquid chromatography apparatus having the same, and more particularly, to a non-continuous sample fraction and integrated unit that lowers the sample complexity and improves the uniformity of the fraction sample.
  • the present invention relates to a dual on-line multifunctional liquid chromatography device having the same.
  • proteomics which is the study of all proteins expressed under specific conditions in vivo, a method of combining liquid chromatography and mass spectrometry (LC-MS / MS) has emerged as an important technology.
  • the separation efficiency of each separation method is the separation efficiency of each separation method, and the second is orthogonality.
  • Separation orthogonality means that by each separation method the sample mixture must be separated in different ways, ie by different physicochemical properties.
  • One of the two-dimensional separation methods recently developed and used is to fractionate the sample according to the degree of hydrophobicity under basic pH and then separate the separated fractions according to the degree of hydrophobicity under acidic pH conditions (two-dimensional reverse phase liquid). Chromatography-inverse liquid chromatography, 2D RP-RPLC).
  • FIG. 1 shows the distribution of the identified peptides in the elution time of each separation method after RPLC separation at pH 10 and each fraction sample was analyzed by mass spectrometry after RPLC separation at pH 2.6.
  • FIG. 1 many of the peptides are not shown, which means that the 2D RP-RPLC method did not use all the separation spaces of the two-dimensional separation.
  • a method developed to solve this problem is a discontinuous integration technique after fractionation.
  • the discontinuous integration technology after fractionation is divided into 96 fractions (1 to 96) according to the order of eluting when RPLC is separated under basic pH, and then integrated into 24 fractions.
  • 25 are integrated into the first fraction and 26 is incorporated into the second fraction.
  • Non-Patent Document 1 M Gilar et al, Anal Chem, 2005, 77, 6426-6434
  • Non-Patent Document 2 J.M. Park et al, Sci. Rep. 5, 18189; doi: 10.1038 / srep18189 (2015)
  • the technical problem to be solved by the present invention is to automate the discontinuous sample fraction and integration process to reduce the complexity of the sample and increase the uniformity of the fraction sample, to improve the fraction reproducibility and prevent the loss of the sample
  • the present invention provides a fractionation and integration unit and a dual on-line multifunctional liquid chromatography apparatus having the same.
  • the sample supply module for supplying a sample to be analyzed; And a unit sample supply time which is connected to the sample supply module to receive the sample continuously, and equally divides the total sample supply time from which the sample is supplied from the sample supply module into a plurality of units, and the plurality of unit sample supply times, respectively.
  • a non-continuous sample comprising a sample fraction module for setting a unit fraction section equally divided into a plurality of parts and then storing the samples supplied during the corresponding unit fraction section within each unit sample supply time to obtain a plurality of fraction samples; Fractional and integrated units may be provided.
  • the sample fraction module may include: a first fraction valve connected to the sample supply module to introduce the sample; A second fractionation valve provided adjacent to the first fractionation valve; And one end connected to the first fractionation valve and the other end connected to the second fractionation valve, a plurality of which is provided corresponding to the number of unit fractional sections within the unit sample supply time, and each unit sample supply time. It may include a fraction sample storage loop for sequentially storing the sample received during the corresponding unit fraction section within.
  • the first fractionation valve may include a fraction sample inlet port through which the sample is introduced from the sample supply module; A plurality of first fraction sample storage loop connection ports provided adjacent to the fraction sample inlet port and connected to one ends of the plurality of fraction sample storage loops; And a first connection bar connecting the fraction sample inlet port and the plurality of first fraction sample storage loop connection ports to communicate with each other in correspondence with the unit fraction section, wherein the second fraction valve includes: A plurality of second fraction sample storage loop connection ports to which the other ends of the fraction sample storage loops are connected; A fraction sample discharge port provided adjacent to the plurality of second fraction sample storage loop connection ports and connected to the other end of the plurality of fraction sample storage loops to discharge the fraction samples; And a second connection bar that connects one of the fraction sample discharge port and the plurality of second fraction sample storage loop connection ports to communicate with each other in correspondence to the unit fraction section.
  • the sample supply module includes: a first sample supply valve connected to a first pump and a sample injector for supplying a first solvent; And a second sample supply valve connected to the first sample supply valve and receiving the sample from the first sample supply valve and supplying the sample to the fraction sample inlet port.
  • the first sample supply valve the first sample inlet port connected to the sample injector; A first sample discharge port provided adjacent to the first sample inlet port; A first solvent inlet port connected to the first pump; A first solvent outlet port provided adjacent to the first solvent inlet port and connected to the second sample supply valve; And a first sample storage loop connection port and a second sample storage loop connection port, wherein both ends of the sample storage loop are respectively connected, wherein each of the first sample storage loop connection port and the second sample storage loop connection port is the first sample storage loop connection port.
  • the sample is stored in the sample storage loop while being connected to a sample inlet port and the first sample outlet port, and each of the first sample storage loop connection port and the second sample storage loop connection port is introduced into the first solvent.
  • the sample may be supplied to the second sample supply valve by injecting the first solvent into the sample storage loop while being connected to the port and the first solvent discharge port.
  • the second sample supply valve may include a second sample inlet port connected to the first solvent outlet port; A second sample discharge port provided adjacent to the second sample inlet port and connected to the fraction sample inlet port; And a sample separation column having both ends connected to the second sample inflow port and the second sample discharge port, and the sample is eluted to the second sample discharge port, and the sample eluted from the sample separation column. It may be supplied to the fraction sample inlet port.
  • receiving a sample to be analyzed continuously set a unit sample supply time equally divided into a plurality of total sample supply time for receiving the sample and a plurality of each unit sample supply time
  • a non-continuous sample fraction and an integrated unit for supplying a plurality of fraction samples obtained by integrating and storing the sample supplied during the corresponding unit fraction section within each unit sample supply time after setting the unit fraction section equally divided into pieces
  • a second solid phase extraction column connected to a first reverse phase liquid chromatography column and a second reverse phase liquid chromatography column, and connected to the first reverse phase liquid chromatography column and a second solid phase connected to the second reverse phase liquid chromatography column
  • the discontinuous sample fraction and the integrated unit and the double column valve wherein the fraction sample sequentially supplied from the discontinuous sample fraction and the integrated unit is alternately provided with the first solid phase extraction column and the first reversed phase liquid.
  • a dual on-line multifunctional liquid chromatography apparatus including a column selection module for supplying a chromatography
  • the non-continuous sample fraction and integrated unit the sample supply module for supplying the sample; And a sample fraction module connected to the sample supply module to continuously receive the sample from the sample supply module, to obtain a plurality of fraction samples, and to sequentially supply the plurality of fraction samples to the column selection module. .
  • the sample fraction module may include: a first fraction valve connected to the sample supply module to introduce the sample; A second fractionation valve provided adjacent to the first fractionation valve; And one end connected to the first fractionation valve and the other end connected to the second fractionation valve, a plurality of which is provided corresponding to the number of unit fractional sections within the unit sample supply time, and each unit sample supply time. It may include a plurality of sample storage loops for sequentially storing the samples received during the corresponding unit fractional section in the.
  • the first fraction valve may include a first fraction sample inlet port through which the sample is introduced from the sample supply module; A plurality of first fraction sample storage loop connection ports provided adjacent to the first fraction sample inlet port and connected to one end of the plurality of fraction sample storage loops; And a first connection bar connecting the fraction sample inlet port and the plurality of first fraction sample storage loop connection ports to communicate with each other in correspondence with the unit fraction section, wherein the second fraction valve includes: A plurality of second fraction sample storage loop connection ports to which the other ends of the fraction sample storage loops are connected; A first fraction sample outlet port provided adjacent to the plurality of second fraction sample storage loop connection ports and connected to the other end of the plurality of fraction sample storage loops to discharge the fraction sample; And a second connection bar that connects one of the first fraction sample discharge port and the plurality of second fraction sample storage loop connection ports to communicate with each other in correspondence to the unit fraction section.
  • the sample supply module includes a first sample inlet port connected to a sample injector, a first sample outlet port provided adjacent to the first sample inlet port, a first solvent inlet port connected to a first pump, A first sample supply valve having a first solvent outlet port provided adjacent to the first solvent inlet port, a first sample storage loop connection port and a second sample storage loop connection port connected to both ends of the sample storage loop, respectively; ; And a second sample inlet port connected to the first solvent outlet port, a second sample outlet port provided adjacent to the second sample inlet port and connected to the first fraction sample inlet port, and the second sample inlet. Both ends are connected to a port and the second sample discharge port, respectively, and may include a second sample supply valve having a sample separation column through which the sample is eluted to the second sample discharge port.
  • the column selection module is connected to the first fraction sample discharge port and provides a path for alternately supplying the plurality of fraction samples to the first solid phase extraction column or the second solid phase extraction column and extracting the first solid phase.
  • a column equilibrium valve configured to alternately equilibrate a column with the first reverse phase liquid chromatography column or the second solid phase extraction column and the second reverse phase liquid chromatography column;
  • a plurality of fractional samples connected to the column equalization valve to alternately supply the first solid phase extraction column or the second solid phase extraction column, and the first reverse phase liquid chromatography column in the first solid phase extraction column.
  • the fractional sample may be eluted or a column selector valve may be used to elute the fractional sample from the second solid phase extraction column to the second reversed phase liquid chromatography column.
  • the column equalization valve may include: a second fraction sample inlet port connected to the first fraction sample outlet port and a second pump for supplying a second solvent; A third solvent inlet port connected to a third pump for supplying a third solvent to introduce the third solvent; A second fraction sample discharge port provided adjacent to the second fraction sample inlet port and selectively connected to the second fraction sample inlet port and the third solvent inlet port; And a third solvent outlet port provided adjacent to the third solvent inlet port and selectively connected to the second fraction sample inlet port and the third solvent inlet port.
  • the fraction sample into which the second solvent is injected while the solvent discharge port is connected is supplied to the first solid phase extraction column or the second solid phase extraction column through the column selection valve, and the third solvent inlet port and the third
  • the first solid phase extraction column and the first reverse phase liquid chromatography column or the second solid phase extraction column and the second reverse phase liquid chromatography column are passed through the column selection valve. Can be balanced alternately.
  • the column selection valve may include: a fraction sample and a third solvent inlet port connected to the third solvent outlet port to which the fraction sample or the third solvent is introduced; A fourth solvent inflow port connected to a fourth pump for supplying a fourth solvent and introducing the fourth solvent; A fraction sample and a third solvent outlet port provided adjacent to the fraction sample and the third solvent inlet port and selectively connected to the fraction sample and the third solvent inlet port and the fourth solvent inlet port; And a fourth solvent outlet port provided adjacent to the fourth solvent inlet port and selectively connected to the fraction sample, the third solvent inlet port, and the fourth solvent inlet port, and the fraction sample and the third solvent inlet port.
  • fractional sample and the third solvent discharge port are connected to each other, and the fractional sample is supplied to the first solid phase extraction column, and then the fourth solvent inlet port and the fractional sample and the third solvent discharge port are connected to each other.
  • the solvent elutes the fractional sample from the first solid phase extraction column to the first reversed phase liquid chromatography column, and the third solvent is connected to the fractional sample and the third solvent inlet port and the fourth solvent outlet port.
  • a second solid phase extraction column and the second reversed phase liquid chromatography column are equilibrated, and the fraction sample, the third solvent inlet port, and the fourth solvent After the discharge port is connected to the fractional sample is supplied to the second solid-phase extraction column, the fourth solvent extracts the fractional sample from the second solid phase while the fourth solvent inlet port and the fourth solvent outlet port are connected.
  • the third solvent was eluted from the column to the second reversed phase liquid chromatography column, and the fractionated sample and the third solvent inlet port were connected to the fractionated sample and the third solvent discharge tote.
  • One reversed phase liquid chromatographie column can be equilibrated.
  • the double column valve may include a first solid phase extraction column connecting port and a first solid phase extraction column path port respectively connected to both ends of the first solid phase extraction column; A first solid phase extraction column inlet port connected to the fraction sample and a third solvent outlet port and selectively connected to the first solid phase extraction column connection port and the first solid phase extraction column path port; A first reverse phase liquid chromatography column port connected to the first reverse phase liquid chromatography column and connected to or disconnected from the first solid phase extraction column connection port; A second solid phase extraction column connection port and a second solid phase extraction column path port respectively connected to both ends of the second solid phase extraction column; A second solid phase extraction column inlet port connected to the fourth solvent outlet port and selectively connected to the second solid phase extraction column connection port and the second solid phase extraction column path port; And a second reverse phase liquid chromatography column port connected to the second reverse phase liquid chromatography column and connected to or disconnected from the second solid phase extraction column connection port.
  • the double column valve may include: a first discharge port provided adjacent to the first solid phase extraction column path port and connected to or disconnected from the first solid phase extraction column path port; And a second discharge port provided adjacent to the first discharge port and connected to or disconnected from the second solid phase extraction column path port.
  • An embodiment of the present invention provides a complexity of a sample by providing a non-continuous sample fraction and an integrated unit which can automatically obtain a plurality of fraction samples by integrating and storing a sample supplied during a corresponding unit fraction section within each unit sample supply time. It can reduce the loss, increase the uniformity of the fraction sample, improve the fraction reproducibility and also prevent the loss of the sample.
  • 1 is a diagram showing the distribution of peptides identified after RPLC separation at pH 10 and each fraction sample was further analyzed by mass spectrometry after RPLC separation at pH 2.6.
  • FIG. 2 is a view for explaining a technique for integrating a sample discontinuously after fractionation.
  • Figure 3 is a dual on-line multifunction liquid chromatography apparatus according to an embodiment of the present invention, a view showing the acquisition operation of the first fractional sample.
  • Figure 4 is a dual on-line multifunction liquid chromatography apparatus according to an embodiment of the present invention, a view showing the acquisition operation of the second fractional sample.
  • FIG. 5 is a dual on-line multifunction liquid chromatography apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a diagram illustrating an operation of supplying a first fractional sample to a first solid phase extraction column as a dual on-line multifunction liquid chromatography apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • the first fraction is supplied to the first reverse phase liquid chromatography column and the second solid phase extraction column and the second reverse phase liquid chromatography column equilibrium It is a figure which shows operation to perform.
  • FIG. 8 is a diagram illustrating an operation of supplying a second fractional sample to a second solid phase extraction column as a dual on-line multifunction liquid chromatography apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 is a dual on-line multifunctional liquid chromatography apparatus according to an embodiment of the present invention, and supplying a second fraction sample to a second reverse phase liquid chromatography column and equilibrating a first solid phase extraction column and a first reverse phase liquid chromatography column. It is a figure which shows operation to perform.
  • Figure 3 is a dual on-line multifunction liquid chromatography apparatus according to an embodiment of the present invention, a view showing the acquisition operation of the first fractional sample
  • Figure 4 is a dual on-line multifunction liquid chromatography apparatus according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 5 is a diagram illustrating an acquisition operation of a tenth fractional sample as a dual on-line multifunctional liquid chromatography apparatus according to an embodiment of the present invention
  • FIG. A dual on-line multifunctional liquid chromatography apparatus according to an embodiment of the present invention which illustrates an operation of supplying a first fractional sample to a first solid phase extraction column
  • FIG. 7 is a dual on-line multifunctional liquid chromatography according to an embodiment of the present invention.
  • a chromatographic apparatus, the first fraction being fed to a first reversed phase liquid chromatography column, the second solid phase extraction column and the second 8 is a diagram illustrating an operation of equilibrating a phase liquid chromatography column, and FIG. 8 illustrates a dual on-line multifunctional liquid chromatography apparatus according to an embodiment of the present invention, and supplying a second fraction sample to a second solid phase extraction column.
  • 9 is a dual on-line multifunction liquid chromatography apparatus according to an embodiment of the present invention, and supplying a second fraction sample to a second reverse phase liquid chromatography column and extracting the first solid phase extraction column and the first reverse phase liquid chromatography. It is a figure which shows the operation
  • the dual on-line multifunctional liquid chromatography apparatus 100 receives a sample to be analyzed continuously and obtains a plurality of fractional samples and supplies a continuous sample.
  • the first solid phase extraction connected with the fractionation and integration unit 200, the first reverse phase liquid chromatography column COL1 and the second reverse phase liquid chromatography column COL2, and the first reverse phase liquid chromatography column COL1.
  • a double column valve 400 having a second solid phase extraction column SPE2 connected to a column SPE1 and a second reversed phase liquid chromatography column COL2, a non-continuous sample fraction and integration unit 200 and a double column
  • the first solid phase extraction column (SPE1) and the first reversed phase liquid chromatography column (COL1) alternately provide a plurality of fraction samples provided between the valve 400 and sequentially supplied from the discontinuous sample fraction and the integrated unit 200, or 2 includes a solid phase extraction column (SPE2), and the second column selection module 300 to be supplied to the reverse phase liquid chromatography column (COL2).
  • the non-continuous sample fraction and the integrated unit 200 serves to obtain a plurality of fraction samples from the samples continuously supplied from the sample injector (S).
  • the unit sample supply time which equally divided the total sample supply time which receives a sample into several pieces is set.
  • a unit fractionation section in which the plurality of unit sample supply times are equally divided into a plurality of units is set.
  • the plurality of fraction samples are obtained by integrating and storing the samples supplied during the corresponding unit fraction sections within each unit sample supply time.
  • the unit sample supply times equally divided into five sample feed times are 20 minutes apart. That is, the first unit sample supply time is 0 to 20 minutes, and the second to fifth unit sample supply times correspond to 20 to 40 minutes, 40 to 60 minutes, 60 to 80 minutes, and 80 to 100 minutes, respectively.
  • the first to fifth unit sample supply time may have a unit fractionation section divided equally into ten.
  • the first unit fraction section is 0 to 2 minutes
  • the second to 10th unit fraction sections are 2 to 4 minutes, 4 to 6 minutes, 6 to 8 minutes, and 8 to 10 minutes, 10-12 minutes, 12-14 minutes, 14-16 minutes, 16-18 minutes, 18-20 minutes.
  • the first unit fraction section is 20 to 22 minutes
  • the second to tenth unit fraction sections are 22 to 24 minutes, 24 to 26 minutes, 26 to 28 minutes, and 28 to 30 minutes, respectively. , 30-32 minutes, 32-34 minutes, 34-36 minutes, 36-38 minutes, 38-40 minutes.
  • a plurality of fractional samples are obtained by collectively storing the samples supplied during the corresponding first to tenth unit fractions within the first to fifth unit supply times.
  • the first unit fraction period within the first unit supply time to the fifth unit supply time ie, 0 to 2 minutes, 20 to 22 minutes, 40 to 42 minutes, 60 to 62 minutes, 80 to 82 minutes).
  • the second fraction sample to the tenth fraction sample are the same as the process of obtaining the first fraction sample, a detailed description thereof will be omitted.
  • the total sample supply time is set to 100 minutes, the first to fifth unit sample supply time is set, and each unit sample supply time is set to 10 unit fractions,
  • the range is not limited thereto, and the total sample supply time, unit sample supply time, and unit fraction period may be variously set.
  • the non-continuous sample fraction and integrated unit 200 is connected to the sample supply module 210 and the sample supply module 210 for supplying a sample and continuously receive a sample from the sample supply module 210. And a sample fraction module 250 for obtaining a plurality of fraction samples and sequentially supplying a plurality of fraction samples to the column selection module 300.
  • the sample supply module 210 serves to continuously supply a sample to the sample fraction module 250.
  • the sample supply module 210 is connected to the first sample supply valve 220 and the first sample supply valve 220 to which the first pump P1 supplying the first solvent and the sample injector S are connected.
  • 1 includes a second sample supply valve 240 for receiving a sample from the sample supply valve 220 and supplying the sample to the sample fraction module 250.
  • the first sample supply valve 220 receives the sample from the sample injector S, stores the sample in the sample storage loop 221, receives the first solvent from the first pump P1, and stores the sample in the sample storage loop 221. It serves to supply a sample to the second sample supply valve 240.
  • the first sample supply valve 220 includes a first sample inlet port 222 connected to the sample injector S and a first sample outlet port 223 adjacent to the first sample inlet port 222. And a first solvent inlet port 226 connected to the first pump P1 and a first solvent outlet port provided adjacent to the first solvent inlet port 226 and connected to the second sample supply valve 240. 227 and a first sample storage loop connection port 224 and a second sample storage loop connection port 225 to which both ends of the sample storage loop 221 are connected, respectively.
  • a first sample storage loop connection port 224 and a second sample storage loop connection port 225 respectively connected to both ends of the sample storage loop 221 are respectively provided with a first sample inlet port 222 and a first sample inlet port 222.
  • the sample is supplied to the first sample inlet port 222 through the sample injector S and is continuously stored in the sample storage loop 221.
  • the first pump (with the first sample storage loop connection port 224 and the second sample storage loop connection port 225 connected to the first solvent inlet port 226 and the first solvent outlet port 227, respectively).
  • the first solvent is injected into the first solvent inlet port 226 through P1), and the sample stored in the sample storage loop 221 is continuously supplied to the second sample supply valve 240.
  • the first pump (P1) is 99% A solution of 10 mM Triethylammonium bicarbonate (TEAB) in water and 10 mM Triethylammonium bicarbonate (TEAB) in acetonitrile ) Is supplied to the first solvent inlet port 226.
  • TEAB Triethylammonium bicarbonate
  • TEAB Triethylammonium bicarbonate
  • the second sample supply valve 240 continuously injects the sample supplied from the first sample supply valve 220 into the sample separation column 243 and inserts the sample injected into the sample separation column 243 into a sample fractionation module ( 250) to supply continuously.
  • the second sample supply valve 240 is provided adjacent to the second sample inlet port 241 and the second sample inlet port 241 connected to the first solvent outlet port 227, and the first fraction sample inlet port ( Both ends are connected to the second sample discharge port 242, the second sample inlet port 241, and the second sample discharge port 242 respectively connected to the second sample discharge port 242, and the sample is separated into the second sample discharge port 242.
  • a sample separation column 243 that elutes is included.
  • the sample stored in the sample storage loop 221 is injected into the sample separation column 243 through the first solvent discharge port 227 and the second sample inlet port 241 by the first solvent. Then, the sample injected into the sample separation column 243 is separated and eluted by the first solvent supplied from the first pump P1 and then to the sample fraction module 250 to be described later along the second sample discharge port 242. Supplied.
  • the first pump (P1) is a solution of 10 mM Triethylammonium bicarbonate (TEAB) in water is reduced from 99% to 50% and 10 mM Triethylammonium acetonitrile solution (10 mM Triethylammonium
  • the first solvent a mixed solution in which the solution B of bicarbonate (TEAB) in acetonitrile) is increased from 1% to 50%, is supplied to the first solvent inlet port 226.
  • the concentration of the B solution of the first solvent is gradually increased so that the sample is easily eluted from the sample separation column 243.
  • the sample fraction module 250 serves to obtain 10 fraction samples from the samples continuously supplied from the sample supply module 210.
  • the sample fraction module 250 is connected to the sample supply module 210 and the first fraction valve 260 to which the sample is introduced, the second fraction valve 280 provided adjacent to the first fraction valve 260, A plurality of fraction sample storage loops 284a to 284j are connected at one end to the first fraction valve 260 and at the other end to the second fraction valve 280.
  • each unit sample supply time has ten unit fractions
  • ten fraction sample storage loops 284a to 284j are provided corresponding to the number of corresponding unit fractions within the unit sample supply time.
  • the first fraction valve 260 is provided adjacent to the first fraction sample inlet port 261 and the first fraction sample inlet port 261 through which the sample is introduced from the second sample outlet port 242.
  • a plurality of first sample storage loop connection ports 262 connected to one end of each of the sample storage loops 284a to 284j, and a first fraction sample inlet port 261 and a plurality of first portions corresponding to a unit fraction section; It includes a first connection bar 263 for connecting any one of the fraction sample storage loop connection port 262 in communication with each other.
  • ten first sample storage loop connection ports 262 are provided corresponding to the number of ten sample storage loops 284a to 284j.
  • the second fraction valve 280 includes a plurality of second fraction sample storage loop connection ports 282 to which the other ends of the plurality of fraction sample storage loops 284a to 284j are connected, and a plurality of second fraction sample storage loops, respectively.
  • a first fraction sample discharge port 281 provided adjacent to the connection port 282 and connected to any other end of the plurality of fraction sample storage loops 284a to 284j to discharge the fraction sample, and corresponds to the unit fraction section;
  • a second connection bar 283 for connecting any one of the first fraction sample discharge port 281 and the plurality of second fraction sample storage loop connection ports 282 to each other.
  • ten second sample storage loop connection ports 282 are provided corresponding to the number of ten sample storage loops 284a to 284j.
  • the operation of acquiring the first fraction sample in the first unit fraction section (0-2 minutes) is as follows.
  • the first connection bar 263 is connected to the first fraction sample storage loop connection port 262 connected to one end of the first fraction sample storage loop 284a of the plurality of first fraction sample storage loop connection ports 262,
  • the second connection bar 283 is connected to the second fraction sample storage loop connection port 282 connected to the other end of the first fraction sample storage loop 284a of the plurality of second fraction sample storage loop connection ports 282. .
  • the first solvent is supplied from the first pump P1 to the sample separation column 243 while the first solvent outlet port 227 and the second sample inlet port 241 are connected to each other.
  • the sample is separated and eluted, and the sample separated and eluted from the sample separation column 243 is supplied to the first fraction sample storage loop 284a through the second sample discharge port 242 through the first fraction sample inlet port 261. Save it.
  • the operation of acquiring the second fraction sample in the second unit fraction section (2 to 4 minutes) is as follows.
  • the first connection bar 263 is connected to a first fraction sample storage loop connection port 262 connected to one end of the second fraction sample storage loop 284b among the plurality of first fraction sample storage loop connection ports 262,
  • the second connection bar 283 is connected to a second fraction sample storage loop connection port 282 connected to the other end of the second fraction sample storage loop 284b among the plurality of second fraction sample storage loop connection ports 282. .
  • the first solvent is supplied from the first pump P1 to the sample separation column 243 while the first solvent outlet port 227 and the second sample inlet port 241 are connected to each other.
  • the sample is separated and eluted, and the sample separated and eluted in the sample separation column 243 is supplied to the second fraction sample storage loop 284b through the second sample discharge port 242 through the first fraction sample inlet port 261. Save it.
  • the first connection bar 263 is connected to the first fraction sample storage loop connection port 262 connected to one end of the tenth fraction sample storage loop 284j among the plurality of first fraction sample storage loop connection ports 262,
  • the second connection bar 283 is connected to the second fraction sample storage loop connection port 282 connected to the other end of the tenth fraction sample storage loop 284j among the plurality of second fraction sample storage loop connection ports 282. .
  • the first solvent is supplied from the first pump P1 to the sample separation column 243 while the first solvent outlet port 227 and the second sample inlet port 241 are connected to each other.
  • the sample is separated and eluted, and the sample separated and eluted in the sample separation column 243 is supplied to the tenth fraction sample storage loop 284j through the second sample discharge port 242 through the first fraction sample inlet port 261. Save it.
  • the first to tenth fraction samples may be obtained by repeating the process of obtaining the first to tenth fraction samples from the unit fraction section to the tenth unit fraction section.
  • the first unit fraction period within the first unit sample supply time to the fifth unit sample supply time ie, 0 to 2 minutes, 20 to 22 minutes, 40 to 42 minutes, 60 to 62 minutes, 80 to 82 minutes) Integrating and storing the sample supplied to the first fraction sample.
  • a first reverse phase liquid chromatography column (COL1) or a second reverse phase liquid chromatograph is used to separate the first to tenth fraction samples from the sample fraction module 250 to analyze the first to tenth fraction samples. It is fed to a chromatography column (COL2).
  • the column selection module 300 extracts the first solid phase provided in the double column valve 400 to be alternately described below with the first to tenth fraction samples sequentially supplied from the sample fraction module 250. It serves to feed the column (SPE1) and the first reverse phase liquid chromatography column (COL1) or the second solid phase extraction column (SPE2) and the second reverse phase liquid chromatography column (COL2).
  • the column selection module 300 uses the first to tenth fractional samples as the first solid phase extraction column (SPE1) and the first reverse phase liquid chromatography column (COL1) or the second solid phase extraction column (SPE2) and the second reverse phase liquid.
  • the first reverse phase liquid chromatography column (COL1) or the second solid phase extraction column (SPE2) and the second reverse phase liquid chromatography column are supplied to one of the chromatography columns (COL2) during the separation analysis of the fraction sample. Simultaneously equilibrate the rest of (COL2).
  • the column selection module 300 is connected to the first fraction sample discharge port 281 and provides a path for alternately supplying a plurality of fraction samples to the first solid phase extraction column (SPE1) or the second solid phase extraction column (SPE2). And equilibrating the first solid phase extraction column (SPE1) and the first reverse phase liquid chromatography column (COL1) or the second solid phase extraction column (SPE2) and the second reverse phase liquid chromatography column (COL2) alternately. ), And connected to the column equilibration valve 310 receives a plurality of fractional samples and alternately supplies the first solid phase extraction column (SPE1) or the second solid phase extraction column (SPE2) to the first solid phase extraction column (SPE1).
  • Column selector valve 330 which allows the fractional sample to be eluted separately from the first reverse phase liquid chromatography column (COL1) or the eluted fraction to the second reversed phase liquid chromatography column (COL2) from the second solid phase extraction column (SPE2). It includes.
  • the column equalization valve 310 serves to provide a path through which the first to tenth fraction samples are alternately supplied to the first solid phase extraction column SPE1 or the second solid phase extraction column SPE2.
  • the column equilibrium valve 310 is configured to supply a second fraction sample inlet port 311 connected to the first fraction sample discharge port 281 and a second pump P2 for supplying the second solvent, and a third solvent for supplying the third solvent.
  • a third solvent inlet port 313 and a third solvent inlet port 311 connected to the third pump P3 and a third solvent inlet are provided to be adjacent to the second fraction sample inlet port 311.
  • the second fraction sample discharge port 312 and the third fraction sample inlet port 311 which are selectively connected to the inlet port 313 are provided adjacent to the third solvent inlet port 313 and the third solvent inlet port 311 and the third solvent inlet port 313
  • the second fraction sample inlet port 311 is connected to the first fraction sample outlet port 281 and the second fraction sample inlet port 311 is connected to the third solvent outlet port 334.
  • the first fraction sample stored in the one fraction sample storage loop 284a is supplied to the first solid phase extraction column SPE1 of the dual selection valve, which will be described later.
  • the second fraction sample inlet port 311 is connected to the first fraction sample outlet port 281 and the second fraction sample inlet port 311 is connected to the third solvent outlet port 334.
  • the second fraction sample stored in the second fraction sample storage loop 284b is supplied to the second solid phase extraction column SPE2 of the dual selection valve which will be described later.
  • the first to tenth fraction samples stored in the first to tenth fraction sample storage loops 284a to 284j may include a first fraction sample discharge port 281 and a second fraction sample inlet port 311 and a third solvent.
  • the discharge port 334 may be alternately supplied to the first solid phase extraction column (SPE1) or the second solid phase extraction column (SPE2).
  • the first to tenth fraction sample discharged from the first to tenth fraction sample storage loops 284a to 284j is a line connecting the first fraction sample discharge port 281 and the second fraction sample inlet port 311.
  • the second solvent is supplied through the second pump P2 disposed on the bed.
  • the second pump P2 supplies a second solvent that is 0.2% trifluoroacetic acid (TFA) in water.
  • the first pump P1 is 99% A solution of 10 mM Triethylammonium bicarbonate (TEAB) in water and 10 mM Triethylammonium bicarbonate (TEAB) in acetonitrile ) Is supplied to the first solvent inlet port 226.
  • the ratio of the flow rate of the first solvent supplied from the first pump P1 and the second solvent supplied from the second pump P2 may be 1: 9.
  • the third solvent inlet port 313 and the third solvent outlet port 334 during the separation analysis of the first fraction sample stored in the first reversed phase liquid chromatography column COL1 are performed.
  • the third solvent equilibrates the second solid phase extraction column SPE2 and the second reverse phase liquid chromatography column COL2 via the column selection valve 330 in the state in which the third solvent is connected.
  • the third solvent inlet port 313 and the third solvent outlet port 334 are performed during the separation analysis of the second fraction stored in the second reversed phase liquid chromatography column COL2.
  • the third solvent equilibrates the first solid phase extraction column SPE1 and the first reverse phase liquid chromatography column COL1 via the column selection valve 330 in the state in which the third solvent is connected.
  • the third solvent is 0.1% formic acid in water, but is not limited thereto.
  • the first solid phase extraction column (SPE1), the first reverse phase liquid chromatography column (COL1), and the second solvent are used. Any aqueous solution capable of equilibrating the solid phase extraction column (SPE2) and the second reverse phase liquid chromatography column (COL2) can be used.
  • the column selection valve 330 receives a plurality of fraction samples from the column equalization valve 310, and alternately replaces the plurality of fraction samples with the first solid phase extraction column SPE1 or the second solid phase extraction column SPE2. To serve.
  • the column selection valve 330 supplies a fourth solvent to the first solid phase extraction column SPE1 so that the fractional sample is eluted from the first solid phase extraction column SPE1 to the first reverse phase liquid chromatography column COL1.
  • the second solid phase extraction column SPE2 is supplied to the fractional sample eluted from the second solid phase extraction column SPE2 to the second reverse phase liquid chromatography column COL2.
  • the column select valve 330 is connected to the third solvent discharge port 334 to supply the fraction sample or the third sample into which the third solvent is introduced, the third solvent inlet port 331, and a fourth pump to supply the fourth solvent ( A fourth solvent inflow port 333 connected to P4) and a fourth solvent inflow port 333 and adjacent to the fraction sample and the third solvent inflow port 331 are provided to separate the fraction sample and the third solvent inflow port 331 and the fourth.
  • Fraction sample and third solvent inlet port 333 and selectively connected to the solvent inlet port 333, adjacent to the fourth solvent inlet port 333 is provided adjacent to the fraction sample and the third solvent inlet port 331 and the fourth
  • a fourth solvent outlet port 334 is selectively connected to the solvent inlet port 333.
  • the fraction sample and the third solvent outlet port 332 and the fraction sample and the third The first fraction sample is supplied to the first solid phase extraction column SPE1 while the solvent inlet port 331, the third solvent outlet port 334, and the second fraction sample inlet port 311 are connected to each other.
  • the fourth solvent extracts the first fractional sample from the first solid phase extraction column (SPE1) while the fourth solvent inlet port 333, the fractional sample, and the third solvent outlet port 332 are connected to each other.
  • the second solid phase extraction column (SPE2) and the second reversed phase liquid chromatography column (COL2) are introduced to equilibrate the second solid phase extraction column (SPE2) and the second reverse phase liquid chromatography column (COL2).
  • the fourth pump (P4) is a solution of 0.1% formic acid in water (C) is reduced from 99% to 60% and 0.1% formic acid in actonitrile (0.1% Formic acid in actonitrile)
  • the fourth solvent which is a mixed solution in which the D solution increases from 1% to 40%, is supplied to the fourth solvent inlet port 333.
  • the concentration of the D solution of the fourth solvent is gradually increased so that the first fraction sample is easily eluted from the first solid phase extraction column (SPE1) or the second fraction sample is easily eluted from the second solid phase extraction column (SPE2). To be.
  • the operation of equilibrating the first solid phase extraction column SPE1 and the first reversed phase liquid chromatography column COL1 may include a fourth solvent discharge port 334, a fraction sample, and a third solvent, as shown in FIG. 8.
  • the second fraction sample is supplied to the second solid phase extraction column SPE2, and is illustrated in FIG. 9.
  • the fourth solvent separates the second fractional sample from the second solid phase extraction column SPE2 in the second reverse phase liquid chromatography column ( Elution with COL2) and the third solvent is the first solid phase extraction column (SPE1) and the first reversed phase liquid chromatography in the state in which the fraction sample and the third solvent inlet port 331 and the fraction sample and the third solvent outlet port 332 are connected.
  • the first solid phase extraction column (SPE1) and the first reversed phase are introduced into the chromatography column (COL1). Equilibrate the liquid chromatography column (COL1).
  • the double column valve 400 according to the present embodiment is different during the separation analysis of the fraction sample in either the first reverse phase liquid chromatography column (COL1) or the second reverse phase liquid chromatography column (COL2) It is responsible for equilibrating the column.
  • the double column valve 400 includes a first solid phase extraction column SPE1 connected to the first reverse phase liquid chromatography column COL1 and a second solid phase extraction column SPE2 connected to the second reverse phase liquid chromatography column COL2. It includes.
  • the fraction sample is supplied to the second reverse phase liquid chromatography column COL2 through the first solid phase extraction column SPE1 or the second reverse phase liquid chromatography column COL1 or the second solid phase extraction column SPE2.
  • the double column valve 400 causes the first to tenth fraction samples to be alternately supplied to the first reverse phase liquid chromatography column COL1 or the second reverse phase liquid chromatography column COL2, and also to the first reverse phase liquid.
  • a column selector valve 330 which allows equilibration of the other columns simultaneously during the separation analysis of the fraction sample in either the chromatography column (COL1) or the second reversed phase liquid chromatography column (COL2). do.
  • the double column valve 400 is the first solid-phase extraction column connecting port 412 and the first solid-phase extraction column path port 413 respectively connected to both ends of the first solid-phase extraction column (SPE1), the fraction sample and A first solid phase extraction column inlet port 411 connected to the third solvent outlet port 332 and selectively connected to the first solid phase extraction column connection port 412 and the first solid phase extraction column path port 413; 1 of the first reverse phase liquid chromatography column port 414 connected to the reversed phase liquid chromatography column COL1 and connected to or disconnected from the first solid phase extraction column connecting port 412, and the second solid phase extraction column SPE2.
  • a second reverse phase liquid chromatography column port connected to the second solid phase extraction column inlet port 431 and the second reverse phase liquid chromatography column COL2 and connected to or disconnected from the second solid phase extraction column connection port 432. 434).
  • the dual column valve 400 further includes a first discharge port 451 provided adjacent to the first solid phase extraction column path port 413 and connected to or disconnected from the first solid phase extraction column path port 413. In the case where the first fraction sample is supplied to the first solid phase extraction column SPE1 and concentrated, the salts are discharged to the outside through the first discharge port 451.
  • the first reverse phase liquid chromatography column (COL1) is injected with the first fractional sample to perform a separation analysis on the first fractional sample, the first reverse phase liquid chromatography column port 414 and The fourth solvent is fractionated with the fourth solvent inlet port 333 while the first solid phase extraction column connection port 412, the first solid phase extraction column path port 413, and the first solid phase extraction column inlet port 411 are connected to each other.
  • the first solid phase extraction column (SPE1) is introduced into the first solid phase extraction column (SPE1) along the sample and the third solvent discharge port 332 to elute the first fraction sample and the first fraction sample is the first reverse phase liquid chromatography. Feed to column COL1.
  • the second reverse phase liquid chromatography column port 434 and the second When the solid phase extraction column connection port 432, the second solid phase extraction column path port 433 and the second solid phase extraction column inlet port 431 is connected, the third solvent is the fractional sample and the third solvent inlet port 331 and The second solid phase extraction column (SPE2) and the second reverse phase liquid chromatography column (COL2) are introduced through the fourth solvent outlet port 334 to the second solid phase extraction column (SPE2) and the second reverse phase liquid chromatography column (COL2). Equilibrate
  • the operation of supplying the second fractional sample to the second solid phase extraction column SPE2 includes: a second solid phase extraction column connection port 432 and a second solid phase extraction column inflow port 431;
  • the second fraction sample is supplied to the second solid phase extraction column SPE2 while the fourth solvent outlet port 334, the fraction sample, and the third solvent inlet port 331 and the third solvent outlet port 334 are connected to each other.
  • the dual column valve 400 further includes a second discharge port 453 provided adjacent to the second solid phase extraction column path port 433 and connected to or disconnected from the second solid phase extraction column path port 433. In the case where the second fraction is supplied to the second solid phase extraction column (SPE2) and concentrated, the salts are discharged to the outside through the second discharge port 453.
  • the second reversed phase liquid chromatography column port (434) and the second reverse phase liquid chromatography column (COL2) are injected with a second fractional sample to perform the separation analysis on the second fractional sample.
  • the fourth solvent is formed in the fourth solvent inflow port 333. 4 is introduced into the second solid phase extraction column (SPE2) along the solvent discharge port 334 to elute the second fraction sample from the second solid phase extraction column (SPE2) and the second fraction sample is a second reverse phase liquid chromatography column (COL2).
  • the first reverse phase liquid chromatography column port 414 and the first When the solid phase extraction column connecting port 412, the first solid phase extraction column path port 413 and the first solid phase extraction column inlet port 411 is connected to the third solvent and the fraction sample and the third solvent inlet port 331 and The first solid phase extraction column (SPE1) and the first reverse phase liquid chromatography column (COL1) flow through the fraction sample and the third solvent discharge port 332 to the first solid phase extraction column (SPE1) and the first reverse phase liquid chromatography. Equilibrate the column COL1.
  • the third to tenth fractional samples are alternately subjected to the first solid phase extraction column (SPE1) and the first reverse phase liquid chromatography column (COL1) or the second solid phase extraction column (SPE2) and the second reverse phase liquid chromatography.
  • SPE1 and the first solid phase extraction column (SPE1) and the first reverse phase liquid chromatography column (COL1) or the second solid phase extraction column (SPE2) and the second reverse phase liquid chromatography column Equilibrate for COL2).
  • the present invention can automate the discontinuous sample fractionation and integration process that lowers the complexity of the sample and increases the uniformity of the fraction sample, thereby improving fraction reproducibility and preventing the loss of the sample.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

비연속적 시료 분획 및 통합유닛과 이를 구비한 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치가 개시된다. 본 발명의 일 실시예에 따른 비연속적 시료 분획 및 통합유닛은, 분석 대상이 되는 시료를 공급하는 시료 공급모듈; 및 시료 공급모듈에 연결되어 시료를 연속적으로 공급받으며, 시료 공급모듈로부터 시료를 공급받는 총 시료공급시간을 복수 개로 균등분할한 단위 시료공급시간을 설정하고 복수의 단위 시료공급시간 각각을 복수 개로 균등분할한 단위 분획구간을 설정한 후 각각의 단위 시료공급시간 내의 대응되는 단위 분획구간 동안 공급받은 시료를 통합 저장하여 복수의 분획시료를 획득하는 시료 분획모듈을 포함한다.

Description

비연속적 시료 분획 및 통합유닛과 이를 구비한 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치
본 발명은 비연속적 시료 분획 및 통합유닛과 이를 구비한 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 시료의 복잡성을 낮추고 분획시료의 균일성을 높이는 비연속적 시료 분획 및 통합유닛과 이를 구비한 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치에 관한 것이다.
생체 내에서 특정 조건 하에 발현된 모든 단백질을 총체적으로 연구하는 학문인 단백체학(프로테오믹스)에서 액체크로마토그래피 장치와 질량 분석 기술을 연계한 방법(LC-MS/MS)이 매우 중요한 기술로 대두되고 있다.
이 중에서도 단백질을 작은 단위체인 펩티드로 가수분해하여 분석하는 바텀업 프로테오믹스(bottom-up or shotgun proteomics)방식이 널리 사용되고 있다.
바텀업 프로테오믹스 방법은 그 유용함이 증명되었지만 불가피하게 시료의 복잡성을 야기한다. 예를 들어 대략 이만 개의 유전체로부터 발현된 단백질을 펩티드로 가수분해하였을 때 수천만 종 이상의 펩티드가 얻어진다. 또한 생체 내 단백질은 넓은 범위의 농도 다이내믹레인지를(1010) 갖는다. 따라서 이러한 시료의 복잡성을 해결하고 효과적인 단백체 분석을 하기 위해서는 고분해능을 갖는 분리방법을 필요로 한다.
이러한 문제점을 해결하기 위한 기술로 이차원 액체크로마토그래피 기술이 있다. 이는 서로 다른 두 가지의 분리방법을 통합하여 사용하는 것이다.
이차원 액체크로마토그래피의 성공 여부를 결정할 수 있는 두 가지 요소가 있는데 첫 번째는 각 분리방법의 분리효율이고, 두 번째는 분리직교성 (orthogonality)이다.
분리직교성이란 각 분리방법에 의해서 시료 혼합물이 서로 다른 방식으로 즉 서로 다른 물리화학적 특성에 의해서 분리가 되어야 한다는 것이다.
최근에 많이 개발되고 사용되는 이차원 분리방법 중에 하나는 시료를 염기성의 pH하에서 소수성의 정도에 따라 분획한 뒤 분리된 분획시료들을 다시 산성의 pH 조건 하에서 소수성의 정도에 따라 분리하는 것이다(이차원 역상액체크로마토그래피-역상액체크로마토그래피, 2D RP-RPLC).
기본적으로 소수성에 의해서 두 번 분리를 하는 것은 분리직교성을 갖는다고 할 수 없지만, 서로 다른 pH조건에서 펩티드들은 고유의 아미노산 서열에 따라 서로 다른 전하 분포를 갖게 되고 따라서 동일한 펩티드일 지라도 서로 다른 정도의 소수성을 갖게 된다. 이로 인해 2D RP-RPLC 방법이 분리직교성을 갖게 된다.
하지만 2D RP-RPLC 방법이 완전한 분리직교성을 갖지는 못한다. 도 1은 pH 10에서 RPLC 분리를 한 뒤 각 분획시료를 다시 pH2.6에서 RPLC 분리를 하여 질량분석장치로 분석한 뒤 동정된 펩티드의 분포를 각 분리방법의 용출 시간에서의 분포를 나타낸 것이다. 도 1에서 보면 펩티드들이 나타나지 않은 부분들이 많이 보이는데 이것은 2D RP-RPLC 방법이 이차원 분리의 분리공간을 모두 사용하지 못했다는 것을 의미한다.
이러한 문제점을 해결하기 위해 개발된 방법이 분획 후 비연속적 통합 기술이다. 도 2a를 참조하면, 분획 후 비연속적 통합기술은 염기성 pH하에서 RPLC 분리를 할 때 용출된 순서에 따라 96개(1번~ 96번)로 나눈 뒤 다시 24개의 분획시료로 통합을 하는데 이때 연속적으로 통합하는 것이 아니라 1번부터 24번까지를 24개의 분획시료로 만든 뒤 다시 25번을 1번째 분획시료에 통합하고 26번을 2번째 분획시료에 통합한다. 이렇게 했을 때 1번째 분획시료에는 1,25,49,73번이 2번째 분획시료에는 2,26,50,74번이 마지막 24번째 분획시료에는 24,48,72,96번이 통합되게 된다. 이런 방식으로 비연속적인 통합을 하였을 때 도 2b에서 도시한 바와 같이 이차원 분리의 전체 분리공간을 사용할 수 있게 된다.
이러한 분획 후 비연속적 통합 기술을 통해 2D RP-RPLC 기술의 분리공간을 모두 활용하여 분리직교성을 확보하게 된다.
그러나, 이러한 통합 과정을 연구자가 직접 수행해야 하기 때문에 인력과 시간이 많이 필요하게 된다. 또한 오프라인 방식으로 얻어진 분획시료를 산성 pH하에서 LC-MS/MS 실험을 하기 위해서는 분획시료의 부피를 줄이고 LC-MS/MS 실험이 가능한 용매에 다시 녹여주는 등 여러 처리 단계를 필요로 하고 이 과정에서 시료의 손실이 발생할 수 있으며 실험의 재현성에도 영향을 줄 수 있다. 따라서, 이러한 과정이 시료주입 이후에 모두 자동으로 일어날 수 있는 액체크로마토그래피 장치에 대한 개발이 요구된다.
[선행기술문헌]
[비특허문헌]
비특허문헌 1: M Gilar et al, Anal Chem, 2005, 77, 6426-6434
비특허문헌 2: J.M. Park et al, Sci.Rep.5, 18189; doi:10.1038/srep18189 (2015)
따라서 본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는, 시료의 복잡성을 낮추고 분획시료의 균일성을 높이는 비연속적 시료분획 및 통합과정을 자동화하여, 분획 재현성을 향상시키며 시료의 손실을 방지할 수 있는 비연속적 시료 분획 및 통합유닛과 이를 구비한 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 분석 대상이 되는 시료를 공급하는 시료 공급모듈; 및 상기 시료 공급모듈에 연결되어 상기 시료를 연속적으로 공급받으며, 상기 시료 공급모듈로부터 상기 시료를 공급받는 총 시료공급시간을 복수 개로 균등분할한 단위 시료공급시간을 설정하고 복수의 단위 시료공급시간 각각을 복수 개로 균등분할한 단위 분획구간을 설정한 후 각각의 단위 시료공급시간 내의 대응되는 단위 분획구간 동안 공급받은 상기 시료를 통합 저장하여 복수의 분획시료를 획득하는 시료 분획모듈을 포함하는 비연속적 시료 분획 및 통합유닛이 제공될 수 있다.
상기 시료 분획모듈은, 상기 시료 공급모듈에 연결되어 상기 시료가 유입되는 제1 분획밸브; 상기 제1 분획밸브에 인접하게 마련되는 제2 분획밸브; 및 일단이 상기 제1 분획밸브에 연결되고 타단이 상기 제2 분획밸브에 연결되되, 상기 단위 시료공급시간 내의 복수의 단위 분획구간의 개수에 대응되어 복수 개 마련되며, 각각의 상기 단위 시료공급시간 내의 대응되는 상기 단위 분획구간 동안 공급받은 상기 시료를 순차로 통합 저장하는 분획시료 저장루프를 포함할 수 있다.
상기 제1 분획밸브는, 상기 시료 공급모듈로부터 상기 시료가 유입되는 분획시료 유입포트; 상기 분획시료 유입포트에 인접하게 마련되며 상기 복수의 분획시료 저장루프의 일단에 각각 연결되는 복수의 제1 분획시료 저장루프 연결포트; 및 상기 단위 분획구간에 대응하여 상기 분획시료 유입포트와 상기 복수의 제1 분획시료 저장루프 연결포트 중 어느 하나를 상호 연통되게 연결하는 제1 연결바를 포함하며, 상기 제2 분획밸브는, 상기 복수의 분획시료 저장루프의 타단이 각각 연결되는 복수의 제2 분획시료 저장루프 연결포트; 상기 복수의 제2 분획시료 저장루프 연결포트에 인접하게 마련되며 상기 복수의 분획시료 저장루프 중 어느 하나의 타단에 연결되어 상기 분획시료가 배출되는 분획시료 배출포트; 및 상기 단위 분획구간에 대응하여 상기 분획시료 배출포트와 상기 복수의 제2 분획시료 저장루프 연결포트 중 어느 하나를 상호 연통되게 연결하는 제2 연결바를 포함할 수 있다.
상기 시료 공급모듈은, 제1 용매를 공급하는 제1 펌프와 시료 주입기가 연결되는 제1 시료 공급밸브; 및 상기 제1 시료 공급밸브에 연결되며 상기 제1 시료 공급밸브로부터 상기 시료를 공급받아 상기 분획시료 유입포트로 공급하는 제2 시료 공급밸브를 포함할 수 있다.
상기 제1 시료 공급밸브는, 상기 시료 주입기에 연결되는 제1 시료 유입포트; 상기 제1 시료 유입포트에 인접하게 마련되는 제1 시료 배출포트; 상기 제1 펌프에 연결되는 제1 용매 유입포트; 상기 제1 용매 유입포트에 인접하게 마련되며 상기 제2 시료 공급밸브에 연결되는 제1 용매 배출포트; 및 시료 저장루프의 양단이 각각 연결되는 제1 시료 저장루프 연결포트와 제2 시료 저장루프 연결포트를 포함하며, 상기 제1 시료 저장루프 연결포트와 상기 제2 시료 저장루프 연결포트 각각이 상기 제1 시료 유입포트와 상기 제1 시료 배출포트에 연결된 상태에서 상기 시료가 상기 시료 저장루프에 저장되고, 상기 제1 시료 저장루프 연결포트와 상기 제2 시료 저장루프 연결포트 각각이 상기 제1 용매 유입포트와 상기 제1 용매 배출포트에 연결된 상태에서 상기 시료 저장루프에 상기 제1 용매를 주입하여 상기 시료를 상기 제2 시료 공급밸브에 공급할 수 있다.
상기 제2 시료 공급밸브는, 상기 제1 용매 배출포트에 연결되는 제2 시료 유입포트; 상기 제2 시료 유입포트에 인접하게 마련되며 상기 분획시료 유입포트에 연결되는 제2 시료 배출포트; 및 상기 제2 시료 유입포트와 상기 제2 시료 배출포트에 양단이 각각 연결되며, 상기 제2 시료 배출포트로 상기 시료가 용출되는 시료 분리칼럼을 포함하며, 상기 시료 분리칼럼에서 용출된 상기 시료는 상기 분획시료 유입포트로 공급될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 분석 대상이 되는 시료를 연속적으로 공급받으며, 상기 시료를 공급받는 총 시료공급시간을 복수 개로 균등분할한 단위 시료공급시간을 설정하고 복수의 단위 시료공급시간 각각을 복수 개로 균등분할한 단위 분획구간을 설정한 후 각각의 단위 시료공급시간 내의 대응되는 단위 분획구간 동안 공급받은 상기 시료를 통합 저장하여 획득한 복수의 분획시료를 공급하는 비연속적 시료 분획 및 통합유닛; 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼과 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼이 연결되며, 상기 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼과 연결되는 제1 고체상 추출칼럼과 상기 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼과 연결되는 제2 고체상 추출칼럼을 구비한 이중 칼럼밸브; 및 상기 비연속적 시료 분획 및 통합유닛과 상기 이중 칼럼밸브 사이에 마련되되, 상기 비연속적 시료 분획 및 통합유닛에서 순차로 공급되는 상기 분획시료를 교대로 상기 제1 고체상 추출칼럼과 상기 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼 또는 상기 제2 고체상 추출칼럼과 상기 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼에 공급하는 칼럼 선택모듈을 포함하는 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치가 제공될 수 있다.
상기 비연속적 시료 분획 및 통합유닛은, 상기 시료를 공급하는 시료 공급모듈; 및 상기 시료 공급모듈에 연결되어 상기 시료 공급모듈로부터 상기 시료를 연속적으로 공급받아 복수의 분획시료를 획득하고 상기 칼럼 선택모듈에 상기 복수의 분획시료를 순차로 공급하는 시료 분획모듈을 포함할 수 있다.
상기 시료 분획모듈은, 상기 시료 공급모듈에 연결되어 상기 시료가 유입되는 제1 분획밸브; 상기 제1 분획밸브에 인접하게 마련되는 제2 분획밸브; 및 일단이 상기 제1 분획밸브에 연결되고 타단이 상기 제2 분획밸브에 연결되되, 상기 단위 시료공급시간 내의 복수의 단위 분획구간의 개수에 대응되어 복수 개 마련되며, 각각의 상기 단위 시료공급시간 내의 대응되는 상기 단위 분획구간 동안 공급받은 상기 시료를 순차로 통합 저장하는 복수의 분획시료 저장루프를 포함할 수 있다.
상기 제1 분획밸브는, 상기 시료 공급모듈로부터 상기 시료가 유입되는 제1 분획시료 유입포트; 상기 제1 분획시료 유입포트에 인접하게 마련되며 상기 복수의 분획시료 저장루프의 일단이 각각 연결되는 복수의 제1 분획시료 저장루프 연결포트; 및 상기 단위 분획구간에 대응하여 상기 분획시료 유입포트와 상기 복수의 제1 분획시료 저장루프 연결포트 중 어느 하나를 상호 연통되게 연결하는 제1 연결바를 포함하며, 상기 제2 분획밸브는, 상기 복수의 분획시료 저장루프의 타단이 각각 연결되는 복수의 제2 분획시료 저장루프 연결포트; 상기 복수의 제2 분획시료 저장루프 연결포트에 인접하게 마련되며 상기 복수의 분획시료 저장루프 중 어느 하나의 타단이 연결되어 상기 분획시료가 배출되는 제1 분획시료 배출포트; 및 상기 단위 분획구간에 대응하여 상기 제1 분획시료 배출포트와 상기 복수의 제2 분획시료 저장루프 연결포트 중 어느 하나를 상호 연통되게 연결하는 제2 연결바를 포함할 수 있다.
상기 시료 공급모듈은, 시료 주입기로에 연결되는 제1 시료 유입포트와, 상기 제1 시료 유입포트에 인접하게 마련되는 제1 시료 배출포트와, 제1 펌프에 연결되는 제1 용매 유입포트와, 상기 제1 용매 유입포트에 인접하게 마련되는 제1 용매 배출포트와, 시료 저장루프의 양단이 각각 연결되는 제1 시료 저장루프 연결포트와 제2 시료 저장루프 연결포트를 구비한 제1 시료 공급밸브; 및 상기 제1 용매 배출포트에 연결되는 제2 시료 유입포트와, 상기 제2 시료 유입포트에 인접하게 마련되며 상기 제1 분획시료 유입포트에 연결되는 제2 시료 배출포트와, 상기 제2 시료 유입포트와 상기 제2 시료 배출포트에 양단이 각각 연결되어 상기 제2 시료 배출포트로 상기 시료가 용출되는 시료 분리칼럼을 구비한 제2 시료 공급밸브를 포함할 수 있다.
상기 칼럼 선택모듈은, 상기 제1 분획시료 배출포트에 연결되며, 상기 복수의 분획시료를 상기 제1 고체상 추출칼럼 또는 상기 제2 고체상 추출칼럼에 교대로 공급하는 경로를 제공하고 상기 제1 고체상 추출칼럼과 상기 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼 또는 상기 제2 고체상 추출칼럼과 상기 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼을 교대로 평형화하는 칼럼 평형화밸브; 및 상기 칼럼 평형화밸브에 연결되어 상기 복수의 분획시료를 공급받아 상기 제1 고체상 추출칼럼 또는 상기 제2 고체상 추출칼럼에 교대로 공급하며, 상기 제1 고체상 추출칼럼에서 상기 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼으로 상기 분획시료가 용출되거나 상기 제2 고체상 추출칼럼에서 상기 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼으로 상기 분획시료가 용출되게 하는 칼럼 선택밸브를 포함할 수 있다.
상기 칼럼 평형화밸브는, 상기 제1 분획시료 배출포트와 제2 용매를 공급하는 제2 펌프에 연결되는 제2 분획시료 유입포트; 제3 용매를 공급하는 제3 펌프에 연결되어 상기 제3 용매가 유입되는 제3 용매 유입포트; 상기 제2 분획시료 유입포트에 인접하게 마련되어 상기 제2 분획시료 유입포트와 상기 제3 용매 유입포트에 선택적으로 연결되는 제2 분획시료 배출포트; 및 상기 제3 용매 유입포트에 인접하게 마련되어 상기 제2 분획시료 유입포트와 상기 제3 용매 유입포트에 선택적으로 연결되는 제3 용매 배출포트를 포함하며, 상기 제2 분획시료 유입포트와 상기 제3 용매 배출포트가 연결된 상태에서 상기 제2 용매가 주입된 상기 분획시료가 상기 칼럼 선택밸브를 거쳐 상기 제1 고체상 추출칼럼 또는 상기 제2 고체상 추출칼럼으로 공급되고, 상기 제3 용매 유입포트와 상기 제3 용매 배출포트가 연결된 상태에서 상기 제3 용매가 상기 칼럼 선택밸브를 거쳐 상기 제1 고체상 추출칼럼과 상기 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼 또는 상기 제2 고체상 추출칼럼과 상기 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼을 교대로 평형화할 수 있다.
상기 칼럼 선택밸브는, 상기 제3 용매 배출포트에 연결되어 상기 분획시료 또는 상기 제3 용매가 유입되는 분획시료 및 제3 용매 유입포트; 제4 용매를 공급하는 제4 펌프에 연결되어 상기 제4 용매가 유입되는 제4 용매 유입포트; 상기 분획시료 및 제3 용매 유입포트에 인접하게 마련되어 상기 분획시료 및 제3 용매 유입포트와 상기 제4 용매 유입포트에 선택적으로 연결되는 분획시료 및 제3 용매 배출포트; 및 상기 제4 용매 유입포트에 인접하게 마련되어 상기 분획시료 및 제3 용매 유입포트와 상기 제4 용매 유입포트에 선택적으로 연결되는 제4 용매 배출포트를 포함하며, 상기 분획시료 및 제3 용매 유입포트와 상기 분획시료 및 제3 용매 배출포트가 연결되어 상기 분획시료가 상기 제1 고체상 추출칼럼으로 공급된 후 상기 제4 용매 유입포트와 상기 분획시료 및 제3 용매 배출포트가 연결된 상태에서 상기 제4 용매가 상기 분획시료를 상기 제1 고체상 추출칼럼에서 상기 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼으로 용출하고 상기 분획시료 및 제3 용매 유입포트와 상기 제4 용매 배출포트가 연결된 상태에서 상기 제3 용매가 상기 제2 고체상 추출칼럼과 상기 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼을 평형화하며, 상기 분획시료 및 제3 용매 유입포트와 상기 제4 용매 배출포트가 연결되어 상기 분획시료가 상기 제2 고체상 추출칼럼으로 공급된 후 상기 제4 용매 유입포트와 상기 제4 용매 배출포트가 연결된 상태에서 상기 제4 용매가 상기 분획시료를 상기 제2 고체상 추출칼럼에서 상기 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼으로 용출하고 상기 분획시료 및 제3 용매 유입포트와 상기 분획시료 및 제3 용매 배출토트가 연결된 상태에서 상기 제3 용매가 상기 제1 고체상 추출칼럼과 상기 제1 역상 액체크로마토그레피 칼럼을 평형화할 수 있다.
상기 이중 칼럼밸브는, 상기 제1 고체상 추출칼럼의 양단에 각각 연결되는 제1 고체상 추출칼럼 연결포트와 제1 고체상 추출칼럼 경로포트; 상기 분획시료 및 제3 용매 배출포트와 연결되되, 상기 제1 고체상 추출칼럼 연결포트와 상기 제1 고체상 추출칼럼 경로포트에 선택적으로 연결되는 제1 고체상 추출칼럼 유입포트; 상기 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼에 연결되며, 상기 제1 고체상 추출칼럼 연결포트에 연결 또는 연결해제되는 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼포트; 상기 제2 고체상 추출칼럼의 양단에 각각 연결되는 제2 고체상 추출칼럼 연결포트와 제2 고체상 추출칼럼 경로포트; 상기 제4 용매 배출포트와 연결되되, 상기 제2 고체상 추출칼럼 연결포트와 상기 제2 고체상 추출칼럼 경로포트에 선택적으로 연결되는 제2 고체상 추출칼럼 유입포트; 및 상기 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼에 연결되며, 상기 제2 고체상 추출칼럼 연결포트에 연결 또는 연결해제되는 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼포트를 포함할 수 있다.
상기 이중 칼럼밸브는, 상기 제1 고체상 추출칼럼 경로포트에 인접하게 마련되어 상기 제1 고체상 추출칼럼 경로포트에 연결 또는 연결해제되는 제1 배출포트; 및 상기 제1 배출포트에 인접하게 마련되어 상기 제2 고체상 추출칼럼 경로포트에 연결 또는 연결해제되는 제2 배출포트를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예는 각각의 단위 시료공급시간 내의 대응되는 단위 분획구간 동안 공급받은 시료를 통합 저장하여 복수의 분획시료를 자동으로 얻을 수 있는 비연속적 시료 분획 및 통합유닛을 구비함으로써, 시료의 복잡성을 낮추고 분획시료의 균일성을 높이며, 분획 재현성을 향상시킬 수 있으며 아울러 시료의 손실을 방지할 수 있다.
도 1은 pH 10에서 RPLC 분리를 한 뒤 각 분획시료를 다시 pH2.6에서 RPLC 분리를 하여 질량분석장치로 분석한 뒤 동정된 펩티드의 분포를 나타내는 도면이다.
도 2는 시료를 분획 후 비연속적으로 통합하는 기술을 설명하기 위한 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치로서, 제1 분획시료의 획득 동작을 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치로서, 제2 분획시료의 획득 동작을 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치로서, 제10 분획시료의 획득 동작을 나타내는 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치로서, 제1 분획시료를 제1 고체상 추출칼럼에 공급하는 동작을 나타내는 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치로서, 제1 분획시료를 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼에 공급하고 제2 고체상 추출칼럼과 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼을 평형화하는 동작을 나타내는 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치로서, 제2 분획시료를 제2 고체상 추출칼럼에 공급하는 동작을 나타내는 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치로서, 제2 분획시료를 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼에 공급하고 제1 고체상 추출칼럼과 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼을 평형화하는 동작을 나타내는 도면이다.
본 발명과 본 발명의 동작상의 이점 및 본 발명의 실시에 의하여 달성되는 목적을 충분히 이해하기 위해서는 본 발명의 바람직한 실시 예를 예시하는 첨부 도면 및 첨부 도면에 기재된 내용을 참조하여야만 한다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 예를 설명함으로써, 본 발명을 상세히 설명한다. 각 도면에 제시된 동일한 참조부호는 동일한 부재를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치로서, 제1 분획시료의 획득 동작을 나타내는 도면이고, 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치로서, 제2 분획시료의 획득 동작을 나타내는 도면이고, 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치로서, 제10 분획시료의 획득 동작을 나타내는 도면이고, 도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치로서, 제1 분획시료를 제1 고체상 추출칼럼에 공급하는 동작을 나타내는 도면이고, 도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치로서, 제1 분획시료를 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼에 공급하고 제2 고체상 추출칼럼과 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼을 평형화하는 동작을 나타내는 도면이고, 도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치로서, 제2 분획시료를 제2 고체상 추출칼럼에 공급하는 동작을 나타내는 도면이고, 도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치로서, 제2 분획시료를 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼에 공급하고 제1 고체상 추출칼럼과 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼을 평형화하는 동작을 나타내는 도면이다.
도 3 내지 도 5를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치(100)는 분석 대상이 되는 시료를 연속적으로 공급받아 복수의 분획시료를 획득하여 공급하는 비연속적 시료 분획 및 통합유닛(200)과, 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL1)과 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL2)이 연결되며 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL1)과 연결되는 제1 고체상 추출칼럼(SPE1)과 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL2)과 연결되는 제2 고체상 추출칼럼(SPE2)을 구비한 이중 칼럼밸브(400)와, 비연속적 시료 분획 및 통합유닛(200)과 이중 칼럼밸브(400) 사이에 마련되어 비연속적 시료 분획 및 통합유닛(200)에서 순차로 공급되는 복수의 분획시료를 교대로 제1 고체상 추출칼럼(SPE1)과 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL1) 또는 제2 고체상 추출칼럼(SPE2)과 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL2)에 공급하는 칼럼 선택모듈(300)을 포함한다.
도 3 내지 도 5를 참조하면, 본 실시예에 따른 비연속적 시료 분획 및 통합유닛(200)은 시료 주입기(S)로부터 연속적으로 공급받은 시료로부터 복수의 분획시료를 획득하는 역할을 한다.
본 실시예에 따른 복수의 분획시료에 대하여 설명하면 다음과 같다.
먼저, 시료를 공급받는 총 시료공급시간을 복수 개로 균등분할한 단위 시료공급시간을 설정한다. 그리고, 복수의 단위 시료공급시간 각각을 복수 개로 균등분할한 단위 분획구간을 설정한다. 그리고 복수의 분획시료는 각각의 단위 시료공급시간 내의 대응되는 단위 분획구간 동안 공급받은 시료를 통합 저장하여 획득한다.
예를 들어, 총 시료공급시간이 100분인 경우에 총 시료공급시간을 5개로 균등분할한 단위 시료공급시간은 각각 20분 간격이다. 즉 제1 단위 시료공급시간은 0~20분이며, 제2 내지 제5 단위 시료공급시간은 각각 20~40분, 40~60분, 60~80분, 80~100분에 해당된다.
그리고, 제1 내지 제5 단위 시료공급시간은 10개로 균등분할한 단위 분획구간을 가질 수 있다. 예를 들어, 제1 단위 시료공간시간 동안 제1 단위 분획구간은 0~2분이며, 제2 내지 제10 단위 분획구간은 각각 2~4분, 4~6분, 6~8분, 8~10분, 10~12분, 12~14분, 14~16분, 16~18분, 18~20분에 해당된다. 그리고, 제2 단위 시료공간시간 동안 제1 단위 분획구간은 20~22분이며, 제2 내지 제10 단위 분획구간은 각각 22~24분, 24~26분, 26~28분, 28~30분, 30~32분, 32~34분, 34~36분, 36~38분, 38~40분에 해당된다.
본 실시예에서는 제1 내지 제5 단위 시료공급시간 내의 대응되는 제1 내지 제10 단위 분획구간 동안 공급받은 시료를 통합 저장하여 복수의 분획시료를 얻는 것이다. 예를 들어, 제1 단위 시료공급시간 내지 제5 단위 시료공급시간 내의 제1 단위 분획구간(즉, 0~2분, 20~22분, 40~42분, 60~62분, 80~82분)에 공급되는 시료를 통합 저장하여 제1 분획시료를 얻는 것이다. 제2 분획시료 내지 제10 분획시료는 제1 분획시료를 획득하는 과정과 동일하므로 이에 대한 상세한 설명은 생략하기로 한다.
또한, 본 실시예에서는 총 시료공급시간을 100분으로 설정하고, 제1 내지 제5 단위 시료공급시간으로 설정하며, 각각의 단위 시료공급시간을 10개의 단위 분획구간으로 설정하였으나, 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니며 총 시료공급시간, 단위 시료공급시간 및 단위 분획구간은 다양하게 설정가능하다.
본 실시예에 따른 비연속적 시료 분획 및 통합유닛(200)은 시료를 공급하는 시료 공급모듈(210)과, 시료 공급모듈(210)에 연결되어 시료 공급모듈(210)로부터 시료를 연속적으로 공급받아 복수의 분획시료를 획득하고 칼럼 선택모듈(300)에 복수의 분획시료를 순차로 공급하는 시료 분획모듈(250)을 포함한다.
본 실시예에 따른 시료 공급모듈(210)은 시료를 연속적으로 시료 분획모듈(250)에 공급하는 역할을 한다.
시료 공급모듈(210)은 제1 용매를 공급하는 제1 펌프(P1)와 시료 주입기(S)가 연결되는 제1 시료 공급밸브(220)와, 제1 시료 공급밸브(220)에 연결되며 제1 시료 공급밸브(220)로부터 시료를 공급받아 시료 분획모듈(250)로 공급하는 제2 시료 공급밸브(240)를 포함한다.
제1 시료 공급밸브(220)는 시료 주입기(S)로부터 시료를 공급받아 시료 저장루프(221)에 저장한 후 제1 펌프(P1)로부터 제1 용매를 공급받아 시료 저장루프(221)에 저장된 시료를 제2 시료 공급밸브(240)로 공급하는 역할을 한다.
이를 위해 제1 시료 공급밸브(220)는 시료 주입기(S)에 연결되는 제1 시료 유입포트(222)와, 제1 시료 유입포트(222)에 인접하게 마련되는 제1 시료 배출포트(223)와, 제1 펌프(P1)에 연결되는 제1 용매 유입포트(226)와, 제1 용매 유입포트(226)에 인접하게 마련되며 제2 시료 공급밸브(240)에 연결되는 제1 용매 배출포트(227)와, 시료 저장루프(221)의 양단이 각각 연결되는 제1 시료 저장루프 연결포트(224)와 제2 시료 저장루프 연결포트(225)를 포함한다.
도시되지는 않았으나, 시료 저장루프(221)의 양단에 각각 연결된 제1 시료 저장루프 연결포트(224)와 제2 시료 저장루프 연결포트(225)가 각각 제1 시료 유입포트(222)와 제1 시료 배출포트(223)에 연결된 상태에서 시료 주입기(S)를 통해 시료가 제1 시료 유입포트(222)로 공급되고 시료 저장루프(221)에 연속적으로 저장된다.
그리고, 제1 시료 저장루프 연결포트(224)와 제2 시료 저장루프 연결포트(225)가 각각 제1 용매 유입포트(226)와 제1 용매 배출포트(227)에 연결된 상태에서 제1 펌프(P1)를 통해 제1 용매 유입포트(226)에 제1 용매를 주입하고 시료 저장루프(221)에 저장된 시료를 제2 시료 공급밸브(240)에 연속적으로 공급한다. 이때, 제1 펌프(P1)는 10mM 중탄산 트리에틸암모늄 수용액(10 mM Triethylammonium bicarbonate(TEAB) in water)인 A용액 99%와 10mM 중탄산 트리에틸암모늄 아세토니트릴 용액(10 mM Triethylammonium bicarbonate(TEAB) in acetonitrile)인 B용액 1%가 혼합된 용액으로 ph 7.5를 가지는 제1 용매를 제1 용매 유입포트(226)에 공급한다.
또한, 제2 시료 공급밸브(240)는 제1 시료 공급밸브(220)에서 공급된 시료를 시료 분리칼럼(243)에 연속적으로 주입하고 시료 분리칼럼(243)에 주입된 시료를 시료 분획모듈(250)로 연속적으로 공급하는 역할을 한다.
제2 시료 공급밸브(240)는 제1 용매 배출포트(227)에 연결되는 제2 시료 유입포트(241)와, 제2 시료 유입포트(241)에 인접하게 마련되며 제1 분획시료 유입포트(261)에 연결되는 제2 시료 배출포트(242)와, 제2 시료 유입포트(241)와 제2 시료 배출포트(242)에 양단이 각각 연결되며 제2 시료 배출포트(242)로 시료가 분리 용출되는 시료 분리칼럼(243)을 포함한다.
시료 저장루프(221)에 저장된 시료는 제1 용매에 의해 제1 용매 배출포트(227)와 제2 시료 유입포트(241)를 통해 시료 분리칼럼(243)에 주입된다. 그리고, 시료 분리칼럼(243)에 주입된 시료는 제1 펌프(P1)에서 공급되는 제1 용매에 의해 분리 용출된 후 제2 시료 배출포트(242)를 따라 후술할 시료 분획모듈(250)로 공급된다. 이때, 제1 펌프(P1)는 10mM 중탄산 트리에틸암모늄 수용액(10 mM Triethylammonium bicarbonate(TEAB) in water)인 A용액이 99%에서 50%로 감소되고 10mM 중탄산 트리에틸암모늄 아세토니트릴 용액(10 mM Triethylammonium bicarbonate(TEAB) in acetonitrile)인 B용액이 1%에서 50%로 증가되는 혼합 용액인 제1 용매를 제1 용매 유입포트(226)에 공급한다. 이처럼, 제1 용매의 B용액의 농도를 점차 증가시켜 시료 분리칼럼(243)에서 시료가 용이하게 용출되게 한다.
본 실시예에 따른 시료 분획모듈(250)은 시료 공급모듈(210)에서 연속적으로 공급된 시료로부터 10개의 분획시료를 획득하는 역할을 한다.
시료 분획모듈(250)은 시료 공급모듈(210)에 연결되어 시료가 유입되는 제1 분획밸브(260)와, 제1 분획밸브(260)에 인접하게 마련되는 제2 분획밸브(280)와, 일단이 제1 분획밸브(260)에 연결되고 타단이 제2 분획밸브(280)에 연결되는 복수의 분획시료 저장루프(284a 내지 284j)를 포함한다.
본 실시예에서 각각의 단위 시료공급시간은 10개의 단위 분획구간을 가지므로 분획시료 저장루프(284a 내지 284j)는 단위 시료공급시간 내의 대응되는 단위 분획구간 개수에 대응되게 10개 마련된다.
그리고, 제1 분획밸브(260)는 제2 시료 배출포트(242)로부터 시료가 유입되는 제1 분획시료 유입포트(261)와, 제1 분획시료 유입포트(261)에 인접하게 마련되며 복수의 분획시료 저장루프(284a 내지 284j)의 일단에 각각 연결되는 복수의 제1 분획시료 저장루프 연결포트(262)와, 단위 분획구간에 대응하여 제1 분획시료 유입포트(261)와 복수의 제1 분획시료 저장루프 연결포트(262) 중 어느 하나를 상호 연통되게 연결하는 제1 연결바(263)를 포함한다. 본 실시예에서 제1 분획시료 저장루프 연결포트(262)는 10개의 분획시료 저장루프(284a 내지 284j)의 개수에 대응하여 10개 마련된다.
또한, 제2 분획밸브(280)는 복수의 분획시료 저장루프(284a 내지 284j)의 타단이 각각 연결되는 복수의 제2 분획시료 저장루프 연결포트(282)와, 복수의 제2 분획시료 저장루프 연결포트(282)에 인접하게 마련되며 복수의 분획시료 저장루프(284a 내지 284j) 중 어느 하나의 타단에 연결되어 분획시료가 배출되는 제1 분획시료 배출포트(281)와, 단위 분획구간에 대응하여 제1 분획시료 배출포트(281)와 복수의 제2 분획시료 저장루프 연결포트(282) 중 어느 하나를 상호 연통되게 연결하는 제2 연결바(283)를 포함한다. 본 실시예에서 제2 분획시료 저장루프 연결포트(282)는 10개의 분획시료 저장루프(284a 내지 284j)의 개수에 대응하여 10개 마련된다.
먼저, 제1 단위 시료공급시간(0~20분) 내의 제1 단위 분획구간 내지 제10 단위 분획구간에서 제1 내지 제10 분획시료를 획득하는 과정을 설명하면 다음과 같다.
도 3에서 도시한 바와 같이 제1 단위 분획구간(0~2분)에서 제1 분획시료를 획득하는 동작은 다음과 같다.
제1 연결바(263)는 복수의 제1 분획시료 저장루프 연결포트(262) 중 제1 분획시료 저장루프(284a)의 일단에 연결된 제1 분획시료 저장루프 연결포트(262)에 연결되고, 제2 연결바(283)는 복수의 제2 분획시료 저장루프 연결포트(282) 중 제1 분획시료 저장루프(284a)의 타단에 연결되는 제2 분획시료 저장루프 연결포트(282)에 연결된다.
그리고, 제1 용매 배출포트(227)와 제2 시료 유입포트(241)가 연결된 상태에서 제1 펌프(P1)에서 제1 용매를 시료 분리칼럼(243)으로 공급하여 시료 분리칼럼(243)에서 시료를 분리 용출시키며, 시료 분리칼럼(243)에서 분리 용출된 시료를 제2 시료 배출포트(242)를 통해 제1 분획시료 유입포트(261)를 거쳐 제1 분획시료 저장루프(284a)에 공급하여 저장한다.
또한, 도 4에서 도시한 바와 같이 제2 단위 분획구간(2~4분)에서 제2 분획시료를 획득하는 동작은 다음과 같다.
제1 연결바(263)는 복수의 제1 분획시료 저장루프 연결포트(262) 중 제2 분획시료 저장루프(284b)의 일단에 연결된 제1 분획시료 저장루프 연결포트(262)에 연결되고, 제2 연결바(283)는 복수의 제2 분획시료 저장루프 연결포트(282) 중 제2 분획시료 저장루프(284b)의 타단에 연결되는 제2 분획시료 저장루프 연결포트(282)에 연결된다.
그리고, 제1 용매 배출포트(227)와 제2 시료 유입포트(241)가 연결된 상태에서 제1 펌프(P1)에서 제1 용매를 시료 분리칼럼(243)으로 공급하여 시료 분리칼럼(243)에서 시료를 분리 용출시키며, 시료 분리칼럼(243)에서 분리 용출된 시료를 제2 시료 배출포트(242)를 통해 제1 분획시료 유입포트(261)를 거쳐 제2 분획시료 저장루프(284b)에 공급하여 저장한다.
또한, 도 5에서 도시한 바와 같이 제10 단위 분획구간(18~20분)에서 제10 분획시료를 획득하는 동작은 다음과 같다.
제1 연결바(263)는 복수의 제1 분획시료 저장루프 연결포트(262) 중 제10 분획시료 저장루프(284j)의 일단에 연결된 제1 분획시료 저장루프 연결포트(262)에 연결되고, 제2 연결바(283)는 복수의 제2 분획시료 저장루프 연결포트(282) 중 제10 분획시료 저장루프(284j)의 타단에 연결되는 제2 분획시료 저장루프 연결포트(282)에 연결된다.
그리고, 제1 용매 배출포트(227)와 제2 시료 유입포트(241)가 연결된 상태에서 제1 펌프(P1)에서 제1 용매를 시료 분리칼럼(243)으로 공급하여 시료 분리칼럼(243)에서 시료를 분리 용출시키며, 시료 분리칼럼(243)에서 분리 용출된 시료를 제2 시료 배출포트(242)를 통해 제1 분획시료 유입포트(261)를 거쳐 제10 분획시료 저장루프(284j)에 공급하여 저장한다.
그리고, 제2 내지 제5 단위 시료공급시간(20~40분, 40~60분, 60~80분, 80~100분)에서 상기한 제1 단위 시료공급시간(0~20분) 내의 제1 단위 분획구간 내지 제10 단위 분획구간에서 제1 내지 제10 분획시료를 획득하는 과정을 반복하여 제1 내지 제10 분획시료를 획득할 수 있다. 예를 들어 제1 단위 시료공급시간 내지 제5 단위 시료공급시간 내의 제1 단위 분획구간(즉, 0~2분, 20~22분, 40~42분, 60~62분, 80~82분)에 공급되는 시료를 통합 저장하여 제1 분획시료를 얻는 것이다.
한편, 상기한 시료 분획모듈(250)에서 획득한 제1 내지 제10 분획시료에 대한 분리 분석을 위해 제1 내지 제10 분획시료를 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL1) 또는 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL2)으로 공급한다.
이를 위해 본 실시예에 따른 칼럼 선택모듈(300)은 시료 분획모듈(250)에서 순차로 공급되는 제1 내지 제10 분획시료를 교대로 후술할 이중 칼럼밸브(400)에 구비된 제1 고체상 추출칼럼(SPE1)과 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL1) 또는 제2 고체상 추출칼럼(SPE2)과 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL2)에 공급하는 역할을 한다.
또한, 칼럼 선택모듈(300)은 제1 내지 제10 분획시료를 제1 고체상 추출칼럼(SPE1)과 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL1) 또는 제2 고체상 추출칼럼(SPE2)과 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL2) 중 어느 하나에 공급하여 분획시료에 대한 분리 분석과정을 수행하는 동안 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL1) 또는 제2 고체상 추출칼럼(SPE2)과 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL2) 중 나머지 하나에 대한 평형화 과정을 동시에 수행하는 역할을 한다.
이러한 칼럼 선택모듈(300)은 제1 분획시료 배출포트(281)에 연결되며 복수의 분획시료를 제1 고체상 추출칼럼(SPE1) 또는 제2 고체상 추출칼럼(SPE2)에 교대로 공급하는 경로를 제공하고 제1 고체상 추출칼럼(SPE1)과 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL1) 또는 제2 고체상 추출칼럼(SPE2)과 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL2)을 교대로 평형화하는 칼럼 평형화밸브(310)와, 칼럼 평형화밸브(310)에 연결되어 복수의 분획시료를 공급받아 제1 고체상 추출칼럼(SPE1) 또는 제2 고체상 추출칼럼(SPE2)에 교대로 공급하며 제1 고체상 추출칼럼(SPE1)에서 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL1)으로 분획시료가 분리 용출되거나 제2 고체상 추출칼럼(SPE2)에서 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL2)으로 분획시료가 분리 용출되게 하는 칼럼 선택밸브(330)를 포함한다.
본 실시예에 따른 칼럼 평형화밸브(310)는 제1 내지 제10 분획시료가 교대로 제1 고체상 추출칼럼(SPE1) 또는 제2 고체상 추출칼럼(SPE2)으로 공급되는 경로를 제공하는 역할을 한다.
칼럼 평형화밸브(310)는 제1 분획시료 배출포트(281)와 제2 용매를 공급하는 제2 펌프(P2)에 연결되는 제2 분획시료 유입포트(311)와, 제3 용매를 공급하는 제3 펌프(P3)에 연결되어 제3 용매가 유입되는 제3 용매 유입포트(313)와, 제2 분획시료 유입포트(311)에 인접하게 마련되어 제2 분획시료 유입포트(311)와 제3 용매 유입포트(313)에 선택적으로 연결되는 제2 분획시료 배출포트(312)와, 제3 용매 유입포트(313)에 인접하게 마련되어 제2 분획시료 유입포트(311)와 제3 용매 유입포트(313)에 선택적으로 연결되는 제3 용매 배출포트(334)를 포함한다.
도 6을 참조하면 제2 분획시료 유입포트(311)는 제1 분획시료 배출포트(281)와 연결되고 제2 분획시료 유입포트(311)가 제3 용매 배출포트(334)와 연결된 상태에서 제1 분획시료 저장루프(284a)에 저장된 제1 분획시료가 후술할 이중 선택밸브의 제1 고체상 추출칼럼(SPE1)에 공급된다. 또한 도 8을 참조하면 제2 분획시료 유입포트(311)는 제1 분획시료 배출포트(281)와 연결되고 제2 분획시료 유입포트(311)가 제3 용매 배출포트(334)와 연결된 상태에서 제2 분획시료 저장루프(284b)에 저장된 제2 분획시료가 후술할 이중 선택밸브의 제2 고체상 추출칼럼(SPE2)에 공급된다.
상기와 같이 제1 내지 제10 분획시료 저장루프(284a 내지 284j)에 저장된 제1 내지 제10 분획시료는 제1 분획시료 배출포트(281)와 제2 분획시료 유입포트(311)와 제3 용매 배출포트(334)와 연결된 상태에서 제1 고체상 추출칼럼(SPE1) 또는 제2 고체상 추출칼럼(SPE2)으로 교대로 공급될 수 있다.
이때, 제1 내지 제10 분획시료 저장루프(284a 내지 284j)에서 배출되는 제1 내지 제10 분획시료는 제1 분획시료 배출포트(281)와 제2 분획시료 유입포트(311)를 연결하는 라인 상에 배치된 제2 펌프(P2)를 통해 제2 용매를 공급받는다. 여기서, 제2 펌프(P2)는 0.2% 트리플루오로아세트산 수용액(0.2% Trifluoroacetic acid (TFA) in water)인 제2 용매를 공급한다. 그리고, 제1 펌프(P1)는 10mM 중탄산 트리에틸암모늄 수용액(10 mM Triethylammonium bicarbonate(TEAB) in water)인 A용액 99%와 10mM 중탄산 트리에틸암모늄 아세토니트릴 용액(10 mM Triethylammonium bicarbonate(TEAB) in acetonitrile)인 B용액 1%가 혼합된 용액인 제1 용매를 제1 용매 유입포트(226)에 공급한다. 또한, 제1 펌프(P1)에서 공급되는 제1 용매와 제2 펌프(P2)에서 공급되는 제2 용매의 유량의 비는 1:9일 수 있다.
이는 제1 고체상 추출칼럼(SPE1) 또는 제2 고체상 추출칼럼(SPE2)으로 공급되는 제1 내지 제10 분획시료에 제2 용매를 주입하여 제1 내지 제10 분획시료를 희석하여 산성화시켜 제1 내지 제10 분획시료가 제1 고체상 추출칼럼(SPE1) 또는 제2 고체상 추출칼럼(SPE2)에서 유실되는 것을 방지하고 유기용매의 조성을 낮추기 위함이다.
그리고, 도 7을 참조하면, 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL1)에 저장된 제1 분획시료에 대한 분리 분석과정을 수행하는 동안 제3 용매 유입포트(313)와 제3 용매 배출포트(334)가 연결된 상태에서 제3 용매가 칼럼 선택밸브(330)를 거쳐 제2 고체상 추출칼럼(SPE2)과 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL2)을 평형화한다. 또한, 도 9를 참조하면, 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL2)에 저장된 제2 분획시료에 대한 분리 분석과정을 수행하는 동안 제3 용매 유입포트(313)와 제3 용매 배출포트(334)가 연결된 상태에서 제3 용매가 칼럼 선택밸브(330)를 거쳐 제1 고체상 추출칼럼(SPE1)과 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL1)을 평형화한다.
본 실시예에서 제3 용매는 0.1 % 포름산 수용액(0.1% Formic acid in water)이 사용되나, 이에 한정되지 않고 제1 고체상 추출칼럼(SPE1)과 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL1) 및 제2 고체상 추출칼럼(SPE2)과 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL2)을 평형화할 수 있는 수용성 용액이면 어느 것이든 사용가능하다.
본 실시예에 따른 칼럼 선택밸브(330)는 칼럼 평형화밸브(310)로부터 복수의 분획시료를 공급받고 복수의 분획시료를 교대로 제1 고체상 추출칼럼(SPE1) 또는 제2 고체상 추출칼럼(SPE2)에 공급하는 역할을 한다. 또한, 칼럼 선택밸브(330)는 제4 용매를 제1 고체상 추출칼럼(SPE1)에 공급하여 제1 고체상 추출칼럼(SPE1)에서 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL1)으로 분획시료가 용출되게 하거나 제2 고체상 추출칼럼(SPE2)에 공급하여 제2 고체상 추출칼럼(SPE2)에서 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL2)으로 분획시료가 용출되게 하는 역할을 한다.
칼럼 선택밸브(330)는 제3 용매 배출포트(334)에 연결되어 분획시료 또는 제3 용매가 유입되는 분획시료 및 제3 용매 유입포트(331)와, 제4 용매를 공급하는 제4 펌프(P4)에 연결되어 제4 용매가 유입되는 제4 용매 유입포트(333)와, 분획시료 및 제3 용매 유입포트(331)에 인접하게 마련되어 분획시료 및 제3 용매 유입포트(331)와 제4 용매 유입포트(333)에 선택적으로 연결되는 분획시료 및 제3 용매 배출포트(332)와, 제4 용매 유입포트(333)에 인접하게 마련되어 분획시료 및 제3 용매 유입포트(331)와 제4 용매 유입포트(333)에 선택적으로 연결되는 제4 용매 배출포트(334)를 포함한다.
제2 고체상 추출칼럼(SPE2)과 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL2)을 평형화하는 동작을 살펴보면, 도 6에서 도시한 바와 같이 분획시료 및 제3 용매 배출포트(332)와 분획시료 및 제3 용매 유입포트(331)와 제3 용매 배출포트(334)와 제2 분획시료 유입포트(311)가 연결된 상태에서 제1 분획시료가 제1 고체상 추출칼럼(SPE1)으로 공급된다. 그리고, 도 7에서 도시한 바와 같이 제4 용매 유입포트(333)와 분획시료 및 제3 용매 배출포트(332)가 연결된 상태에서 제4 용매가 제1 분획시료를 제1 고체상 추출칼럼(SPE1)에서 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL1)으로 용출하고 분획시료 및 제3 용매 유입포트(331)와 제4 용매 배출포트(334)와 제3 용매 배출포트(334)가 연결된 상태에서 제3 용매가 제2 고체상 추출칼럼(SPE2)과 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL2)으로 유입되어 제2 고체상 추출칼럼(SPE2)과 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL2)을 평형화한다.
본 실시예에서 제4 펌프(P4)는 0.1% 포름산 수용액(0.1% Formic acid in water)인 C용액이 99%에서 60%로 감소되고 0.1% 포름산 아세토니트릴 용액(0.1% Formic acid in actonitrile)인 D용액이 1%에서 40%로 증가되는 혼합 용액인 제4 용매를 제4 용매 유입포트(333)에 공급한다. 이처럼, 제4 용매의 D용액의 농도를 점차 증가시켜 제1 고체상 추출칼럼(SPE1)에서 제1 분획시료가 용이하게 용출되게 하거나 제2 고체상 추출칼럼(SPE2)에서 제2 분획시료가 용이하게 용출되게 한다.
또한, 제1 고체상 추출칼럼(SPE1)과 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL1)을 평형화하는 동작을 살펴보면, 도 8에서 도시한 바와 같이 제4 용매 배출포트(334)와 분획시료 및 제3 용매 유입포트(331)와 제3 용매 배출포트(334)와 제2 분획시료 유입포트(311)가 연결된 상태에서 제2 분획시료가 제2 고체상 추출칼럼(SPE2)으로 공급된 후, 도 9에서 도시한 바와 같이 제4 용매 유입포트(333)와 제4 용매 배출포트(334)가 연결된 상태에서 제4 용매가 제2 분획시료를 제2 고체상 추출칼럼(SPE2)에서 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL2)으로 용출하고 분획시료 및 제3 용매 유입포트(331)와 분획시료 및 제3 용매 배출포트(332)가 연결된 상태에서 제3 용매가 제1 고체상 추출칼럼(SPE1)과 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL1)으로 유입되어 제1 고체상 추출칼럼(SPE1)과 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL1)을 평형화한다.
한편, 본 실시예에 따른 이중 칼럼밸브(400)는 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL1) 또는 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL2) 중 어느 하나에서 분획시료에 대한 분리 분석이 진행되는 동안 다른 칼럼에 대한 평형화를 수행하도록 하는 역할을 한다.
이중 칼럼밸브(400)는 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL1)에 연결되는 제1 고체상 추출칼럼(SPE1)과 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL2)에 연결되는 제2 고체상 추출칼럼(SPE2)을 포함한다. 분획시료는 제1 고체상 추출칼럼(SPE1)을 통해 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL1) 또는 제2 고체상 추출칼럼(SPE2)을 통해 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL2)으로 공급된다.
그리고, 이중 칼럼밸브(400)는 제1 내지 제10 분획시료가 교대로 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL1) 또는 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL2)으로 공급되게 하며, 또한 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL1) 또는 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL2) 중 어느 하나에서 분획시료에 대한 분리 분석이 진행되는 동안 동시에 다른 칼럼에 대한 평형화가 수행되도록 하는 칼럼 선택밸브(330)와 유체 연통된다.
이를 위해, 이중 칼럼밸브(400)는 제1 고체상 추출칼럼(SPE1)의 양단에 각각 연결되는 제1 고체상 추출칼럼 연결포트(412)와 제1 고체상 추출칼럼 경로포트(413)와, 분획시료 및 제3 용매 배출포트(332)와 연결되되 제1 고체상 추출칼럼 연결포트(412)와 제1 고체상 추출칼럼 경로포트(413)에 선택적으로 연결되는 제1 고체상 추출칼럼 유입포트(411)와, 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL1)에 연결되며 제1 고체상 추출칼럼 연결포트(412)에 연결 또는 연결해제되는 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼포트(414)과, 제2 고체상 추출칼럼(SPE2)의 양단에 각각 연결되는 제2 고체상 추출칼럼 연결포트(432)와 제2 고체상 추출칼럼 경로포트(433)와, 제4 용매 배출포트(334)와 연결되되 제2 고체상 추출칼럼 연결포트(432)와 제2 고체상 추출칼럼 경로포트(433)에 선택적으로 연결되는 제2 고체상 추출칼럼 유입포트(431)와, 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL2)에 연결되며 제2 고체상 추출칼럼 연결포트(432)에 연결 또는 연결해제되는 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼포트(434)를 포함한다.
도 6을 참조하여 제1 고체상 추출칼럼(SPE1)에 제1 분획시료가 공급되는 동작을 살펴보면, 제1 고체상 추출칼럼 연결포트(412)와 제1 고체상 추출칼럼 유입포트(411)와 분획시료 및 제3 용매 배출포트(332)와 분획시료 및 제3 용매 유입포트(331)와 제3 용매 배출포트(334)가 연결된 상태에서 제1 분획시료가 제1 고체상 추출칼럼(SPE1)으로 공급된다. 그리고, 이중 칼럼밸브(400)는 제1 고체상 추출칼럼 경로포트(413)에 인접하게 마련되어 제1 고체상 추출칼럼 경로포트(413)에 연결 또는 연결해제되는 제1 배출포트(451)를 더 포함하며, 제1 분획시료가 제1 고체상 추출칼럼(SPE1)에 공급되어 농축되는 경우에 염들은 제1 배출포트(451)를 통해 외부로 빠져나가게 된다.
그리고, 도 7을 참조하여 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL1)에 제1 분획시료를 주입하여 제1 분획시료에 대한 분리 분석을 진행하기 위해, 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼포트(414)와 제1 고체상 추출칼럼 연결포트(412)와 제1 고체상 추출칼럼 경로포트(413)와 제1 고체상 추출칼럼 유입포트(411)가 연결된 상태에서 제4 용매가 제4 용매 유입포트(333)와 분획시료 및 제3 용매 배출포트(332)를 따라 제1 고체상 추출칼럼(SPE1)으로 유입되어 제1 고체상 추출칼럼(SPE1)에서 제1 분획시료를 용출하고 제1 분획시료를 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL1)으로 공급한다. 또한, 제1 분획시료에 대한 분리 분석과 동시에 제2 고체상 추출칼럼(SPE2)과 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL2)을 평형화하기 위해, 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼포트(434)와 제2 고체상 추출칼럼 연결포트(432)와 제2 고체상 추출칼럼 경로포트(433)와 제2 고체상 추출칼럼 유입포트(431)가 연결된 상태에서 제3 용매가 분획시료 및 제3 용매 유입포트(331)와 제4 용매 배출포트(334)를 따라 제2 고체상 추출칼럼(SPE2)과 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL2)으로 유입되어 제2 고체상 추출칼럼(SPE2)과 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL2)을 평형화한다.
또한, 도 8을 참조하여 제2 고체상 추출칼럼(SPE2)에 제2 분획시료가 공급되는 동작을 살펴보면, 제2 고체상 추출칼럼 연결포트(432)와 제2 고체상 추출칼럼 유입포트(431)와 제4 용매 배출포트(334)와 분획시료 및 제3 용매 유입포트(331)와 제3 용매 배출포트(334)가 연결된 상태에서 제2 분획시료가 제2 고체상 추출칼럼(SPE2)으로 공급된다. 그리고, 이중 칼럼밸브(400)는 제2 고체상 추출칼럼 경로포트(433)에 인접하게 마련되어 제2 고체상 추출칼럼 경로포트(433)에 연결 또는 연결해제되는 제2 배출포트(453)를 더 포함하며, 제2 분획시료가 제2 고체상 추출칼럼(SPE2)에 공급되어 농축되는 경우에 염들은 제2 배출포트(453)를 통해 외부로 빠져나가게 된다.
그리고, 도 9를 참조하여 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL2)에 제2 분획시료를 주입하여 제2 분획시료에 대한 분리 분석을 진행하기 위해, 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼포트(434)와 제2 고체상 추출칼럼 연결포트(432)와 제2 고체상 추출칼럼 경로포트(433)와 제2 고체상 추출칼럼 유입포트(431)가 연결된 상태에서 제4 용매가 제4 용매 유입포트(333)와 제4 용매 배출포트(334)를 따라 제2 고체상 추출칼럼(SPE2)으로 유입되어 제2 고체상 추출칼럼(SPE2)에서 제2 분획시료를 용출하고 제2 분획시료를 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL2)으로 공급한다.
또한, 제2 분획시료에 대한 분리 분석과 동시에 제1 고체상 추출칼럼(SPE1)과 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL1)을 평형화하기 위해, 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼포트(414)와 제1 고체상 추출칼럼 연결포트(412)와 제1 고체상 추출칼럼 경로포트(413)와 제1 고체상 추출칼럼 유입포트(411)가 연결된 상태에서 제3 용매가 분획시료 및 제3 용매 유입포트(331)와 분획시료 및 제3 용매 배출포트(332)를 따라 제1 고체상 추출칼럼(SPE1)과 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL1)으로 유입되어 제1 고체상 추출칼럼(SPE1)과 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL1)을 평형화한다.
상기와 같은 방식으로 제3 내지 제10 분획시료를 교대로 제1 고체상 추출칼럼(SPE1)과 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL1) 또는 제2 고체상 추출칼럼(SPE2)과 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL2)으로 공급하여 분리 분석을 함과 동시에 제1 고체상 추출칼럼(SPE1)과 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL1) 또는 제2 고체상 추출칼럼(SPE2)과 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼(COL2)에 대한 평형화를 할 수 있다.
이와 같이 본 발명은 기재된 실시 예에 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양하게 수정 및 변형할 수 있음은 이 기술의 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다. 따라서 그러한 수정 예 또는 변형 예들은 본 발명의 특허청구범위에 속한다 하여야 할 것이다.
본 발명은 시료의 복잡성을 낮추고 분획시료의 균일성을 높이는 비연속적 시료분획 및 통합과정을 자동화하여 분획 재현성을 향상시키며 시료의 손실을 방지할 수 있다.

Claims (16)

  1. 분석 대상이 되는 시료를 공급하는 시료 공급모듈; 및
    상기 시료 공급모듈에 연결되어 상기 시료를 연속적으로 공급받으며, 상기 시료 공급모듈로부터 상기 시료를 공급받는 총 시료공급시간을 복수 개로 균등분할한 단위 시료공급시간을 설정하고 복수의 단위 시료공급시간 각각을 복수 개로 균등분할한 단위 분획구간을 설정한 후 각각의 단위 시료공급시간 내의 대응되는 단위 분획구간 동안 공급받은 상기 시료를 통합 저장하여 복수의 분획시료를 획득하는 시료 분획모듈을 포함하는 비연속적 시료 분획 및 통합유닛.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 시료 분획모듈은,
    상기 시료 공급모듈에 연결되어 상기 시료가 유입되는 제1 분획밸브;
    상기 제1 분획밸브에 인접하게 마련되는 제2 분획밸브; 및
    일단이 상기 제1 분획밸브에 연결되고 타단이 상기 제2 분획밸브에 연결되되, 상기 단위 시료공급시간 내의 복수의 단위 분획구간의 개수에 대응되어 복수 개 마련되며, 각각의 상기 단위 시료공급시간 내의 대응되는 상기 단위 분획구간 동안 공급받은 상기 시료를 순차로 통합 저장하는 분획시료 저장루프를 포함하는 비연속적 시료 분획 및 통합유닛.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 제1 분획밸브는,
    상기 시료 공급모듈로부터 상기 시료가 유입되는 분획시료 유입포트;
    상기 분획시료 유입포트에 인접하게 마련되며 상기 복수의 분획시료 저장루프의 일단에 각각 연결되는 복수의 제1 분획시료 저장루프 연결포트; 및
    상기 단위 분획구간에 대응하여 상기 분획시료 유입포트와 상기 복수의 제1 분획시료 저장루프 연결포트 중 어느 하나를 상호 연통되게 연결하는 제1 연결바를 포함하며,
    상기 제2 분획밸브는,
    상기 복수의 분획시료 저장루프의 타단이 각각 연결되는 복수의 제2 분획시료 저장루프 연결포트;
    상기 복수의 제2 분획시료 저장루프 연결포트에 인접하게 마련되며 상기 복수의 분획시료 저장루프 중 어느 하나의 타단에 연결되어 상기 분획시료가 배출되는 분획시료 배출포트; 및
    상기 단위 분획구간에 대응하여 상기 분획시료 배출포트와 상기 복수의 제2 분획시료 저장루프 연결포트 중 어느 하나를 상호 연통되게 연결하는 제2 연결바를 포함하는 비연속적 시료 분획 및 통합유닛.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 시료 공급모듈은,
    제1 용매를 공급하는 제1 펌프와 시료 주입기가 연결되는 제1 시료 공급밸브; 및
    상기 제1 시료 공급밸브에 연결되며 상기 제1 시료 공급밸브로부터 상기 시료를 공급받아 상기 분획시료 유입포트로 공급하는 제2 시료 공급밸브를 포함하는 비연속적 시료 분획 및 통합유닛.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 제1 시료 공급밸브는,
    상기 시료 주입기에 연결되는 제1 시료 유입포트;
    상기 제1 시료 유입포트에 인접하게 마련되는 제1 시료 배출포트;
    상기 제1 펌프에 연결되는 제1 용매 유입포트;
    상기 제1 용매 유입포트에 인접하게 마련되며 상기 제2 시료 공급밸브에 연결되는 제1 용매 배출포트; 및
    시료 저장루프의 양단이 각각 연결되는 제1 시료 저장루프 연결포트와 제2 시료 저장루프 연결포트를 포함하며,
    상기 제1 시료 저장루프 연결포트와 상기 제2 시료 저장루프 연결포트 각각이 상기 제1 시료 유입포트와 상기 제1 시료 배출포트에 연결된 상태에서 상기 시료가 상기 시료 저장루프에 저장되고,
    상기 제1 시료 저장루프 연결포트와 상기 제2 시료 저장루프 연결포트 각각이 상기 제1 용매 유입포트와 상기 제1 용매 배출포트에 연결된 상태에서 상기 시료 저장루프에 상기 제1 용매를 주입하여 상기 시료를 상기 제2 시료 공급밸브에 공급하는 비연속적 시료 분획 및 통합유닛.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 제2 시료 공급밸브는,
    상기 제1 용매 배출포트에 연결되는 제2 시료 유입포트;
    상기 제2 시료 유입포트에 인접하게 마련되며 상기 분획시료 유입포트에 연결되는 제2 시료 배출포트; 및
    상기 제2 시료 유입포트와 상기 제2 시료 배출포트에 양단이 각각 연결되며, 상기 제2 시료 배출포트로 상기 시료가 용출되는 시료 분리칼럼을 포함하며,
    상기 시료 분리칼럼에서 용출된 상기 시료는 상기 분획시료 유입포트로 공급되는 비연속적 시료 분획 및 통합유닛.
  7. 분석 대상이 되는 시료를 연속적으로 공급받으며, 상기 시료를 공급받는 총 시료공급시간을 복수 개로 균등분할한 단위 시료공급시간을 설정하고 복수의 단위 시료공급시간 각각을 복수 개로 균등분할한 단위 분획구간을 설정한 후 각각의 단위 시료공급시간 내의 대응되는 단위 분획구간 동안 공급받은 상기 시료를 통합 저장하여 획득한 복수의 분획시료를 공급하는 비연속적 시료 분획 및 통합유닛;
    제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼과 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼이 연결되며, 상기 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼과 연결되는 제1 고체상 추출칼럼과 상기 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼과 연결되는 제2 고체상 추출칼럼을 구비한 이중 칼럼밸브; 및
    상기 비연속적 시료 분획 및 통합유닛과 상기 이중 칼럼밸브 사이에 마련되되, 상기 비연속적 시료 분획 및 통합유닛에서 순차로 공급되는 상기 분획시료를 교대로 상기 제1 고체상 추출칼럼과 상기 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼 또는 상기 제2 고체상 추출칼럼과 상기 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼에 공급하는 칼럼 선택모듈을 포함하는 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 비연속적 시료 분획 및 통합유닛은,
    상기 시료를 공급하는 시료 공급모듈; 및
    상기 시료 공급모듈에 연결되어 상기 시료 공급모듈로부터 상기 시료를 연속적으로 공급받아 복수의 분획시료를 획득하고 상기 칼럼 선택모듈에 상기 복수의 분획시료를 순차로 공급하는 시료 분획모듈을 포함하는 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 시료 분획모듈은,
    상기 시료 공급모듈에 연결되어 상기 시료가 유입되는 제1 분획밸브;
    상기 제1 분획밸브에 인접하게 마련되는 제2 분획밸브; 및
    일단이 상기 제1 분획밸브에 연결되고 타단이 상기 제2 분획밸브에 연결되되, 상기 단위 시료공급시간 내의 복수의 단위 분획구간의 개수에 대응되어 복수 개 마련되며, 각각의 상기 단위 시료공급시간 내의 대응되는 상기 단위 분획구간 동안 공급받은 상기 시료를 순차로 통합 저장하는 복수의 분획시료 저장루프를 포함하는 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 제1 분획밸브는,
    상기 시료 공급모듈로부터 상기 시료가 유입되는 제1 분획시료 유입포트;
    상기 제1 분획시료 유입포트에 인접하게 마련되며 상기 복수의 분획시료 저장루프의 일단이 각각 연결되는 복수의 제1 분획시료 저장루프 연결포트; 및
    상기 단위 분획구간에 대응하여 상기 분획시료 유입포트와 상기 복수의 제1 분획시료 저장루프 연결포트 중 어느 하나를 상호 연통되게 연결하는 제1 연결바를 포함하며,
    상기 제2 분획밸브는,
    상기 복수의 분획시료 저장루프의 타단이 각각 연결되는 복수의 제2 분획시료 저장루프 연결포트;
    상기 복수의 제2 분획시료 저장루프 연결포트에 인접하게 마련되며 상기 복수의 분획시료 저장루프 중 어느 하나의 타단이 연결되어 상기 분획시료가 배출되는 제1 분획시료 배출포트; 및
    상기 단위 분획구간에 대응하여 상기 제1 분획시료 배출포트와 상기 복수의 제2 분획시료 저장루프 연결포트 중 어느 하나를 상호 연통되게 연결하는 제2 연결바를 포함하는 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 시료 공급모듈은,
    시료 주입기로에 연결되는 제1 시료 유입포트와, 상기 제1 시료 유입포트에 인접하게 마련되는 제1 시료 배출포트와, 제1 펌프에 연결되는 제1 용매 유입포트와, 상기 제1 용매 유입포트에 인접하게 마련되는 제1 용매 배출포트와, 시료 저장루프의 양단이 각각 연결되는 제1 시료 저장루프 연결포트와 제2 시료 저장루프 연결포트를 구비한 제1 시료 공급밸브; 및
    상기 제1 용매 배출포트에 연결되는 제2 시료 유입포트와, 상기 제2 시료 유입포트에 인접하게 마련되며 상기 제1 분획시료 유입포트에 연결되는 제2 시료 배출포트와, 상기 제2 시료 유입포트와 상기 제2 시료 배출포트에 양단이 각각 연결되어 상기 제2 시료 배출포트로 상기 시료가 용출되는 시료 분리칼럼을 구비한 제2 시료 공급밸브를 포함하는 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 칼럼 선택모듈은,
    상기 제1 분획시료 배출포트에 연결되며, 상기 복수의 분획시료를 상기 제1 고체상 추출칼럼 또는 상기 제2 고체상 추출칼럼에 교대로 공급하는 경로를 제공하고 상기 제1 고체상 추출칼럼과 상기 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼 또는 상기 제2 고체상 추출칼럼과 상기 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼을 교대로 평형화하는 칼럼 평형화밸브; 및
    상기 칼럼 평형화밸브에 연결되어 상기 복수의 분획시료를 공급받아 상기 제1 고체상 추출칼럼 또는 상기 제2 고체상 추출칼럼에 교대로 공급하며, 상기 제1 고체상 추출칼럼에서 상기 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼으로 상기 분획시료가 용출되거나 상기 제2 고체상 추출칼럼에서 상기 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼으로 상기 분획시료가 용출되게 하는 칼럼 선택밸브를 포함하는 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 칼럼 평형화밸브는,
    상기 제1 분획시료 배출포트와 제2 용매를 공급하는 제2 펌프에 연결되는 제2 분획시료 유입포트;
    제3 용매를 공급하는 제3 펌프에 연결되어 상기 제3 용매가 유입되는 제3 용매 유입포트;
    상기 제2 분획시료 유입포트에 인접하게 마련되어 상기 제2 분획시료 유입포트와 상기 제3 용매 유입포트에 선택적으로 연결되는 제2 분획시료 배출포트; 및
    상기 제3 용매 유입포트에 인접하게 마련되어 상기 제2 분획시료 유입포트와 상기 제3 용매 유입포트에 선택적으로 연결되는 제3 용매 배출포트를 포함하며,
    상기 제2 분획시료 유입포트와 상기 제3 용매 배출포트가 연결된 상태에서 상기 제2 용매가 주입된 상기 분획시료가 상기 칼럼 선택밸브를 거쳐 상기 제1 고체상 추출칼럼 또는 상기 제2 고체상 추출칼럼으로 공급되고,
    상기 제3 용매 유입포트와 상기 제3 용매 배출포트가 연결된 상태에서 상기 제3 용매가 상기 칼럼 선택밸브를 거쳐 상기 제1 고체상 추출칼럼과 상기 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼 또는 상기 제2 고체상 추출칼럼과 상기 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼을 교대로 평형화하는 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 칼럼 선택밸브는,
    상기 제3 용매 배출포트에 연결되어 상기 분획시료 또는 상기 제3 용매가 유입되는 분획시료 및 제3 용매 유입포트;
    제4 용매를 공급하는 제4 펌프에 연결되어 상기 제4 용매가 유입되는 제4 용매 유입포트;
    상기 분획시료 및 제3 용매 유입포트에 인접하게 마련되어 상기 분획시료 및 제3 용매 유입포트와 상기 제4 용매 유입포트에 선택적으로 연결되는 분획시료 및 제3 용매 배출포트; 및
    상기 제4 용매 유입포트에 인접하게 마련되어 상기 분획시료 및 제3 용매 유입포트와 상기 제4 용매 유입포트에 선택적으로 연결되는 제4 용매 배출포트를 포함하며,
    상기 분획시료 및 제3 용매 유입포트와 상기 분획시료 및 제3 용매 배출포트가 연결되어 상기 분획시료가 상기 제1 고체상 추출칼럼으로 공급된 후 상기 제4 용매 유입포트와 상기 분획시료 및 제3 용매 배출포트가 연결된 상태에서 상기 제4 용매가 상기 분획시료를 상기 제1 고체상 추출칼럼에서 상기 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼으로 용출하고 상기 분획시료 및 제3 용매 유입포트와 상기 제4 용매 배출포트가 연결된 상태에서 상기 제3 용매가 상기 제2 고체상 추출칼럼과 상기 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼을 평형화하며,
    상기 분획시료 및 제3 용매 유입포트와 상기 제4 용매 배출포트가 연결되어 상기 분획시료가 상기 제2 고체상 추출칼럼으로 공급된 후 상기 제4 용매 유입포트와 상기 제4 용매 배출포트가 연결된 상태에서 상기 제4 용매가 상기 분획시료를 상기 제2 고체상 추출칼럼에서 상기 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼으로 용출하고 상기 분획시료 및 제3 용매 유입포트와 상기 분획시료 및 제3 용매 배출토트가 연결된 상태에서 상기 제3 용매가 상기 제1 고체상 추출칼럼과 상기 제1 역상 액체크로마토그레피 칼럼을 평형화하는 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 이중 칼럼밸브는,
    상기 제1 고체상 추출칼럼의 양단에 각각 연결되는 제1 고체상 추출칼럼 연결포트와 제1 고체상 추출칼럼 경로포트;
    상기 분획시료 및 제3 용매 배출포트와 연결되되, 상기 제1 고체상 추출칼럼 연결포트와 상기 제1 고체상 추출칼럼 경로포트에 선택적으로 연결되는 제1 고체상 추출칼럼 유입포트;
    상기 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼에 연결되며, 상기 제1 고체상 추출칼럼 연결포트에 연결 또는 연결해제되는 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼포트;
    상기 제2 고체상 추출칼럼의 양단에 각각 연결되는 제2 고체상 추출칼럼 연결포트와 제2 고체상 추출칼럼 경로포트;
    상기 제4 용매 배출포트와 연결되되, 상기 제2 고체상 추출칼럼 연결포트와 상기 제2 고체상 추출칼럼 경로포트에 선택적으로 연결되는 제2 고체상 추출칼럼 유입포트; 및
    상기 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼에 연결되며, 상기 제2 고체상 추출칼럼 연결포트에 연결 또는 연결해제되는 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼포트를 포함하는 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 이중 칼럼밸브는,
    상기 제1 고체상 추출칼럼 경로포트에 인접하게 마련되어 상기 제1 고체상 추출칼럼 경로포트에 연결 또는 연결해제되는 제1 배출포트; 및
    상기 제1 배출포트에 인접하게 마련되어 상기 제2 고체상 추출칼럼 경로포트에 연결 또는 연결해제되는 제2 배출포트를 더 포함하는 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치.
PCT/KR2016/012395 2016-01-15 2016-10-31 비연속적 시료 분획 및 통합유닛과 이를 구비한 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치 WO2017122911A1 (ko)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16/070,100 US20190017974A1 (en) 2016-01-15 2016-10-31 Unit for non-continuous sample fractionation and integration, and dual online multifunctional liquid chromatography device having same
CN202111466527.XA CN114235994A (zh) 2016-01-15 2016-10-31 非连续样品分级和级联装置以及具有该装置的双在线多维液相色谱系统
EP16885222.6A EP3404408B1 (en) 2016-01-15 2016-10-31 Unit for non-continuous sample fractionation and integration, and dual online multifunctional liquid chromatography device having same
JP2018536832A JP6723365B2 (ja) 2016-01-15 2016-10-31 非連続的試料分画統合デバイス及びこれを備えた二重オンライン多次元液体クロマトグラフィーシステム
CN201680078937.8A CN108603864A (zh) 2016-01-15 2016-10-31 非连续样品分级和级联装置以及具有该装置的双在线多功能液相色谱系统
US17/512,160 US11982652B2 (en) 2016-01-15 2021-10-27 Non-contiguous sample fractionating and concatenating device and dual online multidimensional liquid chromatography system having the same

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2016-0005394 2016-01-15
KR1020160005394A KR101795747B1 (ko) 2016-01-15 2016-01-15 비연속적 시료 분획 및 통합유닛과 이를 구비한 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US16/070,100 A-371-Of-International US20190017974A1 (en) 2016-01-15 2016-10-31 Unit for non-continuous sample fractionation and integration, and dual online multifunctional liquid chromatography device having same
US17/512,160 Division US11982652B2 (en) 2016-01-15 2021-10-27 Non-contiguous sample fractionating and concatenating device and dual online multidimensional liquid chromatography system having the same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2017122911A1 true WO2017122911A1 (ko) 2017-07-20

Family

ID=59311357

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2016/012395 WO2017122911A1 (ko) 2016-01-15 2016-10-31 비연속적 시료 분획 및 통합유닛과 이를 구비한 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치

Country Status (6)

Country Link
US (2) US20190017974A1 (ko)
EP (1) EP3404408B1 (ko)
JP (1) JP6723365B2 (ko)
KR (1) KR101795747B1 (ko)
CN (2) CN108603864A (ko)
WO (1) WO2017122911A1 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3847454A1 (en) * 2018-09-05 2021-07-14 Waters Technologies Corporation Interface module for two-dimensional liquid chromatography
WO2020258705A1 (zh) * 2019-06-28 2020-12-30 信达生物制药(苏州)有限公司 模块化层析装置
CN113341030B (zh) * 2021-07-16 2023-11-07 苏州创新通用色谱仪器有限公司 一种高通量液质联用系统及分离和分析方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008185558A (ja) * 2007-01-31 2008-08-14 Shiseido Co Ltd ２次元液体クロマトグラフィー分析方法および分取用流路切り替えユニット
JP2010014429A (ja) * 2008-07-01 2010-01-21 Shimadzu Corp 液体クロマトグラフ
KR20120000538A (ko) * 2010-06-25 2012-01-02 고려대학교 산학협력단 자동화 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치
US20140373605A1 (en) * 2012-07-17 2014-12-25 Idex Health & Science Llc Liquid Sampling Valve

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6802967B2 (en) * 2002-03-06 2004-10-12 Shimadzu Corporation Multi-dimension liquid chromatography separation system
JP3816883B2 (ja) * 2003-03-06 2006-08-30 株式会社日立ハイテクノロジーズ 液体クロマトグラフ質量分析装置
JP2006125856A (ja) * 2004-10-26 2006-05-18 Sumitomo Chemical Co Ltd 液体クロマトグラフィー装置
DE202005011825U1 (de) 2005-07-25 2006-11-30 Sls Micro Technology Gmbh Mikrosystemtechnischer Injektor für einen Gaschromatographen
WO2009111229A2 (en) * 2008-02-29 2009-09-11 Waters Technologies Corporation Sample dilution for chromatography of multiple process streams
JP2010014559A (ja) * 2008-07-04 2010-01-21 Shimadzu Corp 分取液体クロマトグラフ装置
JP5374769B2 (ja) * 2009-03-25 2013-12-25 大日本住友製薬株式会社 Ｎｍｒ測定用サンプルの製造方法、ｎｍｒ測定方法、ｎｍｒ測定用サンプルの製造装置、及び、分析システム
US9470664B2 (en) * 2009-04-10 2016-10-18 Waters Technologies Corporation Chromatographic interface
CN102961892A (zh) * 2011-09-01 2013-03-13 李贺然 一种制备型多维液相色谱仪
SI2854883T1 (sl) 2012-05-17 2019-08-30 Cartiheal (2009) Ltd. Biomatrični hidrogeli in postopki za njihovo uporabo
WO2014032285A1 (zh) * 2012-08-31 2014-03-06 西安奥岚科技开发有限责任公司 用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统及分离方法
JP6035603B2 (ja) * 2012-12-19 2016-11-30 株式会社日立ハイテクノロジーズ 試料導入装置
KR101617615B1 (ko) * 2014-03-28 2016-05-03 고려대학교 산학협력단 이중 온라인 액체크로마토그래피 장치 및 그 제어 방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008185558A (ja) * 2007-01-31 2008-08-14 Shiseido Co Ltd ２次元液体クロマトグラフィー分析方法および分取用流路切り替えユニット
JP2010014429A (ja) * 2008-07-01 2010-01-21 Shimadzu Corp 液体クロマトグラフ
KR20120000538A (ko) * 2010-06-25 2012-01-02 고려대학교 산학협력단 자동화 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치
US20140373605A1 (en) * 2012-07-17 2014-12-25 Idex Health & Science Llc Liquid Sampling Valve

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP3404408A4 *
WAGNER, KNUT ET AL.: "An Automated On-line Multidimensional HPLC System for Protein and Peptide Mapping with Integrated Sample Preparation", ANALYTICAL CHEMISTRY, vol. 74, no. 4, 2002, pages 809 - 820, XP001115830 *

Also Published As

Publication number Publication date
US11982652B2 (en) 2024-05-14
KR20170085803A (ko) 2017-07-25
EP3404408B1 (en) 2023-11-29
US20190017974A1 (en) 2019-01-17
JP2019502129A (ja) 2019-01-24
KR101795747B1 (ko) 2017-11-08
EP3404408C0 (en) 2023-11-29
JP6723365B2 (ja) 2020-07-22
CN114235994A (zh) 2022-03-25
US20220050087A1 (en) 2022-02-17
EP3404408A1 (en) 2018-11-21
CN108603864A (zh) 2018-09-28
EP3404408A4 (en) 2019-09-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2015147397A1 (ko) 이중 온라인 액체크로마토그래피 장치 및 그 제어 방법
WO2017122911A1 (ko) 비연속적 시료 분획 및 통합유닛과 이를 구비한 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치
US7214313B2 (en) Liquid chromatograph
WO2011162575A2 (ko) 자동화 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치
KR100757512B1 (ko) 초고압 이중 온라인 고체상 추출 및 역상 액체크로마토그래피 장치
US11774413B2 (en) Preparative liquid chromatograph
US20160274069A1 (en) Autosampler and liquid chromatograph
US6498040B1 (en) HPLC apparatus for fractioning and preparing sample for NMR spectrometry and method of changing mobile phase
JP2004101477A (ja) ２次元高速液体クロマトグラフ装置及びそれを用いた蛋白質分析装置
JP2001124755A (ja) 有機化合物を精製するためのｈｐｌｃ法
TWI761660B (zh) 雙重管柱lc-ms系統及其使用方法
El Ouahabi et al. On-line solid-phase extraction to enhance sensitivity in peptide biomarker analysis by microseparation techniques coupled to mass spectrometry: Capillary liquid chromatography versus capillary electrophoresis
Tai et al. Non-targeted identification of D-amino acid-containing peptides through enzymatic screening, chiral amino acid analysis, and LC-MS
CN100390536C (zh) 高通量蛋白质多维阵列色谱分离系统
CN114924082A (zh) 一种高通量富集蛋白质和/或肽段组质谱鉴定方法
CN215415249U (zh) 一种生产型循环多维液相色谱分离系统
WO2020194606A1 (ja) クロマトグラフ装置および分析方法
KR20230113958A (ko) 상호 독립적 이중 온라인 액체크로마토그래피 장치 및 그 제어 방법
CN107014936B (zh) 尿液中褪黑素硫酸盐的检测方法
JP2002340876A (ja) 多連液体クロマトグラフ
Kreuzer et al. Stabilization of N-terminal cysteines in HPLC-HRMS quality control of peptide pools
CN209961743U (zh) 纳流分馏器装置
Chambers et al. An Improved SPE-LC-MS/MS Platform for the Simultaneous Quantitation of Multiple Amyloid β Peptides in Cerebrospinal Fluid for Preclinical or Biomarker Discovery
JP2000266738A (ja) 液体クロマトグラフ質量分析装置
Xie et al. CharaCterization of Protein imPurities by PePtide maPPing with uPLC/mse

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 16885222

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018536832

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2016885222

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2016885222

Country of ref document: EP

Effective date: 20180816