WO2011162575A2 - 자동화 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치 - Google Patents

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WO2011162575A2
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형석원
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김경철
문동기
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고려대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to an automated dual on-line multifunctional liquid chromatography device, and more particularly, it is possible to perform online sample desalination, sample concentration, online digestion and phosphorylated peptide extraction, and column equilibration time between repeated experiments.
  • Automated dual on-line multifunctional liquid chromatography that minimizes dead time to stop the experiment while increasing the experiment speed, enables rapid injection of samples, and highly repeatable with respect to the residence time of liquid chromatography Relates to a photography apparatus.
  • On-line solid phase extraction / capillary reverse-phase liquid chromatography has been recognized as an important technology for proteome research because of its excellent analytical efficiency.
  • it is possible to effectively separate fine amounts of biomaterials and the wide range of analyte-solid reactions makes it possible to identify fine amounts of proteins with high efficiency.
  • Mass spectrometry-base methods have become a standard analytical platform for proteome research, and the shotgun method, or the bottom-up method, is a method for protein analysis prior to mass spectrometry. Is hydrolyzed to peptides, which increase the solubility of biological samples and produce peptide fragments that are readily ionizable and detectable in mass spectrometers.
  • the on-line desalting step is an essential process that must be performed prior to mass spectrometry. This interferes with the ionization process, reducing the detection sensitivity of the peptide sample. In this case, in consideration of time saving and sample loss, an on-line desalting process is more advantageous than an off-line desalting process.
  • the conventional reverse phase liquid chromatography device employs a solid phase extraction column to have only a one-dimensional separation function for desalting and concentrating a sample, or a two-dimensional separation function by connecting a strong cation exchange chromatography device and a reverse phase liquid chromatography online.
  • a two-dimensional reverse phase liquid chromatography apparatus that performs the problem, it is difficult to perform accurate analysis due to mutual interference.
  • such a two-dimensional on-line reverse phase liquid chromatography apparatus could not perform an on-line digestion function for digesting a protein in a peptide state or a function of selectively extracting only phosphorylated peptide.
  • equilibration takes at least two hours to reuse a column having a length of 1 m and an internal diameter of 75 ⁇ m.
  • the present invention is to solve the above problems, the problem to be solved by the present invention is a two-dimensional separation function capable of desalting process and sample concentration, passing through the sample separation column to increase the efficiency of desalination process and sample concentration 2
  • the experiment speed is increased by minimizing dead time which should be stopped during column equilibration time between repeated experiments.
  • the present invention provides an automated dual on-line liquid chromatography device capable of injecting a sample at a high speed and having a very high reproducibility with respect to the retention time of liquid chromatography.
  • a first trap valve in fluid communication with the first solid phase extraction column and the first reversed phase liquid chromatography column;
  • a second trap valve in fluid communication with the second solid phase extraction column and the second reversed phase liquid chromatography column;
  • a first separation valve and a second separation valve for selectively discharging the fluid introduced into the first trap valve or the second trap valve, respectively;
  • a multifunctional selection valve positioned in a flow path from the sample inlet valve to the first and second trap valves and connected to a sample separation column;
  • connection valve for selectively supplying the fluid flowing out of the sample inlet valve to the multi-function selection valve, the first trap valve, or the second trap valve.
  • the apparatus may further include a first solvent supply pump and a second solvent supply pump for supplying a solvent to the automated dual on-line multifunction liquid chromatography apparatus.
  • the first solvent supply pump is in fluid communication with the sample inlet valve or the connection valve, and the second solvent supply pump is in fluid communication with the second separation valve.
  • the first solvent supply pump selectively supplies a solvent to the sample inlet valve or the connection valve through a T-type solvent separation tube.
  • At least one of the first solvent supply pump and the second solvent supply pump be provided with a solvent selection valve so as to supply a first solvent or a mixed solvent of the first solvent and the second solvent.
  • the sample inlet valve may include a sample inlet port, a sample discharge port, a first sample storage loop connection port and a second sample storage loop connection port, a solvent inlet port, and a solvent outlet port connected to each other by a sample storage loop. It is preferable.
  • the sample inlet valve may include: a first mode in which the sample inlet port and the first sample storage loop connection port are in fluid communication, and the second sample storage loop connection port and the sample discharge port are in fluid communication; And a second mode in which the first sample storage loop connection port and the solvent outlet port are in fluid communication, and the second sample storage loop connection port and the solvent inlet port are in fluid communication.
  • connection valve may include a first inflow port, a second inflow port, a first connection port, a second connection port, a first outlet port, and a second outlet port.
  • the connecting valve may include a first mode in which the first inflow port, the first connection port, the second connection port, and the first outlet port are sequentially in fluid communication; And a second mode in which the second inflow port, the second connection port, the first connection port, and the second outlet port are sequentially in fluid communication.
  • connection valve is preferably formed in the Z-type flow path between the ports in fluid communication with each other.
  • the multi-function selection valve the fluid passage mode for introducing the fluid discharged from the sample inlet valve to discharge to the trap valve; A column passing mode through which the fluid discharged from the sample inlet valve passes through the sample separation column and is discharged to the trap valve; And a fluid closing mode for preventing the inflow of the fluid discharged from the sample inlet valve.
  • the multi-function selection valve, the inlet port, the outlet port, the first sample separation column connection port and the second sample separation column connection port respectively connected to both ends of the sample separation column, and other ports to implement the modes optional It may include a plurality of selection ports in fluid communication with.
  • the inflow port and the outlet port is in fluid communication in the fluid passage mode, the inlet port and the first sample separation column connection port, the outlet port and the second sample separation column connection port in the column pass mode Each in fluid communication with each other, it is preferable that the inlet port and the outlet port in the fluid closing mode is fluid disconnected.
  • titanium dioxide column is further connected to the multi-function selection valve
  • the multi-function selection valve the fluid passage mode for introducing the fluid discharged from the sample inlet valve to discharge to the trap valve; A column passing mode through which the fluid discharged from the sample inlet valve passes through the sample separation column and is discharged to the trap valve; A fluid closing mode for preventing an inflow of fluid discharged from the sample inlet valve; And a titanium dioxide column passing mode through which the fluid discharged from the sample inlet valve passes through the titanium dioxide column and is discharged to the trap valve.
  • a first titanium dioxide column connection port and a second titanium dioxide column connection port may include a plurality of selection ports selectively in fluid communication with other ports to implement the modes.
  • the inflow port and the outlet port is in fluid communication in the fluid passage mode, the inlet port and the first sample separation column connection port, the outlet port and the second sample separation column connection port in the column pass mode
  • the inlet port and the outlet port are fluid-disconnected in the fluid closing mode, the inlet port and the first titanium dioxide column connecting port, the outlet port and the second port in the titanium dioxide column passing mode.
  • the titanium dioxide column connection ports are in fluid communication with each other.
  • the first trap valve may include a solid phase extraction column connection port in fluid communication with the first solid phase extraction column, a reverse phase liquid chromatography column connection port in fluid communication with the first reverse phase liquid chromatography column, a first inlet port, And a second inlet port, a sample moving loop connection port connected by the first solid phase extraction column connection port and a sample moving loop, and a discharge port, wherein the second trap valve is in fluid communication with the second solid phase extraction column.
  • a solid phase extraction column connection port, a reverse phase liquid chromatography column connection port in fluid communication with the second reverse phase liquid chromatography column, a first inlet port, a second inlet port, and the second solid phase extraction column connection port and a sample moving loop It may include a connected sample transfer loop connection port, and the discharge port.
  • the first trap valve and the second trap valve may each include: a first mode in which the solid phase extraction column connection port and the first inlet port, the sample moving loop connection port, and the discharge port are in fluid communication with each other; And a second mode in which the reverse phase liquid chromatography column connection port, the solid phase extraction column connection port, and the second inflow port and the sample moving loop connection port are respectively in fluid communication with each other.
  • each of the first separation valve and the second separation valve may include a first inflow port, a second inflow port, a first outflow port, and a second outflow port.
  • the first separation valve and the second separation valve may each include: a first mode in which the first inflow port and the first outflow port, the second inflow port and the second outflow port are in fluid communication with each other; And a second mode in which the first inflow port and the second outflow port, the second inflow port and the first outflow port are in fluid communication with each other.
  • equilibration is performed in the first solid phase extraction column and the first reverse phase liquid chromatography column while the sample is analyzed in the second reverse phase liquid chromatography column.
  • the flow direction of the incoming sample and the flow direction of the sample eluted toward the first reverse phase liquid chromatography column are opposite to each other
  • the flow direction and the flow direction of the sample eluted toward the second reversed phase liquid chromatography column are opposite to each other.
  • the separation efficiency by connecting the one-dimensional separation and reverse phase two-dimensional separation using the one-dimensional separation function and the sample separation column capable of desalting and sample concentration
  • the two-dimensional separation function and high pressure in the solvent can be produced to perform on-line digestion function to digest protein into peptide state.
  • the experiment speed can be increased by minimizing a dead time to stop the experiment during the column equilibration time required between repeated experiments each time.
  • the solvent of the first solvent supply pump flows to the first reverse phase liquid chromatography column
  • the solvent of the second solvent supply pump flows to the second reverse phase liquid chromatography column, while the other column is As the solvent flows, it washes the path that the sample moved and equilibrates the column state, thereby minimizing downtime and increasing sample analysis efficiency.
  • FIG. 1 is a block diagram of each valve in the sample loading step in the automated dual on-line reverse phase liquid chromatography apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a block diagram of each valve in the process of performing an on-line fire extinguishing function in an automated dual on-line reverse phase liquid chromatography apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 is a block diagram of each valve in the process of performing the one-dimensional separation function in the automated dual on-line reverse phase liquid chromatography apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 is a block diagram of each valve in the process of performing the two-dimensional separation function in the automated dual on-line reverse phase liquid chromatography apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a block diagram of each valve in the process of performing the phosphorylated peptide extraction function in the automated dual on-line reverse phase liquid chromatography apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 shows an equilibrium in a second solid phase extraction column and a second reverse phase liquid chromatography column during sample analysis in a first reverse phase liquid chromatography column in an automated dual on-line reverse phase liquid chromatography apparatus according to an embodiment of the present invention. It is a block diagram of each valve in the process made.
  • the sample inlet valve 100 is loaded with the sample to be analyzed;
  • a first trap valve 400a in fluid communication with the first solid phase extraction column 410a and the first reversed phase liquid chromatography column 420a;
  • a second trap valve 400b in fluid communication with the second solid phase extraction column 410b and the second reversed phase liquid chromatography column 420b;
  • a first separation valve 600a and a second separation valve 600b for selectively discharging the fluid introduced into the first trap valve or the second trap valve, respectively;
  • a multi-function selection valve 300 positioned in a flow path from the sample inlet valve to the first and second trap valves and connected to a sample separation column 310;
  • a connection valve 200 for selectively supplying the fluid flowing out of the sample inlet valve to the multifunctional selection valve, the first trap valve, or the second trap valve.
  • Automated dual on-line multifunction liquid chromatography apparatus by changing the mode (or position) of each of the valves described above, that is, the sample is analyzed in one column while performing a variety of functions with only a simple operation of the valve
  • the other column can be used to wash down the path that the sample has traveled as solvent flows and to equilibrate the column to minimize downtime.
  • the sample inlet valve 100, the connection valve 200, the first and second separation valve (600a, 600b), the first and second trap valve (400a, 400b) may include two modes
  • the multifunctional selector valve 300 used to perform various functions of the liquid chromatography apparatus may include three or four modes.
  • a process of analyzing a sample in a first reversed phase liquid chromatography column and a process of equilibrating a column at the same time in a sample analysis process will be described as an example.
  • FIG. 1 is a view illustrating a valve configuration of an automated dual on-line liquid chromatography device in a sample loading step.
  • the sample inlet valve 100 is a valve for loading a sample by introducing a sample to be analyzed, and includes a first sample storage loop connected to each other by a sample inlet port 101, a sample discharge port 102, and a sample storage loop 107.
  • the connection port 103 and the second sample storage loop connection port 104, the solvent inlet port 105, and the solvent outlet port 106 may be included.
  • Automated dual on-line liquid chromatography apparatus by using two solvent supply pump (500a, 500b) as shown in Figure 1 of the sample in one column of two reverse phase liquid chromatography column Allows column equilibration in the other column during analysis.
  • an automated dual on-line liquid chromatography device by changing the flow path of the fluid by using the multi-function selection valve 300, the one-dimensional separation function and the one-dimensional separation using the sample separation column and desalination process and sample concentration
  • Two-dimensional separation function to increase separation efficiency by connecting reverse phase two-dimensional separation, and online digestion function that digests protein into peptide state by generating high pressure in solvent, and selectively extracts only phosphorylated peptide using titanium dioxide column Function can be performed.
  • the state of the sample inlet valve shown in FIG. 1 is a step in which a sample is loaded, and the sample inlet port 101 and the first sample storage loop connection port 103, the sample discharge port 102 and the second sample storage loop are illustrated in FIG. Since the connection ports 104 are in fluid communication with each other, the sample may be introduced into the sample storage loop 107 through the sample inlet port 101. When the user determines that the concentration of the sample is too low through the sample storage loop 107, a sufficient sample concentration can be obtained by repeating the sample injection a plurality of times.
  • the sample storage loop 107 preferably has a volume of 1 ⁇ l to 10 ⁇ l, and when the volume of the sample storage loop 107 is less than 1 ⁇ l, there is a problem in that the handling of the sample is difficult. It is not preferable because the sample injection time is long.
  • sample inlet valve 100 includes a sample discharge port 102, which discharges the extra sample so that the sample can be accommodated within the above-described volume range in the sample storage loop 107. Play a role.
  • connection state of the sample inlet valve is changed by using a mode switching switch (not shown) of the sample inlet valve 100 in the first mode shown in FIG. Switch to 2 mode.
  • the first sample storage loop connection port 103 and the solvent outlet port 106 are in fluid communication, and the second sample storage loop connection port 104 and the solvent inlet port 105 are in fluid communication. Is configured to be in fluid communication.
  • the automated dual on-line multifunction liquid chromatography apparatus may further include a first solvent supply pump 500a and a second solvent supply pump 500b for supplying a solvent.
  • the first solvent supply pump 500a may be in fluid communication with the sample inlet valve 100 or the connection valve 200
  • the second solvent supply pump 500b may include a second separation valve ( 600b) may be in fluid communication.
  • Each of these solvent supply pumps 500a and 500b preferably supplies solvent at a pressure of 5,000 psi to 20,000 psi.
  • the solvent supply pressure is less than 5,000 psi, the length of the usable column is shortened to reduce separation resolution. There is a problem, and if it exceeds 20,000 psi, there is a possibility of solvent leakage from the valve, which is undesirable.
  • the solvent supplied from the solvent supply pumps 500a and 500b may be a first solvent or a mixture of the first solvent and the second solvent.
  • a solvent selection valve (not shown) may be installed in the solvent supply pumps 500a and 500b to supply a first solvent or a mixed solvent in which a first solvent and a second solvent are mixed at a predetermined ratio.
  • the T-type solvent separation tube 510 for selectively supplying a solvent to the sample inlet valve 100 or the connection valve 200 may be connected to the first solvent supply pump 500a.
  • FIG. 2 is a block diagram of each valve in the process of performing an on-line fire extinguishing function in an automated dual on-line reverse phase liquid chromatography apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • the first solvent is introduced into the sample inlet valve 100 from the solvent inlet port through the first solvent supply pump 500a, and the sample remaining in the sample storage loop 107 by the hydraulic pressure of the supplied first solvent is the solvent outlet port. It is discharged through the 106, and reaches the connecting valve 200.
  • the connection valve 200 includes a first inlet port 201, a second inlet port 202, a first connection port 203, a second connection port 204, a first outlet port 205, and a second outlet port. 206, the first inlet port 201 of the connecting valve 200 is in fluid communication with the solvent outlet port 106 of the sample inlet valve 100.
  • connection valve 200 sequentially fluidly communicates the first inlet port 201, the first connection port 203, the second connection port 204, and the first outlet port 205.
  • the first solvent introduced from the solvent supply pump together with the sample includes the first inlet port 201, the first connection port 203, the second connection port 204, and the first outlet port of the connection valve 200. It passes through the connecting valve while passing through 205).
  • the connection valve is formed with a Z-type flow path between the ports in fluid communication with each other.
  • connection valve 200 The first solvent passing through the connection valve 200 reaches the multifunction selection valve through the inlet port 301 of the multifunction selection valve 300 in fluid communication with the first outlet port 205 of the connection valve 200.
  • the multi-function selection valve 300 includes a first sample separation column connection port 302 connected to both ends of the inlet port 301, the outlet port 307, and the sample separation column 310, respectively. And a second sample separation column connection port 303, a first selection port 304, a second selection port 305, and a third selection port 306 configured to be selectively connected to these ports.
  • the titanium dioxide column 311 may be further connected for the phosphorylated peptide extraction function, wherein the multi-function selection valve 300 'is connected to the first titanium dioxide column connection port 308 connected to both ends of the titanium dioxide column 311.
  • a second titanium dioxide column connection port 309 may be further included.
  • the multi-function selection valve 300 may be located in a flow path facing a trap valve to which a reversed phase liquid chromatography column in which a sample loaded from a sample inlet valve into which a sample is loaded in the liquid chromatography device is analyzed is connected.
  • the multi-function selection valve 300 can implement three modes by changing the connection state of each pod, and if the titanium dioxide column 311 is connected can implement four modes.
  • the multi-function selector valve 300 shown in FIG. 2 represents a fluid closing mode that performs an on-line fire extinguishing function. That is, in the fluid closing mode, the fluid discharged from the sample inlet valve is prevented from entering the multifunction selection valve 300. As shown in Fig. 2, in this mode, the inlet port 301 and the outlet port 307 are fluidly disconnected from each other. To this end, the second selection port 305 and the first sample separation column connection port 302, the outlet port 307 and the first selection port 304, the second sample separation column connection port 303 and the third selection port 306 may each be in fluid communication with each other. Therefore, the incoming first solvent does not pass through the multifunctional selector valve 300, and thus the pressure of the supplied first solvent gradually increases.
  • the on-line digestion function of digesting the protein into the peptide state is performed by generating a high pressure by blocking the flow of the solvent during the transport of the solvent.
  • the efficiency of the on-line fire extinguishing function is improved as the pressure of the solvent is increased, it is preferable to increase the pressure of the first solvent to the maximum allowable pressure of the valve.
  • the nine-port multi-function selection valve 300 'connected to the titanium dioxide column can be implemented in the fluid closing mode by closing the first titanium dioxide column connection port 308.
  • FIG. 3 is a block diagram of each valve in the process of performing the one-dimensional separation function in the automated dual on-line reverse phase liquid chromatography apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • the multi-function selection valve 300 is changed to a fluid passage mode, that is, to directly in fluid communication with the inlet port 301 and the outlet port 307. .
  • the second selection port 305, the third selection port 306, the second sample separation column connection port 303 and the first selection port 304 are each other It may be in fluid communication.
  • the first selection port 304, the second titanium dioxide column connection port 309, the second selection port 305, and the second selection port 306 are each other. It may be in fluid communication. It is apparent to those skilled in the art that the connection of such ports is only one embodiment, and may have a connection of various ports for a desired mode.
  • the solvent introduced from the inlet port may be discharged toward the first trap valve 400 through the outlet port without passing through the sample separation column 310 according to the connection relationship between the ports.
  • the first solvent passing through the multifunction selector valve reaches the first separation valve.
  • the first separation valve is a valve that selectively discharges the incoming fluid to the first trap valve 400a or the second trap valve 400b.
  • the first separation valve 600a may include a first inflow port 601, a second inflow port 602, a first outflow port 603, and a second outflow port 604.
  • the first separation valve 600a may include a first mode in which the first inflow port 601 and the first outflow port 603, the second inflow port 602 and the second outflow port 604 are in fluid communication with each other,
  • the first inlet port 601 and the second outlet port 604, the second inlet port 602 and the first outlet port 603 may include a second mode in fluid communication with each other.
  • the first separation valve 600a is in the above-described first mode state so that the first solvent passing through the multifunction separation valve 300 reaches the first trap valve 400a.
  • the first trap valve 400a is a solid phase extraction column connecting port 402 in communication with the first solid phase extraction column 410a, and a reverse phase liquid chromatography column connecting port 406 in communication with the first reverse phase liquid chromatography column 420a.
  • a first inlet port 401, a second inlet port 404, a sample moving loop connection port 403 connected by a solid phase extraction column connection port and a sample moving loop 407, and an emission port 405. can do.
  • the first trap valve 400a may include a first inlet port 401 and a solid phase extraction column connection port 402, as shown in FIG. 3. ),
  • the sample transfer loop connection port 403 and the discharge port 405, the reverse phase liquid chromatography column connection port 406 and the second inlet port 404 may be set in fluid communication with each other.
  • the sample discharged from the multifunctional selection valve 300 and transferred together with the first solvent is injected into the first solid phase extraction column 410a through the solid phase extraction column connection port 402 via the first inlet port 401. do.
  • the flow direction of the sample to be injected (or the flow direction of the first solvent) is the same as the arrow direction shown.
  • Solid phase extraction column (410a. 410b) is a column directly bonded to the solid phase extraction column connecting port 402, in the present invention, the solid phase extraction column has an inner diameter of 50 ⁇ m 500 ⁇ m and length of 1cm to 4cm, which It has a very short length compared to the conventional solid-phase extraction column, the length of the solid-phase extraction column is very small as described above in spite of being operated at a very high pressure of about 20,000 psi in the present invention, to maximize the separation resolution of the sample It becomes possible.
  • the flow direction of the sample flowing in and the flow direction of the sample eluted toward the reversed phase liquid chromatography column are opposite to each other, further improved sample separation resolution can be achieved.
  • a stainless steel liner of an internal inducer may be used as the solid phase extraction columns 410a and 410b, and a material such as C18 may be filled therein, and both ends may be about 2 ⁇ m.
  • discharge port 405 also releases the salt component contained in the sample, thereby enabling an efficient desalting process.
  • the flow rate in the solid phase extraction column during the desalination of the sample can be adjusted to 1.8 ⁇ l / min to 3.0 ⁇ l / min.
  • the reason for limiting the flow rate in the solid phase extraction column to 1.8 to 3.0 ⁇ l / min is to ensure the increase in desalination efficiency, the prevention of the resulting internal pressure increase and the minimization of sample loss in the solid phase extraction column.
  • the two-dimensional separation function that allows the first solvent to pass through the sample separation column to fractionate the sample and increase the desalination and concentration efficiency of the sample.
  • Figure 4 is a block diagram of each valve in the process of performing the two-dimensional separation function in the automated dual on-line reverse phase liquid chromatography apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • the sample inlet valve 100, the connection valve 200, and the first trap valve 400b in the one-dimensional separation function are performed.
  • the valve configuration of the) is maintained as it is, and the mode of the multi-function selection valve 300 may be switched from the fluid passage mode to the column passage mode. That is, as shown in FIG. 4, the column passing mode of the multi-function selection valve is such that the incoming fluid passes through the sample separation column 310 to be discharged toward the trap valve.
  • the inflow port 301 and The first sample separation column connection port 302, the outlet port 307, and the second sample separation column connection port 303 are in fluid communication with each other, and at this time, the second selection port 305 and the third selection port 306. ) May be in fluid communication with each other.
  • the sample separation column 310 may be any column capable of performing a two-dimensional separation function by combining with a reversed phase liquid chromatography column.
  • SCX Strong Cation eXchange
  • WAX Weak Anion eXchange
  • HILIC Hydrophilic Interaction Chromatography
  • SCX-WAX MIXED columns SCX-WAX MIXED columns. It can be used as a sample separation column.
  • the inflow fluid must be discharged through the sample separation column 310 without passing through the titanium dioxide column 311, so that the first selection port 304 and the second titanium dioxide are discharged.
  • the column connection port 309, the second selection port 305, and the third selection port 306 may be in fluid communication with each other.
  • the first solvent introduced into the multifunctional selection valve 300 through the configuration of the valve may be injected into the first solid phase extraction column 410a of the first trap valve 400a by passing through the sample separation column 310. Therefore, after the fractionation of the sample is made it is possible to further increase the desalination of the sample and the concentration of the sample.
  • FIG. 5 is a block diagram of each valve in the process of performing the phosphorylated peptide extraction function in the automated dual on-line reverse phase liquid chromatography apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • the sample inlet valve 100, the connection valve 200, and the first trap valve 400b in the two-dimensional separation function are performed.
  • the valve configuration of the) is maintained as it is, the titanium dioxide column (311) is to be connected to the multi-function selection valve (300 '), and change the mode of the multi-function selection valve (300') to the titanium dioxide column passing mode. That is, as shown in FIG. 5, the titanium dioxide column passing mode of the multi-function selection valve is such that the incoming fluid passes through the titanium dioxide column 311 and is discharged toward the trap valve.
  • the inlet port ( 301, the first titanium dioxide column connection port 308, the outlet port 307 and the second titanium dioxide column connection port 309 are in fluid communication with each other, wherein the first selection port 304 and the first sample
  • the separation column connection port 302, the second selection port 305, and the third selection port 306 may be in fluid communication with each other.
  • the first solvent introduced into the multifunctional selection valve 300 ′ may be injected into the first solid phase extraction column 410 a of the first trap valve 400 a by passing through the titanium dioxide column 311. This allows extraction of phosphorylated peptides.
  • the sample is filled in a predetermined amount in the sample storage loop 107 through the sample inlet port 101, and then the on-line extinguishing function of the sample is performed using the first solvent, and the first fluid is in fluid communication with the first trap valve 400a.
  • the process of performing the 1-dimensional separation function, the 2-dimensional separation function and the phosphorylated peptide extraction function in the solid phase extraction column 410a has been described.
  • FIG. 6 shows an equilibrium in a second solid phase extraction column and a second reverse phase liquid chromatography column during sample analysis in a first reverse phase liquid chromatography column in an automated dual on-line reverse phase liquid chromatography apparatus according to an embodiment of the present invention. It is a block diagram of each valve in the process made.
  • a mixed solvent of the first solvent and the second solvent is used, and the sample is separated through the solvent gradient by varying the ratio of the mixed solvent.
  • a mixed solvent of the first solvent and the second solvent is supplied to the first trap valve 400a through the second solvent supply pump 500b.
  • the second separation valve 600b serves to guide the mixed solvent supplied from the second solvent supply pump 500b to the first trap valve 400a.
  • the second separation valve 600b is a valve that selectively discharges the fluid flowing in the same manner as the first separation valve 600a described above to the first trap valve 400a or the second trap valve 400b.
  • the second separation valve 600b may include a first inflow port 601, a second inflow port 602, a first outflow port 603, and a second outflow port 604.
  • the second separation valve 600b may include a first mode in which the first inflow port 601 and the first outflow port 603, the second inflow port 602 and the second outflow port 604 are in fluid communication with each other,
  • the first inlet port 601 and the second outlet port 604, the second inlet port 602 and the first outlet port 603 may include a second mode in fluid communication with each other.
  • the mode of the second separation valve is changed to the above-described second mode as shown in FIG.
  • the mixed solvent passing through the second separation valve 600b flows into the first trap valve 400a, and the reverse phase liquid chromatography is performed to analyze the sample in the first reverse phase liquid chromatography column in fluid communication with the first trap valve.
  • the mode of the first trap valve 400a is changed such that the graph column connecting port 406, the solid phase extraction column connecting port 402, the second inflow port 404 and the sample moving loop connecting port 403 are in fluid communication with each other. do.
  • the first inlet port 401 and the discharge port 404 may be in fluid communication with each other. Therefore, the mixed solvent introduced through the second inflow port 404 reaches the first solid phase extraction column 410a via the sample moving loop 407, and connects the solid phase extraction column connection port 402 to the reverse phase liquid chromatography column.
  • the first reversed phase liquid chromatography column 420a is passed through the port 406.
  • the flow direction of the sample eluted toward the first reverse phase liquid chromatography column 420a (or the flow direction of the mixed solvent) is the same as an arrow, which indicates the flow of the sample flowing into the first solid phase extraction column 410a. Since the opposite direction (or the flow direction of the first solvent), the separation resolution of the sample can be further improved.
  • Sample separation in the first solid phase extraction column 410a is performed by changing the ratio of the first solvent and the second solvent in the mixed solvent supplied from the second solvent supply pump 500b over time. That is, as the ratio of the second solvent in the mixed solvent increases, the degree of dissociation of the sample bound to the first solid phase extraction column 410a increases to flow into the first reverse phase liquid chromatography column 420a, and then through separation of the sample. The analysis is made.
  • the first solvent and the second solvent various combinations of solvents may be selected to achieve the object as described above, but is not limited thereto, and 0.1% formic acid aqueous solution may be used as the first solvent, 90% of acetonitrile aqueous solution may be used as the second solvent. That is, it can be said that the system adopts a system in which the degree of dissociation of the sample bound to the solid phase extraction column increases as the content of acetonitrile in the total solvent increases.
  • the first reverse phase liquid chromatography column 420a in which the separation of the sample is performed, preferably has an inner diameter of 10 ⁇ m to 150 ⁇ m and a length of 10 cm to 150 cm, and the first reverse phase liquid chromatography column 420a is a mass analyzer ( By connecting to a mass spectrometer, subsequent analytical processes can be performed.
  • the second solid phase extraction column 410b and the second reverse phase liquid chromatography column using the first solvent supplied from the first solvent supply pump. 420b may be equilibrated.
  • the mode of the connection valve 200 is changed such that the first solvent from the first solvent supply pump 500a passes through the second trap valve 400b.
  • connection valve 200 the second inlet port 202, the first solvent of the connecting valve 200 such that the first solvent supplied from the first solvent supply pump 500a reaches the second separating valve 600b via the connecting valve 200.
  • the mode of the connection valve 200 is changed such that the second connection port 204, the first connection port 203, and the second outlet port 206 are sequentially in fluid communication. Even in this case, the Z shape of the flow path in the connection valve may be maintained.
  • the reverse phase liquid chromatography column connection port 406 and the solid phase extraction column connection port 402 and the second inflow port The mode of the second trap valve 400b is changed such that 404 and the sample moving loop connection port 403 are in fluid communication with each other.
  • the first solvent introduced into the second trap valve 400b passes through the second solid phase extraction column 410b and the second reverse phase liquid chromatography column 420b, thereby enabling equilibration thereof.
  • the on-line digestion, 1-dimensional separation, 2-dimensional separation, and phosphorylated peptide extraction function are all performed using the first solvent, and then the process of separating and analyzing the sample using a mixed solvent is performed.
  • various combinations are possible as needed. For example, before separating and analyzing a sample using a mixed solvent, perform only one-dimensional separation function, or perform a combination of one-dimensional separation function and two-dimensional separation function, or first perform an experiment using an online digestion function. After performing, one-dimensional separation function or two-dimensional separation function can be selected and performed.
  • the phosphorylated peptide extraction function may be additionally performed in each of the above processes.
  • the present invention can be used in automated dual on-line multifunctional liquid chromatography apparatus.

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Abstract

본 발명은 자동화 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치에 관한 것으로서, 분석 대상이 되는 시료가 로딩되는 시료유입밸브; 제1 고체상 추출칼럼 및 제1 역상 액체크로마토그래피칼럼과 유체연통되는, 제1 트랩밸브; 제2 고체상 추출칼럼 및 제2 역상 액체크로마토그래피칼럼과 유체연통되는, 제2 트랩밸브; 유입되는 유체를 상기 제1 트랩밸브 또는 상기 제2 트랩밸브로 선택적으로 각각 배출시키는 제1 분리밸브 및 제2 분리밸브; 상기 시료유입밸브에서 상기 제1, 제2 트랩밸브로 향하는 유로에 위치하며, 시료분리칼럼이 연결되는 다기능 선택밸브; 및 상기 시료유입밸브로부터 유출되는 유체를 상기 다기능 선택밸브, 상기 제1 트랩밸브, 또는 상기 제2 트랩밸브로 선택적으로 공급하는 연결밸브;를 포함하며, 본 발명에 따른 자동화 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치를 이용하면 탈염과정 및 시료농축이 가능한 1차원 분리기능 및 시료분리칼럼을 통과시켜 탈염과정 및 시료농축의 효율을 높일 수 있는 2차원 분리기능과, 온라인 소화기능을 수행할 수 있으며, 이와 함께 매회 반복되는 실험 사이에 소요되는 칼럼 평형화 시간 동안 실험을 멈추어야 하는 휴지 시간(dead time)을 최소화하여 실험속도를 증가시킬 수 있다.

Description

자동화 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치
본 발명은 자동화 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 온라인 시료 탈염 과정과 시료 농축, 온라인 소화기능 및 인산화 펩티드 추출기능이 가능하고, 매회 반복되는 실험 사이에 소요되는 칼럼 평형화 시간 동안 실험을 멈추어야 하는 휴지 시간(dead time)을 최소화하여 실험속도를 증가시키며, 시료를 빠른 속도로 주입할 수 있고, 나아가 액체 크로마토그래피의 체류 시간에 대한 반복재현성이 매우 높은 자동화 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치에 관한 것이다.
온라인 고체상 추출 및 역상 액체 크로마토그래피(on-line solid phase extraction/capillary reverse-phase liquid chromatography)는 그 분석 효율성이 매우 우수하여 프로테옴 연구에 있어서 매우 중요한 기술로 인식되어지고 있다. 특히, 이는 미세량의 생체 물질을 효과적으로 분리할 수 있고, 분석물-고체상 반응 범위가 넓어서 높은 효율로 미세량의 단백질들을 동정하는 것을 가능하게 한다.
단백질을 분석하기 위한 방법으로서 질량 분석법에 기초한 방법(mass spectrometry-base methods)은 프로테옴 연구의 표준 분석 플랫폼이 되고 있으며, 대표적인 예로서 샷건 방법 또는 바텀-업 방법 등은 질량 분석기를 사용한 분석 이전에 단백질을 가수분해하여 펩티드로 분해하는데, 이러한 가수분해는 생체 시료들의 용해도를 증가시키며 질량 분석기 중에서 용이하게 이온화 및 검출이 가능한 펩티드 절편들을 생성한다.
그러나, 이러한 공정은 불가피하게 시료의 복잡성을 야기하게 되는 바, 예를 들어 가장 단순한 프로테옴 중의 하나인 효모 프로테옴의 경우에도 약 6,000 여개의 다양한 단백질로부터 300,000개 이상의 펩티드 절편들이 생성된다. 따라서, 이러한 시료 복잡성을 해결하기 위한 방편으로서, 온-/오프-라인 다차원 단백질 동정 기술(on-/off-line multidimensional protein identification technology)과 같은 다양한 방법들이 개발되었으나 (Link, A. J., Eng, J., Schieltz, D. M., Carmack, E., et al., Nat. Biotechnol. 1999, 17, 676-682; Chen, E. I., Hewel, J., Felding-Habermann, B., Yates, J. R. III, Mol. Cell. Proteomics 2006, 5, 53-56.), 액체 크로마토그래피 칼럼의 효율성 및 감도를 개선하여야 하는 필요성은 여전히 존재한다. 이때, 액체 크로마토그래피/질량 분석법 실험의 감도는 분리 칼럼의 길이를 일정하게 유지한 채로, 내경을 감소시키는 경우에 급격히 증가될 수 있다는 사실이 알려진 바 있다(Kim, M. -S., Choie, W. -S., Shin, Y. S., Yu, M. H., Lee, S. -W., Bull. Korean Chem. Soc. 2004, 25, 1833-1839.).
또한, 상당량의 세제 및 염들을 포함하는 생물 시료의 경우에 있어서, 온-라인 탈염 공정(on-line desalting step)은 질량 분석 이전에 거쳐야 하는 필수적인 과정인데, 이는 이러한 불순물들이 분석하고자 하는 펩티드 시료의 이온화 과정을 방해하여 펩티드 시료에 대한 검출 감도를 떨어뜨리기 때문이다. 이때, 시간 절약 및 시료 손실 등을 감안하면 온-라인 탈염 공정이 오프-라인 탈염 공정보다 유리하다.
한편, 종래의 역상 액체크로마토그래피 장치는 고체상 추출칼럼을 채용하여 시료를 탈염시키고 농축시키는 1차원 분리기능만을 가지거나, 강양이온교환 크로마토그래피장치와 역상 액체크로마토그래피를 온라인으로 연결하여 2차원 분리기능을 수행하는 2차원 역상 액체크로마토그래피 장치의 경우에도 상호 간섭현상 등에 의해서 정확한 분석을 수행하기가 곤란한 문제점이 있었다. 또한, 이러한 2차원 온라인 역상 액체크로마토그래피 장치에서는 단백질을 펩티드 상태로 소화시켜주는 온라인 소화(On-line digestion) 기능이나 인산화된 펩티드만을 선택적으로 추출하는 기능을 수행할 수 없었다. 나아가, 긴 길이 및 작은 내부 직경을 갖는 모세관 칼럼을 소수성 매질로 채우는 경우에는 칼럼 평형화(또는 재생)을 위해서 장시간이 소요된다는 문제점이 있었다. 예를 들어, 1m 길이 및 75㎛의 내경을 갖는 칼럼을 재사용하기 위해서는 평형화에 적어도 2시간 이상이 소요된다.
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 탈염과정 및 시료농축이 가능한 1차원 분리기능, 시료분리칼럼을 통과시켜 탈염과정 및 시료농축의 효율을 높일 수 있는 2차원 분리기능, 온라인 소화기능 및 인산화된 펩티드만을 추출하는 기능을 수행함과 동시에, 매회 반복되는 실험 사이에 소요되는 칼럼 평형화 시간 동안 실험을 멈추어야 하는 휴지 시간(dead time)을 최소화하여 실험속도를 증가시키고, 시료를 빠른 속도로 주입할 수 있으며, 나아가 액체 크로마토그래피의 체류 시간에 대한 반복재현성이 매우 높은 자동화 이중 온라인 액체 크로마토그래피 장치를 제공하는 것이다.
본 발명은 상술한 과제를 달성하기 위하여,
분석 대상이 되는 시료가 로딩되는 시료유입밸브;
제1 고체상 추출칼럼 및 제1 역상 액체크로마토그래피칼럼과 유체연통되는, 제1 트랩밸브;
제2 고체상 추출칼럼 및 제2 역상 액체크로마토그래피칼럼과 유체연통되는, 제2 트랩밸브;
유입되는 유체를 상기 제1 트랩밸브 또는 상기 제2 트랩밸브로 선택적으로 각각 배출시키는 제1 분리밸브 및 제2 분리밸브;
상기 시료유입밸브에서 상기 제1, 제2 트랩밸브로 향하는 유로에 위치하며, 시료분리칼럼이 연결되는 다기능 선택밸브; 및
상기 시료유입밸브로부터 유출되는 유체를 상기 다기능 선택밸브, 상기 제1 트랩밸브, 또는 상기 제2 트랩밸브로 선택적으로 공급하는 연결밸브;를 포함하는 자동화 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치를 제공한다.
여기서, 상기 자동화 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치에 용매를 공급하는 제1 용매공급펌프 및 제2 용매공급펌프를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 제1 용매공급펌프는 시료유입밸브 또는 상기 연결밸브에 유체연통되어 있고, 상기 제2 용매공급펌프는 상기 제2 분리밸브에 유체연통되어 있는 것이 바람직하다.
또한, 상기 제1 용매공급펌프는 T형 용매분리관을 통해 상기 시료유입밸브 또는 상기 연결밸브에 선택적으로 용매를 공급하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 제1 용매공급펌프 및 상기 제2 용매공급펌프 중 하나 이상에는 제1 용매 또는 제1 용매와 제2 용매의 혼합용매를 공급할 수 있도록 용매선택밸브가 설치된 것이 바람직하다.
또한, 상기 시료유입밸브는, 시료유입포트, 시료방출포트, 시료저장루프에 의해 서로 연결된 제1 시료저장루프 연결포트 및 제2 시료저장루프 연결포트, 용매유입포트, 및 용매유출포트를 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 시료유입밸브는, 상기 시료유입포트와 상기 제1 시료저장루프 연결포트가 유체연통되고, 상기 제2 시료저장루프 연결포트와 상기 시료방출포트가 유체연통되는 제1 모드; 및 상기 제1 시료저장루프 연결포트와 상기 용매유출포트가 유체연통되며, 상기 제2 시료저장루프 연결포트와 상기 용매유입포트가 유체연통되는 제2 모드;를 포함할 수 있다.
또한, 상기 연결밸브는, 제1 유입포트, 제2 유입포트, 제1 연결포트, 제2 연결포트, 제1 유출포트 및 제2 유출포트를 포함할 수 있다.
또한, 상기 연결밸브는, 상기 제1 유입포트, 상기 제1 연결포트, 상기 제2 연결포트, 상기 제1 유출포트가 순차적으로 유체연통되는 제1 모드; 및 상기 제2 유입포트, 상기 제2 연결포트, 상기 제1 연결포트, 상기 제2 유출포트가 순차적으로 유체연통되는 제2 모드;를 포함할 수 있다.
또한, 상기 연결밸브에는 서로 유체연통된 포트들 사이에 Z형 유로가 형성되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 다기능 선택밸브는, 상기 시료유입밸브로부터 배출되는 유체를 유입하여 상기 트랩밸브로 배출시키는 유체통과모드; 상기 시료유입밸브로부터 배출되는 유체가 상기 시료분리칼럼을 통과하여 상기 트랩밸브로 배출되도록 하는 칼럼통과모드; 및 상기 시료유입밸브로부터 배출되는 유체의 내부 유입을 방지하는 유체폐쇄모드;를 포함할 수 있다.
또한, 상기 다기능 선택밸브는, 유입포트, 유출포트, 상기 시료분리칼럼의 양단과 각각 연결되는 제1 시료분리칼럼 연결포트 및 제2 시료분리칼럼 연결포트, 상기 모드들을 구현하도록 다른 포트들과 선택적으로 유체연통되는 복수의 선택포트를 포함할 수 있다.
또한, 상기 유체통과모드에서 상기 유입포트와 상기 유출포트가 유체연통되고, 상기 칼럼통과모드에서 상기 유입포트와 상기 제1 시료분리칼럼 연결포트, 상기 유출포트와 상기 제2 시료분리칼럼 연결포트가 각각 서로 유체연통되며, 상기 유체폐쇄모드에서 상기 유입포트와 상기 유출포트가 유체단절되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 다기능 선택밸브에는 이산화티타늄칼럼이 더 연결되고,
상기 다기능 선택밸브는, 상기 시료유입밸브로부터 배출되는 유체를 유입하여 상기 트랩밸브로 배출시키는 유체통과모드; 상기 시료유입밸브로부터 배출되는 유체가 상기 시료분리칼럼을 통과하여 상기 트랩밸브로 배출되도록 하는 칼럼통과모드; 상기 시료유입밸브로부터 배출되는 유체의 내부 유입을 방지하는 유체폐쇄모드; 및 상기 시료유입밸브로부터 배출되는 유체가 상기 이산화티타늄칼럼을 통과하여 상기 트랩밸브로 배출되도록 하는 이산화티타늄칼럼통과모드;를 포함할 수 있다.
또한, 상기 다기능 선택밸브는, 유입포트, 유출포트, 상기 시료분리칼럼의 양단에 각각 연결되는 제1 시료분리칼럼 연결포트 및 제2 시료분리칼럼 연결포트, 상기 이산화티타늄칼럼의 양단에 각각 연결되는 제1 이산화티타늄칼럼 연결포트 및 제2 이산화티타늄칼럼 연결포트, 상기 모드들을 구현하도록 다른 포트들과 선택적으로 유체연통되는 복수의 선택포트를 포함할 수 있다.
또한, 상기 유체통과모드에서 상기 유입포트와 상기 유출포트가 유체연통되고, 상기 칼럼통과모드에서 상기 유입포트와 상기 제1 시료분리칼럼 연결포트, 상기 유출포트와 상기 제2 시료분리칼럼 연결포트가 각각 서로 유체연통되고, 상기 유체폐쇄모드에서 상기 유입포트와 상기 유출포트가 유체단절되고, 상기 이산화티타늄칼럼통과모드에서 상기 유입포트와 상기 제1 이산화티타늄칼럼 연결포트, 상기 유출포트와 상기 제2 이산화티타늄칼럼 연결포트가 각각 서로 유체연통되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 제1 트랩밸브는, 상기 제1 고체상 추출칼럼과 유체연통되는 고체상 추출칼럼 연결포트, 상기 제1 역상 액체크로마토그래피칼럼과 유체연통되는 역상 액체크로마토그래피칼럼 연결포트, 제1 유입포트, 제2 유입포트, 상기 제1 고체상 추출칼럼 연결포트와 시료이동루프에 의해 연결된 시료이동루프 연결포트, 및 방출포트를 포함하고, 상기 제2 트랩밸브는, 상기 제2 고체상 추출칼럼과 유체연통되는 고체상 추출칼럼 연결포트, 상기 제2 역상 액체크로마토그래피칼럼과 유체연통되는 역상 액체크로마토그래피칼럼 연결포트, 제1 유입포트, 제2 유입포트, 상기 제2 고체상 추출칼럼 연결포트와 시료이동루프에 의해 연결된 시료이동루프 연결포트, 및 방출포트를 포함할 수 있다.
또한, 상기 제1 트랩밸브 및 상기 제2 트랩밸브 각각은, 상기 고체상 추출칼럼 연결포트와 상기 제1 유입포트, 상기 시료이동루프 연결포트와 상기 방출포트가 각각 서로 유체연통되는 제1 모드; 및 상기 역상 액체크로마토그래피칼럼 연결포트와 상기 고체상 추출칼럼 연결포트, 상기 제2 유입포트와 상기 시료이동루프 연결포트가 각각 서로 유체연통되는 제2 모드;를 포함할 수 있다.
또한, 상기 제1 분리밸브 및 제2 분리밸브 각각은, 제1 유입포트, 제2 유입포트, 제1 유출포트 및 제2 유출포트를 포함할 수 있다.
또한, 상기 제1 분리밸브 및 상기 제2 분리밸브 각각은, 상기 제1 유입포트와 상기 제1 유출포트, 상기 제2 유입포트와 상기 제2 유출포트가 각각 서로 유체연통되는 제1 모드; 및 상기 제1 유입포트와 상기 제2 유출포트, 상기 제2 유입포트와 상기 제1 유출포트가 각각 서로 유체연통되는 제2 모드;를 포함할 수 있다.
또한, 상기 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼에서 상기 시료가 분석되는 동안 상기 제2 고체상 추출칼럼 및 상기 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼에서 평형화가 이루어지는 것이 바람직하다.
또한, 상기 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼에서 상기 시료가 분석되는 동안 상기 제1 고체상 추출칼럼 및 상기 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼에서 평형화가 이루어지는 것이 바람직하다.
또한, 상기 제1 고체상 추출칼럼에서, 유입되는 시료의 흐름방향과 상기 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼을 향해 용출되는 시료의 흐름방향은 서로 반대이고, 상기 제2 고체상 추출칼럼에서, 유입되는 시료의 흐름방향과 상기 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼을 향해 용출되는 시료의 흐름방향은 서로 반대인 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에 따른 자동화 이중 온라인 액체크로마토그래피 장치를 이용하면, 탈염과정 및 시료농축이 가능한 1차원 분리기능 및 시료분리칼럼을 이용한 1차원 분리와 역상 2차원 분리를 연결하여 분리 효율을 높일 수 있는 2차원 분리기능 및 용매에 고압을 생성하여 단백질을 펩티드 상태로 소화시켜주는 온라인 소화기능을 수행할 수 있다. 이와 더불어, 이산화티타늄칼럼을 이용하여 인산화된 펩티드만을 선택적으로 추출할 수 있다. 또한, 복수개의 칼럼과 복수개의 펌프를 이용함으로써 매회 반복되는 실험 사이에 소요되는 칼럼 평형화 시간 동안 실험을 멈추어야 하는 휴지 시간(dead time)을 최소화하여 실험속도를 증가시킬 수 있다. 즉, 제1 용매공급펌프의 용매가 제1 역상 액체크로마토그래피칼럼으로 흐를 경우 제2 용매공급펌프의 용매는 제2 역상 액체크로마토그래피칼럼으로 흐르면서, 한쪽 칼럼에서 시료가 분석되는 동안 다른쪽 칼럼은 용매가 흐르면서 시료가 이동했던 경로를 씻어주고 칼럼 상태를 평형화시켜주는 역할을 하므로, 휴지시간을 최소화하고 시료분석효율을 높일 수 있는 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 자동화 이중 온라인 역상 액체크로마토그래피 장치에서 시료로딩단계에서의 각 밸브의 구성도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 자동화 이중 온라인 역상 액체크로마토그래피 장치에서 온라인 소화기능을 수행하는 과정에서의 각 밸브의 구성도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 자동화 이중 온라인 역상 액체크로마토그래피 장치에서 1차원 분리기능을 수행하는 과정에서의 각 밸브의 구성도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 자동화 이중 온라인 역상 액체크로마토그래피 장치에서 2차원 분리기능을 수행하는 과정에서의 각 밸브의 구성도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 자동화 이중 온라인 역상 액체크로마토그래피 장치에서 인산화펩티드 추출기능을 수행하는 과정에서의 각 밸브의 구성도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 자동화 이중 온라인 역상 액체크로마토그래피 장치에서, 제1 역상 액체크로마토그래피칼럼에서 시료 분석이 이루어지는 동안 제2 고체상 추출칼럼 및 제2 역상 액체크로마토그래피칼럼에서 평형화가 이루어지는 과정에서의 각 밸브의 구성도이다.
이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 자동화 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치는 도 1에 도시된 바와 같이, 분석 대상이 되는 시료가 로딩되는 시료유입밸브(100); 제1 고체상 추출칼럼(410a) 및 제1 역상 액체크로마토그래피칼럼(420a)과 유체연통되는, 제1 트랩밸브(400a); 제2 고체상 추출칼럼(410b) 및 제2 역상 액체크로마토그래피칼럼(420b)과 유체연통되는, 제2 트랩밸브(400b); 유입되는 유체를 상기 제1 트랩밸브 또는 상기 제2 트랩밸브로 선택적으로 각각 배출시키는 제1 분리밸브(600a) 및 제2 분리밸브(600b); 상기 시료유입밸브에서 상기 제1, 제2 트랩밸브로 향하는 유로에 위치하며, 시료분리칼럼(310)이 연결되는 다기능 선택밸브(300); 및 상기 시료유입밸브로부터 유출되는 유체를 상기 다기능 선택밸브, 상기 제1 트랩밸브, 또는 상기 제2 트랩밸브로 선택적으로 공급하는 연결밸브(200);를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 자동화 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치는 상술한 각 밸브들의 모드(또는 포지션)를 변경시킴으로써, 즉 밸브의 단순 조작만으로 다양한 기능을 수행함과 동시에 한쪽 칼럼에서 시료가 분석되는 동안 다른쪽 칼럼은 용매가 흐르면서 시료가 이동했던 경로를 씻어주고 칼럼 상태를 평형화시켜 휴지시간을 최소화할 수 있다. 여기서, 시료유입밸브(100), 연결밸브(200), 제1 및 제2 분리밸브(600a, 600b), 제1 및 제2 트랩밸브(400a, 400b)는 2개의 모드를 포함할 수 있고, 액체크로마토그래피 장치의 다양한 기능을 수행하는데 이용되는 다기능 선택밸브(300)는 3개 또는 4개의 모드를 포함할 수 있다. 이하에서는 제1 역상 액체크로마토그래피칼럼에서 시료의 분석이 이루어지는 과정과, 시료 분석 과정에서 동시에 칼럼의 평형화가 진행되는 과정을 예를 들어 설명하기로 한다.
도 1은 시료로딩단계에서 자동화 이중 온라인 액체크로마토그래피 장치의 밸브 구성도를 도시한 도면이다.
시료유입밸브(100)는 분석하고자 하는 시료를 유입하여 시료를 로딩하는 밸브로서, 시료유입포트(101), 시료방출포트(102), 시료저장루프(107)에 의해 서로 연결된 제1 시료저장루프 연결포트(103) 및 제2 시료저장루프 연결포트(104), 용매유입포트(105), 및 용매유출포트(106)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시에에 따른 자동화 이중 온라인 액체크로마토그래피 장치는 도 1에 도시된 바와 같이 2개의 용매공급펌프(500a, 500b)를 이용하여 2개의 역상 액체크로마토그래피칼럼 중 하나의 칼럼에서 시료의 분석이 이루어지는 동안 다른 하나의 칼럼에서는 칼럼의 평형화를 가능하게 한다. 또한, 이와 같은 자동화 이중 온라인 액체크로마토그래피 장치에서는 다기능 선택밸브(300)를 이용하여 유체의 이동경로를 변경시킴으로써, 탈염과정 및 시료농축이 가능한 1차원 분리기능, 시료분리칼럼을 이용한 1차원 분리와 역상 2차원 분리를 연결하여 분리 효율을 높일 수 있는 2차원 분리기능, 용매에 고압을 생성하여 단백질을 펩티드 상태로 소화시켜주는 온라인 소화기능 이외에도 이산화티타늄칼럼을 이용하여 인산화된 펩티드만을 선택적으로 추출하는 기능을 수행할 수 있다.
도 1에 도시된 시료유입밸브의 상태는 시료가 로딩되는 단계를 나타낸 것으로서, 시료유입포트(101)와 제1 시료저장루프 연결포트(103), 시료방출포트(102)와 제2 시료저장루프 연결포트(104)가 각각 서로 유체연통되어 있어서 시료는 시료유입포트(101)를 통하여 시료저장루프(107)에 유입될 수 있다. 이와 같은 시료저장루프(107)를 통해 사용자가 시료의 농도가 너무 낮다고 판단하는 경우에는 시료 주입을 복수회 반복함으로써 충분한 시료 농도를 얻는 것이 가능하게 된다.
시료저장루프(107)는 1㎕ 내지 10㎕의 체적을 갖는 것이 바람직하며, 시료저장루프(107)의 체적이 1㎕ 미만인 경우에는 시료의 취급이 어렵다는 문제점이 있고, 10㎕를 초과하는 경우에는 시료주입시간이 길어지는 문제점이 있어서 바람직하지 않다.
또한, 시료유입밸브(100)는 시료방출포트(102)를 포함하는데, 시료방출포트(102)는 시료가 시료저장루프(107)에서 상술한 체적 범위 내로 수용될 수 있도록 여분의 시료를 방출하는 역할을 한다.
상술한 바와 같이 시료의 유입이 완료되면, 시료유입밸브(100)의 모드 전환 스위치(미도시)를 이용하여 시료유입밸브의 연결상태를 도 1에 도시된 제1 모드에서 도 2에 도시된 제2 모드로 변환시킨다.
시료유입밸브(100)의 제2 모드에서는 제1 시료저장루프 연결포트(103)와 용매유출포트(106)가 유체 연통되며, 제2 시료저장루프 연결포트(104)와 용매유입포트(105)가 유체연통되도록 구성된다.
한편, 본 발명의 일 실시예에 따른 자동화 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치는 용매를 공급하는 제1 용매공급펌프(500a) 및 제2 용매공급펌프(500b)를 더 포함할 수 있다. 도 1에 도시된 바와 같이, 제1 용매공급펌프(500a)는 시료유입밸브(100) 또는 연결밸브(200)에 유체연통될 수 있고, 제2 용매공급펌프(500b)는 제2 분리밸브(600b)에 유체연통될 수 있다.
이들 각 용매공급펌프(500a, 500b)는 5,000 psi 내지 20,000 psi의 압력으로 용매를 공급하는 것이 바람직한데, 용매의 공급 압력이 5,000 psi 미만인 경우에는 사용가능한 칼럼의 길이가 짧아져서 분리분해능이 저하되는 문제점이 있고, 20,000 psi를 초과하는 경우에는 밸브에서 용매가 누출될 수 있는 가능성이 있어서 바람직하지 않다.
용매공급펌프(500a, 500b)에서 공급되는 용매는 제1 용매 또는 제1 용매와 제2 용매의 혼합물일 수 있다. 이를 위해, 용매공급펌프(500a, 500b)에는 제1 용매 또는 제1 용매와 제2 용매가 일정비율로 섞여진 혼합용매를 공급할 수 있도록 용매선택밸브(미도시)가 설치될 수 있다.
또한, 제1 용매공급펌프(500a)에는 시료유입밸브(100) 또는 연결밸브(200)에 용매를 선택적으로 공급하는 T형 용매분리관(510)이 연결될 수 있다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 자동화 이중 온라인 역상 액체크로마토그래피 장치에서 온라인 소화기능을 수행하는 과정에서의 각 밸브의 구성도이다.
제1 용매공급펌프(500a)를 통해 용매유입포트로부터 제1 용매가 시료유입밸브(100)로 유입되며, 공급되는 제1 용매의 유압에 의해서 시료저장루프(107)에 머물던 시료는 용매유출포트(106)를 통해 배출되고, 연결밸브(200)에 이르게 된다.
연결밸브(200)는 제1 유입포트(201), 제2 유입포트(202), 제1 연결포트(203), 제2 연결포트(204), 제1 유출포트(205) 및 제2 유출포트(206)를 포함할 수 있고, 연결밸브(200)의 제1 유입포트(201)는 시료유입밸브(100)의 용매유출포트(106)와 유체연통되어 있다.
온라인 소화기능을 수행하는 과정에서 연결밸브(200)는 제1 유입포트(201), 제1 연결포트(203), 제2 연결포트(204), 제1 유출포트(205)를 순차적으로 유체연통된 모드를 가진다. 따라서, 용매공급펌프로부터 유입된 제1 용매는 시료와 함께 연결밸브(200)의 제1 유입포트(201), 제1 연결포트(203), 제2 연결포트(204), 제1 유출포트(205)를 거치면서 연결밸브를 통과하게 된다. 이 때, 도 2에 도시된 바와 같이 연결밸브에는 서로 유체연통된 포트들 사이에 Z형 유로가 형성되게 된다.
연결밸브(200)를 통과한 제1 용매는 연결밸브(200)의 제1 유출포트(205)와 유체연통된 다기능 선택밸브(300)의 유입포트(301)를 통해 다기능 선택밸브에 이르게 된다.
다기능 선택밸브(300)는 도 2에 도시된 바와 같이 유입포트(301), 유출포트(307), 시료분리칼럼(310)의 양단이 각각 연결되는 제1 시료분리칼럼 연결포트(302), 제2 시료분리칼럼 연결포트(303), 이들 포트들과 선택적으로 연결가능하게 구성된 제1 선택포트(304), 제2 선택포트(305), 및 제3 선택포트(306)를 포함하여 구성될 수 있다. 또한, 인산화펩티드 추출기능을 위해 이산화티타늄칼럼(311)이 더 연결될 수 있는데, 이 때 다기능 선택밸브(300')는 이산화티타늄칼럼(311)의 양단에 연결되는 제1 이산화티타늄칼럼 연결포트(308) 및 제2 이산화티타늄칼럼연결포트(309)를 추가로 포함할 수 있다.
다기능 선택밸브(300)는 액체크로마토그래피 장치에서 시료가 로딩되는 시료유입밸브에서 로딩된 시료가 분석되는 역상 액체크로마토그래피 칼럼이 연결되는 트랩밸브를 향하는 유로에 위치할 수 있다.
본 발명에 따른 다기능 선택밸브(300)는 각 포드의 연결상태를 변경함으로써 3가지 모드를 구현할 수 있고, 이산화티타늄칼럼(311)이 연결된 경우라면 4가지 모드를 구현할 수 있다.
도 2에 도시된 다기능 선택밸브(300)는 그 중 첫번째인 온라인 소화기능을 수행하는 유체폐쇄모드를 나타낸다. 즉, 유체폐쇄모드에서는 시료유입밸브로부터 배출되는 유체가 다기능 선택밸브(300) 내부로의 유입이 방지된다. 도 2에 도시된 바와 같이, 이 모드에서는 유입포트(301)와 유출포트(307)은 서로 유체단절되어 있다. 이를 위해 제2 선택포트(305)와 제1 시료분리칼럼 연결포트(302), 유출포트(307)와 제1 선택포트(304), 제2 시료분리칼럼 연결포트(303)와 제3 선택포트(306)가 각각 서로 유체연통될 수 있다. 따라서, 유입되는 제1 용매는 다기능 선택밸브(300)를 통과하지 못하고 이에 따라 공급되는 제1 용매의 압력은 점점 증가하게 된다. 이와 같이, 용매의 이송과정에서 용매의 흐름을 막아 높은 압력을 발생시킴으로써 단백질을 펩티드 상태로 소화시켜주는 온라인 소화기능이 수행되게 된다. 이 경우, 온라인 소화기능은 용매의 압력이 증가될수록 그 효율이 향상되므로, 제1 용매의 압력을 밸브의 최대허용압력까지 높여주는 것이 좋다.
한편, 이산화티타늄칼럼이 연결된 9포트의 다기능 선택밸브(300')에서는 제1 이산화티타늄칼럼 연결포트(308)를 폐쇄시킴으로써 유체폐쇄모드를 구현할 수 있다.
온라인 소화기능이 수행된 이후, 시료의 탈염 및 농축을 위한 1차원 분리과정이 수행될 수 있다. 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 자동화 이중 온라인 역상 액체크로마토그래피 장치에서 1차원 분리기능을 수행하는 과정에서의 각 밸브의 구성도이다.
도 3에 도시된 바와 같이, 1차원 분리기능을 수행하기 위해서 다기능 선택밸브(300)를 유체통과모드, 즉 유입포트(301)와 유출포트(307)를 직접 서로 유체연통시키도록 모드를 변경시킨다. 이 때, 7포트의 다기능 선택밸브(300)에서는 제2 선택포트(305)와 제3 선택포트(306), 제2 시료분리칼럼 연결포트(303)와 제1 선택포트(304)가 각각 서로 유체연통될 수 있다. 또한, 9포트의 다기능 선택밸브(300')에서는 제1 선택포트(304)와 제2 이산화티타늄칼럼 연결포트(309), 제2 선택포트(305)와 제2 선택포트(306)가 각각 서로 유체연통될 수 있다. 이와 같은 포트들의 연결관계는 일 실시예에 불과하며, 원하는 모드를 위해 다양한 포트들의 연결관계를 가질 수 있음은 당업자에게 자명하다.
이와 같은 포트의 연결관계에 따라 유입포트로부터 유입된 용매가 시료분리칼럼(310)을 통과하지 않고 유출포트를 통해 제1 트랩밸브(400)쪽으로 배출될 수 있다.
다기능 선택밸브를 통과한 제1 용매는 제1 분리밸브에 이르게 된다. 제1 분리밸브는 유입되는 유체를 제1 트랩밸브(400a) 또는 제2 트랩밸브(400b)로 선택적으로 배출가능하게 하는 밸브이다. 이를 위해 제1 분리밸브(600a)는 제1 유입포트(601), 제2 유입포트(602), 제1 유출포트(603) 및 제2 유출포트(604)를 포함할 수 있다.
제1 분리밸브(600a)는 제1 유입포트(601)와 제1 유출포트(603), 제2 유입포트(602)와 제2 유출포트(604)가 각각 서로 유체연통되는 제1 모드와, 제1 유입포트(601)와 제2 유출포트(604), 제2 유입포트(602)와 제1 유출포트(603)가 각각 서로 유체연통되는 제2 모드를 포함할 수 있다. 다기능 분리밸브(300)를 통과한 제1 용매가 제1 트랩밸브(400a)에 이르게 하기 위해 제1 분리밸브(600a)는 상술한 제1 모드 상태에 있게 된다.
제1 분리밸브(600a)가 제1 모드인 상태에서 제1 용매는 제1 트랩밸브(400a)로 이송된다. 제1 트랩밸브(400a)는 제1 고체상 추출칼럼(410a)과 연통되는 고체상 추출칼럼 연결포트(402), 제1 역상 액체크로마토그래피칼럼(420a)과 연통되는 역상 액체크로마토그래피칼럼 연결포트(406), 제1 유입포트(401), 제2 유입포트(404), 고체상 추출칼럼 연결포트와 시료이동루프(407)에 의해 연결된 시료이동루프 연결포트(403), 및 방출포트(405)를 포함할 수 있다.
시료를 함유한 제1 용매가 제1 고체상 추출칼럼에 유입되기 위해, 제1 트랩밸브(400a)는, 도 3에 도시된 바와 같이, 제1 유입포트(401)와 고체상 추출칼럼 연결포트(402), 시료이동루프 연결포트(403)와 방출포트(405), 역상 액체크로마토그래피칼럼 연결포트(406)와 제2 유입포트(404)가 각각 서로 유체연통되도록 모드를 설정할 수 있다.
따라서, 다기능 선택밸브(300)로부터 배출되어 제1 용매와 함께 이송된 시료는 제1 유입포트(401)를 경유하여 고체상 추출칼럼 연결포트(402)를 통해서 제1 고체상 추출칼럼(410a)으로 주입된다. 이 때, 주입되는 시료의 흐름방향(또는 제1 용매의 흐름방향)은 도시된 화살표 방향과 같다.
고체상 추출칼럼(410a. 410b)은 고체상 추출칼럼 연결포트(402)에 직접 결합된 칼럼으로서, 본 발명에 있어서, 고체상 추출칼럼은 50㎛ 내지 500㎛의 내경 및 1cm 내지 4cm의 길이를 갖는데, 이는 종래 통상적인 고체상 추출 칼럼에 비해서 매우 짧은 길이를 갖는 것으로, 본 발명에서는 약 20,000psi 정도의 초고압에서 구동됨에도 불구하고 고체상 추출칼럼의 길이가 상술한 바와 같이 매우 작기 때문에, 시료의 분리분해능을 극대화할 수 있게 된다. 또한, 후술하는 바와 같이, 유입되는 시료의 흐름방향과 역상 액체크로마토그래피 칼럼을 향해 용출되는 시료의 흐름방향이 서로 반대이므로 더욱 향상된 시료 분리분해능을 달성할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 고체상 추출칼럼(410a, 410b)으로 내부 인듀서 (internal inducer)의 스테인레스 스틸 라이너(liner)를 사용할 수 있으며, C18 등의 물질을 내부에 충진시킨 다음, 양 말단을 약 2㎛ 정도의 세공 크기를 갖는 스테인레스 스틸 스크린으로 막아서 충진물의 유출을 차단함으로써, 높은 압력에 견딜 수 있는 견고한 고체상 추출 칼럼을 이용할 수 있다.
또한, 방출포트(405)는 시료 중에 함유된 염 성분을 함께 방출함으로써, 효율적인 탈염 공정이 이루어질 수 있도록 한다.
이러한 과정에 의해서 상기 시료의 탈염이 진행되는 동안 고체상 추출칼럼 내에서의 유속은 1.8 ㎕/분 내지 3.0 ㎕/분으로 조절될 수 있다.
고체상 추출칼럼 내에서의 유속을 1.8 ~ 3.0 ㎕/분으로 제한하는 이유는 탈염 효율의 증가, 생성되는 내부 압력 증가의 방지 및 고체상 추출칼럼에서 시료의 유실을 최소화를 보장하기 위해서이다.
다음으로, 제1 용매가 시료분리칼럼을 통과하게 하여 시료를 분획한 다음 시료의 탈염 및 농축 효율을 높일 수 있는 2차원 분리기능을 설명한다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 자동화 이중 온라인 역상 액체크로마토그래피 장치에서 2차원 분리기능을 수행하는 과정에서의 각 밸브의 구성도이다.
제1 트랩밸브(400a)의 제1 고체상 추출칼럼(410a)에서 2차원 분리기능을 수행하기 위해서는 1차원 분리기능에서의 시료유입밸브(100), 연결밸브(200) 및 제1 트랩밸브(400b)의 밸브 구성은 그대로 유지하고, 다기능 선택밸브(300)의 모드를 유체통과모드에서 칼럼통과모드로 전환시키면 된다. 즉, 도 4에 도시된 바와 같이 다기능 선택밸브의 칼럼통과모드란, 유입되는 유체가 시료분리칼럼(310)을 통과하여 트랩밸브 쪽으로 배출되도록 하는 것으로서, 이 칼럼통과모드에서는 유입포트(301)와 제1 시료분리칼럼 연결포트(302), 유출포트(307)와 제2 시료분리칼럼 연결포트(303)가 각각 서로 유체연통되며, 이 때 제2 선택포트(305)와 제3 선택포트(306)은 서로 유체연통될 수 있다.
여기서, 시료분리칼럼(310)은 역상 액체크로마토그래피칼럼과 결합하여 2차원 분리기능을 수행할 수 있는 모든 칼럼이 될 수 있다. 예를 들면, 강양이온교환(Strong Cation eXchange, SCX)칼럼, 약음이온교환(Weak Anion eXchange, WAX)칼럼, 힐릭(Hydrophilic Interaction Chromatography, HILIC)칼럼, 강약이온혼합(SCX-WAX MIXED)칼럼 등이 시료분리칼럼으로 이용될 수 있다.
9포트의 다기능 선택밸브(300')에서는 유입되는 유체가 이산화티타늄칼럼(311)을 통과하지 않고 시료분리칼럼(310)을 통과하여 배출되어야 하기에 제1 선택포트(304)와 제2 이산화티타늄칼럼 연결포트(309), 제2 선택포트(305)와 제3 선택포트(306)가 각각 서로 유체연통될 수 있다.
이와 같은 밸브의 구성을 통해 다기능 선택밸브(300)에 유입된 제1 용매는 시료분리칼럼(310)을 통과하여 제1 트랩밸브(400a)의 제1 고체상 추출칼럼(410a)에 주입될 수 있으며, 이로 인해 시료의 분획이 이루어진 후에 시료의 탈염 및 시료의 농축 효율을 더욱 높일 수 있다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 자동화 이중 온라인 역상 액체크로마토그래피 장치에서 인산화펩티드 추출기능을 수행하는 과정에서의 각 밸브의 구성도이다.
제1 트랩밸브(400a)의 제1 고체상 추출칼럼(410a)에서 인산화펩티드 추출기능을 수행하기 위해서는 2차원 분리기능에서의 시료유입밸브(100), 연결밸브(200) 및 제1 트랩밸브(400b)의 밸브 구성은 그대로 유지하되, 다기능 선택밸브(300')에는 이산화티타늄칼럼(311)이 연결되어야 하며, 다기능 선택밸브(300')의 모드를 이산화티타늄칼럼통과모드로 변경시키면 된다. 즉, 도 5에 도시된 바와 같이 다기능 선택밸브의 이산화티타늄칼럼통과모드란, 유입되는 유체가 이산화티타늄칼럼(311)을 통과하여 트랩밸브 쪽으로 배출되도록 하는 것으로서, 이산화티타늄칼럼통과모드에서는 유입포트(301)와 제1 이산화티타늄칼럼 연결포트(308), 유출포트(307)와 제2 이산화티타늄칼럼 연결포트(309)가 각각 서로 유체연통되며, 이 때 제1 선택포트(304)와 제1 시료분리칼럼 연결포트(302), 제2 선택포트(305)와 제3 선택포트(306)는 각각 서로 유체연통될 수 있다.
이와 같은 밸브의 구성을 통해 다기능 선택밸브(300')에 유입된 제1 용매는 이산화티타늄칼럼(311)을 통과하여 제1 트랩밸브(400a)의 제1 고체상 추출칼럼(410a)에 주입될 수 있으며, 이로 인해 인산화된 펩티드를 추출할 수 있다.
지금까지는 시료가 시료유입포트(101)를 통하여 시료저장루프(107)에 소정량 채워진 다음 제1 용매를 이용하여 시료의 온라인 소화기능이 수행되고, 제1 트랩밸브(400a)에 유체연통된 제1 고체상 추출칼럼(410a)에서 1차원 분리기능, 2차원 분리기능 및 인산화펩티드 추출기능이 수행되는 과정을 설명하였다.
다음 과정으로는, 제1 고체상 추출칼럼(410a)에 주입된 시료를 제2 용매를 사용하여 분리함으로써 시료를 분석하는 과정이 수행되어야 하는 바, 이하 이에 대해서 설명하기로 한다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 자동화 이중 온라인 역상 액체크로마토그래피 장치에서, 제1 역상 액체크로마토그래피칼럼에서 시료 분석이 이루어지는 동안 제2 고체상 추출칼럼 및 제2 역상 액체크로마토그래피칼럼에서 평형화가 이루어지는 과정에서의 각 밸브의 구성도이다.
시료분석과정에서의 용매는 제1 용매와 제2 용매의 혼합용매가 사용되며, 혼합용매의 비율을 달리하여 용매 기울기를 통해 시료의 분리가 이루어진다.
도 6을 참조하면, 제2 용매공급펌프(500b)를 통해 제1 용매와 제2 용매의 혼합용매를 제1 트랩밸브(400a)에 공급한다. 이 때, 제2 분리밸브(600b)는 제2 용매공급펌프(500b)로부터 공급되는 혼합용매를 제1 트랩밸브(400a)로 안내하는 역할을 한다.
제2 분리밸브(600b)는 전술한 제1 분리밸브(600a)와 같이 유입되는 유체를 제1 트랩밸브(400a) 또는 제2 트랩밸브(400b)로 선택적으로 배출할 수 있게 하는 밸브이다. 이를 위해, 제2 분리밸브(600b)는 제1 유입포트(601), 제2 유입포트(602), 제1 유출포트(603) 및 제2 유출포트(604)를 포함할 수 있다.
제2 분리밸브(600b)는 제1 유입포트(601)와 제1 유출포트(603), 제2 유입포트(602)와 제2 유출포트(604)가 각각 서로 유체연통되는 제1 모드와, 제1 유입포트(601)와 제2 유출포트(604), 제2 유입포트(602)와 제1 유출포트(603)가 각각 서로 유체연통되는 제2 모드를 포함할 수 있다. 제2 용매공급펌프(500b)로부터 공급되는 혼합용매를 제1 트랩밸브(400a)로 이송시키기 위해서는 도 6에 도시된 바와 같이 제2 분리밸브의 모드를 상술한 제2 모드로 변경시킨다.
제2 분리밸브(600b)를 통과한 혼합용매는 제1 트랩밸브(400a)로 유입되며, 제1 트랩밸브에 유체연통된 제1 역상 액체크로마토그래피칼럼에서 시료의 분석이 이루어지기 위해서 역상 액체크로마토그래피칼럼 연결포트(406)와 고체상 추출칼럼 연결포트(402), 제2 유입포트(404)와 시료이동루프 연결포트(403)가 각각 서로 유체연통되도록 제1 트랩밸브(400a)의 모드를 변경한다. 이 때, 제1 유입포트(401)와 방출포트(404)는 서로 유체연통될 수 있다. 따라서, 제2 유입포트(404)를 통해 유입된 혼합용매는 시료이동루프(407)를 거쳐 제1 고체상 추출칼럼(410a)에 이르고, 고체상 추출칼럼 연결포트(402)와 역상 액체크로마토그래피칼럼 연결포트(406)를 거쳐 제1 역상 액체크로마토그래피칼럼(420a)을 통과하게 된다. 이 경우, 제1 역상 액체크로마토그래피칼럼(420a)을 향해 용출되는 시료의 흐름방향(또는 혼합용매의 흐름방향)은 화살표와 같으며, 이는 제1 고체상 추출칼럼(410a)으로 유입되는 시료의 흐름방향(또는 제1 용매의 흐름방향)과 반대이므로, 시료의 분리 분해능을 더욱 개선시킬 수 있다.
제1 고체상 추출칼럼(410a)에서의 시료 분리는 제2 용매공급펌프(500b)로부터 공급되는 혼합용매 중의 제1 용매 및 제2 용매 비율을 시간 경과에 따라 변화시켜가며 수행된다. 즉, 혼합용매 중의 제2 용매 비율이 증가할수록 제1 고체상 추출칼럼(410a)에 결합된 시료의 해리 정도가 증가하여 제1 역상 액체 크로마토그래피 칼럼(420a)으로 유입되고, 이후 시료의 분리를 통해 분석이 이루어진다.
제1 용매 및 제2 용매로는 상술한 바와 같은 목적을 달성하기 위해서, 다양한 조합의 용매들이 선택될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니지만, 상기 제1 용매로서 0.1%의 포름산 수용액이 사용될 수 있고, 상기 제2 용매로서 90%의 아세토니트릴 수용액이 사용될 수 있다. 즉, 이는 전체 용매 중 아세토니트릴의 함량이 증가할수록 고체상 추출 칼럼에 결합된 시료의 해리 정도가 증가하는 시스템을 채택한 것이라 할 수 있다.
시료의 분리가 수행되는 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼(420a)은 10㎛ 내지 150㎛의 내경 및 10cm 내지 150cm의 길이를 갖는 것이 바람직하며, 제1 역상 액체크로마토그래피칼럼(420a)은 질량 분석기(mass spectrometer)에 연결됨으로써, 후속 분석 공정이 수행될 수 있다.
이와 같이 제1 역상 액체크로마토그래피칼럼(420a)에서 시료의 분석이 이루어지는 동안, 제1 용매공급펌프로부터 공급되는 제1 용매를 이용하여 제2 고체상 추출칼럼(410b) 및 제2 역상 액체크로마토그래피칼럼(420b)을 평형화시킬 수 있다.
이를 위해서는 도 6에 도시된 바와 같이 제1 용매공급펌프(500a)로부터의 제1 용매가 제2 트랩밸브(400b)를 통과하도록 연결밸브(200)의 모드를 변경시킨다.
즉, 제1 용매공급펌프(500a)로부터 공급되는 제1 용매가 연결밸브(200)를 거쳐 제2 분리밸브(600b)에 이르도록, 연결밸브(200)의 제2 유입포트(202), 제2 연결포트(204), 제1 연결포트(203), 제2 유출포트(206)가 순차적으로 유체연통되도록 연결밸브(200)의 모드를 변경한다. 이 경우에도 연결밸브 내의 유로 형상은 Z형상이 유지될 수 있다.
이 때, 제2 분리밸브(600b)에서는 제1 유입포트(601)와 제2 유출포트(604)가 서로 유체연통되어 있기 때문에, 제1 용매는 제2 분리밸브를 거쳐 제2 트랩밸브(600b)로 향할 수 있다.
한편, 제2 고체상 추출칼럼(410b) 및 제2 역상 액체크로마토그래피칼럼(420b)의 평형화를 위해, 역상 액체크로마토그래피칼럼 연결포트(406)와 고체상 추출칼럼 연결포트(402), 제2 유입포트(404)와 시료이동루프 연결포트(403)가 각각 서로 유체연통되도록 제2 트랩밸브(400b)의 모드를 변경한다.
따라서, 제2 트랩밸브(400b)로 유입된 제1 용매가 제2 고체상 추출칼럼(410b) 및 제2 역상 액체크로마토그래피칼럼(420b)을 지나면서 이들의 평형화가 가능하게 된다.
지금까지는 제1 역상 크로마토그래피칼럼에서 시료의 분석이 이루어지는 동안 제2 고체상 추출칼럼 및 제2 역상 액체크로마토그래피칼럼의 평형화가 이루어지는 과정에 대해 설명하였으나, 그 반대의 과정, 예컨대 제2 역상 크로마토그래피칼럼에서 시료의 분석이 이루어지는 동안 제1 고체상 추출칼럼 및 제1 역상 액체크로마토그래피칼럼의 평형화가 가능함은 물론이다.
아울러, 본 실시예에서는 제1 용매를 이용하여 온라인 소화기능, 1차원 분리기능, 2차원 분리기능, 인산화펩티드 추출기능을 모두 수행하고, 이후 혼합용매를 이용하여 시료를 분리 및 분석하는 과정을 일 예로 들어 설명하였지만, 필요에 따라 다양한 조합이 가능하다. 예를 들면, 혼합용매를 사용하여 시료의 분리 및 분석이 이루어지기 전에, 1차원 분리기능만을 수행하거나, 1차원 분리기능 및 2차원 분리기능을 함께 수행하거나, 먼저 온라인 소화기능을 사용하여 실험을 수행한 후 1차원 분리기능 또는 2차원 분리기능을 선택하여 수행할 수 있다. 나아가, 상술한 각 과정에서 인산화펩티드 추출기능을 추가로 수행할 수 있다.
본 발명의 단순한 변형 또는 변경은 모두 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 실시될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.
본 발명은 자동화 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치에 이용될 수 있다.

Claims (23)

  1. 분석 대상이 되는 시료가 로딩되는 시료유입밸브;
    제1 고체상 추출칼럼 및 제1 역상 액체크로마토그래피칼럼과 유체연통되는, 제1 트랩밸브;
    제2 고체상 추출칼럼 및 제2 역상 액체크로마토그래피칼럼과 유체연통되는, 제2 트랩밸브;
    유입되는 유체를 상기 제1 트랩밸브 또는 상기 제2 트랩밸브로 선택적으로 각각 배출시키는 제1 분리밸브 및 제2 분리밸브;
    상기 시료유입밸브에서 상기 제1, 제2 트랩밸브로 향하는 유로에 위치하며, 시료분리칼럼이 연결되는 다기능 선택밸브; 및
    상기 시료유입밸브로부터 유출되는 유체를 상기 다기능 선택밸브, 상기 제1 트랩밸브, 또는 상기 제2 트랩밸브로 선택적으로 공급하는 연결밸브;를 포함하는 자동화 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 자동화 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치에 용매를 공급하는 제1 용매공급펌프 및 제2 용매공급펌프를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 자동화 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 제1 용매공급펌프는 시료유입밸브 또는 상기 연결밸브에 유체연통되어 있고, 상기 제2 용매공급펌프는 상기 제2 분리밸브에 유체연통되어 있는 것을 특징으로 하는 자동화 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 제1 용매공급펌프는 T형 용매분리관을 통해 상기 시료유입밸브 또는 상기 연결밸브에 선택적으로 용매를 공급하는 것을 특징으로 하는 자동화 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 제1 용매공급펌프 및 상기 제2 용매공급펌프 중 하나 이상에는 제1 용매 또는 제1 용매와 제2 용매의 혼합용매를 공급할 수 있도록 용매선택밸브가 설치된 것을 특징으로 하는 자동화 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 시료유입밸브는, 시료유입포트, 시료방출포트, 시료저장루프에 의해 서로 연결된 제1 시료저장루프 연결포트 및 제2 시료저장루프 연결포트, 용매유입포트, 및 용매유출포트를 포함하는 것을 특징으로 하는 자동화 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 시료유입밸브는,
    상기 시료유입포트와 상기 제1 시료저장루프 연결포트가 유체연통되고, 상기 제2 시료저장루프 연결포트와 상기 시료방출포트가 유체연통되는 제1 모드; 및
    상기 제1 시료저장루프 연결포트와 상기 용매유출포트가 유체연통되며, 상기 제2 시료저장루프 연결포트와 상기 용매유입포트가 유체연통되는 제2 모드;를 포함하는 것을 특징으로 하는 자동화 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 연결밸브는, 제1 유입포트, 제2 유입포트, 제1 연결포트, 제2 연결포트, 제1 유출포트 및 제2 유출포트를 포함하는 것을 특징으로 하는 자동화 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 연결밸브는,
    상기 제1 유입포트, 상기 제1 연결포트, 상기 제2 연결포트, 상기 제1 유출포트가 순차적으로 유체연통되는 제1 모드; 및
    상기 제2 유입포트, 상기 제2 연결포트, 상기 제1 연결포트, 상기 제2 유출포트가 순차적으로 유체연통되는 제2 모드;를 포함하는 것을 특징으로 하는 자동화 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 연결밸브에는 서로 유체연통된 포트들 사이에 Z형 유로가 형성되는 것을 특징으로 하는 자동화 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 다기능 선택밸브는,
    상기 시료유입밸브로부터 배출되는 유체를 유입하여 상기 트랩밸브로 배출시키는 유체통과모드;
    상기 시료유입밸브로부터 배출되는 유체가 상기 시료분리칼럼을 통과하여 상기 트랩밸브로 배출되도록 하는 칼럼통과모드; 및
    상기 시료유입밸브로부터 배출되는 유체의 내부 유입을 방지하는 유체폐쇄모드;를 포함하는 것을 특징으로 하는 자동화 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 다기능 선택밸브는, 유입포트, 유출포트, 상기 시료분리칼럼의 양단과 각각 연결되는 제1 시료분리칼럼 연결포트 및 제2 시료분리칼럼 연결포트, 상기 모드들을 구현하도록 다른 포트들과 선택적으로 유체연통되는 복수의 선택포트를 포함하는 것을 특징으로 하는 자동화 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 유체통과모드에서 상기 유입포트와 상기 유출포트가 유체연통되고,
    상기 칼럼통과모드에서 상기 유입포트와 상기 제1 시료분리칼럼 연결포트, 상기 유출포트와 상기 제2 시료분리칼럼 연결포트가 각각 서로 유체연통되며,
    상기 유체폐쇄모드에서 상기 유입포트와 상기 유출포트가 유체단절되는 것을 특징으로 하는 자동화 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 다기능 선택밸브에는 이산화티타늄칼럼이 더 연결되고,
    상기 다기능 선택밸브는,
    상기 시료유입밸브로부터 배출되는 유체를 유입하여 상기 트랩밸브로 배출시키는 유체통과모드;
    상기 시료유입밸브로부터 배출되는 유체가 상기 시료분리칼럼을 통과하여 상기 트랩밸브로 배출되도록 하는 칼럼통과모드;
    상기 시료유입밸브로부터 배출되는 유체의 내부 유입을 방지하는 유체폐쇄모드; 및
    상기 시료유입밸브로부터 배출되는 유체가 상기 이산화티타늄칼럼을 통과하여 상기 트랩밸브로 배출되도록 하는 이산화티타늄칼럼통과모드;를 포함하는 것을 특징으로 하는 자동화 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 다기능 선택밸브는, 유입포트, 유출포트, 상기 시료분리칼럼의 양단에 각각 연결되는 제1 시료분리칼럼 연결포트 및 제2 시료분리칼럼 연결포트, 상기 이산화티타늄칼럼의 양단에 각각 연결되는 제1 이산화티타늄칼럼 연결포트 및 제2 이산화티타늄칼럼 연결포트, 상기 모드들을 구현하도록 다른 포트들과 선택적으로 유체연통되는 복수의 선택포트를 포함하는 것을 특징으로 하는 자동화 이중 온라인 다기능 액체크로마토 그래피 장치.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 유체통과모드에서 상기 유입포트와 상기 유출포트가 유체연통되고,
    상기 칼럼통과모드에서 상기 유입포트와 상기 제1 시료분리칼럼 연결포트, 상기 유출포트와 상기 제2 시료분리칼럼 연결포트가 각각 서로 유체연통되고,
    상기 유체폐쇄모드에서 상기 유입포트와 상기 유출포트가 유체단절되고,
    상기 이산화티타늄칼럼통과모드에서 상기 유입포트와 상기 제1 이산화티타늄칼럼 연결포트, 상기 유출포트와 상기 제2 이산화티타늄칼럼 연결포트가 각각 서로 유체연통되는 것을 특징으로 하는 자동화 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 제1 트랩밸브는,
    상기 제1 고체상 추출칼럼과 유체연통되는 고체상 추출칼럼 연결포트, 상기 제1 역상 액체크로마토그래피칼럼과 유체연통되는 역상 액체크로마토그래피칼럼 연결포트, 제1 유입포트, 제2 유입포트, 상기 제1 고체상 추출칼럼 연결포트와 시료이동루프에 의해 연결된 시료이동루프 연결포트, 및 방출포트를 포함하고,
    상기 제2 트랩밸브는,
    상기 제2 고체상 추출칼럼과 유체연통되는 고체상 추출칼럼 연결포트, 상기 제2 역상 액체크로마토그래피칼럼과 유체연통되는 역상 액체크로마토그래피칼럼 연결포트, 제1 유입포트, 제2 유입포트, 상기 제2 고체상 추출칼럼 연결포트와 시료이동루프에 의해 연결된 시료이동루프 연결포트, 및 방출포트를 포함하는 것을 특징으로 하는 자동화 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 제1 트랩밸브 및 상기 제2 트랩밸브 각각은,
    상기 고체상 추출칼럼 연결포트와 상기 제1 유입포트, 상기 시료이동루프 연결포트와 상기 방출포트가 각각 서로 유체연통되는 제1 모드; 및
    상기 역상 액체크로마토그래피칼럼 연결포트와 상기 고체상 추출칼럼 연결포트, 상기 제2 유입포트와 상기 시료이동루프 연결포트가 각각 서로 유체연통되는 제2 모드;를 포함하는 것을 특징으로 하는 자동화 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치.
  19. 제1항에 있어서,
    상기 제1 분리밸브 및 제2 분리밸브 각각은,
    제1 유입포트, 제2 유입포트, 제1 유출포트 및 제2 유출포트를 포함하는 것을 특징으로 하는 자동화 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 제1 분리밸브 및 상기 제2 분리밸브 각각은,
    상기 제1 유입포트와 상기 제1 유출포트, 상기 제2 유입포트와 상기 제2 유출포트가 각각 서로 유체연통되는 제1 모드; 및 상기 제1 유입포트와 상기 제2 유출포트, 상기 제2 유입포트와 상기 제1 유출포트가 각각 서로 유체연통되는 제2 모드;를 포함하는 것을 특징으로 하는 자동화 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치.
  21. 제1항에 있어서,
    상기 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼에서 상기 시료가 분석되는 동안 상기 제2 고체상 추출칼럼 및 상기 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼에서 평형화가 이루어지는 것을 특징으로 하는 자동화 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치.
  22. 제1항에 있어서,
    상기 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼에서 상기 시료가 분석되는 동안 상기 제1 고체상 추출칼럼 및 상기 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼에서 평형화가 이루어지는 것을 특징으로 하는 자동화 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치.
  23. 제1항에 있어서,
    상기 제1 고체상 추출칼럼에서, 유입되는 시료의 흐름방향과 상기 제1 역상 액체크로마토그래피 칼럼을 향해 용출되는 시료의 흐름방향은 서로 반대이고,
    상기 제2 고체상 추출칼럼에서, 유입되는 시료의 흐름방향과 상기 제2 역상 액체크로마토그래피 칼럼을 향해 용출되는 시료의 흐름방향은 서로 반대인 것을 특징으로 하는 자동화 이중 온라인 다기능 액체크로마토그래피 장치.
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