JP2002510787A - 小型高密度微多孔性固体支持物質、その調製、ならびに大型高分子および生体粒子の精製のための使用 - Google Patents

小型高密度微多孔性固体支持物質、その調製、ならびに大型高分子および生体粒子の精製のための使用

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、重合体の表皮がその中に固定されている高密度微多孔性無機酸化基質を含む小型高密度無機酸化固体支持体またはマイクロビーズ、および特に生体粒子または高分子量高分子の流動層精製のための下流の処理における使用を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野 本発明は、生体粒子または高分子量高分子を精製するための固体支持体に関す
る。
【０００２】発明の背景 核酸、多糖、蛋白質凝集体、ならびにウイルス、ウイルスベクター、膜蛋白質
、および細胞構成物といった生体粒子などの高分子量（「HMW」）高分子は、そ
の物理的特徴のゆえに生体原料から単離することが困難である。HMW高分子およ
び生体粒子を単離するための古典的技法には、密度勾配遠心分離法、精密ろ過、
限外ろ過およびクロマトグラフィが含まれる。これらの方法にはいくつかの実質
的欠点がある。密度勾配遠心分離法は時間がかかり、多大なエネルギーを要する
方法であり、分子または生体粒子が本来持っている異質性のゆえに限られた精製
しかできない。（Greenら、「治療への応用のためのスーパーコイルプラスミドD
NAの調製用精製法」、Biopharm、52〜62ページ（1997年5月）。）クロスフロー
ろ過などの膜技術は、浸透フラックスを維持するためにかなりのずれ応力を必要
とし、このレベルのずれ応力は分子または粒子の完全性にとって有害であり、し
たがってその生物活性にとって有害である。（Braasら、「遺伝子治療のための
レトロウイルスベクターの単離・精製戦略」、Bioseparation、6：211〜228（19
96）。）
【０００３】 高分子量分子または粒子の充填層クロマトグラフィおよび吸着も、操作する吸
着床容量および圧力低下に関して厳重な制限を設ける、これらの化合物の物理的
特徴によって妨害される。
【０００４】 一方では、これらの大きな生体構成物は、生体分離に一般的に用いられる古典
的なゲル媒質中に浸透せず、その結果、これらの大きな生体構成物は、吸着部位
の大部分が配置されている内部表面および細孔容積に近づくことはない。したが
って、移動液相と結合容積との間の分配は本質的に限られている。他方では、こ
れらの大きな、またはHMW生体構成物を取り込むのに十分大きな細孔を有する媒
質の製造は、そのような媒質の細孔における粒子内拡散がその大きなサイズのゆ
えに極度に制限されると考えられるため、興味が持たれない。したがって、その
ような媒質の物質移動および生産性は低いと考えられる。
【０００５】 したがって、非常に分子量の大きい分子および生体粒子のクロマトグラフィお
よび吸着は、吸着の様式に関係なく、遮蔽効果によって妨害される。標的HMW化
合物の吸着が起こるとしても、吸着ビーズの外表面だけに限られるため、結合能
は小さくなる。この正吸着として知られる操作様式は、この非常に低い結合能の
ためにほとんど用いられない。
【０００６】 固相吸着床の流出部分における大型高分子の直接回収は、負固相精製として知
られている。HMW化合物は遅延することなくカラムを通過するが、蛋白質、アミ
ノ酸、糖および塩などのより小さい不純物は、固相多孔性ビーズの粒子内容積中
に拡散し、そこで遅延が起こるか、または吸着されることもある。このアプロー
チは、分離性能にとって有害な多くの欠点を示す。第一に、分離がサイズ排除に
基づくものである場合、充填および操作線速度が非常に低く、カラムの生産性を
劇的に低下させる。加えて、分離が吸着に基づくものである場合、不純物が全て
ビーズ中に拡散して吸着されなければならないため、大量の樹脂が必要とされる
。さらに、負精製法では、非常に大きい高分子は流出部分に共溶出されるため、
これら高分子の異なるタイプ間の選択性はまったくない。特に、負クロマトグラ
フィ精製法を用いて、ゲノムDNAおよび大きなRNA分子からプラスミドを分離する
ことは不可能である。
【０００７】 正および負吸着法の中間のケースとして、操作条件をHMW化合物と不純物の両
方が吸着されるように設定することができる。この場合、標的成分（非常に大き
い高分子など）の流出は、ビーズの外表面がまず飽和して初めて起こる。しかし
、このような条件では、標的成分の回収が低下することになる。
【０００８】 さらに、HMW生体高分子（核酸や多糖など）および生体粒子の溶液は、粘度が
高い傾向にある。この高い粘度は、これらの化合物の精製に多くの様式で害を与
える。例えば： 化合物の拡散性を低下させ、そのため 結合層および粒子内物質移動速度を極度に低下させ、且つ 固定層カラムの液抵抗を上昇させて、大きな圧力低下を引き起こす。
【０００９】 物質移動抵抗の増加は、吸着剤の捕獲効率に対して極度に有害である。滞留時
間をより長くすることで、吸着速度の低下を相殺することができる。しかし、こ
のようなより長い滞留時間を得るためには、非常に低い線速度または非常に長い
カラムを用いる必要があると思われる。これらの戦略はいずれも、精製サイクル
の時間が非常に長くなり、圧力低下が大きくなるため、実施不可能である。
【００１０】 半硬質吸着剤は機械的ひずみがかかると変形し、カラムの詰まりを起こすため
、HMW高分子を含む試料などの高粘度試料によって生じる大きな圧力低下により
、これら半硬質吸着剤の使用は制限される。圧力低下を低減するために、非常に
低い流速または非常に大きい粒径を用いることができると考えられる。しかし、
これらの解決法はいずれも、一方ではサイクルの時間が長くなり、他方では大き
な生体粒子の相互作用表面積が小さすぎて結合能が非常に小さくなるため、調製
用レベルでは現実的ではない。
【００１１】 さらに、ビーズの充填層に注入された固体粒子は粒子内の空隙に徐々に取り込
まれ、そこで蓄積してカラムを不可逆的に詰まらせる傾向がある。
【００１２】 高粘度試料および供給溶液中の微粒子の存在に関連する問題の中には、撹拌タ
ンクの使用によって回避できるものもある。しかし、撹拌タンク接触器を用いた
固体と液体の混合では、捕獲効率が制限される。固定層に比べると、接触器内の
吸着剤濃度が低いために、撹拌タンクの生産性は低くなる。さらに、撹拌タンク
などの半開放系は、洗浄、清浄および自動化が困難である。
【００１３】 流動層接触器も、高粘度試料および不溶性粒子を含む試料を処理するための代
替手段である。（例えば、BuijsおよびWesselingh、「懸濁粒子を含む流れのた
めのバッチ式流動化イオン交換カラム」、J. Chrom.、201:319〜327（1980）；C
hase「膨脹層における吸着クロマトグラフィによる蛋白質の精製」、Tibtec、12
：296〜303（1994）；Somersら、「流動層反応器でのアフィニティクロマトグラ
フィによるエンド-ポリガラクツロナーゼの単離と精製」、Chem. Eng. J.、40：
B7〜B19（1989）；ならびにWellsら、「生体懸濁液からの生化学的回収における
液体流動層吸着」、バイオテクノロジーのための分離法（Separation for Biote
chnology）、M. Verall編、Ellis Harwood、Chicester、217〜224ページ（1987
）参照。）しかし、現在市販されている媒質または吸着剤は、HMW分子および粒
子の精製には不十分である。（米国特許第5522993号および欧州特許第0538350B1
号、第0607998B1号参照。）これらの媒質または吸着剤の内部多孔性は、非常に
大きい溶質には到達不可能であり、その粒径が大きいために外表面積が小さくな
るという不都合が生じる。その結果、これらの媒質はHMW分子および粒子の精製
のために限られた能力しか提供しないことになる。
【００１４】 流動層分離法は、充填層よりも操作圧が低く、供給溶液中の微粒子や懸濁物質
による詰まりが生じにくいため、このような方法は生体産物の回収において魅力
的である。流動層技術は、抗生物質などの小分子の回収のために1958年という早
い時期から利用されている。（Bartelsら、「ストレプトマイシン単離のための
新規イオン交換法」、Chem. Eng. Prog.、54（8）：49〜51（1958）；Belterら
、「ノボビオシン回収プロセスの開発」、Biotechnol. Bioeng.、15：533〜549
（1973）参照。）より最近になって、この技術は蛋白質などのより高分子量分子
の、非清澄供給溶液からの回収に適用されている。（A. Bascoul、「Fluidisati
on liquide-Solide. Erude hydrodynamique et extraction des proteines.」、
These d'etat、Universite Paul Sabatier、Toulouse、フランス（1989）；B. B
iscans、「Chromatographie d'echange D'ions en couche fluidisee. Extracti
on des proteines du lactoserum」、These de docteur ingenieur、Institut n
ational polytechnique de Toulouse、Toulouse、フランス（1985）；Biscansら
、Entropie、125/126：27〜34（1985）；Biscansら、Entropie、125/126：17〜2
6（1985）；DraegerおよびChase、「細胞存在下における蛋白質の液体流動層吸
着」、Bioseparation、2：67〜80（1991）；DraegerおよびChase、「蛋白質精製
のための液体流動層」、Trans IChemE、69（part C）：45〜53（1991）；J. van
der Weil、「吸着による生体産物の連続回収」、PhD Thesis、Delft Universit
y、Delft（1989）；ならびにWellsら、「生体懸濁液からの生化学的回収におけ
る液体流動層吸着」、バイオテクノロジーのための分離法（Separation for Bio
technology）、M. Verall編、Ellis Harwood、Chicester、217〜224ページ（198
7）参照。）
【００１５】 米国特許第4976865号は、蛋白質、酵素、毒素、および抗体などの中程度の分
子量の生体高分子を含む、自己変性傾向を有する分子を含む試料の流動層クロマ
トグラフィによる分離のための方法およびカラムを記載している。この方法は、
試料または供給溶液中のいかなる懸濁物質も、充填および洗浄中に除去されるが
、関心対象分子はカラムに充填された吸着剤の内部に拡散すると想定している。
しかし、米国特許第4976865号に記載されている方法および物質の操作結合能は
、HMW分子および生体粒子の生物精製には不十分である。
【００１６】 米国特許第5522993号および欧州特許第0538350B1号、第0607998B1号は、媒質
内に高密度物質の小粒子を有する重合体樹脂媒質、特にアガロースと、それらの
流動層での使用について記載している。使用について記載された、重合体樹脂媒
質内に取り込まれた高密度物質には、ガラス、石英、およびシリカが含まれる。
しかし、高密度物質小粒子の存在によってこの媒質の密度が上昇したにも関わら
ず、密度はまだ比較的低く、したがって、安定な流動層を得るためには、液相と
固相との間の低い密度の差を補うためにビーズの直径を大きくする必要がある。
欧州特許第0538350B1号、第0607998B1号はまた、重合体物質の多孔性凝集物から
なるビーズと、その中の密度制御粒子についても記載している。これら３つの特
許に記載されているビーズは、密度が低く、粒子サイズが大きいためにHMW高分
子および生体粒子の分離の役に立たず、HMW高分子および生体粒子の単離には不
十分である。
【００１７】発明の概要 本発明は、高い密度、低い多孔度、大きい外表面積、および高い結合能を示す
新規の高密度無機酸化固体支持体またはマイクロビーズを提供する。本発明の小
型高密度無機酸化固体支持体またはマイクロビーズは、充填層および流動層によ
る方法を含む、様々な固相吸着およびクロマトグラフィ法で用いることができ、
流動層装置において特に有用であり、またこのような流動層装置で用いるための
より高い線速度を可能にする。これらの固体支持体またはマイクロビーズは、生
体粒子および高分子量高分子などの大きい生体分子を、特に流動層または膨脹層
による方法で分離または単離するために特に適している。
【００１８】 したがって、本発明の一つの目的は、a）無機酸化基質の総容積の30％未満の
細孔容積を有する無機酸化基質と、b）無機酸化基質の細孔に固定された相互作
用重合体網目とを含む、高密度無機酸化固体支持体またはマイクロビーズに関す
る。本発明の高密度無機酸化固体支持体またはマイクロビーズは、約1.7〜11の
密度、好ましくは約2.1〜約10の密度を有し、且つ粒子サイズは約5μm〜500μm
の範囲、好ましくは約10μm〜100μmの範囲内である。
【００１９】 無機酸化基質は、一つの無機酸化物、または2つもしくはそれ以上の無機酸化
物の任意の組み合わせを含むことができる。好ましくは、無機酸化基質は、チタ
ニア、ジルコニア、イットリア、セリア、ハフニア、タンタリアおよびこれらに
類するものなどの超高密度無機酸化物、またはその混合物の粒子からなる。無機
酸化出発物質の粒子サイズは、望まれる表面の特徴に応じて変動することがあり
、典型的には、比較的平滑な無機酸化基質表面に対しては約0.1μm〜3μmの範囲
の粒子サイズが用いられ、より粗い無機酸化基質表面に対しては約3μm〜15μm
の範囲の粒子サイズが用いられる。
【００２０】 相互作用重合体網目は、共重合単量体、二官能性単量体、もしくはその組み合
わせ、または架橋合成線状重合体、天然有機重合体、もしくはその組み合わせを
含むことができ、相互作用重合体網目を形成するために用いられる成分は、得ら
れる重合体網目に所定の一つまたは複数の性質を付与するために選択される。相
互作用重合体網目成分は、得られる重合体網目が所望の標的分子に対する親和性
を有するように、または得られる重合体網目が、当業者には周知の技術を用いて
、所望の標的分子に対する親和性を有するように重合体網目を続いて官能性付加
もしくは誘導体化することができる、所定の一つまたは複数の性質を有するよう
に選択することができる。
【００２１】 本発明のもう一つの目的は、本明細書に記載の新規高密度無機酸化固体支持体
またはマイクロビーズの、固相吸着およびクロマトグラフィ法における使用に関
する。したがって、本発明はまた、所望の生体分子を、同分子を含む試料から分
離するための方法であって、a）無機酸化基質の総容積の30％未満の細孔容積を
有する無機酸化基質と、b）無機酸化基質の細孔に固定された相互作用重合体網
目とを含む、高密度無機酸化固体支持体またはマイクロビーズからなるクロマト
グラフィ吸着床をクロマトグラフィ装置に充填する段階と、該所望の生体分子を
含む試料をクロマトグラフィ装置に供給する段階と、試料の望まれない成分およ
び不純物をクロマトグラフィ装置から流出する段階と、所望の生体分子を高密度
無機酸化固体支持体から遊離する段階と、所望の生体分子をクロマトグラフィ装
置から溶出する段階とを含む方法にも関する。この方法において用いられる高密
度無機酸化固体支持体の相互作用重合体網目は、所望の生体分子に対する親和性
を有するように調製するか、または所望の生体分子に対する親和性を有するよう
に官能性付加もしくは誘導体化することもできる。さらに、試料をクロマトグラ
フィ装置に供給する際に、所望の生体分子を高密度無機酸化固体支持体またはマ
イクロビーズに吸着させる。
【００２２】 本発明のさらに別の目的は、所望の生体分子を、これを含む試料からクロマト
グラフィを用いて分離するための流動層による方法であって、i）無機酸化基質
の総容積の30％未満の細孔容積を有する無機酸化基質と、ii）無機酸化基質の細
孔に固定された相互作用重合体網目とを含む、高密度無機酸化固体支持体からな
るクロマトグラフィ吸着床を流動層反応器またはカラムに供給する段階と、該流
動層反応器またはカラム中に該高密度無機酸化固体支持体の流動層を作製する段
階と、高密度無機酸化固体支持体を流動層中に維持する条件下で該所望の生体分
子を含む試料を流動層反応器またはカラムに供給する段階と、試料の望まれない
成分および不純物を流動層反応器またはカラムから流出する段階と、所望の生体
分子を高密度無機酸化固体支持体から遊離させて所望の生体分子を流動層反応器
またはカラムから溶出する段階とを含む方法にも関する。この方法において用い
られる高密度無機酸化固体支持体の相互作用重合体網目は、所望の生体分子に対
する親和性を有するように調製するか、または所望の生体分子に対する親和性を
有するように官能性付加もしくは誘導体化することもできる。さらに、試料を流
動層反応器またはカラムに供給する際に、所望の生体分子を高密度無機酸化固体
支持体またはマイクロビーズに吸着させる。
【００２３】 本発明のこれらおよび他の目的は、本開示を読めば当業者には明らかになると
考えられる。
【００２４】発明の詳細な説明 古典的なクロマトグラフィ媒質およびその使用法は、HMW高分子および大きな
分子的実体の精製には不十分である。本発明は、HMW化合物に対して大きな結合
能を提供し、圧力低下が低く、処理量が高い流動層法で操作することができる、
粒径の小さい高密度吸着剤（本明細書において「固体支持体」または「マイクロ
ビーズ」とも呼ばれる）を提供する。さらに、本発明のマイクロビーズは、官能
性付加重合体または単量体によって修飾し、高選択性分離を利用できるようにす
ることもできる。
【００２５】 本発明にしたがい、超大型もしくはHMW高分子または生体粒子を、直径が小さ
く、非常に高密度の固体粒子を用いて分離することができる。これらの粒子は、
懸濁液中で、特に流動層様式で用いるために設計されている。充填層カラムとは
異なり、流動層接触器は低い液抵抗を示し、圧力低下による制限または詰まりに
よって妨害されることはない。
【００２６】 既存の典型的流動層粒子には、粒径が典型的には100〜300μmで、平均粒子密
度が約1.2g/mlの多孔性ゲル物質が含まれる。（Battら、「哺乳動物全細胞培養
ブイヨンからの蛋白質回収のための膨脹層吸着法」、Bioseparation、5：421〜5
2（1995）参照。）これらの物質は超大型もしくはHMW高分子および生体粒子の分
離には適していない。なぜなら、これらの成分は媒質の細孔またはゲル網目内に
拡散せず、媒質の外表面上にのみ吸着するからである。既存の流動層ゲル粒子の
直径が大きいために、所定量のビーズ容積の外表面積はあまり大きな値にはなら
ず、その結果、結合能は非常に小さい。さらに、ゲル型物質では限られた密度し
か得られず、典型的には1.1〜1.3g/cm3以内である。
【００２７】 HMW高分子または粒子が拡散できる細孔容積を拡大するよりもむしろ、本発明
によれば、ビーズの粒子サイズを低下させ、平均粒径の低下により表面積を増大
させる。球状粒子吸着床の単位容積あたりの表面積は、粒径の逆数に比例して変
動する。したがって、粒子サイズを低下させることにより、媒質の表面積は都合
よく増大し、それによって所定の分子に対する結合能が増大する。
【００２８】 しかし、流動層を扱うとき、小径のゲルビーズの有用性は、固体物質の終端速
度によって制限される。粒子の終端速度、すなわち上向きの液流によってビーズ
がカラムから放出される速度は、粒径の二乗に固相および液相の間の密度差を乗
じた値に応じて変動する。小さくて軽いビーズの場合、粒子の終端速度は非常に
低いため、ビーズがカラムから流出しないようにするためには、流動層様式での
操作で操作速度を非現実的に小さくする必要があると考えられる。これはすなわ
ち、密度が低い小型ゲル粒子は、流動速度があまり大きくない場合、例えば約50
cm/時未満でも、カラムまたは接触器から流出すると考えられる。したがって、
これらのビーズでは液相および固相の間の低い密度差を補うために大きな直径を
用いなければならないが、その結果、大きい粒径では媒質の結合能がより小さく
なる。
【００２９】 この問題は、本発明にしたがい、高い速度においても小径粒子またはマイクロ
ビーズの流動化を可能にする、非常に高い密度を示す新規固体物質を用いて作製
された小径粒子を用いることによって克服される。したがって、本発明の固体支
持体またはマイクロビーズでは、小さい粒径から得られる大きい外表面積と、そ
の結果としての大きい結合能が、ビーズまたは粒子の高い固体密度と組み合わさ
れ、本発明のこれらの固体支持体またはマイクロビーズを用いる方法において速
いプロセス速度の使用が可能になる。
【００３０】 本発明の固体支持物質または吸着剤は、チタニア、ジルコニア、イットリア、
セリア、ハフニア、およびタンタリアなどの超高密度無機酸化物、またはその混
合物を用いて作製される。クロマトグラフィに適用するための古典的な多孔性無
機酸化物を基にした物質とは異なり、本発明の固体支持物質または吸着剤は細孔
容積が小さいため、物質の見かけ密度は物質の固有密度に近いものとなる。本発
明の固体支持物質または吸着剤において、細孔容積は総ビーズ容積の約30％より
も低く、好ましくは細孔容積はビーズの総容積の5％〜25％、より好ましくは5％
〜15％である。固体支持物質または吸着剤の細孔容積は、十分な温度処理によっ
て調整することができる。
【００３１】 本発明の固体支持物質または吸着剤において、細孔容積は重合体が細孔内に固
定されるのに十分なちょうどの大きさとし、これらの固定された重合体は高分子
の相互作用が起こるビーズの外表面上に層をなす。得られた重合体の層、すなわ
ち相互作用重合体網目は、安定で、所定の位置に残留する。所望の分子の相互作
用は、固定重合体により、ビーズの外表面上で起こる。
【００３２】 本発明において用いるための無機酸化基質またはマイクロビーズは、無機酸化
物の小粒子の縮合、または重元素の塩溶性分子の縮合を可能にする方法によって
調製される。乳化／懸濁化技法、噴霧乾燥、またはゾル−ゲル法（例えば、米国
特許第5015373号に記載のとおり）などの、当業者には周知の様々な技術を用い
て、本発明に記載の組成物を凝集させることができる。
【００３３】 一般に、直径が0.1μm〜15μmの範囲の無機酸化微粒子（チタニア粉末もしく
はジルコニア粉末またはこれらに類するもの）を、可溶性ケイ酸ナトリウムを含
む水溶液に塩基性pHで懸濁させ、溶液を撹拌しながら油浴中に注いで、無機酸化
物の微粒子を含む小滴の懸濁液を得る。油懸濁液を有機酸で酸性化すると、ケイ
酸ナトリウムはゲルを形成し（液滴がゲル粒子に変わる）、これが高密度無機酸
化物の固体微粒子を取り込む。これらのゲル化したマイクロビーズを次いで、周
知の物理的手段を用いて油から分離し、約80℃〜200℃で乾燥する。ゲル硬化法
により、小粒子凝集物が安定化する。さらに、小粒子間の多孔性またはビーズ内
多孔性がゲル容積の低下によって現れる。この段階で、細孔容積はビーズ容積の
約30％〜70％である。
【００３４】 次いで、得られたビーズ化多孔性無機酸化粒子を高温、例えば約900℃〜1500
℃の範囲、好ましくは約1000℃〜1400℃で約1〜12時間焼成して、超微粒子を融
解し、粒径を小さくし、細孔容積を約30％未満に低下させる。焼成の温度および
時間は、出発物質として用いる一つまたは複数の無機酸化物の性質に応じて異な
り、当業者であれば容易に決定することができる。
【００３５】 次いで、乾燥した多孔度の低い無機粒子を、その細孔容積を上まわる量、好ま
しくは約5％〜10％を上まわる量の単量体溶液に加えることによって、乾燥した
多孔度の低い無機酸化粒子に官能性付加した単量体または重合体および架橋剤の
溶液を含浸し、重合を開始させる。有機産物の重合は、強度のUV光線またはガン
マ線照射もしくはマイクロ波などの他の任意の照射形態といった物理的誘導因子
に関連する、または関連しない周知の化学触媒を含むがこれらに限定されること
はない、化学的誘導因子によって達成される。単量体溶液の架橋または共重合を
誘導するために、温度も用いることができる。重合体の所望の官能性は、重合前
に適当な単量体を選択すること、または重合後の有機層に対する典型的な化学反
応によって得られる。
【００３６】 一例として、本発明にしたがい、ハフニア無機酸化基質またはマイクロビーズ
を、一般に総ビーズ容積の30〜70％の細孔容積を有する基質を生じる、当技術分
野において周知の様々な手段によって作製することができる。その後、細孔容積
をつぶしビーズの比密度を上げるために、得られたハフニアビーズを1200〜1400
℃で約2〜4時間焼成する。その結果、約30％〜70％であった初期細孔容積が、約
10％〜20％に低下する。
【００３７】 基剤となる無機酸化固体支持体または無機酸化基質の焼成後、適当なリガンド
または適当なリンカーを含む単量体混合物を含む溶液を、得られた細孔容積の小
さいハフニアビーズの細孔容積内に注入し、架橋剤存在下で共重合させる。単量
体溶液の含浸量は、官能性付加重合体が細孔内部に連結または固定され、且つ高
密度固体支持体物質またはマイクロビーズの外表面上に、薄層として存在するよ
うに、ビーズの細孔容積よりもわずかに高い、例えば1％〜10％、好ましくは5％
〜10％高い量でなければならない。
【００３８】 次いで、本発明にしたがって製造された固体支持体または吸着剤を分離し、洗
浄し、様々なクロマトグラフィ技法において用いることができ、特に、小型高密
度固体支持体またはマイクロビーズを、超大型高分子および生体粒子を含む、関
心対象生体分子または生体粒子を処理し、分離するために、流動層装置において
用いることができる。
【００３９】 本発明の小さい高密度固体支持体またはマイクロビーズの無機酸化基質と共に
網目化された相互作用重合体は、疎水性もしくは親水性重合体またはその両方を
含むことができる。この重合体構造は、特定の条件による単量体の重合によって
得ることができ、または線状可溶性重合体の架橋によって得ることもできる。
【００４０】 細孔内での固定と共に、無機酸化粒子またはビーズの表面上で単量体が共重合
される場合、初期含浸溶液は、アクリル単量体、ビニル化合物、およびアリル単
量体などの異なるファミリーからの単量体、またはその混合物からなっていても
よい。本発明で用いる典型的な単量体には以下のものが含まれるが、これらに限
定されることはない： −アクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、トリスアクリル、アクリル酸、ア
クリロイルグリシン、ジエチルアミノエチルメタクリルアミド、ビニルピロリド
ン、ビニルスルホン酸、アリルアミン、アリルグリシジルエーテル、またはその
誘導体およびこれらに類するものなどであるが、これらに限定されることはない
、アクリル、メタクリル、ビニル、およびアリル化合物の脂肪族イオン、非イオ
ン、および反応性誘導体； −ビニルトルエン、フェニルプロピルアクリルアミド、トリメチルアミノフェニ
ルブチルメタクリレート、トリチルアクリルアミド、またはその誘導体およびこ
れらに類するものなどであるが、これらに限定されることはない、アクリル、メ
タクリル、ビニル、およびアリル化合物の芳香族イオン、非イオン、および反応
性誘導体； −ビニルイミダゾール、ビニルピロリドン、アクリロイルモルフォリン、または
その誘導体およびこれらに類するものなどであるが、これらに限定されることは
ない、アクリル、メタクリル、ビニル、およびアリル化合物の複素環イオン、非
イオン、および反応性誘導体。
【００４１】 ゲル構造の安定性を増大させるために、二官能性単量体も、本発明の固体支持
体またはマイクロビーズの相互作用重合体網目形成において用いることができる
。本発明において用いるのに適した二官能性単量体は、相互作用重合体網目構造
を形成する過程で他の単量体と反応する、２つのアクリル基などの、２つの重合
可能な官能基を含むものである。より具体的には、本発明の固体支持物質または
マイクロビーズの相互作用重合体網目形成において用いることができる単量体に
は以下のものが含まれるが、これらに限定されることはない： −メチレン-ビス-アクリルアミド、エチレン-ビス-アクリルアミド、ヘキサメチ
レン-ビス-アクリルアミド、グリオキサール-ビス-アクリルアミドおよびこれら
に類するものなどであるが、これらに限定されることはない、ビスアクリルアミ
ド； −メチレン-ビス-メタクリルアミド、エチレン-ビス-メタクリルアミド、ヘキサ
メチレン-ビス-メタクリルアミドおよびこれらに類するものなどであるが、これ
らに限定されることはない、ビス-メタクリルアミド； −ジエチルグリコールジアクリレート、ジエチルグリコールメタクリレート、エ
チレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレートおよび
これらに類するものなどであるが、これらに限定されることはない、ビス-アク
リレート； −エチレングリコール-メタクリレートおよびこれらに類するもの；ならびに −ジアリルタートラジアミド。
【００４２】 本発明の固体支持体またはマイクロビーズの相互作用重合体網目を形成するた
めに選択された単量体、二官能性単量体、またはその組み合わせは、得られる重
合体網目に所定の一つまたは複数の性質を与える。細孔内に固定された重合また
は架橋ゲル網目が形成され、ビーズ表面に層をなす。本発明の固体支持物質また
は組成物に対して主な興味の対象となる性質には、イオン交換作用、疎水性会合
、逆相相互作用、生物特異的認識、およびこのような性質のすべての中間型、ま
たはこれらの性質の複数の組み合わせが含まれるが、これらに限定されることは
ない。
【００４３】 合成または天然原料からの線状重合体などの可溶性有機重合体も、本発明の無
機酸化高密度ビーズの細孔容積を満たし、外表面を覆うために用いることができ
る。合成および天然の可溶性重合体を、古典的な化学的および物理的手段、例え
ばビスエポキシ試薬、ビスアルデヒド、およびこれらに類するものなどであるが
、これらに限定されることはない、化学的二官能性架橋剤によって、所定の位置
（無機酸化ビーズまたは粒子の表面上および細孔構造内部）で架橋する。このよ
うな重合体の架橋後、本発明の固体支持体またはマイクロビーズの無機酸化基質
の細孔に連結または固定され、表面上に層をなした安定なゲル網目が形成される
。
【００４４】 本発明において有用な架橋剤には、二重結合、三重結合、アリル基、エポキシ
ド、アゼチジン、またはひずみ炭化水素環などの他の重合可能な基を少なくとも
一つ有するビニル単量体が含まれる。好ましい架橋剤には、N,N'-メチレン-ビス
-(アクリルアミド)、N,N'-メチレン-ビス-(メタクリルアミド)、ジアリルタート
ラジアミド、アリルメタクリレート、ジアリルアミン、ジアリルエーテル、ジア
リルカーボネート、ジビニルエーテル、1,4-ブタンジオールジビニルエーテル、
ポリエチレングリコールジビニルエーテル、および1,3-ジアリルオキシ-2-プロ
パノールが含まれるが、これらに限定されることはない。
【００４５】 本発明において用いることができる合成線状重合体には、ポリエチレンイミン
、ポリビニルアルコール、ポリビニルアミン、ポリビニルピロリドン、ポリエチ
レングリコール、ポリアミノ酸、核酸、およびそれらの誘導体が含まれるが、こ
れらに限定されることはない。本発明において用いることができる天然可溶性重
合体分子には、アガロース、デキストラン、セルロース、キトサン、グルコサミ
ノグリカン、およびそれらの誘導体などの多糖、ならびに核酸が含まれるが、こ
れらに限定されることはない。
【００４６】 本発明の小型高密度無機酸化固体支持体またはマイクロビーズは、流動層様式
、充填層様式、または他の操作様式で実施することができる様々なクロマトグラ
フィ法において、都合よく使用することができる。本発明の固体支持体またはマ
イクロビーズは、流動層による操作様式を用いた、未精製試料から関心対象とな
る所望の分子または生体粒子を分離または単離するための方法において特に有用
である。
【００４７】 試料から関心対象となる所望の高分子または標的分子を分離または精製するた
めの方法は、典型的には少なくとも２つの段階を含む。第一の段階は、本発明の
無機酸化固体支持体またはマイクロビーズを含む、充填層またはは流動層カラム
などのクロマトグラフィ装置に、その中の少なくとも一つが関心対象となる標的
分子である生体分子の混合物を含む溶液を投入する段階である。第２の段階は、
前記クロマトグラフィ装置に溶出溶液または溶出緩衝液を通過させて、固体支持
体またはマイクロビーズおよびクロマトグラフィ装置から関心対象となる標的分
子を放出させ、それにより試料から標的分子を分離する段階である。
【００４８】 「段階的」溶出は、例えば、溶出溶液または溶出緩衝液の溶媒含量、塩含量ま
たはpHを変化させることによって行うことができる。または、当技術分野におい
て周知の勾配溶出法を用いることもできる。本発明において用いるのに適した溶
出緩衝液または溶出溶液は、当業者には周知である。例えば、イオン強度、pHま
たは溶媒組成を変えることにより、固相支持体に結合している分子を遊離させる
ことができる。溶出緩衝液または溶出溶液は、塩勾配、pH勾配、または関心対象
となる所望の高分子もしくは標的分子を置換するのに特に有用な任意の特定の溶
媒もしくは溶媒混合物も含むことができる。
【００４９】 流動層装置で所望の高分子を分離または単離する方法において、所望の高分子
に対して親和性を有する相互作用重合体網目で官能性付加された、本発明の小型
高密度固体支持物質またはマイクロビーズを流動層装置に充填し、分離しようと
する所望の高分子を含む試料または供給溶液を流動層装置に供給する。試料また
は供給溶液は流動層装置を上向きに通過し、限られた圧力低下で固体支持物質ま
たはマイクロビーズを持ち上げる。そして、所望の高分子は、ビーズの相互作用
重合体網目が持つ一つまたは複数の官能性によって、小型高密度固体支持物質ま
たはマイクロビーズの表面に吸着し、したがって、不純物は連続的な上向きの流
れによって分離される。続いて同じ向きで洗浄を行い、流動層装置に溶出溶液ま
たは溶出緩衝液を通過させることによって吸着した高分子を遊離させ、pHの変化
、イオン強度の調節、または溶媒組成などの物理化学的変化、および他の当業者
には周知の手段の結果、所望の高分子が分離される。
【００５０】 分離を完了した後、固体支持体またはマイクロビーズを大量の洗浄液で洗浄し
て、非常に強固に吸着している生体物質をすべて除去し、別の分離サイクルを開
始できるように、適当な溶液中で再度平衡化する。
【００５１】 本発明の方法は、蛋白質（チログロブリン、α２マクログロブリン、IgGおよ
びIgMクラスの抗体、ならびにこれらに類するものなど）、炭水化物（ヒアルロ
ン酸など）、生体粒子（ウイルス、ウイルスベクター、膜蛋白質、細胞構成物、
およびこれらに類するものなど）、および核酸（プラスミド、DNA、RNA、大型オ
リゴヌクレオチド、およびこれらに類するものなど）を含む、広範囲の大きい生
体分子を単離または分離する際に有効である。本発明の固体支持体またはマイク
ロビーズは、核酸、プラスミド、多糖、蛋白質凝集体、ならびにウイルス、ウイ
ルスベクター、膜蛋白質、および細胞構成物といった生体粒子などの高分子量高
分子を分離または単離する方法において、特に有用である。このような方法は、
流動層による操作様式で実施されることが好ましい。
【００５２】 本発明の小型高密度固体支持物質またはマイクロビーズの、高分子量高分子お
よび生体粒子の捕獲に用いるための主な利点は、以下のとおりである： a）粒子サイズが小さいために、外部表面積が大きくなり、その結果、通常の
大型多孔性ゲル媒質と比べて結合能が大きくなる； b）大きな外表面への結合によって、細孔容積を最小にし、ビーズ密度を最大
にすることができる； c）超高密度ビーズによって、大型高分子および生体粒子を含む試料などの、
高粘度物質存在下でも、流動層接触器または装置で用いる高いプロセス線速度、
および低い操作圧が可能となる； d）粒子内拡散がないため、非常に迅速な物質移動が可能である、すなわち、
外表面を吸着−溶出メカニズムに用いるため、既存の多孔性物質を用いた従来の
固定層または流動層技術に比べて、最終的に回収する量が小さく、したがって、
吸着／溶出の動力学は非常に迅速で、吸着は非常に短い滞留時間で実施すること
ができ、溶出液中の標的分子の損失は無視できる程度となる； e）吸着表面はわずかな外表層に限られ、粒子内容積を含まないため、不純物
の吸着は従来の多孔性ゲル媒質に比べて少ない； f）溶出条件を調節することにより、異なる種類の超大型高分子間の分離が可
能である。
【００５３】 本発明の小型高密度無機酸化固体支持物質またはマイクロビーズの設計上可能
な変更には、物質の外表面の形状を変える段階、物質中の無機酸化物の組成を変
える段階、および本発明の小型高密度固体支持物質またはマイクロビーズの無機
酸化基質または基剤に固定された相互作用重合体網目の組成を変える段階が含ま
れるが、これらに限定されることはない。さらに、実質的にすべての高分子が相
互作用する、無機酸化固相または基剤の表面は、下記の実施例に示すとおり平滑
であってもよく、または表面積を増大させるために粗面であってもよい。
【００５４】 本発明はさらに、本発明の小型高密度固体支持体またはマイクロビーズの調製
およびこれを用いる方法について詳細に記載している下記の実施例を参照するこ
とによって、さらに明らかにされる。当業者であれば、本発明の目的および範囲
から逸脱することなく、物質および方法の両方に対して多くの改変を加えうるこ
とが明らかであると思われる。
【００５５】実施例１： 高密度細孔崩壊多孔性シリカマイクロビーズの乳化縮合による調製 30gの乾燥した固体不規則酸化シリコン（0.3〜3μmの範囲の粒子サイズを有す
る）を15mlの35％ケイ酸ナトリウム濃縮溶液に、撹拌しながら分散させ、次いで
、20mlの蒸留水および9mlの酢酸で希釈した。得られた均質な懸濁液を、2％のセ
スキオレイン酸ソルビタンを含むパラフィン油浴に振盪下でゆっくり注ぎ、小滴
として分散させた。
【００５６】 懸濁液を室温で1時間撹拌し、次いで85℃で1時間加熱した。
【００５７】 酸化シリコン粒子を含む分散した液滴が、ゲル化ビーズに変化した。得られた
ゲル化ビーズは、50μmの平均直径を有し、網目内にあらかじめ形成された固体
酸化シリコンの固体マイクロビーズを取り込んだシリカヒドロゲルを含んでいた
。ゲル化ビーズをろ過して回収し、洗浄し、80℃の空気流下で16時間乾燥した。
乾燥中、ヒドロゲルは徐々に脱水され、固体酸化シリコン微粒子を結合するよう
作用した。得られたビーズの細孔容積は、ビーズ容積の約1/3であった。次いで
ビーズを1100℃で2時間焼成した。この焼成の結果、ビーズよりも小さい粒子は
一部融解して互いに融合し、それにより細孔容積が低下した。この処理の後、最
終的な空隙細孔容積は、総ビーズ容積の約10％となった。乾燥ビーズの密度は約
2.1g/cm3であった。
【００５８】 ビーズの直径および直径の分布は、パラフィン油浴の機械的振盪と、用いる界
面活性剤の量によって制御される。ビーズの直径を制御するために、他の乳化手
段を用いることもできる。
【００５９】 得られた高密度固体支持物質またはマイクロビーズに特異的な生体分子吸着特
性を与えるために、続いてこの固体支持物質またはマイクロビーズを、様々な有
機重合体からなる相互作用重合体網目でコーティングまたは充填することができ
る。
【００６０】実施例２： 細孔容積が小さいジルコン（ケイ化ジルコニウム）マイクロビーズの調製 酸化シリコン固体不規則微粒子をジルコン細末（0.1〜5μmの範囲の粒子サイ
ズを有する）に置き換える以外は、実施例１に記載のとおりにマイクロビーズを
調製した。この方法で得られた乾燥マイクロビーズを、次いで、1400℃で4時間
焼成し、初期細孔容積（ビーズ容積の約1/3）をビーズ容積の約10％に低下させ
た。
【００６１】 これらのビーズが示した密度は約4.2g/cm3であった。
【００６２】 得られた高密度固体支持物質またはマイクロビーズに特異的な生体分子吸着特
性を与えるために、続いてこの固体支持物質またはマイクロビーズを、様々な有
機重合体からなる相互作用重合体網目でコーティングまたは充填することができ
る。
【００６３】実施例３： 細孔容積が小さいチタニア（酸化チタン）マイクロビーズの調製 酸化シリコン固体不規則微粒子を酸化チタン細末（0.1〜10μmの範囲の粒子サ
イズを有する）に置き換える以外は、実施例１に記載のとおりにマイクロビーズ
を調製した。得られた乾燥マイクロビーズを、次いで、1200℃で4時間焼成し、
初期細孔容積（ビーズ容積の約1/3）をビーズ容積の約15％に低下させた。
【００６４】 これらのビーズが示した密度は約3.5g/cm3であった。
【００６５】 得られた高密度固体支持物質またはマイクロビーズに特異的な生体分子吸着特
性を与えるために、続いてこの固体支持物質またはマイクロビーズを、様々な有
機重合体からなる相互作用重合体網目でコーティングまたは充填することができ
る。
【００６６】実施例４： 細孔容積が小さいハフニア（酸化ハフニウム）マイクロビーズの調製 ジルコン細末を酸化ハフニウム細末に置き換える以外は、実施例２に記載のと
おりにマイクロビーズを調製した。得られた乾燥マイクロビーズを、次いで、14
00℃で4時間焼成し、初期細孔容積（ビーズ容積の約1/3）をビーズ容積の約10％
に低下させた。
【００６７】 これらのビーズが示した密度は約8.5g/cm3であった。
【００６８】 得られた高密度固体支持物質またはマイクロビーズに特異的な生体分子吸着特
性を与えるために、続いてこの固体支持物質またはマイクロビーズを、様々な有
機重合体からなる相互作用重合体網目でコーティングまたは充填することができ
る。
【００６９】実施例５： 細孔容積が小さい酸化タンタルマイクロビーズの調製 ジルコン細末を酸化タンタル細末に置き換える以外は、実施例２に記載のとお
りにマイクロビーズを調製した。得られた乾燥マイクロビーズを、次いで、1400
℃で4時間焼成し、初期細孔容積（ビーズ容積の約1/3）をビーズ容積の約10％に
低下させた。
【００７０】 これらのビーズが示した密度は約7.2g/cm3であった。
【００７１】 得られた高密度固体支持物質またはマイクロビーズに特異的な生体分子吸着特
性を与えるために、続いてこの固体支持物質またはマイクロビーズを、様々な有
機重合体からなる相互作用重合体網目でコーティングまたは充填することができ
る。
【００７２】実施例６： 細孔容積が小さい酸化ジルコニウムマイクロビーズの調製 ジルコン細末を酸化ジルコニウム細末（0.1〜3μmの範囲の粒子サイズを有す
る）に置き換える以外は、実施例２に記載のとおりにマイクロビーズを調製した
。得られた乾燥マイクロビーズを、次いで、1400℃で4時間焼成し、初期細孔容
積（ビーズ容積の約1/3）をビーズ容積の約12％に低下させた。
【００７３】 これらのビーズが示した密度は約5.2g/cm3であった。
【００７４】 得られた高密度固体支持物質またはマイクロビーズに特異的な生体分子吸着特
性を与えるために、続いてこの固体支持物質またはマイクロビーズを、様々な有
機重合体からなる相互作用重合体網目でコーティングまたは充填することができ
る。
【００７５】実施例７： 細孔容積が小さいイットリア（酸化イットリウム）マイクロビーズの調製 ジルコン細末を酸化イットリウム細末（0.1〜3μm）に置き換える以外は、実
施例２に記載のとおりにマイクロビーズを調製した。得られた乾燥マイクロビー
ズを、次いで、1400℃で4時間焼成し、初期細孔容積（ビーズ容積の約1/3）をビ
ーズ容積の約20％に低下させた。
【００７６】 これらのビーズが示した密度は約4.5g/cm3であった。
【００７７】 得られた高密度固体支持物質またはマイクロビーズに特異的な生体分子吸着特
性を与えるために、続いてこの固体支持物質またはマイクロビーズを、様々な有
機重合体からなる相互作用重合体網目でコーティングまたは充填することができ
る。
【００７８】実施例８： 細孔容積が小さいアルミナ（酸化アルミニウム）マイクロビーズの調製 酸化シリコン固体不規則微粒子を酸化アルミニウム細末に置き換える以外は、
実施例１に記載のとおりにマイクロビーズを調製した。得られた乾燥マイクロビ
ーズを、次いで、1400℃で4時間焼成し、初期細孔容積（ビーズ容積の約1/3）を
ビーズ容積の約20％に低下させた。
【００７９】 これらのビーズが示した密度は約3.5g/cm3であった。
【００８０】 得られた高密度固体支持物質またはマイクロビーズに特異的な生体分子吸着特
性を与えるために、続いてこの固体支持物質またはマイクロビーズを、様々な有
機重合体からなる相互作用重合体網目でコーティングまたは充填することができ
る。
【００８１】実施例９： タンタリアおよびジルコニアの混合物からなる細孔容積が小さい高密度マイクロ
ビーズの調製 ジルコン細末を酸化タンタリウムおよび酸化ジルコニウム細末の50重量％／50
重量％混合物に置き換える以外は、実施例２に記載のとおりにマイクロビーズを
調製した。得られた乾燥マイクロビーズを、次いで、1400℃で4時間焼成し、初
期細孔容積（ビーズ容積の約1/3）をビーズ容積の約15％に低下させた。
【００８２】 これらのビーズが示した密度は約6.2g/cm3であった。
【００８３】 得られた高密度固体支持物質またはマイクロビーズに特異的な生体分子吸着特
性を与えるために、続いてこの固体支持物質またはマイクロビーズを、様々な有
機重合体からなる相互作用重合体網目でコーティングまたは充填することができ
る。
【００８４】実施例１０： ジルコニアおよびハフニアの混合物からなる細孔容積が小さい高密度マイクロビ
ーズの調製 細末混合物の組成が酸化ジルコニウム細末50重量％および酸化ハフニウム細末
50重量％である以外は、実施例９に記載のとおりにマイクロビーズを調製した。
得られた乾燥マイクロビーズを、次いで、1400℃で4時間焼成し、初期細孔容積
（ビーズ容積の約1/3）をビーズ容積の約25％に低下させた。
【００８５】 これらのビーズが示した密度は約7g/cm3であった。
【００８６】 得られた高密度固体支持物質またはマイクロビーズに特異的な生体分子吸着特
性を与えるために、続いてこの固体支持物質またはマイクロビーズを、様々な有
機重合体からなる相互作用重合体網目でコーティングまたは充填することができ
る。
【００８７】実施例１１： 細孔崩壊多孔性無機酸化マイクロビーズの噴霧乾燥による調製 前述の実施例１から１０に記載の無機酸化微粒子をケイ酸ナトリウム溶液中に
懸濁させたものを、噴霧乾燥によるマイクロビーズの調製に直接用いる。懸濁液
を、回転ディスク、噴霧ノズル、または超音波ネブライザーなどの噴霧化装置か
ら縦型（vertical）乾燥室に、熱気体流、好ましくは空気または窒素と共に注入
する。熱気体流によって、微小液滴から水が速やかに蒸発する。熱気体流は典型
的には約300℃〜350℃の温度で注入し、乾燥器から100℃をわずかに上まわる温
度で出ていく。
【００８８】 ケイ酸ナトリウムは、個々の凝集した無機酸化微粒子を固化するための結合剤
としてはたらく。得られた乾燥マイクロビーズを、次いで、無機酸化網目を不可
逆的に固化するために、マイクロビーズを形成するために用いた一つまたは複数
の無機酸化物の融解温度以上の温度で焼成する。この操作は同時に、ビーズの細
孔容積をビーズ容積の約30％未満、好ましくは約5％〜25％に低下させる。
【００８９】 噴霧乾燥法によって得られる無機酸化固体支持体またはマイクロビーズの密度
は、実施例１から１０に示された密度とほぼ同等である。
【００９０】 得られた高密度固体支持物質またはマイクロビーズに特異的な生体分子吸着特
性を与えるために、続いてこの固体支持物質またはマイクロビーズを、様々な有
機重合体からなる相互作用重合体網目でコーティングまたは充填することができ
る。
【００９１】実施例１２： 細孔容積が小さい高密度無機酸化マイクロビーズの噴霧乾燥による調製 ケイ酸ナトリウム溶液の代わりに、ビーズの調製に用いるのと同じ無機酸化粒
子の硝酸塩または硫酸塩を結合剤として用いる以外は、実施例１１に従ってマイ
クロビーズを調製した。
【００９２】 得られた高密度固体支持物質またはマイクロビーズに特異的な生体分子吸着特
性を与えるために、続いてこの固体支持物質またはマイクロビーズを、様々な有
機重合体からなる相互作用重合体網目でコーティングまたは充填することができ
る。
【００９３】実施例１３： 細孔容積が小さく外表面積が大きい高密度マイクロビーズの調製 表面が粗面である球形ビーズは、平滑なビーズに比べて外表面積が大きい。こ
の実施例では、本発明に従って粗面を有する固体支持物質またはマイクロビーズ
を調製する方法を記載する。
【００９４】 水性スラリー中で用いる最初の無機酸化微粒子または粉末が3μm〜15μmの範
囲の粒子サイズを有する以外は、前述の実施例１から１２に従ってマイクロビー
ズを調製する。小型高密度無機酸化固体支持体またはマイクロビーズを、大きい
粒子サイズを有する出発原料を用いて、本明細書に記載の任意の方法に従って製
造すると、得られる固体支持体またはマイクロビーズの表面波非常に粗くなり、
したがって総外表面積が増加する。
【００９５】 これらの固体支持体またはマイクロビーズを崩壊した後（焼成またはか焼段階
による）、例えば下記の実施例１４から２０に記載のように、相互作用重合体網
目が作られると、これらの固体支持体またはマイクロビーズは、用いた無機酸化
出発原料と同程度の密度を示し、その外表面積に比例して結合能の増大が認めら
れる。典型的には、本発明の小型高密度無機酸化固体支持体またはマイクロビー
ズを粗面を持つように製造すると、固体支持体またはマイクロビーズの表面積な
らびに結合能は約5％〜30％増加する。
【００９６】実施例１４： デキストランコーティングした高密度酸化ジルコニウムビーズ 1N水酸化ナトリウム溶液を、10％デキストラン（分子量10,000ダルトン）水溶
液13mlに、pHが11.5になるまでゆっくり添加する。次いで、炭酸ナトリウムを0.
2Mの濃度になるまで加え、溶液を4℃に冷却する。最終混合物に1％のブタンジオ
ールジグリシジルエーテルを加える。マイクロビーズにデキストランを含浸させ
るために、得られた溶液を、実施例６で調製したような、直径が10μm〜100μm
の範囲であり細孔容積が総ビーズ容積の約12％である、沈降した小型高密度酸化
ジルコニウムマイクロビーズ100mlにただちに加える。
【００９７】 得られた含浸マイクロビーズを密閉容器に移し、85℃で一晩加熱した。これら
の条件下で、デキストラン溶液は無機酸化固体支持体の細孔内に固定された所定
の位置で架橋され、それにより固体支持媒質の細孔を埋めて、固体支持物質また
はマイクロビーズの細孔に固定され、外表面をコーティングする、デキストラン
の3次元相互作用重合体網目を作り上げる。
【００９８】 得られた固体支持体またはマイクロビーズは約0.25重量％の糖を含み、イオン
交換、疎水性、ならびに親和性化学基を結合するための、古典的クロマトグラフ
ィ媒質合成法において用いることができる。
【００９９】実施例１５： チタニアビーズの表面の不活性化 無機酸化表面は、固有の水酸基を有すると同時に、生体分子への非特異的結合
を担うルイス酸部位も有する。これらの表面の性質は、酸化金属に応じて異なり
、酸性、アルカリ性、または両方であり得る。非特異的結合を排除するために、
特別な重合体を不活性化剤として用い、化学的架橋によって所定の位置に不可逆
的に安定化させることができる。
【０１００】 酸化チタンマイクロビーズの表面はほとんどアルカリ性で、その結果、例えば
酸性蛋白質を吸着する。そのような分子の非特異的結合を避けるために、これら
マイクロビーズ表面の不動態化を、マイクロビーズをこれと同量の、非接着性で
よく知られているヒアルロン酸水溶液中でインキュベートすることにより達成し
た。過剰のヒアルロン酸を除去するために洗浄した後、マイクロビーズを乾燥し
、エタノール中1％のブタンジオールジグリシジルエーテルおよび10％の1N水酸
化ナトリウムを含む溶液0.5倍量と共にインキュベートした。この懸濁液を一晩
インキュベートし、次いで大量の洗浄液で洗浄した。得られた不動態化酸化チタ
ン固体支持体またはマイクロビーズを、その後の応用に用いることができる。
【０１０１】 得られた高密度固体支持物質またはマイクロビーズに特異的な生体分子吸着特
性を与えるために、続いてこの固体支持物質またはマイクロビーズを、様々な有
機重合体からなる相互作用重合体網目でコーティングまたは充填することができ
る。
【０１０２】実施例１６： 細孔容積がアガロースで充填された高密度無機酸化ビーズ 4gのアガロース粉末を60℃〜80℃で激しく撹拌しながら水に分散させることに
より、アガロース溶液を得る。この溶液を沸騰水浴中で約20〜30分間加熱するこ
とにより、澄明な溶液が得られる。このアガロース溶液は、40℃以下に冷却する
と、強固な可逆性ゲルを形成する性質を有する。
【０１０３】 実施例１〜１３および１５に記載のとおりに調製した無機酸化物（例えば、酸
化ハフニウム、酸化ジルコニウム、酸化チタン、およびこれらに類するもの）固
体支持体またはマイクロビーズを、密閉容器中で約150℃に加熱し、次いで、同
量の熱アガロース溶液を含浸させるが、ただし用いる熱アガロース溶液の量は無
機酸化固体支持体またはマイクロビーズの細孔容積の110％におおよそ対応して
いる。得られた混合物を80〜120℃で1〜2時間維持し、次いで徐々に室温まで冷
却する。その結果、マイクロビーズの細孔容積内部およびマイクロビーズの表面
付近のアガロース溶液がゲル化し、古典的に記載されている化学反応を用いた液
体クロマトグラフィのための多様な誘導体調製にとって理想的な、有機相互作用
重合体網目を形成する。
【０１０４】実施例１７： セルロースで充填された高密度多孔性無機酸化ビーズ 三酢酸セルロースの溶液をアセトン中に分散させることによって調製する。セ
ルロースの濃度は、典型的には0.1〜5重量％であり得る。当業者には周知の他の
溶媒も、三酢酸セルロースを溶解するために用いることができる。
【０１０５】 実施例１〜１３および１５で調製したような無機酸化物（例えば、酸化ハフニ
ウム、ジルコニア、チタニア、およびこれらに類するもの）固体支持体またはマ
イクロビーズを、密閉容器に入れ、同量の三酢酸セルロース溶液を含浸させるが
、ただし用いる三酢酸セルロース溶液の量は無機酸化物固体支持体またはマイク
ロビーズの細孔容積の110％におおよそ対応している。得られた混合物を1〜2時
間撹拌し、次いで容器を解放して溶媒を空気流によりゆっくりと蒸発させる。
【０１０６】 三酢酸セルロースは無機酸化マイクロビーズの細孔容積内および外表面に沈積
し、疎水性有機網目を形成する。次いで、固相（セルロース誘導体を含む無機酸
化マイクロビーズ）を0.5〜2M水酸化ナトリウムと混合することにより、三酢酸
セルロースを純粋なセルロースに変換する。三酢酸塩が加水分解され、したがっ
てセルロースが再生される。セルロースは水性環境では不溶性で、無機酸化ビー
ズの内部に固定されたまま残存し、当業者には周知の適当な化学的活性化反応実
施後にイオン交換基または親和性もしくは疎水性基を導入するなどの、いくつか
の誘導体化にとって理想的な基質を構成する。
【０１０７】実施例１８： 高密度アガロース−酸化ジルコニウム誘導体へのコンカナバリンAの固定 実施例６および１６にしたがって調製したアガロース−酸化ジルコニウム固体
支持体またはマイクロビーズを、まずジオキサンで繰り返し洗浄することにより
乾燥して、痕跡量の水分をすべて除去する。次いで、乾燥したマイクロビーズを
脱液し、この物質の脱液ケーキ10gを純粋なジオキサン25mlに懸濁し、1gのカル
ボニルジイミダゾール（CDI）を加える。得られた混合物を室温で4時間振盪し、
次いでジオキサンを大量に用いて洗浄して、過剰の試薬を除去する。得られたCD
I活性化物質を、0.2M炭酸緩衝液（pH10）に10mg/mlで溶解したコンカナバリンA5
mlと混合する。この混合物を一晩緩やかに振盪し、最後に水と0.5M NaClを含む2
5mMリン酸緩衝液（pH7.2）とを大量に用いて洗浄する。
【０１０８】 得られた表面上にコンカナバリンAが化学的に結合している高密度アガロース
−酸化ジルコニウム固体支持体またはマイクロビーズは、オバルブミンに対し約
5mg/mlの結合能を示す。
【０１０９】実施例１９： 充填重合による高密度アニオン交換体の調製 5gのジメチルアクリルアミド、0.5gのN,N'-メチレン-ビス-メタクリルアミド
および5gのメタクリルアミドプロピルトリメチル-アンモニウムクロリドを50ml
のジメチルスルホキシドに溶解する。50mlの蒸留水を加えて徹底的に混合し、次
いで0.2gのアゾ-ビス-アミジノ-プロパンをこの混合物に加える。得られた単量
体溶液を、実施例１〜１３および１５のいずれかのとおりに調製した乾燥高密度
無機酸化固体支持体またはマイクロビーズの、用いるマイクロビーズの量が細孔
容積100mlに対応するような所定量と混合し、得られた混合物を徹底的に混合し
て、密閉容器に入れ、30〜60分間放置する。
【０１１０】 次いで、単量体混合物の重合を開始し、完了するために、この混合物を70〜90
℃で4時間加熱する。重合反応終了時に、得られた高密度イオン交換固体支持体
またはマイクロビーズを大量の洗浄液で洗浄し、蛋白質のクロマトグラフィ分離
または単離に用いることができる。
【０１１１】 マイクロビーズ1mlあたりのイオン性基の数は約65μmolで、イオン強度および
pHの古典的条件でのウシ血清アルブミンに対する結合能は約25mg/mlである。
【０１１２】実施例２０： 充填重合による高密度カチオン交換体の調製 5gのジメチルアクリルアミド、0.5gのN,N'-メチレン-ビス-メタクリルアミド
および5gのアクリルアミドメチル-プロパン硫酸ナトリウム塩を50mlのジメチル
スルホキシドに溶解する。50mlの蒸留水を加えて徹底的に混合し、次いで0.2gの
アゾ-ビス-アミジノ-プロパンをこの混合物に加える。得られた単量体溶液を、
実施例１〜１３および１５のいずれかのとおりに調製した乾燥高密度無機酸化固
体支持体またはマイクロビーズの、用いるマイクロビーズの量が細孔容積90mlに
対応するような所定量と混合し、得られた混合物を徹底的に混合して、密閉容器
に入れ、30〜60分間放置する。
【０１１３】 次いで、単量体混合物の重合を開始し、完了するために、この混合物を70〜90
℃で4時間加熱する。重合反応終了時に、得られた高密度イオン交換体またはマ
イクロビーズを大量の洗浄液で洗浄し、蛋白質のクロマトグラフィ分離または単
離に用いることができる。
【０１１４】 マイクロビーズ1mlあたりのイオン性基の数は約60μmolで、イオン強度および
pHの古典的条件でのリゾチームに対する結合能は約35mg/mlである。
【０１１５】実施例２１： 異なる粒子サイズのアニオン交換体の大きい蛋白質に対する結合能測定 アニオン交換固体支持体を、実施例１７に従って調製するが、ただし無機酸化
基質はビーズ容積の約12％の細孔容積を有する酸化ジルコニウムを含む。これら
のビーズが示す密度は約5.2g/cm3である。
【０１１６】 得られた相互作用重合体網目としてセルロースを有する様々な粒径の酸化ジル
コニウム固体支持体を、ふるい分けによって単離する。具体的には、単離する粒
径は約10μm、20μm、40μm、および80μmである。
【０１１７】 これら異なるサイズの粒子の結合能を、大型高分子チログロブリン（分子量67
0,000ダルトン）および10kbのプラスミドに対して測定する。結合能を破過点（b
reakthrough）（「BT」）曲線法によって測定し、計算を10％破過点で行う。 異なる粒子サイズおよび２つの高分子に対する10％BTでの結合能（mg/ml）： 本発明の高密度無機酸化固体支持体またはマイクロビーズの結合能は、粒子サイ
ズに依存すると考えられ、結合は本質的にこれら固体支持体またはマイクロビー
ズの表面上で認められると考えられる。
【０１１８】実施例２２： 様々な無機酸化物の多孔性高密度マイクロスフェアの流動化特性 三つのタイプの無機酸化ビーズを、実施例１２に記載の方法に従って調製する
。
【０１１９】 具体的には、150gの市販35％ケイ酸塩溶液を400mlの蒸留水に混合することに
より、ケイ酸ナトリウム溶液を調製する。同様に、30gの硫酸チタンを400mlの蒸
留水に混合することにより、硫酸チタン溶液を調製し、150gの20％硝酸ジルコニ
ル溶液を400mlの蒸留水に混合することにより、硝酸ジルコニル溶液を調製する
。
【０１２０】 次いで、273gの乾燥固体不規則酸化シリコン（0.3〜5μmの範囲の粒子サイズ
を有する）をケイ酸ナトリウム溶液に、気泡ができないようにゆるやかに撹拌し
ながら加える。同様に、275gの酸化チタン細末（0.1〜10μmの範囲の粒子サイズ
を有する）を硫酸チタニル溶液に、ゆるやかに撹拌しながら加え、275gの酸化ジ
ルコニウム細末（0.1〜3μmの範囲の粒子サイズを有する）を硝酸ジルコニウム
溶液に、ゆるやかに撹拌しながら加える。
【０１２１】 次いで、得られた懸濁液をそれぞれ別々に、Sodeva Atselab噴霧乾燥器（Sode
va、Le bouget du Lac、フランスから市販されている）中に、熱空気流と共に注
入する。熱空気流は懸濁液と同時に約350℃の温度で縦型乾燥室に注入し、乾燥
室から約98℃の温度で出ていく。
【０１２２】 この方法で得られた三タイプの乾燥無機酸化マイクロビーズのそれぞれを、次
いで、1400℃で4時間か焼して、細孔容積をビーズ容積の約10〜15％に低下させ
る。
【０１２３】 得られた無機酸化固体支持体またはマイクロビーズの平均粒径を、レーザー回
折分光法（Malvern粒子サイズ測定器）によって測定する。
【０１２４】 異なる粒子の流動化挙動を、2.5IDの古典的流動層カラムで、蒸留水を移動相
に用いて調べた。前述のとおりに調製した無機酸化固体支持体またはマイクロビ
ーズの各タイプの吸着床を2倍に膨脹させる速度は、下記のとおりである。 密度が高まると、吸着床2倍膨脹時の操作速度に正の影響を及ぼす。これはカラ
ムの生産性に有益な効果を有し、さらに生体物質の変性に関連するリスクを低下
させる。
【０１２５】実施例２３： 高密度酸化ジルコニウムマイクロビーズのコンカナバリンA誘導体を用いた血清
分画からのIgMの捕獲 実施例６、１６および１８に従って調製した、高密度コンカナバリンA−アガ
ロース−酸化ジルコニウム固体支持体またはマイクロビーズ20gを、2mMのMgCl2
を含む50mMトリス-HCl緩衝液（pH7.8）50mlと混合する。
【０１２６】 平行して、凍結ヒト血漿または血清試料200mlを解凍し、ろ過して寒冷沈降物
を除去する。純粋なエタノールを最終濃度が15容積％になるまで加えることによ
り、大きい蛋白質を試料から沈殿させる。室温で約20分間振盪後、遠心沈降によ
って沈殿を回収し、2mM MnCl2を含む50mMトリス-HCl緩衝液（pH7.8）1lに溶解す
る。
【０１２７】 得られた試料溶液は完全に澄明ではなく、溶解していない物質をいくらか含む
が、この試料溶液を、50mMトリス-HCl緩衝液（pH7.8）、2mM MnCl2中で平衡化し
たマイクロビーズ懸濁液をすでに充填した流動層装置に導入する。ビーズを吸着
床の2倍の膨脹で維持する上向きの緩衝液の流れを適用する。試料を完全に装置
に供給した後、50mMトリス-HCl（pH7.8）、2mM MnCl2緩衝液を導入して、不溶性
粒子をすべて洗浄し、次いで、洗浄緩衝液に0.5M塩化ナトリウムを加えることに
より、非特異的に吸着された物質を溶出する。
【０１２８】 コンカナバリンAに対する親和性で知られているIgM（IgMのグリコシル化部分
がコンカナバリンAと特異的に相互作用する）は、洗浄緩衝液を50mMトリス-HCl
緩衝液（pH7.8）、2mM MnCl2および20mM α-メチル-グルコピラノシドからなる
溶出緩衝液で置き換えることにより、固体支持体またはマイクロビーズから選択
的に脱着される。IgMの回収完了後、カラムを次いで初期緩衝液、すなわち50mM
トリス-HCl緩衝液（pH7.8）、2mM MnCl2で平衡化すると、別の分離サイクルのた
めに再使用することができる。
【０１２９】実施例２４： 高密度酸化チタンマイクロビーズのシバクロンブルー誘導体を用いたB型肝炎ウ
イルスの捕獲 実施例３および１６に従って調製した高密度アガロース−酸化チタン固体支持
体またはマイクロビーズ20gを、0.5M塩化ナトリウムを含む50mM炭酸緩衝液（pH1
1.5）50mlに懸濁する。この懸濁液に、2gのシバクロンブルー3GA（B型肝炎ウイ
ルスに対する親和性で知られているトリアジン反応性色素、米国ミズーリ州セン
トルイスのシグマケミカルズから市販されている）を加え、懸濁液を室温で一晩
振盪する。次いで、この懸濁液を60℃で約1時間加熱し、次いで大量の洗浄液で
洗浄して、過剰のシバクロンブルー3GA色素分子を除去する。
【０１３０】 得られたスラリーを直径2.5cmの流動層装置に導入し、リン酸緩衝食塩水の上
向きの流れによって持続的に懸濁状態を維持する。次いで、生理的緩衝溶液中に
B型肝炎ウイルスを含むヒト免疫グロブリン試料溶液を、カラムに底から固体支
持体またはマイクロビーズを流動化状態に維持する線速度で導入する。ウイルス
は、シバクロンブルーによって官能性付加されたアガロース−酸化チタン固体支
持体またはマイクロビーズによって捕獲されるが、ウイルスが除去された免疫グ
ロブリン試料溶液はカラムの最上部から回収される。シバクロンブルーによって
官能性付加されたアガロース−チタニア固体支持体またはマイクロビーズを、次
いで、水酸化ナトリウムおよび他の滅菌溶液で洗浄して、吸着したウイルスを除
去および不活化し、次いで別の分離サイクルを実施することができるように初期
充填緩衝液で再度平衡化する。
【０１３１】 この実施例によるウイルス除去は、約4log程度であり得る。
【０１３２】実施例２５： 高密度酸化ジルコニウムマイクロビーズの4級アミノ誘導体を用いた大腸菌粗抽
出物からのプラスミドの捕獲 実施例６および１９に従って調製した高密度アニオン交換体−酸化ジルコニウ
ム固体支持体またはマイクロビーズ50gを、50mMトリス-HCl、500mM NaCl緩衝液
（pH8.5）100mlに懸濁し、直径25mmの流動層カラムに導入して、マイクロビーズ
の沈降を妨げ、マイクロビーズを流動化状態に維持するのに十分な速度の上向き
の流れによって懸濁状態を維持する。
【０１３３】 平行して、古典的なアルカリ性-SDS処理（0.2M NaOH、1％-SDS）を用いて得た
大腸菌溶解産物を、蛋白質を除去するために様々なアルコール沈降にかけ（Gree
nら、「治療への応用のための超らせんプラスミドDNAの調製用精製」、Biopharm
、52〜62ページ（1997年5月））、50mMトリス-HCl、500mM NaCl緩衝液（pH8.5）
に対して透析ろ過（diafilter）し、得られた溶解産物試料をカラムに底の端か
ら、マイクロビーズの沈降を妨げ、流動化状態に維持するのと同じ線速度で導入
する。
【０１３４】 流動層で懸濁されている高密度マイクロビーズは、小さい断片以外は、溶解産
物試料中の核酸分子のほとんどを吸着する。次いで、結合していない不純物を除
去するために、流動層懸濁液を同じ標準緩衝液で洗浄する。次いで、680mM NaCl
を含む50mMトリス-HCl（pH8.5）緩衝液を用いて、RNA分子を洗浄除去する。その
後、緩衝液中のNaCl濃度を1000mMに上げることにより、プラスミド分子を流動層
様式で特異的に溶出する。最後に、ゲノムDNAなどの強く結合した不純物を、0.5
M水酸化ナトリウム溶液を用いて流動様式で洗浄することにより、マイクロビー
ズから脱着する。カラムを次いで、別の分離サイクルを実施することができるよ
うに50mMトリス-HCl、500mM NaCl緩衝液（pH8.5）で再度平衡化する。
【０１３５】 この流動層プロセスで得たプラスミドの純度は、固定層カラムに充填された類
似のカチオン固相を用いて得たものと同等である。しかし、本実施例においては
、流動層様式では充填層様式の場合のようにプラスミド試料の粘性がカラムの流
速を制限することがないため、溶出がより容易である。
【０１３６】 当業者には、本明細書に具体的に開示されていない他の組成物および方法も、
やはり本明細書より企図されていることが明らかであるはずである。そのような
他の組成物および方法は、本発明の範囲および精神に含まれると考えられる。し
たがって、本発明は本明細書において開示されている特定の態様の記載によって
制限されることはなく、添付の特許請求の範囲によってのみ制限される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｂ０１Ｄ 15/08 Ｂ０１Ｄ 15/08 Ｂ０１Ｊ 20/02 Ｂ０１Ｊ 20/02 Ｚ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ (72)発明者 ジロー ピエール フランス共和国 パリ リュ デュ テラ ンジュ ７ Ｆターム(参考） 4D017 AA07 AA11 CA05 CA17 CB01 DA07 DA08 DB10 EB03 4G066 AA20B AA22B AA25B AA30A AB26C AB27C AC01C AC03C AC12C AC14C AC17C AC26C AC27C AC33C BA20 BA25 BA28 BA38 CA20 CA54 DA11 EA01 FA22

Claims (58)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 a）無機酸化基質の総容積の30％未満の細孔容積を有する無
    機酸化基質と、 b）無機酸化基質の細孔および表面に固定された相互作用重合体網目とを含む、
    高密度無機酸化固体支持体。
  2. 【請求項２】 約1.7〜11の範囲の密度を有する、請求項１記載の高密度無
    機酸化固体支持体。
  3. 【請求項３】 約2.1〜約10の範囲の密度を有する、請求項２記載の高密度
    無機酸化固体支持体。
  4. 【請求項４】 前記高密度無機酸化固体支持体が約5μm〜約500μmの範囲の
    粒子サイズを有する、請求項１または２記載の高密度無機酸化固体支持体。
  5. 【請求項５】 粒子サイズが約10μm〜約100μmの範囲である、請求項４記
    載の高密度無機酸化固体支持体。
  6. 【請求項６】 a）無機酸化基質の総容積の30％未満の細孔容積を有する無
    機酸化基質と、 b）無機酸化基質の細孔および表面に固定された相互作用重合体網目とを含む、
    高密度無機酸化固体支持体であって、 2.1〜11の密度および10μm〜100μmの粒子サイズを有する高密度無機酸化固体支
    持体。
  7. 【請求項７】 細孔容積が無機酸化基質の総容積の5％〜25％である、請求
    項１または６記載の高密度無機酸化固体支持体。
  8. 【請求項８】 細孔容積が5％〜15％である、請求項７記載の高密度無機酸
    化固体支持体。
  9. 【請求項９】 無機酸化基質がチタニア、ジルコニア、イットリア、セリア
    、ハフニア、タンタリア、またはその混合物からなる、請求項１または６記載の
    高密度無機酸化固体支持体。
  10. 【請求項１０】 相互作用重合体網目が、無機酸化基質と所定の位置で架橋
    された可溶性有機重合体または複数の可溶性有機重合体の混合物を含む、請求項
    １または６記載の高密度無機酸化固体支持体。
  11. 【請求項１１】 可溶性有機重合体が多糖または複数の多糖の混合物である
    、請求項１０記載の高密度無機酸化固体支持体。
  12. 【請求項１２】 多糖がアガロース、デキストラン、セルロース、キトサン
    、グルコサミノグリカン、およびその誘導体からなる群より選択される、請求項
    １１記載の高密度無機酸化固体支持体。
  13. 【請求項１３】 可溶性有機重合体が、ポリビニルアルコール、ポリエチレ
    ンイミン、ポリビニルアミン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール
    、ポリアミノ酸、核酸、およびそれらの誘導体からなる群より選択される線状可
    溶性有機重合体である、請求項１０記載の高密度無機酸化固体支持体。
  14. 【請求項１４】 相互作用重合体網目が無機酸化基質と所定の位置で共重合
    された単量体、二官能性単量体、またはその混合物を含む、請求項１または６記
    載の高密度無機酸化固体支持体。
  15. 【請求項１５】 単量体が下記の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される
    、請求項１４記載の高密度無機酸化固体支持体： （ａ）アクリル、メタクリル、ビニル、およびアリル化合物の脂肪族イオン、非
    イオン、および反応性誘導体； （ｂ）アクリル、メタクリル、ビニル、およびアリル化合物の芳香族イオン、非
    イオン、および反応性誘導体； （ｃ）アクリル、メタクリル、ビニル、およびアリル化合物の複素環イオン、非
    イオン、および反応性誘導体；ならびに （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の単量体のいずれかの混合物。
  16. 【請求項１６】 （ａ）がアクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、トリ
    スアクリル、アクリル酸、アクリロイルグリシン、ジエチルアミノエチルメタク
    リルアミド、ビニルピロリドン、ビニルスルホン酸、アリルアミン、アリルグリ
    シジルエーテル、またはその誘導体である、請求項１５記載の高密度無機酸化固
    体支持体。
  17. 【請求項１７】 （ｂ）がビニルトルエン、フェニルプロピルアクリルアミ
    ド、トリメチルアミノフェニルブチルメタクリレート、トリチルアクリルアミド
    、またはその誘導体である、請求項１５記載の高密度無機酸化固体支持体。
  18. 【請求項１８】 （ｃ）がビニルイミダゾール、ビニルピロリドン、アクリ
    ロイルモルフォリン、またはその誘導体である、請求項１５記載の高密度無機酸
    化固体支持体。
  19. 【請求項１９】 二官能性単量体が下記の（ａ）〜（ｅ）からなる群より選
    択される、請求項１４記載の高密度無機酸化固体支持体： （ａ）ビスアクリルアミド； （ｂ）ビス-メタクリルアミド； （ｃ）ビス-アクリレート； （ｄ）エチレングリコール-メタクリレート；および （ｅ）ジアリルタートラジアミド。
  20. 【請求項２０】 （ａ）がN,N'-メチレン-ビス-アクリルアミド、N,N'-エチ
    レン-ビス-アクリルアミド、N,N'-ヘキサメチレン-ビス-アクリルアミド、また
    はグリオキサール-ビス-アクリルアミドである、請求項１９記載の高密度無機酸
    化固体支持体。
  21. 【請求項２１】 （ｂ）がN,N'-メチレン-ビス-メタクリルアミド、N,N'-エ
    チレン-ビス-メタクリルアミド、またはN,N'-ヘキサメチレン-ビス-メタクリル
    アミドである、請求項１９記載の高密度無機酸化固体支持体。
  22. 【請求項２２】 （ｃ）がエチレングリコールジアクリレート、またはエチ
    レングリコールジメタクリレートである、請求項１９記載の高密度無機酸化固体
    支持体。
  23. 【請求項２３】 固相吸着によって標的分子を分離する方法であって、該標
    的分子を含む試料を、請求項１または請求項６記載の高密度無機酸化固体支持体
    を含む固相基質を充填したクロマトグラフィ装置に通過させる段階を含む方法。
  24. 【請求項２４】 標的分子が生体分子である、請求項２３記載の方法。
  25. 【請求項２５】 所望の生体分子を、同分子を含む試料溶液から分離する方
    法であって、下記の段階を含む方法： ａ）ｉ）無機酸化基質の総容積の30％未満の細孔容積を有する無機酸化基質と、
    ｉｉ）相互作用重合体網目が所望の生体分子に対する親和性を有するように官能
    性付加されている、無機酸化基質の細孔および表面に固定された相互作用重合体
    網目とを含む、高密度無機酸化固体支持体からなるクロマトグラフィ吸着床をク
    ロマトグラフィ装置に充填する段階、 ｂ）該所望の生体分子を含む試料溶液をクロマトグラフィ装置に供給し、それに
    よって所望の生体分子が高密度無機酸化固体支持体に吸着される段階、 ｃ）洗浄緩衝液でクロマトグラフィ装置を洗浄し、試料溶液の望ましくない成分
    および不純物をクロマトグラフィ装置から流出させる段階、 ｄ）溶出緩衝液が所望の生体分子を高密度無機酸化固体支持体から遊離させる、
    該溶出緩衝液をクロマトグラフィ装置に供給する段階、および ｅ）所望の生体分子を回収する段階。
  26. 【請求項２６】 高密度無機酸化固体支持体が約2.1〜約11の範囲の密度を
    有する、請求項２５記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記高密度無機酸化固体支持体が約5μm〜約500μmの範囲
    の粒子サイズを有する、請求項２５または２６記載の方法。
  28. 【請求項２８】 粒子サイズが約10μm〜約100μmの範囲である、請求項２
    ７記載の方法。
  29. 【請求項２９】 無機酸化基質がチタニア、ジルコニア、イットリア、セリ
    ア、ハフニア、タンタリア、またはその混合物からなる、請求項２５記載の方法
    。
  30. 【請求項３０】 無機酸化基質がチタニア、ジルコニア、イットリア、セリ
    ア、ハフニア、タンタリア、またはその混合物からなる、請求項２８記載の方法
    。
  31. 【請求項３１】 相互作用重合体網目が、無機酸化基質と所定の位置で架橋
    された可溶性有機重合体または複数の可溶性有機重合体の混合物を含む、請求項
    ２５記載の方法。
  32. 【請求項３２】 相互作用重合体網目が無機酸化基質と所定の位置で共重合
    された単量体、二官能性単量体、またはその混合物を含む、請求項２５記載の方
    法。
  33. 【請求項３３】 所望の生体分子が高分子である、請求項２５記載の方法。
  34. 【請求項３４】 高分子が多糖、プラスミド、核酸、ポリヌクレオチド、ま
    たは蛋白質凝集体である、請求項３３記載の方法。
  35. 【請求項３５】 所望の生体分子が生体粒子である、請求項２５記載の方法
    。
  36. 【請求項３６】 生体粒子がウイルス、ウイルスベクター、膜蛋白質、また
    は細胞構造である、請求項３５記載の方法。
  37. 【請求項３７】 クロマトグラフィ装置が充填層カラム、流動層カラム、ま
    たは連続撹拌タンクである、請求項２５記載の方法。
  38. 【請求項３８】 所望の生体分子を、同分子を含む試料溶液から分離するた
    めの流動層クロマトグラフィ法であって、下記の段階を含む方法： ａ）ｉ）無機酸化基質の総容積の30％未満の細孔容積を有する無機酸化基質と、
    ｉｉ）相互作用重合体網目が所望の生体分子に対する親和性を有するように官能
    性付加されている、無機酸化基質の細孔および表面に固定された相互作用重合体
    網目とを含む、高密度無機酸化固体支持体からなるクロマトグラフィ吸着床を流
    動層カラムに充填する段階、 ｂ）初期緩衝液を該流動層カラムに、高密度無機酸化固体支持体に流動層を形成
    させる線速度で供給する段階、 ｃ）該所望の生体分子を含む試料溶液を流動層カラムに、高密度無機酸化固体支
    持体を流動層中に維持する線速度で供給し、それによって所望の生体分子が高密
    度無機酸化固体支持体に吸着される段階、 ｄ）洗浄緩衝液でクロマトグラフィ装置を洗浄し、試料溶液の望ましくない成分
    および不純物を流動層カラム装置から流出させる段階、 ｅ）溶出緩衝液が所望の生体分子を高密度無機酸化固体支持体から遊離させる、
    該溶出緩衝液を流動層カラムに供給する段階、および ｆ）流動層カラムから溶出された所望の生体分子を回収する段階。
  39. 【請求項３９】 高密度無機酸化固体支持体が約2.1〜約11の範囲の密度を
    有する、請求項３８記載の方法。
  40. 【請求項４０】 前記高密度無機酸化固体支持体が約5μm〜約500μmの範囲
    の粒子サイズを有する、請求項３８または３９記載の方法。
  41. 【請求項４１】 粒子サイズが約10μm〜約100μmの範囲である、請求項
    ４０記載の方法。
  42. 【請求項４２】 無機酸化基質がチタニア、ジルコニア、イットリア、セリ
    ア、ハフニア、タンタリア、またはその混合物からなる、請求項３８記載の方法
    。
  43. 【請求項４３】 無機酸化基質がチタニア、ジルコニア、イットリア、セリ
    ア、ハフニア、タンタリア、またはその混合物からなる、請求項４１記載の方法
    。
  44. 【請求項４４】 相互作用重合体網目が、無機酸化基質と所定の位置で架橋
    された可溶性有機重合体または複数の可溶性有機重合体の混合物を含む、請求項
    ３８記載の方法。
  45. 【請求項４５】 相互作用重合体網目が無機酸化基質と所定の位置で共重合
    された単量体、二官能性単量体、またはその混合物を含む、請求項３８記載の方
    法。
  46. 【請求項４６】 所望の生体分子が高分子である、請求項３８記載の方法。
  47. 【請求項４７】 高分子が多糖、プラスミド、核酸、ポリヌクレオチド、ま
    たは蛋白質凝集体である、請求項４６記載の方法。
  48. 【請求項４８】 所望の生体分子が生体粒子である、請求項３８記載の方法
    。
  49. 【請求項４９】 生体粒子がウイルス、ウイルスベクター、膜蛋白質、また
    は細胞構造である、請求項４８記載の方法。
  50. 【請求項５０】 線速度が100cm/時〜3000cm/時の範囲内である、請求項３
    ８記載の流動層クロマトグラフィ法。
  51. 【請求項５１】 下記の段階を含む、高密度無機酸化固体支持体を調製する
    方法： （ａ）少なくとも一つの無機酸化粒子混合物を調製する段階、 （ｂ）該混合物から無機酸化基質を形成する段階、 （ｃ）得られた無機酸化基質を、無機酸化基質中の粒子よりも小さい粒子を融解
    する高温で焼結する段階であって、焼結によって無機酸化基質の細孔容積が無機
    酸化基質の総容積の30％未満に低下する段階、および （ｄ）得られた焼結無機酸化基質の細孔および表面に固定された相互作用重合体
    網目を形成する段階。
  52. 【請求項５２】 無機酸化基質がチタニア、ジルコニア、イットリア、セリ
    ア、ハフニア、タンタリア、またはその混合物からなる群より選択される、請求
    項５１記載の方法。
  53. 【請求項５３】 無機酸化粒子が0.1μm〜15μmの範囲の粒子サイズを有す
    る、請求項５１記載の方法。
  54. 【請求項５４】 無機酸化粒子が0.1μm〜3μmの粒子サイズを有する、請求
    項５３記載の方法。
  55. 【請求項５５】 高密度無機酸化固体支持体が粗表面を有し、且つ無機酸化
    粒子が3μm〜15μmの粒子サイズを有する、請求項５１記載の方法。
  56. 【請求項５６】 ビーズがゾル-ゲル法、噴霧乾燥法、または乳化-重縮合法
    によって形成される、請求項５１記載の方法。
  57. 【請求項５７】 相互作用重合体網目が無機酸化基質と所定の位置で共重合
    された単量体、二官能性単量体、またはその混合物を含む、請求項５１記載の方
    法。
  58. 【請求項５８】 相互作用重合体網目が、無機酸化基質と所定の位置で架橋
    された可溶性有機重合体または複数の可溶性有機重合体の混合物を含む、請求項
    ５１記載の方法。
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