WO2009154046A1 - 粗面化処理が施された高密度機能性粒子、その製造方法およびそれを用いた標的物質の処理方法 - Google Patents

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臼杵直樹
満永雅一
河野研二
神崎壽夫
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日立マクセル株式会社
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    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
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    • Y10T428/2982—Particulate matter [e.g., sphere, flake, etc.]

Definitions

  • the present invention relates to roughened functional particles having a specific surface area suitable for separation, immobilization, analysis, extraction, purification or reaction of a target substance.
  • the present invention also relates to a method of producing such particles, and a method of treating a target substance using it.
  • Composite particles that specifically bind or react with specific target substances as functional materials used for biochemical applications such as quantification, separation, purification or analysis of target substances such as cells, proteins, nucleic acids or chemical substances are known from the prior art (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 4 5-1019).
  • Such composite particles are magnetic and are formed, for example, by including a magnetic material in nonmagnetic beads.
  • composite particles are provided in a sample containing the target substance, and the target substance is bound to the surface of the composite particle.
  • the target particles bound to the composite particles are recovered by moving the composite particles by application of a magnetic field to aggregate and aggregate them, and then collecting the aggregated composite particles.
  • Such magnetic field or magnetic methods require a smaller amount of solution than methods such as centrifugation, column separation or electrophoresis. It can be performed on samples, and it can be performed in a short time without denaturing the target substance.
  • the density of the composite particles used is as low as 1.O g / cm 3 to 3.4 g / cm 3 , composite particles are not preferable in terms of efficient aggregation.
  • the density of the composite particles is relatively low because a resin or silica having a low density is used as a base material, and a magnetic powder material is dispersed therein to form composite particles. That is, the density of the composite particles depends on the amount of the magnetic powder material, but the content of the magnetic powder material is at most about 20% by weight when calculated from the magnetization amount, and the density of the composite particles is the base material It is close to the low material density of
  • the target substance is bound to the surface of the particle, it can be said that the amount of target substance that can be bound per particle depends on the specific surface area of the particle. That is, if the specific surface area of the particles is small, the amount of target substance that can be bound to one particle will be reduced. When the amount of target substance that can be bound per particle decreases, the amount of detection generally decreases upon detection of the target substance, and as a result, the detection sensitivity decreases. As such, it is preferable that the specific surface area of the particles be somewhat large. However, it is not always good if the specific surface area of the particles is large, but if the particles have a three-dimensional internal penetration network (ie, through holes) or if they have deep holes, the target substance is a hole.
  • the specific surface area of the particles it is not always good if the specific surface area of the particles is large, but if the particles have a three-dimensional internal penetration network (ie, through holes) or if they have deep holes, the target substance is a hole.
  • the 989 zirconia particles have a three-dimensional internal penetration network (ie, penetration holes), and because of their extremely large specific surface area, nonspecific binding tends to occur more than necessary when separating target substances. That is, in the case of a zircon particle having a through hole as described in JP-A-9-15093, substances other than the target substance are bound and blocked by the particle, and the desired target substance is more preferentially given. It is difficult to bind to particles and separate them. Moreover, in the zirconia particle of JP-A-9-159, the apparent nonspecific binding that the target substance which has entered the deep through-hole is difficult to go out is also large. [0004]
  • the pore size of the particle is a size sufficient to accommodate a protein as a ligand or as an adsorbent, and the description of“ pore size ”is not limited thereto. Although there is some description, there is no description as to what degree of pore size (pore radius) should be (accumulated pore diameter volume).
  • the present invention has been made in view of the above circumstances. That is, the object of the present invention is that the movement of the particles is preferable to the separation of the target substance in terms of “aggregation”, and the amount of target substance that can be bound per particle within a range where the force, nonspecific It is to provide many particles. It is also an object of the present invention to provide a method for producing such particles, and a method for performing analysis, extraction, purification, reaction or the like of a target substance using such particles.
  • a substance or functional group to which a target substance can be bound is immobilized on the surface of the particle body
  • the surface of the particle body is roughened, and the specific surface area of the particle is 1. to 100 times the specific surface area of the smooth surface of a true spherical particle having the same particle size and density as the particle.
  • the present invention provides "target substance-binding particles” characterized in that.
  • the term “roughened” as used herein means substantially a treatment that causes the surface area of the particle surface (more specifically, the surface of the particle body) to be reduced.
  • the ratio is 1 X 10- 6 [cm 3 Bruno cm of the unit surface area [cm 2] per pore radius 20 nm or more cumulative pore volume of the particles [cm 3] 2 ] or more.
  • pore substantially means the void portion of the particle (more preferably, the void portion present in the vicinity of the particle surface), among which Also assumed is a pore having a macropore of 100 nm to: L 0; zm and a pore diameter (size) of a mesopore of 1 nm to: L 00 nm, in particular 1 ⁇ ⁇ ! A mesopore of ⁇ 100 nm is assumed (note that such a Mack hole and mesopore can be measured simultaneously by the so-called mercury intrusion method).
  • a substance or functional group capable of binding a target substance is immobilized on the surface thereof.
  • the substance or functional group that binds to the target substance is immobilized. Therefore, the coexistence of the target substance and the particle allows the target substance to bind to the particle, so that it is possible to use the particle of the present invention for various applications such as separation, purification or extraction of the target substance.
  • the particles of the present invention can be suitably used for the application of tailor-made medical technology.
  • target substance substantially means not only separation but also substances that can be various targets such as extraction, quantification, purification or analysis, and can be bound to particles directly or indirectly. As long as it is a substance, it may be any kind of substance.
  • Specific target substances include, for example, nucleic acids, proteins (including, for example, avidin and biotinylated HRP), sugars, lipids, peptides, cells, fungi, bacteria, yeasts, viruses, glycolipids, glycoproteins, complexes, inorganic substances, Vectors, low molecular weight compounds, high molecular weight compounds, antibodies or antigens can be mentioned.
  • the particles of the present invention can be said to exhibit various functions in that they can be used for separation, purification, extraction or analysis of various target substances. Thus, the particles of the present invention can be referred to as "functional particles".
  • the particles of the present invention are characterized by being roughened.
  • the surface of the particle body is roughened, and the specific surface area of the particles is that of true sphere particles (true sphere particles having a smooth surface) having the same particle size and the same density as the particles to be pressed.
  • the specific surface area is 1.4 to: L 00 times, and preferably, the integrated pore volume of the pore radius of at least 20 nm per unit surface area [cm 2 ] of the particle or particle body of the present invention [ proportion of cm 3] is in the IX 1 0- 6 [cm 3 Z cm 2] or more.
  • the “spherical particle” as referred to in the present specification means a particle whose geometrical spherical shape is a true sphere.
  • a “true sphere” is a sphere having substantially the same sphere diameter through the center.
  • a spherical particle having the same particle diameter means that the surface of the particle is smooth or smooth as a whole, and a spherical particle having the same particle diameter as that of the particles of the present invention. It substantially means the particles.
  • the particle diameter J of the particles of the present invention is substantially In the case of deposition, it has an area equal to the area of the particles determined from the number of pixels, etc., based on an electron micrograph or an optical microscope photograph of the particles including the thickness of the polymer being deposited).
  • the particle size of, for example, 300 particles is measured based on the photograph as described above, and the number average
  • image processing software eg.
  • “Image-Pro Plus (manufactured by Media Cybernetics, Inc.)” or the like can be used.
  • “specific surface area of true spherical particles having the same particle diameter and density as the particles of the present invention” in the present specification means a true circle having the same area as that of the particle photograph of the present invention. It substantially means the specific surface area of a true sphere (the density of such a true sphere being identical to the density of the particles of the invention) having a diameter D corresponding to the mean value L of the diameter.
  • the particles of the present invention not only have an increase in specific surface area due to the surface roughening treatment, but are also preferably characterized by the presence of a certain amount or more of pores of a desired size on the particle surface. . More specifically, it is characterized in that a certain amount or more of pores larger than the sizes of “the substance or functional group capable of binding the target substance” and the “target substance” are present. Therefore, not only is the substance or functional group capable of binding the target substance more immobilized in the particle of the present invention, but the target substance The substance or functional group that can be bound is designed to allow more binding. The latter case will be described in detail.
  • the target substance When particles are used, the target substance is bound to the “target substance capable of binding target substance or functional group” immobilized on the particle body, but is immobilized inside the pore “target substance "For substances or functional groups capable of binding In this case, the target substance enters into the pore and then binds. That is, it can be said that a large target substance can not enter into the interior of smaller pores, and can not bind to the “substance or functional group capable of binding the target substance” present inside the pore.
  • the particles of the present invention have a certain amount of larger-sized pores with respect to the "target substance or functional substance capable of binding to the target substance" as well as the "target substance". Because of the above, the effect is achieved that the binding amount of the target substance at the time of using the particle is further increased.
  • the compound derived from the acidic substance used for the roughening treatment substantially adheres to the surface of the particle body. Or it is also characterized by not remaining. That is, hydrochloric acid compounds derived from at least one or more acidic substances selected from the group consisting of hydrochloric acid, sulfuric acid and nitric acid, sulfuric acid compounds, Z or nitrate compounds, etc. Not attached or left.
  • the particles of the present invention is preferably a density of 3. 5 g / cm 3 ⁇ 9 gZcm 3, densities than commonly particles used in the separation of a target substance (or specific gravity) is a feature that a large listening Have.
  • the particle of the present invention may have a through-hole in the particle body or may not have a through-hole.
  • the particle body does not have through holes means that the particle body is substantially solid and the particles do not have an internal penetration network structure. That is, “the particle body does not have through holes” in the present specification means “the particle body or the particle body core portion is solid” and “the particle surface is uneven, It has the same meaning as “does not exist inside the recessed force particle” and "the force density is larger when compared with general porous particles”. If there is no through-hole in the particle body, the “nonspecific adsorption reduction effect” described later can be expected to be more remarkable.
  • the present invention also provides a method of producing the above-mentioned particles.
  • the manufacturing method is A method of producing particles capable of binding a target substance, comprising:
  • step (I) the surface of the raw material particles is roughened, and the specific surface area of the spherical particles having the same particle size and density as the obtained particles is 1.4 to 100 times. As it is characterized by roughening.
  • the ratio of the pore radius 20n m or more integrated pore volume per unit surface area of the particles or particle body [cm 2] [cm 3] is 1 X 10- 6 [cm 3 / cm 2] or more Roughen the surface so that
  • the raw material particles are roughened so as not to form through holes, thereby finally obtaining particles having no internal through holes.
  • the density is 3.5 g / cm 3 to 9 to obtain particles having a larger density (or specific gravity) than in the case of particles generally used for separation of target substances. It is preferable to roughen 0 g / cm 3 raw material particles.
  • the compound derived from the acidic substance used for the surface roughening treatment in particular, “the metal element and the acidic compound may be used after the step (I) (after washing if necessary). It is also characterized in that the compound “)” is substantially not attached or remained on the surface of the particle body.
  • hydrochloric acid compound derived from at least one or more acidic substances selected from the group consisting of hydrochloric acid, sulfuric acid and nitric acid, a sulfuric acid compound U and a nitric acid compound, etc. substantially adhere to the particle surface. It also has the feature that it does not survive.
  • the present invention also provides a method of separating a target substance using the above-mentioned particles.
  • a separation method is a method of separating a target substance from a sample using the above-described "particles of the present invention characterized in that the surface is roughened", and includes the steps described below.
  • the method of the present invention is characterized in that the particles to which the target substance is bound are aggregated / aggregated by natural sedimentation. That is, the method of the present invention does not use a magnetic field or magnetism for moving / aggregating particles, and has a feature of separating a target substance by spontaneous sedimentation of particles. Thus, the target substance can be separated by the natural sedimentation of particles because the natural sedimentation speed of particles is faster than before.
  • the particles used in the method of the present invention are particles that have been subjected to a surface roughening treatment, whereby more “materials or functional groups capable of binding the target substance” to the particle surface are immobilized. is there. Therefore, the method of the present invention has a large amount of target substance that can be bound per particle, and in one operation “more target substance can be separated from the sample” or “more target substance is immobilized”. It also has the feature that particles can be obtained.
  • the particles of the present invention preferably have a density as high as 3.5 g / cm 3 to 9 g / cm 3, and even if they do not use centrifugation and magnetic separation, only the movement velocity of the particles by natural sedimentation is sufficient. It has the effect that a good separation speed can be obtained.
  • natural settling refers to the settling of particles in a liquid under the action of gravity.
  • “separation” means nucleic acid, protein, sugar, lipid, peptide, cell, fungus, bacteria, yeast, virus, glycolipid, glycoprotein, complex, inorganic substance, vector, low molecular compound, Samples containing target substances such as polymer compounds, antibodies or antigens (eg urine of human or animal, blood, serum, plasma, semen, saliva, sweat, tears, fl fluid, amniotic fluid etc .; human or Suspensions such as animal organs, hair, skin, mucous membranes, nails, bones, muscle or nerve tissue, extracts, lysates or ruptures; fecal suspensions, extracts, lysates or ruptures; cultured cells or Suspension of culture tissue, Extract, Lysis or disruption; Virus suspension, Extract, Lysis or disruption; Bacterial suspension, Extract, Lysis or disruption; Soil suspension Turbidity Solution, extract solution, solution or crushed solution; plant suspension, extract solution, solution solution or crushed solution; food-
  • Separatation speed substantially refers to the speed at which particles to which the target substance is bound move through the sample, and in the case of natural sedimentation, substantially means the particle sedimentation speed. ing. If the separation speed is high, the time required to separate the target substance from the sample can be shortened. It will be appreciated that the application of a magnetic field can additionally increase the separation speed if the particles according to the invention are magnetic.
  • the particles of the present invention can obtain sufficient separation speed only by natural sedimentation, the particles of the present invention can be used to separate, immobilize, analyze, extract and purify the target substance without using a complicated mechanism. Alternatively, processing such as reaction can be performed. In other words, using the particles of the present invention, a simple system for separating, immobilizing, analyzing, extracting, purifying or reacting the target substance is obtained.
  • the particles of the present invention are also effective for miniaturizing or chipping such a system.
  • the particles of the present invention are subjected to a surface roughening treatment and are more particles in which “the substance or functional group capable of binding the target substance” is more immobilized on the increased particle surface, 1
  • the amount of target substance that can be bound per particle is large.
  • the target substance can be efficiently purified and separated.
  • the overall detection amount is increased, and advantageous effects such as improvement of detection sensitivity, simple measurement or reduction of measurement error can be achieved.
  • the specific surface area is increased by the roughening, “the substance or functional group capable of binding the target substance” is immobilized on the particle surface increased due to the roughening. ing.
  • the grains of the invention In the case of a unit surface area [cm 2 ], the cumulative pore volume of a pore radius of 20 nm or more
  • Ratio of [cm 3] has become a 1 X 1 0- 6 [cm 3 Z cm 2] or more, than the size of the "substance or functional group capable of binding to a target substance" and "target substance” There are a certain amount or more of large pores.
  • the particles of the present invention not only allow more “substance or functional group to which the target substance can be bound” to be fixed to the particle itself, but also use (separation, immobilization, analysis, extraction, More target substances can be bound to “substance or functional group to which target substances can be bound” in purification or treatment). From another perspective, it does not contribute to the immobilization of “the substance or functional group to which the target substance can be bound” or the binding of the “target substance”, leading to an increase in nonspecific binding.
  • pores having a pore radius of less than 20 nm are smaller, so that the particles of the present invention can bind to one particle while suppressing non-specific binding to some extent. It can be said that the amount of target substance is increased.
  • a polymer may be attached to the surface of the main body of the particle of the present invention.
  • adherered polymer on the surface of the polymer to be applied (hereinafter also referred to as “adhered polymer")
  • a substance or functional group to which a target substance can be bound can be immobilized.
  • the "substance capable of binding the target substance or The functional group can be immobilized on the particle surface.
  • “a substance or functional group capable of binding a target substance” immobilized on the surface of the particle main body force In applications where there is a concern that it will be separated from the surface of the particle main body under various usage conditions. The separation from the particle main body can be prevented by immobilizing “the substance or functional group to which the target substance can be bound” on the deposition polymer.
  • FIG. 1 (a) is a view schematically showing steps of the treatment method of the present invention.
  • FIG. 1 (b) is a view schematically showing the process of the treatment method of the present invention.
  • FIG. 1 (c) is a view schematically showing steps of the treatment method of the present invention.
  • FIG. 2 is a photograph of particle p 1 in Example 1.
  • Fig. 2 (a) is the whole particle photograph
  • Fig. 2 (b) is the surface enlarged photograph.
  • FIG. 3 is a photograph of particles in Comparative Example 1.
  • Fig. 3 (a) is the whole particle photograph
  • Fig. 3 (b) is the surface enlarged photograph.
  • FIG. 4 (a) is a cross-sectional view of the vicinity of the surface of the raw material particle p1 in Example 1.
  • FIG. Figure 4 (b) is an enlarged view of the particle surface area in Figure 4 (a).
  • FIG. 5 (a) is a cross-sectional view of the particles near the surface of the particles after being subjected to the sulfuric acid treatment in Example 1.
  • FIG. 5 (a) is a cross-sectional view of the particles near the surface of the particles after being subjected to the sulfuric acid treatment in Example 1.
  • Fig. 5 (b) is an enlarged view of the vicinity of the particle surface in Fig. 5 (a).
  • Fig. 6 (a) is a cross-sectional view of the vicinity of the surface of porous zirconia particles.
  • Fig. 6 (b) is an enlarged view of the vicinity of the particle surface in Fig. 6 (a).
  • FIG. 7 is a graph showing the relationship between the pore radius of the particle and "the integrated pore volume obtained by integrating the pore volume of the pore radius of 100 nm or less from 100 nm side" (Examples 1 and 4 and Comparative examples 1 and 2).
  • Fig. 8 is an enlarged graph of a part of Fig. 7 (enclosed by dotted line).
  • FIG. 9 is a graph showing the relationship between the pore radius of the particles and the volume occupied by each pore radius (Example 1 and Comparative Example 1).
  • FIG. 10 is a graph showing the relationship between the pore radius of particles and the volume occupied by each pore radius (Example 4 and Comparative Example 2).
  • reference numbers denote the following elements:
  • the particles of the present invention have a density suitable for separation of target substances. That is, human or animal urine, blood, serum, plasma, semen, saliva, sweat, tears, tears, ascites, amniotic fluid, etc .; human or animal organs, hair, skin, skin, mucous membranes, nails, bones, muscle or nerve tissue etc.
  • Suspension, extract, solution or disrupted solution stool suspension, extract, solution or disrupted solution; suspension of cultured cells or cultured tissue, extract, solution or disrupted solution; virus Suspension, Extract, Solution or Solution; Suspension of Bacteria, Extract, Solution, Solution; Soil Suspension, Extract, Solution, Solution; Suspension of Plant, Extracted solution, dissolved solution or crushed solution; Food ⁇ Processed food suspension, extract solution, dissolved solution or crushed solution; Density such that particle settling speed becomes relatively large when dispersed in sample such as waste water The particles have.
  • the density of the particles of the present invention 3 a 5 gZcm 3 ⁇ 9 g / cm 3 , more preferably 5 is 0 g / cm 3 ⁇ 9. 0 g / cm 3, more preferably, 5 5 g / cm 3 to 7. 0 g
  • the density may be greater than 9, 0 g / cm 3 of the particles of the present invention, more specifically, except 9. 0 g / cm 3 (9. 0 g / cm 3 ) ⁇ 23 gZ cm 3 may be possible.
  • the term "density" as used herein refers to the true density in which only the volume occupied by the substance itself is the volume for calculating the density, and the true density measuring device Ultra Pycnometer 1000 (manufactured by Ruasa Einix Co., Ltd.) It is a value that can be determined by using).
  • the surface of the particle body is roughened, and the specific surface area of the particles is the same as the specific surface area of the smooth surface of spherical particles having the same particle size and density as the particles. It is four times to 100 times. This is because the specific surface area of each of the particles of the present invention having the particle size a is 1.4 to 4 times the specific surface area of the true spherical particles (the spherical particles having the same density as the present invention) having the particle size a.
  • the mean value of the specific surface area of the particles of the present invention having an average particle diameter of a that is, a group of powdery particles consisting of a plurality of particles) having a force meaning 100 times that of the particles It means that it is 1.4 to 100 times the specific surface area of the true spherical particles having the diameter a (true spherical particles having the same density as the present invention).
  • the surface of the particle main body of the particles of the present invention is at least one or more acidic substances (excluding phosphoric acid) selected from the group consisting of hydrochloric acid and sulfuric acid and nitric acid. It has a feature in that it is roughened by processing with.
  • SP particles-1 ⁇ 4 XSP true sphere to 500 XSP true sphere.
  • the “specific surface area” as used herein refers to the specific surface area determined by using a specific surface area pore distribution measuring apparatus B e 1sor P-mini (made by Nippon Bell Co., Ltd.). Also, as used herein, “particle size” or “particles identical to the particles of the present invention”
  • the “particle size” in the "true sphere with diameter and density” means the area of the photograph of the particles (the particles including the thickness of the polymer being deposited when the polymer is deposited on the particle body) and
  • the term “mean particle diameter” substantially means the diameter of a perfect circle of the same area, and for example, measures the particle diameter of 300 particles based on an electron micrograph or an optical micrograph of the particles, It substantially means the particle size calculated as the number average.
  • the surface of the particle body is roughened as described above, and in particular, the ratio of integrated pore volume [cm 3 ] per unit surface area [cm 2 ] of pore radius 20 nm or more There has been a 1 X 1 0- 6 [cm 3 / cm 2] or more. Since the “accumulated pore volume” reflects the pore size distribution of the roughened particles, in the particles of the present invention, pores having a pore radius of 20 nm or more are present at a certain ratio or more. ing.
  • pores having a desired size that is, a pore radius of 20 nm or more
  • a desired size that is, a pore radius of 20 nm or more
  • the particle's pore size is too small, “the substance or functional group J capable of binding the target substance and the“ target substance ”can not enter into the pore, and increases due to the pore Not only does the particle surface area not contribute to the immobilization of “the substance or functional group to which the target substance can be bound”, the target substance can not enter into the pore when using the particle, and It becomes impossible to bind to the substance or functional group to which the target substance can be bound.
  • the pore of the particle has a certain size, “the substance or functional group capable of binding the target substance” and “target substance” can enter into the pore. Not only does the increased particle surface area due to the pores effectively contribute to the immobilization of the “substance or functional group capable of binding the target substance”, the target substance becomes a pore when the particle is used. It can enter inside, and can bind to “a substance or functional group to which a target substance can be bound” inside the pore.
  • the pore size is smaller than "the substance or functional group to which the target substance can be bound” and “the target substance”, “the aspect of fixation during particle preparation” and “when using particles” From the point of view of the binding of the target substance in the case of the present invention, even if the specific surface area is large, the force is the same as that in which no pores are substantially present. Smaller in size, reduced in porosity, more of the desired size of pores contributing to the immobilization of the substance or functional group to which the target substance can be bound and the binding of the target substance .
  • the present invention is intended to focus on the cumulative volume of pores of a certain size or more rather than the total cumulative pore volume.
  • the “proportion in which pores of a desired size exist” is evaluated as a ratio per unit surface area of particles or particle bodies so as not to depend on individual particle size. Specifically, it is evaluated by the value of “the integrated pore volume obtained by adding the volume of pores satisfying the desired size” per unit surface area of the particle (particle body). Such "accumulated pore volume per unit surface area (accumulated volume obtained by adding the volume of pores satisfying the desired size)” is defined as "accumulated fine particle having a predetermined diameter or more based on 1 g of particle or particle body. It can be calculated by dividing the pore volume (cm 3 / g) by “the surface area of the smooth surface of a true sphere particle having the same particle size and density based on 1 g (cm 2 / g)”.
  • the integrated pore volume with a pore radius of 20 nm or more is a certain ratio or more.
  • the proportion of unit surface area pore half diameter 20 nm or more cumulative pore volume in [cm 2] [cm 3] is a 1 X 10- 6 [cm 3 / cm 2] or more.
  • the cumulative pore volume [cm] of a pore radius of 20 nm or more per unit surface area [cm 2 ] 3] ratio is 1 X 10- 6 of [cm 3 / cm 2] for more, that target substances can not be out after taken once inside the pores, reducing also apparent specific adsorption by clogging et al As a result, the total amount of nonspecific adsorption decreases, so it can be used more easily than before in actual use
  • the ratio of the integrated pore volume [cm 3 ] is 1 x 10 16
  • the particle size is less than [cm 3 / cm 2 ]
  • the porosity (the content of pores) of the force particles which is another aspect different from the above-mentioned “integrated pore volume equal to or larger than a certain pore radius”, is preferably 90% or less. This is because if the porosity of the particles is not 90% or less, the number of pores in the particles will be too large to lower the particle strength, which may cause practical problems such as breakage of the particles at the time of use. More preferably, the porosity of the particles is on the order of 0.5% to 70%.
  • the particles of the present invention may or may not have through holes in the particle main body, but it is preferable to have no through holes from the viewpoint of reducing nonspecific adsorption. If the particle body does not have a through hole, the ratio of the cumulative pore volume [cm 3] of the pore radius 20 nm on than in a unit surface area [cm 2] is 4. 6X 10- 4 [cm 3 / cm 2 Or less. Therefore, when considered in conjunction with the above requirements, the particles of the present invention, the proportion of more than the cumulative pore volume pore radius 20 nm is 1 X 10- 6 ⁇ 4. 6 X 10- 4 [cm 3 Zcm 2 It said to be preferable is a, more preferably 3 X 10 one 6 ⁇ 1.
  • 5 X 10- 5 [cm 3 / cm 2] e.g., 6 X 10- 6 ⁇ 8X 10- 6 [cm 3 / cm 2]
  • 6 X 10- 6 ⁇ 8X 10- 6 [cm 3 / cm 2] is.
  • the surface is preferably roughened to a depth of about 2 m from the surface of the particle body, more preferably about 1.5 / zm from the surface of the particle body.
  • the surface is roughened to a depth of about 1 / zm from the surface of the particle body.
  • the proportion that is roughened does not exceed 40% of the particle body diameter, more preferably not exceed 30%, and even more preferably not exceed 20%.
  • the phrase “roughened at a certain depth from the surface of the particle body” means “the pores substantially extend to a depth from the surface of the particle body.
  • the value of "accumulated pore volume" referred to in the present specification substantially means the value obtained by using the method of 8 points and 13 points.
  • the B E T method is a measurement method of specific surface area based on multi-layer adsorption, and is an extension of Langmuir's single-layer adsorption theory to multi-layer adsorption.
  • the powerful B ET method measures the amount of adsorption when gas (for example, nitrogen gas) is adsorbed to particles, and applies the B ET equation shown below to the adsorption isotherm obtained by this method, thereby adsorbing a monolayer.
  • DH method which is an abbreviation of Dollimore-Heal method, is an analysis method that obtains the volume frequency distribution of pore size from the relative pressure of adsorbed gas and the increment of adsorption amount, assuming that the pore is cylindrical.
  • V Adsorption equilibrium pressure P adsorption amount at P
  • Vm Monolayer adsorption amount, adsorption amount when gas molecules form a monolayer on the fixed surface
  • the value of “accumulated pore volume” can be determined by using the specific surface area pore distribution measuring apparatus B e 1 sor pm ini (made by Nippon Bell Co., Ltd.) to determine the isothermal adsorption curve of the particles relative pressure Measure (PZP Q ) to 0.90, and based on the isothermal adsorption curve It is a value obtained by calculating the integrated pore volume by the DH method.
  • the particle size or average particle size of the particles of the present invention is preferably 1 ⁇ m to 5 mm.
  • the particle size or average particle size is smaller than 1 m, it becomes difficult to sufficiently increase the moving speed of the particles by natural sedimentation when separating the target substance, while the particle size or average particle size is smaller than 5 mm. If the size is large, the particles may precipitate before binding to the target substance occurs, and the target substance may not be separated sufficiently.
  • the particle size or average particle size is 1 ⁇ to 1 mm, still more preferably 5 ⁇ m to 500 ⁇ m, or most preferably 10 ⁇ m to 100 m. Particle size or average particle size.
  • the particle size or average particle size is too small, rapid oxidation is likely to occur, and in some cases there is a risk that the particles may ignite, but if the particle size is relatively large or average as in the present invention. Rapid oxidation is less likely to occur, and the risk of particle ignition is reduced.
  • the particles of the present invention are those which can obtain sufficient separation speed only by natural sedimentation. That is, the natural sedimentation speed of the particles is faster in the sample containing the target substance.
  • the material of the particle main body is not particularly limited as long as the particles of the present invention have the density and specific surface area as described above.
  • the particle body is formed of metal or metal oxide, for example, dinocora (zirconium oxide, titanium-doped oxide; Preferably, it is formed of at least one material selected from the group consisting of zirconium), iron oxide, alumina, nickel, cobalt, iron, copper and aluminum. Further, in the case of density 9.0 (except 9.
  • the particle body of the particles of the present invention Ag (silver), Au ( Gold), Pt (Platinum), Pd (Palladium), W (Tungsten), Rh (Rhodium), Os (Osmium), Re (Renium), Ir (Iridium), Ru (Ruthenium), Mo (Molybdenum) , Hf (Hough Two Or at least one transition metal element selected from the group consisting of Ta (tantalum), or P b (lead), B i (bismuth) and T 1 (titanium). It is preferable that it is formed from at least one or more kinds of typical metal elements selected from the group consisting of thallium).
  • the particles of the present invention are magnetic.
  • particles of the present invention that are magnetic are also referred to as “magnetic particles”
  • the magnetic separation operation can be performed supplementary to the sedimentation of the particles.
  • the target substance more specifically, “the target substance bound to the particle”
  • magnetic collection and fixation of particles in specific areas can facilitate pivetting and decantation.
  • the material of the main body of the magnetic particle is not particularly limited as long as the particle becomes magnetic.
  • the main body of the magnetic particle is formed of at least one iron oxide selected from the group consisting of oxides of garnet structure comprising transition metal and iron, ferrite, magnetite and ⁇ -iron oxide. Is preferred.
  • the main body of the magnetic particles may comprise at least one or more metal materials selected from the group consisting of nickel, cobalt, iron, and alloys containing these metals.
  • the oxide of garnet structure comprising transition metal and iron is generally referred to as YIG, and for example, a compound represented by the composition formula of Y 3 Fe 5 ⁇ ⁇ 2 and a part of Upsilon this compound include ⁇ was replaced with bismuth i ⁇ ⁇ 3 _ x F e 5 ⁇ ⁇ 2 (0 ⁇ ⁇ 3).
  • the magnetic particles deposit or adhere the magnetic substance to the magnetic particles which are not magnetic. It may be formed by For deposition or adhesion of the magnetic substance, electroless plating, electroplating, sputtering, vacuum evaporation, ion plating, chemical vapor deposition, etc. can be used.
  • the "particles which do not have a magnetic domain” include, for example, particles with high density made of zircoyua (acidic dinoclem, itzrium added acidic zirconium), alumina or the like. .
  • particles of lower density such as aluminum, silica, resin, etc. can also be used.
  • magnetic substance used for deposition or adhesion, ferrite, magnetite, ⁇ -iron oxide, or an oxide of garnet structure comprising a transition metal and iron, etc., as in the material of the magnetic particles described above
  • iron oxides of nickel, cobalt, iron, or alloys comprising these metals can also be mentioned.
  • the volume of the magnetic substance film is preferably 5% or more with respect to the volume of the particles (particles including the magnetic substance film).
  • the thickness of the magnetic substance coating is preferably 1.7% or more with respect to the diameter of the particles (the particles containing the magnetic substance coating).
  • the magnetic properties of magnetic particles include, for example, "saturation magnetization” and "coercivity".
  • saturation magnetization value the higher the response of the particle to the magnetic field.
  • the necessary density must be maintained by limiting the amount of magnetic substance provided.
  • the saturation magnetization of the particles of the present invention is preferably 0.5 A ⁇ m 2 Zk g to 85 A m 2 Zk g (0.5 emu / g to 85 emu / g), more preferably 3 A ⁇ m 2 / kg ⁇ 30 A ⁇ m
  • the coercivity is preferably O kA / ra to 23 KA / m (0 to 300 oersteds), more preferably 0 kA / m to 5.95 kA / m (0 to 200 oersteds) More preferably, it is from 0 k AZ m to 7. 97 k A / m (0 to 100 enorthated).
  • the values of “saturation magnetization” and “coercivity” referred to in the present specification are values measured using a vibrating sample magnetometer (manufactured by Toei Kogyo, type VSM-5). Specifically, the value of “saturation magnetization” is a value determined from the amount of magnetization when a magnetic field of 797 kA / m (10 kilohertz) is applied. The value of “coercivity” is a mark that the amount of magnetization becomes zero when the magnetic field is returned to zero after applying a magnetic field of 797 kA / m and the magnetic field is gradually increased in the reverse direction. It is the value of the Karo magnetic field.
  • the shape of the particles of the present invention is not particularly limited, and may be, for example, a spherical shape, an ellipsoidal shape, a particle shape, a plate shape, a needle shape or a polyhedron shape (for example, a cubic shape).
  • the particle shape is preferably a regular shape, and particularly preferably a spherical shape.
  • the “non-magnetic particle main body” has a spherical or ellipsoidal shape.
  • the active substance (hereinafter also referred to as "the substance to which the target substance can bind") is preferably at least one or more substances selected from the group consisting of biotin, avidin, streptavidin and neutravidin.
  • the “functional group capable of binding a target substance” (hereinafter also referred to as “functional group to which a target substance can be bound”) immobilized on the surface of the present body of the particle of the present invention is a carboxyl group Sulfhydryl functional groups such as hydroxyl group, epoxy group, tosyl group, succinimide group, maleimide group, thiol group, thiol group and disulfide group, aldehyde group, azide group, hydrazide group, primary amino group, secondary amino group Group, at least one functional group selected from the group consisting of a tertiary amino group, an imido-esterore group, a carpidoimide group, an isocyanato group, a jode acetyl group, a halogen substitution of a carboxyl group, and a double bond Is preferred.
  • the “functional group to which the target substance can be bound” may be a derivative of the above-mentioned functional group.
  • immobilization generally refers to a state in which “a substance capable of binding a target substance” or “a functional group capable of binding a target substance” is present near the surface of a particle body. It substantially means that “the substance to which the target substance can bind” or “the functional group to which the target substance can bind” force means only the aspect directly attached to the surface of the S particle body. Absent. Also, “immobilization” substantially means that the “target substance can be bound to a substance or functional group” is immobilized on at least a part of the particle surface, and “target substance can be bound to Substances or functional groups do not necessarily have to be immobilized over the entire particle surface.
  • the substance or functional group to which the target substance can be attached is present over the entire particle surface so that the particle body is contained in “the substance or functional group to which the target substance can be attached”.
  • target substance binding not only includes the aspect in which the target substance is “adsorbed” or “absorbed” to the particle, but also between the target substance and the particle. It also includes embodiments in which the target substance is bound to the particle due to various “affinities” that act on the
  • a substance to which a target substance can be bound or "a target substance is bound to Since the possible functional group is immobilized, the target substance can be bound to the particle via the acting substance or the functional group.
  • the polymer is attached or attached to a part of the surface of the particle body, and the “substance or functional group capable of binding the target substance” is the surface of the particle body and / or the polymer. It is fixed to Also, in another embodiment, the polymer covers the entire surface of the particle body, and "the substance or functional group capable of binding the target substance" is immobilized on the surface of the polymer.
  • the polymer deposited or attached to the surface of the particle main body is preferably one that contributes to the immobilization of the “target substance capable of binding” or “the functional group to which the target substance is capable of binding”; It can be arbitrarily selected according to the type of the substance capable of binding or the functional group to which the target substance can be bound, the conditions of use of the particles, and other necessary properties.
  • Representative polymers are exemplified by polystyrene or derivatives thereof, poly (meth) acrylic acid, poly (meth) acrylic acid ester, polyvinyl ether, polyurethane, polyamide, polyacetate beer, polyvinyl alcohol, polyallylamin and polyethylene Mention may be made of at least one synthetic polymer compound selected from the group consisting of amines.
  • synthetic polymer composites and modified products or copolymers thereof may be used.
  • it may be a semi-synthetic high molecular weight compound such as hydroxyalkyl cellulose, carboxyalkyl cellulose or sodium alginate or a polymer such as natural high molecular weight compound such as chitosan, chitin, starch, gelatin or gum arabic.
  • it may be a polymer in which a functional group to which “target substance can be bound” or “functional group to which the target substance can be bound” can be bound or attached is introduced.
  • various molecules or metal ions constituting the particle body may be used.
  • polymers such as polystyrene, alkyl polymethacrylates, polyvinyl ethers or polyacetates, which are less permeable to water, may be selected. Choose one.
  • adherence substantially means an embodiment in which a polymer is present on at least a part of the particle surface.
  • the binding aspect of the particle of the present invention and the target substance will be described below.
  • the target substance is bound to the particle by the adsorption power or affinity acting between the target substance and the “substance or functional group capable of binding the target substance”. become.
  • Adsorption is synonymous with “chemisorption” for classification and explanation below.
  • the target substance binds to the particle due to the “adsorption force”
  • the “target substance” is avidin
  • the particle main body is formed of zirconia
  • the target substance is bound to
  • the possible substance or functional group is an epoxy group.
  • affinity the following five major substances or functional groups capable of binding the target substance, which are immobilized on the surface of the particle body, are selected based on the type of affinity acting on the target substance: (It should be noted that substances or functional groups listed in each classification are merely examples, and other substances or functional groups can be considered). In addition, when it originates in such affinity, “the substance or functional group which can bind a target substance” is called “the substance or functional group which has affinity” in the following.
  • Silica activated carbon, sulfonic acid group, carboxyl group, jetylaminoethyl group, triethylaminoethyl group, phenyl group, arginine, cellulose, lysine, poly Lysine, polyamide, poly (N-isopropylacrylamide), crown ether or cyclic compound having ⁇ electron, or functional derivative thereof, oxygen conjugate or fluorescent probe conjugate, etc.
  • Alkyl group octadecyl group, octyl group, cyanopropyl group or pityl group or phenole group, or their functional derivative, oxygen bond or fluorescent probe bond, etc.
  • DNA DNA, RNA, Oligo (dT), chitin, chitosan, amylose, cellulose, dextrin, dextran, pullulan, polysaccharide, lysine, polylysine, polyacrylamide, poly (N-isopropylaquinoleamide ) Or] 3-glucans, or their functional derivatives, oxygen conjugates or fluorescent probe conjugates, etc.
  • Iminodiacetic acid nickel, nickel ion, nickelo body, cobalt, cononoret ion, cobalt complex, copper, copper ion or copper complex, or an oxygen bond or fluorescent probe conjugate thereof
  • a substance or functional group having affinity in which the affinity acting on the target substance is due to biologic interaction (biochemical interaction: including interaction with biomolecules Antigen 'antibody reaction, ligand' receptor binding, hydrogen bond, coordination bond, hydrophobic interaction, electrostatic interaction, ⁇ - ⁇ interaction, ⁇ -force thione interaction, dipole interaction and van der Waals' reaction Interactions that work together in a single force or in two or more species)
  • biologic interaction biochemical interaction: including interaction with biomolecules Antigen 'antibody reaction, ligand' receptor binding, hydrogen bond, coordination bond, hydrophobic interaction, electrostatic interaction, ⁇ - ⁇ interaction, ⁇ -force thione interaction, dipole interaction and van der Waals' reaction Interactions that work together in a single force or in two or more species
  • Ovomucoid Inhibitors such as trypsin inhibitor and lipase inhibitor, phosphorylethanolamine, phenylalanin, protamine, sypaque blue, proscience red, heparin, glutathione, DIG, DIG antibody, DNA, R NA, O 1 igo (dT), chitin, chitosan, ⁇ -glucan, calcium phosphate, calcium hydrogen phosphate, hyanoreronic acid, elastin, cericin or fiproin, or their functional derivative, oxygen conjugate or fluorescent probe binding Body etc
  • “having an affinity” as used herein means an electrostatic interaction, ⁇ - ⁇ interaction between a target substance and a substance or a functional group to be immobilized on a particle. It substantially means that effects, ⁇ -force thione interaction, dipolar interaction, hydrophobic interaction, biochemical interaction, hydrogen bond or coordination bond, etc. are brought about.
  • ⁇ -force thione interaction dipolar interaction
  • hydrophobic interaction hydrophobic interaction
  • biochemical interaction hydrogen bond or coordination bond, etc.
  • hydrogen bond or coordination bond etc.
  • two or more of the above-mentioned affinity may be combined, and overlapping substances or functional groups in the above-mentioned classification may be present. I want to.
  • the substance is not necessarily limited to the above-mentioned classification, and any substance or functional group may be used as long as it acts on the target substance and causes the target substance to be present on or near the particle surface. It may be fixed (for example, one that has affinity due to its complementary shape with the target substance).
  • the method for producing particles of the present invention will be described in detail below.
  • the particles to which the target substance can be bound, and the specific surface area of the particles is the same as that of the particles, and the specific surface area of the spherical particles having the same size and density. This is a method of obtaining “particles in which the surface of the particle body is roughened so as to be L 00 times”.
  • the production method of the present invention is
  • the raw material particles are brought into contact with at least one or more acidic substances selected from the group consisting of hydrochloric acid, sulfuric acid and nitric acid.
  • the particle density obtain particles of 3. 5 g / cm 3 S gZcm 3
  • the raw material particles is formed from a metal or metal oxide, for example, Jinorekonia (Sani ⁇ zirconium, yttrium-doped Sani ⁇ Ji Rukoniumu
  • it is formed of at least one material selected from the group consisting of iron oxide, alumina, nickel, comonomers, iron, copper and aluminum.
  • the density of the raw material particles, 3. a 5 gZcm 3 ⁇ 9 gZcm 3, yo Ri preferably 5.
  • the density of the raw material particles may be greater than 9.0 g / cm 3 (more specifically, 9.0 g / cm 3 (excluding 9.0 gZcm 3 ) to 2 3 g / cm 3 ) may also be possible (in this case, the raw material particles are Ag (silver), Au (gold), Pt (platinum), P d (palladium), W (tungsten), Rh (rhodium), O At least one selected from the group consisting of s (osmium), R e (rhenium), I r (iridium), Ru (ruthenium), Mo (molybdenum), H f (hafnium) and Ta (tantalum) force
  • it is formed of the above transition metal element, or P b (lead), B i It is preferable that it is formed of at
  • the particle size or average particle size of the raw material particles is preferably 1 ⁇ ! ⁇ 5 mm, more preferably 5 ⁇ m to 5 ⁇ m, and still more preferably 1 ⁇ m pi! ⁇ 1 0 O / m.
  • the raw material particles to be used are preferably particles in which no through holes are formed. That is, it is preferable that the raw material particles are particles that are substantially solid and do not have a penetration network structure inside.
  • commercially available particles can be used directly as long as they are made of the above-mentioned materials and physical properties.
  • the “at least one or more acidic substance selected from the group consisting of hydrochloric acid, sulfuric acid and nitric acid” is preferably used in the liquid state.
  • these acidic substances it is particularly preferable to use sulfuric acid or nitric acid.
  • hydrothermal reaction When subjected to a hydrothermal reaction (or solpothermal method), “hydrochloric acid”, “sulfuric acid” and “nitric acid” substantially mean “hydrochloric acid aqueous solution”, “aqueous sulfuric acid solution” and “nitric acid aqueous solution”, respectively.
  • the “mixed liquid containing the raw material particles and the acidic substance” forms an aqueous solution.
  • the acid concentration of the acidic substance can be appropriately selected in consideration of the type of acid, temperature, pressure, time, or handling, cost, and safety (for example, 15 to 20 ° C. in a pressure container). In the case of reaction for 3 to 16 hours, for example, 1 to 30 vo 1% of sulfuric acid can be used).
  • a liquid mixture comprising raw material particles and an acidic substance is heated to a suitable temperature.
  • heating can be carried out by "optical crepe", “temperature bath” or “microwave irradiation”.
  • the temperature condition of the hydrothermal reaction is preferably 150 ° C. to 300 ° C., more preferably 160 ° C. to 220 ° C., still more preferably 170 ° C. to The temperature is 240 ° C.
  • the pressure condition of the hydrothermal reaction is preferably from 0 .: to 10 MP a, more preferably from 0.5 to 7 MP a, still more preferably from 0.7 to 3.7 M Pa.
  • the hydrothermal reaction treatment is generally carried out preferably for 1 minute to 12 hours, more preferably for 30 minutes to 9 hours, more preferably for about 1 hour to 7 hours.
  • Sorposa It is possible to use not only water but also various organic solvents in the single circle method. In this case, there is no particular limitation as long as it is a solvent which does not become two-phased with the acid used.
  • the reaction temperature at this time is as described above.
  • the pressure conditions are unambiguously determined as different force temperatures are determined depending on the solvent used.
  • microwaves for hydrothermal reaction treatment "mixture containing raw material particles and acidic substance” is charged into a pressure vessel for hydrothermal reaction, and microphone wave from the outside is mixed into the mixed aqueous solution. Irradiate. The microwave irradiation continues until the temperature of the “mixture containing the raw material particles and the acidic substance” reaches the target temperature, but after the target temperature is reached, the output is kept to keep the temperature constant. You may continue irradiation while changing.
  • the frequency of the microphone mouth wave to be irradiated is particularly limited if it can heat the “mixture containing the raw material particles and the acidic substance” to the target temperature (ie, the temperature of 150 to 300 ° C.) There is no, but for example 2.45 GHz.
  • the output of the microwave to be irradiated is not particularly limited as long as it can be heated to the target temperature, but increasing the output shortens the time to reach the target temperature, while lowering the output keeps the temperature of the mixed water solution constant. It becomes easy to keep. If the output of the microwave can be variably controlled, it is particularly preferable because both shortening of the time to reach the target temperature and temperature control can be appropriately performed.
  • a device capable of variably controlling the output of microwaves mention may be made of "Micro SYNTH (Microsyns)" manufactured by Milestone Generale.
  • step (I) the surface of the raw material particles is roughened, and the specific surface area of the roughened particles is 1.4 to 4 of the specific surface area of the spherical particles having the same particle size and density as the particles.
  • L 00 fold becomes, preferably, the ratio is 1 X 10 one 6 [cm 3 / cm of pore radius 20 nm or more cumulative pore volume per unit surface area of the particles or particle body [cm 2] [cm 3] 2 ] or more.
  • the surface of the raw material particle can be roughened to a depth of up to about 2 ⁇ m, and more preferably, to about 1.5 ⁇ m from the surface of the raw material particle.
  • the proportion roughened does not exceed 40% of the particle body diameter, more preferably not exceed 30%, and still more preferably not exceed 20%.
  • the raw material particles are preferably subjected to washing, filtration or drying.
  • washing the particles impurities can be removed from the particle surface.
  • the acidic substance used for the surface roughening treatment or the compound derived therefrom can be removed.
  • Washing is preferably carried out with water, but in addition to water, particles may be washed with various organic solvents such as alcohol, ethanol, methanol, toluene, and hexane.
  • the filtration may be performed at the time of washing, and the washing solution etc. can be removed from the particles.
  • the drying of the particles is preferably carried out under temperature conditions of preferably 10 to 150 ° C, more preferably 40 to 90 ° C. Although the particles may be dried using drying, the particles may be dried by natural drying.
  • step (II) “the substance or functional group capable of binding to the target substance” is immobilized on the raw material particle. That is, “the substance to which the target substance can be bound” or “the functional group to which the target substance can be bound” is introduced on the surface of the raw material particle.
  • the method for immobilizing “the substance to which the target substance can bind” to the raw material particle and it may be any one that can bind or attach to the raw material particle “the substance to which the target substance can bind”. For example, any method may be used.
  • the “target substance can be bound” is not limited to direct bonding or adhesion to the raw material particles, but if necessary, silicon-containing substances (eg, siloxane, silane coupling agents, sodium phosphate, etc.) Or) other substances such as resin having a functional group to which the target substance can bind or attach are previously attached or introduced to the raw material particles, or the surface of the raw material particles is subjected to a precious metal deposition treatment.
  • silicon containing substances eg, siloxane, silane coupling agents, sodium phosphate, etc.
  • other substances such as resin having a functional group to which the target substance can bind or attach are previously attached or introduced to the raw material particles, or the surface of the raw material particles is subjected to a precious metal deposition treatment.
  • the “target substance can be attached” It may be easy to immobilize the particles.
  • silicon containing When a substance is used, "a substance to which a target substance can be bound” is immobilized on the surface of the raw material particle, and such
  • An example of a method for immobilizing “a substance capable of binding a target substance” to a raw material particle is explained, for example, by reacting a silane coupling agent having an epoxy group or an amino group on the surface of the raw material particle. Substances to which substances can be bound can be immobilized on particles.
  • the method for immobilizing “the functional group to which the target substance can bind” is not particularly limited, and “the functional group to which the target substance can bind” is bound or attached to the particle Any method can be used as long as it can do the same.
  • the “functional group to which the target substance can be bound” may be chemically treated to convert it into another functional group to change the reactivity, adsorptivity, and the like.
  • the substance to which the target substance can be attached not only “the functional group to which the target substance can be attached” is directly bound or attached to the raw material particles, but, if necessary, a silicon-containing substance (eg, siloxane, Other materials such as a silane coupling agent and sodium caerate), a resin having a functional group to which a target substance can be attached or attached, or the like are previously attached to or introduced into the raw material particles, or noble metal coated on the surface of the raw material particles.
  • a silicon-containing substance eg, siloxane, Other materials such as a silane coupling agent and sodium caerate
  • a resin having a functional group to which a target substance can be attached or attached or the like are previously attached to or introduced into the raw material particles, or noble metal coated on the surface of the raw material particles.
  • the roughened raw material particles are dispersed in pure water, and while stirring the obtained dispersion, 3-dalicidoxypropyltrimethoxysilane having an epoxy group at the end is added to the dispersion and stirred.
  • 3-glycidoxyprovir trimethoxysilane may be added alone, or diluted with a solvent such as water or ethanol.
  • the mixing ratio of water and the organic solvent can also be performed at an arbitrary ratio.
  • a catalyst for the reaction it is possible to add an acid such as acetic acid or hydrochloric acid, or a base such as aqueous ammonia.
  • the reaction time is usually from 10 minutes to 6 hours. If it is too short, the reaction may not proceed, and if it is too long, the epoxy may be decomposed.
  • the stirring method is not particularly limited, and may be stirring blades, magnetic stirrers, disc rotors, and the like.
  • drying is carried out, but in this case, it is also possible to dry the particles after washing the particles with an organic solvent other than simply washing with water and drying.
  • organic solvents such as acetone and toluene can be used in this case.
  • the drying is also not particularly limited, and heating may be performed at room temperature, and either normal pressure or reduced pressure may be used.
  • the method for depositing or adhering the polymer to the raw material particles is not particularly limited, and any method may be used as long as the polymer can be deposited on at least a part of the surface of the raw material particles. Good. For example, the following method can be mentioned.
  • the polymer is attached to the surface of the raw material particle by bonding or adsorbing an initiator or a chain transfer agent to the surface of the raw material particle and stretching the polymer from the particle surface.
  • the polymer is deposited on the surface of the raw material particles by carrying out the polymerization in the presence of the raw material particles using a monomer which precipitates with the progress of the polymerization reaction. The deposition can be performed more efficiently by selecting each charge so as to attract the polymer and the particle, or by fixing the polymerizable double bond on the particle surface.
  • a combination of a monomer capable of forming a monomer emulsion and a solvent is selected, and the raw material particles are contained in the resulting monomer emulsion to polymerize the particle surface. Onto the polymer. In this case, it is preferable to use a surface treatment, a surfactant or the like to improve compatibility with the monomer so that the raw material particles are preferentially present in the monomer emulsion.
  • the raw material particles are mixed in the polymer solution, and the solubility of the polymer is reduced by adding a poor solvent, changing pH or adding a large amount of salt.
  • the polymer is deposited on the surface of the raw material particles by precipitation. Also in this case, techniques such as charge selection and fixing of the polymerizable double bond are effective.
  • the raw material particles may be alternately immersed in polymer solutions of different charges to form a laminate on the particle surface.
  • the surface of the raw material particles may be subjected to a specific treatment prior to the polymer deposition treatment.
  • a specific treatment prior to the polymer deposition treatment.
  • coating treatment with metal or inorganic substance adsorption treatment of surfactant, reactive substance such as silane coupling agent or titanium coupling agent
  • adsorption treatment of surfactant, reactive substance such as silane coupling agent or titanium coupling agent
  • Si H-treated with siloxane coating
  • acid treatment or alkali treatment solvent washing treatment, polishing treatment, etc.
  • the contamination of the surface of the raw material particle is removed, the charge of the surface of the raw material particle is controlled, and the reactive functional group is introduced onto the particle surface, so that the deposition efficiency of the polymer is improved. Adhesion between the polymer adherent and the particle surface is improved.
  • the main surface of the particle of the present invention When a silicon-containing substance such as a siloxane or silane coupling agent is used, in addition to “the substance or functional group to which the target substance can be bound” and the adhesion polymer, the main surface of the particle of the present invention It will be appreciated that such silicon-containing materials will be present (eg, silicon compounds may be interposed between the surface of the source particles and the surface of the deposited polymer). If polymerization is carried out by previously binding or adsorbing the initiator and / or the polymerizable double bond to the surface of the raw material particles, surface deposition of the deposited polymer is likely to occur, which may be advantageous for the deposition treatment of the polymer. . In addition, other properties such as reduction of non-specific bonds, suppression of elution of metal ions, adjustment of density, application of color and fluorescence, etc. may be given to impart other properties.
  • silicon-containing substance such as a siloxane or silane coupling agent
  • the deposited polymer may be crosslinked.
  • properties such as durability, solvent resistance or low swelling of the polymer may be improved.
  • the method of crosslinking is not particularly limited, but the typical methods are as follows.
  • the raw material particles are deposited by deposition of a polymer having a carboxyl group or polymerization of a monomer having a carboxyl group.
  • a method of adding a polyfunctional epoxy crosslinking agent to the system after coating and adding heat to crosslink may be mentioned.
  • a method of crosslinking using a hydroxyl group instead of a carboxyl group and an isocyanate crosslinking agent instead of an epoxy crosslinking agent is also conceivable.
  • Examples of the method belonging to b include a method of introducing an epoxy group, an isocyanate group or a double bond into a polymer to be deposited.
  • (3) a can be used to introduce an epoxy group or an isocyanato group
  • (3) b can be used to introduce a double bond.
  • a substance capable of binding a target substance or a “functional group capable of binding a target substance” is immobilized on the main body surface and / or the deposition polymer surface of the particle of the present invention. You will understand that.
  • the method for immobilizing the “functional group to which the target substance can be bound” is not particularly limited in the embodiment in which the adherent polymer is provided on the surface of the raw material particle, and the “functional group to which the target substance can be bound” Any technique may be used as long as it can be bound or attached to the particles. Furthermore, the fixing of the “functional group to which the target substance can be bound” may be performed before, during or after the polymer deposition treatment.
  • the adhesion polymer is provided on the surface of the raw material particles, as a method for immobilizing the “functional group to which the target substance can be attached”, for example, in the polymerization reaction of the polymer to be attached
  • a method for polymerizing or copolymerizing a monomer having a functional group examples include (meth) acrylic acid, glycidyl (meth) acrylate, hydroxyalkyl (meth) acrylate, and dimethyl (meth) acrylate.
  • the reactivity to the functional group a introduced to the adherent polymer by the above method A compound having two functional groups, another functional group b having a and a functional group c having a higher binding property to a target substance, may be additionally introduced into the particle.
  • a compound having two functional groups, another functional group b having a and a functional group c having a higher binding property to a target substance may be additionally introduced into the particle.
  • binding the functional group a to the functional group b it is possible to obtain a particle on which the “functional group c having a higher binding property to the target substance” is immobilized.
  • the two functional groups of the other functional group having reactivity with the introduced functional group a and the “functional group to which the target substance can be bound” may be additionally introduced into the particle into which the functional group a is introduced (in this case as well, “the functional group to which the target substance can be bound via the bond of the functional group a and the functional group b Is immobilized on the particle).
  • the introduction of such a compound may be repeated twice or more to make the linker length longer.
  • the "target substance” The degree of freedom of the functional group capable of binding is increased, and not only the reactivity thereof is improved, but also the degree of freedom of the target substance is enhanced, and advantageous effects such as that the function of the target substance is not suppressed can be expected.
  • the linker has a length of 5 or more and 50 or less, and the above effect can be expected particularly.
  • the main chain of the linker it is particularly preferable to use one with low nonspecific adsorption (for example, polyethylene glycol chain) such as ecologically related substances.
  • the method for immobilizing the “target substance capable of binding to the target substance” in the embodiment in which the deposition polymer is provided on the surface of the raw material particle, and the “target substance is bound to Any technique may be used, as long as it is capable of binding or adhering to the particle. Immobilization of "the substance to which the target substance can bind" may be carried out before, during or after the polymer deposition treatment.
  • the "substance capable of binding to the target substance” can be immobilized on the particle in the same manner as the above-described technique for introducing the "functional group to which the target substance can be bound”.
  • a functional group having a binding property to the “target substance can be bound” is previously introduced on the surface of the raw material particle or on the surface of the attached polymer, and the substance capable of binding the target substance is obtained via the functional group.
  • a hydrophobic polymer is used as the deposition polymer and a hydrophobic one is used as the “target substance can be bound”
  • so-called “hydrophobic interaction” occurs in which hydrophobic substances are adsorbed in water.
  • the hydrophobic “target substance can be bound” can be immobilized on the surface of the deposited polymer.
  • the particles obtained are preferably subjected to washing, filtration, drying or the like after the step (II).
  • washing is preferably carried out with water, but it is also possible to wash particles with various organic solvents such as ethanol, water, etc., alcohol, such as ethanol, water, etc., toluene, hexane, etc.
  • the filtration may be performed at the time of washing, and the washing solution etc. can be removed from the particles.
  • the drying of the particles is preferably carried out under temperature conditions of preferably 10 to 150 ° C, more preferably 40 to 90 ° C. Although the particles may be dried using a drier, the particles may be dried by natural drying.
  • Such a separation method is a method of separating the target substance from the sample or obtaining the particle on which the target substance is immobilized, using the above-mentioned particles of the present invention.
  • the separation method of the present invention comprises the steps of: (i) bringing a sample comprising a target substance into contact with the particles of the present invention, and binding the particles to the target substance; (ii) subjecting the sample to rest and allowing the particles to spontaneously settle in the sample, and (iii) separating the target substance from the sample or recovering the target substance by recovering the particles precipitated in the sample.
  • step (i) the sample comprising the target substance is brought into contact with the particle of the present invention, and the particle and the target substance are mutually bound (see FIG. 1 (a)).
  • the sample and the particles are brought into contact by supplying the particles to a sample comprising the target substance.
  • a stirring process may be performed to promote bonding.
  • the particles to be provided are the above-mentioned particles of the present invention (that is, “particles in powder form (preferably particles having an average size of 1 to 1 mm) whose surface has been subjected to surface roughening treatment).
  • the amount of particles in the powder form is determined in relation to the type of sample, separation application, etc., and can not be specified comprehensively, but to give an example, it can be used from one particle, For analysis and research applications, it can be from 1 to 2 g to 10 3 g), and from industrial use it can be from 1 to 10 3 kg unit to 1 to 10 t unit. .
  • the sample containing the target substance is, for example, a beaker, a measuring cylinder, a test tube, a microtube, a microchip, a chemical chip, a / X-TAS chip, etc. so that natural precipitation of particles is brought about in step (ii). It is preferable to use it in the state of
  • the binding between the target substance and the particles is caused by the adsorptive force or affinity acting between them. More specifically, the target substance and the particle can be obtained by acting on the target substance and the adsorption power or affinity between the target substance and the substance or functional group capable of binding to the target substance immobilized on the particle. Join together. Depending on the amount of particles in powder form to be provided in the sample, there may be particles that do not contribute to the binding of the target substance (for example, when the particles are excessively supplied).
  • the particles used in the method of the present invention do not have a (1) specific surface area larger than necessary, and (2) Since a desired size of pores is present in a certain proportion, it is a particle that can suppress nonspecific binding in which a substance other than the target substance binds to the particle. Therefore, even if the sample contains substances other than the target substance, the target substance can be preferentially bound to the particles.
  • the target substance is, for example, a nucleic acid, a protein (including, for example, avidin and biotinylated HRP, etc.), a sugar, a lipid, a peptide, a cell, a fungus, a bacterium, a yeast, a virus, a glycolipid, a glycoprotein, a complex, as described above.
  • a protein including, for example, avidin and biotinylated HRP, etc.
  • a sugar a lipid, a peptide, a cell, a fungus, a bacterium, a yeast, a virus, a glycolipid, a glycoprotein, a complex, as described above.
  • the sample provided with the particles is allowed to stand to allow the particles of the present invention to naturally settle in the sample (see FIG. 1 (b)).
  • the particles used in the method of the present invention have the density characteristics as described above, so that a relatively high natural sedimentation velocity can be obtained. In other words, since the density of the particles used is high, it is possible to obtain sufficient separation speed just by naturally settling the particles.
  • step (iii) the target particles are separated from the sample or the target-fixed particles are obtained by collecting the particles of the present invention precipitated in the sample (see FIG. 1 (c)). .
  • a supernatant is formed in the upper area of the sample, as the particles settle in the lower area of the sample or in the bottom area of the vessel due to spontaneous sedimentation. Therefore, the particles precipitated in the sample can be recovered by aspirating the supernatant with a pipette or the like. Since the target substance is bound to the recovered particles as described above, the target substance is separated from the sample by the recovery of the particles. [0 0 9 5]
  • the particles to be treated are roughened, whereby the particles with increased area and / or the ability to bind the target substance to the surface of the particles are increased. Because of this, the amount of target substance that can be bound per particle during natural sedimentation is increasing. As a result, in one processing operation, "more target substance is separated from the sample” or “particles on which more target substance is immobilized” are obtained. This leads to an increase in the total amount of detection, which leads to an improvement in detection sensitivity, a simple measurement or a reduction in measurement error, and has some advantageous effects.
  • the method of the present invention can separate the target substance in the sample or obtain particles on which the target substance is immobilized, by applying them, cells, proteins, nucleic acids or A system for analyzing, extracting, purifying and reacting various target substances such as chemical substances becomes possible. More specifically, in addition to the above-described separation of target substances and the construction of a system for immobilization, it is possible to construct a system for analysis, extraction, purification or reaction of target substances. For example, in the “system for analyzing target substance”, the target substance is injected into the chip inner particle by injecting the target substance into the chip in the form in which the particle in which the antibody capable of binding to the target substance is immobilized is loaded in the chip.
  • the target substance mass is detected by absorption, chemiluminescence, fluorescence, magnetism, etc. using as a marker an antibody that is immobilized and further bound with an enzyme that binds to the target substance, a fluorescent dye, a magnetic substance, etc. If it is a nucleic acid, the target substance is immobilized on the chip inner particle by injecting the target substance on which the enzyme or the fluorescent dye is immobilized in the chip in a form loaded with particles on which the nucleic acid capable of binding the target substance is immobilized.
  • the target substance can be analyzed quantitatively or qualitatively by detecting the target substance mass by absorption, chemiluminescence, fluorescence or magnetism.
  • the reaction may be carried out at the same place in a plurality of reaction vessels provided on the chip at each reaction stage, or at another place. It is also possible to use gravity to move between reactors on the chip or to stir in each reactor.
  • the “target substance” is released from the particles and released.
  • the target substance can be extracted or purified by using the “substance substance” or performing necessary treatments such as heating and cooling.
  • “In System J which carries out the reaction of the target substance, the target substance is injected onto the chip soot particles by injecting the target substance into the chip in a form loaded with particles in which the substance capable of binding to the target substance is immobilized.
  • the target substance can be reacted by fixing, mixing, heating, stirring, UV irradiation, etc. at each location of a plurality of reaction vessels on the chip, in which case the target substance can be reacted. It is possible to use gravity to move or to stir in each reaction vessel, or to fix the enzyme or catalyst to particles and to charge it into the reaction system using gravity.
  • polyethylene glycol polyvinyl alcohol, polybutyl pyrrolidone, polyacrylic acid, poly (2-ethyl-2-hydroxy oxazoline), polydimethyl acrylamide, dextran, pullulan, agarose, Sepharose, amylose , Cellobiose, Chitin, Chitosan, Polysaccharide, Normal Serum, Bovine Serum Albumin, Human Serum Albumin, Casein, Skimmed Milk Powder, and at least one substance selected from the group consisting of functional group derivatives thereof It may be attached to The deposition method is not particularly limited, and a general coating method of particles may be used. For example, in the case of using polyethylene glycol, "a substance or functional group to which a target substance can be bound" is immobilized on the surface of the raw material particle, and the
  • a particle to which a target substance can be bound is immobilized on the surface of the particle body, and
  • the surface of the particle body is roughened, and the specific surface area of the particles is 1.4 to L 00 times the specific surface area of the spherical particles having the same particle size and density as the particles. particle.
  • the second aspect in the first aspect, the pore radius 20 nm or more cumulative pore volume per unit surface area [cm 2] [cm 3] ratio 1 X 10- 6 of [cm 3 / cm 2] A particle characterized in that the surface of the particle main body is roughened as described above.
  • a third aspect in the first or second embodiment, the particles, wherein the density of 3. 5 g / cm 3 ⁇ 9 is 0 gZcm 3..
  • the particle main body is formed of at least one or more materials selected from the group consisting of zircoa, itrium added zirconia, iron oxide and alumina.
  • a particle characterized by having Seventh aspect A particle having magnetism according to any one of the first to sixth aspects.
  • the polymer is attached to a part of the surface of the particle main body
  • a particle characterized in that "a substance or functional group to which a target substance can be bound” is immobilized on the surface of a particle body or polymer.
  • the polymer is coated so as to wrap the entire surface of the particle main body, and "the substance or functional group to which the target substance can be bound” is A particle characterized in that it is immobilized on a polymer surface.
  • the polymer is selected from the group consisting of polystyrene, poly (meth) acrylic acid, poly (meth) atalinoleic acid ester, polyvinyl alcohol, polyurethane, polyamide, polyvinyl acetate vinylonate, poly A particle characterized in that it is at least one or more polymers selected from the group consisting of buruanole corneole, polyallylamine and polyethyleneimine.
  • a particle is characterized in that the polymer is cross-linked.
  • the 14th aspect In any of the 1st to 13th aspects described above, “substance capable of binding a target substance”, selected from the group consisting of “1S-Piotin, Avidin, Streptavidin and Neutravidin” Particles characterized by at least one or more substances.
  • a fifteenth aspect In any one of the first to the thirteenth aspects, “a functional group capable of binding a target substance”, a carboxyl group, a hydroxyl group, an epoxy group, a silyl group, a succinimide group, a maleimide Group, thiol group, thioether group, disulfide group, aldehyde group, azide group, hydrazide group, primary amino group, secondary amino group, tertiary amino group, imidester group, carpodiimide group, isocyanato group, iodoacetyl group, carpoxynore
  • a particle characterized by at least one or more functional groups selected from the group consisting of halogen substitution of a group and a double bond.
  • the adsorptive power or affinity acting between “the substance or functional group to which the target substance can be bound” and the “target substance” A particle characterized in that the target substance can be bound to the particle.
  • the affinity acting between the “substance or functional group capable of binding the target substance” and the “target substance” is an electrostatic interaction, ⁇ A particle characterized by interaction, ⁇ -cation interaction, dipolar interaction, hydrophobic interaction, hydrogen bond, coordination bond or biochemical interaction.
  • a method of producing particles capable of binding a target substance comprising: (I) contacting the raw material particles with at least one or more acidic substances selected from the group consisting of hydrochloric acid, sulfuric acid and nitric acid, and
  • step (I) the surface of the raw material particles is roughened so that the specific surface area of the particles is 1.4 to 4: L 00 times the specific surface area of the spherical particles having the same particle size and density as the particles.
  • a method of roughening the surface is 1.4 to 4: L 00 times the specific surface area of the spherical particles having the same particle size and density as the particles.
  • the ratio of the cumulative pore volume [cm 3 ] per unit surface area [cm 2 ] of the pore radius of 20 nm or more is 1
  • Twentieth aspect The manufacturing method according to the eighteenth or nineteenth aspect, wherein in the step (I), the raw material particles are roughened so as not to form through holes.
  • Twenty-second aspect The production method according to any one of the eighteenth to twenty-first aspects, wherein raw material particles having a density of 3.5 g / cm 3 to 9. O g / cm 3 are used.
  • Twenty-third aspect A method for obtaining a particle from which a target substance is separated from a sample or to which a target substance is immobilized, using the particle according to any one of the first to seventeenth aspects, which comprises: Bringing the sample into contact with the particles, and binding the particles to the target substance;
  • Example 1 A method comprising.
  • a Nitrim-made Itrimum-added Zirkoyua particle p 1 was prepared.
  • the particles 1 had a particle size of 23 m and a specific surface area of 0.506 m 2 / g and a density of 6 g / cm 3 .
  • the particles P 1 were mixed with a 25 V 1% aqueous sulfuric acid solution in a pressure resistant vessel, and heated in a thermostat at 200 ° C. for 6 hours. After this, it was washed and dried. By this operation, the specific surface area of the particles became 0.40 m 2 / g.
  • An electron microscopic picture of the particles is shown in Fig. 2 (Fig. 2 (a) is the whole particle picture and Fig. 2 (b) is an enlarged surface picture of the particle).
  • the particles were washed with a 10 mM PBS solution (pH 3.2) and water, and then the particles were dried under vacuum to obtain an avidin-immobilized zircomia particle P1 having avidin immobilized thereon.
  • the particles P 1 had a particle size of 2 3 ⁇ and a specific surface area of 0.4 Om 2 / g and a density of 6 g / cm 3 .
  • the specific surface area 0.40 m 2 / g of the particle P 1 obtained here is a specific surface area when it is a true spherical particle having a smooth surface with a particle size of 23 m (ie, a particle size of 23 ⁇ and a density of 6 g / cm 3 9 ⁇ 2 times that in the specific surface area the force resulting 0. 043m 2 / g) was large.
  • the cumulative pore volume of more pore radius 20 nm is 3. 3 X 10- 3 cm to 3 of which was a g, per unit area of a sphere particles having a particle size and density of the same particles P 1 cumulative pore volume of more pore radius 20 nm is 7. 6 X 10- 6 [cm 3 Bruno cm 2] ToNatsu
  • the cumulative pore volume of more pore radius 20 nm is 3.
  • a silane coupling agent having an epoxy group is used, but as a silane coupling agent, it has an amino group, an isocyanate group, a mercapto group, a functional group having a double bond, and the like. It was noted that one may be used.
  • Example 1 is the same as Example 1 except that the conditions for the sulfuric acid treatment were 200 ° C./8 hours.
  • the obtained particles P 2 have a particle size of 23 ⁇ , a specific surface area of 1.6 m 2 Zg, and a density of 6 g Zcm
  • the specific surface area 1.6 m 2 Z g of the particles P 2 obtained here is the specific surface area (i.e., the particle size 23 Atm and the density 6 g Z cm) of the spherical particles having a smooth surface with a particle size of 23 m.
  • the specific surface area of 0.43 m 2 ( Zg) obtained from No. 3 was 37 times larger than the value obtained.
  • the conditions are the same as in Example 1 except that the conditions for the sulfuric acid treatment were 200 ° C./12 hours.
  • the obtained particles P 3 had a particle diameter of 23 ⁇ , a specific surface area of 2.7 m 2 Zg, and a density of 6 g Z cm 3 .
  • the specific surface area of the particle P 3 obtained here is 2. 7 m 2 Zg, which is a specific surface area when it is made a true sphere particle having a smooth surface with a particle diameter of 2 3 ⁇ (ie, a particle diameter of 23 ⁇ m and a density 6
  • the specific surface area (0.43 m 2 / g) obtained from g / cm 3 was 62 times larger than the specific surface area (0.43 m 2 / g).
  • the cumulative pore volume of more pore radius 20n m is 2. 6 X 10- 2 cm 3 ⁇ Since paragraph, the cumulative pore volume of more than a unit area per Rino pore radius 20 nm of true spherical particles having the same particle size and density and the particle P 3 6. 0X 10- 5 [cm 3 / cm 2 It became].
  • the conditions are the same as in Example 1 except that the conditions for the sulfuric acid treatment were 200 ° C. and Z 16 hours.
  • the obtained particles P4 had a particle size of 23 / zm and a specific surface area of 3.9 m 2 / g and a density of 6 gZ cm 3 .
  • the specific surface area of the particle P 4 obtained here is 3.9 m 2 Zg, which is a specific surface area (ie, the particle diameter of 23 / m and the spherical surface particle having a smooth surface with a particle diameter of 23 / m).
  • the specific surface area (0.43 m 2 / g) obtained from the density 6 g / cm 3 was 90 times larger than the specific surface area value (0.43 m 2 / g).
  • the integrated pore volume of the pore radius of 20 nm or more was 6. 3 ⁇ 10 2 cm 3 Zg
  • the unit area of the spherical particles having the same size and density as the particle P 4 is the cumulative pore volume of more pore radius 20 nm of 1. 4X 10- 4 [cm 3 / cm
  • the conditions are the same as in Example 1 except that the conditions for the sulfuric acid treatment were 160 ° C./6 hours.
  • the obtained particles P5 had a particle size of 23 / zm, a specific surface area of 0.12 m 2 Z g, and a density of 6 gcm 3 .
  • the specific surface area of 0.15 m 2 Zg of particles P 5 obtained here has a particle diameter of 2
  • the specific surface area i.e., the specific surface value of 0.43 m 2 / g obtained from the particle size of 23 zm, density 6 g / cm 3 force
  • the specific surface value 0.43 m 2 / g obtained from the particle size of 23 zm, density 6 g / cm 3 force
  • the cumulative pore volume of more pore radius 20n m is 7. Since been filed with 2X 10- 4 cmS / g, per unit area of a sphere particles having the same particle size and density and particle P 5 Rino cumulative pore volume of more pore radius 20 nm became 1. 7X 10- 6 [cm 3 / cm 2]. [01 11]
  • Example 1 is the same as Example 1 except for mixing with a 25 V o 1% aqueous nitric acid solution instead of sulfuric acid treatment, and heating in a thermostat at 200 ° C. for 4 hours.
  • the obtained particles P6 had a particle size of 23 111, a specific surface area of 0.5 Om 2 / g, and a density of 6 g / cm 3 .
  • the specific surface area of the particle P 6 obtained here is a specific surface area when it is made a true sphere particle having a smooth surface with a particle size of 23 m (ie, a particle size of 23 zm and a density of 6 g It is 12 times larger than the specific surface area of 0.403 m 2 Zg) obtained from / cm 3 .
  • the cumulative pore volume of more pore radius 20n m is 4. Since been filed at 1 X 10- 3 cm 3 Zg, Ri per unit area of a sphere particles having a particle size and density of the same particles P 6 The cumulative pore volume of a pore radius of 20 nm or more was 9.4 ⁇ 10 " 6 [cm 3 / cm 2 ].
  • the conditions are the same as in Example 1 except that the conditions for the sulfuric acid treatment were set to 200 ° C./2 hours by microwave heating.
  • the obtained particles P7 had a particle size of 23 ⁇ , a specific surface area of 0.45 m 2 / g, and a density of 6 g / cm 3 .
  • the specific surface area of 45 m 2 / g of the particles P 7 obtained here is the specific surface area of a true spherical particle having a smooth surface with a particle size of 23 / zm (ie, a particle size of 23 ⁇ and a density of 6 g / g Specific surface area value obtained from cm 3 force 0. 04
  • the resulting particle R 1 is The specific surface area of a spherical particle having a particle diameter of 23 ⁇ , a specific surface area of 0.506 m 2 / g, a density of 6 g / cm 3 and a particle diameter of 2 3 ⁇ ((ie, a particle diameter of 23 ⁇ When compared with a specific surface area of 0.403 m 2 / g) obtained from a density of 6 g / cm 3 force, it is possible to obtain a value of a specific surface area that is 1.3 times larger.
  • FIG. 3 (a) is a photograph of the whole particle, and FIG. 3 (b) is a magnified image of the surface of the particle).
  • Example 1 is the same as Example 1 except that porous zirconia having internal through holes is used as the raw material particles, and the acid treatment step is not performed.
  • the obtained particle R 2 has a particle size of 25 // m, a specific surface area of 17. Om 2 Zg, a density of 6 g / cm 3 and a spherical particle with a particle size of 25 / z m and a smooth surface.
  • the specific surface area is 425 times as large as that of the specific surface area (i.e., the specific surface area value of 0.040 m 2 / g obtained from the particle size 25 / m and the density 6 gZcm 3 ).
  • FIG. 3 An electron microscopic photograph of the particles in Comparative Example 2 is shown in FIG. 3 (FIG. 6 (a) is a photograph of the whole particles, and FIG. 6 (b) is an enlarged surface photograph of the particles).
  • FIGS. 4 (a) and 4 (b) show particle cross sections in the vicinity of the surface of the raw material particles pi (that is, particles before being subjected to the sulfuric acid treatment) in Example 1.
  • FIG. Figure 5 shows particle cross sections in the vicinity of the surface of the raw material particles pi (that is, particles before being subjected to the sulfuric acid treatment) in Example 1.
  • FIGs. 6 (a) and 6 (b) show cross-sectional views of the porous zirconia particle near the surface.
  • “black portions existing in a wave-like manner” represent the through holes of the particles, and the particles are porous.
  • Figs. 4 (a) and 4 (b) in which the raw material particle of Example 1 was photographed there is no such "black portion existing in a wavering manner", and the particle body You can understand that you do not have it.
  • FIGS. 7-10 The graph which showed the relationship between pore radius and integral pore product is shown to FIGS. 7-10.
  • Figures 7 and 8 show the relationship between "pores” and "the integrated pore volume obtained by integrating the pore volume with a pore radius of 100 nm or less from the 100 nm side”.
  • 9 and 10 show the relationship between “pore radius” and “volume occupied by each pore radius”. These two species mean substantially the same thing. It can be seen that the particles of Examples 1 and 4 have a large cumulative pore volume as compared with the particles of Comparative Example 1.
  • Comparative Example 2 it is understood from FIG. 8 that the cumulative pore volume is rapidly increased when the pore radius is 20 nm or less, and that the number of pores of 20 nm or less is extremely large. It also shows that the pore distribution is narrow.
  • the particle R 2 had a specific surface area much larger than that of Example 1, the absorbance was less than half. This is because "the substance or functional group to which the target substance can be bound” is because the cumulative pore volume with a pore radius of 20 nm or more per unit area is approximately 1/8 compared to 1 in 2 It is considered that the pore could not be used effectively.
  • a confirmation test was conducted on the "nonspecific adsorption inhibitory effect" of the particles of the present invention. Specifically, in order to confirm that the “roughened particles of the present invention” have a greater effect of suppressing nonspecific adsorption than “the porous particles having internal through holes”.
  • the “specific binding ability” and “non-specific binding ability” of each particle were prepared using “roughened particles (Example 1)” and “porous particles having internal through holes (Comparative example 2)”. evaluated.
  • the term “specific binding ability” refers to the binding ability of "specific binding” in which the target substance binds to the particle, while “nonspecific binding” means that particles other than the target substance bind to the particle itself. It refers to the binding ability of "nonspecific binding”.
  • each 0.5 mg of the epoxy particles S 1 and T 2 was collected in an Epppen tube, and Sulforhod ami nel O 1 was added to Lubriescence Reierence S tandar ds 0 .
  • Table 3 shows the ratio of the "nonspecific binding” binding amount to the "specific binding” binding amount, that is, the "nonspecific binding Z specific binding ratio”. If the “nonspecific binding ratio of Z specific binding” is smaller, the amount of nonspecific binding will be relatively smaller than the amount of specific binding, suggesting that the effect of nonspecific binding is smaller, If the “nonspecific binding Z specific binding ratio” is larger, the nonspecific binding amount is relatively larger than the specific binding amount, which suggests that the effect of nonspecific binding is greater.
  • the “non-specific binding Z specific binding ratio” is 0.10, while in the porous particle T 2 having internal through holes, “non-specific binding / The ratio of specific binding is 0.32, and it can be confirmed that the roughened particle S 1 is a particle in which the nonspecific binding effect is more suppressed than the porous particle T 2.
  • the particles of the present invention can be used for quantification, separation, purification, analysis and the like of target substances such as cells, proteins, nucleic acids or chemical substances.
  • the particles of the present invention can be bound to nucleic acids such as DNA, and as a result, they can be used for analysis of DNA, which also contributes to the use of therapeutic technology.

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Abstract

　本発明の粒子は、標的物質が結合できる粒子であって、粒子本体表面が粗面化されている高密度粒子である。本発明の粒子は、標的物質を結合させることが可能な物質または官能基が粒子本体表面に固定化されており、粒子の比表面積が、かかる粒子と同一の粒径および密度を有する真球粒子の比表面積の１．４～１００倍となっていることを特徴とする。特に本発明の粒子では、単位表面積［ｃｍ２］あたりの細孔半径２０ｎｍ以上の積算細孔体積［ｃｍ３］の割合が１×１０－６［ｃｍ３／ｃｍ２］以上となっている。

Description

粗面化処理が施された高密度機能性粒子、 その製造方法およびそれを用レ、た標的 物質の処理方法
技術分野
[ 0 0 0 1 ]
本発明は、 標的物質の分離、 固定化、 分析、 抽出、 精製または反応などに適し た比表面積を有する粗面化された機能性粒子に関する。 また、 本発明は、 かかる 粒子の製造方法、 および、 それを用いて標的物質を処理する方法にも関する。
背景技術
[ 0 0 0 2 ]
細胞、 蛋白質、 核酸または化学物質等の標的物質の定量、 分離、 精製または分 析等の生化学用途に利用される機能材として、 特定の標的物質と特異的に結合ま たは反応する複合粒子が従来より知られている （特表平 4— 5 0 1 9 5 6号公報 参照） 。 力、かる複合粒子は、 磁性を帯びており、 例えば非磁性のビーズ中に磁性 体材料を含ませることによって形成される。 標的物質の分離に際しては、 まず、 標的物質が含まれる試料中に複合粒子を供し、 複合粒子の表面に標的物質を結合 させる。 次いで、 磁場の印加により複合粒子を移動させて集合'凝集させ、 その 後、 集合 '凝集した複合粒子を回収することによって、 複合粒子に結合した標的 物質を回収している。 このような磁場または磁気を用いた手法 （以下では 「磁気 分離法」 または単に 「磁気分離」 とも呼ぶ） は、 遠心分離法、 カラム分離法また は電気泳動法などの手法に比べて、 少量の試料に対しても実施でき、 また、 標的 物質を変性させずに短時間で実施できる特徴を有している。 しかしながら、 用い る複合粒子の密度が 1 . O g / c m3〜3 . 4 g / c m3 と小さいので、 効率的 に凝集させる点では複合粒子は決して好ましいものではなかった。 このように複 合粒子の密度が比較的小さい理由は、 密度の低い樹脂やシリカを母材とし、 その 内部に磁性粉材料を分散させて複合粒子化しているからである。 つまり、 複合粒 子の密度は磁性粉材料の量に依存することになるところ、 磁化量から計算すると 磁性粉材料の含率は高々 2 0重量％程度にすぎず、 複合粒子の密度は母材の低い 材料密度に近い値となっている。
[ 0 0 0 3 ]
ここで、 標的物質は粒子の表面に結合することになるので、 1粒子当たりに結 合できる標的物質の量は、 粒子の比表面積に依存しているといえる。 つまり、 粒 子の比表面積が小さいと、 1粒子当たりに結合できる標的物質の量が減少するこ とになる。 1粒子当たりに結合できる標的物質の量が減少すると、 標的物質の検 出に際して、 検出量が全体的に低下し、 結果的に検出感度が低下してしまう。 こ のように、 粒子の比表面積はある程度大きいことが好ましい。 しかしながら、 一 概には粒子の比表面積が大きければ良いという訳ではなく、 粒子が三次元内部貫 通ネットワーク （即ち、 貫通孔） を持つものや、 深い孔を持つものでは、 標的物 質が孔に入らなかったり、 入っても必要な反応等が進まなかったり、 あるいは標 的物質以外の物質が粒子孔に入って外に出難くなるといつた見掛け上の非特異結 合が大きくなる可能性がある。 つまり、 粒子の比表面積が必要以上に大きくなり すぎると、 標的物質が孔に入れず大きな比表面積を有効利用できない、 もしくは 標的物質以外の物質が粒子に結合する 「非特異結合」 の影響が大きくなり得るた めに好ましくないといえる。 例えば、 特表平 9— 5 0 3 9 8 9には、 密度の大き ぃジルコニァ粒子を使用している例が記載されているものの、 特表平 9一 5 0 3
9 8 9のジルコニァ粒子は、 三次元内部貫通ネットワーク （即ち、 貫通孔） を持 つものであり、 比表面積が極めて大きいので標的物質の分離に際して非特異結合 が必要以上に生じやすくなつている。 即ち、 特表平 9一 5 0 3 9 8 9に記載され ているような貫通孔を有するジルコニァ粒子では、 標的物質以外の物質が粒子に より結合しゃすく、 所望の標的物質をより優先的に粒子に結合させて分離するこ とが困難となっている。 また、 特表平 9一 5 0 3 9 8 9号公報のジルコニァ粒子 では、 貫通孔ゃ深い孔に入った標的物質が外に出難いといった見掛け上の非特異 結合も大きくなつている。 [0004]
ちなみに付言しておくと、 特表平 9一 503989では 「粒子の気孔サイズが、 リガンドとしてまたは被吸着剤としてタンパクを収容するに十分なサイズであ る J こと及び 「気孔サイズ」 についての記載はあるものの、 どの程度の気孔サイ ズ （細孔半径） がどの程度 (積算細孔径体積）あればよいかという記載はない。
発明の概要
[0005]
本発明は、 上記事情に鑑みて為されたものである。 つまり、 本発明の課題は、 粒子の移動 '凝集の点で標的物質の分離に好ましく、 力、つ、 非特異結合がある程 度抑えられた範囲において 1粒子当たりに結合できる標的物質の量が多い粒子を 提供することである。 また、 かかる粒子の製造方法、 および、 かかる粒子を用い た標的物質の分析、 抽出、 精製または反応等の処理を行う方法を提供することも 本発明の課題である。
[0006]
上記課題を解決するため、 本発明は、
「標的物質を結合させることが可能な物質または官能基」 が粒子本体の表面に 固定化されており、 かつ、
粒子本体の表面が粗面化されており、 粒子の比表面積が、 かかる粒子と同一の 粒径および密度を有する真球粒子の滑らかな表面の比表面積の 1. ：〜 100倍 となっていることを特徴とする "標的物質結合可能粒子" を提供する。 本明細書 にいう 「粗面化」 とは、 粒子表面 （より具体的には 「粒子本体の表面」 ） の表面 積を增カ卩させる処理のことを実質的に意味している。
[0007]
より好ましくは、 粗面化に起因して、 粒子の単位表面積 [cm2 ] あたりの細 孔半径 20 n m以上の積算細孔体積 [cm3 ] の割合が 1 X 10— 6 [cm3ノ cm2 ] 以上となっている。 本明細書にいう 「細孔」 とは、 粒子の空隙部 （より 好ましくは粒子表面近傍に存在する空隙部） を実質的に意味しており、 その中で も 1 0 0 n m〜： L 0 ;z mのマクロ孔と、 1 n m〜： L 0 0 n mのメソ孔の孔径 （サ ィズ） を有する孔を想定しており、 特に 1 η π！〜 1 0 0 n mのメソ孔を想定して いる （尚、 このようなマク口孔とメソ孔とはいわゆる水銀圧入法で同時に測定で きるものである） 。
[ 0 0 0 8 ]
本発明の粒子は、 その表面に 「標的物質を結合させることが可能な物質または 官能基」 が固定化されている。 換言すれば、 「標的物質と結合する物質または官 能基」 が固定化されている。 従って、 標的物質と粒子とを共存させると、 標的物 質が粒子に結合することができるので、 標的物質の分離、 精製または抽出などの 種々の用途に対して本発明の粒子を用いることができるだけでなく、 テーラーメ 一ド医療技術の用途に対しても本発明の粒子を好適に用いることができる。 ここ で、 「標的物質」 とは、 分離のみならず、 抽出、 定量、 精製または分析などの 種々の対象になり得る物質を実質的に意味しており、 粒子に直接的または間接的 に結合できるものであれば、 いずれの種類の物質であってもかまわない。 具体的 な標的物質として、 例えば、 核酸、 蛋白質 （例えばアビジンおよびビォチン化 H R Pなども含む） 、 糖、 脂質、 ペプチド、 細胞、 真菌、 細菌、 酵母、 ウィルス、 糖脂質、 糖蛋白質、 錯体、 無機物、 ベクター、 低分子化合物、 高分子化合物、 抗 体または抗原等を挙げることができる。 本発明の粒子は、 このように種々の標的 物質の分離、 精製、 抽出もしくは分析に用いることができる点で、 種々の機能を 奏するものといえる。 従って、 本発明の粒子は 「機能性粒子」 と呼ぶことができ るものである。
[ 0 0 0 9 ]
本発明の粒子は、 粗面化処理されていることを特徴としている。 具体的には、 粒子本体の表面が粗面ィ匕されており、 粒子の比表面積が、 力かる粒子と同一粒径 および同一密度を有する真球粒子 （滑らかな表面を有する真球粒子） の比表面積 の 1 . 4〜： L 0 0倍となっており、 かつ、 好ましくは本発明の粒子又は粒子本体 の単位表面積 [ c m2 ] あたりの細孔半径 2 0 n m以上の積算細孔体積 [ c m 3 ] の割合が I X 1 0— 6 [ c m3 Z c m2 ] 以上となっている。 ここで、 本明 細書にいう 「真球粒子」 とは、 幾何学的な球面形状が真球となった粒子のことを 実質的に意味している。 「真球」 とは、 中心を通る球直径が実質的に全て同一と なっている球のことである。 特に、 「同一の粒径を有する真球粒子」 とは、 粒子 表面が全体的に滑らかな又は平滑になっており、 本発明の粒子の粒径と同一の粒 径を有している真球粒子のことを実質的に意味している。 ここで、 本発明の粒子 の粒子表面は、 粗面化に起因して凹凸形状を有し得るので、 「本発明の粒子の粒 径 J としては、 実質的には、 粒子 （粒子本体にポリマーを被着させる場合には、 被着しているポリマーの厚さをも含めた粒子） の電子顕微鏡写真または光学顕微 鏡写真に基づいて、 ピクセル個数等から求めた粒子の面積と等しい面積を有する 真円の直径を用いる。 ただし比表面積は多数個の粒子の平均値として通常求めら れるため、 上記のように写真に基づいて例えば 3 0 0個の粒子の粒径を測定し、 その数平均として算出した平均粒径を用いるのが適している場合が多い。 以上の ような写真からの （平均） 粒径の測定には、 画像処理ソフトウェア （例えば
Γ Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Inc.製） 」 ） 等を用いることができる。 以上を鑑みて纏めると、 本明細書における 「本発明の粒子と同一の粒径および密 度を有する真球粒子の比表面積」 とは、 本発明の粒子写真の面積と同一面積の真 円の直径の平均値 Lに相当する直径 Dを有する真球 （かかる真球の密度は本発明 の粒子の密度と同一） の比表面積のことを実質的に意味している。
[ 0 0 1 0 ]
本発明の粒子は、 粗面化処理に起因して比表面積が増加しているだけでなく、 好ましくは粒子表面に所望サイズの細孔がある一定量以上存在していることも特 徴としている。 より具体的には、 「標的物質を結合させることが可能な物質また は官能基」 および 「標的物質」 のサイズよりも大きい細孔がある一定量以上存在 していることを特徴としている。 従って、 本発明の粒子では 「標的物質を結合さ せることが可能な物質または官能基」 がより多く固定化されているだけでなく、 本発明の粒子の使用時において標的物質が 「標的物質を結合させることが可能な 物質または官能基」 により多く結合できるようになつている。 後者の場合につい て詳述する。 粒子使用時では、 標的物質は、 粒子本体に固定化されている 「標的 物質を結合させることが可能な物質または官能基」 に結合するが、 細孔内部に固 定化されている 「標的物質を結合させることが可能な物質または官能基」 に対し ては、 標的物質が細孔内に入り込んでから結合することになる。 つまり、 サイズ の大きい標的物質はより小さい細孔の内部には入り込むことができず、 細孔内部 に存在する 「標的物質を結合させることが可能な物質または官能基」 に結合でき ないといえる。 この点、 本発明の粒子は、 「標的物質を結合させることが可能な 物質または官能基」 に対してのみならず 「標的物質」 に対してもサイズのより大 き ヽ細孔がある一定量以上存在しているので、 粒子使用時における標的物質の結 合量がより増加するという効果が奏される。
[00 1 1]
本発明の粒子では、 粗面ィヒ処理に用いられた酸性物質に由来する化合物 （具体 的には 「金属元素と酸性化合物とを含んで成る化合物」 ） が粒子本体表面に実質 的には付着または残存していないことも特徴としている。 即ち、 塩酸、 硫酸およ ぴ硝酸から成る群から選択される少なくとも 1種類以上の酸性物質に由来する塩 酸化合物、 硫酸化合物および Zまたは硝酸ィ匕合物等が粒子本体表面には実質的に 付着または残存していない。
[00 1 2]
更に、 本発明の粒子は、 好ましくは密度が 3. 5 g/cm3 ~9 gZcm3で あり、 標的物質の分離に一般的に用いられる粒子よりも密度 （または比重） が大 きいという特徴を有している。
[00 1 3]
本発明の粒子は、 粒子本体に貫通孔を有していてもよいし、 あるいは、 貫通孔 を有していなくてもよい。 ここで 「粒子本体が貫通孔を有していない」 とは、 粒 子本体が実質的に中実であり、 粒子が内部貫通ネットワーク構造を有さないこと を意味している。 即ち、 本明細書にいう 「粒子本体が貫通孔を有していない」 と は、 「粒子本体または粒子本体コア部が中実である」 、 「粒子表面が凹凸状にな つていても、 凹部力粒子内部にまで存在しない」 、 及び 「一般的な多孔質粒子と 比べた場合、 力 さ密度がより大きいこと」 と同義である。 粒子本体に貫通孔を有 していない場合、 後述する 「非特異吸着の低減効果」 がより顕著に期待できる。
[00 14]
また、 本発明では、 上述の粒子の製造方法も提供される。 かかる製造方法は、 標的物質が結合できる粒子を製造する方法であって、
(I) 原料粒子と、 塩酸、 硫酸および硝酸から成る群から選択される少なくと も 1種以上の酸性物質 （リン酸を除く） とを接触させる工程、 および
(I I) 「標的物質と結合することが可能な物質または官能基」 を原料粒子に 固定化する工程を含んで成る。
[0015]
本発明の製造方法は、 工程 （I) において、 原料粒子の表面を粗面化し、 得ら れる粒子と同一の粒径および密度を有する真球粒子の比表面積の 1. 4〜 100 倍となるように粗面化することを特徴としている。 より好ましい態様では、 粒子 または粒子本体の単位表面積 [cm2 ] あたりの細孔半径 20n m以上の積算細 孔体積 [cm3 ] の割合が 1 X 10— 6 [cm3 /cm2 ] 以上となるように粗 面化する。 更に好ましい態様では、 原料粒子に貫通孔が形成されないように粗面 化し、 これにより、 内部貫通孔を有さない粒子を最終的に得る。 また、 本発明の 製造方法では、 標的物質の分離に一般的に用いられる粒子の場合よりも密度 （ま たは比重） の大きい粒子を得るべく、 密度が 3. 5 g/cm3 ~9. 0 g/cm 3 の原料粒子を粗面化する こ と が好ま しい。 尚、 本発明の製造 方法は、 工程 （I) の後 （必要に応じて洗浄を行った後） において、 粗面化処理 に用いた酸性物質に由来する化合物 （特に 「金属元素と酸性化合物とを含んで成 る化合物」 ) が粒子本体表面に実質的に付着または残存していないことも特徴と している。 即ち、 塩酸、 硫酸おょぴ硝酸から成る群から選択される少なくとも 1 種類以上の酸性物質に由来する塩酸化合物、 硫酸化合物おょぴ Zまたは硝酸化合 物等が粒子本体表面には実質的に付着または残存しないという特徴も有している。
[0016]
更に、 本発明では、 上述の粒子を用いた標的物質の分離方法も提供される。 か かる分離方法は、 上述した 「表面が粗面化処理されたことを特徴とする本発明の 粒子」 を用いて、 試料中から標的物質を分離する方法であり、 以下に示す工程を 含んで成る：
( i ) 標的物質を含んで成る試料と本発明の粒子とを接触させ、 粒子と標的物質 とを結合させる工程； ( i i ) 試料を静置に付して、 試料中で粒子を自然沈降させる工程；および ( i i i ) 試料中で沈殿した粒子を回収することによって、 標的物質を試料から 分離する又は標的物質が固定化された粒子を得る工程。
[00 1 7]
本 §明の方法は、 標的物質が結合した粒子を自然沈降によって集合 ·凝集させ るという特徴を有している。 即ち、 本発明の方法は、 粒子の移動 '凝集に磁場ま たは磁気を用いておらず、 粒子の自然沈降で標的物質を分離する特徴を有してい る。 このように、 粒子の自然沈降で標的物質を分離できるのは、 粒子の自然沈降 速度が従来よりも速くなっているからである。
[00 1 8]
また、 本発明の方法で用いられる粒子は、 粗面化処理が施され、 それによつて 粒子表面に 「標的物質を結合させることが可能な物質または官能基」 がより多く 固定化された粒子である。 従って、 本発明の方法は、 1粒子あたりに結合できる 標的物質の量が大きく、 1回の操作で 「標的物質を試料からより多く分離でき る」 又は 「より多くの標的物質が固定化された粒子を得ることができる」 という 特徴も有している。
[00 1 9]
本発明の粒子は、 好ましくは密度が 3. 5 g/cm3 ~9 g/cm3 と大きく、 遠心分離法および磁気分離法を用いなくても、 粒子の自然沈降による移動速度だ けで十分な分離速度が得られる効果を有している。 本明細書において 「自然沈 降」 とは、 重力の作用を受けて粒子が液体中を沈降することを指している。 また、 本明細書において 「分離」 とは、 核酸、 蛋白質、 糖、 脂質、 ペプチド、 細胞、 真 菌、 細菌、 酵母、 ウィルス、 糖脂質、 糖蛋白質、 錯体、 無機物、 ベクター、 低分 子化合物、 高分子化合物、 抗体または抗原等の標的物質を含んだ試料 （例えば、 ヒト又は動物の尿、 血液、 血清、 血漿、 精液、 唾液、 汗、 涙、 fl复水、 羊水等の体 液；ヒト又は動物の臓器、 毛髪、 皮膚、 粘膜、 爪、 骨、 筋肉又は神経組織等の懸 濁液、 抽出液、 溶解液又は破碎液；便懸濁液、 抽出液、 溶解液又は破碎液；培養 細胞又は培養組織の懸濁液、 抽出液、 溶解液又は破碎液；ウィルスの懸濁液、 抽 出液、 溶解液又は破砕液；菌体の懸濁液、 抽出液、 溶解液又は破砕液；土壌懸濁 液、 抽出液、 溶解液又は破砕液；植物の懸濁液、 抽出液、 溶解液又は破砕液；食 品 -加工食品懸濁液、 抽出液、 溶解液又は破砕液；排水等） カゝら標的物質を分離 することを指しており、 より具体的には、 試料中に含まれる標的物質を粒子に結 合させた後、 標的物質が結合した粒子を移動させることによって標的物質を試料 力 ら選別することを実質的に意味している。 そして、 「分離速度」 とは、 標的物 質が結合した粒子が試料中を移動する速度を実質的に指しており、 自然沈降に対 して用いる場合では粒子の沈降速度を実質的に意味している。 分離速度が大きい 場合では、 試料から標的物質を分離するのに要する時間が短くて済むことになる。 なお、 本発明の粒子が磁性を有する場合には、 磁場の印加によって、 分離速度を 付加的に大きくできることを理解されよう。
[ 0 0 2 0 ]
本発明の粒子は、 自然沈降させるだけでも十分な分離速度を得ることができる ので、 本発明の粒子を用いると、 複雑な機構を用いずに標的物質の分離、 固定化、 分析、 抽出、 精製または反応などの処理を行うことができる。 換言すれば、 本発 明の粒子を用いると、 標的物質の分離、 固定化、 分析、 抽出、 精製または反応を 行う簡易なシステムが得られることになる。 尚、 本発明の粒子は、 そのようなシ ステムの小型化またはチップ化にとっても有効である。
[ 0 0 2 1 ]
ここで、 本発明の粒子は粗面化処理が施され、 増加した粒子表面に 「標的物質 を結合させることが可能な物質または官能基」 がより多く固定化された粒子であ るので、 1粒子あたりに結合できる標的物質の量が多くなつている。 その結果、 効率よく標的物質の精製や分離を行うことができる。 換言すれば、 同じ操作を行 つても、 全体の検出量が増大することになり、 検出感度の向上、 簡便な測定また は測定誤差の縮小といった有利な効果が奏されることになる。 尚、 粗面化によつ て比表面積が増加しているものの、 粗面化に起因して増加した粒子表面に 「標的 物質を結合させることが可能な物質または官能基」 が固定ィヒされている。 そのた め、 比表面積の増加に伴う非特異結合の増加以上に、 「標的物質を結合させるこ とが可能な物寳または官能基」 がより多く固定化されていることになるので、 比 表面積の増加に伴う 「非特異結合」 が抑えられることとなる。 特に、 本発明の粒 子では、 単位表面積 [ c m2 ] において細孔半径 2 0 n m以上の積算細孔体積
[ c m3 ] の割合が 1 X 1 0— 6 [ c m3 Z c m2 ] 以上となっており、 「標的 物質を結合させることが可能な物質または官能基」 および 「標的物質」 のサイズ よりも大きい細孔がある一定量以上存在している。 その結果、 本発明の粒子では 「標的物質を結合させることが可能な物質または官能基」 がより多く粒子本体に 固定化できているだけでなく、 使用時 （分離、 固定化、 分析、 抽出、 精製または 反応などの処理） において 「標的物質を結合させることが可能な物質または官能 基」 に標的物質がより多く結合できるようになっている。 別の見方をすれば、 「標的物質を結合させることが可能な物質または官能基」 の固定化や 「標的物 質」 の結合に寄与せず、 非特異結合の増加につながる 「サイズがより小さい細孔
(より具体的には細孔半径が 2 0 n m未満の細孔） 」 がより少なくなつているの で、 本発明の粒子では、 非特異結合がある程度抑えられつつも 1粒子当たりに結 合できる標的物質の量が多くなっているといえる。
[ 0 0 2 2 ]
ちなみに、 本発明の粒子の本体表面にはポリマーが被着していてもよい。 この 場合、 被着しているポリマー （以下では 「被着ポリマー」 ともいう） の表面に
「標的物質を結合させることが可能な物質または官能基」 を固定化させることが できる。 これによつて、 「標的物質を結合させることが可能な物質または官能 基」 を粒子本体に共有結合させることが困難な場合であっても、 「標的物質を結 合させることが可能な物質または官能基」 を粒子表面に固定化できる。 また、 粒 子本体表面に固定化された 「標的物質を結合させることが可能な物質または官能 基」 力 種々の使用条件下の用途において粒子本体表面から分離してしまうこと が懸念される用途では、 「標的物質を結合させることが可能な物質または官能 基」 を被着ポリマーに固定化させることによって粒子本体からの分離を防止する ことができる。 また、 被着させるポリマーとして、 各種分子または金属イオン等 が透過しにくいポリマーを選択すると、 粒子本体表面または粒子内部からの金属 イオン （即ち、 粒子の構成成分たる金属のイオン） の溶出をある程度抑えること ができ、 粒子の種々の用途において金属ィォン等に起因した不要な反応を抑える こともできる。 図面の簡単な説明
[0023]
図 1 (a) は、 本発明の処理方法の工程を模式的に示した図である。
図 1 (b) は、 本発明の処理方法の工程を模式的に示した図である。
図 1 (c) は、 本発明の処理方法の工程を模式的に示した図である。
図 2は、 実施例 1における粒子 p 1の写真である。 特に、 図 2 (a) は粒子全 体写真であり、 図 2 (b) は表面拡大写真である。
図 3は、 比較例 1における粒子の写真である。 特に、 図 3 (a) は粒子全体写 真であり、 図 3 (b) は表面拡大写真である。
図 4 (a) は、 実施例 1における原料粒子 p 1の表面付近の粒子断面図である。 図 4 (b) は、 図 4 (a) の粒子表面付近を拡大した図である。
図 5 (a) は、 実施例 1で硫酸処理に付された後の粒子の表面付近の粒子断面 図である。
図 5 (b) は、 図 5 (a) の粒子表面付近を拡大した図である。
図 6 (a) は、 多孔質ジルコユア粒子の表面付近の粒子断面図である。
図 6 (b) は、 図 6 (a) の粒子表面付近を拡大した図である。
図 7は、 粒子の細孔半径と 「100 nm以下の細孔半径の細孔体積を 100 n m側から積算した積算細孔体積」 との関係を示したグラフである (実施例 1、 4 および比較例 1、 2) 。
図 8は、 図 7の一部 （点線による包囲部分） を拡大したグラフである。
図 9は、 粒子の細孔半径と各細孔半径が占める体積との関係を示したグラフで ある （実施例 1および比較例 1) 。
図 10は、 粒子の細孔半径と各細孔半径が占める体積との関係を示したグラフ である （実施例 4および比較例 2) 。 尚、 図面中、 参照番号は次の要素を意味する：
1…本発明の粒子、 2…標的物質、 3…標的物質以外の物質、 4…試料。 発明を実施するための最良の形態
[0024]
以下では、 まず、 本発明の粒子について詳細に説明し、 その後、 本発明の粒子 の製造方法および本発明の分離方法について説明する。
[0025]
本発明の粒子は、 標的物質の分離に好適な密度を有している。 即ち、 ヒト又は 動物の尿、 血液、 血清、 血漿、 精液、 唾液、 汗、 涙、 腹水、 羊水等の体液； ヒト 又は動物の臓器、 毛髪、 皮膚、 粘膜、 爪、 骨、 筋肉又は神経組織等の懸濁液、 抽 出液、 溶解液又は破砕液；便懸濁液、 抽出液、 溶解液又は破砕液；培養細胞又は 培養組織の懸濁液、 抽出液、 溶解液又は破砕液； ウィルスの懸濁液、 抽出液、 溶 解液又は破碎液；菌体の懸濁液、 抽出液、 溶解液又は破碎液；土壌懸濁液、 抽出 液、 溶解液又は破砕液；植物の懸濁液、 抽出液、 溶解液又は破砕液；食品■加工 食品懸濁液、 抽出液、 溶解液又は破砕液；排水等の試料に粒子を分散させた際に 粒子の沈降速度が比較的大きくなるような密度を粒子は有している。 粒子の密度 が 3. 5 g/cm3 よりも小さくなると、 自然沈降のみによる粒子の移動速度が 実用上好ましくない一方、 粒子の密度が 9 gZcm3 よりも大きくなると、 標的 物質を結合させる際に行う攪拌にとって好ましくない。 従って、 本発明の粒子の 密度は、 3. 5 gZcm3〜9 g/cm3であり、 より好ましくは 5. 0 g/c m3 ~9. 0 g/cm3であり、 更に好ましくは、 5. 5 g/c m3 ~7. 0 g
/cm3である。 尚、 場合によっては、 本発明の粒子の密度が 9, 0 g/cm3 より大きくてもよい場合、 より具体的には、 9. 0 g/cm3 (9. 0 g/cm 3 を除く） 〜23 gZcm3 の場合もあり得る。 ここで、 本明細書にいう 「密度」 とは、 物質自身が占める体積だけを密度算定用の体積とする真密度を意 味しており、 真密度測定装置ウルトラピクノメーター 1000 (ュアサアイォニ クス社製） を使用することによって求めることができる値である。
[0026]
本発明の粒子は、 粒子本体の表面が粗面化されており、 粒子の比表面積が、 か 力る粒子と同一の粒径および密度を有する真球粒子の平滑表面の比表面積の 1. 4倍〜 100倍となっている。 これは、 粒径 aを有する本宪明の粒子の各々の比 表面積が、 粒径 aを有する真球粒子 （本発明と同一の密度を有する真球粒子） の 比表面積の 1. 4倍〜 100倍となっていることを意味している力、 あるいは、 平均粒径 aを有する本発明の粒子 （即ち、 複数個の粒子から成る粉末状の粒子 群） の比表面積の平均値が、 粒径 aを有する真球粒子 （本発明と同一の密度を有 する真球粒子） の比表面積の 1. 4倍〜 100倍となっていることを意味してい る。 本発明の製造方法にて後述するように、 本発明の粒子の粒子本体表面は、 塩 酸、 硫酸おょぴ硝酸から成る群から選択される少なくとも 1種以上の酸性物質 (リン酸を除く） を用いて処理することによって粗面化されている点で特徴を有 している。 より具体的には、 本発明の粒子は、 原料粒子 （または前駆体粒子） と 上記酸性物質とを接触させることによって、 粗面化が施された粒子であることが 好ましい。 このような粗面化処理が施されているので、 本発明の粒子の比表面積 は、 力かる粒子と同一の粒径および密度を有する真球粒子の比表面積の 1. 4〜 100倍となっている。 つまり、 本発明の粒子の比表面積の値を S P粒子 （m2 /g) とし、 力かる粒子と同一の粒径および密度を有する真球粒子の比表面積の 値を S P真球 （m2 Zg) とすると、 SP粒子 = 1. 4XSP真球〜 100 XS P真球となっている。 ここで、 3?粒子< 1. 4 XSP真球となると、 1粒子 あたりに結合できる標的物質の量が減少し、 標的物質の全体的な検出量が減少し てしまう一方、 S P粒子 > 100 X S P真球となると、 標的物質以外の物質が 粒子本体に結合する 「非特異結合」 が必要以上に増加し得るだけでなく、 粒子本 体の構造が脆くなつてしまい実用上好ましくない。 尚、 好ましくは SP粒子 =1. 5 X S P真球〜 80 X S P真球であり、 より好ましくは S P粒子 = 1. 6 X S P真球〜 60 X S P真球である。 粗面化処理の条件および原料粒子の材質など の各種製造条件によっては、 S P粒子- 1 · 4 X S P真球〜 500 X S P真球 となり得る場合もある。
[0027]
本明細書にいう 「比表面積」 は、 比表面積細孔分布測定装置 B e 1 s o r P- m i n i (日本ベル社製） を使用することによつて求めた比表面積のことを指し ている。 また、 本明細書にいう 「粒径」 、 もしくは、 「本 明の粒子と同一の粒 径および密度を有する真球」 における 「粒径」 とは、 粒子 （粒子本体にポリマー を被着させる場合には、 被着しているポリマーの厚さをも含めた粒子） の写真の 面積と同一面積の真円の直径を実質的に意味しており、 「平均粒径」 とは、 粒子 の電子顕微鏡写真または光学顕微鏡写真に基づいて例えば 3 0 0個の粒子の粒径 を測定し、 その数平均として算出した粒径を実質的に意味している。
[ 0 0 2 8 ]
本発明の粒子は、 上述したように粒子本体の表面が粗面化されており、 特に、 単位表面積 [ c m2 ] あたりの細孔半径 2 0 n m以上の積算細孔体積 [ c m3 ] の割合が 1 X 1 0— 6 [ c m3 / c m2 ] 以上となっている。 「積算細孔体積」 は、 粗面化された粒子の細孔径分布が反映されているので、 本発明の粒子は、 細 孔半径 2 0 n m以上の細孔がある一定以上の割合で存在している。
[ 0 0 2 9 ]
本発明では、 所望サイズ （つまり細孔半径 2 0 n m以上） の細孔がある一定量 以上存在していることに意味がある。 これについて詳述する。 粒子の細孔サイズ が小さすぎる場合、 「標的物質を結合させることが可能な物質または官能基 J お よび 「標的物質」 が細孔内に入ることができず、 細孔に起因して増加した粒子表 面積が 「標的物質を結合させることが可能な物質または官能基」 の固定化に寄与 しないだけでなく、 粒子の使用時において標的物質が細孔内に入り込めず、 細孔 内部の 「標的物質を結合させることが可能な物質または官能基」 に結合できなく なってしまう。 これに対して、 粒子の細孔がある程度の大きさを有していると、 「標的物質を結合させることが可能な物質または官能基」 および 「標的物質」 が 細孔内に入ることができ、 細孔に起因して増加した粒子表面積が 「標的物質を結 合させることが可能な物質または官能基」 の固定化に有効に寄与するだけでなく、 粒子の使用時にて標的物質が細孔内部に入り込むことができ、 細孔内部の 「標的 物質を結合させることが可能な物質または官能基」 に結合できる。 換言すれば、 細孔サイズが 「標的物質を結合させることが可能な物質または官能基」 および 「標的物質」 よりも小さすぎると、 「粒子調製時における固定ィヒの観点」 および 「粒子使用時における標的物質の結合の観点」 からは比表面積が大きくても細孔 が実質的に存在していないのと同じとなる力 本発明の粒子では、 そのようなサ ィズの小さ 、細孔が減じられ、 「標的物質を結合させることが可能な物質または 官能基」 の固定化および 「標的物質」 の結合に寄与する望ましいサイズの細孔が より多くなつている。 このように、 本発明は、 全積算細孔体積ではなく、 あるサ ィズ以上の細孔の積算体積に主眼を置いて為されたものである点に留意されたい。
[0030]
ここで、 本発明では 「所望サイズの細孔が存在している割合」 を、 個々の粒径 サイズに依存しないように、 粒子または粒子本体の単位表面積あたりの割合とし て評価している。 具体的には、 「所望サイズを満たしている細孔の体積を足し合 わせた積算細孔体積」 が粒子 （粒子本体） の単位表面積あたりでどれくらいの値 となっているかで評価している。 このような 「単位表面積あたりの積算細孔体積 (所望サイズを満たす細孔の体積を足し合わせた積算体積） 」 は、 「粒子または 粒子本体 1 gを基準とした所定の細孔径以上の積算細孔体積 (cm3 /g) 」 を 「1 gを基準とした同一の粒径および密度を有する真球粒子の平滑表面の表面積 (cm2 /g) 」 で除することで算出できる。
[003 1]
ここで、 本発明の粒子では、 細孔半径が 20 nm以上の積算細孔体積がある一 定以上の割合となっている。 具体的には、 単位表面積 [cm2 ] における細孔半 径 20 n m以上の積算細孔体積 [cm3 ] の割合が 1 X 10— 6 [cm3 /cm 2 ] 以上となっている。 これにより、 " 「標的物質を結合させることが可能な物 質または官能基」 の固定化" および " 「標的物質を結合させることが可能な物質 または官能基」 への標的物質の結合" に対して粒子細孔をより効果的に利用でき るだけでなく、 非特異結合の影響を相対的に小さくできる。 また、 単位表面積 [cm2 ] における細孔半径 20 nm以上の積算細孔体積 [cm3 ] の割合が 1 X 10— 6 [cm3 /cm2 ] 以上の場合、 標的物質が細孔内部に一度取り込ま れた後に出ることができなくなるという、 詰まりによる見掛けの非特異吸着も減 らすことができる。 結果として、 全体の非特異吸着量が減るため、 実際に用いる 際に従来よりも容易に用いることができる。 換言すれば、 単位表面積 [cm2 ] における細孔半径 20 nm以上の積算細孔体積 [cm3 ] の割合が 1 X 1 0一 6 [cm3 /cm2 ] 未満では、 粒子調製時において 「標的物質を結合させること が可能な物質または官能基」 をより多く粒子本体に固定化させ難く、 また、 粒子 使用時において 「標的物質」 を粒子へと結合させ難いので、 結果的に非特異結合 の影響が相対的に大きくなってしまい、 その点で望ましくない。
[0032]
尚、 上記のような 「ある細孔半径以上の積算細孔体積」 とは別の観点である力 粒子の気孔率 （気孔の含有率） は、 90%以下であることが好ましい。 なぜなら、 粒子の気孔率が 90 %以下でないと、 粒子内の細孔が多くなりすぎて粒子強度が 低下し、 使用時に粒子が破損するなど実用上問題となり得るからである。 より好 ましくは、 粒子の気孔率は 0. 5 %〜 70 %程度である。
[0033]
本発明の粒子は、 粒子本体に貫通孔を有していても、 有していなくてもよいが、 非特異吸着の低減の観点からは貫通孔を有していない方が好ましい。 粒子本体が 貫通孔を有していない場合、 単位表面積 [cm2 ] において細孔半径 20 nm以 上の積算細孔体積 [cm3 ] の割合が 4. 6X 10— 4 [cm3 /cm2 ] 以下 程度であることが好ましい。 それゆえ、 上述の要件と併せて考えると、 本発明の 粒子では、 細孔半径 20 nm以上の積算細孔体積の割合が 1 X 10— 6〜 4. 6 X 10— 4 [cm3 Zcm2 ] であることが好ましいといえ、 より好ましくは 3 X 10一6〜 1. 5 X 10— 4 [cm3 Zcm2 ] 、 更に好ましくは 5X 10— 6〜6. 5 X 10— 5 [cm3 /cm2 ] (例えば、 6 X 10— 6〜 8X 10— 6 [cm3 /cm2 ] ) である。 このような場合、 非特異吸着の低減効果がより 顕著となることが期待される。
[0034]
貫通孔を有していない粒子を想定した場合、 本発明では、 好ましくは粒子本体 表面から約 2 mの深さまで粗面化されており、 より好ましくは粒子本体表面か ら約 1. 5/zmの深さまで粗面化されており、 更に好ましくは粒子本体表面から 約 1 /zmの深さまで粗面化されている。 ただし、 好ましくは粗面化されている割 合は粒子本体直径の 40 %を超えておらず、 より好ましくは 30 %を超えておら ず、 更に好ましくは 20%を超えていない。 尚、 「粒子本体表面からある深さま で粗面化されている」 とは、 「粒子本体表面からある深さまでに細孔が実質的に 存在する」 と同義であり、 先述の "真球粒子" を用いて表現すると 「真球粒子表 面からある深さまでが粗面化されている」 と同義である。 また、 上述の 「粗面ィ匕 されている割合 (%) 」 とは、 粒子中央を通る方向に沿って粒子全体を見た場合 の粗面化部分 （=細孔存在領域） の割合のことを実質的に意味している。
[0035]
ここで、 本明細書にいう 「積算細孔体積」 の値は、 8£丁法ぉょび13 法を用 いることによって得られた値を実質的に意味していることに留意されたい。 B E T法とは、 多分子層吸着モデノレに基づいた比表面積の測定法であって、 Langmuir の単分子層吸着理論を多分子層の吸着に拡張したものである。 力かる B ET法は、 粒子に気体 （例えば窒素ガス） を吸着させた際の吸着量を測定し、 これにより得 られる吸着等温線に以下で示される B ET式を適用して単分子層吸着量 Vmを求 め、 この値と吸着ガス分子の分子断面積とから粒子の比表面積を算出する手法で ある。 この BET法による比表面積の測定の詳細は、 J I S Z 8830 ： 20 01で規定されている。 一方、 DH法とは、 Dollimore - Heal法の略で、 細孔を円 筒形と仮定して吸着ガスの相対圧と吸着量の増分から細孔サイズの体積頻度分布 を求める解析法である。
[B ET式]
Figure imgf000018_0001
P：—定温度で吸着平衡状態にあるときの吸着 圧
V：吸着平衡圧 Pにおける吸着量
Po：飽和蒸気圧
Vm：単分子層吸着量、 気体分子が固定表面で単分子層を形成した時の吸着量
C ： BET定数 （吸鶴などに関するパラメータ一）
[0036]
より具体的には、 「積算細孔体積」 の値は、 比表面積細孔分布測定装置 B e 1 s o r pm i n i (日本ベル社製） を使用することによって、 粒子の等温吸着曲 線を相対圧力 （PZPQ ) を 0. 99まで測定し、 力かる等温吸着曲線に基づい て、 D H法によつて積算細孔体積を算出した値である。
[0037]
本発明の粒子の粒径または平均粒径は、 1 μ m〜 5 mmであることが好ましい。 粒径または平均粒径が 1 mよりも小さいと、 標的物質の分離に際して粒子の自 然沈降による移動速度を十分に大きくすることが難しくなる一方、 粒径または平 均粒径が 5 mmよりも大きいと、 標的物質との結合が生じる前に粒子が沈降して しまい、 標的物質を十分に分離できなくなる可能性があるからである。 より好ま しくは 1 μ〜 1 mmの粒径または平均粒径であり、 更に好ましくは 5 μ m〜 50 0 μ mの粒径または平均粒径であり、 最も好ましくは 10 μ m〜 100 mの粒 径または平均粒径である。 尚、 粒径または平均粒径が小さくなりすぎると、 急激 な酸化が生じやすく、 場合によっては粒子が発火する危険性があるが、 本宪明の ような比較的大きい粒径または平均粒径では、 急激な酸化が生じにくく、 粒子が 発火する危険性は低減されている。
[0038]
本発明の粒子は、 上述したように、 自然沈降させるだけでも十分な分離速度を 得ることができるものである。 つまり、 標的物質を含んだ試料中において粒子の 自然沈降速度は速くなっている。
[0039]
粒子本体の材質は、 本発明の粒子が、 上述のような密度および比表面積を有す ることになるのであれば、 特に限定されるものではない。 例えば密度が 3. 5 g /cmS S gZcm3の粒子の場合では、 好ましくは、 粒子本体が、 金属また は金属酸化物から形成されており、 例えば、 ジノレコ-ァ （酸化ジルコニウム、 ィ ットリウム添加酸化ジルコニウム） 、 酸化鉄、 アルミナ、 ニッケル、 コバルト、 鉄、 銅およびアルミニウムから成る群から選択される少なくとも 1種以上の材料 から形成されていることが好ましい。 また、 密度が 9. 0 g/cm3 (9. 0 g /cm3 を除く） 〜23 gZcm3の粒子の場合では、 例えば、 本発明の粒子の 粒子本体が、 Ag (銀） 、 Au (金） 、 P t (白金） 、 Pd (パラジウム） 、 W (タングステン） 、 Rh (ロジウム） 、 O s (オスミウム） 、 Re (レニウム） 、 I r (イリジウム） 、 Ru (ルテニウム） 、 Mo (モリブデン） 、 Hf (ハフ二 ゥム） および T a (タンタル） から成る群から選択される少なくとも 1種類以上 の遷移金属元素から形成されていることが好ましく、 あるいは、 P b (鉛） 、 B i (ビスマス） および T 1 (タリウム） 力 ら成る群から選択される少なくとも 1 種類以上の典型金属元素から形成されていることが好ましい。
[ 0 0 4 0 ]
本発明の粒子は、 磁性を帯びていることも有効である。 （以下、 磁性を帯びて いる本発明の粒子を 「磁性粒子」 とも呼ぶ） 。 なぜなら、 粒子の沈降に対して磁 気分離操作を補助的に行うことができるからである。 その結果、 粒子をより速く 移動させることができ、 標的物質 （より具体的には 「粒子に結合した標的物 質」 ） をより短時間で分離することが可能となる。 また、 磁気で粒子を特定の部 分に集めたり固定することにより、 ピベッティングゃデカンテーションを容易に 行うことができる。
[ 0 0 4 1 ]
尚、 粒子本体の表面に被着ポリマーを設ける場合では、 被着ポリマーに磁性を 付与することは通常難しいため、 粒子本体に磁性を帯びたものを使用することが 好ましい。
[ 0 0 4 2 ]
磁性粒子の本体の材質は、 粒子が磁性を帯びることになる限り、 特に限定され るものではない。 例えば、 磁性粒子の本体は、 遷移金属および鉄を含んで成るガ ーネット構造の酸化物、 フェライト、 マグネタイトならびに γ —酸化鉄から成る 群から選択される少なくとも 1種以上の鉄酸化物から形成されることが好ましい。 あるいは、 磁性粒子の本体が、 ニッケル、 コバルト、 鉄およびそれらの金属を含 んで成る合金から成る群から選択される少なくとも 1種以上の金属材料を含んで 成るものであってもよい。 ここで 「遷移金属および鉄を含んで成るガーネット構 造の酸化物」 とは、 一般的に Y I Gと呼称されるもので、 例えば、 Y 3 F e 5 Ο α 2 の組成式で表される化合物やこの化合物の Υの一部をビスマスで置換した Β i χ Υ 3 _ x F e 5 Ο α 2 ( 0 < Χ < 3 ) を挙げることができる。
[ 0 0 4 3 ]
別法にて、 磁性粒子は、 磁性を帯びていなレヽ粒子に磁性物質を被着または付着 させることによって形成してもよい。 磁性物質の被着または付着に際しては、 無 電解めつき法、 電気めつき法、 スパッタリング法、 真空蒸着法、 イオンプレーテ イング法または化学蒸着法などを用いることができる。 なお、 ここでいう 「磁十生 を帯ぴていない粒子」 とは、 例えば、 ジルコユア （酸ィ匕ジノレコニゥム、 イツトリ ゥム添加酸ィヒジルコニウム） またはアルミナ等から成る密度の高い粒子が挙げら れる。 また、 高密度の磁 1·生物質の比率を高くする場合には、 より密度の低い、 ァ ルミユウム、 シリカ、 樹脂等から成る粒子も使用できる。 被着または付着に用い る 「磁性物質」 としては、 上述の磁性を有する粒子の材質と同様、 フェライト、 マグネタイト、 γ—酸化鉄、 または、 遷移金属および鉄を含んで成るガーネット 構造の酸化物などの鉄酸化物を挙げることができるだけでなく、 ニッケル、 コバ ルト、 鉄、 または、 それらの金属を含んで成る合金も挙げることができる。
[ 0 0 4 4 ]
磁性物質を被着または付着させることによって磁性粒子を得る場合、 粒子表面 に形成される磁性物質被膜の量が少なすぎると、 粒子の磁化の値が小さくなり、 磁気分離に際して好ましくない。 従って、 磁性物質被膜の体積が、 粒子 （磁性物 質被膜を含んだ粒子） の体積に対して 5 %以上であることが好ましい。 磁性物質 被膜の厚さは、 粒子 （磁性物質被膜を含んだ粒子） の直径に対して 1 . 7 %以上 の厚さとなることが好ましい。 ちなみに、 磁性物質被膜を 「磁' 1·生を帯びていない 粒子」 に供する態様のみならず、 「磁性を帯びていない粒子」 の内部に磁性物質 を含ませる態様も考えられる。
[ 0 0 4 5 ]
磁性粒子の磁気特性としては、 例えば 「飽和磁化」 および 「保磁力」 がある。 一般に、 飽和磁化の値が大きいほど磁界に対する粒子の応答性が向上する。 ここ で、 本発明のような密度が比較的大きい粒子に対して磁性をもたすには、 磁性を 帯ぴていない粒子の表面もしくは内部に磁性物質を供する必要がある。 ここで、 磁性物質は磁性を帯びていない粒子よりも密度が小さいために、 供する磁性物質 の量を制限することによって、 必要な密度を維持しなければならない。 また、 粒 子本体に非磁性のポリマーを被着させる場合には、 磁性物質のみから粒子が成る 場合よりも大きい飽和磁化を得ることは現実的に困難である。 以上より、 8 5 A ' m2 /k gよりも大きい飽和磁ィ匕を得ることは実際には困難といえる。 その 一方で、 飽和磁化が 0. 5 A · m2 /k gよりも小さいと磁界に対する粒子の応 答性が必要以上に低下するために好ましくない。 従って、 本発明の粒子の飽和磁 化量は、 好ましくは 0. 5 A · m2 Zk g〜85 A■ m2 Zk g (0. 5 emu /g~85 emu/g) であり、 より好ましくは 3 A · m2 / k g〜 30 A · m
2 /k g (3 emu/g~30 emu/g) であり、 例ぇば 入 -！！^ /！！ 〜 15 A · m2 /k g (4 em /g~ 15 emu/g) である。 また、 一般に、 保磯力の値が大きくなると、 粒子は凝集し易くなる。 しかしながら、 保磁力の値 が大きすぎると凝集作用が強くなりすぎ、 粒子が分散しなくなるので、 標的物質 を結合させる点で好ましくない。 そのため、 保磁力は、 好ましくは、 O kA/ra 〜23KA/m (0〜300エルステッド） であり、 より好ましくは 0 k A/m 〜1 5. 95 k A/m ( 0〜 200エルステッド） であり、 更に好ましくは O k AZm〜7. 97 k A/m (0〜100エノレステツド) である。
[0046]
本明細書でいう 「飽和磁化」 および 「保磁力」 の値は、 振動試料型磁力計 （東 英工業製、 型式 VSM— 5) を用いて測定される値である。 具体的には、 「飽和 磁化」 の値は、 797 kA/m (10キロエルステツド） の磁界を印加した際の 磁化量から求められる値である。 「保磁力」 の値は、 797 kA/mの磁界を印 加した後、 磁界をゼロに戻し、 更に、 磁界を逆方向に徐々に増加させた場合にお いて、 磁化量がゼロになる印カロ磁界の値である。
[0047]
本発明の粒子の形状は特に制限はなく、 例えば、 球形状、 楕円体形状、 粒形状、 板形状、 針形状または多面体形状 （例えば立方体形状） 等であってよい。 但し、 標的物質との結合に際して粒子間のバラツキを小さくするために、 粒子形状は規 則的な形状が望ましく、 特に球形状が好ましい。 また、 磁性を帯びていない粒子 本体に磁性物質被膜を設ける場合には、 「磁性を帯びていない粒子本体」 が球形 状または楕円体形状を有していることが好ましい。
[0048]
本宪明の粒子の本体表面に固定化されている 「標的物質を結合させることが可 能な物質」 （以下では 「標的物質が結合可能な物質」 ともいう） は、 ビォチン、 アビジン、 ストレプトアビジンおよびニュートラアビジンから成る群から選択さ れる少なくとも 1種以上の物質であることが好ましい。 また、 本発明の粒子の本 体表面に固定化されている 「標的物質を結合させることが可能な官能基」 （以下 では 「標的物質が結合可能な官能基」 ともいう） は、 カルボキシル基、 水酸基、 エポキシ基、 トシル基、 スクシンイミ ド基、 マレイミド基、 チオール基、 チォェ 一テル基およびジスルフィド基などの硫ィヒ物官能基、 アルデヒド基、 アジド基、 ヒドラジド基、 一級ァミノ基、 二級ァミノ基、 三級ァミノ基、 イミドエステノレ基、 カルポジイミド基、 イソシァネート基、 ョードアセチル基、 カルボキシル基のハ ロゲン置換体、 ならびに、 二重結合から成る群から選択される少なくとも 1種以 上の官能基であることが好ましい。 なお、 「標的物質が結合可能な官能基」 は、 上述した官能基の誘導体であってもかまわない。
[ 0 0 4 9 ]
本明細書において 「固定化」 とは、 一般的に、 粒子本体の表面付近に 「標的物 質が結合可能な物質」 または 「標的物質が結合可能な官能基」 が存在している態 様を実質的に意味しており、 必ずしも 「標的物質が結合可能な物質」 または 「標 的物質が結合可能な官能基」 力 S粒子本体の表面に直接取り付けられている態様の みを意味するものではない。 また、 「固定化」 とは、 粒子表面の少なくとも一部 に 「標的物質が結合可能な物質または官能基」 が固定化されている態様を実質的 に意味しており、 「標的物質が結合可能な物質または官能基」 が必ずしも粒子表 面全体にわたって固定化されていなくてもよい。 但し、 好ましい態様では、 粒子 本体が 「標的物質が結合可能な物質または官能基」 に内包されるように、 「標的 物質が結合可能な物質または官能基」 が粒子表面全体にわたつて存在している。 なお、 本明細書において 「標的物質が結合」 という用語は、 粒子に対して標的物 質が 「吸着」 または 「吸収」 される態様を包含しているのみならず、 標的物質と 粒子との間に働く種々の 「親和力」 に起因して標的物質が粒子に結合される態様 をも包含している。
[ 0 0 5 0 ]
本発明の粒子本体には 「標的物質が結合可能な物質」 または 「標的物質が結合 可能な官能基」 が固定化されているので、 力かる物質または官能基を介して標的 物質を粒子に結合させることができる。
[ 0 0 5 1 ]
ある好適な態様では、 ポリマーが粒子本体の表面の一部に被着または付着して おり、 「標的物質を結合させることが可能な物質または官能基」 が粒子本体およ び/またはポリマーの表面に固定化されている。 また、 別の態様では、 ポリマー が粒子本体の表面全体を被覆しており、 「標的物質を結合させることが可能な物 質または官能基」 がポリマーの表面に固定ィ匕されている。 粒子本体表面に被着ま たは付着しているポリマーは、 「標的物質が結合可能な物質」 または 「標的物質 が結合可能な官能基」 の固定化に寄与するものが好ましく、 「標的物質が結合可 能な物質」 または 「標的物質が結合可能な官能基」 の種類、 粒子の使用条件、 そ の他必要な特性等により、 任意に選択することができる。 代表的なポリマーを例 示すれば、 ポリスチレンまたはその誘導体、 ポリ （メタ） アクリル酸、 ポリ （メ タ） ァクリル酸エステル、 ポリビニルエーテル、 ポリウレタン、 ポリアミド、 ポ リ酢酸ビエル、 ポリビエルアルコール、 ポリアリルァミンおよびポリエチレンィ ミンから成る群から選択される少なくとも 1種以上の合成高分子化合物を挙げる ことができる。 なお、 このような合成高分子ィ匕合物に限定されず、 これらの変性 物または共重合体であってもかまわない。 更には、 ヒドロキシアルキルセルロー ス、 カルボキシアルキルセルロースもしくはアルギン酸ナトリゥム等の半合成高 分子化合物、 または、 キトサン、 キチン、 デンプン、 ゼラチンもしくはアラビア ゴム等の天然高分子化合物等のポリマーであってもかまわない。 尚、 「標的物質 が結合可能な物質」 または 「標的物質が結合可能な官能基」 が結合または付着で きる官能基が予め導入されているポリマーであってもよい。
[ 0 0 5 2 ]
粒子表面または粒子内部からの金属イオン （即ち、 粒子本体を構成している金 属のイオン） の溶出を抑えることを主たる目的とする場合には、 粒子本体を構成 する各種分子または金属ィオン等が透過しにくい被着ポリマーを選択すればよく、 例えば、 水系で粒子を使用する場合には、 水が透過しにくいポリスチレン、 ポリ メタタリル酸アルキル、 ポリビニルエーテルまたはポリ酢酸ビュルなどのポリマ 一を選択すればよい。
[ 0 0 5 3 ]
尚、 本明細書において 「被着」 または 「付着」 とは、 粒子表面の少なくとも一 部にポリマーが存在している態様を実質的に意味している。
[ 0 0 5 4 ]
次に、 以下において、 本発明の粒子と標的物質との結合態様について説明する。 本発明の粒子と標的物質とを共存させると、 標的物質と 「標的物質を結合させる ことが可能な物質もしくは官能基」 との間に働く吸着力または親和力によって、 標的物質が粒子に結合することになる。 以下分類して説明するため、 「吸着」 を 「化学吸着」 と同義とする。
[ 0 0 5 5 ]
「吸着力」 に起因して、 標的物質が粒子に結合する態様の一例としては、 「標 的物質」 がアビジンであり、 粒子本体がジルコユアから形成されており、 「標的 物質を結合させることができる物質または官能基」 がエポキシ基である場合であ る。
[ 0 0 5 6 ]
「親和力」 に関しては、 標的物質との間に働く親和力の種類に基づいて、 粒子 本体表面に固定化されている 「標的物質を結合させることができる物質または官 能基」 を大きく次の 5つに分類できる （尚、 各分類において挙げる物質または官 能基は、 あくまでも例示にすぎず、 その他の物質または官能基も考えられること に留意されたい） 。 尚、 そのような親和力に起因する場合、 「標的物質を結合さ せることができる物質または官能基」 は、 以下では 「親和性を有する物質または 官能基」 と呼ぶ。
[ 0 0 5 7 ]
( 1 ) 標的物質との間に働く親和力が、 静電相互作用、 π— π相互作用、 π—力 チオン相互作用または双極子相互作用に起因する 「親和性を有する物質または官 能基」 の例
シリカ、 活性炭、 スルホン酸基、 カルボキシル基、 ジェチルアミノエチル基、 ト リエチルアミノエチル基、 フエニル基、 アルギニン、 セルロース、 リジン、 ポリ リジン、 ポリアミド、 ポリ （N-イソプロピルアクリルアミド） 、 クラウンエー テルもしくは π電子を有する環状化合物、 または、 それらの官能基誘導体、 酸素 結合体もしくは蛍光プローブ結合体など
( 2 ) 標的物質との間に働く親和力が疎水相互作用に起因する 「親和性を有する 物質または官能基」 の例
アルキル基、 ォクタデシル基、 ォクチル基、 シァノプロピル基もしくはプチル基 またはフエュノレ基、 または、 それらの官能基誘導体、 酸素結合体もしくは蛍光プ ローブ結合体など
( 3 ) 標的物質との間に働く親和力が水素結合に起因する 「親和性を有する物質 または官能基」 の例
D NA、 R NA、 O l i g o ( d T) 、 キチン、 キトサン、 アミロース、 セル口 ース、 デキストリン、 デキストラン、 プルラン、 多糖、 リジン、 ポリリジン、 ポ リアミド、 ポリ （N-ィソプロピルァクリノレアミド) もしくは ]3 -グルカン、 また は、 それらの官能基誘導体、 酸素結合体もしくは蛍光プローブ結合体など
( 4 ) 標的物質との間に働く親和力が配位結合に起因する 「親和性を有する物質 または官能基」 の例
ィミノジ酢酸、 二ッケル、 二ッケルイオン、 ニッケノ 体、 コバルト、 コノノレト イオン、 コバルト錯体、 銅、 銅イオンもしくは銅錯体、 または、 それらの酸素結 合体もしくは蛍光プロープ結合体など
( 5 ) 標的物質との間に働く親和力が生ィヒ学的相互作用に起因する 「親和性を有 する物質または官能基」 の例 （生化学的相互作用：生体分子に関する相互作用を 含むものであって、 抗原'抗体反応、 リガンド ' レセプター結合、 水素結合、 配 位結合、 疎水相互作用、 静電相互作用、 π— π相互作用、 π—力チオン相互作用、 双極子相互作用およびファンデルワールス力などが単独または二種以上で連係し て働く相互作用）
抗原、 抗体、 レセプター、 リガンド、 ピオチン、 アビジン、 ストレブトァビジ ンニュートラアビジン、 シリカ、 活性炭、 ケィ酸マグネシウム、 ハイド口キシァ パタイト、 ァノレプミン、 アミロース、 セルロース、 レクチン、 プロテイン Α、 プ 口ティン G、 Sタンパク質、 デキストリン、 デキストラン、 プルラン、 多糖、 力 ノレモジュリン、 エッケノレ、 ニッケノレイオン、 ニッケノ] /^体、 コノ ノレト、 コノ ノレト イオン、 コバルト錯体、 銅、 銅イオン、 銅錯体、 ゼラチン、 N-ァセチルダルコ サミン、 イミノジ酢酸、 ァミノフエ二ルホウ酸、 エチレンジァミン二酢酸、 アミ ノベンズアミジン、 ァ ギニン、 リジン、 ポリリジン、 ポリアミド、 ジェチルァ ミノェチル基、 トリェチルアミノエチル基、 E C T E O L A-セルロース、 フィ ブロネクチン、 ビトロネクチン、 アルギニン-グリシン-ァスパラギン （R G D) 酸配列を含むペプチド、 ラミニン、 ポリ （Ν-イソプロピルアクリルアミド） 、 コラーゲン、 コンカナバリン 、 アデノシン 5 'リン酸 （A T P) 、 AD P、 A T P、 ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、 アタリジン色素、 ァプロチュン. オボムコイド、 トリプシンインヒビターゃプ口テアーゼインヒビター等のインヒ ビタ一類、 ホスホリルエタノールァミン、 フエ二ルァラニン、 プロタミン、 シパ ク口ンブルー、 プロシオンレツド、 へパリン、 グルタチオン、 D I G、 D I G抗 体、 D NA、 R NA、 O 1 i g o ( d T) 、 キチン、 キトサン、 β -グルカン、 リン酸カルシウム、 リン酸水素カルシウム、 ヒアノレロン酸、 エラスチン、 セリシ ンもしくはフィプロイン、 または、 それらの官能基誘導体、 酸素結合体もしくは 蛍光プローブ結合体など
[ 0 0 5 8 ]
上述の分類から分かるように、 本明細書で用いる 「親和性を有する」 とは、 標 的物質と粒子に固定化される物質または官能基との間に、 静電相互作用、 π - π 相互作用、 π—力チオン相互作用、 双極子相互作用、 疎水相互作用、 生化学的相 互作用、 水素結合または配位結合などがもたらされることを実質的に意味してい る。 粒子本体に固定化される物質または官能基の種類によっては、 上述の親和性 を 2種以上兼ね備える場合があり、 上述の分類で重複する物質または官能基が存 在する場合がある点に留意されたい。 また、 上述の分類に必ずしも限定される必 要はなく、 標的物質に対して作用し、 標的物質を粒子表面またはその近傍に存在 させる機能を有するものであれば、 いずれの物質または官能基を粒子に固定ィ匕さ せてもよい （一例を挙げるとすると、 標的物質との相捕的な形状に起因して親和 性を有するものが考えられる） 。
[ 0 0 5 9 ] 次に、 以下において、 本発明の粒子の製造方法について詳細に説明する。 本 明の製造方法は、 「標的物質が結合できる粒子であって、 粒子の比表面積が、 か かる粒子と同一の粒径およぴ密度を有する真球粒子の比表面積の 1. 4〜： L 00 倍となるように粒子本体表面が粗面化されている粒子」 を得る方法である。
[0 0 6 0]
本発明の製造方法は、
( I ) 原料粒子 （又は前駆体粒子） と塩酸、 硫酸および硝酸から成る群から選 択される少なくとも 1種以上の酸性物質 （リン酸を除く） とを接触させる工程、 および
( I I ) 「標的物質と結合することが可能な物質または官能基」 を原料粒子に 固定化する工程
を含んで成る。
[006 1]
工程 （I ) では、 原料粒子と、 塩酸、 硫酸および硝酸から成る群から選択され る少なくとも 1種以上の酸性物質とを接触させる。 粒子密度が 3. 5 g/cm3 S gZcm3の粒子を得る場合、 原料粒子は、 金属または金属酸化物から形成 されており、 例えば、 ジノレコニァ （酸ィ匕ジルコニウム、 イットリウム添加酸ィ匕ジ ルコニゥム） 、 酸化鉄、 アルミナ、 ニッケル、 コノ ノレト、 鉄、 銅おょぴアルミ二 ゥムから成る群から選択される少なくとも 1種以上の材料から形成されているこ とが好ましい。 原料粒子の密度は、 3. 5 gZcm3 〜9 gZcm3であり、 よ り好ましくは 5. 0 g/cm3 〜9. 0 g cm3であり、 更に好ましくは、 5. 5 g/cm3 〜7. 0 g/cm3である。 尚、 場合によっては、 原料粒子の密度 が 9. 0 g/c m3 より大きくてもよい場合 （より具体的には、 9. 0 g/cm 3 (9. 0 gZcm3 を除く） 〜 2 3 g/cm3 ) もあり得る （この場合、 原料 粒子は、 Ag (銀） 、 Au (金） 、 P t (白金） 、 P d (パラジウム） 、 W (タ ングステン） 、 Rh (ロジウム） 、 O s (オスミウム） 、 R e (レニウム） 、 I r (イリジウム） 、 Ru (ルテニウム） 、 Mo (モリブデン） 、 H f (ハフニゥ ム） および T a (タンタル） 力 ら成る群から選択される少なくとも 1種類以上の 遷移金属元素から形成されていることが好ましく、 あるいは、 P b (鉛） 、 B i (ビスマス） および T 1 (タリウム） 力 ら成る群から選択される少なくとも 1種 類以上の典型金属元素から形成されていることが好ましい） 。 原料粒子の粒径ま たは平均粒径は、 好ましくは 1 μ η！〜 5 mmであり、 より好ましくは 5 μ m〜 5 Ο Ο μ ιηであり、 更に好ましくは 1 Ο μ π！〜 1 0 O / mである。 更に、 用いる原 料粒子は、 貫通孔が形成されていない粒子であることが好ましい。 即ち、 原料粒 子が実質的に中実であり、 内部にて貫通ネットワーク構造を有していない粒子で あることが好ましい。 尚、 原料粒子は、 上記材質および物性から成るものであれ ば、 市販のものを直接用いることができる。
[ 0 0 6 2 ]
「塩酸、 硫酸および硝酸から成る群から選択される少なくとも 1種以上の酸性 物質」 は、 好ましくは液体状態として使用される。 これらの酸性物質の中でも、 特に硫酸または硝酸を用いることが好ましい。 尚、 原料粒子と上記酸性物質との 接触に際しては、 原料粒子と酸性物質とを含んで成る混合液を加熱処理または水 熱反応 （またはソルボサーマル法） に付すことが好ましい。 水熱反応 （またはソ ルポサーマル法） に付す場合において、 「塩酸」 、 「硫酸」 および 「硝酸」 は、 それぞれ 「塩酸水溶液」 、 「硫酸水溶液」 および 「硝酸水溶液」 を実質的に意味 しており、 「原料粒子と酸性物質とを含んで成る混合液」 は、 水溶液を成してい る。 酸性物質の酸濃度は、 酸の種類、 温度、 圧力、 時間、 あるいはハンドリング、 コスト、 安全性との兼ね合いで適宜選択可能である （例えば、 耐圧容器中で 1 5 0〜 2 5 0 °C、 3〜 1 6時間反応させる場合などでは、 1 0〜 3 0 v o 1 %の硫 酸を用いることができる） 。 上述のような水熱反応では、 「原料粒子と酸性物質 とを含んで成る混合液」 が適当な温度に加熱されることになる。 例えば、 「ォー トクレープ」 、 「恒温槽」 または 「マイクロ波照射」 などによって加熱すること ができる。 水熱反応の温度条件は、 好ましくは 1 5 0 °C〜 3 0 0 °Cであり、 より 好ましくは 1 6 0 °C〜2 8 0 °Cであり、 更に好ましくは 1 7 0 °C〜 2 4 0 °Cであ る。 水熱反応の圧力条件は、 0. ：〜 1 0MP aであることが好ましく、 より好 ましくは 0 . 5〜7 M P a、 更に好ましくは 0 . 7〜3 . 7 M Paである。 また、 水熱反応処理は、 一般的には、 1分〜 1 2時間、 より好ましくは 3 0分から〜 9 時間、 より好ましくは 1時間〜 7時間程度行うことが好ましい。 なお、 ソルポサ 一マル法においては水に限らず各種有機溶剤を使用することが可能である。 その 際は用いる酸と 2相化しない溶媒であれば、 特に制限はない。 この際の反応温度 は上記に示した通りである。 圧力条件は使用する溶媒により異なる力 温度が決 まると一義的に決定される。
[0063]
例えば、 水熱反応処理に際してマイクロ波を利用する場合では、 「原料粒子と 酸性物質とを含んで成る混合液」 を水熱反応用の耐圧容器に仕込み、 外部からマ イク口波を混合水溶液に対して照射する。 マイクロ波の照射は、 「原料粒子と酸 性物質とを含んで成る混合液」 の温度が目標温度に達するまで継続するが、 目標 温度に達した後も、 温度を一定に保っために出力を変化させつつ照射を続けても よ 、。 照射するマイク口波の周波数は、 「原料粒子と酸性物質とを含んで成る混 合液」 を目標温度 （即ち、 150〜300°Cの温度） にまで加熱できるものであ れば、 特に制限はないが、 例えば 2. 45 GHzである。 照射するマイクロ波の 出力についても目標温度にまで加熱できるのであれば特に制限はないが、 出力を 大きくすると目標温度に達する時間を短くできる一方、 出力を低くすれば混合水 溶液の温度を一定に保ちやすくなる。 尚、 マイクロ波の出力を可変制御できれば、 目標温度に達する時間の短縮化と温度制御との双方を適宜行うことができるので 特に好ましい。 マイクロ波の出力を可変制御できる装置としては、 マイルストー ンゼネラノレ社製の 「Mi c r o SYNTH (マイクロシンス） 」 を挙げることが できる。
[0064]
工程 （I) によって、 原料粒子の表面が粗面化され、 粗面化された粒子の比表 面積が、 かかる粒子と同一の粒径および密度を有する真球粒子の比表面積の 1. 4〜： L 00倍となり、 好ましくは、 粒子または粒子本体の単位表面積 [cm2 ] あたりの細孔半径 20 n m以上の積算細孔体積 [cm3 ] の割合が 1 X 10一 6 [cm3 /cm2 ] 以上となる。 尚、 工程 (I) でもたらされる粗面化において は、 好ましくは原料粒子表面から約 2 μ mまでの深さまでが粗面化され得、 より 好ましくは原料粒子表面から約 1. 5 μ mまでの深さまでが粗面化され得、 更に 好ましくは原料粒子表面から約 1 μ mまでの深さまでが粗面化され得る。 ただし、 好ましくは粗面化されている割合は粒子本体直径の 4 0 %を超えておらず、 より 好ましくは 3 0 %を超えておらず、 更に好ましくは 2 0 %を超えていない。 尚、 上述の 「粗面化されている割合 （％) 」 とは、 粒子中央を通る方向に沿って粒子 全体を見た場合の粗面化部分 （=細孔存在領域） の割合のことを実質的に意味し ている。
[ 0 0 6 5 ]
工程 （I ) の後で、 原料粒子は、 洗诤、 濾過または乾燥などに付すことが好ま しい。 粒子を洗浄することによって、 粒子表面から不純物を除去できる。 特に、 粗面化処理に用いられた酸性物質またはそれに由来するような化合物を除去でき る。 洗浄は、 水を用いた水洗が好ましいものの、 水以外にもエタノール、 メタノ ールといったアルコール系、 トルエン、 へキサンなどといった各種有機溶媒を用 いて粒子を洗浄してもよレヽ。 濾過は、 洗浄に際して行ってよく、 洗浄液などを粒 子から除去できる。 粒子の乾燥は、 好ましくは 1 0〜 1 5 0 °C、 より好ましくは 4 0〜 9 0 °Cの温度条件下で行うことが好ましい。 乾,を用いて粒子を乾燥さ せてよいものの、 自然乾燥により粒子を乾燥させてもかまわない。
[ 0 0 6 6 ]
次に工程 （I I ) では、 「標的物質と結合することが可能な物質または官能 基」 を原料粒子に固定化する。 即ち、 「標的物質が結合可能な物質」 または 「標 的物質が結合可能な官能基」 が原料粒子の表面に導入される。 「標的物質が結合 可能な物質」 を原料粒子に固定化させる手法は、 特に制限されるものではなく、 「標的物質が結合可能な物質」 を原料粒子に結合または付着させることができる ものであれば、 いずれの手法を用いてもよい。 「標的物質が結合可能な物質」 を 原料粒子に直接的に結合または付着させることに限らず、 必要に応じて、 珪素含 有物質 （例えばシロキサン、 シラン力ップリング剤おょぴケィ酸ナトリゥムな ど） 、 または、 標的物質が結合もしくは付着可能な官能基を有する榭脂等の他の 物質を予め原料粒子に付着または導入したり、 あるいは、 原料粒子の表面に貴金 属被着処理を施した上で標的物質が結合もしくは付着可能な官能基を有する含硫 黄ィ匕合物等の他の物質を予め原料粒子に付着または導入したりすることによって、 「標的物質が結合可能な物質」 を粒子に固定化させ易くしてもよい。 尚、 珪素含 有物質を用いた場合では、 原料粒子の表面には 「標的物質が結合可能な物質」 が 固定化されていると共に、 かかる珪素含有物質が存在することになる。
[ 0 0 6 7 ]
「標的物質が結合可能な物質」 を原料粒子に固定化させる手法の一例を説明す ると、 例えば、 原料粒子の表面にエポキシ基やアミノ基を有するシランカツプリ ング剤を反応させることによって、 「標的物質が結合可能な物質」 を粒子に固定 化させることができる。
[ 0 0 6 8 ]
同様に、 「標的物質が結合可能な官能基」 を原料粒子に固定化させる手法は、 特に制限されるものではなく、 「標的物質が結合可能な官能基」 を粒子に結合ま たは付着させることができるものであれば、 いずれの手法を用いてもよい。 例え ば、 必要に応じて、 「標的物質が結合可能な官能基」 を化学的に処理して別の官 能基に変換し、 反応性や吸着性等を変更してもよい。 「標的物質が結合可能な物 質」 と同様、 「標的物質が結合可能な官能基」 を原料粒子に直接的に結合または 付着させるだけでなく、 必要に応じて、 珪素含有物質 （例えばシロキサン、 シラ ンカップリング剤およびケィ酸ナトリウムなど） 、 標的物質が結合もしくは付着 可能な官能基を有する樹脂等の他の物質を予め原料粒子に付着または導入したり、 あるいは、 原料粒子の表面に貴金属被着処理を施した上で標的物質が結合もしく は付着可能な官能基を有する含硫黄化合物等の他の物質を予め原料粒子に付着ま たは導入したりすることによって、 「標的物質が結合可能な官能基」 を原料粒子 に固定化させ易くしてもよレ、。 例えば、 珪素含有物質を用いた場合では、 原料粒 子の表面には 「標的物質が結合可能な官能基」 が固定化されていると共に、 かか る珪素含有物質が存在することになる。
[ 0 0 6 9 ]
以下では、 「標的物質が結合可能な官能基」 を粒子に固定化する手法の一例と して、 シランカツプリング剤を用いた手法を説明する。
[ 0 0 7 0 ]
《シラン力ップリング剤を用いた官能基の固定化》 ップリング剤で原料粒子の表面を被覆する手法である。 カゝかる手法は、 シラン力 ップリング剤の末端官能基を変えたものを用いることで、 官能基の種類を容易に 変更できる利点がある。
[ 0 0 7 1 ]
粗面化された原料粒子を純水に分散させ、 得られる分散液を攪抨しながら、 末 端にエポキシ基を有する 3—ダリシドキシプロピルトリメトキシシランを分散液 に添加して攪拌する。 この際、 3—グリシドキシプロビルトリメトキシシランを 単独で添加しても、 水、 エタノールなどの溶剤で希釈して加えてもよレ、。 水と有 機溶剤の混合比も任意の割合で行うことができる。 また、 反応の触媒として、 酢 酸、 塩酸などといった酸や、 アンモニア水といった塩基を加えることも可能であ る。 また、 反応時間は通常 1 0分から 6時間である。 短すぎると反応が進まず、 長すぎるとエポキシの分解を生じてしまう可能性がある。 さらに、 撹拌方法も特 に制限はなく、 撹拌羽根、 マグネティックスターラー、 ディスクローターなどを あげることができる。
[ 0 0 7 2 ]
次いで、 乾燥を行うが、 この際、 単純に水で洗浄し、 乾燥を行う以外にも、 有 機溶剤で粒子を洗浄した後、 粒子を乾燥に付すことも可能である。 この際用いる 有機溶剤はアセトン、 トノレェンといったさまざまなものを用いることが可能であ る。 また、 乾燥も特に制限なく、 室温でも加熱しても良く、 常圧、 減圧のどちら でも構わない。
[ 0 0 7 3 ]
このようにすることで、 エポキシ基を有するィットリゥム添加酸化ジルコニゥ ム粒子を得ることができる。
[ 0 0 7 4 ]
次に、 「ポリマーを粒子に被着または付着させる」 の場合について説明する。 ポリマーを原料粒子に被着または付着させる手法は、 特に制限されるものではな く、 ポリマーを原料粒子表面の少なくとも一部に付着することができるものであ れば、 いずれの手法を用いてもよい。 例えば、 以下の手法を挙げることができる。
( 1 ) 原料粒子の表面から重合を開始する手法 ( 2 ) 原料粒子の存在下で重合を行い、 重合物を粒子表面に析出させる手法
( 3 ) モノマーエマノレジョン中に原料粒子を内包して重合を行う手法
( 4 ) 予め重合して得ておいたポリマーの溶液に原料粒子を混合させ、 粒子表 面にポリマーを析出させる手法
[ 0 0 7 5 ]
上記手法をより具体的に説明すると次のようになる。 （1.) の手法では、 原料 粒子の表面に開始剤や連鎖移動剤を結合または吸着させて、 粒子表面からポリマ 一を伸張させることによって、 原料粒子の表面にポリマーを被着させる。 （2 ) の手法では、 重合反応の進行とともに析出するモノマーを用いて原料粒子の存在 下で重合を行うことによって、 原料粒子の表面にポリマーを被着させる。 ポリマ 一と粒子とが引き合うように各々の電荷を選択したり、 粒子表面に重合性二重結 合を固定しておく等によって被着をより効率的に行うことができる。 （3 ) の手 法では、 モノマーェマルジヨンを形成し得るモノマーと溶剤との組合せを選択し、 それにより得られるモノマーェマルジヨン中に原料粒子を内包させて重合するこ とによって、 粒子表面にポリマーを被着させる。 この場合、 原料粒子がモノマー ェマルジョン中に優先的に存在するように、 モノマーに馴染みをよくする表面処 理ゃ界面活性剤等を用いるとよい。 また、 （4 ) の手法では、 ポリマー溶液中に 原料粒子を混入し、 貧溶剤を加えたり、 p Hを変化させたり、 塩を多量に加えた りすることによってポリマーの溶解性を低下させて析出させることによって、 原 料粒子の表面にポリマーを被着させる。 この場合も電荷の選択や重合性二重結合 の固定等の手法は有効である。 また、 原料粒子を電荷の異なるポリマー溶液に交 互に浸して、 粒子表面に積層を形成してもよい。
[ 0 0 7 6 ]
尚、 上述のような手法では、 マイクロカプセル化手法、 ェマルジヨン重合等の 種々の方法が従来公知であり、 それらを用いて実施することができる。
[ 0 0 7 7 ]
ポリマーの被着処理に先立って、 原料粒子の表面に特定の処理を施してもよい。 例えば、 磁性化処理の他、 金属もしくは無機物によるコート処理、 界面活性剤の 吸着処理、 シランカツプリング剤もしくはチタンカツプリング剤等の反応性物質 を用いた処理、 シロキサン被覆処理おょぴシロキサン中の S i— Hへの官能基導 入処理 （ヒドロシリル化反応） 、 酸処理もしくはアルカリ処理、 溶剤洗浄処理、 または、 研磨処理等を施してもよい。 これらの処理により、 原料粒子の表面の汚 れの除去、 原料粒子の表面の電荷の制御、 粒子表面への反応性官能基の導入が行 われるので、 ポリマーの被着効率が向上したり、 被着ポリマーと粒子表面との密 着性が向上したりする。 尚、 シロキサンまたはシランカップリング剤等の珪素含 有物質を用いた場合では、 本発明の粒子の本体表面には 「標的物質が結合可能な 物質または官能基」 および被着ポリマーの他に、 力かる珪素含有物質が存在する こと （例えば、 珪素化合物が原料粒子表面と被着ポリマー表面との間に介在し得 ること） になることを理解されよう。 開始剤および/または重合性二重結合を原 料粒子の表面に予め結合または吸着させて重合を行うと、 被着ポリマーの表面析 出が生じやすくなるので、 ポリマーの被着処理に有利となり得る。 その他、 非特 異結合の低減、 金属イオン等の溶出の抑制、 密度の調整、 色や蛍光等の付与等、 別の特性を付与するための処理を施してもよい。
[ 0 0 7 8 ]
被着ポリマーには架橋処理を施してもよい。 被着ポリマーが架橋されると、 被 着ポリマーの耐久性、 耐溶剤性または低膨潤性等の特性が向上し得る。 架橋の方 法は特に制限されないが、 代表的な手法を分類すると、 以下のようになる。
( 1 ) a . 原料粒子へのポリマー被着処理に際して架橋、 b . 被着処理後に 架橋
( 2 ) a . 架橋剤を添加 （室温や低温で進行する架橋も含む） 、 b . 架橋性 官能基をポリマー中に導入
( 3 ) a . 熱架橋、 b . 放射線架橋
[ 0 0 7 9 ]
上記手法 （1 ) 、 （2 ) および （3 ) は種々に組み合わせることができること に留意されたい。 例えば、 （1 ) aかつ （2 ) aかつ （3 ) aの 3つを組み合わ せる例としては、 原料粒子の表面から重合を開始したり重合物を原料粒子の表面 に析出させたりしてポリマーを被着させる処理に際して 2官能性のモノマーを含 めて加熱処理を行う手法、 または、 モノマーェマルジヨン中に原料粒子を内包し て重合を行う処理に際して 2官能性のモノマーを含めて加熱処理を行う手法を挙 げることができる。 また、 （1 ) かつ （2 ) a力つ ( 3 ) aの 3つを組み合わ せる例としては、 カルボキシル基を有するポリマーの析出またはカルボキシル基 を有するモノマーの重合によつて原料粒子を被着させる系にぉ 、て、 被着後に多 官能性エポキシ架橋剤を添加し、 熱を加えて架橋させる手法を挙げることができ る。 なお、 同様の系においてカルボキシル基の代わりに水酸基、 エポキシ架橋剤 の代わりにイソシァネート架橋剤を用いて架橋させる手法も考えられる。 （2 ) bに属する例としては、 被着ポリマー中にエポキシ基、 イソシァネート基または 二重結合等を導入する手法が挙げられる。 ここで、 エポキシ基またはイソシァネ ート基の導入には （3 ) aを用いることができ、 二重結合の導入には （3 ) bを 用いることができる。
[ 0 0 8 0 ]
被着ポリマーが用いられる場合、 本発明の粒子の本体表面および/または被着 ポリマー表面に 「標的物質が結合可能な物質」 または 「標的物質が結合可能な官 能基」 が固定化されていることを理解されよう。
[ 0 0 8 1 ]
原料粒子の表面に被着ポリマーを設ける態様において 「標的物質が結合可能な 官能基」 を固定化させる手法は、 特に制限されるものではなく、 「標的物質が結 合可能な官能基」 を原料粒子に結合または付着させることができるものであれば、 いずれの手法を用いてもよい。 更に、 「標的物質が結合可能な官能基」 の固定ィ匕 は、 ポリマーの被着処理前、 被着処理中または被着処理後のいずれに行ってもよ い。
[ 0 0 8 2 ]
原料粒子の表面に被着ポリマーを設ける態様において 「標的物質が結合可能な 官能基」 を固定ィ匕させる手法としては、 例えば、 被着すべきポリマーの重合反応 に際して、 「標的物質が結合可能な官能基」 を有するモノマーを重合または共重 合させる方法がある。 この場合、 「標的物質が結合可能な官能基」 を有するモノ マーの例としては、 （メタ） アクリル酸、 （メタ） アクリル酸グリシジル、 （メ タ） アクリル酸ヒドロキシアルキル、 （メタ） アクリル酸ジメチルアミノアルキ ル、 （メタ） アクリル酸イソシアナートアルキル、 p—スチレンスルホン酸 (塩） 、 ジメチロールプロパン酸、 N—アルキルジエタノールァミン、 （ァミノ ェチルァミノ） ェタノ一 またはリジン等を挙げることができる。
[ 0 0 8 3 ]
原料粒子の表面に被着ポリマーを設ける態様において 「標的物質に対する結合 性がより高い官能基」 を固定化したい場合には、 上記手法で被着ポリマーに導入 された官能基 aに対して反応性を有する他の官能基 bと 「標的物質に対する結合 性がより高い官能基 c」 との 2つの官能基を有する化合物を、 粒子に付加的に導 入してもよい。 この場合、 官能基 aと官能基 bとが結合することによって、 「標 的物質に対する結合性がより高い官能基 c」 が固定化された粒子を得ることがで きる。 また、 被着ポリマー表面と 「標的物質が結合可能な官能基」 との間を離し たい場合または原料粒子表面と 「標的物質が結合可能な官能基」 との間を離した い場合 （即ち、 「リンカ一」 を導入したい場合） にも同様に、 導入された官能基 aに対して反応性を有する他の官能基わと 「標的物質が結合可能な官能基」 との 2つの官能基を有する化合物を、 官能基 aが導入された粒子に付加的に導入して もよい （この場合も同様に、 官能基 aと官能基 bとの結合を介して 「標的物質が 結合可能な官能基」 が粒子に固定化される） 。 尚、 このような化合物の導入を 2 回以上繰り返し行って、 リンカ一をより長くしてもよい。 被着ポリマー表面と 「標的物質が結合可能な官能基」 との間がより離れると、 又は、 原料粒子表面と 「標的物質が結合可能な官能基」 との間がより離れると、 「標的物質が結合可能 な官能基」 の自由度が高まって、 その反応性が向上するだけでなく、 標的物質の 自由度も高まって標的物質の機能が抑制されない等の有利な効果を期待できる。 被着ポリマー主鎖から官能基までの原子数をリンカ一の長さと定義すると、 リン カーの長さは原子 5個以上 5 0個以下で上記の効果が特に期待できる。 ちなみに、 リンカ一の主鎖としては、 生態関連物質等の非特異吸着 1·生の低いもの （例えばポ リエチレングリコール鎖） を用いることが特に好ましい。
[ 0 0 8 4 ]
原料粒子の表面に被着ポリマーを設ける態様において 「標的物質が結合可能な 物質」 を固定化させる手法は、 特に制限されるものではなく、 「標的物質が結合 可能な物質」 を粒子に結合または付着させることができるものであれば、 いずれ の手法を用いてもよい。 「標的物質が結合可能な物質」 の固定化も、 ポリマーの 被着処理前、 被着処理中または被着処理後のいずれに行ってもよい。
[ 0 0 8 5 ]
例えば、 上述の 「標的物質が結合可能な官能基」 を導入する手法と同様な手法 で、 「標的物質が結合可能な物質」 を粒子に固定化させることができる。 一 を 挙げると、 「標的物質が結合可能な物質」 と結合性を有する官能基を原料粒子表 面または被着ポリマー表面に予め導入し、 その官能基を介して 「標的物質が結合 可能な物質」 を粒子に固定化することができる。 また、 被着ポリマーとして疎水 性ポリマーを用い、 「標的物質が結合可能な物質」 として疎水性のものを用いる と、 水中においては疎水性の物質同士が吸着する所謂 「疎水性相互作用」 が生じ ることになるので、 疎水性の 「標的物質が結合可能な物質」 を被着ポリマー表面 に固定化させることができる。
[ 0 0 8 6 ]
本発明の製造方法は、 工程 （I I ) の後で、 得られた粒子を、 洗浄、 濾過また は乾燥などに付すことが好ましい。 粒子を洗浄することによって、 粒子表面から 不純物を除去できる。 洗浄は、 水を用いた水洗が好ましいものの、 水以外にもェ タノ一ノレ、 メタノ一ノレといったァノレコーノレ系、 トルエン、 へキサンなどといった 各種有機溶媒を用いて粒子を洗浄してもよレヽ。 濾過は、 洗浄に際して行ってよく、 洗浄液などを粒子から除去できる。 粒子の乾燥は、 好ましくは 1 0〜 1 5 0 °C、 より好ましくは 4 0 ~ 9 0 °Cの温度条件下で行うことが好ましい。 乾燥機を用い て粒子を乾燥させてよいものの、 自然乾燥により粒子を乾燥させてもかまわない。
[ 0 0 8 7 ]
次に、 以下において、 本発明の粒子を用いた分離方法について詳細に説明する。
[ 0 0 8 8 ]
かかる分離方法は、 上述した本発明の粒子を用いて、 試料中から標的物質を分 離する又は標的物質を固定した粒子を得る方法である。 本発明の分離方法は、 ( i ) 標的物質を含んで成る試料と本発明の粒子とを接触させ、 粒子と標的物質 とを結合させる工程、 (i i) 試料を静置に付して、 試料中で粒子を自然沈降させる工程、 および (i i i) 試料中で沈殿した粒子を回収することによって、 標的物質を試料から 分離する又は標的物質を固定した粒子を得る工程
を含んで成る。
[0089]
工程 (i) では、 標的物質を含んで成る試料と本発明の粒子とが接触し、 粒子 と標的物質とが相互に結合される （図 1 (a) 参照） 。 例えば、 標的物質を含ん で成る試料に対して粒子を供給することによって、 試料と粒子とを接触させる。 結合が促進されるように、 必要に応じて、 攪拌処理を施してもよレ、。 供される粒 子は、 上述の本発明の粒子 （即ち、 「表面に粗面化処理が施された粉末形態の粒 子 （好ましくは平均サイズ 1 ！〜 lmmの粒子） 」 である。 供される粉末形態 の粒子の量は、 試料の種類や分離用途などとの関係で決まつてくるものであり、 総括的に特定できるものではないが、 例を挙げるとすると、 一粒子から使用でき、 分析、 研究用途ではグラム単位まで do— 2 g〜103 g程度） となり、 工業 的に利用する場合はキログラム単位 （1〜103 k g程度） からトン単位 （1〜 10 t程度） までとなり得る。
[0090]
工程 (i i) にて粒子の自然沈降がもたらされるように、 標的物質を含んで成 る試料は、 例えば、 ビーカー、 メスシリンダー、 試験管、 マイクロチューブ、 ィォチップ、 化学チップ、 /X-TASチップなどに仕込んだ状態で用いることが好ま しい。
[0091]
標的物質と粒子との間の結合は、 それらの間に働く吸着力または親和力によつ て引き起こされる。 より具体的には、 粒子に固定化されている 「標的物質を結合 させることが可能な物質もしくは官能基」 と標的物質との間で吸着力または親和 力が働くことによって、 標的物質と粒子とが相互に結合する。 尚、 試料中に供す る粉末形態の粒子の量によっては、 標的物質の結合に寄与しない粒子も存在し得 る （例えば粒子を過剰に供給した場合） 。 尚、 本発明の方法で用いる粒子は、 前 述したように （1) 比表面積が必要以上に大きくなつておらず、 また、 （2) 所 望サイズの細孔がある割合で存在するので、 標的物質以外の物質が粒子に結合す る非特異結合を抑えることができる粒子である。 従って、 試料中に標的物質以外 の物質が含まれていても、 標的物質を優先的に粒子に結合できる。
[ 0 0 9 2 ]
標的物質は、 前述したように、 例えば、 核酸、 蛋白質 （例えばアビジンおよび ビォチン化 H R Pなども含む） 、 糖、 脂質、 ペプチド、 細胞、 真菌、 細菌、 酵母、 ウィルス、 糖脂質、 糖蛋白質、 錯体、 無機物、 ベクター、 低分子化合物、 高分子 化合物、 抗体または抗原等である。 また、 試料は、 前述したように、 例えば、 ヒ ト又は動物の尿、 血液、 血清、 血漿、 精液、 唾液、 汗、 涙、 腹水、 羊水等の体 液；ヒト又は動物の臓器、 毛髪、 皮膚、 粘膜、 爪、 骨、 筋肉又は神経組織等の懸 濁液、 抽出液、 溶解液又は破砕液；便懸濁液、 抽出液、 溶解液又は破砕液；培養 細胞又は培養組織の懸濁液、 抽出液、 溶解液又は破砕液；ウィルスの懸濁液、 抽 出液、 溶解液又は破砕液；菌体の懸濁液、 抽出液、 溶解液又は破砕液；土壌懸濁 液、 抽出液、 溶解液又は破砕液；植物の懸濁液、 抽出液、 溶解液又は破砕液；食 品 ·加工食品懸濁液、 抽出液、 溶解液又は破砕液；排水等である。
[ 0 0 9 3 ]
工程 （i i ) では、 粒子が供された試料を静置に付して、 試料中で本発明の粒 子を自然沈降させる （図 1 ( b ) 参照） 。 本発明の方法で用いる粒子は、 上述し たような密度特性を有するものであるため、 比較的速い自然沈降速度が得られる。 換言すれば、 用いる粒子の密度が大きいので、 粒子を自然沈降させるだけでも十 分な分離速度を得ることができる。
[ 0 0 9 4 ]
工程 （i i i ) では、 試料中で沈殿した本発明の粒子 （図 1 ( c ) 参照） が回 収されることによって、 標的物質が試料から分離される又は標的物質が固定され た粒子が得られる。 例えば、 自然沈降に起因して試料の下方領域または容器の底 領域に粒子が沈殿するので、 上澄みが試料の上方領域に形成される。 従って、 か かる上澄みをピぺットなどで吸引除去することによって、 試料中で沈殿した粒子 を回収することができる。 回収された粒子には、 上述したように標的物質が結合 しているので、 粒子の回収によつて標的物質が試料から分離されることになる。 [ 0 0 9 5 ]
用 1ヽられる粒子は粗面化処理が施され、 それによつて面積が増加した粒子表面 に 「標的物質を結合させることが可能な物質または官能基」 がより多く固定化さ れた粒子であるので、 自然沈降に際して 1粒子あたりに結合できる標的物質の量 が大きくなつている。 その結果、 1回の処理操作で、 「より多くの標的物質が試 料から分離される」 又は 「より多くの標的物質が固定された粒子が得られる」 こ とになる。 このことは、 全体の検出量の増大につながり、 検出感度の向上、 簡便 な測定または測定誤差の縮小といつた有利な効果が奏される。
[ 0 0 9 6 ]
このように本発明の方法では、 試料中の標的物質を分離できたり、 あるいは、 標的物質が固定化された粒子を得ることができるので、 それらを応用することに よって、 細胞、 蛋白質、 核酸または化学物質等の種々の標的物質の分析、 抽出、 精製および反応等を行うシステムが可能となる。 より具体的に言うと、 上述のよ うな標的物質の分離、 固定化を行うシステムの構築以外にも、 標的物質の分析、 抽出、 精製または反応などを行うシステムの構築が可能となる。 例えば、 「標的 物質の分析を行うシステム」 では、 チップ内に標的物質と結合可能な抗体を固定 した粒子を装填した形態でチップ内に標的物質を注入することによりチップ内粒 子に標的物質を固定し、 さらに標的物質に結合する酵素、 蛍光色素、 磁性体など を結合させた抗体をマーカーとして標的物質量を吸光、 化学発光、 蛍光、 または 磁気などにより検出することにより、 また、 標的物質が核酸である場合には標的 物質と結合可能な核酸を固定した粒子を装填した形態でチップ内に酵素または蛍 光色素を固定した標的物質を注入することによりチップ内粒子に標的物質を固定 し、 標的物質量を吸光、 化学発光、 蛍光、 または磁気などにより検出することに より標的物質を定量分析または定性分析することができる。 この際、 各反応段階 においてチップ上に複数個ある反応槽のうち同一箇所で実施しても、 別の箇所で 実施してもかまわない。 また、 チップ上に複数個ある反応槽間の移動、 もしくは 各反応槽中での撹拌に重力を用いることが可能である。 また、 「標的物質の抽出 を行うシステム」 または 「標的物質を精製するシステム」 では、 上述した本発明 の方法の工程 ( i i i ) の分離のあとに、 「標的物質を粒子からはずし遊離させ る物質」 を用いる、 または必要な加熱、 冷却などの処理を行うことにより、 標的 物質を抽出または精製することができる。 更に、 「標的物質の反応を行うシステ ム J では、 チップ内に標的物質と結合可能な物質を固定した粒子を装填した形態 でチップ内に標的物質を注入することによりチップ內粒子に標的物質を固定し、 チップ上に複数個ある反応槽の各所において混合、 加熱、 撹拌、 紫外線照射など を行うことで、 標的物質の反応を実施できる。 この際、 チップ上に複数個ある反 応槽間の移動、 もしくは各反応槽中での撹拌に重力を用いることが可能である。 また、 酵素や触媒を粒子に固定して、 重力を利用して反応系に投入することも可 能である。
[ 0 0 9 7 ]
以上、 本発明の実施形態について説明してきたが、 本発明はこれに限定されず、 種々の改変がなされ得ることを当業者は容易に理解されよう。
[ 0 0 9 8 ]
例えば、 （1 ) 標的物質の分離に際して粒子への非特異結合または非特異吸着 をより抑えるために、 （2 ) 粒子の親和性を制御するために、 または （3 ) 官能 基を導入するための基材として用いるために、 ポリエチレングリコール、 ポリビ ニルアルコール、 ポリビュルピロリ ドン、 ポリアクリル酸、 ポリ（ 2 _ェチル- 2 - 才キサゾリン）、 ポリジメチルアクリルアミド、 デキストラン、 プルラン、 ァガ ロース、 セファロース、 アミロース、 セロビオース、 キチン、 キトサン、 多糖、 正常血清、 ゥシ血清アルブミン、 ヒト血清アルブミン、 カゼイン、 脱脂粉乳およ ぴこれらの官能基誘導体から成る群から選択される少なくとも 1種以上の物質を 原料粒子表面に付着させてもよい。 付着方法としては、 特に限定されるものでは なく、 粒子の一般的な被覆法を用いてよい。 例えば、 ポリエチレングリコールを 用いた場合では、 原料粒子の表面には 「標的物質を結合させることが可能な物質 または官能基」 が固定化されていると共に、 力かるポリエチレングリコールが存 在することになる。
[ 0 0 9 9 ]
尚、 上述のような本発明は、 次の態様を包含する：
第 1の態様： 標的物質が結合できる粒子であって、 「標的物質を結合させることが可能な物質または官能基」 が粒子本体表面に固 定化されており、 また
粒子本体表面が粗面化されており、 粒子の比表面積が粒子と同一の粒径および 密度を有する真球粒子の比表面積の 1. 4〜： L 00倍となっていることを特徴と する粒子。
第 2の態様： 上記第 1の態様において、 単位表面積 [c m2 ] あたりの細孔 半径 20 n m以上の積算細孔体積 [cm3 ] の割合が 1 X 10— 6 [cm3 / c m2 ] 以上となるように粒子本体表面が粗面化されていることを特徴とする粒子。 第 3の態様： 上記第 1または第 2の態様において、 密度が 3. 5 g/cm3 〜9. 0 gZcm3であることを特徴とする粒子。
第 4の態様： 上記第 1〜第 3の態様のいずれかにおいて、 粒子本体が貫通孔 を有していないことを特徴とする粒子。
第 5の態様： 上記第 1〜第 4の態様のいずれかにおいて、 粒子の粒径が 1 μ m〜 5 mmであることを特徴とする粒子。
第 6の態様： 上記第 1〜第 5の態様のいずれかにおいて、 粒子本体が、 ジル コエア、 イツトリゥム添加ジルコニァ、 酸化鉄およびアルミナから成る群から選 択される少なくとも 1種以上の材料から形成されていることを特徴とする粒子。 第 7の態様： 上記第 1〜第 6の態様のいずれかにおいて、 磁性を有すること を特徴とする粒子。
第 8の態様、 上記第 7の態様において、 飽和磁化が 0. 5〜85A ' m2 k gであることを特徴とする粒子。
第 9の態様： 上記第 1〜第 8の態様のいずれかにおいて、 粒子本体表面の一 部にポリマーが被着しており、
「標的物質を結合させることが可能な物質または官能基」 が粒子本体またはポ リマーの表面に固定化されていることを特徴とする粒子。
第 10の態様： 上記第 1〜第 8の態様のいずれかにおいて、 粒子本体表面の 全体を包み込むようにポリマーが被覆しており、 「標的物質を結合させることが 可能な物質または官能基」 がポリマー表面に固定化されていることを特徴とする 粒子。 第 1 1の態様： 上記第 9または第 1◦の態様において、 ポリマーが、 ポリス チレン、 ポリ （メタ） アクリル酸、 ポリ （メタ） アタリノレ酸エステル、 ポリビニ ルエーテノレ、 ポリウレタン、 ポリアミド、 ポリ酢酸ビニノレ、 ポリビュルァノレコー ノレ、 ポリアリルァミンおょぴポリエチレンィミンから成る群から選択される少な くとも 1種以上のポリマーであることを特徴とする粒子。
第 1 2の態様： 上記第 9〜第 1 1の態様のいずれかにおいて、 ポリマーが架 橋されていることを特徴とする粒子。
第 1 3の態様： 上記第 9〜第 1 2の態様のいずれかにおいて、 粒子本体表面 および Zまたはポリマー表面の少なくとも一部に珪素含有物質おょぴ Zまたはポ リエチレンダリコールが存在することを特徴とする粒子。
第 1 4の態様： 上記第 1〜第 1 3の態様のいずれかにおいて、 「標的物質を 結合させることが可能な物質」 1S ピオチン、 アビジン、 ストレプトアビジンお ょぴニュートラアビジンから成る群から選択される少なくとも 1種以上の物質で あることを特徴とする粒子。
第 1 5の態様： 上記第 1〜第 1 3の態様のいずれかにおいて、 「標的物質を 結合させることが可能な官能基」 、 カルボキシル基、 水酸基、 エポキシ基、 ト シル基、 スクシンイミド基、 マレイミド基、 チオール基、 チォエーテル基、 ジス ルフィド基、 アルデヒド基、 アジド基、 ヒドラジド基、 一級ァミノ基、 二級アミ ノ基、 三級アミノ基、 イミ ドエステル基、 カルポジイミド基、 イソシァネート基、 ョードアセチル基、 カルポキシノレ基のハロゲン置換体、 および、 二重結合から成 る群から選択される少なくとも 1種以上の官能基であることを特徴とする粒子。 第 1 6の態様： 上記第 1〜第 1 5の態様のいずれかにおいて、 「標的物質を 結合させることが可能な物質または官能基」 と 「標的物質」 との間に働く吸着力 または親和力によって、 標的物質が粒子に結合できることを特徴とする粒子。 第 1 7の態様： 上記第 1 6の態様において、 「標的物質を結合させることが 可能な物質または官能基」 と 「標的物質」 との間に働く親和力が、 静電相互作用、 π— π相互作用、 π—カチオン相互作用、 双極子相互作用、 疎水相互作用、 水素 結合、 配位結合または生化学的相互作用に起因することを特徴とする粒子。
第 1 8の態様： 標的物質が結合できる粒子を製造する方法であって、 (I) 原料粒子と、 塩酸、 硫酸および硝酸から成る群から選択される少なくとも 1種以上の酸性物質とを接触させる工程、 および
(I I) 「標的物質と結合することが可能な物質または官能基」 を原料粒子に固 定化する工程
を含んで成り、
工程 （I) では、 原料粒子の表面を粗面化し、 粒子の比表面積が、 かかる粒子 と同一の粒径および密度を有する真球粒子の比表面積の 1. 4〜： L 00倍となる ように粗面化することを特徴とする方法。
第 19の態様： 上記第 18の態様において、 工程 （I) では、 単位表面積 [ c m2 ] あたりの細孔半径 20n m以上の積算細孔体積 [cm3 ] の割合が 1
X 10— 6 [cm3 /cm2 ] 以上となるように原料粒子を粗面化することを特 徴とする製造方法。
第 20の態様： 上記第 18または第 19の態様において、 工程 （ I ) では、 原料粒子に貫通孔が形成されないように粗面化することを特徴とする製造方法。 第 21の態様： 上記第 18〜第 20の態様のいずれかにおいて、 工程 （ I ) において、 原料粒子と酸性物質とを含んで成る混合液を水熱反応に付すことを特 徴とする製造方法。
第 22の態様： 上記第 18〜第 21の態様のいずれかにおいて、 密度が 3. 5 g/cm3 ~9. O g/cm3の原料粒子を用いることを特徴とする製造方 法。
第 23の態様： 上記第 1〜第 17の態様のいずれかの粒子を用いて、 試料中 から標的物質を分離する又は標的物質を固定した粒子を得る方法であって、 (i) 標的物質を含んで成る試料と粒子とを接触させ、 粒子と標的物質とを結合 させる工程、
(i i) 試料を静置に付して、 試料中で粒子を自然沈降させる工程、 および
(i i i) 試料中で沈殿した粒子を回収することによって、 試料から標的物質を 分離する又は標的物質を固定した粒子を得る工程
を含んで成る方法。 実施例
[0 100]
《粒子の調製》
実施例 1〜 7および比較例 1， 2において粒子を以下のように調製した。
[0 101]
(実施例 1)
ニイミ産業製のィットリゥム添加ジルコユア粒子 p 1を用意した。 かかる粒子 1は、 粒径 23 m, 比表面積 0. 056 m2 / g 密度 6 g/cm3であつ た。 この粒子 P 1を耐圧容器内にて 2 5 V o 1 %硫酸水溶液と混合し、 恒温槽中 で 200°Cで 6時間加熱した。 この後、 洗浄、 乾燥を行った。 この操作により、 粒子の比表面積が 0. 40m2 /gとなった。 カかる粒子の電顕写真を図 2に示 す （図 2 (a) は粒子全体写真であり、 図 2 (b) は粒子の表面拡大写真であ る） 。 この粒子 10 gを純水 25 gに分散させ、 得られる分散液を攪拌しながら、 末端にエポキシ基を有する 3—グリシドキシプロピノレトリメトキシシラン 3 gを 分散液に添加して更に 4時間攪拌した。 次いで、 アセトンで粒子を洗浄した後、 粒子を真空乾燥に付すことによって、 エポキシ基を有するィットリゥム'添加酸化 ジルコニァ粒子を得た。 引き続いて、 得られた粒子 10 Omgに対して、 5mg のァビジンが 1 0 mMP B S溶液 (p H7. 2) 1m lに溶解している水溶液を 供し、 一晩攪拌した。 その後、 10 mM P B S溶液 （ p H 7. 2) および水で粒 子を洗浄した後、 粒子を真空乾燥に付すことによって、 アビジンが固定化された イツトリゥム添加ジルコユア粒子 P 1を得た。 かかる粒子 P 1は粒径 2 3 μπι, 比表面積 0. 4 Om2 /g 密度 6 g/cm3であった。 ここで得られた粒子 P 1の比表面積 0. 40 m2 / gは、 粒径 23 mの平滑な表面を持つ真球粒子と した際の比表面積 （即ち、 粒径 23 μπαおよび密度 6 g/cm3力 得られる比 表面積値 0. 043m2 /g) と比較すると 9· 2倍大きい値であった。 また、 細孔半径 20 n m以上の積算細孔体積は 3. 3 X 10— 3 c m3 gであったの で、 粒子 P 1と同一の粒径および密度を有する真球粒子の単位面積あたりの細孔 半径 20 nm以上の積算細孔体積は 7. 6 X 10— 6 [ c m3ノ c m2 ] となつ た。
[0102]
尚、 上記の実施例には、 エポキシ基を有したシランカップリング剤を用いてい るが、 シランカップリング剤として、 アミノ基、 イソシァネート基、 メルカプト 基、 二重結合を有する官能基などを有したものを用いてもよいことに留意された レ、。
[0103]
(実施例 2)
実施例 1とは硫酸処理を行う条件を 200 °C/ 8時間とした以外は同一である。 得られた粒子 P 2は、 粒径 23 μπι、 比表面積 1. 6m2 Zg、 密度 6 gZcm
3であった。 ここで得られた粒子 P 2の比表面積 1. 6 m2 Z gは、 粒径 23 mの平滑な表面を持つ真球粒子とした際の比表面積 （即ち、 粒径 23 Atmおよび 密度 6 gZcm3から得られる比表面積値 0. 043m2 Zg) と比較すると 3 7倍大きい値であった。
[0104]
また、 細孔半径 20n m以上の積算細孔体積は 8. 3 X 10— 3 cm3 /gで あつたので、 粒子 P 2と同一の粒径および密度を有する真球粒子の単位面積あた りの細孔半径 20n m以上の積算細孔体積は 1. 9X 10— 5 [cm3 /cm 2 ] となった。
[0105]
(実施例 3 )
実施例 1とは硫酸処理を行う条件を 200 °C/ 12時間とした以外は同一であ る。 得られた粒子 P 3は、 粒径 23 μιη、 比表面積 2. 7m2 Zg、 密度 6 gZ cm3であった。 ここで得られた粒子 P 3の比表面積 2. 7m2 Zgは、 粒径 2 3 μΐηの平滑な表面を持つ真球粒子とした際の比表面積 （即ち、 粒径 23 μ mお よび密度 6 g/cm3 カ ら得られる比表面積値 0. 043m2 / g) と比較する と 62倍大きい値であった。
[0106]
また、 細孔半径 20n m以上の積算細孔体積は 2. 6 X 10— 2 cm3 ^で あつたので、 粒子 P 3と同一の粒径および密度を有する真球粒子の単位面積あた りの細孔半径 20 nm以上の積算細孔体積は 6. 0X 10— 5 [cm3 /cm 2 ] となった。
[0107]
(実施例 4)
実施例 1とは硫酸処理を行う条件を 200 °CZ 16時間とした以外は同一であ る。 得られた粒子 P 4は、 粒径 23/zm、 比表面積 3. 9m2 /g 密度 6 gZ cm3であった。 ここで得られた粒子 P 4の比表面積 3. 9 m2 Zgは、 粒径 2 3 / mの平滑な表面を持つ真球粒子とした際の比表面積 （即ち、 粒径 23 /mお よび密度 6 g/cm3から得られる比表面積値 0. 043m2 /g) と比較する と 90倍大きい値であった。
[0108]
また、 細孔半径 20 n m以上の積算細孔体積は 6. 3 X 10~ 2 cm3 Zgで あつたので、 粒子 P 4と同一の粒径および密度を有する真球粒子の単位面積あた りの細孔半径 20 nm以上の積算細孔体積は 1. 4X 10— 4 [cm3 /cm
2 ] となった。
[0109]
(実施例 5)
実施例 1とは硫酸処理を行う条件を 160 °C/ 6時間とした以外は同一である。 得られた粒子 P 5は、 粒径 23 /zm、 比表面積 0. 12 m2 Z g、 密度 6 g c m3であった。 ここで得られた粒子 P 5の比表面積 0. 12m2 Zgは、 粒径 2
3 mの平滑な表面を持つ真球粒子とした際の比表面積 （即ち、 粒径 23 zmお ょぴ密度 6 g/cm3力 ら得られる比表面積値 0. 043m2 /g) と比較する と 2. 8倍大きレヽ値であつた。
[0110]
また、 細孔半径 20n m以上の積算細孔体積は 7. 2X 10— 4 cmS /gで あつたので、 粒子 P 5と同一の粒径および密度を有する真球粒子の単位面積あた りの細孔半径 20 n m以上の積算細孔体積は 1. 7X 10— 6 [cm3 /cm 2 ] となった。 [01 11]
(実施例 6)
実施例 1とは硫酸処理の代わりに 25 V o 1 %硝酸水溶液と混合し、 恒温槽中 で 200 °Cで 4時間加熱した以外は同一である。 得られた粒子 P 6は、 粒径 23 111、 比表面積0. 5 Om2 /g、 密度 6 g/cm3であった。 ここで得られた 粒子 P 6の比表面積 0. 50 m2 Z gは、 粒径 23 mの平滑な表面を持つ真球 粒子とした際の比表面積 （即ち、 粒径 23 zmおよび密度 6 g/cm3から得ら れる比表面積値 0. 043m2 Zg) と比較すると 12倍大きい値であった。
[0112]
また、 細孔半径 20n m以上の積算細孔体積は 4. 1 X 10— 3 cm3 Zgで あつたので、 粒子 P 6と同一の粒径および密度を有する真球粒子の単位面積あた りの細孔半径 20 nm以上の積算細孔体積は 9. 4 X 10" 6 [cm3 /cm 2 ] となった。
[0113]
(実施例 7)
実施例 1とは硫酸処理を行う条件をマイクロ波による加熱で 200 °C/ 2時間 とした以外は同一である。 得られた粒子 P 7は粒径 23 μπι、 比表面積 0. 45 m2 /g、 密度 6 g/cm3であった。 ここで得られた粒子 P 7の比表面積 45 m2 /gは、 粒径 23 /zmの平滑な表面を持つ真球粒子とした際の比表面積 (即ち、 粒径 23 μπιおよび密度 6 g/cm3力 ら得られる比表面積値 0. 04
3m2 Zg) と比較すると 10倍大きい値であった。
[0114]
また、 細孔半径 20n m以上の積算細孔体積は 3. 4X 10— 3 cm3 Zgで あつたので、 粒子 P 7と同一の粒径および密度を有する真球粒子の単位面積あた りの細孔半径 20n m以上の積算細孔体積は 7. 8 X 10— 6 [cm3 /cm 2 ] となった。
[0115]
(比較例 1)
実施例 1とは硫酸処理を行わなかった以外は同一である。 得られた粒子 R 1は、 粒径 23 μπι, 比表面積 0. 056m2 /g、 密度 6 g/cm3であり、 粒径 2 3 μιηの平滑な表面を持つ真球粒子とした際の比表面積 （即ち、 粒径 23 μπιお よび密度 6 g/cm3力 ら得られる比表面積値 0. 043m2 /g) と比較する と 1. 3倍大きい比表面積の値を得ることができた。
[0116]
また、 細孔半径 20n m以上の積算細孔体積は 7. 5 X 10— 5 cm3 / で あつたので、 粒子 R 1と同一の粒径および密度を有する真球粒子の単位面積あた りの細孔半径 20n m以上の積算細孔体積は 1. 7X 10— 7 [cm3 /cm 2 ] となった。 比較例 1における粒子の電蟫写真を図 3に示す （図 3 (a) は粒 子全体写真であり、 図 3 (b) は粒子の表面拡大写真である） 。
[0117]
(比較例 2)
実施例 1とは原料粒子として内部貫通孔を持つ多孔質ジルコユアを用い、 酸処 理工程を実施していない点を除いては同一である。 得られた粒子 R 2は、 粒径 2 5 //m、 比表面積 17. Om2 Zg、 密度 6 g/cm3であり、 粒径 25 /zmの 平滑な表面を持つ真球粒子とした際の比表面積 （即ち、 粒径 25 / mおよび密度 6 gZcm3から得られる比表面積値 0. 040m2 /g) と比較すると 425 倍大き 、比表面積であつた。
[0118]
また、 細孔半径 20n m以上の積算細孔体積は 4. 0X 10— 4 cn^ /gで あつたので、 粒子 R 2と同一の粒径および密度を有する真球粒子の単位面積あた りの細孔半径 20 nm以上の積算細孔体積は 1. 0X 10— 6 [cm3 /cm 2 ] となった。 比較例 2における粒子の電顕写真を図 3に示す （図 6 (a) は粒 子全体写真であり、 図 6 (b) は粒子の表面拡大写真である） 。
[0119]
実施例 1〜7、 比較例 1, 2の処理条件、 測定結果を表 1にまとめた。
Figure imgf000051_0001
[0120]
《 「粗面化状態の確認」 および 「粒子本体構造の確認」 》
上記硫酸処理の前後で粒子の表面状態がどのように変化したのかを画像により 確認した。 図 4 (a) および （b) は、 実施例 1の原料粒子 p i (即ち、 硫酸処 理に付される前の粒子） の表面近傍の粒子断面図を示している。 一方、 図 5
(a) および （b) は、 実施例 1において原料粒子 p 1を上記硫酸処理に付した 後の表面近傍の粒子断面図を示している。 特に粒子表面の近傍がより拡大された 図 4 (b) と図 5 (b) とを比較すると、 上記硫酸処理によって、 粒子表面が凹 凸形状を有するようになり、 粒子表面が粗面化されていることを良く理解できる であろう。
[0121]
ここで、 図 6 (a) および （b) に、 多孔質ジルコユア粒子の表面付近の断面 図を示す。 かかる図面では 「うねるように存在する黒い部分」 が粒子の貫通孔を 表しており、 粒子が多孔質であることが分かる。 これに対して、 実施例 1の原料 粒子を撮影した図 4 (a) および 4 (b) では、 そのような 「うねるように存在 する黒い部分」 が存在せず、 粒子本体が 「貫通孔を有していない」 ことを理解で きるであろう。
[0122]
細孔半径と積算細孔積の関係を示したグラフを図 7〜10に示す。 図 7および 8は 「細孔 」 と 「 100 nm以下の細孔半径の細孔体積を 100 nm側から 積算した積算細孔体積」 との関係を示している。 また、 図 9および 10は 「細孔 半径」 と 「各細孔半径が占める体積」 との関係を示している。 これら 2種は実質 的に同じことを意味している。 実施例 1および 4の粒子は、 比較例 1の粒子と比 ベて積算細孔体積が大きくなつていることが分かる。 また、 比較例 2は、 図 8よ り、 細孔半径 20 nm以下で積算細孔体積が急激に大きくなつており、 20 nm 以下の細孔が極めて多いことが分かるだけでなく、 図 10より細孔の分布が狭い ことも分かる。
[0123]
《標的物質結合特性の確認》 実施例 1で得られた粒子 P 1、 ならびに比較例 1で得られた粒子 R 1、 比較例 2で得られた粒子 R 2を用いて、 粒子の標的物質結合特性を確認した。 標的物質 としては、 ピオチン化 HRPを用いた。 粒子に固定化されているアビジンは、 ビ ォチン化 H R Pと特異的に結合する。
[0124]
ビォチン化 H R Pと粒子との結合能の比較は実施例 1及び比較例 1、 2に対し て、 それぞれ同様の操作を行った。 まず、 1. 5m 1チューブを 3つ用意し、 そ れぞれに適当量 （発色量が 0. 01〜 1. 5になるような量） の粒子を仕込んだ。 濃度 20 n g /m 1のピオチン化 HR Pを 100 μ 1加えた後、 ポルテックスミ キサ一で 30分間攪拌した。 その後、 1 OmMPB S緩衝液 （ρΗ7. 2) 50 0〃 1で、 それぞれのチューブに仕込まれた粒子を 4回洗浄した。 PBS緩衝液 (ρΗ7. 2) を除去した後、 粒子が含まれるそれぞれのチューブに 200 μ 1 の ΤΜΒ (テトラメチルベンジジン） を加えて 30分間静置させることによって、 粒子を発色させた。 次いで、 1 Ν硫酸を 200 μ 1カロえて、 反応を停止させた。 そして、 上澄みを TEC AN社製プレートリーダー I n f i n i t e 200で吸 光度 (450 nm) を測定することによって、 それぞれのチューブに仕込まれた 粒子の吸光度を求めた。 その結果を表 2に示す。 粒子 P 1では 0. 24、 粒子 R 1では 0. 03、 粒子 R2では 0. 06という値が得られた。 これは、 表面積を 増大させることにより、 粒子 P 1は粒子 R 1に比べて、 標的物質の結合能が 8倍 に増加したことを意味する。 一方で、 粒子 R 2は比表面積が実施例 1に比べては るかに大きいにもかかわらず、 吸光度は半分以下となった。 これは、 2が 1 と比べて単位面積あたりの細孔半径 20n m以上の積算細孔体積がおよそ 8分の 1であるため、 「標的物質を結合させることが可能な物質または官能基」 が細孔 を有効に利用できなかったためと考えられる。
[0125] (表 2)
Figure imgf000054_0001
[0126]
《粗面化処理粒子の非特異吸着抑制効果の確認》
本発明の粒子が有する 「非特異吸着抑制効果」 について確認試験を実施した。 具体的には、 「内部貫通孔を持つ多孔質粒子」 に比べて 「粗面化処理された本発 明の粒子」 が非特異吸着の抑制効果をより多く有するものであることを確認する ために、 「粗面化処理粒子 （実施例 1) 」 および 「内部貫通孔を持つ多孔質粒子 (比較例 2) 」 を用い、 それぞれの粒子における 「特異結合能」 および 「非特異 結合能」 を評価した。 尚、 「特異結合能」 とは、 標的物質が粒子に結合する "特 異結合" の結合能を指している一方、 「非特異結合」 とは、 標的物質以外の粒子 が粒子本体に結合する "非特異結合" の結合能を指している。
[0127]
(粒子の調製）
粗面化処理粒子 P 1 (実施例 1) 、 内部貫通孔を持つ多孔質粒子 R 2 (比較例 2) に対してそれぞれ 「末端にエポキシ基を有する 3—グリシドキシプロビルト リメトキシシラン」 を結合させた。 これによつて、 アビジンを粒子に結合させる ことなく、 エポキシ基を粒子最表面に備えたエポキシ体粒子を調製した。 粗面化 処理粒子 P 1 (実施例 1) 力 ら調製されたエポキシ体粒子を S 1と称し、 内部貫 通孔を持つ多孔質粒子 R 2 (比較例 2) 力 ^調製されたエポキシ体粒子を T 2と 称する。
[0128] 「特異結合能」 については、 エポキシ体粒子 （S 1および T2) とアミノ基を 有する JTe x a s Re d (Su l f o r h o d ami n e .l O l c a d a v e r i n e (B i o t i ura製） ) との結合能を評価し、 「非特異結合能」 につ いては、 エポキシ体粒子 （S 1および T2) とアミノ基をもたない T e X a s Re d (Su l f o r h o d ami n e l O lネ F l u o r e s c e n c e R e f e r e n c e S t a n d a r d* (ABD B i o q. u e s t , I n c 製） との結合能を評価した。 カゝかる結合能の評価に際しては、 蛍光顕微鏡で粒子 における T e X a s Re dの蛍光強度を測定し、 かかる蛍光強度から 「粒子表 面に結合した T e X a s Re dの結合量」 を求めた。 具体的に詳述すると次の ようになる。
[0129]
特異結合能の評価に際しては、 エポキシ体粒子 S l、 T 2をそれぞれエツペン チューブに 0. 5mg枰り取り、 Su l f o r h o d am i n e l O l c a d a v e r i n e 0. 5mg /m 1の水溶液をそれぞれ 50 μ 1加え、 1500 r p mで 2時間撹拌した後、 10 mMリン酸緩衝液 (pH7. 2) 100 /z lで
3回それぞれ洗浄することによって得られた粒子を用いた。
[0130]
同様に、 非特異結合能の評価に際しては、 エポキシ体粒子 S l、 T 2をそれぞ れエツペンチューブに 0. 5mg枰り取り、 Su l f o r h o d ami n e l O 1ネ F l u o r e s c e n c e Re i e r e n c e S t a n d a r ds 0.
5mg /m 1の水溶液をそれぞれ 50 μ 1加え、 1500 r p mで 2時間撹拌し た後、 10 mMリン酸緩衝液 (pH7. 2) 100/ 1で 3回それぞれ洗浄する ことによって得られた粒子を用いた。
[0131]
(結合能の評価）
得られた粒子 （S 1および T2) には Te X a s Re dが結合しているので、 それから発せられる蛍光の強度を測定した。 具体的な操作としては、 Te x a s Re d用フィルターセット （ォプトライン製） を取り付けた蛍光顕微鏡を用いて、 粒子に結合した Te x a s Re dから発せられる蛍光を CCDカメラによって撮 影した。 そして、 画像解析ソフト 「Image- Pro Plus (Media Cybernetics, Inc. 製） 」 を用いた画像解析によって蛍光強度値を算出することによって、 それぞれ の粒子に関して、 「アミノ基を有する T e X a s Re d (Su l f o r h o d am i n e 101 c a d a v e r i n e) 」 の結合量 （= "特異結合" の結合 量） を算出すると共に、 「アミノ基をもたない T e X a s Re d (S u 1 f o r h o d ami n e l O l * F l uo r e s c e n c e Re f e r e n c e S t a n d a r d*) の結合量 （= "非特異結合" の結合量） を算出した。
[0132]
なお、 上記結合量の算出においては、 いわゆる検量線法を用いた。 具体的には、 "特異結合" につレヽて ίま S u l f o r h o d am i n e l O l c a d a v e r i n eの濃度を変えた水溶液、 "非特異結合" については S u 1 f o r h o d a m i n e l O l氺 F l u o r e s c e n c e R e f e r e n c e S t a n d a r d*の濃度を変えた水溶液を検量線標準液として調製し、 それらから得られ る検量線に基づいて、 蛍光強度値から結合量を算出した。
[0133]
(結果）
結果を表 3に示す。 表 3は、 "特異結合" の結合量に対する "非特異結合" の 結合量の割合、 即ち、 「非特異結合 Z特異結合の比」 を示している。 「非特異結 合 Z特異結合の比」 がより小さいと、 非特異結合量が特異結合量よりも相対的に 少ないことになるので、 非特異結合の効果がより小さいことが示唆される一方、 「非特異結合 Z特異結合の比」 がより大きいと、 非特異結合量が特異結合量より も相対的に多いことになるので、 非特異結合の効果がより大きいことが示唆され る。 ここで、 粗面化処理粒子 S 1では 「非特異結合 Z特異結合の比」 が 0. 10 となっているのに対して、 内部貫通孔を持つ多孔質粒子 T 2では 「非特異結合/ 特異結合の比」 が 0. 32となっており、 粗面化処理粒子 S 1は多孔質粒子 T 2 よりも非特異結合の効果がより抑制された粒子であることを確認できた。
[0134] (表 3)
Figure imgf000057_0001
産業上の利用の可能性
[0135]
本発明の粒子は、 細胞、 蛋白質、 核酸または化学物質等の標的物質の定量、 分 離、 精製および分析等に利用できる。 例えば、 本発明の粒子は、 DNA等の核酸 を結合させることができ、 結果的に DN Aの解析に用いることができるので、 テ 一ラーメード医療技術にも資するものである。
関連出願の相互参照
[0136]
本出願は、 日本国特許出願第 2008— 158949号 （出願日 ： 2008 年 6月 18日、 発明の名称 「粗面化処理が施された高密度機能性粒子、 その製造 方法およびそれを用いた標的物質の処理方法」 ) に基づくパリ条約上の優先権を 主張する。 当該出願に開示された内容は全て、 この引用により、 本明細書に含ま れるとする。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 標的物質が結合できる粒子であって、
前記標的物質を結合させることが可能な物質または官能基が粒子本体の表面に 固定化されており、 また
前記粒子本体の表面が粗面化されており、 前記粒子の比表面積が前記粒子と同 一の粒径おょぴ密度を有する真球粒子の比表面積の 1. 4〜 100倍となってい ることを特 ί敫とする粒子。
2. 単位表面積 [cm2 ] あたりの細孔半径 20 n m以上の積算細孔体積 [ c m3 ] の割合が 1 X 10— 6 [cm3 /cm2 ] 以上となるように前記粒子本体 の表面が粗面化されていることを特徴とする、 請求項 1に記載の粒子。
3. 前記粒子の密度が 3. 5 g/cm3〜9. 0 gZc m3であることを特徴 とする、 請求項 1に記載の粒子。
4. 粒子本体が貫通孔を有していないことを特 ί敷とする、 請求項 1に記載の粒 子。
5. 前記粒子の粒径が 1 ！!！〜 5 mmであることを特徴とする、 請求項 1に記 載の粒子。
6. 前記粒子本体が、 ジルコユア、 イツトリゥム添加ジルコユア、 酸化鉄およ ぴアルミナから成る群から選択される少なくとも 1種以上の材料から形成されて いることを特徴とする、 請求項 1に記載の粒子。
7. 前記標的物質を結合させることが可能な物質が、 ビォチン、 アビジン、 ス トレプトァビジンおよびニュートラァビジンから成る群から選択される少なくと も 1種以上の物質であることを特徴とする、 請求項 1に記載の粒子。
8 . 前記標的物質を結合させることが可能な官能基力 カルボキシル基、 水酸 基、 エポキシ基、 トシル基、 スクシンイミド基、 マレイミド基、 チオール基、 チ ォエーテノレ基、 ジスルフィド基、 アルデヒド基、 アジド基、 ヒドラジド基、 一級 アミノ基、 二級ァミノ基、 三級ァミノ基、 イミドエステル基、 カルポジィミド基、 イソシァネート基、 ョードアセチル基、 カルボキシル基のハロゲン置換体、 およ ぴ、 二重結合から成る群から選択される少なくとも 1種以上の官能基であること を特徴とする、 請求項 1に記載の粒子。
9 . 前記粒子本体の表面の一部にポリマーが被着しており、
前記標的物質を結合させることが可能な物質または官能基が前記粒子本体また は前記ポリマーの表面に固定化されていることを特徴とする、 請求項 1に記載の 粒子。
1 0. 前記粒子本体の表面全体をポリマーが被覆しており、
前記標的物質を結合させることが可能な物質または官能基が前記ポリマーの表面 に固定化されていることを特徴とする、 請求項 1に記載の粒子。
1 1 . 前記粒子が磁性を有することを特徴とする、 請求項 1に記載の粒子。
1 2 . 前記標的物質を結合させることが可能な物質または官能基と前記標的物 質との間に働く吸着力または親和力によって、 前記標的物質が前記粒子に結合で きることを特徴とする、 請求項 1に記載の粒子。
1 3 . 標的物質が結合できる粒子を製造する方法であって、
( I ) 原料粒子と、 塩酸、 硫酸および硝酸から成る群から選択される少なくとも 1種以上の酸性物質とを接触させる工程、 および
( I I ) 標的物質と結合することが可能な物質または官能基を前記原料粒子に固 定化する工程
を含んで成り、
工程 （I) では、 前記原料粒子の表面を粗面化し、 前記粒子の比表面積が、 前 記粒子と同一の粒径および密度を有する真球粒子の比表面積の 1. 4〜 100倍 となるように粗面化することを特徴とする方法。
14, 工程 （ I ) では、 単位表面積 [cm2 ] あたりの細孔半径 20n m以上 の積算細孔体積 [cm3 ] の割合が 1 X 10— 6 [cm3 /cm2 ] 以上となる ように前記原料粒子を粗面化することを特徴とする、 請求項 13に記載の製造方 法。
15. 工程 （I) において、 前記原料粒子と前記酸性物質とを含んで成る混合 液を水熱反応に付すことを特徴とする、 請求項 13に記載の製造方法。
16. 密度が 3. 5 g/cm3〜9. 0 g / c m3 の前記原料粒子を用い ることを特徴とする、 請求項 13に記載の製造方法。
17. 請求項 1に記載の粒子を用いて、 試料中から標的物質を分離する又は標 的物質を固定した粒子を得る方法であって、
(i) 標的物質を含んで成る試料と前記粒子とを接触させ、 前記粒子と前記標的 物質とを結合させる工程、
(i i) 前記試料を静置に付して、 前記試料中で前記粒子を自然沈降させる工程、 および
(i i i) 前記試料中で沈殿した前記粒子を回収することによって、 前記試料か ら前記標的物質を分離する又は前記標的物質を固定した前記粒子を得る工程 を含んで成る方法。
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