JP2000500063A - 吸着法および分離媒体 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
密度が>1g/cm-3であり、充填剤を取り込んだポリマー基本マトリックスからなるビーズ集合。このビーズは、充填粒子の密度が≧3g/cm-3であり、ビーズの密度および/またはサイズが前以て決定した密度およびサイズ範囲に分布することを特徴とする。特に重要な充填粒子は、丸形、例えば球形、楕円形またはその集塊/凝塊である。ビース集合は、特に流動床、好ましくは安定な膨潤床における吸着法に有益である。
Description
【発明の詳細な説明】
吸着法および分離媒体
技術分野および先行既知技術
本発明は、膨潤/流動床における吸着過程、特にクロマトグラフィーに関する
。最も効果的な床は、沈降力に対して液体を向流させて、沈降ビーズからなる床
を膨潤/流動させて作製する。床が所望の容積になるまで膨潤または流動したら
、サンプルを流動化した流れに導入する。分離すべきサンプルをのせた物質また
は物質群は、そこでビーズに吸着され、床通過時にサンプルに相関して遅延する
。吸着は、マトリックス/ビーズの、分離すべき物質または物質群への結合能に
より達成される。より効率的でない床は、乱流を用いて懸濁性ビーズを撹拌する
ことにより、または機械的な撹拌により作製することができる。この後者の型の
床は、もちろん、クロマトグラフィーではなく、バッチ様吸着法に関する。
本発明の内容において、「ビーズ」なる語は、床を作る粒子の集合を意味する
。ビーズは幾分球形であり得、従って、不規則な形、例えば顆粒形、つぶれた形
なども含み得るが、しかし本発明に関しては、球形または他の丸形が好ましい。
互いに異なるサイズおよび/または密度のビーズを含むビーズ集合を選択し、
膨潤床でこの集合を使用することにより、より大きくより重いビーズが床の下方
にあり、より小さくより軽い粒子が床の上方にある、いわゆる分類床を得ること
が可能である。流動容器の底の液体分布が不均一のとき、ビーズは平衡状態にあ
る。各ビーズは全床の非常に限られた容積内でしか移動せず、これは、ビーズの
逆混合が非常に制限されていることを意味する。これが安定な膨潤床(時に、安
定な流動床と呼ばれる)の特徴であり、流動床の場合には通常である全体的逆混
合と対照的である。効果的にクロマトグラフィーを行うために、逆混合を最小限
に保つことが重要である。多段階吸着、および吸着物質の濃度勾配が床の縦方向
に生じる。床における逆混合はしばしば軸方向分散として測定され、しばしば「
容器分散係数」で表される(Levenspiel、「Chemical Reaction Engineering」第
2版、John Wiley & Sons(1972)参照)。安定な膨潤床では、容器分散係数は好
ましくは≦75×10-3、より好ましくは≦20×10-3である。床の逆混合は
、各容器またはタンクが理論段に相当する連続容器モデルを用いて説明できる(L
evenspiel、「Chemical Reaction engineering」第2版、John Wiley & Sons(1
972)参照)。段数が多いほど、より安定でより効果的な床となる。床の段数は、
容器分散係数に直接相関している。クロマトグラフィー用の膨潤床の段数は、好
ましくは≧5、より好ましくは≧30である。全体的に逆混合した流動床では、
段数は1、すなわち完全なる撹拌である。
床の膨潤化/流動化は、通常、末端にカラムの断面領域を覆う網目構造を有す
るカラムで行うか、または流動を乱さない他の穿孔装置を用いて行う。これ関し
ては、例えば、WO−A−9218237(Pharmacia Biotech AB、Uppsala、Sweden)
参照。
吸着後、直接膨潤床から溶出できる。あるいは、床を静置し、通常、床が膨潤
した方向とは逆に流れる液流により、床から吸着物質を溶出し得る。
通常、水性液体が使用されるが(例えば、水中に溶解した緩衝液)、これは他の
液体の使用を除外するものではない。
膨潤床に関連して、膨潤度H/H0についてしばしば言及される(ここで、Hは
膨潤床の高さであり、H0は沈降床の高さである)。実践的な理由から、最も低い
膨潤度が選択されるが、ビーズは充填したり集塊を形成してはならない。膨潤度
は、通常、2〜10、好ましくは2.4〜3.2の範囲内にあるが、同時に、床は
安定であり、その時々に必要な底の数があることが優先される。
現在、安定な膨潤床のクロマトグラフィー用のシステムおよび/またはマトリ
ックスを供給する業者が少なくとも2つ存在する。Pharmacia Biotech AB(Upps
ala、Sweden)は、充填剤である石英粒子(先が尖ったガラスの破片に似ている
)と共に架橋多糖類(アガロース)のビーズを使用した、ストリームライン(登
録商標)を市販している。ビーズ密度は約1.2であり、サイズは125〜31
5μmの範囲内にある。ストリームライン(登録商標)は、原則的に、イオン交
換クロマトグラフィーに使用されている。WO−A−9218237(Pharmacia Biote
ch
AB)も参照。これには、適切なカラムの構築物が記載されている。他の主要な
業者はBioprocessing Ltd.(Durham、England)であり、この業者の多孔性ガラ
スビーズ(プロセップ(登録商標))は、特に膨潤床のクロマトグラフィーに使用
できる(Beyzavi,et al,Genetic Engineering News、1994年3月1日 17))。この
分野におけるさらに別の業者はSepracorである。
また、特許文献には、不安定な流動床、すなわち、逆混合を小さくし、軸方向
拡散を小さくすることをあまり必要としない床をもつクロマトグラフィー用の類
似のシステムが記載されている。例えば、米国4,976,865(Sanchez,et
al,CNRS)参照。ここでは、セグメント化したカラムの使用を教示し、ビーズは
かなり顕著に各セグメント内を乱流することができる。この別システムにおいて
は、各セグメントにおけるかなり顕著な逆混合により一連のバッチ吸着が行われ
るために、濃度勾配が生じる。
WO-A-9200799(KEM-EN-TEK;Upfront Chromatography)では、流動床の使
用を教示し、これは、注入流を撹拌することにより流れを均一に混合および分布
させ、混合領域の次に非乱流領域がくるように作製している。後に、非乱流領域
は、安定な膨潤床として働くと主張されている。使用する液体よりも重いまたは
軽いビーズを使用しており、流れの方向は、それぞれ、上方向または下方向のい
ずれかであり得る。この後者の刊行物では、結合して、流動床における吸着に使
用できるビーズを生成できる多くの充填剤およびポリマー物質を開示する。
先行の流動床システムに関連した問題点
膨潤および/または流動床における吸着法の場合、全容量および/または漏出
容量が改善されたビーズを使用したいという明確な願望がある。現在の技術で到
達できる以上の流速、例えば、流速1,000cm/時、好ましくは例えば流速1,
500cm/時までといったさらに速い流速を使用したい場合、漏出容量の改善要
求は特に明白となる。上記した、安定な膨潤床と低い膨潤度の必要性以外にまた
、より速く沈降を形成できるビーズの入手が必要である。高度に逆混合した流動
床(不安定)におけるバッチ吸着においては、高密度のビーズもまた望ましい。
なぜなら、この性質の床は吸着過程の終盤により速く沈降するからである。従っ
て、
高密度であるか、または先行既知技術の場合よりも大きいビーズの集合が必要で
ある。同時に、流速の増加は、ほとんどの場合、漏出容量の減少をもたらし、こ
れは次に、関連した過程の高い生産性を打ち消してしまう。これと平行して、漏
出容量が改善されたビーズが必要である。
ストリームライン(登録商標)では、従来、アガロース・マトリックスに石英
粒子を含む充填マトリックスを使用してきた。プロテインAをビーズに結合させ
ると、IgGの全容量が24mg/mlであるゲルを得ることができる。線形流速30
0cm/時における同ゲルの漏出容量(c/c0=0.01、ただしcは溶出液のIgG
濃度であり、c0はアプライした液体中のIgG濃度である)は、ゲル1ml当たり
わずか1mgIgGである。プロセップ(登録商標)(Bioprocessing Ltd.)の場合、
濃度はそれぞれゲル1ml当たり30mgおよび24mgIgGである。この数値は充
填床における研究に関するものであるが、充填剤のあるビーズと無いビーズ間に
おける関係は膨潤床にも当てはめることができる。これにより、充填剤が漏出容
量を減少させることが説明される。多孔性ガラスビーズは全容量に関して高い漏
出容量を付与できるが、充填粒子がガラスに挿入されないので、ガラス自体が付
与する以上に密度は増加し得ない。
本発明の目的
○本発明の第一の目的は、流動床に関与する吸着/脱吸着過程のより迅速な方
法を提供することである。これが特に重要なのは、膨潤床のクロマトグラフィー
である。
○第二の目的は、漏出容量が改善され、安定な膨潤床のクロマトグラフィーに
特に適した充填マトリックスを提供することである。
○第三の目的は、安定な膨潤床のクロマトグラフィーにおいて高収率を可能と
することである。
本発明の記載
今回我々は、いわゆる充填マトリックスを用いることにより、および、形、直
径、密度および質に関して充填剤を最適化することにより、速い流速を使用でき
満足のいく漏出容量を得ることができることを発見した。鋭い先端をもつ不規則
な粒子形の充填物質は、球状顆粒および他の幾分丸い形よりも漏出容量を低下さ
せる。このことは、例えばビーズの孔サイズ、孔容積および直径などの、クロマ
トグラフィーで一般的に受け入れられている他の変数に関しても、充填マトリッ
クスを最適化すべきであるという事実を排除するものではない。例えば、孔サイ
ズの増加は、マトリックスに吸着される物質の拡散および透過を促進することが
知られている。また、ビーズ直径の減少は、ゲル容積単位当たりの開孔数を増加
させ、よって物質のビーズ透過性を亢進する(漏出容量を増加させる)こともま
た知られている。また、孔直径およびビーズ直径に関する最適値は、ビーズに結
合/吸着する物質にも関連する。
本発明の主要な態様は、序論で定義した吸着法に存する。この本発明の態様は
、使用したビーズが、≧3g/cm3、好ましくは≧4g/cm3、およびそれ以上の密度
の顆粒形または粒子形の充填剤を含むことを特徴とする。これまで研究されてき
たこれらの充填剤は、全て密度が<20g/cm3である。このことは、さらに高い
密度、例えば25g/cm3までの密度をもつ、他の有効な充填剤を利用する可能性
を除外するものではない。使用するビーズに適応された条件下で、充填粒子が不
活性であり不溶性であることが重要である。
適当な充填粒子の物質は、しばしば、スチール(例えば、アンバル(登録商標
)
ウム)または他の金属塩(例えば、タングステンカーバイド)のいずれかの形の
重金属である。充填剤はまた金属球(例えば、タンタル)も含み得る。
充填粒子はサイズが異なり得、常に、該粒子のサイズは使用するビーズのサイ
ズよりもずっと小さい。典型的なサイズは1〜70μmであり、15〜50μm範
囲が好ましい。
充填剤を欠く対応するビーズに関して高い漏出容量を保持しようと望むのであ
れば、充填剤の幾何学的形態は非常に重要である。従って、好ましい充填剤形は
球形、楕円形、水滴形、ヌードル形、豆形、およびその集塊/凝塊および不規則
な形を含む他の丸形である。特に好ましくは、連続的に丸い丸形である。
ビーズの充填剤含量は、到達する密度、すなわち使用すると考えられる流速に
より決定する。
安定な膨潤床を使用する場合、ビーズが安定により容易に適当な位置に配置さ
れるように、重くおよび/または大きなビーズの上に軽くおよび/または小さな
ビーズがくるように、好ましくはビーズはサイズおよび/または密度に差がある
。カラムのセグメント形の仕切りは全く必要ない。外部の磁場と組合せて、磁気
充填剤を使用することも必要でない。従って、一定の範囲内のサイズを有するビ
ーズ画分を使用することができる。範囲内の下限部分のビーズの割合は、その上
限部分のビーズよりも多い。
安定な膨潤床を作製するために使用したビーズ集合の典型的な粒子サイズ分布
では、通常、ビーズの95%が、幅が平均ビーズ直径の0.1〜10倍、好まし
くは平均ビーズ直径の0.3〜3倍の範囲内にある。選択すべき正確な粒子サイ
ズ分布は、流速、平均ビーズ直径、ビーズ密度、液体密度等の因子に依存する。
粒子サイズ分布が広すぎると、大量のビーズが水簸および/または沈降する。粒
子サイズ分布が狭すぎると、膨潤床の安定性を打ち消してしまう。このことは、
その集団の個々のビーズが一定の密度範囲内の密度分布を有する場合にのみ、ビ
ーズ集合は単分散できることを意味する。
ビーズの全表面積(外および内表面)および全ビーズ容積の比は、漏出容量に
非常に重要である。より大きな比接触表面積(小さなビーズ)は、より大きな漏
出容量をもたらす。一方、全容量はわずかにしか影響を受けない。ビーズの平均
粒子サイズは、一般的に10〜1,000μmであり、好ましくは50〜700μ
mの範囲内にある。ビーズが膨潤床を作製したカラムから漏れ得ないという事実
から下限を決定する。該範囲内におけるビーズサイズおよび分布の制限範囲の選
択に影響を与える他の因子は、所望の容量およびサンプルから分離すべき物質ま
たは物質群を含む。あまり好ましくはないが、他の方法は一つの同じ床で使用し
たビーズの密度を変化させることである。個々のビーズのサイズおよび密度の両
方が変化するビーズ画分も使用できる。
ビーズの密度(平均密度)は、常に、>1g/cm3、例えば≧1.1g/cm3、例え
ば≧1.2g/cm3およびそれ以上である(流動状態で床を維持するために使用した
緩衝液中で測定)。一つの同じ床で使用するビーズは、好ましくは一般的に同じ
密度を有する。必要な充填剤の量は、使用するポリマー基本マトリックス、およ
び所望の密度から容易に測定できる。
好ましくは、ビーズは開孔をもつ多孔性である。最適の間隙率は、とりわけ吸
着される物質または物質群を基に測定でき、慣用的に計算できる。効果的な吸着
および/または分離を行うために、吸着される物質または物質群のKavは0.4
0〜0.95の範囲内にある。Kavの定義については、L.Hagel「タンパク質精製
、
ishers Inc.ニューヨーク、1989、p.99参照。
ビーズは、通常、充填剤が封入されたポリマー基本マトリックスからなる。基
本マトリックスのポリマーは、疎水性であり得、例えば、スチレン−ジビニルベ
ンゼンコポリマーからなるビーズを、例えば、表面を適当な親水性ポリマー(好
ましくは、ヒドロキシまたはアミノ基を有するポリマー)でコーティングし親水
性とする。また、基本マトリックスは不溶性または可溶性親水性ポリマー、例え
ばアガロース、セルロース、デキストラン、デンプン等からなり、必要であれば
、既知方法で架橋して望ましい有孔度及び安定性をもたせる。本出願時、アガロ
ースは好ましいポリマーであり、これは好ましくは架橋形であった。
ビーズは、しばしば、分離すべき物質または物質群に対して数種の形態の親和
力をもつ。このことは、通常、基本マトリックスは、関与する物質/物質群に親
和性を有する1つ以上の基により置換されていることを意味する。典型的な基と
しては:
1.正に荷電した基(1級、2級、3級または4級アミン基)
2.負に荷電した基(例えば、カルボキシ、ホスホン酸、スルホン酸等)
3.両性基
4.特異的な親和性を有する基(例えば、生物学的親和性基)、例えばIgG
−結合タンパク質(プロテインA、G、L等)とIgG、レクチンと炭水化物、
抗原/ハプテンと抗体、(連鎖球菌)アビジンとビオチン間
5.相補的核酸/オリゴヌクレオチド
6.π電子系を示す基
7.キレート基
8.疎水性基等。
マトリックス自体もまた、吸着する物質または物質群に親和性を有し、この親
和性は、非置換ビーズの床を通過するときの関与物質が遅延することで示される
。これらの基により、本発明の方法は、アフィニティークロマトグラフィー、例
えばイオン交換クロマトグラフィー、生物学的特異的アフィニティークロマトグ
ラフィー、疎水性クロマトグラフィー、「逆相クロマトグラフィー」、キレート
クロマトグラフィー、共有結合クロマトグラフィー等として行うことができる。
本出願の出願日に、IgG−結合タンパク質、例えばプロテインA、G、Hまた
はL(好ましくは組換え技術で産生し、所望によりシステインを含む(例えば、
rProteinA−cys))により置換された上記のビーズの使用は、特にアフィニテ
ィー精製IgG、殊にモノクローナル抗体に適していた。あるいは、吸着は容器
中でバッチ様に行うことができ、粒子を液体流にさらすか、または撹拌すること
で粒子を流動化する。
精製するサンプルは、充填または膨潤床のクロマトグラフィー法、または流動
床のバッチ吸着法において以前に使用されたものと同じ型であり得る。本発明は
、発酵槽および他の細胞培養容器の上清/培養培地の直接処理、特に膨潤床のク
ロマトグラフィー法に適用でき非常に利点がある。
本発明は、種々の分子量およびタイプの化合物の分離に機能する。例としては
、多糖、タンパク質/ポリペプチドおよ核酸および、例えば分子量≧5,000
ダルトンの合成水溶性ポリマーである。本発明に記載のビーズに吸着する物質の
典型的に好ましい分子量は>50,000、好ましくは>100,000である。
通常上限はないが、この工程は、通常、分子量が350,000以下の化合物の
除去に制限される。
ビーズの製造、架橋、結合基の導入、充填剤の添加等は既知方法で行われるが
、ビーズが前記の吸着目的に適していることを確実とする。ビーズは、必要であ
ればふるいにかけ、適当なサイズ画分とする。
関与する親和性基は、適当な親水性基、例えばカルボキシ、アミノ、ヒドロキ
シ等を、適当な二機能性試薬、例えばCNBr、ビセポキシドまたは対応するエ
ピハロヒドリン等で活性化することにより、ビーズに導入し得、次に、関与する
親和性基をもつ化合物と反応させる。
本発明の第二の態様は、吸着法、特にクロマトグラフィー法でマトリックスと
して使用するに適した、前記の膨潤/流動床で使用する上記のビーズ集合(ビー
ズ画分)である。本発明のこの態様は、クロマトグラフィーカラムに配置の、上
記の安定な膨潤床形の集合も含む。本態様は、また、親和性基を欠失するビーズ
集合も含み、前活性形を含む。後者の場合、顧客/使用者は自分で所望の基を導
入することができる。
本発明のこの第二の態様の特に重要な具体例は、IgG結合タンパク質、特に
、ビーズへの結合を仲介するアミノ酸システインを含むIgG結合タンパク質で
置換されたビーズを含む。このタイプのタンパク質は、組換え技術を用いて以前
に産生されていた、例えばプロテインAのシステイン変異体(Ljungquist,et a
l、(Eur.J.Biochem.186(1989)557-561)およびProfy(EP 284,368)、プロテイ
ンGのシステイン変異体(Fahnestock,et al、(米国 4,977,247))である。シス
テイン含有タンパク質であるチオール基を介して固体相に共有結合することが知
られている。また、ある結合法は、チオールを介する、例えば反応性ジスルフィ
ド(例えばピリジルジスルフィド)またはマレイミド基を介する結合に対して高
い選択性を付与することが知られている。他の方法、例えばエポキシまたはエピ
ハロヒドリンを介するものは、反応性が低く、また1級アミン(リシル)を介し
た結合となる。
IgG結合タンパク質、特に組換えプロテインA−cysを用いて、全容量が30
mg IgG/mlゲル以上、例えば40〜60mg IgG/mlゲルであり、漏出容量が2
0mg IgG/mlゲル以上、例えば20〜30mg IgG/mlゲルである、充填マトリ
ックスを作製することに成功した(c/c0=0.01、ただし、cは溶出液のIg
G濃度であり、c0は使用した液体のIgG濃度である)。基本マトリックスは架
橋アガロースからなる。これらの場合には、充填剤は前記の粒子形をもつ。本明
細
書の実験部も参照されたい。
下記の実験部は、本出願の優先権主張時における最も好ましいビーズ集合の製
造を開示する。さらに誘導体化するか、または別の実験で使用する場合、このビ
ーズ集合を標準的ゲルと呼ぶ。
実験部
製造法
使用した充填剤:
量%)C 0.02%、Si 0.41%、Mn 0.31%、P 0.007%、S 0.
001%、Cr 15.5%、Ni 75.0%、Cu 0.02%およびFe 8.68%
をもつクロム−ニッケル合金である。合金の密度は8.4g/cm3である。粒子は球
形であり、2つの直径をもつ調製物を使用した(16〜44μm &<16μm)。○タンタル(Ta)
(Novakemi AB、Enskede、スウェーデン)、これは密度が1
6.5g/cm3であり、焼結球形粒子からなる。直径5〜44μm。○タングステンカーバイド(Ta)(WC)
(AB Sandvik Coromant、ストックホ
ルム、スウェーデン)、これは密度が15.6g/cm3であり、小さな(タンタルに
関連して)焼結球形粒子からなる。2つの調製物を使用した(直径10〜50μm
および<15μm)。○酸化ジルコニウム(ZrO2)
(MEL Chemicals、マンチェスター、イギリス)
、これは密度が5.6g/cm3であり、小さな(タンタルに関連して)焼結球形粒子
からなる。5〜30μmの直径をもつ調製物を使用した。
1.エマルション
工程1.1.乳化反応器でのエチルセルロースの溶解装置
:底が平らで、水浴、電気撹拌機および温度計を備えた円柱ガラス製反応器
2.5l(乳化容器)。方法
:トルエン1050mlを反応器に入れ、その後、撹拌機を作動させ、エチル
セルロース49.5gを「ファイン・ジェット」として添加した。全てのエチルセ
ルロースが溶解するまで(約2時間)、混合物を60℃に加熱した。
工程1.2.アガロースおよび充填剤を含む溶液の調製装置
:底弁(反応器は、その内容物が乳化容器に移すことができるように配置す
る)、撹拌機、循環水および温度計のついたマントルガラス製反応器方法
:蒸留水900mlを反応器に投入した。次いで撹拌機を作動させ、アガロー
ス36gを入れた。アガロースが溶解するまで(約1時間)混合物を95℃に加
熱した。次いで、アンバル(登録商標)を混合物に加え、混合物をさらに15分
間撹拌し、その後、温度を70℃まで下げた。
工程1.3.アガロースおよび充填剤を含む溶液の乳化容器への移し変え方法
:乳化容器における撹拌機のスピードを130r.p.m.に調整し、溶液(70
℃)を乳化容器に移した。
工程1.4.粒子サイズの調整
これは、慣用的に撹拌機のスピードを変化させて行った。目標値
:主要なビース画分のビース直径が80〜160μmであるゲルを所望す
る場合、ビースの95%(容積)が直径<200μm(標準ゲル)となるときに
乳化工程を停止する。主要ビース画分のビース直径が80〜200μmであるも
のを所望する場合、95%のビースが直径<250μmとなるときに乳化工程を
停止する。
工程1.5.冷却冷却
:水浴の加熱を停止した。使用した装置を用いて(実験規模)、浴温度を約7
時間で60から30℃に下げた。
工程1.6.後処理方法
:ビースを、撹拌およびその後99.5%エタノール3lを用いてデカント(
3回)することにより洗浄した。ビースの洗浄は、自己排出によりエタノール2
lで4回ヌッチェ上で続けた。最後にビースを撹拌およびデカントし蒸留水に移
した。
2.架橋装置
:ガラス製反応器、水浴、撹拌機、ガラス製冷却器および温度計。方法
:75%ゲルスラリー100mlおよび硫酸ナトリウム34gを反応器に入れ
、
2時間撹拌し、その後、温度を50℃に上げた。次いで、45%NaOH溶液1m
lおよび水素化ホウ素ナトリウム0.1gを加えた。45%NaOH溶液7ml(10
.5g)およびエピクロロヒドリン7.5mlを、ポンプを用いて、6〜8時間かけ
て同時に加えた。50℃で反応系を撹拌しながら一晩(約16時間)反応させた
。反応完了時に、ゲルを7×150mlの水を用いてスラリー化(洗浄)し、その
後、ゲルを60%酢酸でpH5〜6に酸性とし、湿潤ふるいにかけた(80〜16
0μmまたは80〜200μm)。
3.完成ゲルへのプロテインAの結合
天然プロテインAは、Pharmacia Biotech AB、Sweden製であった。組換えプロ
テインA−cys(rProteinA−cys)は、天然型の4つのIgG−結合ドメイン(
E、D、A、BおよびC)、続くX−ドメインの最初の8つのアミノ酸、続くC
末端の5つのアミノ酸およびシステインの非プロテインA配列を含む(EP28
4,368に記載のように、プロテインA配列は18位のアラニンから316位
のプロリンまでに対応する)。実験方法はProfy T(EP284,268)および
Lungquist,et al(Eur.J.Biochem.186(1989)557-561)により以前記載された
方法と類似であった。rProteinA−cys溶液は還元緩衝液中で貯蔵した。
A.天然タンパク質A N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)との結合
:標準ゲル30mlを蒸留水で
洗浄し、撹拌しながら蒸留水18ml中に溶解したNaOH3.67gと混合し、温
度を24℃に調節した。数分後、混合物を激しく撹拌しながら、エピクロロヒド
リン7.2mlを加えた。2時間後、ゲルを蒸留水300mlを用いてガラスフィル
ター上で洗浄した。次いで、洗浄したゲルを6−アミノカプロン酸(6−ACS
;30ml溶液1M6−ACS、1M NaCl pH11.5)と混合し、混合物を
17〜24時間撹拌し、次いで最後に0.5M NaCl 200mlで洗浄した。次
いで、ゲルを再度洗浄し、2×30mlアセトンで洗浄し、その後、ゲルをアセト
ン15mlと混合し、系を撹拌しながら、NHS559mgおよびジシクロヘキシル
カルボジイミド1007mgを用いて活性化した。31℃で4〜17時間後、ゲル
をアセトン2×30ml+イソプロパノール450mlで洗浄し、氷冷した1mM
HCl 210mlを用いて冷却した。得られた活性化ゲルを、天然プロテインA(
0.2M NaHCO3、1M NaCl pH8)を含む溶液30mlと混合し、室温で
2時間撹拌し、次いでトリス緩衝液pH8、酢酸緩衝液pH3、最後に蒸留水で
洗浄した。
B.rProteinA−cysの結合 1,4−ビス(2,3−エポキシプロポキシ)ブタン(BPRブタン)による活性 化
水抜きしたセファロース(登録商標)FF1l(エピクロロヒドリンで架橋し
たビーズ形のアガロース、Pharmacia Biotech AB、Uppsala、Sweden)を蒸留水
を用いてヌッチェ上で洗浄し、系を撹拌しながら、サーモスタットを備えた反応
容器中で、35℃で、蒸留水300mlに溶解したNaOH55gと混合した。BP
Rブタン390mlを加えた。系を35℃で2時間撹拌し、次いで水15lで洗浄
した。rProteinA−cysの結合
活性化ゲルを窒素ガスで飽和させた0.1M リン酸ナトリウム、1mM EDT
A、pH8.5 3×1l窒素ガスを用いてヌッチェ上で洗浄し、流した。次いで
、ゲルを0.1Mリン酸ナトリウム、1mM EDTA、pH8.5の窒素ガス飽
和水溶液に溶かしたrProteinA−cys5.5gと混合した。窒素ガスを吹き込みな
がら、系を37℃で撹拌した。硫酸ナトリウム(370g)を加えた。系を37
℃で2時間撹拌した後、ゲルを蒸留水3lで洗浄し、裂け目が形成されるまで吸
入乾燥させた。不活性化
:系を撹拌しながら、吸引乾燥ゲルを0.2M重炭酸ナトリウム、0.5
M NaCl、1mM EDTA、pH10 900mlに溶かしたグリセロール100
mlと混合した。系を37℃で一晩撹拌し、その後ゲルを、各サイクル3×1ゲル
容積で3回のサイクルで、0.1Mトリス、0.15M NaCl、pH8および0.
05M酢酸を用いてヌッチェ上でpH洗浄した。最後にゲルを水で洗浄した。
前記の製造条件は、下記の表で開示したように変化させた。
解析法
完成ゲルにおける作用試験
膨張度装置
:ポンプP6000およびカラムXK26/60(Pharmacia Biotech AB、U
ppsala、Sweden)。方法
:完成ゲル約70mlをカラムにつめた。下部のアダプターへの距離が約52
cmとなるように、上部のアダプター(ネットなし)を取り付けた。膨潤度の測定
を望む速度よりも速い約100cm/時の流速で、1時間かけて溶出を行った。溶
出過程の最後に、流速を下げ、膨潤度を測定した。さらに30分後に、ゲル高さ
(H)を読み、ポンプを切った。ゲルが下降し沈降して15分後、ゲル高さ(H0
)を再度読む。ゲル膨潤度はH/H0の関係から決定する。
300cm/時での漏出容量QB(IgGの結合)(c/c0=0.01)。充填床。天然プ
ロテインAおよびrProteinA−cys。装置
機器:2つのP6000ポンプを備えたFPLC(Pharmacia Biotech AB)、U
V−2およびプリンター。
カラム:XK16/20(Pharmacia Biotech AB)。
緩衝液A:20mMリン酸ナトリウム、pH7.0。
緩衝液B:0.1Mグリシン、pH3.0。
タンパク質:hIgG(Pharmacia Biotech AB)
流速:10ml/分→>300cm/時実験方法
:水抜きしたプロテインAゲル25ml(または上記により標準ゲルから
作製したrProteinA−cysゲル)を静置し、カラムに沈降させた。アダプターを
ゲル表面に取り付け、緩衝液Aを含む流れを段階的に10ml/分とし、その後、
アダプターをさらに調整した。次いで、緩衝液A1ml当たりIgG0.5gの流れ
をカラムを通して流した。カラムは初め迂回し、流れは直接UVモニターに運ば
れ、そこで非吸収溶液に対する吸収値(280nm)を測定し(c0)、その後、サ
ンプルと共に流れをカラムを通して通過させた。カラムを通る流れの吸光度(2
80nm)が吸光度c0の1%となる時に、試験を停止し、ゲルを洗浄し、ゲルに
結合したIgGを緩衝液Bで溶出し、0.1Mグリシン、pH2.5、30%イソ
プロパノールおよび20%エタノールで洗浄した。溶出液を回収し、そのIgG
含量を測定し、ゲル1ml当たりの吸収IgG量を得た(c/c0=0.1に対する漏
出容量(QB))。
膨潤床の漏出容量QB(IgG)。
天然プロテインA。装置
:
機器:ポンプP6000、UV−2;280nmおよびプリンター(Pharmacia
Biotech AB)
カラム:XK26/60(Pharmacia Biotech AB)
緩衝液A:20mMリン酸ナトリウム、pH7.0
緩衝液B:0.1Mグリシン、pH3.0
タンパク質:緩衝液A中の0.5mg/ml hIgG(Pharmacia Biotech AB)
流速:300cm/時実験方法
:プロテインAゲル沈降12.8cm(上記に従い標準ゲルから作製)を
400cm/時で水簸し、XK26/60(Pharmacia Biotech AB)で段階的に膨
潤させた。カラムを初めに迂回させ、流度を直接UVモニターに運び、非吸収溶
液の吸光度(280nm)を測定し(c0)、その後サンプルと共に流れをカラムを
通して通過させた。カラムを通る流れの吸光度(280nm)が吸光度c0の1%
となる時に、試験を停止し、ゲルを洗浄し、ゲルに結合したIgGを緩衝液Bで
溶出し、0.1Mグリシン、pH2.5、30%イソプロパノールおよび20%エ
タノールで洗浄した。溶出液を回収し、そのIgG含量を測定し、ゲル1ml当た
りの吸収IgG量を得た(c/c0=0.01に対する漏出容量(QB))。
全容量(IgG)。充填床。天然プロテインAおよびrProteinA−cys装置
:
機器:スーパーループをもつFPLC系(Pharmacia biotech AB)
カラム:1mlハイトラップ(Pharmacia Biotech AB)
緩衝液A:10mMジヒドロリン酸ナトリウム、0.15M塩化ナトリウムお
よび10mm EDTA、pH7.0
緩衝液B:0.5M酢酸(pHが約2.7となる)
IgG溶液:緩衝液A10ml中、hIgG150mg実験方法
:プロテインAゲル(または前記に従い標準ゲルから作製したrプロテ
インA−cysゲル)1.0mlをカラムに充填し、緩衝液Aで平衡化し、その後、I
gG溶液を0.15ml/分の流速でスーパーループを通して輸送した。同じ流速で
緩衝液Aを用いて洗浄した後、吸収IgGを流速0.30ml/分で緩衝液B9mlを
用いて溶出した。溶出液を回収し、その容積を測定した。A280を1:10に希
釈後に読み、全IgG容量(mg(IgG/mlゲル)を溶出容積(ml)×A280(希釈
溶出液)×7.244で決定した。1)アガロース溶液100ml当たりの量;2)タングステンカーバイド;
3)低い乳化率のために、タンパク質Aへ架橋および結合しなかった;
4)酸化ジルコニウム
1)アンバル直径16-44μm;2)アガロース溶液(4%)100mlについて計算した
表中の量
密度は1.6−1.8間で変化する。
膨潤床の安定性の特徴付け
孔面積が全面積の0.3%であるディストリビューターを含むカラム(200m
m、高さ100cm)を15cm(4.7lrProteinA−cysゲル)充填し、これは8
0−160μmの範囲の粒子サイズ分布を有する。ゲルを300cm/時の線形流速
で38cmまで膨潤させた(20mMリン酸ナトリウム、pH7.0)。ディストリ
ビューター付近の圧力降下は100パスカルであった。刺激実験として、0.2
5%アセトン溶液をカラムに陽性段階反応注入した。アセトン溶液100%がカ
ラム出口で検出されたら、陰性段階反応のために、流れを緩衝液に切り替えた。
カラムおよびシステムの段数は、パルス注入で適用した原則と同じようにして陰
性段階反応を基礎として計算した(Chemical Reaction Engineering、第2版、Jo
hn Wiley & Sons(1971))。カラムとシステムの段数は40であった。次いで、シ
ステムの寄与に関する段数補正を行い、その結果、カラムには34個の段があっ
た。これは17×10-3の容器分散係数に相当する。
検討
膨潤度
試験結果により、高速流(>300cm/時)の場合でも、本発明の充填マトリ
ックスは、膨潤床で実践的に使用される範囲内の膨潤度に到達できることが示さ
れ
る。
充填剤
製造条件および結果は、表1から明らかである。使用した充填剤はアンバル(
登録商標)、タンタル、タングステンカーバイド、酸化ジルコニウムおよび石英
であった。種々の充填剤の間に、IgGに結合するゲルの全容量に関して差はな
いように考えられる。漏出容量は使用した充填剤の型およびその直径および形に
より著しく影響を受ける。研究されている充填剤はグループに分類分けすること
ができる:
○グループ1−充填剤ありおよび無しにおけるゲルに関する
およその漏出容量(IgG)
アンバル(登録商標):直径16−20μmの球形粒子
アンバル(登録商標):直径16−44μmの球形粒子
タンタル:直径5−44μm焼結球形粒子
○グループ2−グループ1よりも約25%低い漏出容量(IgG)
アンバル(登録商標):直径<16μm球形粒子
タングステンカーバイド:直径10−50μm焼結小1)球粒子
酸化ジルコニウム:直径5−30μm焼結小1)球粒子
○グループ3−グループ1よりもおよそ70%低い漏出容量(IgG)
タングステンカーバイド:直径<15μm焼結小1)球粒子
石英:直径25μm「つぶれたような粒子」1)
タンタルに関する
等しい直径をもつ充填剤間の比較
○アンバル(登録商標)およびタンタル(5−44μm)により、充填剤を欠失
したゲルと同じ漏出容量(IgG)が得られる。
○タングステン・カーバイド(10−50μm)により、アンバル(登録商標)(1
6−44μm)よりも約30%低い漏出容量(IgG)が得られる。
○タングステン・カーバイド(<15μm)により、アンバル(登録商標)(<16
μm)よりも約50%低い漏出容量(IgG)が得られる。
○石英(<25μm)により、アンバル(登録商標)(<16μm)よりも約75%低
く、タングステン・カーバイドよりも約40%低い漏出容量が得られる。
漏出容量(IgG)に関連した種々の充填剤の有益性は、これを基にアンバル
(登録商標)=タンタル>タングステン・カーバイド>石英としてランク付する
ことができる。もし、漏出容量が単に形により影響を受けると仮定すれば、平滑
な球状表面(アンバル(登録商標))が、小さく球状の焼結粒子(タングステン・
カーバイド)の表面よりも良い。全ての中で最悪なものは不規則な形(「つぶれ
た形)」(石英))である。ストリームライン(登録商標)に存在するマトリック
スに含まれる石英は充填剤として最も適していないことが研究から理解できる。
異なる直径をもつ同じ型の充填剤を比較した場合、以下の事が分かる:
○アンバル(登録商標)−粒子直径が<16μmであるものは、直径が16−4
4μmの粒子よりも約25%漏出容量(IgG)が低い。
○タングステン・カーバイド−粒子直径が<15μmであるものは、粒子サイズ
が10−50μmの粒子よりも約50%漏出容量(IgG)が低い。
従って、粒子直径が<15μmである充填剤は、漏出容量(IgG)を下げる。
粒子サイズ分布が45−105μmの範囲内にあるアンバル(登録商標)と共
に乳化すると大変収率が低かった。なぜなら、充填剤はビーズに取り込まれずに
沈降したからである。
マトリックスに関して行った研究により、製造収率に関する充填粒子の最適直
径は15−40μmであることが示される。
多量の移動、およびその高速流における高漏出容量を達成するために、全体の
システム溶液を考慮しないのであれば、好ましい形式はビーズ直径<80μmの
使用である。発酵槽溶液を通過させながら(粒状の不純物を含む)、床を保持す
るように機能する網を、クロマトグラフィー膨潤床の入口および出口でしばしば
使用する。このことは、現存のストリームライン(登録商標)の場合、直径が5
6μmまでの粒状不純物は通過できることを意味する。最適の容量を得ようと思
うのであれば、好ましくは上限のビーズ直径を、下限のビーズ直径にできるだけ
近づけるべきである。この研究で、上限160−200μmにおいて、高収率お
よび高漏出容量が得られた。上限の最終選択は、基本マトリックスの経費と性能
を上げることにより得た粒子サイズ分布に依存する。
本発明のビーズを含む膨潤床の安定性
試験の結果により、安定床の条件を満たす膨潤床は、経済的に良好に得ること
できることが示された。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.請求項4〜13に記載のビーズ集合をマトリックスとして使用することを 特徴とする、サンプル溶液から、ビーズに親和性を有する1つ以上の物質を分離 するための、充填マトリックスの形のビーズを含む流動床における吸着法。 2.流動床が安定な膨潤床であり、好ましくは容器分散係数が≦75×10-3 であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。 3.分離すべき物質または物質群に親和性を示す基で置換したビーズを使用す ることを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。 4.充填粒子の密度が≧3g/cm-3であることを特徴とする、密度が>1g/cm-3 であり、充填粒子が取り込まれた、ポリマー基本マトリックスからなるビーズ集 合。 5.個々のビーズが、一定の密度範囲内で異なる密度を、および/または一定 のサイズ範囲内で異なるサイズを有することを特徴とする、請求項4に記載のビ ーズ集合。 6.ビーズの平均密度が≧1.2g/cm-3であることを特徴とする、請求項4ま たは5に記載のビーズ集合。 7.ビーズの平均サイズが、10〜1,000μm、好ましくは50〜700μ mであることを特徴とする、請求項4〜6のいずれか1つに記載のビーズ集合。 8.充填剤の粒子サイズが、1〜70μm、好ましくは15〜50μmであるこ とを特徴とする、請求項4〜7のいずれか1つに記載のビーズ集合。 9.充填粒子が丸形であるか、またはそのような形の粒子の集塊/凝塊である ことを特徴とする、請求項4〜8のいずれか1つに記載のビーズ集合。 10.充填粒子が球形または楕円形であることを特徴とする、請求項4〜9の いずれか1つに記載のビーズ集合。 11.充填粒子が、好ましくは重金属塩形、例えばカーバイドまたは酸化物形 、または合金または純金属の形の重金属を含むことを特徴とする、請求項4〜1 0のいずれか1つに記載のビーズ集合。 12.ポリマー基本マトリックスは、多数のヒドロキシ基を含むことを特徴と する、請求項4〜11のいずれか1つに記載のビーズ集合。 13.ビーズが多孔性であることを特徴とする、請求項4〜12のいずれか1 つに記載のビーズ集合。
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