FR2853664A1 - Procede pour cultiver des cellules, supports de culture de cellules et appareil de culture de cellules - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne un procédé de culture de cellules en utilisant une solution de culture et des supports granulaires et en appliquant un champ magnétique à la solution pour l'agiter, les cellules adhérant aux et se développant sur les surfaces des supports.Le support comprend une particule magnétique avec une couche de revêtement de surface. L'invention comprend également un appareil de culture de cellules avec un générateur de champ magnétique.Application : culture de cellules sur des microsupports, avec une agitation plus douce et plus efficace.
Description
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La présente invention concerne un procédé pour cultiver des cellules (procédé de culture de cellules), des supports de culture de cellules et un appareil de culture de cellules.
Ces dernières années, la technologie de culture de cellules est utilisée dans divers domaines industriels et de domaines de recherche tels que le génie génétique de cellules et de tissus, des tests d'innocuité de médicaments, la production de protéines à des fins de traitement ou à des fins de diagnostic et des domaines similaires.
Récemment, afin de cultiver efficacement un grand nombre de cellules dépendant de l'ancrage, la culture de cellules a été effectuée par culture tridimensionnelle à haute densité (culture sur microsupports), au lieu de la culture sur plaque qui est couramment utilisée. Tandis que, dans la culture sur plaque, une fiole de culture est utilisée, dans la culture sur microsupports, un certain nombre de supports en forme de billes servant de tuteurs pour les cellules sont utilisés.
Dans cette culture sur microsupports, divers types de supports de culture de cellules (supports pour culture cellulaire) sont utilisés.
A ce propos, dans cette culture sur microsupports, il est important d'agiter une solution de culture suffisamment au cours du procédé de culture de cellules, afin de mettre en suspension les supports uniformément afin qu'une nutrition puisse être assurée de manière uniforme pour chaque cellule adhérant aux supports.
En conséquence, dans cette culture sur microsupports, une fiole d'agitation centrifuge, comprenant une barre d'agitation équipée d'une ailette, a été utilisée, la fiole d'agitation centrifuge provoquant la rotation de la barre d'agitation pour agiter une solution de culture (voir le brevet japonais mis à l'Inspection Publique n Hei 06-209 761).
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Cependant, dans la culture sur microsupports utilisant une telle fiole d'agitation centrifuge, si la vitesse de rotation de la barre d'agitation est trop grande, il existe le cas où l'ailette et les supports entrent fortement en collision, ce qui fait que les cellules se détachent des supports ou que les cellules sont endommagées. Cela rend impossible la croissance satisfaisante des cellules.
D'autre part, si la vitesse de rotation de la barre d'agitation est trop faible, les supports sont susceptibles de se déposer dans la fiole d'agitation centrifuge, ce qui fait que les supports ne sont pas mis en suspension uniformément dans la solution de culture. Dans un tel cas, la nutrition n'est pas assurée de manière uniforme pour chaque cellule, ce qui fait qu'une vitesse de croissance désirée ne peut être obtenue. Pour ces raisons, il est extrêmement important de soumettre la barre d'agitation à une rotation à une vitesse de rotation appropriée.
Cependant, avec une telle culture sur microsupports utilisant la fiole d'agitation centrifuge, il se pose un problème de grande difficulté de rotation de la barre d'agitation à une vitesse de rotation appropriée. Il existe également un problème de nécessité d'établir les conditions de culture (la vitesse de rotation de la barre d'agitation, et des conditions similaires) en fonction du type de cellules à utiliser, de la forme de la fiole et de facteurs similaires.
En conséquence, un objectif de la présente invention consiste à proposer un procédé pour cultiver des cellules, des supports de culture de cellules et un appareil de culture de cellules permettant d'agiter une solution de culture de manière uniforme et douce.
Afin d'atteindre l'objectif précité, le procédé de culture de cellules comprend les étapes consistant : à préparer une solution de culture de cellules contenant au moins des cellules à cultiver et des supports granulaires de culture de cellules auxquels les cellules sont amenées à
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adhérer et à se développer sur ceux-ci ; et à appliquer un champ magnétique à la solution de culture de cellules de manière à agiter la solution de culture de cellules sous l'effet du champ magnétique, ce qui fait que les cellules adhèrent aux et se développent sur les surfaces des supports de culture de cellules.
Suivant le procédé décrit ci-dessus, il est possible d'agiter la solution de culture de manière uniforme et douce sans détachement des cellules des supports de culture de cellules, ce qui permet aux cellules de croître efficacement.
Dans une forme de réalisation de la présente invention, chacun des supports peut comprendre une particule magnétique ayant une surface et une couche de revêtement qui est fournie pour couvrir au moins une partie de la surface de la particule magnétique de manière à permettre aux cellules d'adhérer à celle-ci, les supports de culture de cellules étant déplacés dans la solution de culture par application du champ magnétique, ce qui agite la solution de culture. Suivant ce procédé, il est possible d'agiter la solution de culture en plaçant seulement les cellules et les supports de culture de cellules dans la solution de culture.
Dans cette forme de réalisation, il est préféré que l'intensité du champ magnétique appliqué à la solution de culture de cellules soit modifiée au cours du temps et/ou la position du champ magnétique appliqué à la solution de culture de cellules soit également modifiée au cours du temps. Cela permet d'agiter la solution de culture de manière plus uniforme et douce.
En outre, dans cette forme de réalisation, il est préféré que la masse volumique des différents supports de culture de cellules soit comprise dans l'intervalle de 0,8 à 2,5 g/cm3. Cela permet d'agiter de manière satisfaisante la solution de culture.
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En outre, dans cette forme de réalisation, il est également préféré que, lorsque le diamètre moyen de particules des supports de culture de cellules est défini par A m et la longueur maximale de la cellule amenée à adhérer au support de culture de cellules est définie par B um, le rapport A/B soit compris dans l'intervalle de 2 à 100. Cela permet d'augmenter suffisamment la surface du support de culture de cellules, comparativement aux dimensions de la cellule, et cela rend aisée l'adhérence des cellules et leur croissance sur les surfaces des supports de culture de cellules.
En outre, dans cette forme de réalisation, il est également préféré que le diamètre moyen de particules des supports de culture de cellules soit compris dans l'intervalle de 50 à 500 um.
En outre, dans cette forme de réalisation, il est également préféré que la couche de revêtement soit constituée principalement d'un composé à base de phosphate de calcium. Puisque le composé à base de phosphate de calcium est biologiquement inerte, il existe une moindre possibilité qu'il détériore les cellules.
Dans ce cas, il est préféré que la couche de revêtement soit formée de fines particules du composé à base de phosphate de calcium, les particules étant partiellement incluses dans une surface incluant et adjacente à la surface de la particule magnétique.
Cela permet de parvenir à une excellente adhérence entre la couche de revêtement et la particule magnétique.
En outre, dans ce cas, la couche de revêtement peut être formée par collision des particules poreuses du composé à base de phosphate de calcium avec la surface de la particule magnétique. Cela permet de former de manière aisée et fiable la couche de revêtement.
En outre, dans cette forme de réalisation, il est préféré que chacune des particules magnétiques soit formée en mélangeant une résine et une matière magnétique. Suivant
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ce procédé, il est possible d'ajuster la densité de la particule magnétique (en conséquence du support de culture de cellules) en choisissant leur rapport de formulation (rapport de mélange) entre la résine et la matière magnétique de manière appropriée. En outre, la forme et les dimensions du support de culture de cellules peuvent également être ajustées aisément.
Dans une autre forme de réalisation de la présente invention, la solution de culture peut contenir en outre des particules magnétiques, et les particules magnétiques sont déplacées dans la solution de culture par application du champ magnétique, ce qui agite la solution de culture.
Suivant ce procédé, il est possible d'agiter la solution de culture uniformément et doucement en ajoutant simplement les particules magnétiques à la solution de culture, en plus des cellules et des supports de culture de cellules.
Dans cette forme de réalisation, il est également préféré que l'intensité du champ magnétique appliqué à la solution de culture de cellules soit modifiée au cours du temps et/ou la position du champ magnétique appliqué à la solution de culture de cellules soit modifiée au cours du temps.
En outre, dans cette forme de réalisation, il est préféré que chacun des supports de culture de cellules comprenne un corps de base constitué d'une résine et ayant une surface et une couche de revêtement qui est prévue pour couvrir au moins une partie de la surface du corps de base de telle sorte que les cellules puissent y adhérer.
Dans ce cas, il est préféré que la couche de revêtement soit constituée principalement d'un composé à base de phosphate de calcium.
En outre, dans ce cas, il est également préféré que la couche de revêtement soit formée de fines particules du composé à base de phosphate de calcium, les particules étant partiellement incluses dans une surface incluant et adjacente à la surface du corps de base.
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En outre, dans ce cas, il est préféré que les particules du composé à base de phosphate de calcium soient formées de particules poreuses, et la couche de revêtement soit formée par collision des particules poreuses avec la surface de la particule magnétique.
En outre, dans ce cas, il est également préféré que la masse volumique des différents supports de culture de cellules soit comprise dans l'intervalle de 0,8 à 1,4 g/cm3.
En outre, dans cette forme de réalisation, il est également préféré que, lorsque le diamètre moyen de particules des supports de culture de cellules est défini par A m et la longueur maximale de la cellule qui est amenée à adhérer aux supports de culture de cellules est définie par B um, le rapport de A/B soit compris dans l'intervalle de 2 à 100.
Dans ce cas, il est également préféré que, lorsque le diamètre moyen de particules des supports de culture de cellules est défini par A um et le diamètre moyen de particules des particules magnétiques est défini par C m, le rapport de C/A soit compris dans l'intervalle de 0,02 à 10.
En outre, dans ce cas, il est également préféré que le diamètre moyen de particules des supports de culture de cellules soit compris dans l'intervalle de 50 à 500 m.
En outre, dans cette forme de réalisation, il est préféré que chacune des particules magnétiques soit formée en mélangeant une résine et une matière magnétique.
En outre, dans cette forme de réalisation, il est également préféré que la masse volumique des différentes particules magnétiques soit comprise dans l'intervalle de 0,8 à 2, 5 g/cm3.
En outre, il est également préféré que le diamètre moyen de particules des particules magnétiques soit compris dans l'intervalle de 10 à 500 um.
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Dans une modification de cette forme de réalisation, chacune des particules magnétiques peut comprendre en outre une couche de revêtement qui couvre au moins une partie de la surface de la poudre magnétique de telle sorte que les cellules puissent adhérer à celle-ci.
Dans ce cas, il est préféré que la couche de revêtement soit constituée principalement d'un composé à base de phosphate de calcium.
En outre, il est également préféré que la couche de revêtement soit formée de fines particules du composé à base de phosphate de calcium, les particules étant partiellement incluses dans une surface incluant et adjacente à la surface de la particule magnétique.
Dans ce cas, il est préféré que les particules du composé à base de phosphate de calcium soient formées de particules poreuses, et la couche de revêtement soit formée par collision des particules poreuses avec la surface de la particule magnétique.
En outre, dans cette forme de réalisation, il est préféré que le rapport de mélange des particules magnétiques et des supports de culture de cellules soit compris dans l'intervalle de 10 :90 50 :50, rapport en volume.
Un autre aspect de la présente invention concerne des supports de culture de cellules auxquels des cellules sont amenées à adhérer à leurs surfaces et y croître, chacun des supports comprenant une particule magnétique ayant une surface, et une couche de revêtement qui est fournie pour couvrir au moins une partie de la surface de la particule magnétique de telle sorte que les cellules puissent y adhérer.
Dans les supports de culture de cellules, il est préféré que la masse volumique du support soit comprise dans l'intervalle de 0,8 à 1,4 g/cm3.
En outre, il est également préféré que, lorsque le diamètre moyen de particules des supports de culture de
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cellules est défini par A um et la longueur maximale de la cellule qui est amenée à adhérer aux supports de culture de cellules est définie par B pm, le rapport A/B soit compris dans l'intervalle de 2 à 100.
Dans ce cas, il est préféré que le diamètre de particules des supports de culture de cellules soit compris dans l'intervalle de 50 à 500 m.
En outre, dans les supports de culture de cellules, il est préféré que la couche de revêtement soit constituée principalement d'un composé à base de phosphate de calcium.
Dans ce cas, il est préféré que la couche de revêtement soit formée de fines particules du composé à base de phosphate de calcium, les fines particules étant partiellement incluses dans la particule magnétique à proximité de sa surface.
En outre, il est également préféré que les fines particules du composé à base de phosphate de calcium soient formées de particules poreuses et la couche de revêtement soit formée par collision des particules poreuses avec la surface de la particule magnétique.
En outre, il est également préféré que les particules magnétiques soient formées en mélangeant une résine et une matière magnétique.
Un aspect supplémentaire de la présente invention concerne un appareil de culture de cellules. L'appareil de culture de cellules comprend un récipient de culture de cellules pour stocker une solution de culture de cellules contenant au moins des cellules à cultiver et des supports granulaires de culture de cellules auxquelles les cellules sont amenées à adhérer et à se développer en surface, et au moins un générateur de champ magnétique pour appliquer un champ magnétique à la solution de culture afin d'agiter la solution de culture sous l'effet du champ magnétique.
Au moyen de l'appareil de culture de cellules décrit ci-dessus, il est possible d'agiter la solution de culture de manière uniforme et douce sans détacher les cellules des
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supports de culture de cellules, ce qui permet aux cellules de croître efficacement.
Dans cet appareil de culture de cellules de la présente invention, il est préféré que chacun des supports comprenne une particule magnétique ayant une surface et une couche de revêtement qui est fournie pour couvrir au moins une partie de la surface de la particule magnétique de telle sorte que les cellules puissent y adhérer, les supports de culture de cellules étant déplacés dans la solution de culture par application du champ magnétique, en agitant ainsi la solution de culture.
En outre, il est également préféré que la solution de culture contienne en outre des particules magnétiques, et les particules magnétiques soient déplacées dans la solution de culture par application du champ magnétique, en agitant ainsi la solution de culture.
Dans l'appareil de culture de cellules de la présente invention, le générateur de champ magnétique est construit de telle sorte que l'intensité du champ magnétique engendré soit modifiée au cours du temps, et/ou le générateur de champ magnétique est construit de telle sorte que la position du champ magnétique engendré soit modifiée au cours du temps. Cela permet d'agiter la solution de culture de manière plus uniforme et douce.
Dans l'appareil de culture de cellules, il est également préféré que le générateur de champ magnétique soit disposé autour de la périphérie extérieure du récipient de culture de cellules. En outre, il est également préféré que le générateur de champ magnétique soit fourni de manière à venir en contact avec la solution de culture. De plus, il est également préféré que le générateur de champ magnétique soit disposé à proximité de la surface du liquide de la solution de culture présente dans le récipient de culture de cellules. Ces configurations permettent de déplacer le support de culture de cellules ou les particules magnétiques largement dans le
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sens ascendant et le sens descendant de la solution de culture, ce qui permet d'agiter la solution de culture plus uniformément.
En outre, dans l'appareil de culture de cellules de la présente invention, il est également préféré que ledit au moins un générateur de champ magnétique comprenne deux ou plus de deux générateurs de champ magnétique. Cela permet aux supports de culture de cellules ou aux particules magnétiques de se déplacer dans la solution de culture suivant des motifs désirés et complexes.
Ces objectifs, structures et résultats, parmi d'autres, de la présente invention apparaîtront plus nettement en prenant en considération la description détaillée suivante des formes de réalisation préférées, conjointement avec les dessins annexés.
La figure 1 est une vue en coupe transversale d'un support de culture de cellules utilisé dans un procédé de culture de cellules d'une première forme de réalisation de la présente invention.
La figure 2 est une vue en coupe transversale d'un support de culture de cellules utilisé dans un procédé de culture de cellules d'une deuxième forme de réalisation de la présente invention.
La figure 3 est une vue en coupe transversale d'une particule magnétique utilisée dans le procédé de culture de cellules de la deuxième forme de réalisation.
La figure 4 est une vue en coupe transversale d'une modification de la particule magnétique utilisée dans le procédé de culture de cellules de la deuxième forme de réalisation.
La figure 5 est une vue schématique en perspective d'un appareil de culture de cellules d'une première forme de réalisation de la présente invention.
La figure 6 est un chronogramme qui représente les motif s d'un champ magnétique engendré par un générateur de
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champ magnétique de l'appareil de culture de cellules de la première forme de réalisation.
La figure 7 est une vue schématique en perspective d'un appareil de culture de cellules d'une deuxième forme de réalisation de la présente invention.
La figure 8 est une vue schématique en perspective d'un appareil de culture de cellules d'une troisième forme de réalisation de la présente invention.
La figure 9 est un chronogramme qui représente les motifs d'un champ magnétique engendré par un générateur de champ magnétique de l'appareil de culture de cellules de la troisième forme de réalisation.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La présente invention est appliquée à une culture par agitation centrifuge dans laquelle des cellules sont amenées à se développer à l'état de suspension dans une solution de culture (milieu liquide), la solution de culture étant agitée.
La présente invention est appliquée à une culture par agitation centrifuge dans laquelle des cellules sont amenées à se développer à l'état de suspension dans une solution de culture (milieu liquide), la solution de culture étant agitée.
Dans une telle culture par agitation centrifuge, en particulier dans le cas où des cellules dépendant de l'ancrage sont cultivées, les cellules et les supports de culture de cellules (supports pour la culture cellulaire) sont mis en suspension dans une solution de culture et les cellules sont amenées à croître à l'état d'adhérence des cellules aux surfaces des supports.
Un procédé de culture de cellules utilisant ces supports de culture de cellules est désigné en particulier sous le nom de cultures sur microsupports, et la présente invention peut être utilisée convenablement pour la culture sur microsupports.
Ci-après, un procédé de culture de cellules (procédé pour cultiver des cellules), des supports de culture de cellules et un appareil de culture de cellules conformes à la présente invention sont décrits sur la base de formes de réalisation préférées dans lesquelles la présente invention
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est appliquée à la culture sur microsupports de la manière décrite ci-dessus.
Tout d'abord, un procédé de culture de cellules suivant une première forme de réalisation de la présente invention est décrit. La caractéristique de la première forme de réalisation de la présente invention concerne un procédé de culture de cellules qui comprend les étapes consistant à préparer une solution de culture de cellules contenant des cellules devant être cultivées et des supports granulaires de culture de cellules comprenant des particules magnétiques ; et à appliquer un champ magnétique à la solution de culture de cellules de manière à déplacer les supports de culture de cellules dans la solution de culture de cellules pour agiter la solution de culture de cellules sous l'effet du champ magnétique appliqué, les cellules adhérant ainsi aux surfaces des supports de culture de cellules et se développant sur ces surfaces.
De la manière décrite ci-dessus, dans ce procédé, les supports de culture de cellules qui sont réactifs avec le champ magnétique sont utilisés. La figure 1 représente une coupe transversale d'un de ces supports de culture de cellules.
Comme le montre la figure 1, un support de culture de cellules 1 est constitué d'une particule magnétique 2 et d'une couche de revêtement 3 qui couvre une surface de la particule magnétique 2 de telle sorte que les cellules puissent y adhérer. Le support de culture de cellules 1 est déplacé dans une solution de culture lorsqu'un champ magnétique y appliqué, ce qui agite la solution de culture de manière uniforme et douce. En conséquence, les cellules sont amenées aisément à adhérer à la surface de chaque support de culture de cellules 1 et la nutrition de chaque cellule est assurée de manière égale. En conséquence, ce support de culture de cellules 1 sert de tuteur efficace pour permettre aux cellules de croître.
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En outre, suivant le procédé de la présente invention, il est possible d'empêcher de soumettre à un choc mécanique les supports de culture de cellules 1, choc qui serait généré dans le procédé classique utilisant une fiole d'agitation centrifuge en raison de la collision d'une ailette et des supports de culture de cellules, ce qui permet ainsi d'éviter aux cellules adhérant aux supports de culture de cellules 1 d'être détachées de leur surface et ce qui permet également d'éviter de détériorer les cellules.
La particule magnétique 2 est une partie qui constitue une base de chaque support de culture de cellules 1. La particule magnétique 2 peut être formée d'une matière magnétique, mais il est préféré que la particule magnétique soit formée d'une matière composite qui est obtenue en mélangeant une résine et une matière magnétique. Suivant cette structure, il est possible d'ajuster la densité de la matière magnétique (c'est-à-dire de chaque support de culture de cellules 1) aisément en choisissant un rapport de formulation (rapport de mélange) de la résine et de la matière magnétique de manière appropriée. En outre, il existe un autre avantage consistant en la possibilité d'ajuster aisément la forme et les dimensions (dimension moyenne de particules, ou analogues) des supports de culture de cellules 1.
En ce qui concerne la structure de la particule magnétique 2 (particule composite), il est préféré que, comme le montre la figure 1, une matière magnétique (poudre magnétique 22) soit dispersée dans une matière de base 21 qui est constituée principalement de la résine. Une telle particule magnétique 2 peut être produite relativement aisément par moulage ou granulation d'une résine à l'état fondu, à laquelle la matière magnétique a été mélangée. A cet égard, il faut noter que, dans cette particule magnétique 2 sous forme de particule composite, la matière
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magnétique peut être dispersée seulement dans une partie de la matière de base 21 qui est à proximité de sa surface.
Des exemples de matières magnétiques 22 comprennent un alliage ferromagnétique contenant de l'oxyde de fer, Fe, Ni, Co, etc., comme constituant principal, un ferrite, un ferrite de baryum, un ferrite de strontium, etc. Ces matières magnétiques peuvent être utilisées seules ou sous forme d'une association de deux ou plus de deux.
En ce qui concerne la résine, il est possible d'utiliser diverses résines thermodurcissables et diverses résines thermoplastiques. Des exemples de résines thermoplastiques comprennent un polyamide, un polyéthylène, un polypropylène, un polystyrène, un polyimide, une résine acrylique et un polyuréthanne thermoplastique. En outre, des exemples de résines thermodurcissables comprennent une résine époxy, une résine phénolique, une résine de mélamine, une résine d'urée, un polyester insaturé, une résine alkyde, un polyuréthanne thermodurcissable et l'ébonite. Ces résines peuvent être utilisées seules ou sous forme d'une association de deux ou plus de deux.
En outre, la résine peut être colorée avec des pigments organiques, des pigments inorganiques, des colorants acides, des colorants basiques, etc.
La couche de revêtement 3 est formée d'une matière à laquelle les cellules peuvent adhérer. En ce qui concerne cette matière, un polystyrène, un polyacrylamide, la cellulose, le dextrane et des matières similaires peuvent être mentionnées. Cependant, une matière contenant un composé à base de phosphate de calcium comme constituant principal est particulièrement préférable. Cela est dû au fait que le composé à base de phosphate de calcium est biologiquement inerte et, ainsi, il existe une moindre possibilité qu'il détériore les cellules.
En particulier, lorsque la couche de revêtement 3 est formée en utilisant le composé à base de phosphate de calcium comme matière principale, la couche de revêtement 3
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capture les ions métalliques engendrés par la matière magnétique 22, ce qui empêche l'élution des ions métalliques dans une solution de culture. Cela permet d'éviter un effet néfaste sur les cellules. Dans ce cas, la couche de revêtement 3 joue le rôle de couche de barrière aux ions.
Le composé à base de phosphate de calcium n'est pas particulièrement limité et divers composés ayant un rapport Ca/P de 1,0 à 2,0 peuvent être utilisés. Des exemples de tels composés comprennent Calo(P04) 6(OH)2, Calo (P04) 6F2, Calo (P04) 6C12, Ca3 (P04) 2, Ca2P207, Ca (P03)2 et CaHP04 . Ces composés peuvent être utilisés seuls ou sous forme d'une association de deux ou plus de deux.
Parmi ces composés, comme composés à base de phosphate de calcium, un composé contenant de l'hydroxyapatite (Ca10 (PO4) 6 (OH) 2) comme constituant principal convient le mieux. L'hydroxy-apatite est utilisée comme biomatériau et, ainsi, les cellules peuvent y adhérer de manière extrêmement efficace et il existe une possibilité particulièrement réduite de détérioration des cellules.
En outre, dans le cas où de la fluoroapatite (Ca10 (PO4) 6F2) est utilisée, il est préférable que la teneur en fluor du composé total à base de phosphate de calcium soit égale ou inférieure à 5 % en poids. En fixant la teneur en fluor du composé total à base de phosphate de calcium à une valeur égale ou inférieure à 5 % en poids, il est possible d'éviter ou de réduire au minimum l'élution du fluor de la couche de revêtement 3 (c'est-à-dire du support de culture de cellules 1). En conséquence, la détérioration des cellules peut être supprimée ou réduite au minimum et, en résultat, il est possible d'empêcher une réduction de l'efficacité de croissance des cellules.
Ces composés à base de phosphate de calcium peuvent être synthétisés par un procédé connu de synthèse à l'état humide, un procédé connu de synthèse à l'état sec ou un procédé similaire. Dans ce cas, le composé résultant à base
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de phosphate de calcium peut contenir une substance restant en résultat de la synthèse (une matière première ou une matière similaire) et/ou un produit de réaction secondaire formé au cours de la synthèse.
Dans le cas où la couche de revêtement est formée principalement du composé à base de phosphate de calcium, la couche de revêtement 3 peut être formée en amenant le composé à base de phosphate de calcium à être adsorbé à la surface de la particule magnétique 2. Cependant, il est préféré que, comme le montre la figure 1, la couche de revêtement 3 soit formée de fines particules 31 du composé à base de phosphate de calcium (appelées simplement ciaprès "particules 31") qui sont partiellement incluses dans une surface incluant et adjacente à la surface de la particule magnétique 2. Cela assure une excellente adhérence entre la couche de revêtement 3 et la particule magnétique 2, en empêchant ainsi convenablement le détachement de la couche de revêtement 3 de la surface de la particule magnétique 2. A ce propos, il est possible de fournir un support de culture de cellules 1 ayant une résistance mécanique suffisante.
Dans un tel cas, la couche de revêtement 3 peut être formée, par exemple, par collision de particules poreuses formées principalement du composé à base de phosphate de calcium (désignées simplement ci-après sous le nom de "particules poreuses") contre la surface de la particule magnétique 2. Suivant ce procédé, il est possible de former de manière aisée et fiable la couche de revêtement 3.
Par collision des particules poreuses contre la surface de la particule magnétique 2, ces particules sont dissociées en fines particules 31 ayant un diamètre de particules extrêmement petit lors de la collision contre la particule magnétique 2, et certaines des particules 31 sont incluses partiellement dans la particule magnétique 2.
Lorsque les particules 31 sont incluses partiellement dans la particule magnétique 2, la particule magnétique 2
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capture les particules 31 sous l'action de sa force élastique, en fixant ainsi les particules 31 sur la surface de la particule magnétique 2.
Les particules poreuses sont de préférence produites par agglomération de particules primaires du composé à base de phosphate de calcium. En utilisant de telles particules poreuses, il est possible de revêtir de manière plus fiable la surface de la particule magnétique 2 car ces particules poreuses sont fragmentées plus efficacement lors de la collision contre la particule magnétique 2.
Le diamètre moyen de particules des particules poreuses n'est pas limité à une quelconque valeur spécifique mais est de préférence égal ou inférieur à 100 um. Si le diamètre moyen de particules des particules poreuses est supérieur à 100 um, il existe un cas où la vitesse de la particule poreuse lors de la collision contre la particule magnétique 2 devient trop faible, ce qui fait que la particule poreuse n'est pas fragmentée efficacement.
Une collision entre les particules magnétiques 2 et les particules poreuses peut être réalisée, par exemple, en utilisant une machine d'hybridation disponible dans le commerce, à l'état sec. Dans un tel cas, la collision est réalisée dans des conditions consistant en le rapport de mélange entre les particules magnétiques 2 et les particules poreuses compris dans l'intervalle d'environ 400 :1 à 50 :1, rapport pondéral, et en la température à l'intérieur de l'appareil égale ou inférieure à la température de ramollissement de la résine qui est utilisée comme matière principale de la particule magnétique 2 (habituellement égale ou inférieure à 80 C), par exemple.
De telles particules poreuses peuvent être produites, par exemple, d'une manière connue suivante.
Plus précisément, les particules poreuses peuvent être produites en séchant directement par pulvérisation une suspension contenant des particules cristallines (particules primaires) d'un composé à base de phosphate de
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calcium synthétisé par un procédé connu à l'état humide, pour obtenir des particules secondaires granulées. En variante, ces particules secondaires peuvent être obtenues en ajoutant un additif tel qu'un agent d'ajustement de viscosité, des particules d'un composé organique ou des fibres qui peuvent être produites par évaporation par chauffage, ou par un moyen similaire, à la suspension, puis en séchant par pulvérisation la suspension. Il faut noter que les particules secondaires obtenues peuvent être frittées si nécessaire.
Puisque les particules secondaires obtenues sont poreuses, ces particules secondaires peuvent être utilisées directement dans la formation de la couche de revêtement 3.
Dans le cas où des particules poreuses ayant une plus forte porosité sont préférables, ces particules poreuses peuvent être produites, par exemple, de la manière suivante.
Tout d'abord, une suspension dans laquelle les particules secondaires décrites ci-dessus sont mises en suspension est préparée et la suspension est transformée en un bloc par moulage à l'état humide, compression à sec, etc. A cet égard, il faut noter qu'un composé organique qui peut être évaporé dans le procédé de frittage suivant pour produire des pores peut être ajouté à la suspension. Le diamètre des pores peut être régulé en ajustant des conditions telles que la température de frittage et des conditions similaires au lieu de l'addition d'un tel composé organique. Puis, le bloc ainsi obtenu est fritté à une température comprise dans l'intervalle de 400 à 1300 C.
Si la température de frittage est inférieure à 400 C, il existe un risque que le composé organique ne soit pas totalement évaporé ou que le bloc ne soit pas fritté de manière satisfaisante. D'autre part, si le frittage est effectué à une température élevée supérieure à 1300 C, il existe un risque que le corps fritté résultant devienne
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excessivement dense ou que le composé à base de phosphate de calcium soit décomposé.
Puis le bloc ainsi fritté est broyé et ensuite calibré pour obtenir des particules ayant un diamètre de particules désiré.
Le diamètre des pores dans la particule poreuse peut être ajusté, par exemple, en choisissant de manière appropriée le diamètre de la particule primaire, la viscosité de la suspension, le type d'additif, etc.
La particule poreuse ainsi obtenue a de préférence une surface spécifique égale ou supérieure à 10 m2 / g et un diamètre des pores d'environ 500 à 1000 . Un support de culture de cellules 1 produit en utilisant des particules poreuses satisfaisant ces impératifs permet aux cellules d'adhérer à sa surface et y croître plus efficacement.
Il faut noter qu'un procédé pour former la couche de revêtement 3 (un procédé pour la production du support de culture de cellules 1) n'est pas limité au procédé décrit ci-dessus.
En outre, la couche de revêtement 3 peut être dense ou poreuse.
De plus, l'épaisseur moyenne de la couche de revêtement 3 n'est pas limitée à une quelconque valeur spécifique mais est comprise avantageusement dans l'intervalle d'environ 0,1 à 5 um, plus avantageusement dans l'intervalle d'environ 0,5 à 2 m. Si l'épaisseur moyenne de la couche de revêtement 3 est inférieure à la valeur limite inférieure ci-dessus, il existe un risque qu'une partie de la surface de la particule magnétique 2 soit exposée dans le support de culture de cellules 1.
D'autre part, si l'épaisseur moyenne de la couche de revêtement 3 dépasse la valeur limite supérieure précitée, il devient difficile d'ajuster la densité du support de culture de cellules 1.
Dans ce cas, il est préféré qu'un tel support de culture de cellules 1 puisse être aisément déplacé dans une
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solution de culture lorsqu'un champ magnétique est appliqué et puisse être sédimenté ou précipité dans la solution de culture lors de la suppression du champ magnétique. En utilisant un tel support de culture de cellules 1, il est possible d'agiter de manière aisée et fiable la solution de culture.
De ce point de vue, il est préféré que la masse volumique de chaque support de culture de cellules 1 soit comprise dans l'intervalle d'environ 0,8 à 2,5 g/cm3, plus avantageusement dans l'intervalle d'environ 1,0 à 1,2 g/cm3. Si la masse volumique des supports de culture de cellules 1 est trop faible, il est difficile de sédimenter les supports de culture de cellules 1 dans la solution de culture lors de la suppression du champ magnétique. D'autre part, si la masse volumique des supports de culture de cellules 1 est trop grande, il est nécessaire d'appliquer un champ magnétique plus intense pour déplacer le support de culture de cellules 1 dans la solution de culture. Dans tous les cas, il existe un risque que la solution de culture ne puisse être agitée suffisamment.
Les dimensions du support de culture de cellules 1 ne sont pas limitées à une quelconque valeur spécifique, mais les dimensions suivantes sont préférables, par exemple.
A ce propos, lorsque le diamètre moyen de particules des supports de culture de cellules 1 est défini par A ( m) et la longueur maximale d'une cellule qui est amenée à adhérer au support de culture de cellules 1 est définie par B (um), le rapport A/B est compris avantageusement dans l'intervalle d'environ 2 à 100, plus avantageusement d'environ 5 à 50. En fixant le rapport A/B à une valeur comprise dans l'intervalle précité, il est possible d'augmenter suffisamment la surface de chaque support de culture de cellules 1 par rapport aux dimensions de la cellule, ce qui permet aux cellules d'adhérer à et de croître sur les surfaces des supports de culture de cellules 1 plus aisément.
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Dans la pratique, le diamètre moyen de particules des supports de culture de cellules 1 est compris avantageusement dans l'intervalle d'environ 50 à 500 m, plus avantageusement dans l'intervalle d'environ 100 à 300 um. En fixant le diamètre moyen de particules des supports de culture de cellules 1 à une valeur dans l'intervalle précité, il est possible d'améliorer davantage les effets décrits ci-dessus.
Pour permettre à un grand nombre de cellules d'adhérer à et de croître sur les surfaces des supports de culture de cellules 1 décrits ci-dessus, il est préféré que la surface pratiquement totale de chaque particule magnétique 2 soit couverte avec la couche de revêtement 3, d'une manière similaire à la présente forme de réalisation. Cependant, le support de culture de cellules 1 peut avoir une structure dans laquelle une partie de la surface de la particule magnétique 2 est couverte avec la couche de revêtement 3, en fonction du type de cellule devant être cultivée avec le support de culture de cellules 1, du type de matière constitutive de la particule magnétique 2 ou de facteurs similaires (c'est-à-dire une structure dans laquelle une partie de la surface de la particule magnétique 2 est exposée à travers des lacunes de la couche de revêtement 3) .
Une description est ensuite présentée en ce qui concerne un procédé de culture de cellules d'une deuxième forme de réalisation de la présente invention, et des supports de culture de cellules des particules magnétiques utilisées dans le procédé de culture de cellules de la deuxième forme de réalisation.
La caractéristique de la deuxième forme de réalisation concerne un procédé de culture de cellules qui comprend les étapes consistant à préparer une solution de culture de cellules contenant des cellules devant être cultivées, des supports granulaires de culture de cellules et des particules magnétiques ; et appliquer un champ magnétique à
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la solution de culture de cellules de manière à déplacer les particules magnétiques dans la solution de culture de cellules pour agiter la solution de culture de cellules, en permettant ainsi aux cellules d'adhérer à et de croître sur les surfaces des supports de culture de cellules.
A ce propos, dans le cas où une culture de cellules est effectuée suivant le procédé de culture de cellules de cette deuxième forme de réalisation, tout d'abord les particules magnétiques ainsi que les cellules et les supports de culture de cellules sont ajoutés à la solution de culture. Puis les particules magnétiques sont déplacées dans la solution de culture en appliquant un champ magnétique à la solution de culture, de manière à agiter la solution de culture. Dans ces conditions, les cellules adhèrent à et se développent sur la surface des supports de culture de cellules.
Suivant cette forme de réalisation, il est possible d'agiter une solution de culture de manière uniforme et douce et, en résultat, les cellules peuvent se développer efficacement.
En outre, de la manière décrite plus loin de manière plus détaillée, un tel procédé pour cultiver des cellules permet d'agiter plus uniformément une solution de culture en modifiant l'intensité ou la position d'un champ magnétique à appliquer à la solution de culture au cours du temps.
Ci-après, chacun des constituants du procédé de culture de cellules de la deuxième forme de réalisation est décrit successivement.
La figure 2 est une vue en coupe transversale qui représente la structure du support de culture de cellules utilisée dans le procédé de culture de cellules de la deuxième forme de réalisation, la figure 3 est une vue en coupe transversale qui représente la structure de la particule magnétique utilisée dans le procédé de culture de cellules de la deuxième forme de réalisation, et la figure
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4 est une vue en coupe transversale qui représente une modification de la particule magnétique utilisée dans le procédé de culture de cellules de la deuxième forme de réalisation.
(Support de culture de cellules 1A)
Comme avec la première forme de réalisation, un support de culture de cellules 1A sert de tuteur pour la croissance des cellules et est produit sous forme granulaire ou sous forme de particule (de préférence sous une forme granulaire pratiquement sphérique).
Comme avec la première forme de réalisation, un support de culture de cellules 1A sert de tuteur pour la croissance des cellules et est produit sous forme granulaire ou sous forme de particule (de préférence sous une forme granulaire pratiquement sphérique).
Comme support de culture de cellules 1A, un support formé d'une matière contenant, comme constituant principal, un polystyrène, un polyacrylamide, de la cellulose ou un dextrane ou une matière similaire, peut être utilisé (suivant l'utilisation habituelle dans une culture sur microsupports). Cependant, dans cette deuxième forme de réalisation, des supports de culture de cellules 1A ayant chacun une structure représentée sur la figure 2 sont utilisés. A ce propos, chaque support 1A est constitué d'un corps de base 11 et d'une couche de revêtement 12 qui est fournie pour couvrir la surface du corps de base 11 de telle sorte que les cellules puissent adhérer à la couche de revêtement 12.
L'utilisation d'un tel support ayant une structure représentée sur la figure 2 comme support de culture de cellules 1A permet au support de culture de cellules 1A de présenter convenablement la fonction permettant aux cellules d'y adhérer et de se développer sur celui-ci, et permet aisément d'ajuster la forme, les dimensions (diamètre moyen de particules ou dimensions similaires) et les propriétés physiques (densité et propriétés similaires) du support de culture de cellules 1A. Ci-après, une description détaillée, est présentée en ce qui concerne ce support de culture de cellules 1A.
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Le corps de base 11 est de préférence formé d'une résine. L'utilisation d'un tel corps de base permet d'améliorer davantage l'effet décrit ci-dessus.
Comme résine, il est possible d'utiliser diverses résines thermodurcissables et diverses résines thermoplastiques. Des exemples de résines thermoplastiques comprennent un polyamide, un polyéthylène, un polypropylène, un polystyrène, un polyimide, une résine acrylique et un polyuréthanne thermoplastique, et des exemples de résines thermodurcissables comprennent une résine époxy, une résine phénolique, une résine de mélamine et une résine d'urée et un polyester insaturé, une résine alkyde et un polyuréthanne thermodurcissable et l'ébonite. Ces résines peuvent être utilisées seules ou sous forme d'une association de deux ou plus de deux.
En outre, la résine peut être colorée avec des pigments organiques, des pigments inorganiques, des colorants acides, des colorants basiques, etc.
Comme matières constitutives de la couche de revêtement 12, n'importe quelle matière peut être utilisée du moment que les cellules peuvent y adhérer et, en particulier, une matière contenant un composé à base de phosphate de calcium comme matière principale convient. Le composé à base de phosphate de calcium est préférable puisqu'il est biologiquement inerte et il existe de moindres possibilités de détérioration des cellules.
Le composé à base de phosphate de calcium n'est pas particulièrement limité et divers composés ayant un rapport Ca/P compris dans l'intervalle de 1,0 à 2,0 peuvent être utilisés. Des exemples de tels composés comprennent Caio(P04)6(OH)2, Ca10 (PO4) 6F2, Calo (P04) 6Cl2, Ca3 (P04) 2, Ca2P207, Ca(P03)2 et CaHP04. Ces composés peuvent être utilisés seuls ou sous forme d'une association de deux ou plus de deux.
Parmi ces composés, comme composés à base de phosphate de calcium, un composé contenant de l'hydroxy-apatite (Ca10 (PO4) 6 (OH) 2) comme constituant principal convient le
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mieux. L'hydroxy-apatite est utilisée comme biomatériau, les cellules peuvent adhérer de manière extrêmement efficace à celle-ci et il existe une moindre possibilité de détérioration des cellules.
En outre, dans le cas où de la fluoroapatite (Ca10 (PO4) 6F2) est utilisée, il est préféré que la teneur en fluor du composé total à base de phosphate de calcium soit égale ou inférieure à 5 % en poids. En fixant la teneur en fluor du composé total à base de phosphate de calcium à une valeur égale ou inférieure à 5 % en poids, il est possible d'empêcher ou de réduire au minimum l'élution du fluor de la couche de revêtement 12 (c'est-à-dire du support de culture de cellules 1A). En outre, la détérioration des cellules peut être supprimée ou réduite au minimum et, en résultat, une réduction de l'efficacité de croissance des cellules est évitée.
Ces composés à base de phosphate de calcium peuvent être synthétisés par un procédé connu de synthèse à l'état humide, par un procédé connu de synthèse à l'état sec ou un procédé similaire. Dans ce cas, le composé résultant à base de phosphate de calcium peut contenir une substance restant en résultat de la synthèse (une matière première ou une matière similaire) et/ou un produit de réaction secondaire formé au cours de la synthèse.
Dans le cas où la couche de revêtement 12 est formée principalement du composé à base de phosphate de calcium, la couche de revêtement 12 peut être formée en laissant le composé à base de phosphate de calcium s'adsorber à la surface du corps de base 11. De préférence, comme le montre la figure 2, la couche de revêtement 12 est formée de particules 13 du composé à base de phosphate de calcium (ces particules étant appelées simplement ci-après "particules 13") qui sont partiellement incluses dans une surface incluant et adjacente à la surface du corps de base 12. Cela assure une excellente adhérence entre la couche de revêtement 12 et le corps de base 11, en empêchant ainsi
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convenablement le détachement de la couche de revêtement 12 de la surface du corps de base 11. A ce propos, il est possible d'obtenir un support de culture de cellules 1A ayant une résistance mécanique suffisante.
Dans un tel cas, la couche de revêtement 12 peut être formée, par exemple, par collision de particules poreuses formées principalement du composé à base de phosphate de calcium (appelées simplement ci-après "particules poreuses") contre la surface du corps de base 11. Suivant un tel procédé, il est possible de former de manière aisée et fiable la couche de revêtement 12.
Par collision des particules poreuses contre la surface du corps de base 11, ces particules sont dissociées en fines particules 13 ayant un diamètre de particules extrêmement petit lors de la collision contre le corps de base 11, et les particules 13 sont partiellement incluses dans le corps de base 11. Lorsque les particules 13 sont incluses partiellement dans le corps de base 11, le corps de base 11 capture les particules 13 sous l'action de sa force élastique, en fixant ainsi les particules 13 sur le corps de base 11.
Les particules poreuses sont de préférence produites en agglomérant des particules primaires du composé à base de phosphate de calcium. En utilisant de telles particules poreuses, il est possible de revêtir de manière plus fiable la surface du corps de base 11 car ces particules poreuses sont fragmentées plus efficacement lors de la collision contre le corps de base 11.
Le diamètre moyen des particules poreuses n'est pas limité à une quelconque valeur spécifique mais est de préférence égal ou inférieur à 100 um. Si le diamètre moyen de particules des particules poreuses est supérieur à 100 um, il existe un cas où la vitesse des particules poreuses lors de la collision contre le corps de base 11 devient trop faible, ce qui fait que la particule poreuse n'est pas fragmentée efficacement.
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Une collision entre les corps de base 11 et les particules poreuses peut être réalisée, par exemple, en utilisant une machine d'hybridation disponible dans le commerce, à l'état sec. En ce qui concerne les conditions à ce moment, par exemple, le rapport de mélange entre les corps de base 11 et les particules poreuses est compris dans l'intervalle d'environ 400:1 à 50 :1 rapport pondéral et la température à l'intérieur de l'appareil égale ou inférieure à la température de ramollissement de la résine qui est utilisée comme matière principale du corps de base 11 (habituellement égale ou inférieure à 80 C) .
Ces particules poreuses peuvent également être produites, par exemple, d'une manière connue, comme suit.
Plus précisément, les particules poreuses peuvent être produites en séchant directement par pulvérisation une suspension contenant des particules cristallines (particules primaires) d'un composé à base de phosphate de calcium synthétisé par un procédé connu à l'état humide, pour obtenir des particules secondaires granulées. En variante, ces particules secondaires peuvent être obtenues en ajoutant un additif tel qu'un agent d'ajustement de viscosité, des particules d'un composé organique ou des fibres qui peuvent être produites par évaporation par chauffage, ou par un moyen similaire, à la suspension, puis en séchant par pulvérisation la suspension. Il faut noter que les particules secondaires obtenues peuvent être frittées si nécessaire.
Puisque les particules secondaires obtenues sont poreuses, ces particules secondaires peuvent être utilisées directement dans la formation de la couche de revêtement 12.
Dans le cas où des particules poreuses ayant une plus forte porosité sont préférables, ces particules poreuses peuvent être produites, par exemple, de la manière suivante.
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Tout d'abord, une suspension dans laquelle les particules secondaires décrites ci-dessus sont mises en suspension est préparée, et la suspension est mise sous forme d'un bloc par moulage par voie humide, compression à sec ou un procédé similaire. A cet égard, il faut noter qu'un composé organique qui peut être évaporé dans le procédé de frittage suivant pour former des pores peut être ajouté à la suspension. Le diamètre des pores peut être régulé en ajustant des conditions telles que la température de frittage et des conditions similaires au lieu d'ajouter un tel composé organique. Puis, le bloc ainsi obtenu est fritté à une température comprise dans l'intervalle d'environ 400 à 1300 C. Si la température de frittage est inférieure à 400 C, il existe un risque que le composé organique ne soit pas totalement évaporé ou bien que le bloc ne soit pas fritté de manière satisfaisante. D'autre part, si le frittage est effectué à une température élevée supérieure à 1300 C, il existe un risque que le corps fritté résultant devienne excessivement dense ou que le composé à base de phosphate de calcium subisse une décomposition.
Puis le bloc ainsi fritté est broyé et ensuite calibré pour obtenir des particules ayant un diamètre de particules désiré.
Le diamètre des pores dans la particule poreuse peut être ajusté, par exemple, en choisissant de manière appropriée le diamètre de la particule primaire, la viscosité de la suspension, le type d'additif, etc.
La particule poreuse ainsi obtenue a de préférence une surface spécifique égale ou supérieure à 10 m2 / g et un diamètre des pores d'environ 500 à 1000 Â. Un support de culture de cellules 1A produit en utilisant des particules poreuses satisfaisant ces impératifs permet aux cellules d'adhérer à et de croître sur sa surface plus efficacement.
Il faut noter qu'un procédé pour former la couche de revêtement 12 (un procédé pour la production du support de
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culture de cellules 1A) n'est pas limité au procédé décrit ci-dessus.
En outre, la couche de revêtement 12 peut être dense ou poreuse.
De plus, l'épaisseur moyenne de la couche de revêtement 12 n'est pas limitée à une quelconque valeur spécifique, mais elle est comprise avantageusement dans l'intervalle d'environ 0,1 à 5 um, plus avantageusement dans l'intervalle d'environ 0,5 à 2 m. Si l'épaisseur moyenne de la couche de revêtement 12 est inférieure à la valeur limite inférieure précitée, il existe un risque qu'une partie de la surface du corps de base 11 soit exposée dans le support de culture de cellules 1A. D'autre part, si l'épaisseur moyenne de la couche de revêtement 12 excède la valeur limite supérieure précitée, il devient difficile d'ajuster la densité du support de culture de cellules 1A.
Un tel support de culture de cellules 1A a de préférence une masse volumique proche de celle de l'eau.
Plus précisément, la masse volumique du support de culture de cellules 1A est comprise avantageusement dans l'intervalle d'environ 0,8 à 1,4 g/cm3, plus avantageusement dans l'intervalle d'environ 0,9 à 1,2 g/cm3. En fixant la masse volumique du support de culture de cellules 1A à une valeur comprise dans l'intervalle précité, il est possible de mettre en suspension plus uniformément les supports de culture de cellules 1A dans une solution de culture.
Les dimensions du support de culture de cellules 1A ne sont pas limitées à une quelconque valeur spécifique, mais les valeurs suivantes sont préférables, par exemple.
A ce propos, lorsque le diamètre moyen de particules des supports de culture de cellules 1A est défini par A (um) et la longueur maximale d'une cellule qui est amenée à adhérer au support de culture de cellules 1A est définie par B (pm), le rapport A/B est compris de préférence dans l'intervalle d'environ 2 à 100, plus avantageusement
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d'environ 5 à 50. En fixant le rapport A/B à une valeur comprise dans l'intervalle précité, il est possible d'augmenter suffisamment la surface du support de culture de cellules 1A par rapport aux dimensions de la cellule, ce qui permet aux cellules d'adhérer à et de croître sur la surface du support de culture de cellules 1A plus aisément.
En outre, lorsque le diamètre moyen de particules des supports de culture de cellules 1A est défini par A (um) et le diamètre moyen de particules des particules magnétiques 2A qui seront décrites plus loin est défini par C (um) , le rapport C/A est compris de préférence dans l'intervalle d'environ 0,02 à 10, plus avantageusement d'environ 0,3 à 3. En fixant le rapport C/A à une valeur comprise dans l'intervalle précité, il est possible d'agiter suffisamment une solution de culture sous l'action du mouvement des particules magnétiques 2A (voir ci-dessous), ce qui permet aux supports pour cultures de cellules 1A d'être mis en suspension dans la solution de culture plus uniformément.
Plus précisément, le diamètre moyen de particules des supports de culture de cellules 1A est compris avantageusement dans l'intervalle d'environ 50 à 500 um, plus avantageusement dans l'intervalle d'environ 100 à 300 um. En fixant le diamètre moyen de particules des supports de culture de cellules 1A à une valeur dans l'intervalle ci-dessus, il est possible d'améliorer davantage les effets décrits ci-dessus.
Pour permettre à un grand nombre de cellules d'adhérer à et de croître sur les surfaces du support de culture de cellules 1A décrit ci-dessus, il est préféré que pratiquement la totalité de la surface du corps de base 11 soit couverte avec la couche de revêtement 12, d'une manière similaire à la présente forme de réalisation.
Cependant, le support de culture de cellules 1A peut avoir une structure dans laquelle une partie de la surface du corps de base 11 est couverte avec la couche de revêtement 12, en fonction du type de cellule qui est amené à adhérer
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au support de culture de cellules 1A, du type de matière constitutive du corps de base 11 ou de paramètres similaires (c'est-à-dire une structure dans laquelle une partie de la surface du corps de base 11 est exposée à travers les lacunes de la couche de revêtement 12).
(Particule magnétique 2A)
La particule magnétique 2A peut être déplacée dans une solution de culture par application d'un champ magnétique.
La particule magnétique 2A peut être déplacée dans une solution de culture par application d'un champ magnétique.
Lorsque les particules magnétiques 2A sont déplacées dans la totalité de la solution de culture, la solution de culture est agitée de manière uniforme et douce et, en résultat, les supports de culture de cellules 1A sont mis en suspension uniformément dans la solution de culture.
En conséquence, il devient aisé pour les cellules d'adhérer à la surface des supports de culture de cellules 1A et la nutrition des cellules adhérant au support de culture de cellules 1A est assurée de manière uniforme. En outre, il est possible d'éviter de soumettre à un choc mécanique les supports de culture de cellules 1, choc qui serait engendré dans le procédé classique utilisant une fiole d'agitation centrifuge en raison de la collision d'une ailette et des supports de culture des cellules, ce qui permet d'éviter aux cellules adhérant aux supports de culture de cellules d'être détachées de leur surface et ce qui permet également d'éviter la détérioration des cellules. Pour cette raison, conformément à la présente invention, les cellules peuvent croître plus efficacement.
Il est préféré que les particules magnétiques 2A puissent être déplacées aisément par application d'un champ magnétique et puissent se déposer (précipiter) dans une solution de culture lors de la suppression du champ magnétique. Cela permet à la solution de culture d'être agitée plus aisément et de manière plus fiable.
De ce point de vue, la masse volumique des particules magnétiques 2A est comprise de préférence dans l'intervalle d'environ 0,8 à 2,5 g/cm3, plus avantageusement dans
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l'intervalle d'environ 1,2 à 1,9 g/cm3. Si la masse volumique des particules magnétiques 2A est trop faible, il est difficile pour les particules magnétiques 2A de se déposer dans une solution de culture lorsqu'un champ magnétique est supprimé. D'autre part, si la masse volumique des particules magnétiques 2A est trop forte, un champ magnétique intense est requis pour déplacer les particules magnétiques 2A dans la solution de culture. Dans tous les cas, il existe un risque que la solution de culture ne puisse être agitée suffisamment.
Les particules magnétiques 2A peuvent être formées d'une matière magnétique dans leur ensemble, mais elles sont de préférence constituées de matériaux composites qui est obtenu en mélangeant une résine et une matière magnétique. Dans ce cas, en fixant le rapport de formulation (rapport de mélange) entre la résine et la matière magnétique de manière appropriée, il est possible d'ajuster aisément la masse volumique de la particule magnétique 2A. En outre, il existe un avantage consistant en la possibilité d'ajuster aisément la forme et les dimensions (par exemple le diamètre moyen de particules) de la particule magnétique 2A.
Comme le montre la figure 3, la particule magnétique (particule composite) 2A a de préférence une structure dans laquelle une matière magnétique (poudre magnétique) 22 est dispersée dans un corps de base 21 formé principalement de la résine. Ces particules magnétiques 2A peuvent être produites relativement aisément, par exemple en transformant la résine à l'état fondu contenant la matière magnétique 22 en particules (granulation). A cet égard, il faut noter que la particule magnétique 2A sous forme de particule composite peut avoir une structure dans laquelle la matière magnétique 22 est dispersée seulement à proximité de la surface du corps de base 21.
Des exemples de matières magnétiques 22 comprennent un alliage ferromagnétique contenant de l'oxyde de fer, Fe,
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Ni, Co, etc. comme constituant principal, un ferrite, un ferrite de baryum, un ferrite de strontium, etc. Ces matières magnétiques peuvent être utilisées seules ou sous forme d'une association de deux ou plus de deux.
En ce qui concerne la résine, une matière identique à celle mentionnée ci-dessus pour le corps de base 11 du support de culture de cellules 1A peut être utilisée.
Le diamètre moyen de particules des particules magnétiques 2A est compris avantageusement dans l'intervalle d'environ 10 à 500 pm, plus avantageusement dans l'intervalle d'environ 100 à 300 um. Si le diamètre moyen de particules des particules magnétiques 2A est trop faible, un courant turbulent ne peut être engendré suffisamment dans une solution de culture. D'autre part, si le diamètre moyen de particules des particules magnétiques 2A est trop grand, un champ magnétique intense est nécessaire pour déplacer les particules magnétiques 2A dans une solution de culture. Dans tous les cas, il existe un risque que la solution de culture ne puisse être agitée suffisamment. A cet égard, il faut noter que, si le diamètre moyen de particules des particules magnétiques 2A est trop petit, il existe également un risque que les particules magnétiques 2A ne soient pas aisément agglomérées les unes avec les autres.
La quantité de particules magnétiques 2A à ajouter à une solution de culture n'est pas limitée à une quelconque valeur spécifique, mais les particules magnétiques 2A sont de préférence ajoutées de telle sorte que le rapport de mélange entre les particules magnétiques 2A et les supports de cellule 1A puisse être compris dans l'intervalle d'environ 10 :90 50 :50 particulier d'environ 20 :80 40:60) en pourcentage en volume. Si la quantité de particules magnétiques 2A à ajouter à une solution de culture est trop petite, il existe un risque que la solution de culture ne puisse être agitée suffisamment.
D'autre part, si la quantité de particules magnétiques 2A à
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ajouter à une solution de culture est trop grande, il existe un risque que la fréquence de collision entre les particules magnétiques 2A et les supports de culture de cellules 1A augmente, ce qui fait que les cellules se détachent des supports de culture de cellules 1A.
En outre, comme le montre la figure 4, une telle particule magnétique 2A peut avoir une structure modifiée dans laquelle au moins une partie de la surface (sur la figure 4, pratiquement la totalité de la surface) de la particule magnétique 2A est couverte avec une couche de revêtement 23 qui permet aux cellules d'y adhérer, par exemple. L'utilisation d'une telle particule magnétique 2A permet aux cellules d'adhérer aux surfaces des particules magnétiques 2A et y croître, ce qui améliore davantage l'efficacité de croissance des cellules.
La couche de revêtement 23 a de préférence une structure identique à celle de la couche de revêtement 12 du support de culture de cellules 1A. A ce propos, il est préféré que la couche de revêtement 23 soit formée principalement du composé à base de phosphate de calcium.
En outre, la couche de revêtement 23 est de préférence formée de fines particules 24 constituées principalement du composé à base de phosphate de calcium qui sont partiellement incluses dans une surface incluant et adjacente à la surface de la particule magnétique 2A. Dans ce cas, il est préféré que la couche de revêtement 23 soit formée par collision de particules poreuses formées principalement du composé à base de phosphate de calcium contre la surface de la particule magnétique 2A.
En particulier, lorsque la couche de revêtement 23 est formée en utilisant le composé à base de phosphate de calcium comme matière principale, la couche de revêtement 23 capture les ions métalliques engendrés à partir de la matière magnétique 22 pour empêcher l'élution des ions métalliques dans une solution de culture. Cela permet d'éviter une influence néfaste sur les cellules. Dans ce
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cas, la couche de revêtement 23 joue le rôle de couche de barrière aux ions.
(Solution de culture)
Dans les procédés de culture de cellules des première et deuxième formes de réalisation de la présente invention décrites ci-dessus, la même solution de culture peut être utilisée.
Dans les procédés de culture de cellules des première et deuxième formes de réalisation de la présente invention décrites ci-dessus, la même solution de culture peut être utilisée.
Plus précisément, une solution de culture 140 est choisie de manière appropriée en fonction du type de cellule à utiliser ou de facteurs similaires, et n'est pas limitée à une quelconque solution spécifique. Des exemples de solutions de culture utilisables comprennent le milieu MEM de Dulbecco, le MEM de Nissui, le milieu BME, le milieu MCDB-104 et des milieux similaires.
En outre, la solution de culture 140 peut contenir, par exemple, du sérum, une protéine sérique telle que l'albumine et des additifs tels que diverses vitamines, un aminoacide et des sels, si nécessaire.
Puis, par référence aux figures 5 à 9, une description est proposée en ce qui concerne un appareil de culture de cellules qui peut être utilisé pour les procédés de culture de cellules des première et deuxième formes de réalisation décrites ci-dessus.
Première forme de réalisation
Tout d'abord, une première forme de réalisation de l'appareil de culture de cellules de la présente invention est décrite.
Tout d'abord, une première forme de réalisation de l'appareil de culture de cellules de la présente invention est décrite.
La figure 5 est une vue schématique en perspective qui représente un appareil de culture de cellules de la première forme de réalisation de la présente invention, et la figure 6 est un diagramme dans le temps qui représente les motifs d'un champ magnétique engendré par un générateur de champ magnétique de l'appareil de culture de cellules.
Un appareil de culture de cellules 100 représenté sur la figure 5 comprend un récipient de culture 110, un générateur de champ magnétique 120, un système de commande
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130 et un dispositif de chauffage 150. Lorsque le système de commande 130 est connecté à une source de courant électrique, la puissance électrique nécessaire pour actionner chacun des composants de l'appareil de culture de cellules 100 est fournie.
Le récipient de culture 110 est un composant destiné à recevoir la solution de culture 140 et comporte un orifice 111, à travers lequel la solution de culture 140 est introduite et déchargée, à sa partie supérieure. L'orifice 111 est obturé hermétiquement avec un bouchon 112 lorsque cela est nécessaire, pour maintenir l'étanchéité à l'air dans le récipient de culture 110.
La forme, la capacité et les caractéristiques similaires du récipient de culture 110 ne sont pas particulièrement limitées et sont déterminées de manière appropriée en fonction du type de cellule utilisé, du type de solution de culture 140, etc.
Le générateur de champ magnétique 120 est un composant pour engendrer un champ magnétique afin de déplacer les supports de culture de cellules 1 utilisés dans le procédé de culture de cellules de la première forme de réalisation ou les particules magnétiques 2A utilisées dans le procédé de culture de cellules de la deuxième forme de réalisation dans la solution de culture 140. Le générateur de champ magnétique 120 comprend un électroaimant 121 et un couvercle non magnétique pour recevoir l'électroaimant 121 (non représenté).
Dans la présente forme de réalisation, l'électroaimant 121 est constitué d'une matière de noyau métallique toroïdal 122 et d'un conducteur 123 enroulé en spirale autour de la périphérie de la matière de noyau 122. Le passage d'un courant électrique à travers le conducteur 123 engendre un champ magnétique à proximité du conducteur 123.
Le couvercle non magnétique a pour fonction de protéger et de fixer l'électroaimant 121 et est constitué
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de diverses résines, telles qu'une résine à base acrylique, une résine à base de silicone, par exemple.
Le récipient de culture 110 est placé à l'intérieur d'un tel générateur de champ magnétique 120. En d'autres termes, le générateur de champ magnétique 120 est placé autour de la périphérie du récipient de culture 110. Le générateur de champ magnétique 120 est fixé et maintenu par un élément de fixation (non représenté). La position du générateur de champ magnétique 120 dans la direction verticale du récipient de culture 110 est de préférence fixée à un niveau à proximité de la surface de la solution de culture 140 au moment où la solution de culture 140 est stockée (reçue) dans le récipient de culture 110. En fixant la position du générateur de champ magnétique à un tel niveau, il est possible de déplacer largement les supports de culture de cellules 1 ou les particules magnétiques 2A dans la direction verticale de telle sorte que la solution de culture 140 soit agitée plus uniformément.
La distance entre le générateur de champ magnétique 120 et le récipient de culture 110 (qui est représentée par "d" sur la figure 5) n'est pas particulièrement limitée mais le générateur de champ magnétique et le récipient de culture 110 sont de préférence placés aussi près que possible. En particulier, ils sont de préférence placés de manière à venir en contact (intime) l'un avec l'autre.
Le générateur de champ magnétique 120 est conçu de telle sorte qu'il puisse modifier l'intensité d'un champ magnétique à engendrer au cours du temps. Un exemple de motif d'un champ magnétique à engendrer par le générateur de champ magnétique 120 comprend un motif de production intermittente d'un champ magnétique à des intervalles réguliers (voir la figure 6(a)). Lorsqu'un champ magnétique est engendré, les supports de culture de cellules 1 ou les particules magnétiques 2A sont attirés à la paroi du générateur de champ magnétique 120, ce qui fait que les supports de culture de cellules 1 ou les particules
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magnétiques 2A montent dans la solution de culture 140.
Dans un tel état, lorsque la production du champ magnétique est interrompue, les supports de culture de cellules 1 ou les particules magnétiques 2A attirés à la paroi du générateur de champ magnétique se déposent sous l'action de leur propre poids. En répétant un tel mouvement vertical des supports de culture de cellules 1 ou des particules magnétiques 2A, un courant turbulent a été engendré dans la solution de culture 140, ce qui fait que la solution de culture 140 est agitée de manière uniforme et douce.
L'intensité maximale (valeur absolue) du champ magnétique est déterminée de manière appropriée en fonction de la masse volumique du support de culture de cellules 1 ou de la particule magnétique 2A, de la composition et du volume de la solution de culture 140, et de facteurs similaires, et n'est pas limitée à une quelconque valeur spécifique mais est comprise avantageusement dans l'intervalle d'environ 0,1 à 100 Wb/m2, plus avantageusement dans l'intervalle d'environ 0,2 à 50 Wb/m2.
Si l'intensité maximale du champ magnétique (densité de flux magnétique) est trop faible, il existe un risque que l'attraction satisfaisante des supports de culture de cellules 1 ou des particules magnétiques 2A à la paroi du générateur de champ magnétique 120 devienne difficile, en empêchant l'agitation suffisante de la solution de culture 140. D'autre part, si l'intensité maximale du champ magnétique est accrue au-delà de la valeur limite supérieure précitée, il existe un risque que le champ magnétique ait un effet néfaste sur les cellules, en plus d'un gaspillage de puissance électrique.
Le motif d'un champ magnétique à engendrer par le générateur de champ magnétique 120 n'est pas limité au motif de production intermittente du champ magnétique à des intervalles réguliers (voir la figure 6(a)) et peut être un motif d'augmentation et de diminution de l'intensité d'un champ magnétique à engendrer à des intervalles réguliers
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(voir la figure 6(b)), un motif de variation continue de l'intensité, du sens, etc., d'un champ magnétique à engendrer (voir la figure 6(c)) ou un motif similaire, par exemple. Ces motifs peuvent être éventuellement combinés.
Le système de commande 130 a pour fonction de modifier les conditions (par exemple le type, la quantité, le sens, le temps, la fréquence, etc. ) du courant électrique fourni par une source de courant électrique. Le système de commande 130 convertit le courant électrique fourni par une source de courant électrique en un courant électrique satisfaisant des conditions prédéterminées (courant électrique ayant un motif prédéterminé) et fournit le courant électrique converti à l'électroaimant 121 (générateur de champ magnétique 120) . Par exemple, dans le cas où le générateur de champ magnétique 120 engendre un champ magnétique de manière intermittente, le système de commande 130 convertit un courant alternatif fourni par une source de courant électrique en un courant pulsé et fournit le courant pulsé à l'électroaimant 121.
En outre, le dispositif de chauffage 150 est connecté électriquement au système de commande 130. Le dispositif de chauffage 150 renferme, par exemple, un élément chauffant, un élément à effet Peltier ou un élément similaire, et chauffe la solution de culture 140 sous le contrôle du système de commande 130.
Puis un fonctionnement de l'appareil de culture de cellules 100 (c'est-à-dire le procédé de culture de cellules utilisant l'appareil) est décrit.
(1) Tout d'abord, les supports de culture de cellules 1 (dans le cas du procédé de culture de cellules de la première forme de réalisation) ou les supports de culture de cellules 1A et les particules magnétiques 2A (dans le cas du procédé de culture de cellules de la deuxième forme de réalisation sont soumis respectivement à un traitement de stérilisation. Cela permet de diminuer le nombre de micro-organismes ou de moisissures présents sur la surface
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des supports de culture de cellules 1 ou des supports de culture de cellules 1A et des particules magnétiques 2A, ou bien de tuer totalement les micro-organismes ou les moisissures. En conséquence, la possibilité que les microorganismes ou les moisissures provoquent une détérioration des cellules est réduite ou supprimée, ce qui permet aux cellules de croître plus efficacement.
Lors du traitement de stérilisation, un procédé dans lequel les supports de culture des cellules 1 ou les supports de culture de cellules 1A et les particules magnétiques 2A sont mis en contact avec une solution stérilisante, un moyen de stérilisation en autoclave, un moyen de stérilisation par un gaz, un moyen de stérilisation par un rayonnement, ou un moyen similaire, peut être utilisé, par exemple. Parmi ces procédés, le procédé dans lequel les supports de culture de cellules 1 ou les supports de culture de cellules 1A et les particules magnétiques 2A sont mis en contact avec une solution stérilisante convient. Suivant un tel procédé, il est possible de stériliser plus efficacement un grand nombre des supports de culture de cellules 1 ou des supports de culture de cellules 1A et des particules magnétiques 2A.
Dans le cas où une solution stérilisante est utilisée, les supports de culture de cellules 1 ou les supports de culture de cellules 1A et les particules magnétiques 2A sont lavés après un traitement de stérilisation pour éliminer la solution stérilisante adhérant à la surface des supports de culture de cellules 1 ou des supports de culture de cellules 1A et des particules magnétiques 2A.
(2) Puis les supports de culture de cellules 1 ou les supports de culture de cellules 1A et les particules magnétiques 2A, après achèvement du procédé (1) précité, et les cellules (qui sont amenées à adhérer aux supports 1A et aux particules magnétiques 2A) sont ajoutés ou mélangés à la solution de culture 140, et la solution de culture 140
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ainsi obtenue est stockée (reçue) dans le récipient de culture 110 de l'appareil de culture de cellules 100.
Dans ce cas, par exemple, un vecteur alternatif (vecteur) contenant un gène codant pour une protéine cible a été introduit préalablement dans chaque cellule.
Des exemples de cellules comprennent une cellule animale, une cellule végétale, une bactérie et un virus.
Parmi ces cellules, une cellule animale convient particulièrement. L'utilisation d'une cellule animale comme une telle cellule permet d'appliquer la présente invention à des domaines techniques plus larges. En outre, dans le cas où une protéine est produite, il est possible de produire convenablement une protéine ayant une structure plus complexe (par exemple une glycoprotéine).
(3) Puis, comme cela a été décrit ci-dessus, lorsque l'appareil de culture de cellules 100 est actionné, le générateur de champ magnétique 120 applique un champ magnétique ayant un motif prédéterminé à la solution de culture 140. De cette manière, les supports de culture de cellules 1 ou les supports de culture de cellules 1A et les particules magnétiques 2A sont déplacées dans la solution de culture 140 et la solution de culture 140 est ensuite agitée sous l'action du mouvement des supports de culture de cellules 1 ou des supports de culture de cellules 1A et des particules magnétiques 2A de telle sorte que les supports de culture de cellules 1 ou les supports de culture de cellules 1A et les particules magnétiques 2A soient mis en suspension uniformément dans la solution de culture 140.
A ce moment, la solution de culture 140 est chauffée par le dispositif de chauffage 150. La température de la solution de culture 140 est déterminée de manière appropriée en fonction du type de cellules à cultiver et de paramètres similaires et n'est pas limitée à une quelconque valeur spécifique. Habituellement, la température est comprise dans l'intervalle d'environ 4 à 40 C et est
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comprise de préférence dans l'intervalle d'environ 25 à 37 C.
Dans ces conditions, les cellules adhèrent à et se développent sur la surface des supports de culture de cellules 1 ou des supports de culture de cellules 1A et des particules magnétiques 2A dans la solution de culture 140.
En particulier, puisque la solution de culture 140 est agitée de manière uniforme et douce en raison du mouvement des particules magnétiques 2, les cellules peuvent être cultivées extrêmement efficacement.
Les cellules cultivées produisent alors une protéine cible. La protéine est déchargée dans la solution de culture 140 ou bien est accumulée dans les cellules, par exemple.
A ce moment, la culture de cellules peut être effectuée en fournissant un gaz contenant de l'oxygène gazeux, si nécessaire.
(4) Puis la protéine produite est recueillie. Dans le cas où la protéine déchargée dans la solution de culture 140 est recueillie, la protéine peut être recueillie par exemple de la manière suivante.
Plus précisément, l'agitation de la solution de culture 140 est interrompue dans le procédé (3) précité, puis un surnageant est recueilli après la sédimentation des supports pour les supports de culture de cellules 1 ou les supports de culture de cellules 1A et les particules magnétiques 2A dans la solution de culture 140. En variante, la solution de culture 140 peut être filtrée pour recueillir le filtre résultant. Puis la solution recueillie (surnageant ou filtrat) est traitée (par exemple chromatographie), ce qui permet à la protéine cible d'être aisément recueillie.
Deuxième forme de réalisation
Un appareil de culture de cellules suivant une deuxième forme de réalisation de la présente invention est maintenant décrit.
Un appareil de culture de cellules suivant une deuxième forme de réalisation de la présente invention est maintenant décrit.
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La figure 7 est une vue schématique en perspective qui représente l'appareil de culture de cellules de la deuxième forme de réalisation de la présente invention.
La deuxième forme de réalisation est décrite ci-après en mettant l'accent sur la différence entre les première et deuxième formes de réalisation et, en conséquence, une description des points concordants sera omise.
L'appareil de culture de cellules 100 représenté sur la figure 7 et l'appareil de culture de cellules 100 de la première forme de réalisation sont identiques, à l'exception de la structure du générateur de champ magnétique 120.
Plus précisément, le générateur de champ magnétique 120 de la deuxième forme de réalisation comprend l'électroaimant 121 obtenu en enroulant en spirale le conducteur 123 autour de la périphérie d'une matière de noyau rectiligne (cylindrique) 122. Le générateur de champ magnétique 120 est de préférence couvert d'un revêtement étanche à l'eau, formé principalement d'une matière n'ayant aucune influence sur un champ magnétique.
Le générateur de champ magnétique 120 est fixé (maintenu) par son passage à travers le bouchon 112 à fixer au récipient de culture 110. Dans la forme de réalisation de la présente invention, le générateur de champ magnétique 120 est placé de manière à venir en contact avec la solution de culture 140 lorsque la culture de cellules est effectuée.
Le motif d'un champ magnétique à engendrer par le générateur de champ magnétique 120 peut être n'importe lequel des motifs décrits ci-dessus représentés sur la figure 6, par exemple.
L'appareil de culture de cellules 100 de la deuxième forme de réalisation peut avoir la même fonction et le même effet que ceux de la première forme de réalisation.
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Troisième forme de réalisation
Un appareil de culture de cellules suivant une troisième forme de réalisation de la présente invention est maintenant décrit.
Un appareil de culture de cellules suivant une troisième forme de réalisation de la présente invention est maintenant décrit.
La figure 8 est une vue schématique en perspective qui représente l'appareil de culture de cellules de la troisième forme de réalisation de la présente invention, et la figure 9 est un diagramme dans le temps qui représente les motifs d'un champ magnétique à engendrer par le générateur de champ magnétique.
Ci-après, la troisième forme de réalisation est décrite en mettant l'accent sur la différence entre les première et troisième formes de réalisation et, en conséquence, une description des points concordants sera omise.
L'appareil de culture de cellules 100 représenté sur la figure 8 et l'appareil de culture de cellules 100 de la première forme de réalisation sont identiques, à l'exception de la structure du générateur de champ magnétique 120.
Plus précisément, le générateur de champ magnétique 120 de la troisième forme de réalisation comprend quatre électroaimants (une pluralité d'électroaimants) 121A à 121D.
Les électroaimants 121A à 121D sont espacés à des intervalles pratiquement identiques le long de la direction circonférentielle du récipient de culture 110.
Avec une telle structure, une commutation successive entre les électroaimants 121A à 121D à alimenter en énergie électrique, c'est-à-dire une modification de la position d'un champ magnétique à engendrer au cours du temps, permet de compliquer davantage le motif de mouvement des supports de culture de cellules 1 et des particules magnétiques 2A dans la solution de culture 140. En conséquence, les supports de culture de cellules 1 ou le support de culture de cellules 1A et les particules magnétiques 2A sont mis en
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suspension plus uniformément dans la solution de culture 140 et, en résultat, les cellules peuvent se développer plus efficacement.
Le motif d'un champ magnétique à engendrer par chacun des électroaimants 121A à 121D (commutation entre les électroaimants 121A à 121D à alimenter en énergie électrique) peut être le motif représenté sur la figure 9, par exemple. Plus précisément, tandis qu'un des électroaimants engendre un champ magnétique, d'autres électroaimants n'engendrent aucun champ magnétique et la commutation est effectuée entre les électroaimants pour engendrer un champ magnétique de manière successive (synchrone). Cela permet de déplacer les supports de culture de cellules 1A ou les particules magnétiques 2A le long de la surface intérieure du récipient de culture 110.
Il faut noter que le motif d'un champ magnétique à engendrer par les électroaimants 121A à 121D n'est pas limité au motif représenté sur la figure 9 et peut être un motif obtenu en combinant éventuellement les motifs représentés sur la figure 6, par exemple.
Dans les électroaimants 121A à 121D, par exemple, le nombre de bobinages du conducteur 123, la forme totale et leurs dimensions peuvent être identiques ou différents les uns des autres.
L'appareil de culture de cellules 100 de la troisième forme de réalisation peut présenter la même fonction et le même effet que ceux de la première forme de réalisation.
Il faut noter que la présente invention n'est pas limitée aux appareils de culture de cellules décrits cidessus et, du moment que les mêmes fonctions sont réalisées, il est possible d'apporter diverses modifications et additions à chaque partie de tels appareils. En outre, deux ou plus de deux des formes de réalisation décrites ci-dessus peuvent être éventuellement combinées.
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Dans chacune des formes de réalisation décrites cidessus, le générateur de champ magnétique est fixe.
Cependant, dans la présente invention, le générateur de champ magnétique et le récipient de culture peuvent être fournis de telle sorte qu'ils puissent être soumis à un mouvement relatif pour modifier la position d'un champ magnétique à appliquer à une solution de culture au cours du temps. Par exemple, le générateur de champ magnétique peut être déplacé dans la direction verticale ou dans la direction horizontale par rapport au récipient de culture, le générateur de champ magnétique peut être déplacé de manière à être rapproché et éloigné du récipient de culture et le générateur de champ magnétique peut être déplacé le long de la direction circonférentielle du récipient de culture. Ces mouvements du générateur de champ magnétique peuvent être combinés.
En outre, dans la présente invention, le générateur de champ magnétique peut faire varier l'intensité d'un champ magnétique à appliquer à une solution de culture au cours du temps suivant le motif décrit ci-dessus tout en étant soumis à un déplacement relatif par rapport au récipient de culture pour modifier la position du champ magnétique à appliquer à la solution de culture au cours du temps.
De plus, dans chacune des formes de réalisation, le générateur de champ magnétique comprend l'électroaimant, mais des aimants permanents peuvent être utilisés au lieu de l'électroaimant. Dans un tel cas, le générateur de champ magnétique est en outre muni d'un mécanisme de déplacement d'aimant permanent pour déplacer les aimants permanents par rapport au récipient de culture de telle sorte que les supports de culture de cellules et/ou les particules magnétiques puissent être déplacées dans la solution de culture par le mouvement des aimants permanents. Dans ce cas, les aimants permanents peuvent être déplacés dans diverses directions telles que la direction ascendante et la direction descendante, vers la droite et vers la gauche,
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des directions obliques et des directions circonférentielles et n'importe quelles associations arbitraires de ces directions.
En outre, dans les procédés de culture de cellules des première et deuxième formes de réalisation décrites cidessus, d'autres supports de culture de cellules peuvent être utilisés conjointement avec les supports de culture de cellules mentionnés ci-dessus. En ce qui concerne ces autres supports de culture de cellules, on peut citer des supports constitués d'une matière contenant comme constituant principal de ces supports un polystyrène, un polyacrylamide, de la cellulose, un dextrane, etc., et des supports constitués chacun d'un corps de base formé principalement d'une résine et d'une couche de revêtement qui couvre la surface du corps de base et qui est constituée d'une matière à laquelle les cellules peuvent adhérer.
EXEMPLES
Puis des exemples concrets des procédés de culture de cellules des première et deuxième formes de réalisation conformes à la présente invention sont décrits.
Puis des exemples concrets des procédés de culture de cellules des première et deuxième formes de réalisation conformes à la présente invention sont décrits.
Procédé de culture de cellules de la première forme de réalisation
1. Préparation de supports de culture de cellules (supports de culture de cellules I-A)
Tout d'abord, 50 g de particules de Nylon (corps de base) ayant un diamètre moyen de particules de 150 um et une masse volumique de 1,90 g/cm3 et 0,25 g de particules d'hydroxyapatite (particules poreuses obtenues par agglomération de particules primaires) ayant un rapport Ca/P de 1,67 et un diamètre moyen de particules de 10 m ont été préparés.
1. Préparation de supports de culture de cellules (supports de culture de cellules I-A)
Tout d'abord, 50 g de particules de Nylon (corps de base) ayant un diamètre moyen de particules de 150 um et une masse volumique de 1,90 g/cm3 et 0,25 g de particules d'hydroxyapatite (particules poreuses obtenues par agglomération de particules primaires) ayant un rapport Ca/P de 1,67 et un diamètre moyen de particules de 10 m ont été préparés.
La particule d'hydroxyapatite avait une surface spécifique de 45 m2 /g et un diamètre des pores de 600 Â.
Puis ces particules de Nylon et ces particules d'hydroxyapatite ont été introduites dans un appareil NARA
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HYBRIDIZATION SYSTEM NHS-1 (produit par Nara Machinery Co., Ltd., ayant une puissance émise de 5,5 kW et un courant émis de 23 A) et le système a été soumis à un fonctionnement à 6400 tr/min et une température de 32 à 50 C pendant 5 min. De cette manière, des supports de culture de cellules I-A revêtus d'hydroxyapatite (chacun ayant une structure représentée sur la figure 1) ont été obtenus.
Le support de culture de cellules I-A ainsi obtenu avait un diamètre moyen de particules de 151 um.
(l'épaisseur moyenne de la couche de revêtement de la couche d'hydroxyapatite de revêtement était égale à 1 m) et une masse volumique de 1,92 g/cm3.
Support de culture de cellules I-B
Tout d'abord, 50 g de particules de Nylon (corps de base) ayant un diamètre moyen de particules de 150 um et une masse volumique de 1,02 g/cm3 et 0,25 g de particules d'hydroxyapatite (particules poreuses obtenues par agglomération de particules primaires) ayant un rapport Ca/P de 1,67 et un diamètre moyen de particules de 10 pm ont été préparés.
Tout d'abord, 50 g de particules de Nylon (corps de base) ayant un diamètre moyen de particules de 150 um et une masse volumique de 1,02 g/cm3 et 0,25 g de particules d'hydroxyapatite (particules poreuses obtenues par agglomération de particules primaires) ayant un rapport Ca/P de 1,67 et un diamètre moyen de particules de 10 pm ont été préparés.
* La particule d'hydroxyapatite avait une surface spécifique de 45 m2 /g et un diamètre des pores de 600 .
Puis ces particules de Nylon et ces particules d'hydroxyapatite ont été introduites dans un appareil NARA HYBRIDIZATION SYSTEM NHS-1 (produit par Nara Machinery Co., Ltd., ayant une puissance émise de 5,5 kW et un courant émis de 23 A) et le système a été soumis à un fonctionnement à 6400 tr/min et une température de 32 à 50 C pendant 5 min. De cette manière, des supports de culture de cellules I-B revêtus d'hydroxyapatite (chacun ayant une structure représentée sur la figure 1) ont été obtenus.
Le support de culture de cellules I-B ainsi obtenu avait un diamètre moyen de particules de 151 um (l'épaisseur moyenne de la couche d'hydroxyapatite de
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revêtement était égale à 1 um) et une masse volumique de 1,03 g/cm3.
Supports de culture de cellules I-C
Des particules de dextrane ayant un diamètre moyen de particules de 200 pm et une masse volumique de 1,03 g/cm3 (produites par Pharmacia) ont été préparées comme supports de culture de cellules I-C.
Des particules de dextrane ayant un diamètre moyen de particules de 200 pm et une masse volumique de 1,03 g/cm3 (produites par Pharmacia) ont été préparées comme supports de culture de cellules I-C.
2. Culture des cellules
2-1 Culture de cellules dérivées d'un ostéosarcome humain (HOS)
Une telle cellule dérivée d'un ostéosarcome humain est une cellule ayant une longueur maximale d'environ 20 um.
2-1 Culture de cellules dérivées d'un ostéosarcome humain (HOS)
Une telle cellule dérivée d'un ostéosarcome humain est une cellule ayant une longueur maximale d'environ 20 um.
Exemple Ia-1
1,5 g des supports de culture de cellules I-A et 30 ml d'une suspension contenant 2 x 105 cellules dérivés d'un ostéosarcome humain (HSO) par millilitre (/ml) ont été introduits dans 100 ml de milieu MEM de Nissui (solution de culture). Il faut noter qu'une quantité de 10 % en volume de sérum de f#tus bovin avait été ajoutée au milieu MEM Nissui.
1,5 g des supports de culture de cellules I-A et 30 ml d'une suspension contenant 2 x 105 cellules dérivés d'un ostéosarcome humain (HSO) par millilitre (/ml) ont été introduits dans 100 ml de milieu MEM de Nissui (solution de culture). Il faut noter qu'une quantité de 10 % en volume de sérum de f#tus bovin avait été ajoutée au milieu MEM Nissui.
Cette solution de culture a été introduite dans un récipient de culture (qui est un récipient en verre résistant à la chaleur produit par IWAKI-PYREX) d'un appareil de culture de cellules représenté sur la figure 5 et les cellules ont été cultivées. En ce qui concerne les conditions de culture, le motif d'un champ magnétique engendré était un motif représenté sur la figure 6(a), l'intervalle d'impulsion était égal à 2 s, la température de la solution de culture était égale à 37 C et le temps de culture était de 5 jours.
Exemple Ia-2
Une culture de cellules a été effectuée de la même manière que dans l'exemple Ia-1, sauf que l'intervalle d'impulsion a été porté à 10 s.
Une culture de cellules a été effectuée de la même manière que dans l'exemple Ia-1, sauf que l'intervalle d'impulsion a été porté à 10 s.
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Exemple Ia-3
Une culture de cellules a été effectuée de la même manière que dans l'exemple Ia-1, sauf qu'une quantité de 1,5 g des supports de culture de cellules I-A a été remplacée par 0,6 g des supports de culture de cellules I-A et 0,8 g des supports de culture de cellules I-B.
Une culture de cellules a été effectuée de la même manière que dans l'exemple Ia-1, sauf qu'une quantité de 1,5 g des supports de culture de cellules I-A a été remplacée par 0,6 g des supports de culture de cellules I-A et 0,8 g des supports de culture de cellules I-B.
Exemple Ia-4
Une culture de cellules a été effectuée de la même manière que dans l'exemple Ia-1, sauf qu'une quantité de 1,5 g des supports de culture de cellules I-A a été remplacée par 0,6 g des supports de culture de cellules I-A et 0,8 g des supports de culture de cellules I-C.
Une culture de cellules a été effectuée de la même manière que dans l'exemple Ia-1, sauf qu'une quantité de 1,5 g des supports de culture de cellules I-A a été remplacée par 0,6 g des supports de culture de cellules I-A et 0,8 g des supports de culture de cellules I-C.
Exemple comparatif Ia-1
1,5 g des supports de culture de cellules I-B et 30 ml d'une suspension contenant 2 x 105 cellules dérivées d'un ostéosarcome humain (HOS) par millilitre (/ml) ont été ajoutés à 100 ml de milieu MEM de Nissui (solution de culture). Il faut noter que 10 % en volume de sérum de f#tus bovin ont été ajoutés au milieu MEM de Nissui.
1,5 g des supports de culture de cellules I-B et 30 ml d'une suspension contenant 2 x 105 cellules dérivées d'un ostéosarcome humain (HOS) par millilitre (/ml) ont été ajoutés à 100 ml de milieu MEM de Nissui (solution de culture). Il faut noter que 10 % en volume de sérum de f#tus bovin ont été ajoutés au milieu MEM de Nissui.
Cette solution de culture a été introduite dans une fiole d'agitation centrifuge (produite par Shibata Scientific Technology Ltd. ) et les cellules ont été cultivées. Les conditions de culture étaient une vitesse de rotation du barreau d'agitation de 30 tr/min, une température de la solution de culture de 37 C et une période de culture de 5 jours.
Exemple comparatif Ia-2
Une culture de cellules a été effectuée de la même manière que dans l'exemple comparatif Ia-1, sauf que la vitesse de rotation de la barre d'agitation a été portée à 60 tr/min.
Une culture de cellules a été effectuée de la même manière que dans l'exemple comparatif Ia-1, sauf que la vitesse de rotation de la barre d'agitation a été portée à 60 tr/min.
Exemple comparatif Ia-3
Une culture de cellules a été effectuée de la même manière que dans l'exemple comparatif Ia-1, sauf que les supports de culture de cellules I-B ont été remplacés par les supports de culture de cellules I-C.
Une culture de cellules a été effectuée de la même manière que dans l'exemple comparatif Ia-1, sauf que les supports de culture de cellules I-B ont été remplacés par les supports de culture de cellules I-C.
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2-2 Culture de cellules dérivées de reins de singes (Vero)
Une telle cellule dérivée d'un rein de singe est une cellule ayant une longueur maximale d'environ 20 um.
Une telle cellule dérivée d'un rein de singe est une cellule ayant une longueur maximale d'environ 20 um.
(Exemples Ib-1 à Ib-4 et exemples comparatifs Ib-1 à Ib-3)
Une culture de cellules a été effectuée de la même manière que dans chacun des exemples Ia-1 à Ia-4 et exemples comparatifs Ia-1 à Ia-3, sauf que les cellules dérivées d'un ostéosarcome humain ont été remplacées par des cellules dérivées d'un rein de singe.
Une culture de cellules a été effectuée de la même manière que dans chacun des exemples Ia-1 à Ia-4 et exemples comparatifs Ia-1 à Ia-3, sauf que les cellules dérivées d'un ostéosarcome humain ont été remplacées par des cellules dérivées d'un rein de singe.
2-3 Culture de cellules provenant d'un moustique (c6-36)
Une telle cellule dérivée d'un moustique est une cellule ayant une longueur maximale d'environ 20 um.
Une telle cellule dérivée d'un moustique est une cellule ayant une longueur maximale d'environ 20 um.
(Exemples Ic-1 à Ic-4 et exemples comparatifs Ic-1 à Ic-3)
Une culture de cellules a été effectuée de la même manière que dans chacun des exemples Ia-1 à Ia-4 et exemples comparatifs Ia-1 à Ia-3, sauf que les cellules dérivées d'un ostéosarcome humain ont été remplacées par des cellules dérivées d'un moustique.
Une culture de cellules a été effectuée de la même manière que dans chacun des exemples Ia-1 à Ia-4 et exemples comparatifs Ia-1 à Ia-3, sauf que les cellules dérivées d'un ostéosarcome humain ont été remplacées par des cellules dérivées d'un moustique.
3. Evaluation
Dans chacun des exemples et exemples comparatifs, une quantité prédéterminée de la solution de culture a été prélevée au bout de 3 h, 1 jour, 3 jours et 5 jours après le début de la culture (début de l'agitation), puis le nombre de cellules adhérant à la surface des supports de culture de cellules (15 mg) a été déterminé par comptage.
Dans chacun des exemples et exemples comparatifs, une quantité prédéterminée de la solution de culture a été prélevée au bout de 3 h, 1 jour, 3 jours et 5 jours après le début de la culture (début de l'agitation), puis le nombre de cellules adhérant à la surface des supports de culture de cellules (15 mg) a été déterminé par comptage.
Le nombre de cellules a été compté en soumettant les cellules traitées avec de l'EDTA ou de la trypsine à une coloration avec du bleu Trypan.
Les résultats sont présentés sur les tableaux 1 à 3.
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Tableau 1 (Cellules dérivées d'un ostéosarcome humain (HOS) )
<tb>
<tb> Support <SEP> de <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> cellules
<tb> culture <SEP> de <SEP> (x <SEP> 105 <SEP> cellules/ml)
<tb> cellules <SEP> Après <SEP> Après <SEP> Après <SEP> Après
<tb> 3 <SEP> h <SEP> 1 <SEP> jour <SEP> 3 <SEP> jours <SEP> 5 <SEP> jours
<tb> Ex. <SEP> Ia-1 <SEP> I-A <SEP> 0,9 <SEP> 4,0 <SEP> 9,8 <SEP> 9,9
<tb> Ex. <SEP> Ia-2 <SEP> I-A <SEP> 0,9 <SEP> 4,2 <SEP> 9,9 <SEP> 10,1
<tb> Ex. <SEP> Ia-3 <SEP> I-A+I-B <SEP> 1,0 <SEP> 4,5 <SEP> 10,1 <SEP> 11,0
<tb> Ex. <SEP> Ia-4 <SEP> I-A+I-C <SEP> 1,0 <SEP> 4,8 <SEP> 10,2 <SEP> 10,8
<tb> Ex. <SEP> comp. <SEP> Ia-1 <SEP> I-B <SEP> 0,6 <SEP> 3,9 <SEP> 5,5 <SEP> 6,1
<tb> Ex. <SEP> comp. <SEP> Ia-2 <SEP> I-B <SEP> 0,4 <SEP> 0,6 <SEP> 0,5 <SEP> 0,3
<tb> Ex. <SEP> comp. <SEP> Ia-3 <SEP> I-C <SEP> 0,9 <SEP> 4,2 <SEP> 5,8 <SEP> 6,5
<tb>
Tableau 2 (Cellules dérivées de reins de singe (Vero) )
<tb> Support <SEP> de <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> cellules
<tb> culture <SEP> de <SEP> (x <SEP> 105 <SEP> cellules/ml)
<tb> cellules <SEP> Après <SEP> Après <SEP> Après <SEP> Après
<tb> 3 <SEP> h <SEP> 1 <SEP> jour <SEP> 3 <SEP> jours <SEP> 5 <SEP> jours
<tb> Ex. <SEP> Ia-1 <SEP> I-A <SEP> 0,9 <SEP> 4,0 <SEP> 9,8 <SEP> 9,9
<tb> Ex. <SEP> Ia-2 <SEP> I-A <SEP> 0,9 <SEP> 4,2 <SEP> 9,9 <SEP> 10,1
<tb> Ex. <SEP> Ia-3 <SEP> I-A+I-B <SEP> 1,0 <SEP> 4,5 <SEP> 10,1 <SEP> 11,0
<tb> Ex. <SEP> Ia-4 <SEP> I-A+I-C <SEP> 1,0 <SEP> 4,8 <SEP> 10,2 <SEP> 10,8
<tb> Ex. <SEP> comp. <SEP> Ia-1 <SEP> I-B <SEP> 0,6 <SEP> 3,9 <SEP> 5,5 <SEP> 6,1
<tb> Ex. <SEP> comp. <SEP> Ia-2 <SEP> I-B <SEP> 0,4 <SEP> 0,6 <SEP> 0,5 <SEP> 0,3
<tb> Ex. <SEP> comp. <SEP> Ia-3 <SEP> I-C <SEP> 0,9 <SEP> 4,2 <SEP> 5,8 <SEP> 6,5
<tb>
Tableau 2 (Cellules dérivées de reins de singe (Vero) )
<tb>
<tb> Supports <SEP> pour <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> cellules
<tb> culture <SEP> de <SEP> (x <SEP> 105 <SEP> cellules/ml)
<tb> cellules <SEP> Après <SEP> Après <SEP> Après <SEP> Après
<tb> 3 <SEP> h <SEP> 1 <SEP> jour <SEP> 3 <SEP> jours <SEP> 5 <SEP> jours
<tb> Ex. <SEP> Ib-1 <SEP> I-A <SEP> 1,0 <SEP> 2,9 <SEP> 6,0 <SEP> 9,8
<tb> Ex. <SEP> Ib-2 <SEP> I-A <SEP> 0,9 <SEP> 3,0 <SEP> 6,0 <SEP> 9,9
<tb> Ex. <SEP> Ib-3 <SEP> I-A+I-B <SEP> 1,0 <SEP> 3,5 <SEP> 6,5 <SEP> 11,5
<tb> Ex. <SEP> Ib-4 <SEP> I-A+I-C <SEP> 1,0 <SEP> 3,4 <SEP> 7,0 <SEP> 11,1
<tb> Ex. <SEP> comp. <SEP> Ib-1 <SEP> I-B <SEP> 0,6 <SEP> 3,1 <SEP> 5,5 <SEP> 6,5
<tb> Ex. <SEP> comp. <SEP> Ib-2 <SEP> I-B <SEP> 0,5 <SEP> 0,4 <SEP> 0,1 <SEP> 0,1
<tb> Ex. <SEP> comp. <SEP> Ib-3 <SEP> I-C <SEP> 0,9 <SEP> 3,0 <SEP> 5,8 <SEP> 7,0
<tb>
Tableau 3 (Cellules dérivées d'un moustique (C6/36))
<tb> Supports <SEP> pour <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> cellules
<tb> culture <SEP> de <SEP> (x <SEP> 105 <SEP> cellules/ml)
<tb> cellules <SEP> Après <SEP> Après <SEP> Après <SEP> Après
<tb> 3 <SEP> h <SEP> 1 <SEP> jour <SEP> 3 <SEP> jours <SEP> 5 <SEP> jours
<tb> Ex. <SEP> Ib-1 <SEP> I-A <SEP> 1,0 <SEP> 2,9 <SEP> 6,0 <SEP> 9,8
<tb> Ex. <SEP> Ib-2 <SEP> I-A <SEP> 0,9 <SEP> 3,0 <SEP> 6,0 <SEP> 9,9
<tb> Ex. <SEP> Ib-3 <SEP> I-A+I-B <SEP> 1,0 <SEP> 3,5 <SEP> 6,5 <SEP> 11,5
<tb> Ex. <SEP> Ib-4 <SEP> I-A+I-C <SEP> 1,0 <SEP> 3,4 <SEP> 7,0 <SEP> 11,1
<tb> Ex. <SEP> comp. <SEP> Ib-1 <SEP> I-B <SEP> 0,6 <SEP> 3,1 <SEP> 5,5 <SEP> 6,5
<tb> Ex. <SEP> comp. <SEP> Ib-2 <SEP> I-B <SEP> 0,5 <SEP> 0,4 <SEP> 0,1 <SEP> 0,1
<tb> Ex. <SEP> comp. <SEP> Ib-3 <SEP> I-C <SEP> 0,9 <SEP> 3,0 <SEP> 5,8 <SEP> 7,0
<tb>
Tableau 3 (Cellules dérivées d'un moustique (C6/36))
<tb>
<tb> Supports <SEP> de <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> cellules
<tb> culture <SEP> de <SEP> (x <SEP> 105 <SEP> cellules/ml)
<tb> cellules <SEP> Après <SEP> Après <SEP> Après <SEP> Après
<tb> 3 <SEP> h <SEP> 1 <SEP> jour <SEP> 3 <SEP> jours <SEP> 5 <SEP> jours
<tb> Ex. <SEP> Ic-1 <SEP> I-A <SEP> 0,8 <SEP> 2,5 <SEP> 5,6 <SEP> 8,3
<tb> Ex. <SEP> Ic-2 <SEP> I-A <SEP> 0,6 <SEP> 3,2 <SEP> 5,8 <SEP> 8,5
<tb> Ex. <SEP> Ic-3 <SEP> I-A+I-B <SEP> 0,9 <SEP> 4,2 <SEP> 8,0 <SEP> 9,2
<tb> Ex. <SEP> Ic-4 <SEP> I-A+I-C <SEP> 1,0 <SEP> 4,5 <SEP> 8,3 <SEP> 9,8
<tb> Ex. <SEP> comp. <SEP> Ic-1 <SEP> I-B <SEP> 0,4 <SEP> 2,5 <SEP> 4,8 <SEP> 5,2
<tb> Ex. <SEP> comp. <SEP> Ic-2 <SEP> I-B <SEP> 0,1 <SEP> 0,08 <SEP> 0,04 <SEP> 0,01
<tb> Ex. <SEP> comp. <SEP> Ic-3 <SEP> I-C <SEP> 0,6 <SEP> 2,5 <SEP> 5,0 <SEP> 5,9
<tb>
<tb> Supports <SEP> de <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> cellules
<tb> culture <SEP> de <SEP> (x <SEP> 105 <SEP> cellules/ml)
<tb> cellules <SEP> Après <SEP> Après <SEP> Après <SEP> Après
<tb> 3 <SEP> h <SEP> 1 <SEP> jour <SEP> 3 <SEP> jours <SEP> 5 <SEP> jours
<tb> Ex. <SEP> Ic-1 <SEP> I-A <SEP> 0,8 <SEP> 2,5 <SEP> 5,6 <SEP> 8,3
<tb> Ex. <SEP> Ic-2 <SEP> I-A <SEP> 0,6 <SEP> 3,2 <SEP> 5,8 <SEP> 8,5
<tb> Ex. <SEP> Ic-3 <SEP> I-A+I-B <SEP> 0,9 <SEP> 4,2 <SEP> 8,0 <SEP> 9,2
<tb> Ex. <SEP> Ic-4 <SEP> I-A+I-C <SEP> 1,0 <SEP> 4,5 <SEP> 8,3 <SEP> 9,8
<tb> Ex. <SEP> comp. <SEP> Ic-1 <SEP> I-B <SEP> 0,4 <SEP> 2,5 <SEP> 4,8 <SEP> 5,2
<tb> Ex. <SEP> comp. <SEP> Ic-2 <SEP> I-B <SEP> 0,1 <SEP> 0,08 <SEP> 0,04 <SEP> 0,01
<tb> Ex. <SEP> comp. <SEP> Ic-3 <SEP> I-C <SEP> 0,6 <SEP> 2,5 <SEP> 5,0 <SEP> 5,9
<tb>
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Comme le montrent chacun des tableaux, il devient manifeste que tous les exemples (présente invention) manifestent une plus grande efficacité de culture de cellules que les exemples comparatifs, quel que soit le type de cellules.
En outre, même dans le cas où l'intervalle d'impulsion du motif engendré de champ magnétique a été modifié, les exemples (présente invention) n'ont pas manifesté une grande variation d'efficacité de croissance des cellules. Cela indique qu'il n'est pas nécessaire de fixer strictement les conditions de culture en fonction du type de cellule et de paramètres similaires dans les exemples.
D'autre part, les exemples comparatifs utilisant une fiole d'agitation centrifuge pour la culture variaient largement en ce qui concerne l'efficacité de culture des cellules en fonction de la vitesse de rotation du barreau d'agitation. Cela signifie que, dans les exemples comparatifs, l'état des cellules qui se sont développées variait fortement en fonction de la vitesse de rotation du barreau d'agitation, quel que soit le type de cellule. Cela indique que l'optimisation des conditions de culture est extrêmement difficile. En outre, dans les exemples comparatifs, le détachement des cellules des supports pour culture de cellules a été confirmé.
A cet égard, il faut noter qu'une culture de cellules a été également effectuée de la même manière que dans chacun des exemples décrits ci-dessus, en utilisant l'appareil de culture de cellules représenté sur la figure 5, la figure 7 ou la figure 8 et en faisant varier considérablement le motif d'un champ magnétique. Les résultats étaient identiques à ceux décrits ci-dessus.
Procédé de culture de cellules de la deuxième forme de réalisation 1. Préparation de supports de culture de cellules et de particules magnétiques
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Supports de cultures de cellules II-A
Tout d'abord, 50 g de particules de Nylon (corps de base) ayant un diamètre moyen de particules de 150 pm et une masse volumique de 1,02 g/cm3 et 0,25 g de particules d'hydroxyapatite (particules poreuses obtenues par agglomération de particules primaires) ayant un rapport Ca/P de 1,67 et un diamètre moyen de particules de 10 um ont été préparés.
Tout d'abord, 50 g de particules de Nylon (corps de base) ayant un diamètre moyen de particules de 150 pm et une masse volumique de 1,02 g/cm3 et 0,25 g de particules d'hydroxyapatite (particules poreuses obtenues par agglomération de particules primaires) ayant un rapport Ca/P de 1,67 et un diamètre moyen de particules de 10 um ont été préparés.
La particule d'hydroxyapatite avait une surface spécifique de 45 m2 /g et un diamètre des pores de 600 Â.
Puis ces particules de Nylon et particules d'hydroxyapatite ont été introduites dans un appareil NARA HYBRIDIZATION SYSTEM NHS/1 (produit par Nara Machinery Co., Ltd., ayant une puissance émise de 5,5 kW et un courant émis de 23 A) et le système a été soumis à un fonctionnement à 6400 tr/min à une température de 32 à 50 C pendant 5 min. De cette manière, des supports de culture de cellules II-A revêtus d'hydroxyapatite (chacun ayant une structure représentée sur la figure 2) ont été obtenus.
Le support de culture de cellules II-A ainsi obtenu avait un diamètre moyen de particules de 151 um (l'épaisseur moyenne de la couche d'hydroxyapatite de revêtement était égale à 1 um) , et une masse volumique de 1,03 g/cm3.
Supports de culture de cellules II-B
Des particules de dextrane ayant un diamètre moyen de particules de 200 pm et une masse volumique de 1,03 g/cm3 (produites par Pharmacia) ont été préparées comme supports de culture de cellules II-B.
Des particules de dextrane ayant un diamètre moyen de particules de 200 pm et une masse volumique de 1,03 g/cm3 (produites par Pharmacia) ont été préparées comme supports de culture de cellules II-B.
Support de culture de cellules II-C
Des particules de Nylon ayant un diamètre moyen de particules de 150 m et une masse volumique de 1,02 g/cm3 ont été préparées comme supports de culture de cellules II-C.
Des particules de Nylon ayant un diamètre moyen de particules de 150 m et une masse volumique de 1,02 g/cm3 ont été préparées comme supports de culture de cellules II-C.
Particules magnétiques II-A
Des particules composites de Nylon-ferrite (chacune ayant une structure représentée sur la figure 3) ayant un
Des particules composites de Nylon-ferrite (chacune ayant une structure représentée sur la figure 3) ayant un
<Desc/Clms Page number 55>
diamètre moyen de particules de 150 um et une masse volumique de 1,90 g/cm3 ont été préparées comme particules magnétiques II-A
Particules magnétiques II-B
Tout d'abord, 50 g de particules composites de Nylonferrite ayant un diamètre moyen de particules de 150 um et une masse volumique de 1,90 g/cm3 et 0,25 g de particules d'hydroxyapatite (particules poreuses obtenues par agglomération de particules primaires) ayant un rapport Ca/P de 1,67 et un diamètre moyen de particules de 10 um ont été préparés.
Particules magnétiques II-B
Tout d'abord, 50 g de particules composites de Nylonferrite ayant un diamètre moyen de particules de 150 um et une masse volumique de 1,90 g/cm3 et 0,25 g de particules d'hydroxyapatite (particules poreuses obtenues par agglomération de particules primaires) ayant un rapport Ca/P de 1,67 et un diamètre moyen de particules de 10 um ont été préparés.
La particule d'hydroxyapatite avait une surface spécifique de 45 m2/g et un diamètre des pores de 600 Â.
Puis ces particules composites de Nylon-ferrite et particules d'hydroxyapatite ont été introduites dans un appareil NARA HYBRIDIZATION SYSTEM NHS/1 (produit par Nara Machinery Co., Ltd., ayant une puissance émise de 5,5 kW et un courant émis de 23 A) et le système a été soumis à un fonctionnement à 6400 tr/min à une température de 32 à 50 C pendant 5 min. De cette manière, des particules magnétique II-B revêtues d'hydroxyapatite ont été obtenues.
La particule magnétique II-B ainsi obtenue avait un diamètre moyen de particules de 151 m (l'épaisseur moyenne de la couche d'hydroxyapatite de revêtement était égale à 1,0 um) et une masse volumique de 1,93 g/cm3.
2. Culture de cellules
2-1 Culture de cellules dérivées d'un ostéosarcome humain (HOS)
Une telle cellule dérivée d'un ostéosarcome humain est une cellule ayant une longueur maximale d'environ 20 pm.
2-1 Culture de cellules dérivées d'un ostéosarcome humain (HOS)
Une telle cellule dérivée d'un ostéosarcome humain est une cellule ayant une longueur maximale d'environ 20 pm.
Exemple IIa-1
0,8g des supports de culture de cellules II-A, 0,6g des particules magnétiques II-A et 30 ml d'une suspension contenant 2 x 105 cellules dérivées d'un ostéosarcome humain (HOS) par millilitre (/ml) ont été ajoutés à 100 ml de milieu MEM de Nissui (solution de culture). Il faut
0,8g des supports de culture de cellules II-A, 0,6g des particules magnétiques II-A et 30 ml d'une suspension contenant 2 x 105 cellules dérivées d'un ostéosarcome humain (HOS) par millilitre (/ml) ont été ajoutés à 100 ml de milieu MEM de Nissui (solution de culture). Il faut
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noter que 10 % en volume de sérum de f#tus bovin avaient été ajoutés au milieu MEM de Nissui. Le rapport en volume entre les supports de culture de cellules II-A et les particules magnétiques II-A était égal à 70:30.
Cette solution de culture a été stockée dans un récipient de culture (qui est un récipient en verre résistant à la chaleur produit par IWAKI-PYREX) d'un appareil de culture de cellules représenté sur la figure 5 et les cellules ont été cultivées. En ce qui concerne les conditions de culture, le motif d'un champ magnétique engendré était un motif représenté sur la figure 6(a), l'intervalle d'impulsion était égal à 2 s, la température de la solution de culture était égale à 37 C et le temps de culture était égal à 5 jours.
Exemple IIa-2
Une culture de cellules a été effectuée de la même manière que dans l'exemple IIa-1, sauf que l'intervalle d'impulsion a été porté à 10 s.
Une culture de cellules a été effectuée de la même manière que dans l'exemple IIa-1, sauf que l'intervalle d'impulsion a été porté à 10 s.
Exemple IIa-3
Une culture de cellules a été effectuée de la même manière que dans l'exemple I-A, sauf que les particules magnétiques II-A ont été remplacées par les particules magnétiques II-B. Le rapport en volume entre les supports de culture de cellules II-A et les particules magnétiques II-B était égal à 70:30.
Une culture de cellules a été effectuée de la même manière que dans l'exemple I-A, sauf que les particules magnétiques II-A ont été remplacées par les particules magnétiques II-B. Le rapport en volume entre les supports de culture de cellules II-A et les particules magnétiques II-B était égal à 70:30.
Exemple IIa-4
Une culture de cellules a été effectuée de la même manière que dans l'exemple IIa-1, sauf qu'une quantité de 0,8 g des supports de culture des cellules II-A a été remplacée par 0,2 g des supports de culture de cellules II-B.
Une culture de cellules a été effectuée de la même manière que dans l'exemple IIa-1, sauf qu'une quantité de 0,8 g des supports de culture des cellules II-A a été remplacée par 0,2 g des supports de culture de cellules II-B.
Exemple comparatif IIa-1
0,8 g des supports pour culture de cellules A et 30 ml d'une suspension contenant 2 x 105 cellules dérivées d'un ostéosarcome humain (HOS) par millilitre ont été ajoutés à 100 ml de milieu MEM de Nissui (solution de culture). Il
0,8 g des supports pour culture de cellules A et 30 ml d'une suspension contenant 2 x 105 cellules dérivées d'un ostéosarcome humain (HOS) par millilitre ont été ajoutés à 100 ml de milieu MEM de Nissui (solution de culture). Il
<Desc/Clms Page number 57>
faut noter que 10 % en volume de sérum de f#tus bovin avaient été ajoutés au milieu MEM de Nissui.
Cette solution de culture a été introduite dans une fiole d'agitation centrifuge (produite par Shibata Scientific Technology Ltd. ) et les cellules ont été cultivées. Les conditions de culture étaient une vitesse de rotation du barreau d'agitation de 30 tr/min, une température de la solution de culture de 37 C et un temps de culture de 5 jours.
Exemple comparatif IIa-2
Une culture de cellules a été effectuée de la même manière que dans l'exemple comparatif IIa-1, sauf que la vitesse de rotation du barreau d'agitation a été portée à 60 tr/min.
Une culture de cellules a été effectuée de la même manière que dans l'exemple comparatif IIa-1, sauf que la vitesse de rotation du barreau d'agitation a été portée à 60 tr/min.
Exemple comparatif IIa-3
Une culture de cellules a été effectuée de la même manière que dans l'exemple comparatif IIa-1, sauf que les supports de culture de cellules II-A ont été remplacés par les supports de culture de cellules II-C.
Une culture de cellules a été effectuée de la même manière que dans l'exemple comparatif IIa-1, sauf que les supports de culture de cellules II-A ont été remplacés par les supports de culture de cellules II-C.
2-2 Culture de cellules dérivées de reins de singe (Vero)
Une telle cellule dérivée d'un rein de singe est une cellule ayant une longueur maximale d'environ 20 um.
Une telle cellule dérivée d'un rein de singe est une cellule ayant une longueur maximale d'environ 20 um.
Exemples IIb-1 à IIb-4 et exemples comparatifs IIb-1 à IIb-3
Une culture de cellules a été effectuée de la même manière que dans chacun des exemples IIa-1 à IIa-4 et exemples comparatifs IIa-1 à IIa-3, sauf que les cellules dérivées d'un ostéosarcome humain ont été remplacées par des cellules dérivées d'un rein de singe.
Une culture de cellules a été effectuée de la même manière que dans chacun des exemples IIa-1 à IIa-4 et exemples comparatifs IIa-1 à IIa-3, sauf que les cellules dérivées d'un ostéosarcome humain ont été remplacées par des cellules dérivées d'un rein de singe.
2-3 Culture de cellules dérivées d'un moustique (C6/36)
Une telle cellule dérivée d'un moustique est une cellule ayant une longueur maximale d'environ 20 um.
Une telle cellule dérivée d'un moustique est une cellule ayant une longueur maximale d'environ 20 um.
<Desc/Clms Page number 58>
(Exemples IIc-1 à IIc-4 et exemples comparatifs IIc-1 à IIc-3)
Une culture de cellules a été effectuée de la même manière que dans chacun des exemples IIa-1 à IIa-4 et exemples comparatifs IIa-1 à IIa-3, sauf que les cellules dérivées d'un ostéosarcome humain ont été remplacées par des cellules dérivées d'un moustique.
Une culture de cellules a été effectuée de la même manière que dans chacun des exemples IIa-1 à IIa-4 et exemples comparatifs IIa-1 à IIa-3, sauf que les cellules dérivées d'un ostéosarcome humain ont été remplacées par des cellules dérivées d'un moustique.
3. Evaluation
Dans chacun des exemples et exemples comparatifs, une quantité prédéterminée de la solution de culture a été prélevée au bout de 3 h, 1 jour, 3 jours et 5 jours après le début de la culture (début d'agitation), puis le nombre de cellules adhérant à la surface des supports de culture de cellules (15 mg) a été déterminé par comptage. Le nombre de cellules a été compté en soumettant les cellules traitées avec de l'EDTA ou de la trypsine à une coloration avec du bleu Trypan.
Dans chacun des exemples et exemples comparatifs, une quantité prédéterminée de la solution de culture a été prélevée au bout de 3 h, 1 jour, 3 jours et 5 jours après le début de la culture (début d'agitation), puis le nombre de cellules adhérant à la surface des supports de culture de cellules (15 mg) a été déterminé par comptage. Le nombre de cellules a été compté en soumettant les cellules traitées avec de l'EDTA ou de la trypsine à une coloration avec du bleu Trypan.
Les résultats sont présentés sur les tableaux 4 à 6.
<Desc/Clms Page number 59>
Tableau 4 (Cellules dérivées d'un ostéosarcome humain (HOS))
<tb>
<tb> Supports <SEP> Parti- <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> cellules <SEP> (x <SEP> 105 <SEP> cellules/ml)
<tb> de <SEP> cules <SEP> Après <SEP> 3 <SEP> h <SEP> Après <SEP> 1 <SEP> Après <SEP> 3 <SEP> Après
<tb> culture <SEP> magnéti- <SEP> jour <SEP> jours <SEP> 5 <SEP> jours
<tb> de <SEP> ques
<tb> cellules
<tb> Ex. <SEP> IIa-1 <SEP> II-A <SEP> II-A <SEP> 0,9 <SEP> 4,1 <SEP> 9,8 <SEP> 10,0
<tb> Ex. <SEP> IIa-2 <SEP> II-A <SEP> II-A <SEP> 1,0 <SEP> 4,3 <SEP> 9,6 <SEP> 9,6
<tb> Ex. <SEP> IIa-3 <SEP> II-A <SEP> II-B <SEP> 1,0 <SEP> 4,5 <SEP> 10,1 <SEP> 11,0
<tb> Ex. <SEP> IIa-4 <SEP> II-B <SEP> II-A <SEP> 0,9 <SEP> 4,0 <SEP> 9,6 <SEP> 9,8
<tb> Ex. <SEP> comp. <SEP> II-A <SEP> - <SEP> 0,9 <SEP> 3,5 <SEP> 9,0 <SEP> 9,0
<tb> A-1
<tb> Ex. <SEP> comp. <SEP> II-A <SEP> - <SEP> 0,8 <SEP> 0,9 <SEP> 1,2 <SEP> 1,0
<tb> IIa-2
<tb> Ex. <SEP> comp. <SEP> II-C <SEP> - <SEP> Mesure <SEP> Mesure <SEP> Mesure <SEP> Mesure
<tb> IIa-3 <SEP> impossible <SEP> impossible <SEP> impossible <SEP> impossible
<tb>
Tableau 5 (Cellules dérivées de rein de singe (Vero))
<tb> Supports <SEP> Parti- <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> cellules <SEP> (x <SEP> 105 <SEP> cellules/ml)
<tb> de <SEP> cules <SEP> Après <SEP> 3 <SEP> h <SEP> Après <SEP> 1 <SEP> Après <SEP> 3 <SEP> Après
<tb> culture <SEP> magnéti- <SEP> jour <SEP> jours <SEP> 5 <SEP> jours
<tb> de <SEP> ques
<tb> cellules
<tb> Ex. <SEP> IIa-1 <SEP> II-A <SEP> II-A <SEP> 0,9 <SEP> 4,1 <SEP> 9,8 <SEP> 10,0
<tb> Ex. <SEP> IIa-2 <SEP> II-A <SEP> II-A <SEP> 1,0 <SEP> 4,3 <SEP> 9,6 <SEP> 9,6
<tb> Ex. <SEP> IIa-3 <SEP> II-A <SEP> II-B <SEP> 1,0 <SEP> 4,5 <SEP> 10,1 <SEP> 11,0
<tb> Ex. <SEP> IIa-4 <SEP> II-B <SEP> II-A <SEP> 0,9 <SEP> 4,0 <SEP> 9,6 <SEP> 9,8
<tb> Ex. <SEP> comp. <SEP> II-A <SEP> - <SEP> 0,9 <SEP> 3,5 <SEP> 9,0 <SEP> 9,0
<tb> A-1
<tb> Ex. <SEP> comp. <SEP> II-A <SEP> - <SEP> 0,8 <SEP> 0,9 <SEP> 1,2 <SEP> 1,0
<tb> IIa-2
<tb> Ex. <SEP> comp. <SEP> II-C <SEP> - <SEP> Mesure <SEP> Mesure <SEP> Mesure <SEP> Mesure
<tb> IIa-3 <SEP> impossible <SEP> impossible <SEP> impossible <SEP> impossible
<tb>
Tableau 5 (Cellules dérivées de rein de singe (Vero))
<tb>
<tb> Supports <SEP> Parti- <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> cellules <SEP> (x <SEP> 105 <SEP> cellules/ml)
<tb> pour <SEP> cules <SEP> Après <SEP> Après <SEP> Après <SEP> Après
<tb> culture <SEP> magnéti- <SEP> 3 <SEP> h <SEP> 1 <SEP> jour <SEP> 3 <SEP> jours <SEP> 5 <SEP> jours
<tb> de <SEP> ques
<tb> ~~~~~~~~ <SEP> cellules
<tb> Ex. <SEP> IIb-1 <SEP> II-A <SEP> II-A <SEP> 1,0 <SEP> 3,0 <SEP> 5,8 <SEP> 9,8
<tb> Ex. <SEP> IIb-2 <SEP> II-A <SEP> II-A <SEP> 1,1 <SEP> 3,2 <SEP> 6,5 <SEP> 11,3
<tb> Ex. <SEP> IIb-3 <SEP> II-A <SEP> II-B <SEP> 1,0 <SEP> 3,5 <SEP> 6,5 <SEP> 11,5
<tb> Ex. <SEP> IIb-4 <SEP> II-B <SEP> II-A <SEP> 0,9 <SEP> 3,0 <SEP> 5,6 <SEP> 9,4
<tb> Ex. <SEP> comp. <SEP> II-A <SEP> - <SEP> 0,9 <SEP> 2,2 <SEP> 4,3 <SEP> 4,2
<tb> IIb-1
<tb> Ex. <SEP> comp. <SEP> II-A <SEP> - <SEP> 0,8 <SEP> 1,2 <SEP> 4,0 <SEP> 9,2
<tb> IIb-2
<tb> Ex. <SEP> comp. <SEP> II-C <SEP> - <SEP> Mesure <SEP> Mesure <SEP> Mesure <SEP> Mesure
<tb> IIb-3 <SEP> impossible <SEP> impossible <SEP> impossible <SEP> impossible
<tb>
<tb> Supports <SEP> Parti- <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> cellules <SEP> (x <SEP> 105 <SEP> cellules/ml)
<tb> pour <SEP> cules <SEP> Après <SEP> Après <SEP> Après <SEP> Après
<tb> culture <SEP> magnéti- <SEP> 3 <SEP> h <SEP> 1 <SEP> jour <SEP> 3 <SEP> jours <SEP> 5 <SEP> jours
<tb> de <SEP> ques
<tb> ~~~~~~~~ <SEP> cellules
<tb> Ex. <SEP> IIb-1 <SEP> II-A <SEP> II-A <SEP> 1,0 <SEP> 3,0 <SEP> 5,8 <SEP> 9,8
<tb> Ex. <SEP> IIb-2 <SEP> II-A <SEP> II-A <SEP> 1,1 <SEP> 3,2 <SEP> 6,5 <SEP> 11,3
<tb> Ex. <SEP> IIb-3 <SEP> II-A <SEP> II-B <SEP> 1,0 <SEP> 3,5 <SEP> 6,5 <SEP> 11,5
<tb> Ex. <SEP> IIb-4 <SEP> II-B <SEP> II-A <SEP> 0,9 <SEP> 3,0 <SEP> 5,6 <SEP> 9,4
<tb> Ex. <SEP> comp. <SEP> II-A <SEP> - <SEP> 0,9 <SEP> 2,2 <SEP> 4,3 <SEP> 4,2
<tb> IIb-1
<tb> Ex. <SEP> comp. <SEP> II-A <SEP> - <SEP> 0,8 <SEP> 1,2 <SEP> 4,0 <SEP> 9,2
<tb> IIb-2
<tb> Ex. <SEP> comp. <SEP> II-C <SEP> - <SEP> Mesure <SEP> Mesure <SEP> Mesure <SEP> Mesure
<tb> IIb-3 <SEP> impossible <SEP> impossible <SEP> impossible <SEP> impossible
<tb>
<Desc/Clms Page number 60>
Tableau 6 (Cellules dérivées d'un moustique (C6/36))
<tb>
<tb> Supports <SEP> Parti- <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> cellules <SEP> (x <SEP> 105 <SEP> cellules/ml)
<tb> pour <SEP> cules <SEP> Après <SEP> Après <SEP> Après <SEP> Après
<tb> culture <SEP> magnéti- <SEP> 3 <SEP> h <SEP> 1 <SEP> jour <SEP> 3 <SEP> jours <SEP> 5 <SEP> jours
<tb> de <SEP> ques
<tb> cellules
<tb> Ex. <SEP> IIc-1 <SEP> II-A <SEP> II-A <SEP> 0,8 <SEP> 2,2 <SEP> 5,3 <SEP> 8,0
<tb> Ex. <SEP> IIc-2 <SEP> II-A <SEP> II-A <SEP> 0,8 <SEP> 4,2 <SEP> 7,5 <SEP> 8,9
<tb> Ex. <SEP> IIc-3 <SEP> II-A <SEP> II-B <SEP> 0,9 <SEP> 4,2 <SEP> 8,0 <SEP> 9,2
<tb> Ex. <SEP> IIc-4 <SEP> II-B <SEP> II-A <SEP> 0,8 <SEP> 2,1 <SEP> 5,5 <SEP> 7,9
<tb> Ex. <SEP> comp. <SEP> II-A <SEP> - <SEP> 0,8 <SEP> 1,0 <SEP> 4,8 <SEP> 7,5
<tb> IIc-1
<tb> Ex. <SEP> comp. <SEP> II-A <SEP> - <SEP> 0,7 <SEP> 0,9 <SEP> 0,9 <SEP> 0,8
<tb> IIc-2
<tb> Ex. <SEP> comp. <SEP> II-C <SEP> - <SEP> Mesure <SEP> Mesure <SEP> Mesure <SEP> Mesure
<tb> IIc-3 <SEP> impossible <SEP> impossible <SEP> impossible <SEP> impossible
<tb>
<tb> Supports <SEP> Parti- <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> cellules <SEP> (x <SEP> 105 <SEP> cellules/ml)
<tb> pour <SEP> cules <SEP> Après <SEP> Après <SEP> Après <SEP> Après
<tb> culture <SEP> magnéti- <SEP> 3 <SEP> h <SEP> 1 <SEP> jour <SEP> 3 <SEP> jours <SEP> 5 <SEP> jours
<tb> de <SEP> ques
<tb> cellules
<tb> Ex. <SEP> IIc-1 <SEP> II-A <SEP> II-A <SEP> 0,8 <SEP> 2,2 <SEP> 5,3 <SEP> 8,0
<tb> Ex. <SEP> IIc-2 <SEP> II-A <SEP> II-A <SEP> 0,8 <SEP> 4,2 <SEP> 7,5 <SEP> 8,9
<tb> Ex. <SEP> IIc-3 <SEP> II-A <SEP> II-B <SEP> 0,9 <SEP> 4,2 <SEP> 8,0 <SEP> 9,2
<tb> Ex. <SEP> IIc-4 <SEP> II-B <SEP> II-A <SEP> 0,8 <SEP> 2,1 <SEP> 5,5 <SEP> 7,9
<tb> Ex. <SEP> comp. <SEP> II-A <SEP> - <SEP> 0,8 <SEP> 1,0 <SEP> 4,8 <SEP> 7,5
<tb> IIc-1
<tb> Ex. <SEP> comp. <SEP> II-A <SEP> - <SEP> 0,7 <SEP> 0,9 <SEP> 0,9 <SEP> 0,8
<tb> IIc-2
<tb> Ex. <SEP> comp. <SEP> II-C <SEP> - <SEP> Mesure <SEP> Mesure <SEP> Mesure <SEP> Mesure
<tb> IIc-3 <SEP> impossible <SEP> impossible <SEP> impossible <SEP> impossible
<tb>
Comme le montrent chacun des tableaux, il est devenu manifeste que tous les exemples (présente invention) manifestent une plus grande efficacité de culture de cellules que les exemples comparatifs, quel que soit le type de cellule.
En outre, même dans le cas où l'intervalle d'impulsion du motif engendré d'un champ magnétique a été modifié, les exemples (présente invention) n'ont pas manifesté une forte variation d'efficacité de croissance des cellules. Cela indique que, dans le cas des exemples, il n'est pas nécessaire de fixer strictement les conditions de culture en fonction du type de cellule et de paramètres similaires.
D'autre part, les exemples comparatifs utilisant une fiole d'agitation centrifuge pour la culture ont présenté une forte variation d'efficacité de culture des cellules en fonction de la vitesse de rotation du barreau d'agitation. Cela signifie que, dans les exemples comparatifs, l'état des cellules qui se sont développées variait fortement en fonction de la vitesse de rotation du barreau d'agitation,
<Desc/Clms Page number 61>
quel que soit le type de cellule. Cela indique que l'optimisation des conditions de culture est extrêmement difficile. En outre, dans les exemples comparatifs, le détachement des cellules des supports pour la culture des cellules a été confirmé.
Il faut noter qu'une culture de cellules a été effectuée de la même manière que dans chacun des exemples décrits ci-dessus, en utilisant l'appareil de culture de cellules représenté sur la figure 5, la figure 7 et la figure 8 et en faisant varier considérablement le motif du champ magnétique. Les résultats étaient identiques à ceux décrits ci-dessus.
Effet de l'invention
Comme cela a été décrit ci-dessus, conformément à la présente invention, il est possible d'agiter une solution de culture de manière uniforme et douce, ce qui permet aux cellules de croître efficacement.
Comme cela a été décrit ci-dessus, conformément à la présente invention, il est possible d'agiter une solution de culture de manière uniforme et douce, ce qui permet aux cellules de croître efficacement.
En outre, en choisissant de manière appropriée les structures du support de culture de cellules et de la particule magnétique, l'effet décrit ci-dessus peut être encore amélioré.
Enfin, il doit être entendu que de nombreuses modifications et additions peuvent être apportées aux formes de réalisation décrites ci-dessus sans s'écarter du cadre et de l'esprit de l'invention, tels qu'ils sont définis dans les revendications suivantes.
En outre, il doit également être entendu que la présente invention concerne le sujet figurant dans les Demandes de Brevet japonais n 2003-107143 et n 2003- 107144 (toutes deux déposées le 10 avril 2003) qui sont expressément citées dans leur intégralité à titre de référence dans le présent mémoire.
Claims (47)
1. Procédé pour cultiver des cellules, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant : à préparer une solution de culture de cellules contenant au moins des cellules à cultiver et des supports granulaires de culture de cellules auxquels les cellules peuvent adhérer et se développer sur ceux-ci ; et à appliquer un champ magnétique à la solution de culture de cellules de manière à agiter la solution de culture de cellules sous l'effet du champ magnétique, ce qui fait que les cellules adhèrent aux, et se développent sur les, surfaces des supports de culture de cellules.
2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que chacun des supports comprend une particule magnétique ayant une surface et une couche de revêtement qui est fournie pour couvrir au moins une partie de la surface de la particule magnétique de telle sorte que les cellules puissent y adhérer, les supports de culture de cellules étant déplacés dans la solution de culture par application du champ magnétique, ce qui agite la solution de culture.
3. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que l'intensité du champ magnétique appliqué à la solution de culture de cellules est modifiée au cours du temps.
4. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que la position du champ magnétique appliqué à la solution de culture de cellules est modifiée au cours du temps.
5. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que la masse volumique de chacun des supports de culture de cellules est comprise dans l'intervalle de 0, 8 à 2,5 g/cm3.
6. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que, lorsque le diamètre moyen de particules des supports de culture de cellules est défini par A um et la
<Desc/Clms Page number 63>
longueur maximale de la cellule pouvant adhérer aux supports de culture de cellules est définie par B um, le rapport A/B est compris dans l'intervalle de 2 à 100.
7. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que le diamètre moyen de particules des supports de culture de cellules est compris dans l'intervalle de 50 à 500 pm.
8. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que la couche de revêtement est constituée principalement d'un composé à base de phosphate de calcium.
9. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que la couche de revêtement est formée de fines particules du composé à base de phosphate de calcium, les particules étant partiellement incluses dans une surface incluant, et adjacente à, la surface de la particule magnétique.
10. Procédé suivant la revendication 9, caractérisé en ce que les particules du composé à base de phosphate de calcium sont formées à partir de particules poreuses, et la couche de revêtement est formée par collision des particules poreuses avec la surface de la particule magnétique.
11. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que chacune des particules magnétiques est formée en mélangeant une résine et une matière magnétique.
12. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la solution de culture contient en outre des particules magnétiques et les particules magnétiques sont déplacées dans la solution de culture par application du champ magnétique, ce qui agite la solution de culture.
13. Procédé suivant la revendication 12, caractérisé en ce que l'intensité du champ magnétique appliqué à la solution de culture de cellules est modifiée au cours du temps.
14. Procédé suivant la revendication 12, caractérisé en ce que la position du champ magnétique appliqué à la
<Desc/Clms Page number 64>
solution de culture de cellules est modifiée au cours du temps.
15. Procédé suivant la revendication 12, caractérisé en ce que chacun des supports comprend un corps de base constitué d'une résine ayant une surface et une couche de revêtement qui est fournie pour couvrir au moins une partie de la surface du corps de base de telle sorte que les cellules puissent y adhérer.
16. Procédé suivant la revendication 15, caractérisé en ce que la couche de revêtement est constituée principalement d'un composé à base de phosphate de calcium.
17. Procédé suivant la revendication 16, caractérisé en ce que la couche de revêtement est formée de fines particules du composé à base de phosphate de calcium, les particules étant incluses partiellement dans une surface incluant, et adjacente à, la surface du corps de base.
18. Procédé suivant la revendication 17, caractérisé en ce que les particules du composé à base de phosphate de calcium sont formées à partir de particules poreuses, et la couche de revêtement est formée par collision des particules poreuses avec la surface de la particule magnétique.
19. Procédé suivant la revendication 12, caractérisé en ce que la masse volumique de chacun des supports de culture de cellules est comprise dans l'intervalle de 0, 8 à 1,4g/ cm3.
20. Procédé suivant la revendication 12, caractérisé en ce que, lorsque le diamètre moyen de particules des supports de culture de cellules est défini par A um et la longueur maximale de la cellule qui peut adhérer aux supports de culture de cellules est définie par B um, le rapport A/B est compris dans l'intervalle de 2 à 100.
21. Procédé suivant la revendication 12, caractérisé en ce que, lorsque le diamètre moyen de particules des supports de culture de cellules est défini par A pm et le diamètre moyen de particules des particules magnétiques est
<Desc/Clms Page number 65>
défini par C um, le rapport C/A est compris dans l'intervalle de 0,02 à 10.
22. Procédé suivant la revendication 12, caractérisé en ce que le diamètre moyen de particules des supports de culture de cellules est compris dans l'intervalle de 50 à 500 m.
23. Procédé suivant la revendication 12, caractérisé en ce que chacune des particules magnétiques est formée en mélangeant une résine et une matière magnétique.
24. Procédé suivant la revendication 12, caractérisé en ce que la masse volumique de chacune des particules magnétiques est comprise dans l'intervalle de 0, 8 à 2, 5 g/cm3.
25. Procédé suivant la revendication 12, caractérisé en ce que le diamètre moyen de particules des particules magnétiques est compris dans l'intervalle de 10 à 500 um.
26. Procédé suivant la revendication 12, caractérisé en ce que chacune des particules magnétiques comprend en outre une couche de revêtement qui couvre au moins une partie de la surface de la particule magnétique de telle sorte que les cellules puissent y adhérer.
27. Procédé suivant la revendication 26, caractérisé en ce que la couche de revêtement est constituée principalement d'un composé à base de phosphate de calcium.
28. Procédé suivant la revendication 27, caractérisé en ce que la couche de revêtement est formée de fines particules du composé à base de phosphate de calcium, les particules étant incluses partiellement dans une surface incluant, et adjacente à, la surface de la particule magnétique.
29. Procédé suivant la revendication 28, caractérisé en ce que les particules du composé à base de phosphate de calcium sont formées à partir de particules poreuses, et la couche de revêtement est formée par collision des particules poreuses avec la surface de la particule magnétique.
<Desc/Clms Page number 66>
30. Procédé suivant la revendication 12, caractérisé en ce que le rapport de mélange des particules magnétiques et des supports de culture de cellules est compris dans l'intervalle de 10 :90 50 :50, rapport en volume.
31. Supports de culture de cellules auxquels des cellules peuvent adhérer sur leurs surfaces et y croître, caractérisés en ce que chacun des supports comprend : une particule magnétique ayant une surface ; une couche de revêtement qui est fournie pour couvrir au moins une partie de la surface de la particule magnétique de telle sorte que les cellules puissent y adhérer.
32. Supports de culture de cellules suivant la revendication 31, caractérisés en ce que la masse volumique du support est comprise dans l'intervalle de 0,8à 2,5 g/cm3.
33. Supports de culture de cellules suivant la revendication 31, caractérisés en ce que, lorsque le diamètre moyen de particules des supports de culture de cellules est défini par A um et la longueur maximale de la cellule qui peut adhérer au support de culture de cellules est définie par B um, le rapport A/B est compris dans l'intervalle de 2 à 100.
34. Supports de culture de cellules suivant la revendication 31, caractérisés en ce que le diamètre de particules des supports de culture de cellules est compris dans l'intervalle de 50 à 500 m.
35. Supports de culture de cellules suivant la revendication 31, caractérisés en ce que la couche de revêtement est constituée principalement d'un composé à base de phosphate de calcium.
36. Supports de culture de cellules suivant la revendication 35, caractérisés en ce que la couche de revêtement est formée de fines particules du composé à base de phosphate de calcium, les fines particules étant
<Desc/Clms Page number 67>
partiellement incluses dans la particule magnétique à proximité de sa surface.
37. Supports de culture de cellules suivant la revendication 36, caractérisés en ce que les fines particules du composé à base de phosphate de calcium sont formées à partir de particules poreuses, et la couche de revêtement est formée par collision des particules poreuses avec la surface de la particule magnétique.
38. Supports de culture de cellules suivant la revendication 31, caractérisés en ce que les particules magnétiques sont formées en mélangeant une résine et une matière magnétique.
39. Appareil de culture de cellules, caractérisé en ce qu'il comprend : un récipient de culture de cellules pour stocker une solution de culture de cellules contenant au moins des cellules à cultiver et des supports granulaires de culture de cellules auxquels les cellules peuvent adhérer et s'y développer ; et au moins un générateur de champ magnétique pour appliquer un champ magnétique à la solution de culture afin d'agiter la solution de culture sous l'effet du champ magnétique.
40. Appareil de culture de cellules suivant la revendication 39, caractérisé en ce que chacun des supports comprend une particule magnétique ayant une surface et une couche de revêtement fournie pour couvrir au moins une partie de la surface de la particule magnétique de telle sorte que les cellules puissent y adhérer, les supports de culture de cellules étant déplacés dans la solution de culture par application du champ magnétique, ce qui agite la solution de culture.
41. Appareil de culture de cellules suivant la revendication 39, caractérisé en ce que la solution de culture contient en outre des particules magnétiques, et les particules magnétiques sont déplacées dans la solution
<Desc/Clms Page number 68>
de culture par application du champ magnétique, agitant ainsi la solution de culture.
42. Appareil de culture de cellules suivant la revendication 39, caractérisé en ce que le générateur de champ magnétique est construit de telle sorte que l'intensité du champ magnétique engendré soit modifiée au cours du temps.
43. Appareil de culture de cellules suivant la revendication 39, caractérisé en ce que le générateur de champ magnétique est construit de telle sorte que la position du champ magnétique engendré soit modifiée au cours du temps.
44. Appareil de culture de cellules suivant la revendication 39, caractérisé en ce que le générateur de champ magnétique est placé autour de la périphérie extérieure du récipient de culture de cellules.
45. Appareil de culture de cellules suivant la revendication 39, caractérisé en ce que le générateur de champ magnétique est fourni de manière à venir en contact avec la solution de culture.
46. Appareil de culture de cellules suivant la revendication 39, caractérisé en ce que le générateur de champ magnétique est placé à proximité de la surface liquide de la solution de culture présente dans le récipient de culture de cellules.
47. Appareil de culture de cellules suivant la revendication 39, caractérisé en ce que ledit au moins un générateur de champ magnétique comprend deux ou plus de deux générateurs de champ magnétique.
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