JP2004313007A - 細胞培養担体、細胞培養方法および細胞培養装置 - Google Patents

Abstract

【課題】均一かつ緩やか（マイルド）に培養液を撹拌することができ、細胞を効率よく付着、増殖させることができる細胞培養担体、かかる細胞培養担体を用いる細胞培養方法および細胞培養装置を提供すること。
【解決手段】本発明の細胞培養装置１００は、細胞と細胞培養担体１とを含む培養液１４０を収納する培養容器１１０と、培養液１４０中で細胞培養担体１を移動させるための磁場を発生する磁場発生装置１２０と、コントローラ１３０と、加温装置１５０とを有している。この細胞培養装置１００では、培養液１４０へ磁場を与え、培養液１４０中で細胞培養担体１を移動させることにより、培養液１４０を撹拌するとともに、細胞を細胞培養担体１の表面に付着させ、増殖させる。
【選択図】図２

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞培養担体、細胞培養方法および細胞培養装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、細胞培養技術が、細胞組織工学、医薬品等の安全性試験、治療や診断を目的としたタンパク質の生産等、様々な産業、研究分野で応用されている。
【０００３】
現在、この細胞培養には、付着依存性細胞を大量に効率よく培養するために、培養フラスコによる平面培養ではなく、細胞の足場となるビーズ状の担体を用いた三次元高密度培養（マイクロキャリヤー培養）が用いられている。
【０００４】
このマイクロキャリヤー培養には、各種の担体（細胞培養担体）が用いられている。
【０００５】
ところで、マイクロキャリヤー培養では、担体を均一に懸濁させ、付着させた各細胞に偏りなく栄養を供給するため、細胞培養を行っている間は、培養液を十分に撹拌することが重要となる。
【０００６】
これまで、このマイクロキャリヤー培養には、一般に、羽根（フィン）が形成された撹拌子を用い、これを回転させながら培養液の撹拌を行うスピンナーフラスコが使用されている（特許文献１参照）。
【０００７】
しかしながら、スピンナーフラスコを用いるマイクロキャリヤー培養では、撹拌子の回転速度が速過ぎると、羽根と担体とが激しく衝突して細胞が担体から脱落したり、破壊されてしまう場合があり、細胞を十分に増殖させることができない。一方、撹拌子の回転速度が遅過ぎると、担体がスピンナーフラスコ中で沈んでしまい、培養液中に均一に懸濁されない。このような場合、細胞への栄養供給に偏りが生じ、期待する程の増殖率が得られないため、攪拌子を適度な回転速度で回転させることが極めて重要となる。
【０００８】
ところが、スピンナーフラスコを用いるマイクロキャリヤー培養では、攪拌子を適度な回転速度で回転させることが非常に難しいという問題がある。また、用いる細胞の種類やフラスコの形状等に応じて、培養条件（攪拌子の回転速度等）の設定が必要であるという問題もある。
【０００９】
【特許文献１】
特開平０６−２０９７６１号公報
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、均一かつ緩やか（マイルド）に培養液を撹拌することができ、細胞を効率よく付着、増殖させることができる細胞培養担体、かかる細胞培養担体を用いる細胞培養方法および細胞培養装置を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
このような目的は、下記（１）〜（１９）の本発明により達成される。
【００１２】
（１） 細胞を表面に付着させ、増殖させる細胞培養担体であって、
磁性粒子と、該磁性粒子の表面の少なくとも一部を覆うように形成され、前記細胞が付着し得る被覆層とを有することを特徴とする細胞培養担体。
【００１３】
本発明によれば、均一かつ緩やかに培養液を撹拌することができ、細胞を効率よく付着、増殖させることができる。
【００１４】
（２） 前記細胞培養担体の密度は、０．８〜２．５ｇ／ｃｍ^３である上記（１）に記載の細胞培養担体。
これにより、培養液の撹拌を十分に行うことができる。
【００１５】
（３） 前記細胞培養担体の平均粒径をＡ［μｍ］とし、前記細胞培養担体に付着させる細胞の最大長さをＢ［μｍ］としたとき、Ａ／Ｂが２〜１００である上記（１）または（２）に記載の細胞培養担体。
【００１６】
これにより、細胞培養担体の表面積を細胞の大きさ（サイズ）に対して十分に大きくすることができるため、細胞が細胞培養担体の表面に付着、増殖するのがより容易となる。
【００１７】
（４） 前記細胞培養担体の平均粒径は、５０〜５００μｍである上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の細胞培養担体。
【００１８】
これにより、細胞が細胞培養担体の表面に付着、増殖するのがより容易となるとともに、細胞培養担体を培養液中でより均一に懸濁させることができる。
【００１９】
（５） 前記被覆層は、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成されている上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の細胞培養担体。
【００２０】
リン酸カルシウム系化合物は、生物学的に不活性であり、細胞に対してダメージを与えるおそれが極めて低いことから好ましい。
【００２１】
（６） 前記被覆層は、前記磁性粒子の表面付近に、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された粒子の一部が貫入することにより形成されたものである上記（５）に記載の細胞培養担体。
これにより、被覆層と磁性粒子との密着性を優れたものとすることができる。
【００２２】
（７） 前記被覆層は、前記磁性粒子の表面に、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された多孔質粒子を衝突させることにより形成されたものである上記（６）に記載の細胞培養担体。
かかる方法によれば、容易かつ確実に、被覆層を形成することができる。
【００２３】
（８） 前記磁性粒子は、樹脂材料と磁性材料とを複合化してなるものである上記（１）ないし（７）のいずれかに記載の細胞培養担体。
【００２４】
これにより、樹脂材料と磁性材料との配合比率（混合比率）を設定することで、容易に磁性粒子（延いては、細胞培養担体）の密度（比重）を調整することができるとともに、細胞培養担体の形状、大きさ（平均粒径等）等の調整が容易となる。
【００２５】
（９） 上記（１）ないし（８）のいずれかに記載の細胞培養担体と、細胞とを含む培養液へ磁場を与え、前記培養液中で前記細胞培養担体を移動させることにより、前記培養液を撹拌するとともに、前記細胞を前記細胞培養担体の表面に付着させ、増殖させることを特徴とする細胞培養方法。
【００２６】
本発明によれば、均一かつ緩やかに培養液を撹拌することができ、細胞を効率よく付着、増殖させることができる。
【００２７】
（１０） 前記培養液へ与える磁場の強度を、経時的に変化させる上記（９）に記載の細胞培養方法。
これにより、培養液をより均一に攪拌することができる。
【００２８】
（１１） 前記培養液へ与える磁場の位置を、経時的に変化させる上記（９）または（１０）に記載の細胞培養方法。
これにより、培養液をより均一に攪拌することができる。
【００２９】
（１２） 上記（９）ないし（１１）のいずれかに記載の細胞培養方法に用いることを特徴とする細胞培養装置。
【００３０】
本発明によれば、均一かつ緩やかに培養液を撹拌することができ、細胞を効率よく付着、増殖させることができる。
【００３１】
（１３） 上記（１）ないし（８）のいずれかに記載の細胞培養担体と、細胞とを含む培養液を収納する培養容器と、
前記培養液中で前記細胞培養担体を移動させるための磁場を発生する磁場発生装置とを有することを特徴とする細胞培養装置。
【００３２】
本発明によれば、均一かつ緩やかに培養液を撹拌することができ、細胞を効率よく付着、増殖させることができる。
【００３３】
（１４） 前記磁場発生装置は、発生する磁場の強度を経時的に変化させるよう構成されている上記（１３）に記載の細胞培養装置。
これにより、培養液をより均一に攪拌することができる。
【００３４】
（１５） 前記磁場発生装置は、発生する磁場の位置を経時的に変化させるよう構成されている上記（１３）または（１４）に記載の細胞培養装置。
これにより、培養液をより均一に攪拌することができる。
【００３５】
（１６） 前記磁場発生装置は、前記培養容器の外周部に設けられている上記（１３）ないし（１５）のいずれかに記載の細胞培養装置。
【００３６】
（１７） 前記磁場発生装置は、前記培養液に接触して設けられている上記（１３）ないし（１５）のいずれかに記載の細胞培養装置。
【００３７】
（１８） 前記磁場発生装置は、前記培養容器内に収納された前記培養液の液面付近に設けられている上記（１３）ないし（１７）のいずれかに記載の細胞培養装置。
【００３８】
これにより、細胞培養担体を上下方向に大きく移動させることができ、培養液をより均一に撹拌することができる。
【００３９】
（１９） 前記磁場発生手段を複数個有する上記（１３）ないし（１８）のいずれかに記載の細胞培養装置。
【００４０】
これにより、細胞培養担体の培養液中での移動をより複雑なパターンとすることができる。
【００４１】
【発明の実施の形態】
本発明は、細胞を懸濁させた培養液（液体培地）を撹拌しながら、細胞を浮遊状態で増殖させる撹拌培養に適用される。
【００４２】
ここで、この撹拌培養では、特に細胞が付着依存性細胞の場合、細胞とともに、細胞を付着させる細胞培養担体を培養液中に懸濁し、この細胞培養担体の表面に細胞を付着させた状態で増殖させることが行われる。
【００４３】
細胞培養担体を用いる培養方法は、特にマイクロキャリヤー培養と称され、本発明は、このマイクロキャリヤー培養に好適に用いることができる。
【００４４】
以下、本発明の細胞培養担体、細胞培養方法および細胞培養装置を、マイクロキャリヤー培養に適用した場合を一例として説明する。
【００４５】
まず、本発明の細胞培養担体について説明する。
図１は、本発明の細胞培養担体の実施形態を示す断面図である。
【００４６】
図１に示す細胞培養担体１は、磁性粒子２と、この磁性粒子２の表面を覆うように形成され、細胞が付着し得る被覆層３とを有している。この細胞培養担体１は、磁場が与えられることにより、培養液中で移動し、培養液を均一かつ緩やか（マイルド）に攪拌する。このため、細胞が細胞培養担体１の表面に付着し易くなるとともに、付着した細胞には、均一に栄養が供給されることになる。したがって、細胞培養担体１は、細胞増殖の良好な足場となる。
【００４７】
また、従来のスピナーフラスコを用いた培養のように、羽根と細胞培養担体１とが衝突して生じる激しい衝撃が細胞培養担体１に加わるのを防止することができるので、付着した細胞が細胞培養担体１の表面から脱落することや、細胞が破壊されるのを防止することができる。
【００４８】
磁性粒子２は、細胞培養担体１の骨格を構成する部分である。磁性粒子２は、その全体が磁性材料で構成されたものであってもよいが、樹脂材料と磁性材料とを複合化してなる複合化粒子であるのが好ましい。これにより、樹脂材料と磁性材料との配合比率（混合比率）を設定することで、容易に磁性粒子２（延いては、細胞培養担体１）の密度（比重）を調整することができる。また、細胞培養担体１の形状、大きさ（平均粒径等）等の調整が容易となるという利点もある。
【００４９】
この複合化粒子（磁性粒子２）の形態としては、図１に示すように、主として樹脂材料で構成された基材２１中に磁性材料（磁性粉体）２２が分散されたものが好適である。かかる磁性粒子２は、例えば、磁性材料２２を混合した溶融状態の樹脂材料を粒状に成形（造粒）することにより、比較的容易に製造することができる。なお、複合化粒子は、磁性材料２２が基材２１の表面付近にのみ分散されたものであってもよい。
【００５０】
この磁性材料２２としては、例えば、酸化鉄、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ等を主成分とする強磁性合金、フェライト、バリウムフェライト、ストロンチウムフェライト等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００５１】
また、樹脂材料としては、各種熱硬化性樹脂、各種熱可塑性樹脂を用いることができ、具体的には、熱可塑性樹脂としては、例えば、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリイミド、アクリル樹脂、熱可塑性ポリウレタン等、熱硬化性樹脂としては、例えば、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、尿素樹脂、不飽和ポリエステル、アルキド樹脂、熱硬化性ポリウレタン、エボナイド等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００５２】
また、樹脂材料は、有機顔料、無機顔料、酸性染料、塩基性染料等で着色されたものであってもよい。
【００５３】
被覆層３は、細胞が付着し得る材料で構成されている。このような材料としては、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、セルロース、デキストラン等を用いることもできるが、特に、リン酸カルシウム系化合物を主材料とするものが好適である。リン酸カルシウム系化合物は、生物学的に不活性であり、細胞に対してダメージを与えるおそれが極めて低いことから好ましい。
【００５４】
特に、リン酸カルシウム系化合物を主材料として被覆層３を形成することにより、磁性材料２２から生じる金属イオンを被覆層３で捕捉して、培養液中に金属イオンが溶出するのを防止することもできる。これにより、細胞への悪影響を防止することができる。この場合、被覆層３は、イオンバリヤ層として機能する。
【００５５】
リン酸カルシウム系化合物としては、特に限定されず、Ｃａ／Ｐ比が１．０〜２．０の各種化合物を用いることができ、例えば、Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６（ＯＨ）_２、Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６Ｆ_２、Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６Ｃｌ_２、Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２、Ｃａ_２Ｐ_２Ｏ_７、Ｃａ（ＰＯ_３）_２、ＣａＨＰＯ_４等のうちの１種または２種以上を混合して用いることができる。
【００５６】
これらの中でも、リン酸カルシウム系化合物としては、ハイドロキシアパタイト（Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６（ＯＨ）_２）を主成分とするものが最適である。ハイドロキシアパタイトは、生体材料として用いられるものであり、細胞が極めて効率よく付着することができ、かつ、細胞に対するダメージを与える可能性が特に低い。
【００５７】
また、フッ素アパタイト（Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６Ｆ_２）を用いる場合には、全リン酸カルシウム系化合物中のフッ素含有率を、５重量％以下とするのが好ましい。全リン酸カルシウム系化合物中のフッ素含有率を、５重量％以下とすることにより、被覆層３（細胞培養担体１）からのフッ素の溶出が防止または極めて少量とされるので、細胞へのダメージは、無いかまたは極めて小さいものとすることができ、その結果、細胞の増殖効率が低下するのが防止される。
【００５８】
なお、これらのリン酸カルシウム系化合物は、公知の湿式合成法、乾式合成法などによって合成することができる。この場合、リン酸カルシウム系化合物中には、その合成の際に残存する物質（原料等）または合成の過程で生じる二次反応生成物等が含まれていてもよい。
【００５９】
被覆層３を主としてリン酸カルシウム系化合物で構成する場合、この被覆層３は、磁性粒子２の表面に、リン酸カルシウム系化合物を吸着させることにより形成されたものであってもよいが、図１に示すように、磁性粒子２の表面付近に、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された粒子３１（以下、単に「粒子３１」と言う。）の一部が貫入することにより形成されたものであるのが好ましい。これにより、被覆層３と磁性粒子２との密着性を優れたものとすることができる。このため、被覆層３の磁性粒子２の表面からの剥離を好適に防止すること、すなわち、細胞培養担体１の強度を優れたものとすることができる。
【００６０】
また、この場合、被覆層３は、例えば、磁性粒子２の表面に、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された多孔質粒子（以下、単に「多孔質粒子」と言う。）を衝突させることにより形成することができる。かかる方法によれば、容易かつ確実に、被覆層３を形成することができる。
【００６１】
磁性粒子２の表面に多孔質粒子を衝突させると、多孔質粒子は、磁性粒子２に衝突する際に、破砕されて比較的小さい粒径の粒子３１となり、その一部が磁性粒子２に貫入する。このとき、粒子３１の一部が磁性粒子２に貫入すると、磁性粒子２は、自らの弾性力により粒子３１を掴み込むようにして固定する。
【００６２】
また、多孔質粒子は、リン酸カルシウム系化合物の一次粒子を凝集結合させることにより製造されたものを用いるのが好ましい。このような多孔質粒子は、磁性粒子２に衝突した際に、より効率よく破砕されるので、磁性粒子２の表面をより確実に被覆することができる。
【００６３】
多孔質粒子の平均粒径は、特に限定されないが、１００μｍ以下であるのが好ましい。多孔質粒子の平均粒径が１００μｍを超えると、磁性粒子２への衝突時の速度が低くなり、多孔質粒子が効率よく破砕されない場合がある。
【００６４】
この磁性粒子２と多孔質粒子との衝突は、例えば、市販のハイブリダイゼーション装置を用いて、乾式で行うことができる。このときの条件は、例えば、磁性粒子２と多孔質粒子との混合比が、重量比で４００：１〜５０：１程度、装置内の温度が、磁性粒子２の主材料として用いた樹脂材料の軟化温度以下（通常、８０℃以下）とされる。
【００６５】
また、このような多孔質粒子は、例えば、次のような公知の方法で製造することができる。
【００６６】
すなわち、多孔質粒子は、公知の方法で湿式合成したリン酸カルシウム系化合物の結晶粒子（一次粒子）を含むスラリーを、直接噴霧乾燥などにより二次粒子に造粒するか、または、前記スラリーに粘度調整剤、加熱により消失する有機化合物粒子または繊維等の添加物を加えて、噴霧乾燥などにより二次粒子に造粒する。なお、得られた二次粒子は、必要に応じて焼成するようにしてもよい。
【００６７】
この二次粒子自体が多孔質粒子となっているので、この二次粒子をそのまま被覆層３の形成に使用することができる。
【００６８】
さらに、より高気孔率の多孔質粒子が好ましい場合には、例えば、次の方法で製造するようにする。
【００６９】
まず、前記二次粒子を再びスラリー状に懸濁して、湿式成形または加圧による乾式成形等により、ブロック体に成形する。なお、この際、後の焼成工程で消散して、気孔を形成するための有機化合物を添加してもよい。また、かかる有機化合物を添加せずに、例えば焼成温度等の他の条件を調節することにより、気孔径を制御することもできる。次いで、得られたブロック体を４００〜１３００℃程度の温度範囲で焼成する。焼成温度が４００℃未満では、有機化合物の熱消失、ブロック体の焼結等が充分に行われないおそれがある。一方、焼成を１３００℃を超える高温で行うと、焼結体が緻密化し過ぎたり、リン酸カルシウム系化合物が分解を起こすおそれがある。次いで、このように焼成したブロック体を粉砕後、分級して所望の粒径のものとする。
【００７０】
この多孔質粒子の気孔径は、例えば、前記一次粒子の大きさ、スラリーの粘度、添加物等を適宜設定することによって、調整することができる。
【００７１】
このようにして得られる多孔質粒子は、その比表面積が１０ｍ^２／ｇ以上、かつ、細孔径（気孔径）が５００〜１０００Å程度であることが好ましい。かかる条件を満足する多孔質粒子を用いて製造される細胞培養担体１は、その表面への細胞の付着の効率、付着した細胞の増殖の効率をより向上させることができる。
【００７２】
なお、被覆層３の形成方法（細胞培養担体１の製造方法）は、これに限定されるものではない。
【００７３】
このような被覆層３は、緻密質なものまたは多孔質なもののいずれであってもよい。
【００７４】
また、被覆層３の平均厚さは、特に限定されないが、０．１〜５μｍ程度であるのが好ましく、０．５〜２μｍ程度であるのがより好ましい。被覆層３の平均厚さが前記下限値未満である場合、細胞培養担体１では、部分的に磁性粒子２が露出してしまうおそれがある。一方、被覆層３の平均厚さが前記上限値を超えた場合、細胞培養担体１の密度の調整が困難となる。
【００７５】
このような細胞培養担体１は、磁場を与えることにより容易に移動可能であり、また、磁場を取り除いたときには培養液中で沈降（沈殿）し得るものであるのが好ましい。これにより、培養液をより容易かつ確実に攪拌することができる。
【００７６】
かかる観点からは、細胞培養担体１の密度（比重）は、０．８〜２．５ｇ／ｃｍ^３程度であるのが好ましく、１．０〜１．２ｇ／ｃｍ^３程度であるのがより好ましい。細胞培養担体１の密度が小さ過ぎると、磁場を取り除いた際に、細胞培養担体１が培養液中で沈降し難くなり、一方、細胞培養担体１の密度が大き過ぎると、細胞培養担体１を培養液中で移動させるのに大きな磁場が必要となり、いずれの場合も、培養液の撹拌を十分に行えないおそれがある。
【００７７】
また、細胞培養担体１の大きさ（サイズ）も、特に限定されないが、例えば、次のようなものが好ましい。
【００７８】
すなわち、細胞培養担体１の平均粒径をＡ［μｍ］とし、細胞培養担体１に付着させる細胞の最大長さをＢ［μｍ］としたとき、Ａ／Ｂが２〜１００程度であるのが好ましく、５〜５０程度であるのがより好ましい。これにより、細胞培養担体１の表面積を細胞の大きさ（サイズ）に対して十分に大きくすることができるため、細胞が細胞培養担体１の表面に付着、増殖するのがより容易となる。
【００７９】
具体的には、細胞培養担体１の平均粒径は、５０〜５００μｍ程度であるのが好ましく、１００〜３００μｍ程度であるのがより好ましい。これにより、前記効果をより向上させることができる。
【００８０】
以上説明したような細胞培養担体１は、その表面により多くの細胞を付着させ、増殖させる観点からは、本実施形態のように、磁性粒子２の表面のほぼ全てが被覆層３で覆われているのが好ましいが、付着させる細胞の種類や、磁性粒子２の構成材料（樹脂材料）の種類等によっては、その表面の一部が被覆層３で覆われたような構成（換言すれば、磁性粒子２の一部が被覆層３から露出する構成）であってもよい。
【００８１】
次に、このような細胞培養担体１を用いて、細胞の培養を行う細胞培養装置（本発明の細胞培養装置）について説明する。
【００８２】
＜第１実施形態＞
まず、本発明の細胞培養装置の第１実施形態について説明する。
【００８３】
図２は、本発明の細胞培養装置の第１実施形態を示す模式図、図３は、磁場発生装置が発生する磁場のパターンを示す図である。
【００８４】
図２に示す細胞培養装置１００は、培養容器１１０と、磁場発生装置１２０と、コントローラ（制御部）１３０と、加温装置１５０とを有している。コントローラ１３０が電源に接続されることにより、細胞培養装置１００の各部の作動に必要な電力が供給される。
【００８５】
培養容器１１０は、培養液１４０を収納するものであり、上部に培養液１４０を供給・排出するための開口部１１１が形成されている。この開口部１１１は、必要に応じて栓体１１２によって閉塞され、培養容器１１０内の気密性が保たれるようになっている。
【００８６】
培養容器１１０の形状、容量等は、特に限定されず、用いる細胞の種類、培養液１４０の種類等に応じて適宜設定される。
【００８７】
磁場発生装置１２０は、培養液１４０中で細胞培養担体１を移動させるための磁場を発生するものであり、電磁石１２１と、この電磁石１２１を収納する非磁性体カバー（図示せず）とを有している。
【００８８】
本実施形態では、電磁石１２１は、金属製の環状の芯材１２２と、この芯材１２２の外周部にラセン状に巻回された導線１２３とで構成され、導線１２３に通電することにより周辺に磁場を発生する。
【００８９】
非磁性体カバーは、電磁石１２１を保護、固定する機能を有するものであり、例えば、アクリル系樹脂、シリコーン系樹脂等の各種樹脂材料等で構成されている。
【００９０】
このような磁場発生装置１２０の内側には、培養容器１１０が設けられている。換言すれば、磁場発生装置１２０は、培養容器１１０の外周部に設けられている。なお、磁場発生装置１２０は固定部材（図示せず）により、固定・保持されている。磁場発生装置１２０の培養容器１１０の高さ方向における設置位置は、培養液１４０を培養容器１１０内に収納（貯留）したときに、培養液１４０の液面付近とするのが好ましい。これにより、細胞培養担体１を上下方向に大きく移動させることができ、培養液１４０をより均一に撹拌することができる。
【００９１】
また、磁場発生装置１２０と培養容器１１０との離間距離（図２中ｄ）は、特に限定されないが、磁場発生装置１２０と培養容器１１０とができるだけ接近しているのが好ましく、特に、これらが接触（密着）して設けられているのが好ましい。
【００９２】
磁場発生装置１２０は、発生する磁場の強度を経時的に変化させるよう構成されている。この磁場発生装置１２０が発生する磁場のパターンとしては、例えば、一定間隔でオン／オフするパターン（図３（ａ）参照）が挙げられる。磁場を発生させると、細胞培養担体１が磁場発生装置１２０側に引き寄せられ、培養液１４０中で浮上する。また、この状態から磁場の発生を停止すると、磁場発生装置１２０側に引き寄せられた細胞培養担体１がその自重によって沈降する。このような細胞培養担体１の上下移動の繰り返しにより培養液１４０には乱流が生じ、培養液１４０が均一かつ緩やかに撹拌される。
【００９３】
磁場の最大強度（絶対値）は、細胞培養担体１の密度（比重）、培養液１４０の組成や容積等に応じて適宜設定され、特に限定されないが、０．１〜１００Ｗｂ／ｍ^２程度であるのが好ましく、０．２〜５０Ｗｂ／ｍ^２程度であるのがより好ましい。磁場の最大強度（磁束密度）が小さ過ぎると、細胞培養担体１を磁場発生装置１２０側に十分に引き寄せることが困難となり、培養液１４０の撹拌が不十分になるおそれがある。また、磁場の最大強度を前記上限値を超えて大きくしても、消費電力が無駄にかかるばかりか、磁場が細胞へ悪影響を及ぼすおそれがある。
【００９４】
なお、磁場発生装置１２０が発生する磁場のパターンは、一定間隔でオン／オフするパターン（図３（ａ）参照）に限らず、例えば、発生する磁場の強度を一定間隔で増減させるパターン（図３（ｂ）参照）、発生する磁場の強度や向き等を連続的に変化させるパターン（図３（ｃ）参照）等であってもよい。また、これらのパターンは、任意に組み合わせるようにしてもよい。
【００９５】
コントローラ１３０は、電源から供給される電流の条件（例えば、種類、量、方向、時間、周波数等）を変化させる機能を有するものである。そして、コントローラ１３０は、電源から供給される電流を変換して、所定の条件（パターン）の電流を電磁石１２１（磁場発生装置１２０）に供給する。例えば、磁場発生装置１２０に間欠的に磁場を発生させる場合、電源から供給される交流電流をパルス電流に変換し、電磁石１２１に供給する。
【００９６】
また、コントローラ１３０には、加温装置１５０が電気的に接続されている。この加温装置１５０は、例えば、ヒータ、ペルチェ素子等が内蔵されており、コントローラ１３０の制御により培養液１４０を加温する。
【００９７】
次に、このような細胞培養装置１００の使用方法（本発明の細胞培養方法）の一例を説明する。
【００９８】
［１］ まず、細胞培養担体１に、それぞれ滅菌処理を施す。これにより、細胞培養担体１の表面に存在する微生物やカビ等の数を低減、または、これらを完全に死滅させることができる。これにより、微生物やカビ等による細胞へのダメージが低減または除去され、細胞は、より効率よく増殖することができる。
【００９９】
この滅菌処理には、例えば、細胞培養担体１と滅菌液とを接触させる方法、オートクレーブ滅菌、ガス滅菌、放射線滅菌等を用いることができるが、これらの中でも、細胞培養担体１と滅菌液とを接触させる方法が好適である。かかる方法によれば、大量の細胞培養担体１を、より効率よく滅菌することができる。
【０１００】
滅菌液を用いる場合、滅菌処理後の細胞培養担体１を洗浄して、その表面に付着した滅菌液を除去する。
【０１０１】
［２］ 次に、前記工程［１］終了後の細胞培養担体１と、細胞（付着させる細胞）とを培養液１４０に添加（混合）し、この培養液１４０を、細胞培養装置１００の培養容器１１０内に収納（貯留）する。
【０１０２】
ここで、細胞には、例えば、目的とするタンパク質をコードする遺伝子を含むシャトルベクター（ベクター）を移入しておくようにする。
【０１０３】
この細胞としては、例えば、動物細胞、植物細胞、細菌、ウイルス等が挙げられるが、これらの中でも、特に、動物細胞が好適である。細胞として動物細胞を用いることにより、本発明をより広範な技術分野へ適用することが可能となるとともに、タンパク質の生産を行う場合には、より複雑な構造を有するもの（例えば、糖タンパク質等）の生産を好適に行うことができる。
【０１０４】
培養液１４０は、用いる細胞の種類等により適宜選択され、特に限定されないが、例えば、ダルベッコＭＥＭ培地、ニッスイＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＭＣＤＢ−１０４培地等を用いることができる。
【０１０５】
また、これらの培養液１４０中には、必要に応じて、例えば、血清、アルブミン等の血清タンパク質、各種ビタミン類、アミノ酸、塩類等の添加剤を添加するようにしてもよい。
【０１０６】
［３］ 次に、細胞培養装置１００を作動させると、前述のようにして培養液１４０には、磁場発生装置１２０から所定のパターンの磁場が与えられる（印加される）。これにより、培養液１４０中で細胞培養担体１が移動し、この細胞培養担体１の移動により培養液１４０が攪拌されるとともに、細胞培養担体１は、培養液１４０中に均一に懸濁される。
【０１０７】
また、このとき、加温装置１５０により培養液１４０は加温される。この培養液１４０の加温の温度は、培養する細胞の種類等に応じて適宜設定され、特に限定されないが、通常、４〜４０℃程度、好ましくは２５〜３７℃程度とされる。
【０１０８】
このような状態で、培養液１４０中では、細胞が細胞培養担体１の表面に付着し、その表面で増殖する。特に、細胞培養担体１の移動による培養液１４０の攪拌は、均一かつ緩やかに行われるため、細胞の培養を極めて効率よく行うことができる。
【０１０９】
そして、増殖した細胞は、目的とするタンパク質を生産（産生）して、このタンパク質を、例えば培養液１４０中へ放出したり、細胞内に蓄積したり等する。
【０１１０】
なお、このとき、必要に応じて、酸素ガスを含むガスを供給しつつ、細胞の培養を行うようにしてもよい。
【０１１１】
［４］ 次に、生産されたタンパク質を回収する。例えば、培養液１４０中に放出されたタンパク質を回収する場合には、次のようにすることができる。
【０１１２】
すなわち、前記工程［３］における培養液１４０の攪拌を停止して、細胞培養担体１が培養液１４０中で沈殿した後上清を採取するか、磁石を用いて細胞培養担体１を回収した後、培養液１４０を採取するか、または、培養液１４０を濾過して濾液を採取する。そして、この採取液（上清または濾液）を処理（例えば、クロマトグラフィー等）することにより、目的とするタンパク質を容易に回収することができる。
【０１１３】
＜第２実施形態＞
次に、本発明の細胞培養装置の第２実施形態について説明する。
【０１１４】
図４は、本発明の細胞培養装置の第２実施形態を示す模式図である。
以下、第２実施形態について説明するが、前記第１実施形態との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
【０１１５】
図４に示す細胞培養装置１００では、磁場発生装置１２０の構成が異なり、それ以外は、前記第１実施形態の細胞培養装置１００と同様である。
【０１１６】
すなわち、第２実施形態の磁場発生装置１２０は、直線状（円柱状）の芯材１２２の外周部にラセン状に導線１２３が巻回されてなる電磁石１２１を有している。なお、磁場発生装置１２０は、磁場に影響を与えない材料を主材料として構成される防水カバーで覆うことが好ましい。
【０１１７】
この磁場発生装置１２０は、培養容器１１０に装着される栓体１１２に挿通された状態で、固定（固着）されている。そして、本実施形態では、細胞の培養を行う際に、磁場発生装置１２０は、培養液１４０に接触するように設置される。
【０１１８】
磁場発生装置１２０が発生する磁場のパターンは、例えば、前述した図３に示すパターンとすることができる。
【０１１９】
このような第２実施形態の細胞培養装置１００においても、前記第１実施形態と同様の作用・効果が得られる。
【０１２０】
＜第３実施形態＞
次に、本発明の細胞培養装置の第３実施形態について説明する。
【０１２１】
図５は、本発明の細胞培養装置の第３実施形態を示す模式図、図６は、磁場発生装置が発生する磁場のパターンを示す図である。
【０１２２】
以下、第３実施形態について説明するが、前記第１実施形態との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
【０１２３】
図５に示す細胞培養装置１００では、磁場発生装置１２０の構成が異なり、それ以外は、前記第１実施形態の細胞培養装置１００と同様である。
【０１２４】
すなわち、第３実施形態の磁場発生装置１２０は、４つ（複数）の電磁石１２１Ａ〜１２１Ｄを備えている。
【０１２５】
そして、各電磁石１２１Ａ〜１２１Ｄは、培養容器１１０の周方向に沿って、ほぼ等間隔で設けられている。
【０１２６】
このような構成により、通電する電磁石１２１Ａ〜１２１Ｄを順次切り替えると、すなわち、発生する磁場の位置を経時的に変化させると、細胞培養担体１の培養液１４０中での移動をより複雑なパターンとすることができる。これにより、細胞培養担体１を培養液１４０中でより均一に懸濁させることができ、その結果、細胞をより効率よく増殖させることができる。
【０１２７】
各電磁石１２１Ａ〜１２１Ｄが発生する磁場のパターン（各電磁石１２１Ａ〜１２１Ｄへの通電の切替）は、例えば、図６に示すようにすることができる。すなわち、１つの電磁石が磁場を発生している間は、他の電磁石は磁場を発生しないようにし、磁場を発生する電磁石を順次（同期させて）切り替えていく。これにより、細胞培養担体１を培養容器１１０の内面に沿って移動させることができる。
【０１２８】
なお、各電磁石１２１Ａ〜１２１Ｄが発生する磁場のパターンは、図６に示すものに限定されず、例えば、図２に示すようなパターンを任意に組み合わせたものであってもよい。
【０１２９】
また、各電磁石１２１Ａ〜１２１Ｄは、互いに、例えば導線１２３の巻回数、全体形状、大きさ等が同じであってもよく、異なっていてもよい。
【０１３０】
このような第３実施形態の細胞培養装置１００においても、前記第１実施形態と同様の作用・効果が得られる。
【０１３１】
以上、本発明の細胞培養担体、細胞培養方法および細胞培養装置について説明したが、本発明は、これらに限定されるものではなく、各部の構成は、同様の機能を発揮する任意の構成のものに置換することができ、また、任意の構成を付加することもできる。
【０１３２】
例えば、各前記実施形態では、磁場発生装置は、電磁石を備える構成のものであったが、電磁石に代えて永久磁石を用いてもよい。この場合、例えば、永久磁石を培養容器に対して移動させる移動機構を設け、この永久磁石の移動操作により培養液中の磁性粒子を移動させるようにすることができる。また、この場合、永久磁石の移動は、上下、左右、斜め、回転等を任意に組み合わせることができる。また、各前記実施形態の任意の２以上の構成を組み合わせるようにしてもよい。
【０１３３】
また、各前記実施形態では、磁場発生装置が固定された構成のものであったが、本発明では、磁場発生装置と培養容器とが相対的に移動可能に設けられ、培養液へ与える磁場の位置を経時的に変化させる構成であってもよい。このような構成としては、磁場発生装置を培養容器に対して、例えば、上下方向へ、左右方向へ、接近離間させる方向へ、周方向に沿って、または、これらを組み合わせて移動させる構成等が挙げられる。
【０１３４】
さらに、本発明では、磁場発生装置は、前述したようなパターンで培養液へ与える磁場の強度を経時的に変化させるとともに、培養容器に対して相対的に移動可能に設けられ、培養液へ与える磁場の位置を経時的に変化させる構成とされていてもよい。
【０１３５】
また、本発明の細胞培養方法では、必要に応じて、他の細胞培養担体を併用することもできる。他の細胞培養担体としては、例えば、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、セルロース、デキストラン等を主材料とするもの、主として樹脂材料で構成された基材の表面を、細胞が付着し得る材料で被覆したもの等が挙げられる。
【０１３６】
【実施例】
次に、本発明の具体的実施例について説明する。
【０１３７】
１．細胞培養担体の用意
［細胞培養担体Ａ］
まず、平均粒径１５０μｍ、密度１．９０ｇ／ｃｍ^３のフェライト複合化ナイロン粒子５０ｇと、Ｃａ／Ｐ比１．６７、平均粒径１０μｍハイドロキシアパタイト粒子（一次粒子が凝集結合した多孔質粒子）０．２５ｇとを用意した。
【０１３８】
なお、ハイドロキシアパタイト粒子は、その比表面積が４５ｍ^２／ｇ、かつ、その細孔径が６００Åであった。
【０１３９】
次に、これらフェライト複合化ナイロン粒子およびハイドロキシアパタイト粒子をＮＡＲＡハイブリダイゼーションシステムＮＨＳ−１（（株）奈良機械製作所製、定格動力５．５ｋＷ、定格電流２３Ａ）に投入し、この装置を６４００回転／分、３２〜５０℃で５分間稼動させた。これにより、表面がハイドロキシアパタイトで被覆された細胞培養担体Ａ（図１参照）を得た。
【０１４０】
なお、得られた細胞培養担体Ａは、平均粒径１５１μｍ（ハイドロキシアパタイト被覆層の平均厚さ１．０μｍ）、密度１．９２ｇ／ｃｍ^３であった。
【０１４１】
［細胞培養担体Ｂ］
まず、平均粒径１５０μｍ、密度１．０２ｇ／ｃｍ^３のナイロン粒子（基材）５０ｇと、Ｃａ／Ｐ比１．６７、平均粒径１０μｍのハイドロキシアパタイト粒子（一次粒子が凝集結合した多孔質粒子）０．２５ｇとを用意した。
【０１４２】
なお、ハイドロキシアパタイト粒子は、その比表面積が４５ｍ^２／ｇ、かつ、その細孔径が６００Åであった。
【０１４３】
次に、これらナイロン粒子およびハイドロキシアパタイト粒子をＮＡＲＡハイブリダイゼーションシステムＮＨＳ−１（（株）奈良機械製作所製、定格動力５．５ｋＷ、定格電流２３Ａ）に投入し、この装置を６４００回転／分、３２〜５０℃で５分間稼動させた。これにより、表面がハイドロキシアパタイトで被覆された細胞培養担体Ｂを得た。
【０１４４】
なお、得られた細胞培養担体Ｂは、平均粒径１５１μｍ（ハイドロキシアパタイト被覆層の平均厚さ１μｍ）、密度１．０３ｇ／ｃｍ^３であった。
【０１４５】
［細胞培養担体Ｃ］
細胞培養担体Ｃとして、平均粒径２００μｍ、密度１．０３ｇ／ｃｍ^３のデキストラン粒子（ファルマシア社製）を用意した。
【０１４６】
２．細胞の培養
２−１． ヒト骨肉腫由来細胞（ＨＯＳ）の培養
このヒト骨肉腫由来細胞は、最大長さが約２０μｍの細胞である。
【０１４７】
（実施例１Ａ）
細胞培養担体Ａ：１．５ｇと、２×１０^５個／ｍＬのヒト骨肉腫由来細胞（ＨＯＳ）懸濁液：３０ｍＬとを、ニッスイＭＥＭ培地（培養液）１００ｍＬに添加した。なお、ニッスイＭＥＭ培地中には、１０ｖｏｌ％のウシ胎児血清を添加して用いた。
【０１４８】
この培養液を、図２に示すような細胞培養装置の培養容器（ＩＷＡＫＩ−ＰＹＲＥＸ社製、耐熱広口ガラス瓶）に収納して、細胞の培養を行った。なお、培養条件は、発生する磁場のパターン：図３（ａ）、パルス間隔：２秒、培養液の温度：３７℃、培養の日数：５日間とした。
【０１４９】
（実施例２Ａ）
パルス間隔を１０秒とした以外は、前記実施例１Ａと同様にして、細胞の培養を行った。
【０１５０】
（実施例３Ａ）
細胞培養担体Ａ：１．５ｇに代えて、細胞培養担体Ａ：０．６ｇと細胞培養担体Ｂ：０．８ｇとを用いた以外は、前記実施例１Ａと同様にして、細胞の培養を行った。
【０１５１】
（実施例４Ａ）
細胞培養担体Ａ：１．５ｇに代えて、細胞培養担体Ａ：０．６ｇと細胞培養担体Ｃ：０．８ｇとを用いた以外は、前記実施例１Ａと同様にして、細胞の培養を行った。
【０１５２】
（比較例１Ａ）
細胞培養担体Ｂ：１．５ｇと、２×１０^５個／ｍＬのヒト骨肉腫由来細胞（ＨＯＳ）懸濁液：３０ｍＬとを、ニッスイＭＥＭ培地（培養液）１００ｍＬに添加した。なお、ニッスイＭＥＭ培地中には、１０ｖｏｌ％のウシ胎児血清を添加して用いた。
【０１５３】
この培養液を、スピンナーフラスコ（柴田科学社製）に収納して、細胞の培養を行った。なお、培養条件は、撹拌子の回転速度：３０ｒｐｍ、培養液の温度：３７℃、培養の日数：５日間とした。
【０１５４】
（比較例２Ａ）
攪拌子の回転速度を６０ｒｐｍとした以外は、前記比較例１Ａと同様にして、細胞の培養を行った。
【０１５５】
（比較例３Ａ）
細胞培養担体Ｂに代えて、細胞培養担体Ｃを用いた以外は、前記比較例１Ａと同様にして、細胞の培養を行った。
【０１５６】
２−２． サル腎臓由来細胞（Ｖｅｒｏ）の培養
このサル腎臓由来細胞は、最大長さが約２０μｍの細胞である。
【０１５７】
（実施例１Ｂ〜４Ｂ、比較例１Ｂ〜３Ｂ）
サル腎臓由来細胞を用いた以外は、それぞれ、前記実施例１Ａ〜４Ａおよび比較例１Ａ〜３Ａと同様にして、細胞の培養を行った。
【０１５８】
２−３． 蚊由来細胞（Ｃ６／３６）の培養
この蚊由来細胞は、最大長さが約２０μｍの細胞である。
【０１５９】
（実施例１Ｃ〜４Ｃ、比較例１Ｃ〜３Ｃ）
蚊由来細胞を用いた以外は、それぞれ、前記実施例１Ａ〜４Ａおよび比較例１Ａ〜３Ａと同様にして、細胞の培養を行った。
【０１６０】
３．評価
各実施例および各比較例において、それぞれ、培養開始（撹拌開始）から３時間後、１日後、３日後、５日後に、各培養液の所定量を採取し、細胞培養担体（１５ｍｇ）の表面に付着している細胞の数を計測した。この細胞数の計測は、ＥＤＴＡまたはトリプシン処理した細胞をトリパンブルー染色することにより行った。
その結果を、表１〜表３に示す。
【０１６１】
【表１】

【０１６２】
【表２】

【０１６３】
【表３】

【０１６４】
各表に示すように、各実施例（本発明）では、いずれも、細胞の種類によらず、各比較例に対して、細胞の培養効率が高いことが明らかとなった。
【０１６５】
また、実施例（本発明）では、磁場の発生パターンのパルス間隔を変更した場合でも、細胞の増殖効率に大きな変動は、認められなかった。このことから、実施例では、細胞の種類等に応じた培養条件の厳密な設定を要しないことが判る。
【０１６６】
これに対して、スピンナーフラスコを用いる培養である比較例では、攪拌子の回転速度の違いにより、細胞の培養効率が大きく変動するものであった。すなわち、比較例では、いずれの細胞も、その育成状態が攪拌子の回転速度の違いにより大きく異なるものであった。このため、培養条件の最適化が極めて難しいことが判る。
また、比較例では、細胞培養担体からの細胞の脱落も認められた。
【０１６７】
なお、図２、図４および図５に示すような細胞培養装置を用いて、磁場のパターンを種々変更して、各前記実施例と同様にして細胞の培養を行ったが、前記と同様の結果が得られた。
【０１６８】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明によれば、培養液を均一かつ緩やか（マイルド）に撹拌することができ、細胞を効率よく増殖させることができる。
【０１６９】
また、細胞培養担体の構成を適宜設定することにより、前記効果をより向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の細胞培養担体の実施形態を示す断面図である。
【図２】本発明の細胞培養装置の第１実施形態を示す模式図である。
【図３】磁場発生装置が発生する磁場のパターンを示す図である。
【図４】本発明の細胞培養装置の第２実施形態を示す模式図である。
【図５】本発明の細胞培養装置の第３実施形態を示す模式図である。
【図６】磁場発生装置が発生する磁場のパターンを示す図である。
【符号の説明】
１ 細胞培養担体
２ 磁性粒子
２１ 基材
２２ 磁性材料
３ 被覆層
３１ 粒子
１００ 細胞培養装置
１１０ 培養容器
１１１ 開口部
１１２ 栓体
１２０ 磁場発生装置
１２１ 電磁石
１２１Ａ〜１２１Ｄ 電磁石
１２２ 芯材
１２３ 導線
１３０ コントローラ
１４０ 培養液
１５０ 加温装置

Claims (19)

1. 細胞を表面に付着させ、増殖させる細胞培養担体であって、
   磁性粒子と、該磁性粒子の表面の少なくとも一部を覆うように形成され、前記細胞が付着し得る被覆層とを有することを特徴とする細胞培養担体。
2. 前記細胞培養担体の密度は、０．８〜２．５ｇ／ｃｍ^３である請求項１に記載の細胞培養担体。
3. 前記細胞培養担体の平均粒径をＡ［μｍ］とし、前記細胞培養担体に付着させる細胞の最大長さをＢ［μｍ］としたとき、Ａ／Ｂが２〜１００である請求項１または２に記載の細胞培養担体。
4. 前記細胞培養担体の平均粒径は、５０〜５００μｍである請求項１ないし３のいずれかに記載の細胞培養担体。
5. 前記被覆層は、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成されている請求項１ないし４のいずれかに記載の細胞培養担体。
6. 前記被覆層は、前記磁性粒子の表面付近に、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された粒子の一部が貫入することにより形成されたものである請求項５に記載の細胞培養担体。
7. 前記被覆層は、前記磁性粒子の表面に、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された多孔質粒子を衝突させることにより形成されたものである請求項６に記載の細胞培養担体。
8. 前記磁性粒子は、樹脂材料と磁性材料とを複合化してなるものである請求項１ないし７のいずれかに記載の細胞培養担体。
9. 請求項１ないし８のいずれかに記載の細胞培養担体と、細胞とを含む培養液へ磁場を与え、前記培養液中で前記細胞培養担体を移動させることにより、前記培養液を撹拌するとともに、前記細胞を前記細胞培養担体の表面に付着させ、増殖させることを特徴とする細胞培養方法。
10. 前記培養液へ与える磁場の強度を、経時的に変化させる請求項９に記載の細胞培養方法。
11. 前記培養液へ与える磁場の位置を、経時的に変化させる請求項９または１０に記載の細胞培養方法。
12. 請求項９ないし１１のいずれかに記載の細胞培養方法に用いることを特徴とする細胞培養装置。
13. 請求項１ないし８のいずれかに記載の細胞培養担体と、細胞とを含む培養液を収納する培養容器と、
    前記培養液中で前記細胞培養担体を移動させるための磁場を発生する磁場発生装置とを有することを特徴とする細胞培養装置。
14. 前記磁場発生装置は、発生する磁場の強度を経時的に変化させるよう構成されている請求項１３に記載の細胞培養装置。
15. 前記磁場発生装置は、発生する磁場の位置を経時的に変化させるよう構成されている請求項１３または１４に記載の細胞培養装置。
16. 前記磁場発生装置は、前記培養容器の外周部に設けられている請求項１３ないし１５のいずれかに記載の細胞培養装置。
17. 前記磁場発生装置は、前記培養液に接触して設けられている請求項１３ないし１５のいずれかに記載の細胞培養装置。
18. 前記磁場発生装置は、前記培養容器内に収納された前記培養液の液面付近に設けられている請求項１３ないし１７のいずれかに記載の細胞培養装置。
19. 前記磁場発生手段を複数個有する請求項１３ないし１８のいずれかに記載の細胞培養装置。

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