KR100837265B1 - 조직 공학 및 조직 재생을 위한 조직 형성 세포들을 기계적으로 자극하는 방법 - Google Patents

조직 공학 및 조직 재생을 위한 조직 형성 세포들을 기계적으로 자극하는 방법

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Abstract

조직 형성 세포를 기계적 스트레스를 받게함과 동시에 세포로부터 조직을 배양하되, 상기 기계적 스트레스는 자기적으로 발생되는 것을 특징으로 하는 조직 배양 방법.

Description

조직 공학 및 조직 재생을 위한 조직 형성 세포들을 기계적으로 자극하는 방법{A METHOD OF MECHANICALLY STIMULATING TISSUE FORMING CELLS FOR TISSUE ENGINEERING AND REGENERATION APPLICATIONS}
본 발명은 세포 배양에 관한 것으로서, 상세하게는(여기에 한정되는 것은 아니며) 사람 또는 동물 조직을 대체하는 대체 조직을 형성하기 위한 세포 배양 방법에 관한 것이다. 본 발명은 더 상세하게는, 여기에 한정되는 것은 아니며, 기계-반응(mechano-responsive) 조직에 관한 것이다.
인간 및 동물에 대한 대체 조직(replacement tissue)의 체외(in vitro, 시험관내) 배양은 중요한 기술 발전으로서 환자로부터 얻은 세포로부터 조직이 성장하도록 하여 대체 조직이 거부 반응 문제를 일으키지 않도록 한다. 대체 요법(replace therapies)을 위해 만들어질 수 있는 대체 조직의 일 예로서, 결합 조직(connective tissue), 뼈, 연골(cartilage), 건(腱, tendon) 그리고 췌장 등이 있다.
대체 조직은 대체하고자 하는 조직과 동일한 유형(type)의 세포로 구성되어져야 할 뿐 아니라, 아마도 복잡할 수 있는, 필요한 3차원 형상를 가져야 한다. 따라서, 대체 조직은 일반적으로 생체반응기(bioreactor) 내의 배양 환경(culture medium)에 담궈진 적합한 형상의 골격(scaffold) 상부에 또는 그 내에서 성장된다. 골격은 세포 성장 기질(substrate)로서 조직이 필요한 3차원 형태로 성장할 수 있도록 하는 형상을 가진다. 생체반응기 내에는 배양 환경의 (일반적으로 일정한) 흐름(flow)이 있어 골격 상부 또는 내부의 조직-형성 세포가 끊임없이 영양소를 공급받을 있고 세포의 신진대사(metabolic) 산물(waste product)이 제거된다. 생체반응기 내에 사용되는 배양 환경의 일반적인 양적 증가는, 정적 배양 플라스크에 비교해서, 다수의 서로 다른 조직 유형의 생산을 위해서 적합한 크기의 범위를 갖는 골격을 배양 환경에 담그는 것을 허용한다. 골격 전체에 배양 환경을 살포(perfusion)하면 모든 세포가 구조 전체를 통해서 성장을 위한 다양한 조건으로부터 이득을 얻는다[1].
뿐만 아니라, 특히 기계-반응(mechano-responsive) 조직의 경우, 완전한 기능을 가지는 조직으로 배양하는 동안 조직 형성 세포를 기계적인 스트레스를 받게 하는 것이 필요하다. 따라서, 예를 들면, 뼈, 연골, 인대, 건(tendon) 등과 같은 몇몇 결합 조직은 필요한 기계적인 특성을 갖도록 배양 중에 기계적인 스트레스를 받을 필요가 있다[2].
필요되는 스트레스의 정도는 세표 유형(cell type)과 조직 유형에 따라 다양하게 변한다. 그러한 스트레스를 발생하는 여러 방법들은 널리 알려져 있으며, 예컨대, 셀에 대한 직접적인 기계적 자극, 유체역학의 압축(hydrodynamic compress) 시스템 등이 있다. 셀에 대한 직접적인 기계적 자극을 이용하는 방법은 롤러(roller) 또는 그와 같은 것을 사용하여 세포를 압축하는데 반해, 유체역학의 압축 시스템을 이용하는 방법은 생체반응기를 제공하는 세포 배양 환경에서 증가된 압력 펄스를 이용하여 세포를 기계적으로 자극한다. 하지만, 기능적인 조직을 형성하기 위해서 세포를 기계적으로 자극하는 알려진 방법 중에서 어느 것도 뼈, 건, 연골 등과 같은 여러 조직 유형에 대해서는 완전히 만족적이지 못하다. 직접적인 기계적 자극 방법은 적용함에 있어서 상당히 귀찮으며, 배양을 위해 필요한 무균 조건(aseptic condition)을 유지하기 힘들다. 유체역학의 압축 방법은 일반적으로 비효율적이다. 게다가, 앞서 언급한 모든 방법은 어느 한 시점에서 단지 하나의 스트레스 크기만이 배양된 세포들 범위를 가로질러 가해지는(세포 수준에서는 일반적으로 보다 높은 크기의 스트레스가 필요함) 단점과 세포가 성장하는 골격 그 자체가 가해진 스트레스를 견딜만한 상당한 크기의 기계적 저항력이 있어야 한다는 단점이 있다.
따라서 본 발명의 목적은 상술한 방법들이 가지는 단점을 없애거나 완하시키는 것이다.
본 발명의 일 양상에 따르면, 자기적으로 발생된 기계적인 스트레스를 받도록 하면서 조직 형성 세포를 성장하는 것을 포함하는 조직 배양 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명에 따르면 완전한 기능을 갖는 조직 형성을 확보하기 위해서 자기적으로 발생된 스트레스가 조직 형성 세포에 가해진다.
본 발명에 따른 방법은 환자에게 이식되는 조직의 성장을 위해서 체외(시험관내) 배양에 적용될 수 있다. 시험관내 배양에서 효과적이라면, 조직 형성 세포가 3차원의 골격 상부에 또는 내에서 배양되는 것이 바람직하며, 또한 조직 배양 환경이 흐르는 생체반응기 내에서 배양되는 것이 바람직하다. 다른 유형의 조직 배양 용기(vessel)가 사용될 수 있다. 본 발명이 환자의 몸 내에 그 자리에서(in situ) 새로운 조직을 성장하는 체내(in vivo) 에도 적용될 수 있다.
스트레스는 생체반응기 내에 가해진 자기장에 대응하여 힘(force)을 발생시키고 발생된 힘을 필요되는 스트레스를 가하기 위해서 배양되는 조직 형성 세포에 전달할 수 있는 자성 물질에 의해서 형성될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 상기 자성 물질은 조직 형성 세포에 부착되고, 바람직하게는 마이크로-입자 또는 나노-입자, 바람직하게는 코팅된 자성 마이크로-입자 또는 나노-입자이다. 또는, 상기 자성 물질은 상기 배양 환경에 삽입되는 철분함유유체(ferrofluid)일 수 있다. 또는, 상기 자성 물질은 이들 둘의 조합, 즉, 세포에 부착되는 자성 물질과 철분함유유체의 조합일 수 있다.
사용되는 자성물질의 종류에 관계없이, 시간-변이 자성 구배 장(magnetic gradient field) 또는 균질한 장(field)의 사용은 자성 물질의 이동을 조절하고 끊임없이 스트레스가 조직 형성 세포에 반복적으로 가해지도록 한다. 그러한 스트레스는 크기 및 가해지는 방향 모든 면에서 정확하게 변하여 조직 형성 세포가 필요되는 스트레스 형성 처방계획(regime)을 받게되어 완전한 기능의 조직이 형성되는 것을 확보한다. 이것은 동일한 골격(또는 다른 골격)의 다른 영역에 있는 다른 세포에 부착된 입자의 자성 특성을 변하시키는 것에 의해 달성되거나, 구배 장(gradient field)에서 장(field)의 공간적인 변이를 사용하는 것을 통해서 달성된다.
자기장은 예컨대, 약 0.1 ~ 10 헤르쯔의 주파수(frequency)에서 변이될 수 있다. 그러나, 이와 같은 범위 밖의 주파수 또한 사용될 수 있다. 자기장은 전형적으로 여기에 한정되는 것은 아니며 약 10 밀리테슬라(mT) 내지 약 1400 밀리테슬라 크기의 유속밀도(flux density)를 가진다.
세포에 가해지는 스트레스의 크기는 일반적으로 여기에 한정되는 것은 아니며 약 0.1 피코뉴톤 내지 약 100 피코뉴톤 이며, 가해지는 스트레스의 방향은 가해진 자기장에서 자성 입자의 직선 운동, 병진(translational) 운동(구배에 기인하며, 입자는 자기적으로 차단될 필요는 없음) 또는 회전 운동(가해진 자기장에 대한 입자의 자화 벡터 각도에 기인하며, 자기적으로 차단된 입자이어야 함)에 따라 결정된다.
본 발명의 중요한 이점은 자기장의 변화가 원격지에서 조절될 수 있기 때문에, 생체반응기와 같은 체외(시험관내)에서, 또는 체내에서 무균 상태를 유지하면서 가해진 스트레스의 방향 및 크기를 용이하게 제어할 수 있다는 것이다. 게다가, 세포 수준에서 발생된 스트레스는 일반적으로 작고(예컨대, 수 피코뉴톤(a few piconewtons))[3] 따라서 상부 또는 내에서 조직 형성 세포가 성장하는 골격 어떤 것도 향상된 기계적 특성을 필요로 하지 않는 다는 것이다.
본 발명의 방법은 기계적 로딩(loading), 즉, 기계-반응 이온 통로(channel)의 활성화를 요구하는 생체반응기 및 기계적인 체내에서 다양한 유형의 조직을 만드는데 사용될 수 있다. 다양한 유형의 조직은 여기에 한정되는 것은 아니며, 뼈, 연골, 인대, 건 등을 포함한다. 배양되는 세포의 생체검사는 표준화된 절차[4]의해 얻어질 수 있다.
본 발명은 또한 적어도 서로 다른 두 유형, 예컨대, 뼈와 연골의 조직을 포함하는 조직체에 적용될 수 있다. 또한 인간 중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cell)를 소오스(source)로 사용할 수 있다. 중간엽 줄기 세포는 골격 상부 또는 내에서 그 자리에서(in situ) 연골세포 또는 뼈 세포로 분화한다.
이상에서 언급한 것 같이, 본 발명의 바람직한 실시예는 필요되는 스트레스를 가해주기 위해 자성 마이크로-입자 또는 나노-입자를 조직 형성 세포에 부착시키는 것을 포함한다. 그 상부 또는 내에서 조직이 성장하는 골격에 조직 형성 세포를 부착하기 전에 상기 자성 마이크로-입자 또는 나노-입자는 기능화되고 상기 조직 형성 세포에 부착된다. 따라서, 예컨대, 상기 자성 마이크로-입자 또는 나노-입자는 세포에 대한 부착을 위해서 예컨대, 섬유소결합(fibronectin)과 RGD 분자 같은 부착 분자로 코팅될 수 있다.
(세포에 부착되어지는) 상기 자성 마이크로-입자 또는 나노-입자는 점차적으로 구형의 또는 타원형이 되고 약 10나노미터 내지 약 10 마이크로미터의 범위의 직경을 가진다.
상기 자성 마이크로-입자 또는 나노-입자는 코팅되거나 코팅되지 않을 수 있으며, 단일-도메인 또는 다중-도메인일 수 있다. 적합한 입자로서 여기에 한정되지 않지만 아래의 것들을 포함한다:
(1) 스페로테크 인코포레이션(Shperotech, Inc.)사로부터 입수 가능한 코팅된 자성 미소구체(microsphere:마이크로스피어, d=4㎛)
이 미소구체는 폴리머에의해 코팅된 자기적으로 차단된 코아로 구성된다.
(2) 조정가능한 크기(d=50 ~ 300 나노미터)를 가지며 좁은 치수(size)의 분포를 가지는 단일-도메인, 아철산염(ferrite)-도핑 실리카 나노입자[5].
하지만 자성 물질이 입자화되거나 세포에 부착되는 것이 필수적인 것은 아니다. 예컨대, 생체반응기 내부 또는 체내(in vivo)에서 풍부 환경(profusion media)이 철분함유유체를 포함하는 것도 가능하다. 철분함유유체는 가해진 구배를 가진 자기장으로부터 힘을 발생하여 배양되는 세포에 전해주는데 사용된다. 철분함유유체는 예컨대, PVA/자철광(magnetite) 나노입자-기저(base) 철분함유유체(d=4~10나노미터)[6] 일 수 있다. 또한, 세포에 부착된 자성 입자와 더불어 철분함유유체를 사용할 수 있다.
생체반응기는 예컨대, 풍부 환경 시스템, 스핀 플라스크 시스템, 유체역학 압축 시스템 그리고 회전 용기(vessel) 시스템 같은 현존하는 생체반응기의 변형일 수 있다.
통상적으로 자기장은 조직 배양 용기(만약 체외 배양에 적용할 경우) 외부에서 또는 체외에서(만약 체내 배양에 적용할 경우) 생성되고, 영구자석 또는 전자석(electromagnetic)에 의해 제공된다. 다양한 자기장을 생성하기 위해서, 영구자석이 배양되는 세포에 대하여 이동할 수 있다. 따라서, 생체반응기의 경우, 그러한 영구자석의 이동은, 예컨대, 길이방향으로(longitudinal) 상기 생체반응기를 따라서, 상기 생체반응기, 또는 그 주위로(부터) 접근-후퇴 운동일 수 있다. 이러한 운동의 어떠한 조합도 사용될 수 있다. 전자석의 경우, 자기장을 변화시키는 것은 적당한 전기 흐름(전류)을 전자석과 동일한 수준으로 하는 것에 의해 달성된다. 이때, 앞서 영구자석에서 설명한 방법과 동일한 방식으로 전자석이 이동할 수 있다.
상업적으로 입수하여 사용할 수 있는 자석으로서, 필요한 구배(gradient)를 갖는 자기장 및 유속밀도를 발생할 수 있는 것으로서, 예컨대, 네오다이미움-아이론-보론(Neodymium-Iron-Boron) 및 사마리움-코발트(Samarium-Cobalt) 영구자석이 있다. 이들 영구자석은 여러가지 요구 명세서에 맞도록 기하학적으로 재단되고 자화될 수 있으며, 표면에서 1테슬라(10,000 가우스) 보다 많은 유속밀도를 발생할 수 있다. 사용될 수 있는 전자석의 일 예로서, 수 테슬라의 자기장을 만들어 낼 수 있는 냉동(cryo-cooled), 초전도(superconducting) 자석 코일들이 있다.
세포에 가해진 힘은 점차적으로 0.1 피코뉴톤 에서 10 피코뉴톤으로 될 것이며, 그러한 힘은 세포막 통로(transmembrane channel)를 열수 있다. 이러한 힘을 발생시키는 자기장과 장 구배(field gradient)는 자석, 자성 입자의 체적 및 형태 그리고 조직체(tissue construct) 및 자석과의 거리에 의존한다. 이와 같은 매개 변수들은 다음의 식에 지배된다:
Fmag = (x2 - x1)V(1/μ0)B(∇B)
위 식에서 'x2'는 자석 입자의 체적 자화율(volume magnetic susceptibility)을, 'x1'은 주위 환경(즉, 조직/뼈)의 체적 자화율을, 'μ0' 는 자유 공간의 자화율을, 'B'는 테슬라 단위의 자속 밀도를 각각 가리킨다. 위 식에서 비록 구형 입자이고 어떠한 자기 쌍극자 상호 작용이 없다는 것을 가정하였지만, 시스템에 필요한 자기장 및 자기 구배에 대한 아주 좋은 근사치를 제공한다.
인간의 조직(tissue)에 있어서 'x1' 은 자철광(또는 철분함유유체에 사용되는 다른 자성 물질 및 나노입자)의 자화율과 비교해서 아주 작고 음의 값이기 때문에, 'x1' 은 상기 식에서 무시할 수 있고 따라서 우변의 항 '(x2 - x1)'은 'x2' 로 볼수 있다. 또, 자철광 입자/유체/물질의 z-축(수직축)을 따라 가해진 장(field)에서의 병진 운동이 관심사이고 상대적인 도자율(permeability)이 '1'이라고 가정할 경우, 입자가 자기장 소오스로 근접할 때 위 식에서 힘은 다음과 같이 간단해 진다:
Fmag = (x2)VB(dB/dz)
이 식으로부터 철분함유유체 및 자석 입자의 존재하에서 조직체가 받는 압축(병진) 힘은 장의 세기, 장의 구배 그리고 입자의 체적 및 자기 성질에 의존한다. 이들 매개 변수들 중 하나는 강한 공간 변이(장의 세기/장의 구배 결과물)를 가질 것이다. 이것이 3차원에서 차분 힘(differential force)의 적용을 가능하게 한다. 또한, 골격의 서로 다른 영역에 다른 자기 특성 및 체적 특성의 입자, 철분함유유체와 자성 입자를 뿌림(seeding)으로써, 가해진 힘에서 3차원적 변이를 향상시킬 수 있다. 이로 인해 생체반응기 내부에서 가해진 힘의 공간 변이를 통해서 복합 조직체의 성장이 촉진된다.
다수의 서로 다른 골격 형태(특히 치수가 변경될 수 있는 3차원의 다공성 블록들)가 사용될 수 있다. 본 발명의 이점 중 하나는 관여한 스트레스가 일반적으로 작기 때문에 골격이 강화된 물리적 특성(mechanical property)을 가질 필요가 없다는 것이다. 예컨대, 골격으로서, 생물분해성이 있는, 다공성의 폴리라틱산(PLA)이 사용될 수 있다. 또는 빨리 분해되고 물리적으로 덜 강한 폴리글리콜산(Poly Glycol Acid) 물질 및 천연물질(natural material)[7]인 교원질 골격(collagen scaffold)이 사용될 수있다. 세포 접착 특성을 향상시키기 위해서 골격은 교원질 형태 1(collagen type 1) 또는 다른 접착 분자(예컨대, RGD 또는 비-RGD 계 분자)로 코팅될 수 있다.
첨부된 도면을 참조하면서 단지 실시예를 통하여 본 발명을 설명하기로 한다.
도 1은 본 발명의 제1 실시예를 도시한다.
도 2는 본 발명의 제2 실시예를 도시한다.
도 3은 자기장에 의한 기계적 감각 세포막 이온 통로의 활성화를 설명하는 도면이다.
도 1은 튜브형의 생체반응기(1) 및 영구자석(2)을 도시하고 있다. 영구자석(2)은 생체반응기(1)의 외부에 위치하며 이송 기구(carrier arrangement)(3)에 장착된다. 이송 기구(3)는 도시되지 않은 컴퓨터-제어(또는 다른 시간-변이) 구동 시스템에 연결된다.
생체반응기(1) 내부에는 튜브 장축 방향(길이 방향)으로 다수의 서로 이격된 조직체(4)가 있다. 도 1에서는 조직체(4)의 일측(영구자석(2)에서 먼 측)에는 뼈 조직이, 타측(영구자석(2)에서 가까운 측)에는 연골 조직(다른 조직 유형이 또한 사용될 수 있음)이 위치하는 것을 도시하고 있다. 조직 세포(조직체)는 거기에 부착된 자석 구슬(magnetic beads)(미도시)을 가지고 있으며 3차원 골격(미도시)에 뿌려진다. 영양소는 도에서 화살표(5)로 표시된 방향으로 생체반응기(1)에 공급되어 화살표(6)로 표시된 방향으로 생체반응기(1)로부터 배출된다.
도면에서는 총 4개의 영구자석(조직체(4)의 개수에 따라 변함)이 생체반응기(1)의 외측에 그 장축방향(길이방향)으로 이격되어 배치되어 있다. 영구자석은 각 조직체에 대응하도록, 즉, 하나의 조직체에 하나의 영구자석이 관련되도록 배치되며, 또한 영구자석은 연골측에, 즉 연골에 마주하도록 배치된다.
이와 같은 장치의 사용에 있어서, 이송 장치(3)는 영구자석(2)이 생체반응기(1)로부터 가까워지고 멀어지도록 영구자석(2)을 횡단하여 진동시키도록 구동된다. 영구자석(2)이 구동되는 진동 주파수는 변할 수 있으며, 일반적으로 0.1 내지 10 헤르쯔 이며 이 범위 밖의 주파수도 사용될 수 있다.
영구자석(2)의 진동은 조직체(4)에 가해지는 압축/이완(compression/relaxation) 사이클을 자극하고 그 주파수 역시 영구자석에 부착된 기계적 구동 수단(미도시)에 의해서 변할 수 있다. 자기장 구배(공간적으로 자기장의 세기를 변화시킴)는 연골이 뼈 세포에 비해 미세하게 높은 유속밀도를 받는 것을 보장한다.
강한 자기장 구배는 영구자석으로 향하는 병진운동을 나노입자에 발생시키고 생체반응기 내부의 세포 및 골격을 압축한다. 이 같은 압축은 생체반응기 내부의 세포에 직접 접근하지 않고서도 기계적 로딩을 자극한다. 이 같은 로딩은 자기장의 세기, 구배, 자석의 위치 그리고/또는 조직체를 압축하는 나노 입자의 물리적 특성에 따라 용이하게 변경될 수 있다.
필요에 따라서는 뼈 세포와 결합된 자석 입자는 연골 세포와 결합된 자석 입자와는 다른 자기 특성을 가질수 있으며, 이에 따라 서로 다른 기계적인 스트레스가 서로 다른 유형의 세포에 가해질 수 있다.
도 2는 도 1에서 보여진 장치의 변형을 도시한다. 도 2의 경우, (영구)자석(2)은 생체반응기(1)의 장축(길이방향)에 평행하도록 진동한다(도 1의 경우 길이 방향에 횡단하도록 진동함).
앞서 설명한 실시예의 다양한 변형이 가능할 것이다. 예컨대, 자석이 생체반응기 주위를 상대적으로 스위프(sweep)될 수 있다. 이는 자석을 고정시키고 생체반응기를 그것의 장축(길이 방향의 축) 둘레를 회전시키는 것에 의해서 아주 용이하게(반드시 이와 같은 필요한 것은 아니며 다른 방법에 의해서도 가능하며) 구현할 수 있다.
다른 방법으로 또는 추가적으로 도 1 및 도 2에 도시된 영구자석이 전자석으로 대체될 수도 있다. 세포에 부착되는 나노-입자는 철분함유유체로 대체될 수 도 있다. 필요에 따라서 나노-입자 및 철분함유유체의 조합이 사용될 수 있다.
더 나아가서 자석/금속 판 또는 완전한 골격을 일그러뜨리기(deform) 위해서 자석에 부착될수 있는 다른 구조물이 사용될 수 있다.
도 3은 조직체에 대한 주기적인 기계적 로딩을 야기시키기 위한 자기장의 사용에 의해 기계적 감각 세포막 이온 통로(mechano-sensitive transmembrane ion channel)을 활성화시키는 다른 방법을 도시한다.
구체적으로 도 3은 세포질(cytoplasm)을 밀폐한 세포막(11)을 가지는 세포(10)를 도시한다. 세포막(11)에는 기계 감각적 이온 통로(13)가 있다. 자기적으로 차단된 기능화된 입자(14)(예컨대, 스페로테크사의 코팅된 강자성의 입자, d=4.5㎛)가 세포막(11)에 직접적으로 또는 세포골격계(cytoskeletal) 결합[8, 9]을 통해서 견고하게 부착된다.
도 3a는 어떠한 자기장도 세포(10)에 가해지지 않은 경우이며 따라서 이온 통로(13)는 닫혀있다.
도 3b를 참조하면, 자기장 소오스(미도시)를 진동시킴으로써, 세포(10)에 부착된 자석 입자(14)가 비틀리고 기계적 스트레스를 세포막(11)에 가하고 통로(13)에서 기계적 감각을 활성화시킨다. 이러한 이온 통로(13)의 활성화는 배양되는 세포에서 생화학적 반응 경로를 유발하고 생체반응기 내에서 조직체의 주기적인 기계적 로딩을 자극한다.
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본 발명은 세포 배양에 관한 것으로서, 상세하게는 사람 또는 동물 조직을 대체하는 대체 조직을 형성하기 위한 세포 배양 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 기계-반응(mechano-responsive) 조직에 관한 것이다.

Claims (22)

  1. 기계적 스트레스를 받게 하여 체외에서 조직 형성 세포들을 기계적으로 자극하되,
    상기 기계적 스트레스는 가해진 자기장에 대하여 힘을 발생시킬 수 있고 발생된 힘을 상기 조직 형성 세포들에 전달할 수 있는 기능을 가지며 상기 조직 형성 세포에 부착된 자성 물질에 의해서 발생 되고, 상기 가해지는 기계적 스트레스는 가해진 자기장에서 상기 자성 물질의 선형적인 병진 운동 결과로 발생하는 것을 특징으로 하는 기계적으로 세포들을 자극하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 스트레스는 인가된 자성 구배에 응하여 힘을 발생시키고 발생 된 힘을 상기 조직 형성 세포에 전달할 수 있는 자성 물질에 의해 발생 되는 것을 특징으로 하는 기계적으로 세포들을 자극하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 자성 물질은 마이크로-입자 또는 나노-입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 기계적으로 세포들을 자극하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 자성 물질은 철분함유유체를 포함하는 것을 특징으로 하는 기계적으로 세포들을 자극하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 자기장은 상기 조직 형성 세포의 배양 중에 변하는 것을 특징으로 하는 기계적으로 세포들을 자극하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 자기장은 사인곡선 형태로 변하는 것을 특징으로 하는 기계적으로 세포들을 자극하는 방법.
  7. 제 5 항에 있어서,
    상기 자기장은 약 0.1 내지 10 헤르쯔의 주파수에서 변하는 것을 특징으로 하는 기계적으로 세포들을 자극하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 조직 형성 세포는 3차원 골격 상에서 또는 3차원 골격 내에서 성장하는 것을 특징으로 하는 기계적으로 세포들을 자극하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 조직 형성 세포는 배양 배지가 흘러서 공급되는 생체반응기 내에서 배양되는 것을 특징으로 하는 기계적으로 세포들을 자극하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 자기장은 상기 생체반응기 외부에서 가해지는 것을 특징으로 하는 기계적으로 세포들을 자극하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서,
    상기 조직 형성 세포는 결합 조직을 형성하기 위해 배양되는 것을 특징으로 하는 기계적으로 세포들을 자극하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 조직 형성 세포는 뼈, 연골, 인대, 또는 건을 형성하기 위해 배양되는 것을 특징으로 하는 기계적으로 세포들을 자극하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서,
    둘 또는 그 이상의 서로 다른 유형의 세포가 배양되는 것을 특징으로 하는 기계적으로 세포들을 자극하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    서로 다른 스트레스가 상기 서로 다른 유형의 세포에 가해지는 것을 특징으로 하는 기계적으로 세포들을 자극하는 방법.
  15. 제 13 항에 있어서,
    상기 조직 형성 세포는 뼈-형성 세포 및 연골-형성 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 기계적으로 세포들을 자극하는 방법.
  16. 제 1 항에 있어서,
    상기 조직 형성 세포에 가해지는 힘은 약 0.01 내지 100 피코뉴턴의 범위를 가지는 것을 특징으로 하는 기계적으로 세포들을 자극하는 방법.
  17. 제 1 항의 방법에 적절한 생체반응기에 있어서,
    상기 생체반응기는 배양 배지를 위해 유입구 및 배출구를 구비하며 그것의 내부에 다양한 자기장을 제공하기 위한 자기장 인가 수단이 제공되는 생체반응기.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 자기장 인가 수단은 전자석을 포함하는 것을 특징으로 하는 생체반응기.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 자기장 인가 수단은 상기 생체반응기에 대해서 움직이는 적어도 하나의 영구자석을 포함하는 것을 특징으로 하는 생체반응기.
  20. 삭제
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