WO2015005299A1 - 培養装置、培養システム、及び培養方法 - Google Patents

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WO2015005299A1
WO2015005299A1 PCT/JP2014/068103 JP2014068103W WO2015005299A1 WO 2015005299 A1 WO2015005299 A1 WO 2015005299A1 JP 2014068103 W JP2014068103 W JP 2014068103W WO 2015005299 A1 WO2015005299 A1 WO 2015005299A1
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culture
cells
magnetic
solution
unit
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PCT/JP2014/068103
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田島　秀二
上田　哲也
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ユニバーサル・バイオ・リサーチ株式会社
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    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/04—Flat or tray type, drawers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M35/06—Magnetic means
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    • C12M25/16—Particles; Beads; Granular material; Encapsulation
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves

Definitions

  • the present invention relates to a culture apparatus, a culture system, and a culture method for performing cell culture using magnetic particles.
  • Adherent cells such as somatic cells adhere to the bottom surface of the culture vessel, form a scaffold, and then repeat cell division and cell elongation to increase the number of cells. At that time, since the cells remain attached to the bottom surface of the culture container, when the number of cells continues to increase, the cells compete for the adhesive surface on the bottom surface of the container. Therefore, if the number of cells continues to increase, there will be no gaps between cells, eventually cells will be stratified, cells will suffocate, and nutrients will not spread sufficiently (confluent state), resulting in dead cells .
  • the cell adhesion protein is degraded with an enzyme solution such as trypsin to float the cells, or the cells are physically peeled off from the culture vessel with a scraper.
  • an enzyme solution such as trypsin to float the cells, or the cells are physically peeled off from the culture vessel with a scraper.
  • trypsin is known to be toxic to cells, and it is known that trypsin treatment changes the properties of cells and generates dead cells. Therefore, it is required to reduce the number of processes for applying stress to these cells as much as possible.
  • Patent Document 1 Culturing the cells in three dimensions (see Patent Document 1), changing the strength of the magnetic field applied to the magnetic particles attached to the cells, generating mechanical stress on the cells, and culturing the cells (Patent Document) 2) is known. Further, these patent documents also describe that a magnet for applying a magnetic field can be moved.
  • JP 2004-313008 A Japanese translation of publication No. 2004-520028
  • Patent Documents 1 and 2 do not describe holding (fixing) or dispersing cells in a predetermined region with magnetic particles using an external magnet.
  • the invention of Patent Document 1 uses a magnetic field of a magnet to culture cells while stirring them in a culture solution. Although the magnetic field of a magnet is used for cell culture, the cells are cultured without stirring the cells using the magnetic field. There is no description or suggestion of culturing cells while holding the cells in a predetermined region within the container.
  • the position of the cells can be adjusted by transferring the cells to another container while applying stress to the cells by hand with the risk of contamination. While moving, the cells had a problem that they had to be given a new environment that could absorb nutrients.
  • Still another object of the present invention is to solve the above-mentioned problems, and the position of the cell is adjusted so that the cell can absorb nutrients without performing manual work and stressing the cell.
  • the present inventor varied the distance and / or position between the magnet unit arranged outside the culture vessel and the culture vessel to place the magnetic particles and cells in the culture vessel.
  • the cell position was successfully controlled in a non-contact manner by being held in a predetermined region or dispersed in a culture vessel, and the present invention was completed. That is, the present invention is as follows.
  • (1) is a cell, a magnetic particle that directly or indirectly adheres to the cell, and a culture container containing the solution, a temperature control unit of the culture container, a magnet provided outside the culture container,
  • a culture apparatus comprising a magnetic force adjustment unit for adjusting the magnetic force of the magnet, wherein the magnetic force adjustment unit adjusts the magnetic force of the magnet to hold the magnetic particles and the cells in a predetermined region in the culture vessel.
  • the culture apparatus is characterized in that cell culture is performed in a state of being performed.
  • (2) is the culture apparatus according to (1), wherein the magnetic force adjusting unit adjusts the magnetic force of the magnet to disperse the magnetic particles and the cells in the culture vessel.
  • (3) The culture apparatus according to (1) or (2), wherein the magnet is a plurality of magnets arranged at intervals.
  • (4) is the culture apparatus according to (3), wherein each of the plurality of magnets is arranged to face one surface of the culture vessel.
  • (5) is the culture apparatus according to (3) or (4), wherein each of the plurality of magnets is arranged to have a polarity different from that of an adjacent magnet.
  • (6) The culture apparatus according to any one of (3) to (5), wherein the plurality of magnets are arranged in a matrix.
  • the culture apparatus according to any one of 1) to (8).
  • the culture device according to any one of (1) to (14).
  • (16) is any one of (1) to (15), wherein at least one of the temperature control unit and the magnetic force control unit is detachable from the culture vessel.
  • Culture apparatus. (17) is a culture system comprising the culture apparatus according to any one of (1) to (16), wherein a supply unit that supplies materials and solutions used for cell culture to the culture container; A culture system comprising a magnetic particle separation unit for separating the magnetic particles from a solution containing cells cultured in a culture vessel.
  • (20) is characterized in that the supply section and the culture container, and the culture container and the magnetic substance separation unit are connected by pipe lines, respectively. It is a culture system given in any 1 paragraph.
  • (23) is a cell culturing method characterized by culturing cells using the culture apparatus according to any one of (1) to (16).
  • (24) is a method of culturing cells using the culture system according to any one of (17) to (22), wherein the material used for cell culture from the supply unit to the culture vessel And a step of supplying a solution, and the culture apparatus.
  • a step of culturing cells using the method a step of separating magnetic particles from a solution containing cells by the magnetic particle separation unit, and a step of separating cells from the solution from which the magnetic particles have been separated.
  • a method characterized by (25) is the method according to (24), comprising a step of dispensing the material or solution used for the cell culture to the supply unit using a dispensing mechanism.
  • (26) is the method according to (24) or (25), wherein the control unit automatically executes each of the steps.
  • cell culture can be performed while controlling the position of the cell automatically so that the cell can absorb nutrients without performing manual work and applying stress to the cell.
  • FIG. 5 is a top schematic view showing the culture system of FIG. 4. It is a block diagram of the culture system of FIG. It is an enlarged view which shows operation
  • a cell provided outside the culture vessel is brought close to the culture vessel, and cell culture is performed in a state where the magnetic particles and cells are fixed (held) on the inner surface (predetermined region) of the culture vessel,
  • the magnetic particles and cells fixed on the inner surface of the culture vessel are shaken by vibrating the magnet approaching the culture vessel, or the magnetic particles and cells are dispersed in the culture vessel by separating the magnet from the culture vessel.
  • It is a culture apparatus that can automatically control the position of a cell without performing work and applying stress to the cell.
  • the present invention provides a sterile process from seeding to collection of cells without applying stress to the cells by moving the solution into the culture apparatus by gravity drop or by moving the solution out of the culture apparatus.
  • fixing means holding in a predetermined region, and means a state in which the device can swing to some extent while being held in the predetermined region.
  • the culture apparatus 10 includes a culture vessel 3, a temperature adjustment unit 5, and a magnetic force adjustment unit 7.
  • the culture apparatus 10 will be described with reference to FIG.
  • the culture vessel 3 has a thin internal space
  • the temperature control unit 5 includes a recess 5r
  • the lower side of the culture vessel 3 is accommodated in the recess 5r of the temperature control unit 5.
  • the culture vessel 3, the temperature adjustment unit 5, and the magnetic force adjustment unit 7 have a laminated structure.
  • the temperature adjustment unit 5 and / or the magnetic force adjustment unit 7 can be arranged on both upper and lower surfaces or one surface of the culture vessel 3.
  • the thickness of the culture vessel 3 can be preferably a thin layer of 1.0 to 10 mm, more preferably 3.0 to 5 mm, but is not limited thereto.
  • the shape of the culture vessel 3 is a rectangle having a side of 20 cm, the material of the culture vessel 3 is preferably a thin and transparent flexible resin, and the volume of the culture vessel 3 is preferably 20 to 40 ml. I can't.
  • the shape of the culture vessel 3 may be a cube, a cylinder, a prism, or a meandering pipe.
  • the culture vessel 3 is provided with inlet ports 3a to 3e and an outlet port 3f. Magnetic particles, a culture solution, carbon dioxide and the like are supplied into the culture vessel 3, and these are discharged from the culture vessel 3. be able to.
  • the inlet ports 3a to 3e are preferably provided on one side surface of the culture vessel 3, and the outlet port 3f is provided on the other side surface of the culture vessel 3.
  • the present invention is not limited to this.
  • the temperature adjustment unit 5 is preferably a temperature management device such as a thermal cycler, a film heater (planar heating element), or a Peltier element that can be cooled and heated, but is not limited thereto.
  • a temperature management device such as a thermal cycler, a film heater (planar heating element), or a Peltier element that can be cooled and heated, but is not limited thereto.
  • the temperature adjustment unit 5 is formed with recessed port accommodating portions 5a to 5f for accommodating the inlet ports 3a to 3e and the outlet port 3f.
  • the size and shape of the temperature control unit 5 may be any as long as the temperature of the culture vessel can be quickly managed.
  • a temperature sensor that detects the temperature of the culture vessel 3 may be included.
  • the magnetic force adjusting unit 7 includes a magnet 7a that applies a magnetic force to the inside of the culture vessel 3 from the outside, and a magnet moving mechanism 7b that enables the magnet 7a to approach, separate from, and vibrate the culture vessel 3.
  • the operation of the magnet moving mechanism 7b is controlled by the control unit 20 described later.
  • the magnet 7a is preferably a permanent magnet or an electromagnet.
  • the present invention is not limited to this, and the size and shape of the magnet may be any as long as they exert a magnetic field on the magnetic particles.
  • the magnet 7a may be a plurality of magnets arranged in a matrix like the magnet 207a of the second embodiment.
  • an electromagnet and a current supply device that supplies and interrupts current to the electromagnet may be provided.
  • the magnetic particles contained in the culture solution include balls, granules, and fine particles regardless of the size, and the shape is not limited to a spherical shape, and may include any shape.
  • the material used for the magnetic particles is preferably, but not limited to, a magnet attracting material having no eluate that adversely affects cells, such as iron oxide such as Fe 3 O 4 and nickel cobalt alloy.
  • a carrier capable of holding the magnetic particles and the cultured cells on the surface can be used. By using the carrier, the cells can indirectly adhere to the magnetic particles via the carrier.
  • the carrier to which cells and magnetic particles are attached include a fiber aggregate, a porous solid material, or an ion exchange resin.
  • the magnetic particles enter the gaps of the fiber assembly or the pores of the porous solid material and are integrated, and the cells are adsorbed on the surface of the fiber assembly or the porous solid material.
  • a cellulose carrier can be used. Furthermore, such a carrier can also attach cell nutrients to its surface.
  • the culture system 100 includes a culture apparatus 10 shown in FIG. 1, a gas supply unit 8 to which a gas supply unit (not shown) is connected, a plurality of solution supply units 9 for supplying various solutions and reagents to the culture vessel 3, A magnetic particle separation unit 15 for separating magnetic particles from a solution containing cells cultured in the culture vessel 3, a cell sorting port 17 for sorting cells from a solution containing cells supplied from the magnetic particle separation unit 15, And a waste bottle 19 for storing the solution discharged from the cell sorting port 17.
  • the solution supply unit 9 supplies magnetic particles, a culture solution, a washing solution, an eluate and other various solutions, reagents, or cells into the culture vessel 3.
  • FIG. 2 shows four solution supply units, but the number is not limited to four, and can be adjusted as appropriate according to necessary reagents and the like.
  • One gas supply unit 8 and four solution supply units 9 and the five inlet ports 3a to 3e of the culture vessel 3 are respectively connected by flexible connection tubes (pipe lines). Each of these five connection tubes is provided with a valve 11.
  • the outlet port 3f of the culture vessel 3 and the magnetic particle separation unit 15 are connected by a flexible connection tube, and a valve 13 that can be opened and closed is provided in this connection tube.
  • the valves 11 and 13 may be manually opened / closed valves such as a pinch cock, or may be electromagnetic valves, air operated valves, or the like that are automatically opened / closed by the control unit 20 described later.
  • the culture solution or reagent supplied from the solution supply unit 9 is dropped and transferred to the culture vessel 3 via the connection tube. Is done.
  • various solutions can be pressurized and automatically transferred by a pump (not shown).
  • the gas supply unit 8 supplies carbon dioxide and humidity gas of a concentration necessary for cell culture provided from the gas supply unit to the culture container.
  • gas conditions with a carbon dioxide concentration of 5%, a humidity of 95%, and a temperature of 37% are suitable for cell culture.
  • the gas supply unit can provide the gas supply unit with a gas in which the carbon dioxide concentration, humidity, and temperature are appropriately adjusted in accordance with the type of cultured cells and the culture conditions, in addition to providing the gas under the above conditions to the culture vessel. .
  • the valve 13 is closed so that the solution does not leak from the culture vessel 3 during cell culture. Then, after the cell culture is completed, the valve 13 is opened, and the solution containing the magnetic particles to which the cultured cells are attached is moved to the magnetic particle separation unit 15.
  • the magnetic particle separation unit 15 includes a second magnetic force adjustment unit including a separation container (not shown), a magnet disposed outside the separation container, and a magnet moving mechanism that moves the magnet.
  • a separation container not shown
  • the magnet approaches the separation container and captures the magnetic particles in the solution.
  • the magnetic particles can be separated from the culture solution in the separation container by discharging only the culture solution from the separation container and holding the magnetic particles with the cultured cells attached thereto in the separation container. Thereafter, the cultured cells attached to the magnetic particles are washed and eluted with a washing solution and an elution solution supplied from a solution inlet (not shown) provided in the solution supply unit 9 or the magnetic particle separation unit 15.
  • the operation of the second magnet moving mechanism is controlled by the control unit 20.
  • the method of eluting cells in the separation container of the magnetic particle separation unit 15 is preferably a method of treating with trypsin or a method of peeling with a large amount of buffer solution, but is not limited thereto.
  • the concentration of trypsin used for the cells in the separation container is compared with the conventional one. It can be reduced and it is difficult to stress cells.
  • the cultured cells eluted from the magnetic particle separation unit 15 can be sorted and transferred to another container while maintaining a sterile condition.
  • the cell sorting port 17 is provided with a three-way cock (three-way valve) (not shown). After the cleaning solution is moved to the waste bottle 19, the three-way cock can be operated to change the flow so that the solution containing cultured cells separated from the magnetic particles by the eluate flows to the cell sorting port 17.
  • a container for receiving cultured cells is connected to the cell sorting port 17.
  • the cell sorting port 17 is not limited to the three-way cock, and any mechanism such as a three-way ball switching valve can be arranged as long as the mechanism can change the flow of the solution. In FIG.
  • the cell sorting port 17 is illustrated as being provided at a position higher than the magnetic particle separation unit 15. However, the cell sorting port 17 is arranged so that the solution falls from the magnetic particle separation unit 15 to the cell sorting port 17.
  • the intake port 17 may be disposed at a position lower than the magnetic particle separation unit 15.
  • the waste liquid bottle 19 stores the solution discharged from the cell sorting port 17.
  • a valve may be installed at the tip of the waste liquid bottle. When this valve is closed, the bottle can be replaced while maintaining sterility.
  • FIG. 3 is a control block diagram of the culture system 100.
  • the control unit 20 includes various sensors 21, a timing unit 22, a magnet moving mechanism 7 b, a temperature adjustment unit 5, a valve drive unit 11 a that opens and closes the valve 11, and a valve drive unit 12 a that opens and closes the valve 12. It is connected. Based on the signals from the various sensors 21, the control unit 20 can move the magnet moving mechanism 7b periodically and regularly according to the input program. Moreover, the control part 20 controls temperature by the temperature control unit 5, opens and closes the valve 11 by the valve drive part 11a, and opens and closes the valve 12 by the valve drive part 12a.
  • the various sensors 20 are a temperature sensor, a humidity sensor, a carbon dioxide concentration sensor, a pH sensor, a solution speed sensor, a solution volume sensor, a fungus sensor, and the like.
  • any one or more of a temperature sensor, a humidity sensor, a carbon dioxide concentration sensor, a solution volume sensor, a pH sensor, and a fungus sensor can be provided.
  • the magnetic particle separation unit 15, the cell sorting port 17, or the waste bottle 19 at least one of a solution volume sensor, a pH sensor, and a fungus sensor can be provided as various sensors 20.
  • a flow sensor can be provided as various sensors 20 in the connection tube in the vicinity of the valve 11 or 12.
  • the control unit 20 can perform operation control in conjunction with each component, or can automatically stop when an abnormality is detected.
  • a culture solution containing magnetic particles, cultured cells, and a carrier such as a cellulose carrier is supplied from the solution supply unit 9 to the culture vessel 3.
  • carbon dioxide and humidity gas at concentrations necessary for cell culture are supplied from the gas supply unit 8 to the culture vessel 3.
  • the gas supply unit 8 supplies gas to the culture vessel 3 so as to maintain gas conditions of a carbon dioxide concentration of 5%, a humidity of 95%, and a temperature of 37%.
  • the temperature of the solution in the culture vessel 3 is adjusted by a temperature adjustment unit 5 attached to the lower surface of the culture vessel 3.
  • the magnetic particles to which the cultured cells adhere directly or indirectly are concentrated and fixed on the inner surface of the culture vessel 3 by the magnet 7 a of the magnetic force adjusting unit 7 that is close to the culture vessel 3.
  • Cell culture is performed by repeating stationary culture and shaking culture.
  • the magnetic particles in the culture vessel 3 can be vibrated by changing the magnetic force of the magnet by swinging the magnetic force adjusting mechanism 7b as shown by an arrow in FIG.
  • the culture vessel 3 can be vibrated left and right by a slide mechanism (not shown). Since the position of the culture vessel 3 varies depending on the slide mechanism, the connection tube connected to the culture vessel 3 has a sufficient length so that the connection is maintained even if the position of the culture vessel 3 varies. Arranged.
  • the cells attached to the magnetic particles are also shaken, the position of the cultured cells on the magnetic particles can be moved, and the surrounding solution can be stirred.
  • the grown cells can always maintain a state where they can naturally absorb nutrients.
  • the magnetic particles are dispersed from the inner surface of the culture vessel 3.
  • the magnetic particle separation unit 15 is at a lower position than the culture vessel 3, so that the culture solution containing the magnetic particles falls according to gravity, and the magnetic particles are removed from the culture vessel 3. It moves to the separation container in the separation unit 15.
  • the magnet of the second magnetic force adjusting unit After flowing the solution into the separation container, the magnet of the second magnetic force adjusting unit is brought close to the separation container, the magnetic particles in the solution are fixed to the inner surface of the separation container, and only the culture solution is discharged from the separation container. Then, the carrier to which the cultured cells and magnetic particles are attached is separated from the culture solution. Thereafter, the culture cell and the carrier to which the magnetic particles are attached are washed with a washing liquid supplied from the supply port provided in the solution supply unit 9 or the magnetic particle separation unit 15, and then the eluate supplied into the separation container. To elute the cultured cells from the carrier.
  • the eluted cultured cells are moved to another container through the cell sorting port 17 while maintaining aseptic condition.
  • the waste liquid bottle 19 stores the solution generated in a series of steps.
  • a culture system 200 according to a second embodiment of the present invention will be described with reference to FIGS.
  • the culture system 200 is provided on the culture vessel 203 having a thin internal space, the temperature management unit 205 provided on the upper surface side of the culture vessel 203, and the lower surface side of the culture vessel 203.
  • a magnetic force adjusting unit 207 a tilting mechanism 212 is connected to the culture vessel 203, and the culture vessel 203 is periodically tilted within a range indicated by an angle ⁇ in FIG.
  • the tilt mechanism 212 can use a motor.
  • the angle range in which the tilting mechanism 212 tilts the culture vessel 203 can be preferably 10 to 20 °.
  • a slide mechanism 214 is connected to the culture vessel 203, and the slide mechanism 214 periodically slides (vibrates) the culture vessel 203 in the horizontal direction indicated by an arrow 214a in FIG.
  • the slide mechanism 214 is realized by converting the rotation of the motor into a linear motion using a rack or a cam. Since the position of the culture vessel 203 is changed by the tilting mechanism 212 and the slide mechanism 214, the connection tube connected to the culture vessel 203 has a length so that the connection is maintained even if the position of the culture vessel 203 is changed. It is arranged with a margin.
  • the temperature management unit 205 is provided on the upper surface of the culture vessel 205, but the temperature management unit 205 may be provided on both the upper and lower surfaces of the culture vessel 205 or on the lower surface.
  • the temperature management unit 205 can use a temperature management device such as a thermal circular, a Peltier element, or a film heater (planar heating element), but is not limited thereto.
  • the slide mechanism 214 is not limited to the one that slides the culture vessel 203 itself as shown in FIG. 4, and it is only necessary to slide the other relative to one of the culture vessel 203 and the magnet 207a.
  • the slide mechanism 214 ′ may slide the second magnetic force adjustment unit 207 ′ without moving the culture vessel 203.
  • the arrangement of the magnets 207'a in the second magnetic force adjustment unit 207 ' can be the same as the arrangement of the magnets 207a in the magnetic force adjustment unit 207.
  • the slide mechanism 214 ′ can use the same mechanism as the slide mechanism 214. In FIG.
  • the second magnetic force adjustment unit 207 ' is provided on the upper surface side of the culture vessel 203, and is repeatedly slid in the horizontal direction by the slide mechanism 214'. By this slide, the magnetic force exerted on the magnetic particles in the culture vessel 203 by the magnet 207′a of the second magnetic force adjustment unit 207 ′ fluctuates, and the magnetic particles and cells concentrated and fixed in the culture vessel 203 slide. Rocks in the direction (substantially horizontal).
  • the temperature management unit 205 is not shown in FIG. 10, the temperature management unit is located between the culture vessel 203 and the second magnetic force adjustment unit 207 ′ or the upper surface of the second magnetic force adjustment unit 207 ′. Can be provided on the side.
  • a gas cylinder 230 containing carbon dioxide, a solution supply container 209, and an opening 209a are provided on the left side surface of the culture container 203 through a flexible connection tube having the valve 11, respectively. Connected.
  • the connection tube is provided with a valve 11. Since the solution supply container 209 is disposed at a higher position than the culture container 203, the solution supplied from the solution supply container 209 moves to the culture container 203 by gravity drop.
  • the culture system 200 includes an automatic dispenser 240 that can move three-dimensionally, and a plurality of various containers 250 a that contain reagents, solutions, cultured cells, and the like are arranged on the adjustment stage 250.
  • the automatic dispenser 240 can adjust the necessary amount of reagent, solution, cultured cells, etc., drawn from the various containers 250a and move them to the solution supply container 209.
  • a waste liquid tank 260 for storing the waste liquid from the culture container 203 and a connection point C are connected to the right side surface of the culture container 203 through a flexible connection tube having the valve 11.
  • the magnetic force adjusting unit 207 has a plurality of permanent magnets 207a arranged in a matrix, that is, vertically and horizontally at equal intervals.
  • the permanent magnets 207a included in this array can concentrate and fix the magnetic particles and cells included in the culture solution in the culture vessel 203 on the inner surface of the culture vessel 203, respectively.
  • the magnets 207a adjacent to each other are arranged so that the polarities are always reversed. As a result, the polarities of the magnetic particles adsorbed on the adjacent magnet 207a become different, and as a result of the repulsive force acting between them, the group of magnetic particles and cells adsorbed on the magnet 207a are likely to concentrate.
  • the magnetic force adjusting unit 207 can be moved toward and away from the culture vessel 203 along the guide 207 b by the magnetic force adjusting unit moving mechanism 207 c.
  • the magnetic force adjusting unit 207 approaches the lower surface of the culture vessel 3
  • the magnetic particles and cells contained in the culture solution in the culture vessel 203 are concentrated and fixed (adsorbed) on the lower surface of the culture vessel 203 by the magnetic force of the magnet 207a. be able to.
  • the magnetic force adjustment unit 207 is separated from the lower surface of the culture vessel 3, the magnetic force of the magnet 207a does not reach the culture vessel 203, and the magnetic particles and cells move and disperse from the lower surface of the culture vessel 203.
  • FIG. 6 is a control block diagram of the culture system 200.
  • the control unit 220 includes various sensors 221, a timing unit 222, a magnet moving mechanism 207b, a temperature adjustment unit 205, a valve driving unit 11a that opens and closes the valve 11, a tilting mechanism 212 that tilts the culture vessel 203, A slide mechanism 214a for sliding the culture vessel 203, a dispenser moving mechanism 241 for moving the dispenser 240 three-dimensionally, a dispensing pump 242 for controlling the suction and discharge of the automatic dispenser 240, Two magnet moving mechanisms 206a are connected.
  • the controller 220 adjusts the solution or the like using the automatic dispenser 240, dispenses the solution into the solution supply container 209, operates the magnet moving mechanism 207b based on signals from the various sensors 221, and controls the temperature adjustment unit.
  • the temperature is controlled by 205, and the valve 11 is opened and closed by the valve drive unit 11a.
  • the control unit 220 operates the tilting mechanism 212 and the slide mechanism 214a to execute tilting and sliding of the culture vessel 203.
  • the controller 220 controls the movement of the second magnet moving mechanism 206 a to concentrate and fix the magnetic particles in the magnetic particle separation unit 206.
  • the various sensors 221 are a temperature sensor, a humidity sensor, a carbon dioxide concentration sensor, a pH sensor, a solution speed sensor, a solution volume sensor, a time sensor, a fungus sensor, and the like.
  • the culture vessel 203 can be provided with any one or more of a temperature sensor, a humidity sensor, a carbon dioxide concentration sensor, a solution volume sensor, a pH sensor, and a fungus sensor as the various sensors 20.
  • the magnetic particle separation unit 206, the cell collection container 218, or the waste liquid tank 206 as various sensors 220, at least one of a solution volume sensor, a pH sensor, and a fungus sensor can be provided.
  • a flow sensor can be provided as various sensors 220 in the connection tube in the vicinity of the valve 11.
  • the control unit 220 can control the operation of each component in conjunction with the signals of the various sensors 220, or can automatically stop when an abnormality is detected.
  • the separation mechanism 207c may be configured to move the other of the culture vessel 203 and the magnetic force adjustment unit 207 in the vertical direction relatively several mm to several tens mm. By vertically moving the separation mechanism 207c, it is possible to reliably control whether the magnetic force of the magnet 207a of the magnetic force adjusting unit 207 is exerted or blocked in the culture vessel 203.
  • the aggregate A (conjugate) containing magnetic particles is concentrated (aggregated) on the inner bottom surface of the culture vessel 203 by the magnet 207a and fixed.
  • the slide mechanism 214 slides in the horizontal direction indicated by the arrow repeatedly relative to one of the culture vessel 203 and the magnet 207a over a distance of several mm to several tens of mm.
  • the periphery of the aggregate A is agitated, and nutrients can be introduced between the cells contained in the aggregate A.
  • Aggregate A is composed of magnetic particles, cultured cells, and a filamentous cellulose carrier (carrier).
  • the tilting mechanism 212 can swing the culture device 210 including the temperature management unit 205, the culture vessel 203, and the magnetic force adjustment unit 207 within the range of the angle ⁇ . Thereby, the culture solution can be continuously stirred to supply nutrients to the cells.
  • a connection tube reaching the connection point C is connected to the upper part of the magnetic particle separation unit 206 via a coupler 206b (or lure).
  • the magnetic particle separation unit 206 is disposed at a position lower than the connection point C and the culture vessel 203. Therefore, by opening the valve 11 (FIG. 4) provided on the tube connecting the culture vessel 203 and the connection point C, the solution in the culture vessel 203 is automatically removed from the culture vessel 203 according to gravity. It is dropped and transferred to the separation unit 206.
  • the magnetic particle separation unit 206 is provided with a second magnet moving mechanism 206a, and the second magnet moving mechanism 206a adsorbs magnetic particles contained in the solution.
  • a cleaning liquid supply unit 270 is provided above the magnetic particle separation unit 206 via a connection tube provided with the valve 11.
  • the cleaning liquid supply unit 270 is dispensed with the cleaning liquid, trypsin solution, and the like by the automatic dispenser 240, and is dropped and transferred from the cleaning liquid supply unit 270 to be supplied into the separation container of the magnetic particle separation unit 206.
  • a waste liquid tank 219 is connected to the lower part of the magnetic particle separation unit 206 via a connection tube provided with the valve 11 and a coupler (or lure) 219a connected to the connection tube.
  • a cultured cell collection container 218 is disposed under the magnetic particle separation unit 206 via a connection tube provided with the valve 11.
  • a line (connection tube) for connecting the magnetic particle separation unit 206 and the waste liquid tank 219 and a line for connecting the magnetic particle separation unit 206 and the cultured cell collection container 218 are provided independently. It is also possible to use a single line and branch off by a three-way valve so that it can be selectively dropped and transferred to the waste liquid tank 219 or the cultured cell collection container 218.
  • FIG. 12 is a modified example of the magnetic particle separation unit 206 in FIG.
  • a connection tube reaching the connection point C is connected to the upper part of the magnetic particle separation unit 206 '.
  • the magnetic particle separation unit 206 is disposed at a position lower than the connection point C and the culture vessel 203.
  • a cylinder 270 ' is connected to the upper part of the magnetic particle separation unit 206' via a coupler 206'b, and the cylinder 270 'is detachable from the magnetic particle separation unit 206'.
  • a piston 270'a is accommodated so as to be movable forward and backward.
  • an air vent pipe 206'c for taking in and out air in accordance with the operation of the piston 270'a is connected to the upper part of the magnetic particle separation unit 206 '.
  • a culture solution containing magnetic particles, cultured cells, and a carrier such as a cellulose carrier is dispensed into the solution supply container 209 using the dispenser 240.
  • the culture solution is dropped and transferred from the solution supply container 209 to the culture container 203 through a connection tube.
  • Carbon dioxide or the like is supplied from the gas cylinder 230 to the culture vessel 203.
  • the temperature of the solution in the culture vessel 203 is adjusted by the temperature adjustment unit 205.
  • the magnetic particles to which the cultured cells adhere directly or indirectly are arranged in a matrix on the inner surface of the culture vessel 3 by the plurality of magnets 207a of the magnetic force adjustment unit 207 approaching the culture vessel 203.
  • the culture vessel 207 is slid left and right by the slide mechanism 214 or tilted by the tilt mechanism 212, and the magnetic particles and the cells are oscillated.
  • the separation mechanism 207b may approach or separate the magnet 207a from the culture vessel 207. These movements can agitate the ambient atmosphere of the cells and supply nutrients to the cells.
  • the magnetic force adjustment unit 207b When the magnetic force adjustment unit 207b is separated from the culture vessel 203 after the cell culture is completed, the cells and magnetic particles are dispersed in the culture vessel 203, and the combined magnetic particles and cells are floated in the culture vessel 203. Can do. In this floating state, the valve 11 on the connection point C side is opened, and the solution containing cells and magnetic particles is passed through the connection point C to the magnetic particle separation unit 206 in FIG. 10 or the magnetic particle separation unit 206 ′ in FIG. Drop and transfer.
  • a solution containing a combined body of cells and magnetic particles dropped and transferred from the culture vessel 203 is accommodated in the magnetic particle separation unit 206.
  • the second magnet moving mechanism 206a is moved to the position of the solid line, and the cells and magnetic particles are concentrated and fixed on the inner surface of the separation container of the magnetic particle separation unit 206a.
  • the valve 11 on the waste liquid tank 219 side is opened in this fixed state, the solution (culture solution) is separated from the combined body of magnetic particles and cells and discharged to the waste liquid tank 219.
  • the valve 11 on the cleaning liquid supply unit 270 side is closed, and the cleaning liquid is dispensed to the cleaning liquid supply unit 270 using the automatic dispenser 240.
  • the valve 11 on the waste liquid tank 219 side is closed and the valve on the cleaning liquid supply unit 270 side is opened, so that the cleaning liquid is dropped and transferred into the separation container of the magnetic particle separation unit 206.
  • the second magnet moving mechanism 206a is moved to the position of the broken line while the cleaning liquid is accommodated in the separation container, the combined body of cells and magnetic particles is dispersed in the separation container, and the combined body can be washed. .
  • the conjugate can be concentrated and re-fixed on the inner surface of the separation container of the magnetic particle separation unit 206.
  • the waste liquid tank 219 side valve 11 is opened, the cleaning liquid is separated from the combined body, and discharged to the waste liquid tank 219.
  • the valve 11 on the waste liquid tank 219 side is closed, and the separation liquid such as trypsin solution dispensed by the automatic dispenser 240 is dropped and transferred to the magnetic particle separation unit 206 via the cleaning liquid supply unit 270. To do.
  • the second magnet moving mechanism 206a When the second magnet moving mechanism 206a is moved to the position of the broken line while the separation liquid is accommodated in the separation container in the magnetic particle separation unit 206, the combined body of cells and magnetic particles floats in the separation container, Further, when a stirring device such as a vortex mixer (not shown) is used to form a vortex in the separation container and stir, the combined body is broken and the cells are separated from the magnetic particles.
  • a stirring device such as a vortex mixer (not shown) is used to form a vortex in the separation container and stir, the combined body is broken and the cells are separated from the magnetic particles.
  • the second magnet moving mechanism 206a When the second magnet moving mechanism 206a is moved to the position of the solid line in this separated state, the magnetic particles are concentrated and fixed on the inner surface of the separation container, while the cells are suspended in the solution in the separation container.
  • the valve 11 on the cell collection container 218 side When the valve 11 on the cell collection container 218 side is opened in this cell floating state, the solution
  • the following process is executed instead of the process executed by the magnetic particle separation unit 206 of FIG.
  • a solution containing a combined body of cells and magnetic particles dropped and transferred from the culture vessel 203 is accommodated in the magnetic particle separation unit 206 '.
  • the second magnet moving mechanism 206a is moved to the position of the solid line, and the combined body of cells and magnetic particles is concentrated and fixed on the inner surface of the separation container of the magnetic particle separation unit 206 '.
  • the piston 270a of the cylinder 270 ' is pulled up in this fixed state, the solution (culture solution) is separated from the combined body, and the solution is sucked into the cylinder 270'.
  • the cylinder 270 ′ With the solution sucked out, the cylinder 270 ′ is removed from the magnetic particle separation unit 206 ′, and the solution is discharged from the cylinder 270 ′ to a waste liquid tank (not shown).
  • the cylinder 270' After cleaning the cylinder 270 ', the cylinder 270' is connected to the magnetic particle separation unit 206 'while the cleaning liquid is sucked into the cylinder 270'. In this connected state, the piston 270'a is pushed down, and the cleaning liquid is injected from the cylinder 270 'into the separation container of the magnetic particle separation unit 206'.
  • the second magnet moving mechanism 206a When the second magnet moving mechanism 206a is moved to the position of the broken line in a state where the cleaning liquid is injected into the separation container, the combined body of cells and magnetic particles is dispersed in the separation container. In this dispersed state, the conjugate is washed. After the cleaning, when the second magnet moving mechanism 206a is moved again to the solid line position, the conjugate can be concentrated and re-fixed on the inner surface of the separation container of the magnetic particle separation unit 206. In the re-fixed state, only the cleaning liquid is sucked into the cylinder 270 ', the cylinder 270' is removed from the magnetic particle separation unit 206 ', and the cleaning liquid is discharged from the cylinder 270' to the waste liquid tank.
  • the cylinder 270 ' After discharging the cleaning liquid, the cylinder 270 'is cleaned, and a separating liquid such as a trypsin solution is sucked into the cylinder 270'.
  • the cylinder 270 ' is connected to the magnetic particle separation unit 206', and a separation liquid is injected into the magnetic particle separation unit 206 '.
  • the second magnet moving mechanism 206a When the second magnet moving mechanism 206a is moved to the position of the broken line in a state where the separation liquid is accommodated in the container in the magnetic particle separation unit 206, the combined body of cells and magnetic particles floats in the separation container.
  • the conjugate is broken and the cells are separated from the magnetic particles.
  • the second magnet moving mechanism 206a When the second magnet moving mechanism 206a is moved to the position of the solid line in this separated state, the magnetic particles are concentrated and fixed on the inner surface of the separation container, while the cells are suspended in the solution in the separation container.
  • the valve 11 on the cell collection container 218 side When the valve 11 on the cell collection container 218 side is opened in this cell floating state, the solution containing the cells from which the magnetic particles have been separated is dropped and transferred to the cell collection container 218, and the cultured cells can be collected.
  • the principle of gravity movement of the solution control of gas supply into the culture vessel 203 by the gas cylinder 230, opening and closing of the valve 11 such as a pinch cock, and cultured cells in the cell separation units 206 and 206 ′
  • the valve 11 such as a pinch cock
  • the cell separation units 206 and 206 ′ By separating the liquid from the liquid and the magnetic particles, it is possible to continuously and continuously perform from the introduction of the cells into the culture system 200 to the collection of the cells.
  • stem cells such as ES cells and iPS cells can be automatically cultured in a necessary amount and supplied to a patient or the like for each patient.
  • the present invention can be applied to all cells that require culture, such as ES cells, iPS cells, somatic stem cells, immune cells, and dendritic cells.
  • mixing, agitation, temperature control, reaction, separation, washing, supply of liquid / gas, transfer, etc. of elements used for cell culture can be automatically performed by a control unit according to a program.
  • the culture apparatus and culture system of each embodiment of the present invention are based on the premise that cultured cells adhere directly or indirectly to magnetic particles.
  • an experiment was conducted on the adhesion of cultured cells to the magnetic particles, which is the premise of the culture apparatus.
  • a carrier made of an ion exchange resin was used so that the cultured cells were indirectly attached to the magnetic particles. This experiment was conducted to confirm that the cultured cells retain their shape while bound to the carrier.
  • -Cultured cell lines Jurkat cells (human, T-cell Leukemia, ATCC) ⁇ Media: RPMI media 1640 (Life technologies, 11875-093) ⁇ Fetal Bovine Serum: Life technologies, 10437-028 Antibiotic: Antibiotic-Antimycotic, 100X (Life technologies, 15240-062) ⁇ Phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4): Life technologies, 10010023 ⁇ Cell cryopreservation solution: Cell Banker (LSI Rulece, BLC-1) ⁇ Carrier: Strongly basic anion exchange resin crushed material (Amberlite IRA400J, particle size 45-150 ⁇ m) ⁇ Culture container: Petri dish for suspension culture 35 ⁇ (Sumitomo Bakelite, MS-1135R) ⁇ Disposable pipette 50 ml, 25 ml, 5 ml ⁇ Disposable tip 1 ml
  • Fetal Bovine Serum 50 ml of Fetal Bovine Serum was added to 500 ml of RPMI1640, and 5 ml of Antibiotic-Antimycotic, 100X was added. This was used as a medium, stored at 4 ° C., and returned to room temperature when used. 10 ml of the medium was aseptically dispensed into a petri dish. A Jurkat tube stored in a cell banker was taken out and thawed, and the whole amount (1 ⁇ 10 6 cells, 1 ml) was added to the petri dish. The cells were cultured for 3 days in a 37 ° C. CO 2 incubator (CO 2 : 5%).
  • Fig. 13 shows photographs of the observation results (first day, third day, and fifth day).
  • “X100” and “x400” in FIG. 13 indicate the magnification of the inverted microscope.
  • FIG. 13 (A) Jurkat cells bound to the carrier immediately after contact with the carrier.
  • FIGS. 13B and 13C it can be seen that the cells are proliferating in the state in which the binding between the cells and the carrier is maintained after 3 days and 5 days by stirring culture. It was. Therefore, it was suggested that the cells can grow on the carrier while the cultured cells bind to the carrier in the agitated state.
  • a magnetized carrier is not used, but it is possible to magnetize the carrier while maintaining the surface layer state of the carrier. Since the carrier made of ion exchange resin and the magnetic particles of iron powder are bonded, the carrier can be indirectly magnetized by mixing them. Such binding is described in, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2009-247244, “Method for separating microorganisms including binding between carrier and magnetic substance”, which is incorporated by reference (incorporate by reference).

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Abstract

　本発明の培養装置１０は、細胞、磁性粒子、及び培養液を収容する培養容器１０と、培養容器１０の温度調節ユニット５と、培養容器１０の外部に設けられる磁石７ａと、磁石７ａの磁力を調節する磁力調節ユニット７ｂと、磁力調節ユニット７ｂの動作を制御する制御部とを具備する。磁力調節ユニット７ｂが磁石７ｂの磁力を調節して、磁性粒子及び細胞を培養容器１０内の所定領域に保持するか、又は磁性粒子及び細胞を前記培養容器内で分散する。

Description

培養装置、培養システム、及び培養方法
　本発明は、磁性粒子を用いて細胞培養を行う培養装置、培養システム、及び培養方法に関するものである。
　体細胞等の付着細胞は、培養容器の底面に付着し、足場を形成してから細胞分裂と細胞伸長を繰り返し、細胞数を増加させていく。その際、細胞は培養容器の底面に付着したままであるから、細胞数の増加が続くと、細胞同士が容器底面の接着面の奪い合いになる。そのため、細胞数の増加が続くと、細胞間の隙間がなくなり、最終的には細胞が重層化し、細胞が窒息し、栄養が十分に行き渡らなくなるため（コンフルエント状態）、死細胞が発生してしまう。
　そのため、付着細胞を培養容器で培養する際は、コンフルエント状態になる前に、細胞数が一定数（一定密度）になった段階で、培養容器から細胞を剥がして、他の容器に移し替え、細胞に栄養が十分に行き渡るようにしながら培養していく必要がある（継代培養）。
　培養容器から細胞を引き剥がして、他の容器に移し替えるためには、トリプシン等の酵素溶液で細胞接着タンパク質を分解して細胞を浮遊させるか、スクレイパーで培養容器から細胞を物理的に引き剥がす必要がある。細胞培養の分野において、これらの方法は細胞にストレスを付与するものであり、細胞にとって好ましくない処理であることは周知の事項である。例えば、トリプシンは細胞に毒性があることが知られており、トリプシン処理によって細胞の性質が変化し、死細胞が発生することが知られている。したがって、これらの細胞にストレスを付与する処理を、できる限り少なくすることが求められている。
　また、培養容器から細胞を引き剥がして、他の容器に移し替える作業はクリーンベンチにおいて手作業で行われる。手作業においては、常にコンタミネーション（雑菌混入）の危険性がある。
　以上の問題点から、体細胞等の付着細胞を培養容器で培養する際には、手作業の工程のない完全に自動化された中で、細胞が安定して栄養を吸収できるように位置を変えることのできる培養装置が求められている。
　ところで、これまでに磁性粒子を利用した細胞培養として、磁性粒子に細胞を付着させ、磁性粒子を含む培養液に磁場を与えて、磁性粒子を培養液中で移動させ、磁性粒子を撹拌しながら細胞を三次元で培養すること（特許文献１参照）、細胞が付着した磁性粒子に与える磁場の強さを変化させて、細胞に機械的な応力を発生させ、細胞を培養すること（特許文献２参照）が知られている。また、これらの特許文献には、磁場を与える磁石を移動させることができることも記載されている。
特開２００４－３１３００８号公報 特表２００４－５２００２８号公報
　しかしながら、特許文献１や２には、外部磁石を使って磁性粒子で細胞を所定領域に保持（固定）させたり、分散させたりすることは記載されていない。特に特許文献１の発明は、磁石の磁場を使って培養液内で細胞を撹拌しながら培養するものであり、磁石の磁場を細胞培養に使用するものの、磁場により細胞を撹拌することなく、培養容器内で細胞を所定領域に保持して細胞を培養することは記載も示唆もされていない。
　本発明の目的は、培養効率のよい新規な培養装置、及び培養システムを提供することである。本発明の別の目的は、磁石の磁場を用いて培養容器内で細胞を所定領域に保持しつつ、細胞を所定領域である程度位置が変位可能な状態で培養することができる培養装置、及び培養システムを提供することである。
　また、これまでに、細胞を継代培養するためには、コンタミネーションの危険性を伴う手作業で、細胞にストレスを与えながら、細胞を他の容器に移し替えるなどして、細胞の位置を移動させながら、栄養を吸収できる新たな環境を細胞に与えなければならないという問題点を有していた。
　本発明のさらに別の目的は、上記の問題点を解決するためになされたものであり、手作業を行わず、細胞にストレスを与えることなく、細胞が栄養を吸収できるように細胞の位置を非接触で制御することができる培養装置、及び培養システムを提供することである。
　本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、培養容器の外部に配置した磁石ユニットと培養容器との距離および／または位置を変動させて、磁性粒子及び細胞を培養容器内で所定領域に保持、または培養容器内で分散させることにより、細胞の位置を非接触で制御することに成功し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
　（１）は、細胞、前記細胞を直接的又は間接的に付着する磁性粒子、及び溶液を収容する培養容器と、前記培養容器の温度調節ユニットと、前記培養容器の外部に設けられる磁石と、前記磁石の磁力を調節する磁力調節ユニットとを具備する培養装置であって、前記磁力調節ユニットが前記磁石の磁力を調節して、前記磁性粒子及び前記細胞を前記培養容器内の所定領域に保持した状態で、細胞培養を行うことを特徴とする、培養装置である。
　（２）は、前記磁力調節ユニットが前記磁石の磁力を調節して、前記磁性粒子及び前記細胞を前記培養容器内に分散することを特徴とする、（１）に記載の培養装置である。（３）は、前記磁石が、間隔をあけて配置された複数の磁石であることを特徴とする、（１）又は（２）に記載の培養装置である。（４）は、前記複数の磁石のそれぞれが、前記培養容器の一面に対向するように配置されることを特徴とする、（３）に記載の培養装置である。（５）は、前記複数の磁石のそれぞれが、隣接する磁石と極性が異なるように配置されることを特徴とする、（３）又は（４）に記載の培養装置である。（６）は、前記複数の磁石が、マトリックス状に配置されることを特徴とする（３）～（５）のいずれか１項に記載の培養装置である。（７）は、前記磁性粒子及び前記細胞が、前記培養容器内の前記所定領域に保持された状態で濃縮又は凝集されている、（１）～（６）のいずれか１項に記載の培養装置である。（８）は、前記磁力調節ユニットが、前記磁石と前記培養容器との距離及び／又は位置を変動させることを特徴とする、（１）～（７）のいずれか１項に記載の培養装置である。
　（９）は、前記磁力調節ユニットが前記磁石を前記培養容器に接近させることにより、前記磁性粒子及び前記細胞を前記所定領域に保持した状態で、前記細胞培養を行うことを特徴とする、（１）～（８）のいずれか１項に記載の培養装置である。（１０）は、前記磁石及び前記培養容器の一方に対して他方を相対的にスライドするスライド機構を備えることを特徴とする、（１）～（９）のいずれか１項に記載の培養装置である。（１１）は、前記スライド機構により前記細胞培養の振盪培養を行うことを特徴とする、（１０）に記載の培養装置である。（１２）は、前記培養容器を揺動する揺動機構を備えることを特徴とする、（１）～（１１）のいずれか１項に記載の培養装置である。
　（１３）は、前記磁力調節ユニットが前記培養容器内で前記磁性粒子及び前記細胞を前記所定領域に保持した状態で、前記培養容器に溶液を注入するか、又は前記培養容器から溶液を排出することを特徴とする、（１）～（１２）のいずれか１項に記載の培養装置である。（１４）は、前記磁力調節ユニットが、前記磁石の接近、振動、及び離間から選択される複数の動作を組み合わせて、前記細胞培養を行うことを特徴とする、（１）～（１３）のいずれか１項に記載の培養装置である。
　（１５）は、前記磁力調節ユニットが、前記培養容器内で前記磁性粒子及び前記細胞を分散可能とした状態で、前記培養容器から培養細胞を含む溶液を回収することを特徴とする、（１）～（１４）のいずれか１項に記載の培養装置である。（１６）は、前記培養容器に対して、前記温度調節ユニット、及び前記磁力調節ユニットの少なくとも一つが脱着可能であることを特徴とする、（１）～（１５）のいずれか１項に記載の培養装置である。（１７）は、（１）～（１６）のいずれか１項に記載の培養装置を具備する培養システムであって、細胞培養に用いる材料及び溶液を前記培養容器に供給する供給部と、前記培養容器で培養された細胞を含む溶液から前記磁性粒子を分離する磁性粒子分離ユニットとを具備したことを特徴とする、培養システムである。
　（１８）は、前記溶液が重力落下によって移送されることを特徴とする、（１７）に記載の培養システムである。（１９）は、前記供給部、前記培養容器、前記磁性体分離ユニットが、順に上方から下方に配置されることを特徴とする、（１７）又は（１８）に記載の培養システムである。（２０）は、前記供給部と前記培養容器との間、前記培養容器と前記磁性体分離ユニットとの間を、それぞれ管路で接続することを特徴とする、（１７）～（１９）のいずれか１項に記載の培養システムである。（２１）は、前記管路のそれぞれを開閉する弁を備えることを特徴とする、（２０）に記載の培養システムである。（２２）は、前記細胞培養に用いる前記材料及び溶液を前記供給部に分注する分注機構を備えることを特徴とする、（１７）～（２１）のいずれか１項に記載の培養システムである。
　（２３）は、（１）～（１６）のいずれか１項に記載の培養装置を用いて細胞の培養を行うことを特徴とする細胞の培養方法である。（２４）は、（１７）～（２２）のいずれか１項に記載の培養システムを用いて、細胞を培養する方法であって、前記供給部から前記培養容器へ、細胞培養に用いる前記材料及び溶液を供給する工程と、前記培養装置である。を用いて細胞を培養する工程と、前記磁性粒子分離ユニットで細胞を含む溶液から磁性粒子を分離する工程と、前記磁性粒子が分離された溶液から細胞を分取する工程と、を具備することを特徴とする、方法である。（２５）は、分注機構を用いて前記細胞培養に用いる前記材料又は溶液を前記供給部に分注する工程を備える、（２４）に記載の方法である。（２６）は、制御部が前記各工程を自動的に実行することを特徴とする、（２４）又は（２５）に記載の方法である。
　本発明では、手作業を行わず、細胞にストレスを与えることなく、細胞が栄養を吸収できるように細胞の位置を自動的に制御しながら細胞培養を行うことができる。
本発明の第１の実施形態に係る培養装置を示す分解斜視図である。 図１の培養装置を備える培養システムを示す斜視図である。 図２の培養システムのブロック図である。 本発明の第２の実施形態に係る培養システムを示す側面模式図である。 図４の培養システムを示す上面模式図である。 図４の培養システムのブロック図である。 図４の培養システムにおける磁力調節ユニットの動作を示す拡大図である。 図４の培養システムにおけるスライド状態を示す拡大図である。 図４の培養システムにおける傾動機構の動作を示す拡大図である。 図４の培養システムの変形例を示す拡大図である。 図４の培養システムにおける磁性粒子分離ユニットを示す模式図である。 図４の培養システムにおける磁性粒子分離ユニットの変形例を示す模式図である。 本発明の培養装置の前提となる培養試験を示す写真である。
（概要）
　本発明は、培養容器の外部に設けられた磁石を培養容器に接近させて、培養容器の内表面（所定領域）に磁性粒子及び細胞を固定（保持）させた状態で細胞培養を行ったり、培養容器に接近した磁石を振動させて培養容器の内表面に固定した磁性粒子及び細胞を揺らしたり、培養容器から磁石を離間させて培養容器内に磁性粒子及び細胞を分散させたりするなど、手作業を行わず、細胞にストレスを与えることなく、細胞の位置を自動的に制御することができる培養装置である。また、本発明は、重力落下によって前記培養装置内に溶液を移動させるか、前記培養装置から外に溶液を移動させることにより、より細胞にストレスを与えずに細胞の播種から回収までを、無菌状態で且つ自動的に行うことができる細胞培養システムである。
　以下、図面を参照して、本発明の好適な実施形態について説明する。なお、各実施形態において、同一部分は同一符号を付して説明を省略する。以下、「固定する」とは、所定領域に保持することを意味し、この所定領域に保持された状態で、ある程度、揺れ動くことが可能な状態を意味する。
（第１の実施形態）
　本発明の第１の実施形態に係る培養装置１０を図１を用いて説明する。培養装置１０は、培養容器３と、温度調節ユニット５と、磁力調節ユニット７とを具備している。
　図１に基づいて、培養装置１０を説明する。培養容器３は薄い内部空間を有し、温度調節ユニット５は凹部５ｒを備え、培養容器３の下側部が温度調節ユニット５の凹部５ｒに収容される。培養容器３、温度調節ユニット５、及び磁力調節ユニット７は、積層構造である。温度調節ユニット５及び／又は磁力調節ユニット７は、培養容器３の上下両面または片面に配置することができる。
　培養容器３の厚さは好ましくは１．０～１０ｍｍ、より好ましくは３．０～５ｍｍの薄層とすることができるが、これらに限られない。培養容器３の形状は１辺が２０ｃｍの矩形とし、培養容器３の材質は、薄く透明な可撓性樹脂とし、培養容器３の容量は、２０～４０ｍｌとすることが好ましいが、これらに限られない。培養容器３の形状は、立方体、円柱、角柱でもよく、蛇行するパイプ状のものでもよい。
　培養容器３には、入口ポート３ａ～３ｅと出口ポート３ｆが設けられており、培養容器３内に磁性粒子、培養液、二酸化炭素等を供給したり、培養容器３からこれらを排出したりすることができる。図１に示すように、入口ポート３ａ～３ｅを、培養容器３の一側面に設け、出口ポート３ｆは、培養容器３の他側面に設けることが好ましいが、これに限られない。
　温度調節ユニット５は、サーマルサイキュラー等の温度管理装置、フィルムヒータ（面状発熱体）、または冷却及び加熱が可能なペルチェ素子とすることが好ましいが、これらに限られない。培養容器３を温度調節ユニット５の凹部５ｒに収容すると、凹部５ｒの表面と培養容器３とが密着して、培養容器３と温度調節ユニット５との間で熱交換可能となる。温度調節ユニット５には、入口ポート３ａ～３ｅと出口ポート３ｆとを収容するために窪んだポート収容部５ａ～５ｆが形成されている。温度調節ユニット５の大きさや形状は、培養容器の温度管理を迅速にできるものであればよい。培養容器３の温度を検知する温度センサーを含んでもよい。
　磁力調節ユニット７は、培養容器３の外部からその内部に磁力を加える磁石７ａと、培養容器３に対して磁石７ａを接近、離間、振動を可能にする磁石移動機構７ｂとを備える。磁石移動機構７ｂの動作は、後述する制御部２０により制御される。磁石７ａは、永久磁石または電磁石であることが好ましいが、これに限らず、磁石の大きさや形状は、磁性粒子に磁場を及ぼすものであればよい。磁石７ａは、第２の実施形態の磁石２０７ａのように複数の磁石をマトリックス状に配置したものとすることもできる。なお、磁石７ａおよび磁石移動機構７ｂに代えて、電磁石と、電磁石に電流を供給しかつ遮断する電流供給装置を設けるようにしても良い。
　培養溶液に含まれる磁性粒子は、径の大小を問わず、ボール状、粒状及び微粒子を含み、形状は球状のものに限定されるものではなく、いかなる形状のものも含んでよい。磁性粒子に用いる材料は、Ｆｅ３Ｏ４等の酸化鉄、ニッケルコバルト合金等、細胞に悪影響を与える溶出物のない磁石吸引性材料を用いることが好ましいがこれらに限定されない。培養細胞が磁性粒子に直接的に付着しにくい場合には、磁性粒子と培養細胞とをその表面で保持可能な担体を用いることができる。担体を用いることにより、細胞は担体を介して間接的に磁性粒子と付着することができる。細胞及び磁性粒子を付着する担体としては、繊維集合体、多孔質固体素材、又はイオン交換樹脂が挙げられる。磁性粒子は、繊維集合体の間隙又は多孔質固体素材の孔に入り一体化され、且つ繊維集合体又は多孔質固体素材の表面に細胞が吸着される。好ましい担体としては、セルロースキャリアを用いることができる。さらに、このような担体は、その表面に細胞栄養素の付着も可能である。
　本発明の第1の実施形態に係る培養システム１００を、図２に基づいて説明する。培養システム１００は、図１に示した培養装置１０と、不図示のガス供給ユニットが接続されるガス供給部８と、培養容器３に各種溶液や試薬を供給する複数の溶液供給部９と、培養容器３で培養された細胞を含む溶液から磁性粒子を分離する磁性粒子分離ユニット１５と、磁性粒子分離ユニット１５から供給された細胞を含む溶液から細胞を分取する細胞分取ポート１７と、細胞分取ポート１７から排出された溶液を収容する廃液ボトル１９とを具備している。
　溶液供給部９は、培養容器３内に磁性粒子、培養液、洗浄液、溶出液等の各種溶液、試薬、又は細胞を供給する。図２には、４つの溶液供給部が記載されているが、その個数は４つに限られず、必要な試薬等に応じて適宜調節可能である。１つのガス供給部８及び４つの溶液供給部９と、培養容器３の５つの入口ポート３ａ～３ｅとは、それぞれ可撓性の接続チューブ（管路）で接続される。これらの５つの接続チューブには弁１１がそれぞれ設けられる。培養容器３の出口ポート３ｆと磁性粒子分離ユニット１５とは、可撓性の接続チューブで接続され、この接続チューブには開閉可能な弁１３が設けられる。弁１１、１３は、ピンチコック等の手動で開閉される弁であってもよいし、後述する制御部２０により自動で開閉される、電磁弁、エア作動弁等であってもよい。
　図２に示すように、溶液供給部９は培養容器３より上方に配置されるため、溶液供給部９から供給される培養液や試薬等は、接続チューブを介して、培養容器３に落下移送される。但し、不図示のポンプ等によって、各種溶液を加圧して自動移送することもできる。
　ガス供給部８は、ガス供給ユニットから提供される細胞培養に必要な濃度の二酸化炭素、湿度の気体を培養容器に供給する。通常、二酸化炭素濃度５％、湿度９５％、温度３７％の気体条件が細胞培養に適している。ガス供給ユニットは、前記条件の気体を培養容器に提供するほか、培養細胞の種類や培養状況に応じて、二酸化炭素濃度、湿度、温度を適宜調節した気体をガス供給部に提供することができる。
　弁１３は、細胞培養中は培養容器３から溶液が漏出しないように閉鎖されている。そして、細胞培養終了後に弁１３は開放され、培養細胞が付着した磁性粒子を含む溶液を磁性粒子分離ユニット１５に移動させる。
　磁性粒子分離ユニット１５は、不図示の分離容器と、分離容器の外部に配置される磁石と、前記磁石を移動する磁石移動機構とを備える第２の磁力調節ユニットを具備している。分離容器内に溶液が流入すると、磁石が分離容器に接近し、溶液中の磁性粒子を捕獲する。そして、分離容器から培養液のみを排出し、培養細胞が付着した磁性粒子を分離容器に保持することにより、分離容器中で培養溶液から磁性粒子を分離することができる。その後、溶液供給部９、または磁性粒子分離ユニット１５に設けられた不図示の溶液注入口から供給される洗浄液、溶出液によって、磁性粒子に付着した培養細胞は洗浄、溶出される。第２の磁石移動機構の動作は、制御部２０により制御される。
　磁性粒子分離ユニット１５の分離容器内で細胞を溶出する方法は、トリプシンで処理する方法、または大量の緩衝液によって剥離させる方法が好ましいが、これらに限られない。本発明においては、細胞が培養容器３に付着することなく、磁性粒子分離ユニット１５の分離容器に移動されるため、分離容器内で細胞に使用されるトリプシンの濃度を、従来のものに比べて少なくすることができ、細胞にストレスを与えにくい。
　細胞分取ポート１７では、無菌状態を保持したまま磁性粒子分離ユニット１５から溶出した培養細胞を分取して他の容器に移し替えることができる。細胞分取ポート１７には、不図示の三方コック（三方弁）が配置されている。洗浄液の溶液を廃液ボトル１９に移動させた後、三方コックを操作して、溶出液によって磁性粒子から分離した培養細胞を含む溶液が細胞分取ポート１７に流れるように流れを変えることができる。細胞分取ポート１７には、培養細胞を受け入れる容器が接続されている。また、細胞分取ポート１７には、三方コックに限られず、溶液の流れを変えることができる機構であれば、例えば三方ボール切替弁等、任意の機構を配置することができる。図２において、細胞分取ポート１７は、磁性粒子分離ユニット１５よりも高い位置に設けるように図示したが、溶液が、磁性粒子分離ユニット１５から細胞分取ポート１７に落下するように、細胞分取ポート１７を磁性粒子分離ユニット１５よりも低い位置に配置してもよい。
　廃液ボトル１９は、細胞分取ポート１７から排出した溶液を貯留する。廃液ボトルの先端には、弁を設置してもよい。この弁を閉鎖すると無菌状態を保持したままボトルの交換ができる。
　図３は、培養システム１００の制御ブロック図である。制御部２０には、各種センサー２１と、計時部２２と、磁石移動機構７ｂと、温度調節ユニット５と、弁１１を開閉する弁駆動部１１ａと、弁１２を開閉する弁駆動部１２ａとが接続されている。制御部２０は、各種センサー２１からの信号に基づき、磁石移動機構７ｂを、入力したプログラムによって周期的、規則的に磁石を動かすことができる。また、制御部２０は、温度調節ユニット５により温度を制御し、弁駆動部１１ａにより弁１１を開閉し、弁駆動部１２ａにより弁１２を開閉する。
　各種センサー２０は、温度センサー、湿度センサー、二酸化炭素濃度センサー、ｐＨセンサー、溶液速度センサー、溶液容量センサー、菌センサー等である。培養装置１０には、各種センサー２０として、温度センサー、湿度センサー、二酸化炭素濃度センサー、溶液容量センサー、ｐＨセンサー、菌センサーのいずれか１つ又は複数を設けることができる。溶液供給部９、磁性粒子分離ユニット１５、細胞分取ポート１７、又は廃液ボトル１９には、各種センサー２０として、溶液容量センサー、ｐＨセンサー、菌センサーの少なくとも１つを設けることができる。弁１１又は１２の近傍の接続チューブには、各種センサー２０としてフローセンサーを設けることができる。制御部２０は、上記各種センサー２０の信号に応じて、各構成を連動して運転制御したり、異常を検知した場合は自動停止したりすることができる。
　以下、本発明の第１の実施形態に係る培養システム１００を用いて細胞を培養し、培養細胞を回収する方法を具体的に説明する。
　磁性粒子、培養細胞、及びセルロースキャリア等の担体を含む培養液が、溶液供給部９から培養容器３に供給される。その後、培養容器３には、細胞培養に必要な濃度の二酸化炭素、湿度の気体がガス供給部８から供給される。ガス供給部８は、二酸化炭素濃度５％、湿度９５％、温度３７％の気体条件に維持するように培養容器３に気体を供給する。培養容器３内の溶液は、培養容器３の下面に取り付けられている温度調節ユニット５によって温度が調節される。
　培養容器３内で、培養細胞が直接的又は間接的に付着した磁性粒子は、培養容器３に接近した磁力調節ユニット７の磁石７ａによって培養容器３の内表面に濃縮され固定される。細胞培養は、静置培養と振盪培養を繰り返して行われる。振盪培養を行う際には、磁力調節機構７ｂを図２に矢印で示すように揺動して磁石の磁力を変化させることより、培養容器３内の磁性粒子を振動することができる。または、不図示のスライド機構により培養容器３を左右に振動することもできる。培養容器３の位置は、スライド機構により変動するため、培養容器３に接続される接続チューブは、培養容器３の位置が変動しても接続が維持されるように、その長さに余裕を持たせて配置される。
　このように、磁性粒子を揺らすことにより、磁性粒子に付着した細胞も揺らして、磁性粒子上における培養細胞の位置を動かして、周囲の溶液を攪拌することができる。この攪拌によって、成長した細胞は、常に自然に栄養を吸収できる状態を維持することができる。
　細胞培養終了後、培養容器３から磁石７ａを離間させると、培養容器３の内表面から磁性粒子が分散する。そして、閉鎖していた弁１３を開放すると、磁性粒子分離ユニット１５は培養容器３よりも低い位置にあるため、磁性粒子を含む培養液は、重力にしたがって落下して、培養容器３から磁性粒子分離ユニット１５内の分離容器に移動する。
　分離容器内に溶液を流入させた後、第２の磁力調節ユニットの磁石を分離容器に接近させ、溶液中の磁性粒子は分離容器の内表面に固定し、分離容器から培養液のみを排出し、培養液から培養細胞及び磁性粒子が付着した担体を分離する。その後、溶液供給部９、または磁性粒子分離ユニット１５に設けられた供給口から供給される洗浄液によって、培養細胞及び磁性粒子が付着した担体を洗浄し、その後、分離容器内に供給された溶出液により、担体から培養細胞を溶出する。
　溶出した培養細胞は、細胞分取ポート１７を介して、無菌状態を保持したまま他の容器に移動する。廃液ボトル１９は、一連の工程で発生した溶液を貯留する。
（第２の実施形態）
　本発明の第２の実施形態に係る培養システム２００を図４～１１を用いて説明する。図４及び図５に示すように、培養システム２００は、薄い内部空間を有する培養容器２０３と、培養容器２０３の上面側に設けられた温度管理ユニット２０５と、培養容器２０３の下面側に設けられた磁力調節ユニット２０７とを備える。培養容器２０３には傾動機構２１２が接続され、図３に角度θで示す範囲で培養容器２０３を周期的に傾動させる。傾動機構２１２は、モータを用いることができる。傾動機構２１２が培養容器２０３を傾動する角度範囲は、好ましくは１０～２０°とすることができる。
　培養容器２０３には、スライド機構２１４が接続され、スライド機構２１４は、図４の矢印２１４ａで示す水平方向に培養容器２０３を周期的にスライド（振動）させる。スライド機構２１４は、モータの回転をラックやカムで直線運動に変換することにより実現される。培養容器２０３の位置は、傾動機構２１２やスライド機構２１４により変動するため、培養容器２０３に接続される接続チューブは、培養容器２０３の位置が変動しても接続が維持されるように、その長さに余裕を持たせて配置される。
　図４では、温度管理ユニット２０５を培養容器２０５の上面に設けるとしたが、温度管理ユニット２０５を培養容器２０５の上下両面に設けたり、下面に設けてもよい。温度管理ユニット２０５は、サーマルサーキュラー等の温度管理装置、ペルチェ素子、又はフィルムヒータ（面状発熱体）を用いることができるが、これらに限定されない。
　スライド機構２１４は、図４に示したよう培養容器２０３自体をスライドさせるものに限定されず、培養容器２０３及び磁石２０７ａの一方に対して他方を相対的にスライドさせればよい。例えば、図１０に示すように、培養容器２０３を動かさずに、スライド機構２１４’が、第２の磁力調節ユニット２０７’をスライドさせてもよい。第２の磁力調節ユニット２０７’内の磁石２０７’ａの配置は、磁力調節ユニット２０７内の磁石２０７ａの配置と同じにすることができる。スライド機構２１４’は、スライド機構２１４と同じ機構を用いることができる。図１０では、第２の磁力調節ユニット２０７’が培養容器２０３の上面側に設けられており、スライド機構２１４’により、水平方向に繰り返しスライドされる。このスライドにより、第２の磁力調節ユニット２０７’の磁石２０７’ａが培養容器２０３内の磁性粒子に及ぼす磁力が変動して、培養容器２０３内で濃縮及び固定されている磁性粒子及び細胞がスライド方向（ほぼ水平方向）に揺動される。なお、図１０には、温度管理ユニット２０５が図示されていないが、温度管理ユニットを、培養容器２０３と第２の磁力調節ユニット２０７’との間、又は第２の磁力調節ユニット２０７’の上面側に設けることができる。
　図４及び図５において、培養容器２０３の左側面には、弁１１を有する可撓性の接続チューブを介して、二酸化炭素等を含むガスボンベ２３０と、溶液供給容器２０９と、開口部２０９ａがそれぞれ接続される。接続チューブには、弁１１が設けられている。溶液供給容器２０９は、培養容器２０３より高い位置に配置されるため、溶液供給容器２０９から供給された溶液は重力落下により培養容器２０３に移動する。
　図４に示すように、培養システム２００は、三次元的に移動可能な自動分注器２４０を備え、調整ステージ上２５０には、試薬、溶液、培養細胞等を収容する各種容器２５０ａが複数配置されており、自動分注器２４０は各種容器２５０ａから試薬、溶液、培養細胞等を必要量吸引して調整し、溶液供給容器２０９に移動することができる。
　図４及び図５において、培養容器２０３の右側面には、弁１１を有する可撓性の接続チューブを介して、培養容器２０３からの廃液を溜める廃液槽２６０と、連結点Ｃとが接続される。連結点Ｃには、図１１に示す磁性粒子分離ユニット２０６、又は図１２に示す磁性粒子分離ユニット２０６’が接続される。
　図５に示すように、磁力調節ユニット２０７には、複数の永久磁石２０７ａが、マトリックス状に、即ち、等間隔で縦横に配列されている。この配列に含まれる永久磁石２０７ａが、それぞれ培養容器２０３内の培養溶液に含まれる磁性粒子及び細胞を、培養容器２０３の内面上に濃縮して固定することができる。隣合う磁石２０７ａの極性は、常に逆になるように配置される。これによって、隣合う磁石２０７ａに吸着した磁性粒子の極性が異なるようになり、両者の間に斥力が働く結果、磁石２０７ａに吸着された磁性粒子及び細胞の集団が集中しやすくなる。
　図４に示すように磁力調節ユニット２０７は、磁力調節ユニット移動機構２０７ｃにより、ガイド２０７ｂに沿って、培養容器２０３に接近したり離間したりすることができる。磁力調節ユニット２０７が培養容器３の下面に接近すると、磁石２０７ａの磁力により培養容器２０３内の培養溶液に含まれる磁性粒子及び細胞を、培養容器２０３内下面上に濃縮して固定（吸着）することができる。磁力調節ユニット２０７が培養容器３の下面から離間すると、磁石２０７ａの磁力が培養容器２０３内に及ばなくなり、培養容器２０３内下面上から磁性粒子及び細胞が移動して分散する。
　図６は、培養システム２００の制御ブロック図である。制御部２２０には、各種センサー２２１と、計時部２２２と、磁石移動機構２０７ｂと、温度調節ユニット２０５と、弁１１を開閉する弁駆動部１１ａと、培養容器２０３を傾動する傾動機構２１２と、培養容器２０３をスライドするスライド機構２１４ａと、分注器２４０を三次元的に移動する分注器移動機構２４１と、自動分注器２４０の吸引及び吐出を制御する分注用ポンプ２４２と、第２の磁石移動機構２０６ａとが接続されている。制御部２２０は、自動分注器２４０を用いて溶液等を調整し、溶液を溶液供給容器２０９に分注し、各種センサー２２１からの信号に基づき、磁石移動機構２０７ｂを動作させ、温度調節ユニット２０５により温度を制御し、弁駆動部１１aにより弁１１を開閉する。制御部２２０は、傾動機構２１２や、スライド機構２１４ａを動作して、培養容器２０３の傾動や、スライドを実行する。制御部２２０は、第２の磁石移動機構２０６ａの移動を制御して、磁性粒子分離ユニット２０６内で磁性粒子を濃縮して固定する。
　各種センサー２２１は、温度センサー、湿度センサー、二酸化炭素濃度センサー、ｐＨセンサー、溶液速度センサー、溶液容量センサー、時間センサー、菌センサー等である。培養容器２０３には、各種センサー２０として、温度センサー、湿度センサー、二酸化炭素濃度センサー、溶液容量センサー、ｐＨセンサー、菌センサーのいずれか１つ又は複数を設けることができる。溶液供給容器２０９、磁性粒子分離ユニット２０６、細胞回収容器２１８、又は廃液槽２０６には、各種センサー２２０として、溶液容量センサー、ｐＨセンサー、菌センサーの少なくとも１つを設けることができる。弁１１の近傍の接続チューブには、各種センサー２２０としてフローセンサーを設けることができる。制御部２２０は、上記各種センサー２２０の信号に応じて、各構成を連動して運転制御したり、異常を検知した場合は自動停止したりすることができる。
　図７に示すように、分離機構２０７ｃにより、培養容器２０３及び磁力調節ユニット２０７の一方に対して他方を、相対的に数ｍｍ～数十ｍｍ垂直方向に移動できるようにしてもよい。分離機構２０７ｃの垂直移動によって、培養容器２０３内に、磁力調節ユニット２０７の磁石２０７ａの磁力を及ぼしたり遮断したりすることを確実に制御できる。
　図８に示すように、磁性粒子を含む凝集体Ａ（結合体）が、磁石２０７ａにより培養容器２０３の内底面上で濃縮（凝集）され固定された状態にある。この状態で、スライド機構２１４が培養容器２０３及び磁石２０７ａの一方に対して他方を数ｍｍ～数十ｍｍの距離にわたって相対的に繰り返し矢印で示す水平方向にスライドをする。これによって、凝集体Ａの周囲が攪拌され、凝集体Ａに含まれる細胞の間に栄養素を導入できる。凝集体Ａは、磁性粒子と、培養細胞と、糸状のセルロースキャリア（担体）とから構成されている。
　図９に示すように、傾動機構２１２が、温度管理ユニット２０５と培養容器２０３と磁力調節ユニット２０７とから構成される培養装置２１０を、角度θの範囲で揺動させることができる。これにより培養液を継続的に攪拌して細胞に栄養を供給することができる。
　図１１に示すように、磁性粒子分離ユニット２０６の上部には、カプラー２０６ｂ（又はルアー）を介して連結点Ｃに至る接続チューブが接続されている。磁性粒子分離ユニット２０６は、連結点Ｃ及び培養容器２０３よりも低い位置に配置されている。したがって、培養容器２０３と連結点Ｃとを接続するチューブに設けた弁１１（図４）を開放することにより、培養容器２０３内の溶液は、重力にしたがって自動的に、培養容器２０３から磁性粒子分離ユニット２０６へ落下移送される。磁性粒子分離ユニット２０６には、第２の磁石移動機構２０６ａが設けられ、第２の磁石移動機構２０６ａが溶液中に含まれる磁性粒子を吸着する。
　磁性粒子分離ユニット２０６の上方には、弁１１が設けられた接続チューブを介して洗浄液供給部２７０が設けられる。洗浄液供給部２７０には、自動分注器２４０により洗浄液やトリプシン溶液等が分注され、これらは、洗浄液供給部２７０から落下移送されて、磁性粒子分離ユニット２０６の分離容器内に供給される。磁性粒子分離ユニット２０６の下部には、弁１１が設けられた接続チューブ、及びこの接続チューブに連結されるカプラー（又はルアー）２１９ａを介して廃液槽２１９が接続されている。また、磁性粒子分離ユニット２０６の下部には、弁１１が設けられた接続チューブを介して培養細胞回収容器２１８が配置される。図１１では、磁性粒子分離ユニット２０６及び廃液槽２１９を接続するライン（接続チューブ）と、磁性粒子分離ユニット２０６及び培養細胞回収容器２１８を接続するラインとを独立して設けたが、これらを途中まで１つのラインとし、三方弁により分岐して、廃液槽２１９又は培養細胞回収容器２１８に選択的に落下移送できるようにしてもよい。
　図１２の磁性粒子分離ユニット２０６’は、図１１の磁性粒子分離ユニット２０６の変形例である。磁性粒子分離ユニット２０６’の上部には、連結点Ｃに至る接続チューブが接続されている。磁性粒子分離ユニット２０６は、連結点Ｃ及び培養容器２０３よりも低い位置に配置されている。磁性粒子分離ユニット２０６’の上部には、カプラー２０６’ｂを介してシリンダ２７０’が接続され、シリンダ２７０’は、磁性粒子分離ユニット２０６’と着脱自在である。シリンダ２７０’には、ピストン２７０’ａが上下方向に進退自在に収容されている。ピストン２７０’ａを実線状態から破線状態に引き上げることにより、磁性粒子分離ユニット２０６’内の溶液をシリンダ２７０’内へ吸引することができる。ピストン２７０’ａを破線状態から実線状態に押し下げることにより、シリンダ２７０’から磁性粒子分離ユニット２０６’内へ溶液を吐出することができる。また、磁性粒子分離ユニット２０６’の上部には、ピストン２７０’ａの動作に応じて空気を出し入れする空気抜き管２０６’ｃが接続される。
　以下、本発明の第２の実施形態に係る培養システム２００を用いて細胞を培養し、培養細胞を回収する方法を具体的に説明する。
　磁性粒子、培養細胞、及びセルロースキャリア等の担体を含む培養液が、分注器２４０を用いて、溶液供給容器２０９に分注される。培養液は、溶液供給容器２０９から培養容器２０３に接続チューブを介して落下移送される。ガスボンベ２３０から二酸化炭素等が、培養容器２０３に供給される。培養容器２０３内の溶液は、温度調節ユニット２０５によって温度が調節される。
　培養容器２０３内で、培養細胞が直接的又は間接的に付着した磁性粒子は、培養容器２０３に接近した磁力調節ユニット２０７の複数の磁石２０７ａによって培養容器３の内表面に、マトリックス状に配置されて、この配置で濃縮され固定される。この固定状態で、培養容器２０７は、スライド機構２１４により左右にスライドしたり、傾動機構２１２により傾動されて、磁性粒子及び細胞が揺動される。さらに、分離機構２０７ｂにより、磁石２０７ａの培養容器２０７への接近、離間を行ってもよい。これらの運動により、細胞の周囲雰囲気が攪拌され細胞に栄養を供給することができる。
　細胞培養終了後、培養容器２０３から磁力調節ユニット２０７ｂを離間させると、培養容器２０３内で細胞及び磁性粒子が分散して、培養容器２０３内で磁性粒子及び細胞の結合体を浮遊状態化することができる。この浮遊状態で、連結点Ｃ側の弁１１を開放し細胞及び磁性粒子を含む溶液を、連結点Ｃを介して、図１０の磁性粒子分離ユニット２０６又は図１１の磁性粒子分離ユニット２０６’に落下移送する。
　図１１の磁性粒子分離ユニット２０６では、次の工程が実行される。培養容器２０３から落下移送された細胞及び磁性粒子の結合体を含む溶液が、磁性粒子分離ユニット２０６に収容される。この収容状態で、第２の磁石移動機構２０６ａを実線の位置に移動して、磁性粒子分離ユニット２０６ａの分離容器の内表面に細胞及び磁性粒子を濃縮して固定する。この固定状態で、廃液槽２１９側の弁１１を開放すると、磁性粒子及び細胞の結合体から溶液（培養液）が分離され、廃液槽２１９に排出される。溶液を排出した状態で、洗浄液供給部２７０側の弁１１を閉鎖して、洗浄液を自動分注器２４０を用いて洗浄液供給部２７０に分注する。洗浄液が洗浄液供給部２７０に収容された状態で、廃液槽２１９側の弁１１を閉鎖し、洗浄液供給部２７０側の弁を開放すると、洗浄液が磁性粒子分離ユニット２０６の分離容器内に落下移送される。洗浄液が分離容器内に収容された状態で、第２の磁石移動機構２０６ａを破線の位置に移動すると、分離容器内で細胞及び磁性粒子の結合体が分散され、結合体を洗浄することができる。洗浄後に、再度、第２の磁石移動機構２０６ａを実線の位置に移動すると、磁性粒子分離ユニット２０６の分離容器の内表面に結合体を濃縮して再固定することができる。
　この再固定状態で廃液槽２１９側の弁１１を開放して結合体から洗浄液を分離して、廃液槽２１９に排出する。洗浄液の排出後、廃液槽２１９側の弁１１を閉鎖し、自動分注器２４０で分注されたトリプシン溶液等の分離液を、洗浄液供給部２７０を介して、磁性粒子分離ユニット２０６に落下移送する。分離液が磁性粒子分離ユニット２０６内の分離容器に収容された状態で、第２の磁石移動機構２０６ａを破線の位置に移動させると、細胞及び磁性粒子の結合体が分離容器内に浮遊し、さらに不図示のボルテックスミキサー等の攪拌装置を用いて分離容器内に渦を形成して攪拌すると、結合体が破壊され磁性粒子から細胞が分離する。この分離状態で、第２の磁石移動機構２０６ａを実線の位置に移動すると、磁性粒子が分離容器の内表面に濃縮され固定される一方、細胞が分離容器内の溶液中に浮遊される。この細胞浮遊状態で、細胞回収容器２１８側の弁１１を開放すると、磁性粒子が分離された細胞を含む溶液が細胞回収容器２１８に落下移送され、培養細胞を分取することができる。
　図１２の磁性粒子分離ユニット２０６’では、図１１の磁性粒子分離ユニット２０６が実行した工程に換えて次の工程が実行される。培養容器２０３から落下移送された細胞及び磁性粒子の結合体を含む溶液が、磁性粒子分離ユニット２０６’に収容される。この収容状態で、第２の磁石移動機構２０６ａを実線の位置に移動して、磁性粒子分離ユニット２０６’の分離容器の内表面に細胞及び磁性粒子の結合体を濃縮して固定する。この固定状態で、シリンダ２７０’のピストン２７０ａを引き上げると、結合体から溶液（培養液）が分離され、溶液がシリンダ２７０’内に吸い出される。溶液を吸い出した状態で、シリンダ２７０’を磁性粒子分離ユニット２０６’から取り外して、シリンダ２７０’から不図示の廃液槽に溶液が排出される。シリンダ２７０’を洗浄した後に、シリンダ２７０’内に洗浄液を吸引した状態で、シリンダ２７０’を磁性粒子分離ユニット２０６’に接続する。この接続状態で、ピストン２７０’ａを押し下げて、洗浄液をシリンダ２７０’から磁性粒子分離ユニット２０６’の分離容器内に注入する。洗浄液が分離容器内に注入された状態で、第２の磁石移動機構２０６ａを破線の位置に移動すると、分離容器内で細胞及び磁性粒子の結合体が分散される。この分散状態で、結合体が洗浄される。洗浄後に、再度、第２の磁石移動機構２０６ａを実線の位置に移動すると、磁性粒子分離ユニット２０６の分離容器の内表面に結合体を濃縮して再固定することができる。再固定状態で、洗浄液のみをシリンダ２７０’に吸引し、シリンダ２７０’を磁性粒子分離ユニット２０６’から取り外して、シリンダ２７０’から洗浄液を廃液槽に排出する。
　洗浄液の排出後、シリンダ２７０’を洗浄し、トリプシン溶液等の分離液をシリンダ２７０’に吸引する。このシリンダ２７０’を磁性粒子分離ユニット２０６’に接続して、磁性粒子分離ユニット２０６’内に分離液を注入する。分離液が磁性粒子分離ユニット２０６内の容器に収容された状態で、第２の磁石移動機構２０６ａを破線の位置に移動させると、細胞及び磁性粒子の結合体が分離容器内に浮遊する。シリンダ２７０’を用いて、結合体が浮遊した溶液の吸引、吐出を繰り返すことにより、結合体が破壊され細胞が磁性粒子から分離する。この分離状態で、第２の磁石移動機構２０６ａを実線の位置に移動すると、磁性粒子が分離容器の内表面に濃縮され固定される一方、細胞が分離容器内の溶液中に浮遊される。この細胞浮遊状態で、細胞回収容器２１８側の弁１１を開放すると、磁性粒子が分離された細胞を含む溶液が細胞回収容器２１８に落下移送され、培養細胞を分取することができる。
　第２の実施の形態においては、溶液の重力移動原理と、ガスボンベ２３０による培養容器２０３内へのガス供給制御、ピンチコック等の弁１１の開閉、及び細胞分離ユニット２０６、２０６’での培養細胞と液体及び磁性粒子との分離により、培養システム２００への細胞の導入から細胞の回収までを一貫継続して繰り返し行うことができる。これによって、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞といった幹細胞を、必要量、自動的に培養して、患者毎に病院等にて供給できる。
　本発明は、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、体性幹細胞、免疫細胞、樹状細胞等、培養を要する細胞全てに実施可能である。本発明において、細胞培養に用いる要素の混合、攪拌、温度制御、反応、分離、洗浄、液体・気体の供給、移送等は、プログラムにしたがって制御部により自動的に行うことができる。
　本発明の各実施形態の培養装置及び培養システムは、培養細胞が磁性粒子に直接的又は間接的付着することを前提としている。本実施例では、前記培養装置の前提となる培養細胞の磁性粒子への付着に関して実験を行った。実験にあたっては、培養細胞が磁性粒子に間接的に付着するように、イオン交換樹脂製の担体を用いた。本実験は、培養細胞が担体に結合したまま、形状を保持することを確認するために行った。
　実験で使用した試薬及び消耗品は下記のとおりである。
・培養細胞株：Jurkat細胞 (human, T-cell Leukemia, ATCC)
・培地：RPMI media 1640 (Life technologies, 11875-093)
・ウシ胎児血清（Fetal Bovine Serum）：Life technologies, 10437-028
・抗生物質：Antibiotic-Antimycotic, 100X (Life technologies, 15240-062)
・リン酸緩衝生理食塩水（PBS, pH 7.4）： Life technologies, 10010023
・細胞凍結保存液：セルバンカー（LSIメディエンス, BLC-1）
・担体：強塩基性陰イオン交換樹脂破砕物（アンバーライトIRA400J, 粒径45～150 μm）
・培養容器：浮遊培養用シャーレ35φ（住友ベークライト, MS-1135R）
・ディスポーザブルピペット 50 ml, 25 ml, 5 ml
・ディスポーザブルチップ 1 ml
　実験で使用した機器は下記のとおりである。
・CO2インキュベーターHeracell 150SS (Helaeus, 155SS)
・倒立顕微鏡（カールツァイスマイクロイメージング社, Primo Vert）
・電動ピペッター（Thermo Scientific S1 Pipet Filler）
・ピペッターP1000 （Gilson, P1000）
　500 mlのRPMI1640に50 mlのFetal Bovine Serumを加え、5 mlのAntibiotic-Antimycotic, 100Xを加えた。これを培地とし、4℃で保管し、使用時に室温に戻した。10 mlの培地を無菌的にシャーレに分取した。セルバンカーによって保存されたJurkatのチューブを取り出し、融解後、シャーレに全量（1×106 cells, 1 ml）を加えた。37 ℃のCO2 インキュベーター（CO2 : 5 %）にて3日間培養した。
　9 mlのRPMI1640を新たなシャーレに無菌的に分取した。３日間培養した培養液を電動ピペッターで、撹拌し、1 mlの培養液をシャーレに加え、電動ピペッターで培養液を撹拌した。200 μlの担体（5 g/ml）を シャーレに加え、電動ピペッターで培養液を撹拌した。なお、電動ピペッターによる撹拌は、培養液の全量を吸引し全量を吐出する動作を10回繰り返えすことにより行った。撹拌後の培養液を倒立顕微鏡で観察した。シャーレをCO2 インキュベーター（CO2 : 5 %）にて3日間培養し、培養液を倒立顕微鏡で観察した。さらに3日間培養し、培養液を倒立顕微鏡で観察した。
　観察結果の写真（初日、３日目、５日目）を図１３に示す。図１３中の「ｘ１００」、「ｘ４００」は倒立顕微鏡の倍率を示す。図１３（Ａ）に示すように、Jurkat細胞は、担体と接触後に直ち担体に結合した。さらに、図１３（Ｂ）及び（Ｃ）に示すように、撹拌培養によって、３日後、及び５日後も、細胞と担体との結合が保持された状態で、細胞が増殖している様子が伺えた。したがって、細胞は、撹拌状態で培養細胞が担体に結合すると共に、担体上で増殖しうることが示唆された。
　上記実験では、磁化した担体を用いていないが、担体の表層状態を保持したまま担体を磁化することは可能である。イオン交換樹脂製の担体と鉄粉の磁性粒子とは結合するため、これらを混合することにより、担体を間接的に磁化することができる。このような結合は、例えば、本出願人による特開２００９－２４７２４４号公報「担体と磁性体の結合を含む微生物分離方法」に記載されており、これを参照により援用する（incorporate by reference）。
３　培養容器
５　温度調節ユニット
７　磁力調節ユニット
７ａ　磁石
７ｂ　磁石移動機構７ｂ
８　ガス供給部
９　溶液供給部
１０　培養装置
１１　弁
１５　磁性粒子分離ユニット
１７　細胞分取ポート
１９　廃液ボトル
１００　培養システム
２０３　培養容器
２０５　温度調節ユニット
２０６　磁性粒子分離ユニット
２０７　磁力調節ユニット
２０７ａ　磁石
２０７ｃ　移動機構
２１４　スライド機構
２１８　回収容器
２３０　ガスボンベ
２４０　分注器
２６０　廃液槽
２００　培養システム

Claims (26)

  1. 　細胞、前記細胞を直接的又は間接的に付着する磁性粒子、及び溶液を収容する培養容器と、前記培養容器の温度調節ユニットと、前記培養容器の外部に設けられる磁石と、前記磁石の磁力を調節する磁力調節ユニットとを具備する培養装置であって、
    　前記磁力調節ユニットが前記磁石の磁力を調節して、前記磁性粒子及び前記細胞を前記培養容器内の所定領域に保持した状態で、細胞培養を行うことを特徴とする、培養装置。
  2. 　前記磁力調節ユニットが前記磁石の磁力を調節して、前記磁性粒子及び前記細胞を前記培養容器内に分散することを特徴とする、請求項１に記載の培養装置。
  3. 　前記磁石が、間隔をあけて配置された複数の磁石であることを特徴とする、請求項１又は２項に記載の培養装置。
  4. 　前記複数の磁石のそれぞれが、前記培養容器の一面に対向するように配置されることを特徴とする、請求項３に記載の培養装置。
  5. 　前記複数の磁石のそれぞれが、隣接する磁石と極性が異なるように配置されることを特徴とする、請求項３又は４に記載の培養装置。
  6. 　前記複数の磁石が、マトリックス状に配置されることを特徴とする請求項３～５のいずれか１項に記載の培養装置。
  7. 　前記磁性粒子及び前記細胞は、前記培養容器内の前記所定領域に保持された状態で濃縮又は凝集されている、請求項１～６のいずれか１項に記載の培養装置。
  8. 　前記磁力調節ユニットが、前記磁石と前記培養容器との距離及び／又は位置を変動させることを特徴とする、請求項１～７のいずれか１項に記載の培養装置。
  9. 　前記磁力調節ユニットが前記磁石を前記培養容器に接近させることにより、前記磁性粒子及び前記細胞を前記所定領域に保持した状態で、前記細胞培養を行うことを特徴とする、請求項１～８のいずれか１項に記載の培養装置。
  10. 　前記磁石及び前記培養容器の一方に対して他方を相対的にスライドするスライド機構を備えることを特徴とする、請求項１～９のいずれか１項に記載の培養装置。
  11. 　前記スライド機構により前記細胞培養の振盪培養を行うことを特徴とする、請求項１０に記載の培養装置。
  12. 　前記培養容器を揺動する揺動機構を備えることを特徴とする、請求項１～１１のいずれか１項に記載の培養装置。
  13. 　前記磁力調節ユニットが前記培養容器内で前記磁性粒子及び前記細胞を前記所定領域に保持した状態で、前記培養容器に溶液を注入するか、又は前記培養容器から溶液を排出することを特徴とする、請求項１～１２のいずれか１項に記載の培養装置。
  14. 　前記磁力調節ユニットが、前記磁石の接近、振動、及び離間から選択される複数の動作を組み合わせて、前記細胞培養を行うことを特徴とする、請求項１～１３のいずれか１項に記載の培養装置。
  15. 　前記磁力調節ユニットが、前記培養容器内で前記磁性粒子及び前記細胞を分散可能とした状態で、前記培養容器から培養細胞を含む溶液を回収することを特徴とする、請求項１～１４のいずれか１項に記載の培養装置。
  16. 　前記培養容器に対して、前記温度調節ユニット、及び前記磁力調節ユニットの少なくとも一つが脱着可能であることを特徴とする、請求項１～１５のいずれか１項に記載の培養装置。
  17. 　請求項１～１６のいずれか１項に記載の培養装置を具備する培養システムであって、細胞培養に用いる材料及び溶液を前記培養容器に供給する供給部と、前記培養容器で培養された細胞を含む溶液から前記磁性粒子を分離する磁性粒子分離ユニットとを具備したことを特徴とする、培養システム。
  18. 　前記溶液が重力落下によって移送されることを特徴とする、請求項１７に記載の培養システム。
  19. 　前記供給部、前記培養容器、前記磁性体分離ユニットが、順に上方から下方に配置されることを特徴とする、請求項１７又は１８に記載の培養システム。
  20. 　前記供給部と前記培養容器との間、前記培養容器と前記磁性体分離ユニットとの間を、それぞれ管路で接続することを特徴とする、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の培養システム。
  21. 　前記管路のそれぞれを開閉する弁を備えることを特徴とする、請求項２０に記載の培養システム。
  22. 　前記細胞培養に用いる前記材料及び溶液を前記供給部に分注する分注機構を備えることを特徴とする、請求項１７～２１のいずれか１項に記載の培養システム。
  23. 　請求項１～１６のいずれか１項に記載の培養装置を用いて細胞の培養を行うことを特徴とする細胞の培養方法。
  24. 　請求項１７～２２のいずれか１項に記載の培養システムを用いて、細胞を培養する方法であって、
    　前記供給部から前記培養容器へ、細胞培養に用いる前記材料及び溶液を供給する工程と、
    　前記培養装置を用いて細胞を培養する工程と、
    　前記磁性粒子分離ユニットで細胞を含む溶液から磁性粒子を分離する工程と、
    　前記磁性粒子が分離された溶液から細胞を分取する工程と、
    を具備することを特徴とする、方法。
  25. 　分注機構を用いて前記細胞培養に用いる前記材料又は溶液を前記供給部に分注する工程を備える、請求項２４に記載の方法。
  26. 　制御部が前記各工程を自動的に実行することを特徴とする、請求項２４又は２５に記載の方法。
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