KR20190140906A

KR20190140906A - 세포-유래 마이크로필라멘트 네트워크의 생성 방법

Info

Publication number: KR20190140906A
Application number: KR1020197028446A
Authority: KR
Inventors: 팅팡 이; 거하드 와그너
Original assignee: 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지
Priority date: 2017-04-14
Filing date: 2018-04-13
Publication date: 2019-12-20
Also published as: US20220080028A1; WO2018191672A1; US20200138904A1; JP2020516593A; US11185568B2; EP3448396A4; CA3019250A1; EP3448396A1; CN109789167A

Abstract

본 발명은 세포-유래 마이크로필라멘트의 네트워크를 제공한다. 매트릭스 지지체 및 세포 배양 배지 중에서 세포를 배양하는 것을 통해 마이크로필라멘트의 네트워크를 생산하는 방법 (여기서 세포는 증식하고, 응집된 세포괴를 형성하고, 이는 세포괴 외부에 및 그 주변에 마이크로필라멘트를 생산하고, 여기서 세포외 마이크로필라멘트는 연결되어, 연속 세포외 마이크로필라멘트 네트워크를 형성함), 및 치료를 필요로 하는 부위에 마이크로필라멘트 네트워크를 적용시키는 단계를 포함하는, 의학적 병태를 치료하는 방법 뿐만 아니라 상처 회복 및 조직 재생을 촉진시키는 방법을 또한 제공한다.

Description

세포-유래 마이크로필라멘트 네트워크의 생성 방법

관련 출원 데이터

본 출원은 2017년 4월 14일 출원된 미국 가출원 번호 62/485,422를 우선권 주장하고, 상기 가출원은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에서 참조로 포함된다.

정부 이익에 관한 진술

본 발명은 미국 국립 보건원(National Institutes of Health)으로부터 승인 번호 CA68262 하에 정부 지원에 의해 이루어졌다. 정부는 본 발명에 소정의 권리를 갖는다.

분야

본 발명은 상처 치유 및 조직 재생에 유용한 방법 및 조성물에 관한 것이다.

상처 회복은 복잡한 생물학적 프로세스를 포함하며, 표면적이 넓은 상처를 관리하는 것은 큰 도전과제가 된다 ([Singer, A. J. & Clark, R. A. Cutaneous wound healing. The New England journal of medicine 341, 738-746 (1999)], [Passier, R., van Laake, L. W. & Mummery, C. L. Stem-cell-based therapy and lessons from the heart. Nature 453, 322-329 (2008)]). 매년 1억 명이 넘는 환자들이 상처로 고생하고 있다 (Takeo, M., Lee, W. & Ito, M. Wound healing and skin regeneration. Cold Spring Harbor perspectives in medicine 5, a023267 (2015)). 포유동물 기관에서는 손상 발생 후 즉시, 파괴 및/또는 이환된 세포는 면역계, 혈액 응고 캐스케이드, 염증 경로, 및 임의의 이웃하는 비손상 세포 내에서 다양한 세포내 및 세포간 경로를 유도하는 각종 분자를 방출한다 (Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y. & Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature 453, 314-321 (2008)). 손상에 대해 정상적으로 반응하는 동안, 호중구, 단핵구, 림프구, 내피 세포, 각질형성세포, 섬유모세포, 및 줄기 세포 및 그의 유도체를 비롯한, 많은 유형의 세포는 신호전달, 유전자 발현, 및 표현형에서 현저한 변화를 겪게 되고, 이를 통해 세포 이동, 증식, 및 분화가 일어나게 된다 (Lane, S. W., Williams, D. A. & Watt, F. M. Modulating the stem cell niche for tissue regeneration. Nature biotechnology 32, 795-803 (2014)). 동적인 상호간의 세포-세포외 매트릭스 (ECM) 및 세포-세포 상호작용이 염증, 새 조직 형성, 및 리모델링의 복합한 프로세스 동안 다양한 경로의 활성화 및 중단을 정확하게 조정한다. 일부 진핵 유기체는 여전히 충분히 이해되고 있지 못하고 있는 프로세스인 재생을 통해 성체로서 사는 그의 전생에 걸쳐 원래의 조직 구조 및 기능을 완전하게 복제할 수 있는 능력을 유지한다. 알 수 없는 이유에서, 인간은 오직 출생 전 발생 동안에만 상기 능력을 나타낸다 (Zielins, E. R. et al. Wound healing: an update. Regenerative medicine 9, 817-830 (2014)). 병태생리가 비-치유 궤양에서 관찰되는 것과 같은 손상된 치유, 또는 비후성 반흔 및 켈로이드에서 발견되는 것과 같은 "과다치유"를 유도할 수 있다. 추가로, 부적절한 개입은 악성 형질변환을 유발할 수 있다 (Chidgey, A. P., Layton, D., Trounson, A. & Boyd, R. L. Tolerance strategies for stem-cell-based therapies. Nature 453, 330-337(2008)). 병진 연구에서 줄기 세포가 유망함에도 불구하고, 임상 상처 치유 방식에서 동종 이계 및 자가 줄기 세포 요법 사용은 여전히 많은 조절상의 장애물에 직면해 있다 (Rose, L. F. & Chan, R. K. The Burn Wound Microenvironment. Advances in wound care 5, 106-118 (2016)). 인간에서 복잡하고, 만성적이며, 및 부위가 큰 상처 관리는 도전과제로 남아있다.

상처 치료용으로 적절한 것으로 간주되기 위해서는, 물질/작용제는 신생물 발생을 유도하지 않으면서, 재상피화 및 상처 치유를 촉진시키고, 통증은 최소화시키며, 감염 위험은 감소시키고, 미용상 기형을 감소시켜야 하고; 그러한 물질을 선별하는 것이 현대 상처 관리 및 재생 의학의 주된 요소가 된다 (Lutolf, M. P. & Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nature biotechnology 23, 47-55 (2005)). 현재 이용가능한 인공 상처-치유 매트릭스는 합성 매트릭스이고/거나, 다양한 기술을 사용하여 제조된 천연 생체모방 물질을 함유하고; 상기 물질로는 실리콘, 바이오브랜, 나노피브릴, 초분자 물질, 및 개별 또는 다중 생화학적 ECM-유래 신호를 제공하는 스캐폴드를 포함한다 ([Warner, P. M., Coffee, T. L. & Yowler, C. J. Outpatient burn management. The Surgical clinics of North America 94, 879-892 (2014)]; [Hubbell, J. A. Biomaterials in tissue engineering. Bio/technology 13, 565-576 (1995)]). ECM은 세포 분비 단백질 및 글리코사미노글리칸의 교합 메쉬로 구성된다. 천연 ECM은 신호 유도 세포 이동 및 줄기 세포 분화에 중요한 표면 토폴로지, 벌크 강성, 탄성, 전단력, 및 공극 크기와 같은 생물리학적 특성을 갖는다. 추가로, ECM은 또한 세포 운명에 영향을 주는 다양한 가용성 성장 인자, 신호 수용체 및 유착 분자를 고정시킨다. 재구성된 ECM 및 ECM-유래 물질에는 천연 토폴로지 정보, 가용성 성장 인자 및 고정된 인자 농축물이 존재하지 않을 수 있다. 현행 기술이 상당히 진보하였음에도 불구하고, 상처 회복에서 사용하는 데 이상적인 물질이 될 수 있게 만드는 완전하고, 천연의 ECM 생물리적, 생화학적, 및 생체역학적 특성을 갖는 넓은 면적의 (ft² 규모) 천연 생체물질은 현재 이용가능한 것은 없다 (Chien, K. R. Regenerative medicine and human models of human disease. Nature 453, 302-305 (2008)).

상처 감염은 계속해서 어려운 도전 문제가 되고 있으며, 건강관리상의 큰 부담을 주고 있다. 미생물 오염 및 콜로니화를 막는 상처에서의 물리적 장벽은 상처 감염 예방에 필수적이다. (급성 또는 만성) 상처는 보통 박테리아, 진균 및 바이러스를 비롯한 미생물을 함유한다 ([Sood, A., Granick, M. S., and Tomaselli, N. L. (2014) Wound Dressings and Comparative Effectiveness Data. Advances in wound care 3, 511-529], [Lall, R. R., Wong, A. P., Lall, R. R., Lawton, C. D., Smith, Z. A., and Dahdaleh, N. S. (2014) Evidence-based management of deep wound infection after spinal instrumentation. Journal of clinical neuroscience : official journal of the Neurosurgical Society of Australasia], [Misic, A. M., Gardner, S. E., and Grice, E. A. (2014) The Wound Microbiome: Modern Approaches to Examining the Role of Microorganisms in Impaired Chronic Wound Healing. Advances in wound care 3, 502-510]). 상처에 박테리아가 존재하면, 상처 오염, 콜로니화 및 감염이 일어날 수 있다 (Adam, E. N., and Southwood, L. L. (2006) Surgical and traumatic wound infections, cellulitis, and myositis in horses. The Veterinary clinics of North America. Equine practice 22, 335-361, viii). 상처 감염 동안, 박테리아는 증식하고, 치유는 파괴되고, 상처 조직은 손상된다 (국부 감염) ([Gomathysankar, S., Halim, A. S., and Yaacob, N. S. (2014) Proliferation of keratinocytes induced by adipose-derived stem cells on a chitosan scaffold and its role in wound healing, a review. Archives of plastic surgery 41, 452-457], [Grazul-Bilska, A. T., Johnson, M. L., Bilski, J. J., Redmer, D. A., Reynolds, L. P., Abdullah, A., and Abdullah, K. M. (2003) Wound healing: the role of growth factors. Drugs of today 39, 787-800]). 박테리아는 인근 조직으로 감염 확산시키거나, 또는 전신 질환을 보이는 전신 감염을 초래할 수 있다. 급성 상처로는 외과성 상처 및 외상성 상처, 화상을 포함한다 ([Palmieri, T. L., Przkora, R., Meyer, W. J., 3rd, and Carrougher, G. J. (2014) Measuring burn injury outcomes. The Surgical clinics of North America 94, 909-916], [Jeng, J., Gibran, N., and Peck, M. (2014) Burn care in disaster and other austere settings. The Surgical clinics of North America 94, 893-907]). 예를 들어, 미국에서만도 매년 대략 500,000여 명의 사람들이 의학적 화상 치료를 구하고 있다 (Heard, J. P., McDonald, K. M., Xing, Y., Kluesner, K. M., Liao, J., and Wibbenmeyer, L. A. (2014) Regional and National Review of Factors Associated With Burn Wound Cellulitis. Journal of burn care & research : official publication of the American Burn Association). 만성 상처로는 당뇨성 족부 궤양, 정맥 다리 궤양, 동맥 다리/족부 궤양 및 압박성 궤양을 포함한다 ([Moran, M. E. (2014) Scleroderma and evidence based non-pharmaceutical treatment modalities for digital ulcers: a systematic review. Journal of wound care 23, 510-516], [Baltzis, D., Eleftheriadou, I., and Veves, A. (2014) Pathogenesis and treatment of impaired wound healing in diabetes mellitus: new insights. Advances in therapy 31, 817-836]). 비록 상처 감염의 효과적인 관리를 위해서는 학제적 접근이 필요하지만, 손상된 조직을 미생물로부터 보호하는 물리적 장벽이 최적의 감염 관리 방법이다 (Cheadle, W. G. (2006) Risk factors for surgical site infection. Surgical infections 7 Suppl 1, S7-11).

천연 세포 세포질 막은 인광체, 당 쇄 등에 의해 변형된 수천 개의 막 단백질을 보유하는 지질 이중막이다. 세포 세포질 막은 효과적으로 미생물 감염에 대한 물리적 장벽을 형성할 수 있다 (Hahler, B. (2006) Surgical wound dehiscence. Medsurg nursing: official journal of the Academy of Medical-Surgical Nurses 15, 296-300; quiz 301). 그러나, 단일 세포의 세포질 막의 면적은 임상 용도로 적용되기에는 너무 작다 (㎛² 수준). 세포막은 취약하고, 두께가 아주 얇기 때문에 (5~10 nm), 다수 세포의 세포질 막을 수집하기 어렵고, 상처 치료에 유용한 막으로 재조직화하기 어렵다. 상처 회복, 및 상처 감염의 효과적인 예방 및 관리에 유용한, 넓은 면적의 막이 여전히 요구되고 있다.

본 개시내용은 이러한 요구사항을 충족시켜 주며, 매트릭스 지지체에서 성장된 천연 1차 인간 상피 세포가 넓은 면적의 마이크로필라멘트 네트워크를 생산한다는 발견을 기반으로 한다. 한 측면에 따라, 마이크로필라멘트 네트워크는 만성 및 급성 상처, 화상 치료, 급성 및 외과적 상처 치료를 비롯한, 상처 감염의 예방 및 관리를 위한 물리적 장벽으로서 작용한다. 본원에서 제시되는 바와 같이, 세포 매트릭스 상에서 배양된 1차 인간 상피 세포는 넓은 면적의 마이크로필라멘트 네트워크를 생성한다. 또 다른 측면에 따라, 마이크로필라멘트 네트워크는 세포 또는 핵 제거를 위해 프로세싱된다. 한 측면에 따라, 마이크로필라멘트 네트워크는 상처에 적용될 수 있고, 미생물 유도 상처 감염을 예방하기 위한 물리적 장벽으로서 작용한다. 조작된 넓은 면적의 마이크로필라멘트 네트워크-매트릭스 복합층은 박테리아, 진균 및 바이러스를 비롯한, 미생물에 의한 감염을 효과적으로 예방할 수 있다.

진핵 세포에서 주 세포골격 중합체인 마이크로필라멘트는 액틴 서브유니트 및 액틴-결합 단백질에 의해 중합된다. 마이크로필라멘트는 세포 분열 및 세포질 분열, 세포 형상 유지, 소포체 수송, 신호 전달 및 세포 운동성을 위해 필수적이다. 대부분의 동물 세포는 마이크로미터 (㎛) 규모의 세포 크기를 유지하고, 이는 세포골격 마이크로필라멘트 네트워크의 면적으로 동일 규모로 한정한다. 특정 측면에 따라, 시험관내 마트리겔 상에서 배양된 인간 상피 세포괴는 초대형 세포외 마이크로필라멘트 네트워크 (EMN)를 생성한다. 상기 EMN은 세포 이동을 촉진시킨다. 한 측면에 따라, 상기 EMN은 제곱 피트 (ft²) 크기로 성장할 수 있다. 또 다른 측면에 따라, 상기 마이크로필라멘트 네트워크는 일반 상처 치유 요법에서 유용성을 갖는다. 특정 측면에 따라, 인간 상피 세포괴에 의해 생성된 EMN은 광범위한 막으로 둘러싸인 마이크로필라멘트를 함유한다. 한 측면에 따라, 마이크로필라멘트 네트워크는 세포괴 제거를 위해 처리되고, 이로써, 인공, 무세포, 및 ft² 규모의 초대형 다층 격자 (UML)를 생산한다. 또 다른 측면에 따라, 상기 UML은 재상피화를 촉진시키는 데 사용될 수 있다. 추가의 또 다른 측면에 따라, 상기 UML은 마우스에서 2도 열 화상 상처를 치유하는 데 유용성을 갖는다. 특정 측면에 따라, 인간 상피 세포에 의해 생산된 EMN은 세포 이동을 촉진시킨다. 한 측면에 따라, 세포 제거 후 수득된 UML은 상처 치유 및 조직 재생을 촉진시키는 데 사용될 수 있다.

한 측면에서, 본 개시내용의 실시양태는 복수의 마이크로필라멘트 발원 영역 사이에서 연속 격자 또는 메쉬 구조로 상호연결된 세포-유래 마이크로필라멘트를 포함하는 네트워크에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용의 실시양태는 매트릭스 지지체 및 세포 배양 배지 중에서 세포를 배양하는 단계를 포함하고, 여기서 세포는 증식하고, 응집된 세포괴를 형성하고, 여기서 세포괴는 세포괴 외부에 및 그 주변에 마이크로필라멘트를 생산하고, 여기서 세포외 마이크로필라멘트는 연속 세포외 마이크로필라멘트 네트워크를 연결하고, 형성하는 것인, 마이크로필라멘트의 네트워크를 제조하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 마이크로필라멘트의 네트워크는 세포의 핵 및/또는 네트워크로부터 세포 제거를 위해 처리된다. 한 실시양태에서, 세포괴는 매트릭스 지지체의 상부에 형성된다.

한 실시양태에서, 네트워크의 마이크로필라멘트는 세포외 마이크로필라멘트이다. 또 다른 실시양태에서, 마이크로필라멘트는 막으로 둘러싸여 있는 것이다. 한 실시양태에서, 마이크로필라멘트는 액틴을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 액틴은 β-액틴을 포함한다. 한 실시양태에서, 마이크로필라멘트는 약 1-1000 ㎛ 길이이다. 또 다른 실시양태에서, 마이크로필라멘트는 분지형이다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 마이크로필라멘트는 약 2-10개의 분지를 갖는다. 한 실시양태에서, 다중 마이크로필라멘트가 함께 정렬되고, 다양한 아키텍처 구조의 번들을 형성한다. 또 다른 실시양태에서, 마이크로필라멘트 발원 영역은 연속 격자 또는 메쉬 구조를 위한 연결 노드를 형성한다. 한 실시양태에서, 네트워크는 접착 물질을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 접착 물질은 마이크로필라멘트와 회합하고, 마이크로필라멘트의 직경을 확장시킨다. 한 실시양태에서, 네트워크의 면적은 약 1 ㎛² 내지 약 500 ㎠ 범위이고, 두께는 약 1 nm내지 약 0.5 cm 범위이다. 또 다른 실시양태에서, 네트워크는 단일층 또는 다층이다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 마이크로필라멘트의 표면적은 세포내 세포골격 마이크로필라멘트 네트워크 표면적의 등가 단위보다 크다.

한 실시양태에서, 네트워크는 다공성이다. 한 실시양태에서, 공극 크기는 직경 약 0.1 - 5 ㎛ 범위이다. 한 실시양태에서, 네트워크는 생물활성제 및/또는 생물불활성제를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 생물활성제는 치료 약물이다. 한 실시양태에서, 마이크로필라멘트 발원 영역은 세포를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 네트워크는 매트릭스 지지체 상에 존재한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 매트릭스 지지체는 생분해성이다. 한 실시양태에서, 네트워크는 마트리겔 매트릭스 지지체 상에 존재한다. 한 실시양태에서, 네트워크에는 세포로부터의 핵이 결여되어 있는다. 또 다른 실시양태에서, 네트워크에는 세포가 결여되어 있는다. 한 실시양태에서, 마이크로필라멘트 발원 영역은 유전자가 변형된 또는 변형되지 않은 진핵 세포를 포함한다. 한 실시양태에서, 진핵 세포는 포유동물 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 포유동물 세포는 인간 세포이다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 인간 세포는 인간 유방 상피 세포이다. 한 실시양태에서, 마이크로필라멘트는 매트릭스 지지체의 상부 표면 내에 포매된다. 한 실시양태에서, 매트릭스는 마트리겔이다. 한 실시양태에서, 매트릭스 지지체는 세포 부착 및 이동을 억제시킨다.

추가의 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 부위에 마이크로필라멘트 네트워크를 적용시킴으로써 의학적 병태를 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 마이크로필라멘트 네트워크는 매트릭스와 함께 적용된다. 또 다른 실시양태에서, 마이크로필라멘트 네트워크는 매트릭스 부재하에 적용된다. 한 실시양태에서, 의학적 병태는 상처 또는 손상된 조직이다. 또 다른 실시양태에서, 마이크로필라멘트 네트워크는 상처 또는 손상된 조직의 치유를 촉진시키고/거나, 그의 감염을 예방한다. 한 실시양태에서, 의학적 병태는 화상이다. 한 실시양태에서, 본 방법은 손상된 피부의 재상피화를 증진시키거나 또는 촉진시키는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 방법은 치료를 필요로 하는 부위에 마이크로필라멘트 네트워크를 적용시키기 전, 그와 공동으로, 또는 그 이후에 치료 약물을 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

관련된 측면에서, 본 개시내용은 복수의 세포 클러스터를 매트릭스 기재의 표면 상에서 세포 클러스터가 세포 클러스터 외부에 및 그 주변에 마이크로필라멘트를 생산하는 조건하에서 배양하는 단계를 포함하고, 여기서 세포외 마이크로필라멘트는 매트릭스 기재의 표면 상의 세포 클러스터 사이에서 연결되어 마이크로필라멘트의 연속 세포외 네트워크를 형성하는 것인, 시험관내에서 세포-유래 마이크로필라멘트의 연속 네트워크를 생산하는 방법을 고려한다. 한 실시양태에서, 세포 클러스터는 평균 거리 약 1 ㎛ 내지 약 1000 ㎛만큼 이격되어 있다. 또 다른 실시양태에서, 세포 클러스터를 연결하는 마이크로필라멘트의 평균 길이는 약 1 ㎛ 내지 약 1000 ㎛이다. 한 실시양태에서, 연속 세포외 마이크로필라멘트 네트워크는 다층 격자이다. 또 다른 실시양태에서, 마이크로필라멘트는 분지형이다. 한 실시양태에서, 연속 세포외 마이크로필라멘트 네트워크는, 길이가 약 10 ㎛ 내지 약 1000 ㎛인 긴 마이크로필라멘트 및 길이가 약 1 ㎛ 내지 약 10 ㎛인 짧은 마이크로필라멘트를 포함하는 다층 격자이다. 또 다른 실시양태에서, 마이크로필라멘트의 연속 세포외 네트워크의 표면적은 약 0.01 ㎠ 내지 500 ㎠이다. 한 실시양태에서, 연속 세포외 마이크로필라멘트 네트워크는 메쉬이다. 또 다른 실시양태에서, 연속 세포외 마이크로필라멘트 네트워크는 다공성이다. 한 실시양태에서, 세포는 매트릭스 기재의 표면 상에 이식되고, 여기서 세포는 이동하고, 프리클러스터로 응집되고, 증식되어 세포 클러스터를 형성한다. 또 다른 실시양태에서, 본 방법은 연속 세포외 마이크로필라멘트 네트워크로부터 세포 핵 또는 세포 클러스터를 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 매트릭스 기재는 세포의 부착 및/또는 이동을 억제시킨다. 또 다른 실시양태에서, 본 방법은 매트릭스 기재를 연속 세포외 마이크로필라멘트 네트워크로부터 분리시키는 단계를 추가로 포함한다.

또 다른 측면에 따라, 상처 회복 및/또는 조직 재생의 촉진을 필요로 하는 부위에 마이크로필라멘트 네트워크를 적용시키는 단계를 포함하는, 상처 회복 및/또는 조직 재생을 촉진시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 마이크로필라멘트 네트워크는 매트릭스와 함께 또는 그의 부재하에 적용된다. 한 실시양태에서, 마이크로필라멘트 네트워크는 제곱 피트 (ft²) 규모의 초대형 마이크로필라멘트 격자 (UML)를 형성한다. 또 다른 실시양태에서, UML은 세포 이동을 위한 환경을 구축한다. 한 실시양태에서, 마이크로필라멘트 네트워크는 다층이고, 3차원 (3D)이다. 또 다른 실시양태에서, 본 방법은 세포괴를 제거하는 단계, 및 무세포 UML (AUML)을 생산하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, AUML은 상처 회복을 촉진시킨다. 또 다른 실시양태에서, 본 방법은 AUML을 상처 부위에 적용시키는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, AUML을 적용시키는 단계는 각질형성세포가 재상피화된 표피에서 큰 터널을 생성할 수 있게 할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 큰 터널은 상처 회복 부위로의 세포 및 영양소를 위한 경로를 제공한다. 특정 실시양태에서, 마이크로필라멘트 네트워크는 상처 부위의 감염을 예방한다. 한 실시양태에서, 본 방법은 상처 피부의 재상피화를 증진 또는 촉진시키는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상처는 2도 열 화상 상처이다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 본 방법은 치료를 필요로 하는 부위에 마이크로필라멘트 네트워크를 적용시키기 전, 그와 공동으로, 또는 그 이후에 치료 약물을 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

본 개시내용에서, 및 특히, 청구범위 및/또는 단락에서, 예컨대, "포함한다(comprises)," "포함된(comprised)," "포함하는(comprising)" 등과 같은 용어는 미국 특허법상 그에 기여하는 의미를 가질 수 있고; 예컨대, 상기 용어는 "포함한다(includes)," "포함된(included)," "포함하는(including)" 등을 의미할 수 있고; 예컨대, "본질적으로 ~으로 이루어진," "본질적으로 ~으로 이루어진다"와 같은 용어는 미국 특허법상 그에 원인이 되는 의미를 가지며, 예컨대, 상기 용어를 통해 요소가 명확하게 언급되지 않을 수 있지만, 선행 기술에서 발견되거나, 또는 본 발명의 기초 또는 신규한 특징에 영향을 주는 요소는 배제시킨다는 것에 주의한다. 본 실시양태 및 다른 실시양태는 하기 상세한 설명으로부터 및 그에 의해 개시되거나, 자명하다.

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도 1a-f는 마트리겔 매트릭스 상에서 세포괴를 형성하는 인간 유방 상피 세포 (HMEC)의 이미지를 보여주는 것이다. 도 1a는 개별 인간 유방 상피 세포 (HMEC)가 2D 환경에서 불규칙한 형상 모양 (좌측)으로 나타나며, 일관되게, 3D (3차원) 마트리겔 배양물 중에서 구형 형태를 보인다는 것 (우측)을 도시한 것이다. HMEC를 낮은 세포 밀도로 (6-웰-플레이트 중 1×10³개의 세포/웰) 두꺼운 마트리겔 매트릭스 (깊이 20~30 ㎛) 상에 이식하였다. 세포 이식 후 5시간 (h) 경과시에 도립 위상차 이미지를 촬영하였다. 도 1b는 최소 표면적으로 마트리겔 매트릭스 (MM)에 노출된 구형 HMEC의 횡단면을 보여주는 대표 톨루이딘 블루 이미지이다. 도 1c는 2개의 구형 적층된 HMEC (흰색 별표 표시)가 마트리겔 매트릭스 (MM)와 표면 접촉하고 있지 않음을 보여주는 세포군의 횡단면의 대표 톨루이딘 블루 이미지이다. 도 1d는 다중 적층된 HMEC (흰색 별표 표시)가 마트리겔 매트릭스 (MM)와 접촉하고 있지 않음을 보여주는 마운드된 세포괴의 횡단면의 대표 톨루이딘 블루 이미지이다. 도 1e는 HMEC가 세포 이동, 응집, 증식 및 적층 이후에 다수의 세포괴를 형성한다는 것을 보여주는 대표 도립 위상차 이미지이다. 도 1f는 세포괴가 세포괴 외부에, 세포괴 주변에 및 웰 (6-웰-플레이트) 또는 10 cm 디쉬에서 전체 마트리겔 표면을 커버하는 초대형 메쉬 (적색 화살표 표시)를 생성한다는 것을 보여주는 대표 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색 이미지이다. 초대형 메쉬 중에 다수의 크고 (직경 > 40 ㎛), 둥근 홀 (청색 화살표 표시)이 존재한다. 홀의 연부 (녹색 화살표 표시)가 제시되어 있다. 스케일 막대 = 10 ㎛.
도 2a-b는 인간 세포괴가 초대형 및 연속 세포외 마이크로필라멘트 네트워크를 생성한다는 것에 관한 형광 이미지를 보여주는 것이다. 도 2a는 세포외 마이크로필라멘트 네트워크의 조성 및 구조에 관한 형광 현미경 검사를 보여주는 것이다. 증강된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 태그부착된-원형질막 Ca² ⁺-ATPase2 (EGFP-PMCA2)를 코딩하는 플라스미드를 일시적으로 1차 정상 인간 유방 상피 세포 (HMEC) 내로 형질감염시켰다. EGFP-PMCA2를 과다발현하는 HMEC를 마트리겔 매트릭스 표면 상에 이식하고, 64시간 (h) 동안 배양하였다. HMEC는 이동하고, 응집하고, 증식하고, 마트리겔 층에 세포괴 (CM)를 형성하였다. 좌측 패널: DAPI (4',6-디아미디노-2-페닐인돌) 염색 이미지는 세포괴 사이 및 그 주변에 세포 핵 물질이 있다는 것을 보여준다. 가운데 패널: 세포괴가 세포괴 외부에 대량의 막으로 둘러싸인, 긴, 분지형의 세포외 마이크로파이버 (ECMF, 흰색 화살표 표시)를 생성한다. 내포된 마이크로파이버는 세포괴 주변의 큰 네트워크를 형성한다. 긴 세포외 마이크로파이버 (흰색의 굵은 화살표 표시)는 2개의 세포괴 (CM1 및 CM2)를 연결한다. 우측 패널: 병합 이미지는 내포된 세포외 마이크로파이버 네트워크가 그를 생성하는 세포괴 외부에 위치한다는 것을 보여준다. 도 2b는 액틴으로 구성된 마이크로필라멘트의 형광 이미지를 보여주는 것이다. EGFP-PMCA2 및 mCherry 태그부착된-β-액틴 (mCherry-β-액틴)을 코딩하는 플라스미드를 일시적으로 HMEC 내로 공동 형질감염시켰다. 세포괴 (CM) 생산 마이크로파이버는 액틴 기반이고, 막으로 둘러싸인 세포외 마이크로필라멘트 (ECMF, 흰색 화살표 표시)이다. 세포외 마이크로필라멘트는 네트워크 및 번들 (황색 화살표 표시)을 형성한다. 세포외 마이크로필라멘트 연결 노드 (EMCN, 보라색 화살표 표시), 세포외 마이크로필라멘트 어셈블리된 네트워크 공간 (EMNS, 흰색 별표 표시), 및 마이크로필라멘트 접착 물질 (AM)이 제시되어 있다. 스케일 막대 = 20 ㎛.
도 3은 세포외 마이크로필라멘트의 길이 분포를 보여주는 것이다. 무작위로 선택된 총 385개의 HMEC 세포외 마이크로필라멘트의 길이 분포: 대략 51%는 1~5 ㎛ 범위이고, 22.6%는 5~10 ㎛ 범위이고, 8.9%는 10~20 ㎛ 범위이고, 5.2%는 20~40 ㎛ 범위이고, 2%는 40~100 ㎛ 범위이고, 1%는 100~300 ㎛ 범위이고, 2%는 최대 1000 ㎛에까지 이른다.
도 4a-e는 세포외 마이크로필라멘트 네트워크의 발생에 관한 형광 이미지 및 막대 그래프를 보여주는 것이다. 시간 경과에 따른 HMEC 세포외 마이크로필라멘트 네트워크 발생에 관한 대표 형광 이미지. EGFP-PMCA2를 과다발현하는 HMEC를 마트리겔 매트릭스 표면 상에 이식하고, 일정 기간 동안 배양하였다. 도 4a-d는 세포외 마이크로필라멘트 및 마이크로필라멘트 연결 노드의 개수가 빠르게 증가하여, 다층 3D 세포외 마이크로필라멘트 네트워크를 신속하게 형성한다는 것을 보여주는 이미지이다. 스케일 막대 = 20 ㎛. 도 4e는 발생 동안의 세포외 마이크로필라멘트의 증가에 관한 정량적 분석을 보여주는 것이다 (평균 ± s.d., 각 시점에 n = 5개의 부위, 각 부위는 2개의 HMEC 세포괴 사이에 일직선으로 위치한다).
도 5a-c는 세포외 마이크로필라멘트 네트워크의 아키텍처 구조의 이미지를 보여주는 것이다. 도 5a는 세포외 마이크로필라멘트 (ECMF, 적색 화살표 표시)가 세포외 마이크로필라멘트 연결 노드 (EMCN, 보라색 화살표 표시)를 통해 규칙적 및 불규칙적인 형상의 공간 (별표 표시)과 연결되어 있음을 나타낸 병합 형광 이미지를 보여주는 것이다. 세포외 마이크로필라멘트 네트워크 중 삼각형 (흰색 별표 표시), 사각형 (보라색 별표 표시) 및 오각형 (황색 별표 표시) 공간이 제시되어 있다. 큰 번들 (청록색 화살표 표시)은 수개의 길고, 평행이며, 트위스트된 세포외 마이크로필라멘트에 의해 형성된다. 흰색 점선으로 프레임 표시된 영역은 도 (b)에 확대 제시되어 있다. 도 5b는 2개의 세포외 마이크로필라멘트가 트위스트되고, 2개의 고리가 있는 트위스트된 번들 (청록색 화살표 표시)을 형성한다는 것을 보여주는 것이다. 도 5c는 (b)의 고리가 있는 트위스트된 번들을 보여주는 카툰이다. 스케일 막대 = 10 ㎛.
도 6a-b는 초대형, 다공성, 다층 및 조밀한 네트워크를 형성하는 세포외 마이크로필라멘트의 형광 이미지를 보여주는 것이다. 도 6a는 10 cm 디쉬에서 다중 네트워크로 구성된 초대형, 연속, 세포외 마이크로필라멘트 네트워크의 일부에 관한 형광 이미지를 보여주는 것이다. EGFP - PMCA2를 과다발현하는 HMEC를 마트리겔 매트릭스 표면 상에 이식하고, 80h 동안 배양하였다. 2개의 세포괴, 및 그 주변의 세포외 마이크로필라멘트 네트워크가 제시되어 있다. 핵 물질 (흰색 화살표 표시)이 없는, 비공지의, 막으로 둘러싸여 있는 둥근 물체가 수개 초대형 네트워크 중에 산재되어 있다. 병합 이미지에서 흰색으로 프레임 표시된 영역은 도 (b)에 제시되어 있다. 도 6b는 (도 6a)에서 흰색으로 프레임 표시된 영역의 확대 이미지를 보여주는 것이다. 두 세포괴의 세포외 마이크로필라멘트 네트워크는 광범위하게 연결되어, 중단없이 연속 초대형 네트워크 복합체를 형성한다. 동일 초대형 네트워크 중의 집속 상부 층 및 비집속 하부 층이 제시되어 있다. 다층 세포외 마이크로필라멘트 네트워크 전역에 걸쳐 작은 공극 (흰색 별표 표시, 공극 크기 범위: 0.1~5 ㎛)이 다량 존재한다. 스케일 막대 = 20 ㎛.
도 7은 초대형 세포외 마이크로필라멘트 메쉬의 표면 상에서 이동하는 세포의 이미지를 보여주는 것이다. HMEC를 마트리겔 매트릭스 표면 상에 이식하고, 110h 동안 배양하였다. H&E 이미지는 수개의 HMEC 세포괴가 디셈블리되어 있음을 보여준다 (청색 화살표 표시; DCM, 디셈블리된 세포괴). 탈착되고, 이동하고, 세포괴 부위에 남은 개별 세포 (적색 화살표 표시로 제시)는 (마트리겔 표면이 노출된 큰 홀에서가 아닌) 초대형 세포외 마이크로필라멘트 네트워크의 표면 상에서 이동한다. 이들 이동성 세포의 형태는 가변적이지만, 구형 형태는 가지지 않는다. 흰색 화살표 표시: 디셈블리된 세포괴. 스케일 막대 = 10 ㎛.
도 8a-c는 500 ㎠, 초대형 규모 및 무세포 세포외 마이크로필라멘트 어셈블리된 네트워크 복합체의 생성에 관한 개략적 다이어그램 및 이미지를 보여주는 것이다. 도 8a는 인공, 500 ㎠ 초대형 및 HMEC 세포괴 생성된 마이크로필라멘트 네트워크 복합체의 생성에 관한 개략적 다이어그램을 보여주는 것이다. HMEC를 세포 배양 배지 중에서 마트리겔 매트릭스 층 상에 이식한다. HMEC는 이동하고, 응집하고, 증식하고, 세포괴를 형성한다. 이어서, 세포괴는 길고, 분지형이고, 막으로 둘러싸인 세포외 마이크로필라멘트를 생성한다. 내포된 세포외 마이크로필라멘트는 세포괴 외부에 및 그 주변에 네트워크를 형성한다. 세포외 마이크로필라멘트 네트워크는 연결되어, 전체 마트리겔 표면을 커버하는 500 ㎠의 연속, 초대형 격자를 형성한다. 인공 탈세포화 후, 500 ㎠ 초대형 규모의, 무세포, 세포외 마이크로필라멘트 네트워크 (EMN, 적색 화살표 표시)가 생산된다. 도 8b는 500 ㎠ 플레이트의 마트리겔 매트릭스 표면 상의 세포괴 (CM, 청색 화살표 표시)와 함께, 초대형 연속 HMEC 세포외 마이크로필라멘트 네트워크 (EMN, 적색 화살표 표시)의 일부의 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색 이미지를 보여주는 것이다. 본 단계에는 세포외 마이크로필라멘트 네트워크의 어셈블리에 의해 유발된 큰 (직경 ≥ 20 ㎛) 둥근 홀은 없다. 스케일 막대 = 10 ㎛. 도 8c는 인공 탈세포화 이후의 무세포, 500 ㎠ 초대형 규모의 세포외 마이크로필라멘트 EMN (적색 화살표 표시)의 일부를 나타낸 H&E 염색 이미지를 보여주는 것이다. 스케일 막대 = 10 ㎛.
도 9a-c는 무세포 초대형 마이크로필라멘트 격자 (AUML)가 심재성 2도 열 화상 상처의 재상피화 및 치유, 및 재상피화된 표피에서 각질형성세포 터널 및 EMN의 생성을 촉진시킨다는 것을 보여주는 것이다. (도 9a)는 화상 후 14일째(14 day post-burn: dpb) AUML이 심재성 2도 열 화상 상처 치유에 미치는 효과에 관한 통계학적 분석을 보여주는 것이다. 스튜던트 t-검정; 양측; 각 군당 n = 5마리의 마우스. (도 9b)는 재상피화된 표피 (RE-ED)에서 큰 터널을 형성하는 각질형성세포를 보여주는 것이다. 대표 면역형광 이미지는 AUML로 처리된 상처에서는 RE-ED 중에 다중 각질형성세포 터널 (KT)이 존재한다는 것을 보여준다. 큰 KT1 루멘은 상이한 유형의 세포를 다수 함유한다. KT2 루멘은 각질형성세포 EMN을 보유한다. 프레임 표시된 KT1 및 KT2 영역은 각각 도 11b-c에 확대되어 있다. 진피 (DM) 및 모낭 (HF)이 제시되어 있다. 스케일 막대 = 10 ㎛. (도 9c)는 5개의 상처에서 절개된 표본에서의 각질형성세포 터널의 총 발생빈도의 산점도이다 (각 표본은 마우스의 상처 표본으로부터 무작위로 선택된 것이다, n = 각 군당 5마리의 마우스, 본페로니 교정 후 윌콕슨 순위 합 검정, P < 10^- ¹⁵). 각각의 검은색 점은 각질형성세포 터널을 나타낸다. (도 9d) 도 14b 영역의 확대도. 대표 면역형광 이미지는 큰 각질형성세포 터널 (KT, 보라색 점선으로 표지) 루멘이 큰 각질형성세포 EMN (KEMN)을 함유하며, 이는 세포 이동 및 거동을 위한 스캐폴드 및 환경 (흰색 화살표 표시)을 공급한다는 것을 보여준다. 각질형성세포 EMN (주황색 화살표 표시) 및 각질형성세포 EMN 분해에 의해 유발된 불규칙한 홀 (보라색 별표 표시)이 제시되어 있다.
도 10a-b는 AUML이 2도 열 화상 상처의 재상피화 및 치유를 촉진시키고, 각질형성세포 터널의 생성을 허용한다는 것을 보여주는 것이다. (도 10a)는 화상 후 다른 경과일 (dpb)에서의 마우스에서 메피폼(Mepiform) 또는 AUML로 처리/처리되지 않은 2도 열 피부 화상 상처의 대표 이미지를 보여주는 것이다. (도 10b)는 14 dpb에서의 각 마우스 군으로부터의 화상 상처의 절개된 표본의 대표 H&E 이미지를 보여주는 것이다. AUML 처리된 상처 중 재상피화된 표피 (RE-ED)에는 다중 세포를 포함하는 2개의 큰 각질형성세포 터널 (KT)이 존재하지만, 처리되지 않았거나, 또는 메피폼으로 처리된 군으로부터의 상처에는 존재하지 않는다. 청색 프레임으로 표시된 영역은 도 11a에 제시되어 있다. 재상피화된 표피 (RE-ED) 및 진피 (DE)가 제시되어 있다.
도 11a-c는 각질형성세포 터널 및 EMN이 AUML 처리된 상처 중 재상피화된 표피에서 세포 수송을 위한 길을 제공한다는 것을 보여주는 것이다. (도 11a)는 도 10b의 프레임으로 표시된 영역의 확대된 영역을 보여주는 것이다. AUML 처리된 상처의 재상피화된 표피에 2개의 큰 각질형성세포 터널이 존재한다. 각질형성세포 터널-1 (KT1) 루멘에는, 다중 적혈구 (RBC, 검은색 화살표 표시) 및 각질형성세포 EMN (KEMN) 단편 (청색 화살표 표시)이 존재한다. KT2 루멘에는, 적혈구 및 유핵 세포 (청록색 화살표 표시)를 비롯한, 그 안/그 위에서 이동하는 다양한 유형의 세포를 포함하는 각질형성세포 EMN (KEMN, 청색 화살표 표시)이 존재한다. (도 11b)는 도 9b의 프레임으로 표시된 영역 (흰색 표시)의 확대된 영역을 보여주는 것이다. 각질형성세포 터널-1 (KT1)의 루멘에는, 적혈구 (보라색 화살표 표시), 및 완전히 성숙화된 세포질 및 작고, 조밀한 농축핵을 갖는 정염 적혈모구 (ON) (흰색 화살표 표시)를 비롯한, 그 안에서 이동하는 다중의 상이한 유형의 세포가 존재한다. (도 11c)는 도 9b의 프레임으로 표시된 영역 (주황색 표시)의 확대된 영역을 보여주는 것이다. 각질형성세포 터널-2 (KT2)의 루멘에 각질형성세포 EMN (KEMN)이 존재한다. 각질형성세포 EMN (KEMN, 주황색 화살표 표시)으로 구성된 막으로 둘러싸인 및 세포외 마이크로필라멘트가 제시되어 있다. 유핵 세포 (흰색 화살표 표시)는 각질형성세포 EMN에서 이동한다. (a)에서 스케일 막대는 20 ㎛이고, (b-c)에서는 10 ㎛이다.
도 12a-c는 각질형성세포 터널 및 EMN이 AUML 처리된 상처 중 재상피화된 표피에서 세포 수송 및 이동을 위한 길을 제공한다는 것을 보여주는 것이다. (도 12a)는 AUML 처리된 상처 중 재상피화된 표피에 2개의 각질형성세포 터널 (KT1 및 KT2)이 존재한다는 것을 보여주는 대표 H&E 염색 이미지이다. 프레임으로 표시된 영역 (KT1 및 KT2)은 확대되고, 각각 (b) 및 (c)에 제시된다. 재상피화된 표피 (RE-ED) 및 진피 (DE)가 제시되어 있다. (도 12b)는 다수의 성숙한 제핵 적혈구 (RBC, 검은색 화살표 표시)가 KT1 루멘 중 큰 각질형성세포 EMN (KEMN)에서 이동한다는 것을 보여주는 것이다. (도 12c)는 2개의 유핵 세포가 큰 각질형성세포 터널-2 (KT2)에서 이동한다는 것을 여주는 것이다.
도 13a-c는 각질형성세포 EMN은 각질형성세포 터널 루멘에서의 세포 이동 및 거동을 위한 스캐폴드를 공급하고, 각질형성세포 EMN이 디셈블리한다는 것을 보여주는 것이다. (도 13a)는 각질형성세포 EMN 복합체가 AUML 처리된 상처의 재상피화된 표피 중 큰 각질형성세포 터널 루멘에서 형성된다는 것을 보여주는 대표 H&E 염색 이미지이다. 재상피화된 표피 (RE-ED) 및 진피 (DE)가 제시되어 있다. 프레임으로 표시된 영역은 확대되고, (b)에 제시되어 있다. (도 13b)는 (a)의 확대된 영역을 보여주는 것이다. 큰 각질형성세포 터널 (KT)의 루멘에서 디셈블리할 때, 다수의 세포 (청색 화살표 표시)가 각질형성세포 EMN (KEMN) 복합체 중에 위치한다. 검은색 화살표 표시는 각질형성세포 EMN 단편을 보여주는 것이고, 검은색 별표 표시는 각질형성세포 EMN 복합체의 디셈블리에 의해 유발된 큰 홀 (또는 큰 채널의 횡단면)을 보여주는 것이다. 프레임으로 표시된 영역은 확대되고, (c)에 제시되어 있다. (도 13c)는 각질형성세포 EMN의 아키올로지를 보여주는 것이다. EMN으로 구성된 각질형성세포 세포외 마이크로필라멘트 (KEMN, 검은색 화살표 표시)는 다양한 크기의 불규칙한 형상을 갖는 공극 (녹색 화살표 표시)을 함유한다. 각질형성세포 EMN의 디셈블리에 의해 각질형성세포 EMN 중에 다수의 채널 (검슨색 별표 표시)이 생성된다. 각질형성세포 EMN에서 채널의 연부 (청색 화살표 표시)가 제시되어 있다.
도 14a-c는 각질형성세포 EMN 복합체가 세포를 위한 환경을 부축하고, 각질형성세포 ECMF 디셈블리가 각질형성세포 EMN 분해를 유도한다는 것을 보여주는 것이다. (도 14a)는 AUML을 통해 재상피화된 표피는 상이한 단계에서 각질형성세포 EMN을 보유하는 각질형성세포 터널 복합체를 형성할 수 있게 된다는 것을 보여주는 대표 면역형광 이미지이다. 재상피화된 표피 (RE-ED), 진피 (DE) 및 모낭 (HF)이 제시되어 있다. 프레임으로 표시된 영역은 (b)에 제시되어 있다. (도 14b)는 이웃하는 3개의 각질형성세포 터널 (KT1, KT2 및 KT3)을 함유하는 각질형성세포 터널 복합체가 존재한다는 것을 보여주는 것이다. KT1 루멘 중의 각질형성세포 EMN (KEMN)은 대개 분해되고, 작은 채널 (흰색 별표 표시)이 남은 각질형성세포 EMN에 존재한다. KT2 루멘 중의 각질형성세포 EMN 대부분은 온전한 상태이고, 두 채널(청록색 별표 표시)이 상기 EMN 중에 존재한다. KT3 루멘 중의 큰 각질형성세포 EMN은 분해되고, 수개의 큰 또는 작은 EMN 단편으로 나누어진다. 다중 세포 (흰색 화살표 표시)가 KT3 루멘 중의 각질형성세포 EMN에 위치한다. 흰색 및 주황색의 프레임으로 표시된 영역은 각각 보충 자료 도 12c 및 도 3에 제시되어 있다. (도 14c)는 각질형성세포 막으로 둘러싸인 마이크로필라멘트의 디셈블리가 각질형성세포 EMN (KEMN, 주황색 화살표 표시)의 분해를 유도하여 EMN에서 채널 (청록색 화살표 표시)을 형성한다는 것을 보여주는 대표 형광 이미지이다.
도 15a-b는 넓은 면적의 1차 정상 인간 세포막의 생성을 보여주는 것이다. 도 14a는 넓은 면적의 1차 정상 인간 세포막 생성에 관한 개략적 다이어그램이다. 세포막 층의 깊이는 약 40 nm이다. 도 14b는 10 cm (직경) 디쉬 중 마트리겔 매트릭스 상의 (에오신 염색된) 천연 1차 정상 인간 세포막의 일부의 대표 이미지이다. 스케일 막대 = 100 ㎛

본 개시내용의 측면은 매트릭스 지지체에서 성장된 천연 1차 인간 상피 세포가 넓은 면적의 마이크로필라멘트 네트워크를 생산한다는, 지금까지 발견되지 않았던 관찰 결과에 기초한다. 한 측면에 따라, 마이크로필라멘트 네트워크는 상처 감염의 예방 및 관리를 위한 물리적 장벽으로서 작용할 수 있다. 본 개시내용의 특정 실시양태는 연속 세포-유래 마이크로필라멘트 네트워크 뿐만 아니라, 넓은 면적의 마이크로필라멘트 네트워크를 생산하는 조직 조작 방법에 관한 것이다. 본원에 개시된 조건하에서 형성된 세포외 마이크로필라멘트는 다세포 유기체에는 존재하지 않는다. 상기 마이크로필라멘트 네트워크는 화상 치료, 급성 및 외과성 상처 치료를 비롯한, 예컨대, 상처 감염 예방을 포함하는 상처 치유에서 유용성을 갖는다. 특정 측면에 따라, 마이크로필라멘트 네트워크는 세포 이동을 촉진시키고, 조직 재생을 촉진시킨다. 한 측면에 따라, 세포 매트릭스 상에서 배양된 정상 1차 인간 상피 세포가 넓은 면적의 마이크로필라멘트 네트워크를 생성한다. 한 실시양태에서, 마이크로필라멘트 네트워크는 세포의 핵 또는 DNA 제거를 위해 프로세싱된다. 또 다른 실시양태에서, 마이크로필라멘트 네트워크는 세포 제거를 위해 물리적, 화학적 및/또는 기계적으로 프로세싱된다. 또 다른 측면에 따라, 마이크로필라멘트 네트워크는 예컨대, 물리적 장벽으로서 상처 치유에서 유용성을 가지며, 이는 미생물 유도 상처 감염 예방을 위해 상처에 적용된다. 특정 실시양태에서, 생물공학 방법이 넓은 면적의 (최대 500 ㎠) 마이크로필라멘트 네트워크를 생산한다. 상기 네트워크는 상처 감염 예방에 유용하다. 한 실시양태에서, 세포-유래 마이크로필라멘트 네트워크는 생분해성이고, 환자의 조직과 생물학적으로 적합성을 나타낸다. 또 다른 실시양태에서, 마이크로필라멘트 네트워크는 상처 부위로부터 미생물을 차단시킬 수 있다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 마이크로필라멘트 네트워크는 조직 회복 및/또는 조직 재생에 관여하는 이종 세포의 작용을 지지하는 미세환경을 구축하기 위해 반투과성을 나타낸다. 한 실시양태에서, 넓은 면적의 연속 세포-유래 마이크로필라멘트 네트워크를 통해 넓은 면적의 2도 (3도) 열 화상 상처가 있는 환자의 치료 및 치유에서 주된 장애물 중 하나를 극복할 수 있다.

한 측면에 따라, 본 발명자들은 상처 회복을 촉진시키기 위한, 초대형의, 다공성이고, 조밀하며, 다층이고, 3차원 (3D)인 세포외 마이크로필라멘트 메쉬를 생성하는 신뢰가능한 방법을 제공한다. 인간 상피 세포괴가 긴, 막으로 둘러싸인 세포외 마이크로필라멘트 (ECMF)를 생산하는 것으로 나타났다. 한 실시양태에서, 내포된 ECMF는 초대형 세포외 마이크로필라멘트 네트워크 (EMN)를 형성한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 EMN은 연결되어, 제곱 피트 (ft2) 규모의 초대형 마이크로필라멘트 격자 (UML)를 형성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 UML은 세포 이동을 위한 환경을 구축한다. 한 실시양태에서, 세포괴를 제거하여 상처 회복을 촉진시키는 데 사용될 수 있는 무세포 UML (AUML)을 생산한다. 예시적인 실시양태에서, 마우스의 2도 열 화상 상처에 적용되었을 때, AUML은 각질형성세포가 재상피화된 표피에서 큰 터널을 생성하여 상처 회복 부위에 세포 및 영양소를 위한 경로를 제공한다. 상기 큰 AUML의 특성으로는 생분해성, 생체적합성, 및 반투과성을 포함한다. 특정 실시양태에서, AUML은 상처 회복 및 조직 재생에서의 광범위한 사용에 적합한 천연, 생화학적, 생물리적, 및 생체역학적 성분을 함유한다.

진핵 세포에서 주요 세포골격 중합체인 마이크로필라멘트는 액틴 서브유니트 및 액틴-결합 단백질에 의해 중합된다. 마이크로필라멘트는 세포 분열 및 세포질 분열, 세포 형상 유지, 소포체 수송, 신호 전달, 감지, 및 세포 운동성에 필수적이다 (Gunning, P. W., Ghoshdastider, U., Whitaker, S., Popp, D. & Robinson, R. C. The evolution of compositionally and functionally distinct actin filaments. Journal of cell science 128, 2009-2019 (2015)). 세포골격 액틴 (β-액틴 및 γ-액틴 포함) 어셈블리 및 탈중합은 마이크로필라멘트 네트워크 리모델링을 유도한다 (Herman, I. M. Actin isoforms. Current opinion in cell biology 5, 48-55 (1993)). ㎛ 규모의 성체 동물 세포 크기가 단일 세포의 세포골격 마이크로필라멘트 네트워크의 잠재적 면적을 ㎛² 규모로 제한한다 ([Lloyd, A. C. The regulation of cell size. Cell 154, 1194-1205 (2013)], [Ginzberg, M. B., Kafri, R. & Kirschner, M. Cell biology. On being the right (cell) size. Science 348, 1245075 (2015)]). 한 측면에 따라, 인간 상피 세포괴는 세포 이동을 촉진시키는 초대형 세포외 마이크로필라멘트 네트워크를 생성한다. 또 다른 측면에 따라, 본 개시내용은 제곱 피트 (ft²) 수준의 인공 및 초대형 세포외 마이크로필라멘트 네트워크를 생성하는 일반 전략법을 제공한다. 한 측면에 따라, 인간 세포괴는 막으로 둘러싸인 세포외 마이크로필라멘트에 의해 어셈블리된 초대형 (ft²) 규모의 메쉬 구조물을 생성한다. 한 실시양태에서, 상기 메쉬 구조물은 세포 이동을 촉진시키는 기능성 ECM으로서 세포에 의해 사용된다. 또 다른 측면에 따라, 상기 천연 메쉬는 마우스에서 화상 상처 치유를 촉진시키는 데 효과적이다. 특정 실시양태에서, 상기 메쉬는 단순하고, 신뢰가능하며, 초대형이고, 3D인 세포외 마이크로필라멘트 메쉬 (ft² 이상)이다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 상기 메쉬는 다공성이거나, 천연이거나, 조밀하거나, 또는 무세포이다. 한 측면에 따라, 상기 메쉬는 상처 회복 및 조직 재생을 촉진시키는 데 사용될 수 있다. 특정 측면에 따라, 인간 상피 세포괴는 세포외에서 긴 (길이가 최대 1000 ㎛) 액틴 중합된 마이크로필라멘트를 생성한다. 한 측면에 따라, 마이크로필라멘트는 막으로 둘러싸여 있는 것이다. 한 실시양태에서, 세포 및 세포-유래 세포외 마이크로필라멘트는 초대형 연속 네트워크를 형성하고, 이는 세포 이동을 위한 길을 열어준다. 또 다른 실시양태에서, 탈세포화를 통해, 등가 크기의 단일 인간 상피 세포 중 세포골격 마이크로필라멘트 네트워크 면적과 비교하여 마이크로필라멘트 네트워크 면적이 최대 약 10억배 (1×10⁹배) 증가된, 인공, 무세포 및 초대형 (500 제곱 센티미터, ㎠) 격자가 생성된다. 특정 실시양태에서, 초대형 및 다공성 세포외 마이크로필라멘트 메쉬를 통해 마우스에서 2도 열 화상 상처의 재상피화 및 치유가 촉진된다. 특정 측면에 따라, 본 개시된 방법은 세포 이동을 촉진시키고, 조직 재생 및 상처 치유에 유용한 초대형 규모의 세포외 마이크로필라멘트 네트워크를 생산한다.

"대상체," "개체," 및 "환자"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 척추동물, 바람직하게, 포유동물, 더욱 바람직하게, 인간을 지칭한다. 포유동물은 뮤린, 유인원, 인간, 경작용 동물, 스포츠용 동물, 및 애완동물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 생체내에서 수득되거나, 또는 시험관내에서 배양된, 생물학적 엔티티의 조직, 세포 및 그의 자손 또한 포함된다.

"치료제," "치료가 가능한 작용제" 또는 "치료 작용제"라는 용어는 상호교환적으로 사용되고, 대상체에게 투여되었을 때, 얼마간의 유익한 효과를 부여하는 분자 또는 화합물을 지칭한다. 유익한 효과로는 진단 측정의 가능한 구현; 질환, 증상, 장애, 또는 병적 상태 호전; 질환, 증상, 장애, 또는 병태 발병의 감소 또는 예방; 및 일반적으로, 질환, 증상, 장애, 또는 병적 상태 방해를 포함한다.

본원에서 사용되는 "치료" 또는 "치료하는," 또는 "완화시키는" 또는 "호전시키는"이라는 것은 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 치료적 이익 및/또는 예방적 이익을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 유익한 또는 원하는 결과를 얻기 위한 접근법을 지칭한다. 치료적 이익이란, 치료시 하나 이상의 질환, 병태, 또는 증상에서의 임의의 치료적으로 관련된 개선 또는 그에 미치는 효과를 의미한다. 예방적 이익을 위해, 조성물은 특정 질환, 병태, 또는 증상이 발생될 위험이 있는 대상체에게, 또는 비록 질환, 병태, 또는 증상이 아직은 소견을 보이지 않았을 수도 있지만, 질환의 생리적 증상들 중 하나 이상의 것을 보고한 대상체에게 투여될 수 있다.

"유효량" 또는 "치료학상 유효량"이라는 용어는 유익한 또는 원하는 결과를 발휘하도록 하는 데 충분한 작용제의 양을 지칭한다. 치료학상 유효량은 치료되는 대상체 및 질환, 대상체의 체중 및 연령, 질환 상태의 중증도, 투여 방식 등 중 하나 이상의 것에 따라 달라질 수 있으며, 이는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 상기 용어는 또한 본원에 기술된 이미지화 방법들 중 어느 하나에 의한 검출 이미지를 제공하는 용량에도 적용된다. 구체적인 용량은 선택된 특정 작용제, 수행 기준이 되는 투약 요법, 다른 화합물과의 조합 투여 여부, 투여 시간, 이미지화되는 조직, 및 운반이 이루어지는 물리적 전달 시스템 중 하나 이상에 따라 달라질 수 있다.

한 측면에 따라, 마이크로필라멘트 네트워크를 생산하는 방법은 매트릭스 지지체 및 세포 배양 배지 중에서 세포를 배양함으로써 이루어진다. 한 실시양태에서, 세포괴는 매트릭스 지지체의 상부에 형성된다. 또 다른 실시양태에서, 매트릭스는 세포 배양 배지, 마트리겔이다.

한 실시양태에서, 네트워크의 마이크로필라멘트는 액틴, 예컨대, β-액틴, γ-액틴, 및 액틴-상호작용 단백질을 포함한다. 한 실시양태에서, 마이크로필라멘트 길이는 약 1-1000 ㎛, 10-900 ㎛, 20-800 ㎛, 30-700 ㎛, 40-600 ㎛, 50-500 ㎛, 60-400 ㎛, 70-300 ㎛, 80-200 ㎛, 및 90-100 ㎛이다. 또 다른 실시양태에서, 마이크로필라멘트는 분지형이다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 마이크로필라멘트는 약 2-10, 3-9, 4-8, 5-7개의 분지를 갖는다. 한 실시양태에서, 네트워크는 접착 물질을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 접착 물질은 마이크로필라멘트와 회합되어 있고, 마이크로필라멘트의 직경을 확장시킨다. 한 실시양태에서, 네트워크의 면적은 약 1 ㎛² 내지 약 500 ㎠ 범위이다. 또 다른 실시양태에서, 네트워크의 면적은 약 10 ㎛² 내지 약 400 ㎠, 약 100 ㎛² 내지 약 300 ㎠, 약 200 ㎛² 내지 약 200 ㎠, 약 1000 ㎛² 내지 약 100 ㎠ 및 약 1 ㎠ 내지 약 10 ㎠ 범위이다. 또 다른 실시양태에서, 네트워크의 두께는 약 1 nm 내지 약 1 cm, 약 10 nm 내지 약 0.1 cm, 약 100 nm 내지 약 0.01 cm 내지 약 1000 nm 내지 약 0.001 cm 범위이다. 한 실시양태에서, 네트워크는 치료를 필요로 하는 부위에 단일층으로서 적용된다. 또 다른 실시양태에서, 네트워크의 다층이 치료를 필요로 하는 부위에 적용될 수 있다.

특정 실시양태에서, 네트워크의 공극 크기는 직경이 약 0.1 - 5 ㎛, 약 0.2 - 4 ㎛, 약 0.3 - 3 ㎛, 약 0.4 - 2 ㎛ 및 약 0.1 - 1 ㎛ 범위이다. 한 실시양태에서, 네트워크는 생물활성제 및/또는 생물불활성제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물활성제 및/또는 생물불활성제는 인테그린, 유착 수용체, 및 막 단백질을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 생물활성제는 항체 및 미생물 억제제를 비롯한 치료 약물이다. 한 실시양태에서, 네트워크는 매트릭스 지지체 상에 존재한다. 특정 실시양태에서, 매트릭스 지지체는 생분해성이다. 예시적인 실시양태에서, 네트워크는 마트리겔 매트릭스 지지체 상에 존재한다. 한 실시양태에서, 마이크로필라멘트 발원 영역은 유전자가 변형된 또는 변형되지 않은 진핵 세포를 포함한다.

또 다른 측면에 따라, 본 발명은 치료를 필요로 하는 부위에 마이크로필라멘트 네트워크를 적용시킴으로써 의학적 병태를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 의학적 병태는 상처, 급성 상처 및 만성 상처, 화상 상처, 열 화상 상처, 화학 화상 상처, 및 전기 화상 상처를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 통상의 기술자에게 공지된 다수의 상처 유형에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 마이크로필라멘트 네트워크는 매트릭스와 함께 적용된다. 또 다른 실시양태에서, 본 방법은 매트릭스 기재를 연속 세포외 마이크로필라멘트 네트워크로부터 분리시키는 단계를 추가로 포함하고, 마이크로필라멘트 네트워크는 매트릭스 부재하에 적용된다.

본 발명의 다양한 방법에 따른 본원에 기술된 작용제 및 조성물의 투여는 다양한 방법에 따라 달성될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 작용제 및 조성물은 임의의 적합한 수단에 의해, 예컨대, 비경구적, 정맥내, 피하, 근육내, 안와내, 안과적, 뇌실내, 두개내, 관절낭내, 척수내, 수조내, 복강내, 협측, 직장, 질, 비내, 또는 에어로졸 투여에 의해 투여될 수 있다. 투여는 국부 투여, 즉, 특정 부위로 지정될 수 있거나, 또는 전신 투여일 수 있다. 투여는 또한 직접적인 외과적 이식, 내시경술, 카테터 삽입, 또는 세척에 의해 영향을 받을 수 있다. 외과적 수술 동안 적용되는 경우, 본 발명의 조성물은 조직 위로 유동되거나, 조직 상에 분무될 수 있거나, 조직 상에 페인팅될 수 있거나, 또는 관련 기술분야 내에 포함된 임의의 다른 수단에 의해 이루어질 수 있다. 대안적으로, 외과적 수술 동안 적용되는 본 발명의 조성물은 적합한 매트릭스 내로 도입될 수 있다. 추가로, 외과적 수술 동안 적용되는 본 발명의 조성물은 환자에서 재상피화가 요구되는 상처 부위에 이식될 수 있다.

본 발명의 조성물은 생체적합성 오일, 예컨대, 참깨유, 히알루론산, 시클로덱스트린, 락토스, 라피노스, 만닛톨, 카르복시 메틸 셀룰로스, 열 또는 화학 반응성 겔, 수크로스 아세테이트 이소부티레이트를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 적절한 담체 또는 벌크화제 중에서, 또는 그와 함께 투여될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 본 발명의 조성물 중의, 기술된 약물/화합물의 농도는 제한 없이, 투여하고자 하는 약물의 투여량, 사용되는 화합물의 화학적 특징 (예컨대, 소수성), 및 투여 경로를 비롯한, 다수의 인자에 따라 달라지게 될 것이다. 투여하고자 하는 약물의 바람직한 투여량은 가능하게는 질환 유형 및 정도, 조직 손실 또는 결함, 특정 환자의 전반적인 건강 상태, 선택된 화합물의 상대적인 생물학적 효능, 화합물의 제제, 제제 중 부형제의 존재 및 유형, 및 투여 경로를 포함하나, 이에 제한되지 않는 변수에 의존할 수 있다. 본 발명의 치료 분자는 개체에게 제공될 수 있으며, 여기서 전형적인 용량은 1일당 약 10 ng/kg (체중) 내지 약 1 g/kg (체중) 범위이고; 바람직한 용량은 약 0.1 mg/kg (체중) 내지 100 mg/kg (체중) 범위이고, 더욱 특히 바람직한 투여량은 10-1000 ㎍/용량 범위이다. 숙련된 임상의는 본 발명의 유효 용량은 적응증, 질환/상처의 병리, 및 개체의 신체상의 특징을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 다수의 인자를 고려하여 변형될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 상기 언급된 인자들 중 임의의 것 또는 그들 모두를 고려하여 용량을 변경, 변형, 또는 최적화시킬 수 있다는 것 또한 관련 기술분야의 범위 내에 명백하게 포함된다.

실시예

하기 실시예는 본 발명의 다양한 실시양태를 제시하기 위한 목적으로 제공된 것이며, 어느 방식으로든 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본원에 기술된 방법과 함께 본 실시예는 이제 바람직한 실시양태를 나타내고, 예시적인 것이며, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 청구범위의 범주에 의해 정의되는 바와 같은 본 발명의 정신 내에 포함되는 그 안에서의 변경 및 다른 용도를 관련 기술분야의 통상의 기술자는 만들어 낼 수 있을 것이다.

실시예 I

실험 절차

세포, 배양 배지, 플라스미드, 시약, 및 마우스. 정상 1차 인간 유방 상피 세포 (HMEC, ATCC®PCS-600-010™)를 ATCC로부터 주문하였다. 본 연구에서 사용되는 모든 세포를 검사하였고, 마이코플라스마 오염은 없는 것으로 확인되었다. MEGM™ 유방 상피 세포 성장 배지 불렛키트™(MEGM™ Mammary Epithelial Cell Growth Medium BulletKit™) (클로네틱스™ MEGM™ 유방 상피 세포 성장 배지 + 싱글쿼츠™ 키트 패키지(Clonetics™ MEGM™ Mammary Epithelial Cell Growth Medium plus SingleQuots™ Kit package))를 론자(Lonza) (CC-3150)로부터 주문하였다. HMEC를 습윤화된 5% CO₂ 대기 중 37℃에서 마트리겔 매트릭스 층 존재하/부재하에 MEGM 불렛키트™ 중에서 배양하였다. EGFP-hPMCA2z/b (^#47584) 및 mCherry-β-액틴 (^#54967) 플라스미드를 애드진(Addgene)으로부터 주문하였다. 항-γ-액틴 (감마 액틴, 모노클로날, ab123034) 및 항-범-카드헤린 (폴리클로날, ab140338) 항체는 압캠(Abcam)으로부터 주문하였다. 마트리겔™ 막 매트릭스 (CB-40234) 및 코닝(Corning)® 마트리겔® 기저 막 매트릭스, 페놀 레드 무함유, *LDEV 무함유 (제품 #356237)는 코닝으로부터 구입하였다. 코닝® 500 ㎠의 사각형 TC 처리된 배양용 디쉬 (제품 #431110)는 코닝으로부터 구입하였다. 메피폼® (상처 치료용 실리콘 막, 문헌 [Warner, P. M., Coffee, T. L. & Yowler, C. J. Outpatient burn management. The Surgical clinics of North America 94, 879-892 (2014)])은 멘린케 헬스케어(MOelnlycke Healthcare)로부터 주문하였다. 6주령된 암컷 마우스 (계통 명칭: BALB /cJ)를 잭슨 라보라토리(Jackson Laboratory)로부터 주분하였다. 동물 실험은 하버드 의과 대학의 동물 실험 윤리 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee of Harvard Medical School)의 승인하에 수행되었다.

세포외 마이크로필라멘트 발생 및 일시적 형질감염. 마트리겔™ 막 매트릭스를 4℃에서 밤새도록 해동시켰다. 마트리겔 층 (깊이 20~30 ㎛)을 미리 냉각시킨 6-웰-플레이트, 10 cm 디쉬 또는 500 ㎠의 사각형 중에서, 이어서, 습윤화된 5% CO₂ 대기 중 25℃에서 20분 동안 겔에 의해 제조하였다. 형광 이미지화를 위해, 마트리겔 층을 6-웰-플레이트 중 VWR-마이크로(VWR-Micro) 커버 상에서 페놀 레드 무함유 마트리겔을 이용하여 제조하였다. HMEC를 마트리겔 층 상에 플레이팅하고, 습윤화된 5% CO₂ 대기 중 37℃에서 MEGM 불렛키트™ 중에서 배양하였다. 세포 배양 후 48-110h 동안 세포외 마이크로필라멘트를 발생시켰다. EGFP-hPMCA2z/b (애드진, #47584) 및 mCherry-β-액틴 (#54967)의 플라스미드를 매뉴얼에 따라 리포펙타민® 2000 (라이프 테크놀러지즈(Life Technologies), #11668027)을 사용하여 HMEC 내로 형질감염시켰다. 항-γ-액틴 (감마 액틴, 모노클로날, ab123034) 및 항-범-카드헤린 (폴리클로날, ab140338) 항체를 압캠으로부터 주문하였다. 형질감염 후 2일째, 형질감염된 세포를 명시된 배지 중 마트리겔 매트릭스 층 상에 플레이팅하였다 (6-웰-플레이트의 웰당 1 × 10³ 세포개의 세포). 명시된 시간 동안의 배양 기간이 경과한 후, 세포 및 마트리겔을 4% 파라포름알데히드 (PFA)로 고정시켰다. 세포 고정 후, 세포의 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색을 수행하였다. VWR-마이크로 커버와 함께 샘플을 유리 슬라이드 상으로 옮겨 놓고, 이어서, 이미지를 획득하였다.

이미지 획득. 니콘(Nikon) TMS 도립 위상차 현미경 및 니콘 쿨픽스(Nikon Coolpix) 자동 4300 디지털 카메라를 이용하여 위상차 이미지를 촬영하였다. 80i 정립 현미경 및 20× 또는 40× 렌즈가 장착된 디지털 하마마츠(Hamamatsu) ORCA-ER 냉각형 CCD 카메라 및 메타모르프(MetaMorph) 이미지 획득 소프트웨어를 이용하여 고정된 세포의 형광 이미지를 촬영하였다. 80i 정립 현미경 및 20× 또는 40× 렌즈가 장착된 디지털 하마마츠 ORCA-ER 냉각형 CCD 카메라 및 NIS-엘레먼츠(NIS-Elements) 획득 소프트웨어를 이용하여 고정된 세포 또는 조직 절편의 헤마톡실린 및 에오신 염색 이미지를 촬영하였다.

톨루이딘 블루 염색. HMEC를 6-웰 플레이트 중 플라스틱 디스크 상의 마트리겔 매트릭스 층 (깊이 약 60 ㎛) 상에 플레이팅하였다. 포름알데히드-글루타르알데히드-피크르산 고정제 (0.2 M 코카딜레이트 완충제 중 2.5% 파라포름알데히드, 5.0% 글루타르알데히드, 및 0.06% 피크르산): 세포 배양 배지 = 1:1로 구성된 고정제 혼합물을 HMEC를 사용하여 고정시켰다. 이어서, 고정된 HMEC를 1% 사산화오스뮴 (OsO4)/1.5% 포타슘페로시아니드 (KFeCN₆) 중에서 30 min 동안 사후 고정시키고, 물 중에서 3회에 걸쳐 세척하고, 30 min 동안 1% 수성 우라닐 아세테이트 중에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 물 중에서 2회 세척하고, 알콜 구배로 탈수시켰다 (각 5 min씩; 50%, 70%, 95%, 2 × 100%) (Basler, M., Pilhofer, M., Henderson, G. P., Jensen, G. J. & Mekalanos, J. J. Type VI secretion requires a dynamic contractile phage tail-like structure. Nature 483, 182-186 (2012)). 세포를 프로필렌옥시드 및 TAAB 에폰(TAAB Epon) (마리백 캐나다 인크.(Marivac Canada Inc.: 캐나다 셍로헝))의 1:1 혼합물 중에 2 h 내지 밤새도록 침지시켰다. 이어서, 샘플을 TAAB 에폰 중에 포매시키고, 60℃에서 48 h 동안 중합시켰다. 라이헤르트 울트라커트-S(Reichert Ultracut-S) 마이크로톰을 사용하여 초박편 섹션 (약 60 nm)으로 커팅하였다. 이어서, 초박편으로 절편화된 표본을 (30초 동안) 톨루이딘 블루로 염색하였다. 80i 정립 현미경 (20×, 40× 렌즈)으로 이미지를 촬영하였다.

탈세포화. 명시된 기간 동안 세포를 배양한 후 (500 ㎠ 디쉬 중 마트리겔 층 상에서 6 × 10⁴개의 HMEC), 500 ㎠ 디쉬 (코닝® 500 ㎠의 사각형 TC 처리된 배양용 디쉬) 중 HMEC 및 초대형 규모의 세포외 마이크로필라멘트 네트워크를 10 min 동안 4% 파라포름알데히드로 고정시킨 후, 1×PBS로 3회 세척하고, H&E 염색하였다. 세포괴 및 세포를 피펫 팁 (1 mL 또는 100 ㎕)을 이용하여 제거하고, 니콘 TMS 도립 위상차 현미경을 이용한 후, 1× PBS로 3회 세척하였다. 명시된 시간 동안 세포를 배양한 후, 세포 및 초대형 세포외 마이크로필라멘트 네트워크를 1 h 동안 0.5% KMnO4 (1× PBS 중, pH 7.1, 지질 안정화를 위해, 문헌 [Zhao, S. et al. Fixation-induced cell blebbing on spread cells inversely correlates with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate level in the plasma membrane. FEBS Open Bio 4, 190-199 (2014)])로, 이어서, 15 min 동안 10% 중성 완충처리된 포르말린 고정제로 고정시켰다. 이어서, 1× PBS로 3회 세척하여 유리 화학 잔류물을 제거하였다. 세포괴 및 세포를 피펫 팁 (1 mL 또는 100 ㎕)을 이용하여 제거하고, 니콘 TMS 도립 위상차 현미경을 이용한 후, 1× PBS로 3회 세척하여 탈착된 세포를 제거하였다. AUML을 맞춤형으로 만들고, 마트리겔 매트릭스로부터 분리시켰다. 열 화상 상처 치유 분석을 위해 자제 제작된 AUML 특정 전달 장치에 의해 마트리겔이 없는 AUML을 AUML의 상부 측이 상처 표면과 접촉하도록 상처 표면 상으로 옮겨 놓았다.

동물 열 화상 상처 치유 검정법. 6주령된 성체 BALB /cJ 암컷 마우스의 체중을 측정하고 (체중, 20~24 g), 10 mg/kg 크실라진 (아나세드 주사액(AnaSed® Injection), 크실라진 멸균 용액(Xylazine Sterile Solution))을 복강내 (IP) 주사하여 마취시켰다. 마취된 마우스의 등으로부터 털을 깎아내고, 상업적으로 이용가능한 제모제를 이용하여 상기 부위를 누드화시켰다. 피부를 98℃에 4초 동안 노출시킴으로써 15마리의 마우스에 심재성 2도 열 화상 상처 (직경 1.5 cm)를 유도하였다 (Zhang, Y. et al. Role for heat shock protein 90alpha in the proliferation and migration of HaCaT cells and in the deep second-degree burn wound healing in mice. PLoS One 9, e103723 (2014)). 심재성 2도 열 화상 상처를 갖는 15마리의 마우스를 무작위로 3개군 (각 군당 5마리의 마우스)으로 나누었다. 격일로 메피폼® 또는 맞춤형 AUML 처리하에/처리 없이 상처를 관리하였다. 니콘 카메라로 상처의 이미지를 촬영하였다. 화상 후 14d (일)째, 마우스를 희생시키고, H&E 염색 분석을 통한 조직학적 평가를 위해 상처를 잘라 내었다 (절편화된 표본, 깊이 5 ㎛).

이중 면역조직염색 분석. 피부 상처를 잘라 내고, 히스토초이스(HistoChoice)® MB 고정제 (암레스코(Amresco))로 고정시키고, 파라핀에 포매시켰다. 항-범-카드헤린 항체 (압캠, ab140338, 1:200; 라이프 테크놀러지즈, ^#982425, 알렉스 플루오르(Alex Fluor)®488 염소 항-토끼 IgG (H+L) 2차 항체, 1:1000), 항-γ-액틴 항체 (압캠, ab123034, 1:200; 라이프 테크놀러지즈, 알렉스 플루오르®568 염소 항-토끼 IgG (H+L) 2차 항체, 1:1000), 및 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI, 1:1000)을 이용하여 절편화된 표본 (깊이 5 ㎛)에 대해 이중 면역조직화학 염색을 수행하였다. 20×/40×/60x 렌즈가 장착된 니콘 80i 정립 현미경을 이용하여 형광 이미지를 촬영하였다. 모든 이미지는 메타모르프 이미지 획득 소프트웨어를 사용하여 수득하였다.

통계학적 분석. 앞서 기술된 바와 같이 통계학적 분석을 수행하였다 (Yi, T. et al. eIF1A augments Ago2-mediated Dicer-independent miRNA biogenesis and RNA interference. Nat Commun 6, 7194 (2015)). 데이터 (오차 막대)는 평균 및 SD (n = 3 이상)로 제시된다. P 값은 스튜던츠 t 검정 (테일 = 2)을 이용하여 측정하였다. **, P < 0.01;***, P < 0.001.

정상 1차 인간 유방 상피 세포 (HMEC)를 명시된 두께의 (3D) 마트리겔 매트릭스-배양 배지 혼합물 겔 층 상에 플레이팅하였다. 2D 배양물과 달리, 개별 HMEC는 불규칙한 형상을 보이지 않았지만, 일관되게 구형 형태를 나타내었고, 최소 표면적이 마트리겔과 접촉한 상태 그대로 남아있었다 (도 1a- b). 이는 마트리겔이 세포 유착, 부착 및 확산에 바람직하지 못한 환경이라는 것을 시사하는 것이다. 그러나, 더욱 장시간이 경과하였을 때, HMEC는 이동하고, 응집하고, 증식하였고, 조밀한 세포괴를 형성하였고, 여기서 다중 적층된 세포는 마트리겔 매트릭스와 접촉하지 않은 상태를 유지하였다 (도 1c- d). 세포 이식 후 24 또는 36시간 (h) 경과시 세포괴 주변에는 세포 생성된 물질이 없었다 (도 1c- d). 그러나, 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색 이미지화시, 본 발명자들은 이식 후 102 h째에, 세포괴가 세포괴 외부에 및 주변에 및 웰 (6-웰-플레이트) 또는 10 cm 디쉬에서 전체 마트리겔 표면을 커버하는 초대형 메쉬 구조물을 생성하였다는 것을 발견하였다 (도 1e-f).

초대형 메쉬가 막으로 둘러싸인 단위에 의해 구축되는지 여부를 조사하기 위해, 막 연관 분자 마커를 검출하였다. 원형질막 칼슘 수송 ATPase-2 (PMCA2)는 세포로부터 Ca² ⁺를 제거하는 칼슘 유출 펌프로서 작용하고 (문헌 [Street, V. A., McKee-Johnson, J. W., Fonseca, R. C., Tempel, B. L. & Noben-Trauth, K. Mutations in a plasma membrane Ca2+-ATPase gene cause deafness in deafwaddler mice. Nature genetics 19, 390-394 (1998)] 참조), 유방 상피 세포를 비롯한, 다수의 세포 유형의 Ca² ⁺ 함량을 조절한다 (문헌 [VanHouten, J. et al. PMCA2 regulates apoptosis during mammary gland involution and predicts outcome in breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107, 11405-11410 (2010)] 참조). 따라서, 증강된 녹색 형광 단백질 (EGFP)-태그부착된 PMCA2 (EGFP-PMCA2)를 코딩하는 플라스미드를 이용하여 일시적으로 HMEC를 형질감염시켰다. 형광 이미지화시, EGFP-PMCA2는 세포의 원형질막 전역에 및 세포괴 주변의 내포된 마이크로파이버의 큰 부분의 표면을 따라 분포하는 것으로 관찰되었다. 이는 세포괴가 세포괴를 연결하는 막으로 둘러싸인 세포외 마이크로파이버를 대량으로 왕성하게 생산한다는 것을 제안한다 (도 2a). 긴 세포외 마이크로파이버 및 짧은 세포외 마이크로파이버가 조밀하게 연결되어 있고, 이로써, 연속 네트워크를 구성한다 (도 2a).

2개의 비근육 및 고도로 보존되는 이소액틴인 β- 및 γ-액틴, 둘 모두 마이크로필라멘트 성분이고, 세포질 분열 (문헌 [Pollard, T. D. et al. Actin and myosin biochemistry in relation to cytokinesis. Annals of the New York Academy of Sciences 582, 120-130 (1990)] 참조), 세포 소기관 수송 (문헌 [Bretscher, M. S. Getting membrane flow and the cytoskeleton to cooperate in moving cells. Cell 87, 601-606 (1996)] 참조), 신호 전달 (문헌 [Janmey, P. A. The cytoskeleton and cell signaling: component localization and mechanical coupling. Physiological reviews 78, 763-781 (1998)] 참조), 세포 이동 (문헌 [Theriot, J. A. & Mitchison, T. J. Actin microfilament dynamics in locomoting cells. Nature 352, 126-131 (1991)]; [Mitchison, T. J. & Cramer, L. P. Actin-based cell motility and cell locomotion. Cell 84, 371-379 (1996)]; [Pollard, T. D. & Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell 112, 453-465 (2003)] 참조), 및 세포 형상 유지 및 변경 (문헌 [Gardel, M. L. et al. Elastic behavior of cross-linked and bundled actin networks. Science 304, 1301-1305 (2004)]; [Herman, I. M. Actin isoforms. Current opinion in cell biology 5, 48-55 (1993)]; [Keren, K. et al. Mechanism of shape determination in motile cells. Nature 453, 475-480 (2008)] 참조)에서 많은 역할을 한다. 추가로, β-액틴이 세포외 마이크로파이버 조성에 관여하는지 여부도 조사하였다. mCherry-태그부착된-β-액틴 (mCherry-β-액틴) 및 EGFP-PMCA2를 코딩하는 2개의 플라스미드를 일시적으로 HMEC 내로 공동 형질감염시켰고, 이후, β-액틴은 세포질 전역 및 모든 세포외 마이크로파이버를 따라 분포하는 것으로 관찰되었다 (도 2b). 이는 마이크로필라멘트가 막으로 둘러싸인 세포외 마이크로파이버의 구조적 성분이라는 것을 입증한다 (도 2a-b). 내포된 세포외 마이크로필라멘트는 마이크로필라멘트 연결 노드를 통해 네트워크를 형성하며, 그 사이에는 크기가 가변적인 큰 다각적 공간을 남긴다 (도 2b). 이어서, 다공성 (다각적 공극), 세포외 마이크로필라멘트 어셈블리된 네트워크는 연결되어 세포괴 주변에 초대형, 연속, 다공성 세포외 마이크로필라멘트 네트워크를 형성한다 (도 2a-b). 세포외 마이크로필라멘트는 강력한 분지화 형태형성능을 갖는다 (도 2a-b 및 도 3). 세포외 마이크로필라멘트 개수가 빠르게 증가하고, 이로써, 조밀한 네트워크를 빠르게 형성한다 (도 4a- e). 상기 데이터는 본 발명자들이 현재 알고 있는 지식에 따르면, 다세포 유기체에는 존재하지 않는, 지속성이고, 길며, 고도로 분지형이고, 막으로 둘러싸인 세포외 마이크로필라멘트의 이러한 초대형 메쉬가 여기서 최초로 생성되었다는 것을 제안한다. 상기의 이전에는 인정받지 못했던 구조물이 고도한 네트워크 형성 능력을 가지고, 세포골격 마이크로필라멘트 및 스트레스섬유 (문헌 [Tojkander, S., Gateva, G. & Lappalainen, P. Actin stress fibers--assembly, dynamics and biological roles. Journal of cell science 125, 1855-1864 (2012)] 참조), 기저 막 (문헌 [Nelson, D. A. & Larsen, M. Heterotypic control of basement membrane dynamics during branching morphogenesis. Developmental biology 401, 103-109 (2015)] 참조), 비분지형 상피 브릿지 (문헌 [Zani, B. G., Indolfi, L. & Edelman, E. R. Tubular bridges for bronchial epithelial cell migration and communication. PloS one 5, e8930 (2010)] 참조), 또는 짧고/거나, 일시적 사상위족 (문헌 [ Mattila, P. K. & Lappalainen, P. Filopodia: molecular architecture and cellular functions. Nature reviews. Molecular cell biology 9, 446-454 (2008)] 참조), 섬모, 미세융모 (문헌 [Cutz, E. et al. Microvillus inclusion disease: an inherited defect of brush-border assembly and differentiation. The New England journal of medicine 320, 646-651 (1989)] 참조), 포도솜, 및 인바도포디아 (문헌 [Murphy, D. A. & Courtneidge, S. A. The 'ins' and 'outs' of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function. Nature reviews. Molecular cell biology 12, 413-426 (2011)] 참조)와는 상이하다.

다중의 긴 세포외 마이크로필라멘트는 함께 정렬되어 두꺼운 번들을 형성한다. 2개 이상의 세포외 마이크로필라멘트는 함께 트위스트되어 고리가 있는 트위스트된 번들을 형성할 수 있다 (도 2b 및 5a- c). 이러한 관찰 결과는 조직화된 세포외 마이크로필라멘트 네트워크 (EMS)의 아키텍처 구조가 고도로 다양하다는 것을 시사하는 것이다. 상기 결과는 HMEC 세포괴의 주요 특성 중 하나는 그가 세포외 막으로 둘러싸인 마이크로필라멘트를 생산하고, 이를 통해서 초대형, 연속, 및 다공성 EMN을 강건하게 생성한다는 것을 입증한다 (도 2a-b 및 4a-e 내지 5a-c).

시간 경과 후 (80 h), 다중 EMN 복합체는 연결되고, 세포괴 주변의 초대형, 연속, 다공성, 다층 격자로 조합되고, 마트리겔 표면 전역으로 확산된다 (도 6a- b). 다양한 크기의, 미확인된 막으로 둘러싸인 둥근 점이 상기 초대형 3D EMN 전역에 걸쳐 산재되어 있다 (도 6a-b).

상기 초대형 EMN의 잠재적 기능을 확인하기 위해, HMEC를 마트리겔 층 상에 세포 이식한 후 110 h 동안 연속 배양하였다. 110 h째, 세포괴는 디셈블리하기 시작하였고, 개별 세포는 탈착되고, 이동하고, 세포괴 부위에 남아 있었고, EMN의 디셈블리에 의해 유발된 큰 둥근 홀 중의 마트리겔 표면은 피해 가면서, 초대형 EMN 표면 상에 그대로 남아 있었거나, 그를 따라 이동하였다 (도 7). 추가로, 디셈블리된 세포괴 기원의 개별 세포는 불규칙적인 형태를 가졌고, 구형 세포는 관찰되지 않았다 (도 7). 본 결과는 초대형 EMN 표면이 세포 유착, 부착, 확산, 이동 및 다른 거동을 촉진시킨다는 것을 시사하는 것이다. 종합해 보면, 상기 데이터는 세포괴가 초대형 연속 EMN을 생성하여 세포 활성에 바람직한 환경을 생성하고, 세포 이동을 위한 새로운 길을 제공한다는 것을 입증하였다 (도 1a-f, 2a-b, 3, 4a-e, 5a-c, 6a-b 및 7).

세포괴가 ft² 규모의 EMN을 효과적으로 발생시킬 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 500 ㎠ 배양 플레이트의 마트리겔 층 상에 HMEC를 이식시켰다. 세포괴는 전체 500 ㎠ 마트리겔 표면을 커버하는 초대형 EMN을 생성하였고 (도 8a-b), 이는 초대형 규모의 EMN을 생산할 수 있는 세포괴의 특별한 능력을 입증하는 것이며, 이는 세포가 제거된다면, 상처 치유용으로서 잠재적으로 적용될 수 있다는 것을 제안하였다. 탈세포화를 통해 이종계 동종 이계 세포 유전자 물질을 제거한 결과, 조직 재생에서의 사용을 위한 최소의 면역원성을 갖는 천연 구조물이 생성되었다²⁶. 이를 달성하기 위해, 고정 후, 세포괴 및 세포를 제거함으로써 인공 500 ㎠ (ft² 수준) 초대형 및 무세포 세포외 마이크로필라멘트 메쉬가 생산되었다 (도 8c). 상기 데이터는 상기 무세포 초대형 규모의 세포외 마이크로필라멘트 격자 (AUML)의 잠재적 크기는 구조물 고유의 특징들 중 어느 것에 의해서도 제한되지 않는다는 것을 시사하는 것이다.

전 세계 660만 명 이상의 사람들이 매년 각종 화상으로 고통받고 있는 것으로 추정되며, 연간 전 세계의 치명적인 화상 건수는 1990년 280,000건에서 2010년 338,000건으로 증가하였다 (Lozano, R. et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet 380, 2095-2128 (2012)). 재상피화 및 상처 치유는 넓은 면적의 2도 (3도) 열 화상 상처가 있는 환자를 위한 도전 과제가 된다. 치료 및 치유에 대한 주된 장애물 중 하나는, 조직 회복에 관여하는 (문헌 [Braun, K. M. & Prowse, D. M. Distinct epidermal stem cell compartments are maintained by independent niche microenvironments. Stem cell reviews 2, 221-231(2006)]; [Solanas, G. & Benitah, S. A. Regenerating the skin: a task for the heterogeneous stem cell pool and surrounding niche. Nature reviews. Molecular cell biology 14, 737-748 (2013)]; [Nowak, J. A., Polak, L., Pasolli, H. A. & Fuchs, E. Hair follicle stem cells are specified and function in early skin morphogenesis. Cell stem cell 3, 33-43 (2008)] 참조) 이종 세포의 작용을 지지하는 것으로서 (문헌 [Taylor, G., Lehrer, M. S., Jensen, P. J., Sun, T. T. & Lavker, R. M. Involvement of follicular stem cells in forming not only the follicle but also the epidermis. Cell 102, 451-461 (2000)]; [Watt, F. M., Lo Celso, C. & Silva-Vargas, V. Epidermal stem cells: an update. Current opinion in genetics & development 16, 518-524 (2006)]; [Watt, F. M. & Jensen, K. B. Epidermal stem cell diversity and quiescence. EMBO molecular medicine 1, 260-267(2009)] 참조), 물질은 분해성이어야 하고, 환자의 조직과 생물학적으로 적합성을 나타내어야 하고, 상처 부위로부터 미생물을 차단시킬 수 있어야 하고, 미세환경을 구축하기 위해 반투과성이어야 한다 (문헌 [Heng, M. C. Wound healing in adult skin: aiming for perfect regeneration. International journal of dermatology 50, 1058-1066 (2011)] 참조)라는 요구되는 특징들을 갖는 넓은 면적의 연속 물질이 없다는 것이다.

초대형, 연속, 다공성, 다층 및 천연 AUML이 화상 상처의 치유를 촉진시키는 환경을 생성할 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 마우스에서 2도 열 피부 화상 상처에 대해 메피폼 (Warner, P. M., Coffee, T. L. & Yowler, C. J. Outpatient burn management. The Surgical clinics of North America 94, 879-892 (2014)), 또는 AUML 처리/비처리를 수행하였다. 화상 후 14d째, AUML은 처리되지 않았거나, 또는 메피폼으로 처리된 것보다 2도 열 화상 상처의 재상피화 및 치유를 더욱 효과적으로 촉진시킨 것으로 나타났다 (도 9a 및 도 10a).

표피는 무혈관인 반면, 진피는 그의 혈관 네트워크를 통해 무혈관 표피에 영양소를 공급한다 ([Reinke, J. M. & Sorg, H. Wound repair and regeneration. European surgical research. Europaische chirurgische Forschung. Recherches chirurgicales europeennes 49, 35-43 (2012)], [Yamaguchi, Y. & Yoshikawa, K. Cutaneous wound healing: an update. The Journal of dermatology 28, 521-534 (2001)]). 카드헤린은 각질형성세포 유착 및 이동을 비롯한, 매우 다양한 기능을 수행하는 막횡단 단백질이다 (Lecuit, T. & Yap, A. S. E-cadherin junctions as active mechanical integrators in tissue dynamics. Nature cell biology 17, 533-539 (2015)). 흥미롭게도, AUML 처리가 재상피화된 표피 내의 다수의 큰 터널 생성을 유의적으로 촉진시킨 것으로 나타났다 (도 9b-c 및 도 10b, 도 12a 및 도 13a). 조직화학적 및 면역조직화학 염색 분석 결과, 상기 각질형성세포 터널은 적혈구를 비롯한 다수의 상이한 유형의 세포를 함유한다는 것이 입증되었고, 이는 상기 각질형성세포 터널이 기능적으로 세포, 가용성 성장 인자 및 영양소를 위한 경로를 제공한다는 것을 제안한다 (도 9b 및 도 11a-c, 12a-c 및 13a- c). 더욱 중요하게는, 각질형성세포가 각질형성세포 터널 루멘에서 EMN을 생성하고, (적혈구를 비롯한) 다양한 세포는 각질형성세포 EMN에서 이동하는 것으로 나타났으며, 이는 각질형성세포가 EMN이 생체내에서 세포 이동 및 다른 거동을 위한 스캐폴드를 제공할 수 있게 한다는 것을 입증한다 (도 9d 및 도 11a-c, 12a-c 및 13a-c 및 14a- c). 각질형성세포 EMN이 디셈블리되었고, 세포는 각질형성세포 터널을 채웠고, 이는 더욱 후속 단계에서는 각질형성세포 터널 및 EMN이 재상피화된 표피에서 소실되었다는 사실과 일치하며, AUML이 각질형성세포 터널 및 EMN의 조직화된 생성 및 분해를 위해 적절한 환경을 생성한다는 것을 제안한다 (도 9d, 도 10b 및 도 11a-c, 12a-c 및 13a-c 및 14a- c). 종합해 보면, AUML이 각질형성세포가 세포, 가용성 성장 인자 및 영양소를 위한 경로로서 작용하는 큰 각질형성세포 터널을 생성하고, 큰 각질형성세포 EMN이 생체내에서 세포 이동 및 다른 거동을 위한 스캐폴드를 공급할 수 있게 함으로써 상처 회복을 촉진시킬 수 있도록 허용하는 적절한 환경을 구축한다는 것이 상기 데이터를 통해 입증되었다.

천연 생물리적, 생화학적, 및 생체역학적 신호는 무손상 상태 그대로 유지시키면서, 탈세포화된, 완전히 인간 세포에 의해 생성되고, 세포 이동 및 다른 거동을 위한 스캐폴드 및 환경으로서 세포에 의해 천연적으로 사용된 ft² 규모의 AUML은 AUML이 상처 회복 촉진용으로서 적용될 수 있도록 하였다. 세포막으로 둘러싸인 세포외 마이크로필라멘트의 특징에 기인하여 AUML은 상처 회복 및 조직 재생 촉진을 위한 생분해성, 생체적합성, 반투과성 및 최소의 면역원성을 나타내는 생체물질로서 사용될 수 있다. 매우 넓은 면적의 AUML을 생성할 수 있는 잠재능에 기인하여 AUML은 임의 크기의 상처에 대하여 쉽게 맞춤화될 수 있다. AUML은 세포 및 영양소를 위한 경로를 제공하는 큰 각질형성세포 터널의 생성, 및 생체내 세포 이동 및 다른 거동을 위한 스캐폴드를 공급하는 각질형성세포 EMN의 생산을 촉진시킨다. 이러한 방식으로, 각질형성세포 터널 및 EMN은 조직 회복 동안 세포 이동, 증식, 분화 및 계층화가 발생하는 표피 부위에서 세포, 가용성 성장 인자 및 영양소에 대한 많은 수요를 충족시켜 준다.

고도로 조직된 조직 발생에서 넓은 면적의 천연 메쉬는 신호 유도 세포 이동, 증식 및 분화를 촉진시키며, 그의 천연 생물리적, 생화학적, 및 생체역학적 신호를 갖는, 상기의 생분해성, 생체적합성, 반투과성 및 무한 면역원성을 나타내는 AUML은 매우 다양한 범위의 상처를 치료하고, 조직 재생을 촉진시키는 방법으로서 적용될 것으로 기대된다.

본원에 제공된 데이터는, 마트리겔에서 성장된 세포로부터 생산된 것으로서, 이전에는 인정받지 못했던 세포외 마이크로필라멘트 네트워크가 세포 이동을 촉진시킨다는 것을 보여주고 있다. 본 개시내용은 2도 열 화상 상처의 재상피화 및 치유를 촉진시키는 무세포 및 초대형 규모의 (ft² 규모) 세포외 마이크로필라멘트 네트워크를 고려한다.

실시예 II

화상 치료, 급성 및 외과성 상처 치료를 비롯한, 상처 감염 예방 및 관리를 위한 넓은 면적의 천연 1차 정상 인간 세포막을 생산하는 신규한 조직 조작 방법을 기술한다. 세포 매트릭스 상에서 배양된 정상 1차 인간 상피 세포는 핵 또는 DNA가 없는 넓은 면적의 (최대 500 ㎠) 1차 정상 인간 세포막을 생성하며, 이는 상처에 적용될 수 있고, 미생물 유도 상처 감염을 예방하기 위한 물리적 장벽으로서 작용할 수 있다. 조작된 넓은 면적의 세포막-매트릭스 복합 층은 박테리아, 진균 및 바이러스를 비롯한, 미생물에 의한 감염을 효과적으로 예방할 수 있다.

물질 및 방법

큰 1차 정상 인간 세포막의 성장. 다양한 크기 (75 ㎠, 또는 300 ㎠, 또는 500 ㎠ 이상)의 디쉬 중 마트리겔™ 매트릭스 층 (Yi, T., Kabha, E., Papadopoulos, E., and Wagner, G. (2014) 4EGI-1 targets breast cancer stem cells by selective inhibition of translation that persists in CSC maintenance, proliferation and metastasis. Oncotarget 5, 6028-6037)을 마트리겔™ 막 매트릭스 (CB-40234, Corning) 및 미리 냉각시킨 디쉬를 이용하여 얇은 플라스틱 막 상에서 제조한 후, 이어서, 37℃에서 20분 동안 인큐베이터에서 인큐베이션시켰다. 1차 정상 인간 유방 상피 세포 (HMEC) (Scheel, C., Eaton, E. N., Li, S. H., Chaffer, C. L., Reinhardt, F., Kah, K. J., Bell, G., Guo, W., Rubin, J., Richardson, A. L., and Weinberg, R. A. (2011) Paracrine and autocrine signals induce and maintain mesenchymal and stem cell states in the breast. Cell 145, 926-940)를 DMEM 배지 중 마트리겔 매트릭스 층 상에서 배양하였다. 포유동물 세포를 5% CO₂ 존재하에 37℃에서 배양하였다. 50시간 배양 후, HMEC는 세포괴 및 넓은 면적의 1차 정상 인간 세포막을 형성한다. 팁에 의해 세포괴를 제거하였고, 핵의 유전자 물질이 없는 넓은 면적의 1차 정상 인간 세포막이 생성되었다. DMEM 배지 제거 후, 세포막을 1× PBS로 3회 세척하였다.

결과

본 방법에 의해 생성된 넓은 면적의 천연 1차 정상 인간 세포막 (도 15a-b)은 1) 초대형 면적의 (최대 500 ㎠ 이상) 핵이 없는 천연 세포막; 단일 세포 면적과 비교하여 면적이 10억배 (10¹⁰배) 증가; 2) 이중 천연 1차 정상 인간 세포막 층; 3) DNA의 유전자 물질 부재; 4) 천연 막 단백질과 함께 천연 지질 막; 5) 세포막 및 마트리겔 매트릭스의 용이한 분해; 및 6) 상처 감염 예방을 포함하는 특징을 갖는다.

본원에서 본 발명의 바람직한 실시양태가 제시되고, 기술되었지만, 상기 실시양태는 단지 예로서 제공된 것이라는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게는 자명할 것이다. 이에, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명으로부터 벗어남 없이 다수의 변형, 변경, 및 치환을 만들어 낼 수 있을 것이다. 본원에 기술된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 하기 청구범위는 본 발명의 범주를 정의하고, 이러한 청구범위 내의 방법 및 구조, 및 그의 등가물은 그에 의해 그에 포괄되는 것으로 의도된다.

Claims

복수의 마이크로필라멘트 발원 영역 사이에서 연속 격자 또는 메쉬 구조로 상호연결된 세포-유래 마이크로필라멘트를 포함하는 네트워크.
제1항에 있어서, 마이크로필라멘트가 세포외 마이크로필라멘트인 네트워크.
제1항에 있어서, 마이크로필라멘트가 막으로 둘러싸여 있는 것인 네트워크.
제1항에 있어서, 마이크로필라멘트가 액틴을 포함하는 것인 네트워크.
제4항에 있어서, 액틴이 β-액틴을 포함하는 것인 네트워크.
제1항에 있어서, 마이크로필라멘트가 약 1-1000 ㎛ 길이인 네트워크.
제1항에 있어서, 마이크로필라멘트가 분지형인 네트워크.
제7항에 있어서, 마이크로필라멘트가 약 2-10개의 분지를 갖는 것인 네트워크.
제1항에 있어서, 다중 마이크로필라멘트가 함께 정렬되고, 다양한 아키텍처 구조의 번들을 형성하는 것인 네트워크.
제1항에 있어서, 마이크로필라멘트 발원 영역이 연속 격자 또는 메쉬 구조를 위한 연결 노드를 형성하는 것인 네트워크.
제1항에 있어서, 접착 물질을 추가로 포함하는 네트워크.
제11항에 있어서, 접착 물질이 마이크로필라멘트와 회합하고, 마이크로필라멘트의 직경을 확장시키는 것인 네트워크.
제1항에 있어서, 네트워크의 면적이 약 1 ㎛² 내지 약 500 ㎠ 범위이고, 두께가 약 1 nm 내지 약 0.5 cm 범위인 네트워크.
제1항에 있어서, 네트워크가 단일층 또는 다층인 네트워크.
제1항에 있어서, 마이크로필라멘트의 표면적이 세포내 세포골격 마이크로필라멘트 네트워크 표면적의 등가 단위보다 큰 것인 네트워크.
제1항에 있어서, 네트워크가 다공성인 네트워크.
제16항에 있어서, 공극 크기가 직경 약 0.1 - 5 ㎛ 범위인 네트워크.
제1항에 있어서, 생물활성제 및/또는 생물불활성제를 추가로 포함하는 네트워크.
제18항에 있어서, 생물활성제가 치료 약물인 네트워크.
제1항에 있어서, 마이크로필라멘트 발원 영역이 세포를 포함하는 것인 네트워크.
제1항에 있어서, 네트워크가 매트릭스 지지체 상에 존재하고, 여기서 매트릭스 지지체는 생분해성인 네트워크.
제1항에 있어서, 네트워크가 마트리겔 매트릭스 지지체 상에 존재하는 것인 네트워크.
제1항에 있어서, 네트워크에 세포로부터의 핵이 결여되어 있는 것인 네트워크.
제1항에 있어서, 네트워크에 세포가 결여되어 있는 것인 네트워크.
제1항에 있어서, 마이크로필라멘트 발원 영역이 유전자가 변형된 또는 변형되지 않은 진핵 세포를 포함하는 것인 네트워크.
제25항에 있어서, 진핵 세포가 포유동물 세포인 네트워크.
제26항에 있어서, 포유동물 세포가 인간 세포인 네트워크.
제27항에 있어서, 인간 세포가 인간 유방 상피 세포인 네트워크.
제1항에 있어서, 마이크로필라멘트가 매트릭스 지지체의 상부 표면 내에 포매되는 것인 네트워크.
제1항에 있어서, 매트릭스 지지체가 세포 부착 및 이동을 억제시키는 것인 네트워크.
매트릭스 지지체 및 세포 배양 배지 중에서 세포를 배양하는 단계이며, 여기서 세포는 증식하고, 응집된 세포괴를 형성하고, 여기서 세포괴는 세포괴 외부에 및 그 주변에 마이크로필라멘트를 생산하고, 여기서 세포외 마이크로필라멘트는 연결되어, 연속 세포외 마이크로필라멘트 네트워크를 형성하는 것인 단계, 및
네트워크로부터 세포의 핵 및/또는 세포를 제거하는 단계를 포함하는, 마이크로필라멘트의 네트워크를 생산하는 방법.
제31항에 있어서, 세포괴가 매트릭스 지지체의 상부에 형성되는 것인 방법.
제31항에 있어서, 마이크로필라멘트가 매트릭스 지지체의 상부 표면 내에 포매되는 것인 방법.
제31항에 있어서, 매트릭스 지지체가 세포 부착 및 이동을 억제시키는 것인 방법.
제31항에 있어서, 마이크로필라멘트가 세포외 마이크로필라멘트인 방법.
제31항에 있어서, 마이크로필라멘트가 막으로 둘러싸여 있는 것인 방법.
제31항에 있어서, 마이크로필라멘트가 액틴을 포함하는 것인 방법.
제37항에 있어서, 액틴이 β-액틴을 포함하는 것인 방법.
제31항에 있어서, 마이크로필라멘트가 약 1-1000 ㎛ 길이인 방법.
제39항에 있어서, 마이크로필라멘트가 분지형인 방법.
제40항에 있어서, 마이크로필라멘트가 약 2-10개의 분지를 갖는 것인 방법.
제31항에 있어서, 다중 마이크로필라멘트가 함께 정렬되고, 다양한 아키텍처 구조의 번들을 형성하는 것인 방법.
제31항에 있어서, 마이크로필라멘트 발원 영역이 연속 격자 또는 메쉬 구조를 위한 연결 노드를 형성하는 것인 방법.
제31항에 있어서, 접착 물질을 추가로 포함하는 방법.
제44항에 있어서, 접착 물질이 마이크로필라멘트와 회합하고, 마이크로필라멘트의 직경을 확장시키는 것인 방법.
제31항에 있어서, 네트워크의 면적이 약 1 ㎛² 내지 약 500 ㎠ 범위이고, 두께가 약 1 nm 내지 약 0.5 cm 범위인 방법.
제31항에 있어서, 네트워크가 단일층 또는 다층인 방법.
제31항에 있어서, 마이크로필라멘트의 표면적이 세포내 세포골격 마이크로필라멘트 네트워크 표면적의 등가 단위보다 큰 것인 방법.
제31항에 있어서, 네트워크가 다공성인 방법.
제49항에 있어서, 공극 크기가 직경 약 0.1 - 5 ㎛ 범위인 방법.
제31항에 있어서, 네트워크가 생물활성제 및/또는 생물불활성제를 추가로 포함하는 것인 방법.
제51항에 있어서, 생물활성제가 치료 약물인 방법.
제31항에 있어서, 매트릭스가 생분해성인 방법.
제31항에 있어서, 매트릭스가 마트리겔인 방법.
제31항에 있어서, 세포가 유전자가 변형된 또는 변형되지 않은 진핵 세포인 방법.
제55항에 있어서, 진핵 세포가 포유동물 세포인 방법.
제56항에 있어서, 포유동물 세포가 인간 세포인 방법.
제57항에 있어서, 인간 세포가 인간 유방 상피 세포인 방법.
치료를 필요로 하는 부위에 제1항의 마이크로필라멘트 네트워크를 적용시키는 단계를 포함하는, 의학적 병태를 치료하는 방법.
제59항에 있어서, 마이크로필라멘트 네트워크가 매트릭스와 함께 적용되는 것인 방법.
제59항에 있어서, 마이크로필라멘트 네트워크가 매트릭스 부재하에 적용되는 것인 방법.
제59항에 있어서, 의학적 병태가 상처 또는 손상된 조직인 방법.
제59항에 있어서, 마이크로필라멘트 네트워크가 상처 또는 손상된 조직의 감염을 예방하고, 상처 치유 및 조직 재생을 촉진시키는 것인 방법.
제59항에 있어서, 의학적 병태가 화상인 방법.
제59항에 있어서, 손상된 피부의 재상피화를 증진시키거나 또는 촉진시키는 것을 포함하는 방법.
제59항에 있어서, 치료를 필요로 하는 부위에 마이크로필라멘트 네트워크를 적용시키는 단계 이전에, 그와 공동으로, 또는 그 이후에 치료 약물을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
복수의 세포 클러스터를 매트릭스 기재의 표면 상에서 세포 클러스터가 세포 클러스터 외부에 및 그 주변에 마이크로필라멘트를 생산하는 조건하에서 배양하는 단계를 포함하고, 여기서 세포외 마이크로필라멘트는 매트릭스 기재의 표면 상의 세포 클러스터 사이에서 연결되어 마이크로필라멘트의 연속 세포외 네트워크를 형성하는 것인, 시험관내에서 세포-유래 마이크로필라멘트의 연속 네트워크를 생산하는 방법.
제67항에 있어서, 세포 클러스터가 평균 거리 약 1 ㎛ 내지 약 1000 ㎛만큼 이격되어 있는 것인 방법.
제67항에 있어서, 세포 클러스터를 연결하는 마이크로필라멘트의 평균 길이가 약 10 ㎛ 내지 약 100 ㎛인 방법.
제67항에 있어서, 연속 세포외 마이크로필라멘트 네트워크가 다층 격자인 방법.
제67항에 있어서, 마이크로필라멘트가 분지형인 방법.
제67항에 있어서, 연속 세포외 마이크로필라멘트 네트워크가, 길이가 약 10 ㎛ 내지 약 1000 ㎛인 긴 마이크로필라멘트 및 길이가 약 1 ㎛ 내지 약 10 ㎛인 짧은 마이크로필라멘트를 포함하는 다층 격자인 방법.
제67항에 있어서, 마이크로필라멘트의 연속 세포외 네트워크의 표면적이 약 0.01 ㎠ 내지 500 ㎠인 방법.
제67항에 있어서, 연속 세포외 마이크로필라멘트 네트워크가 메쉬인 방법.
제67항에 있어서, 연속 세포외 마이크로필라멘트 네트워크가 다공성인 방법.
제67항에 있어서, 세포가 매트릭스 기재의 표면 상에 이식되고, 여기서 세포는 이동하고, 프리클러스터로 응집되고, 증식되어 세포 클러스터를 형성하는 것인 방법.
제67항에 있어서, 연속 세포외 마이크로필라멘트 네트워크로부터 세포 핵 또는 세포 클러스터를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제67항에 있어서, 매트릭스 기재가 세포의 부착을 억제시키는 것인 방법.
제67항에 있어서, 매트릭스 기재를 연속 세포외 마이크로필라멘트 네트워크로부터 분리시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
상처 회복 및/또는 조직 재생의 촉진을 필요로 하는 부위에 제1항의 마이크로필라멘트 네트워크를 적용시키는 단계를 포함하는, 상처 회복 및/또는 조직 재생을 촉진시키는 방법.
제80항에 있어서, 마이크로필라멘트 네트워크가 매트릭스와 함께 적용되는 것인 방법.
제80항에 있어서, 마이크로필라멘트 네트워크가 매트릭스 부재하에 적용되는 것인 방법.
제80항에 있어서, 마이크로필라멘트 네트워크가 제곱 피트 (ft²) 규모의 초대형 마이크로필라멘트 격자 (UML)를 형성하는 것인 방법.
제83항에 있어서, UML이 세포 이동을 위한 환경을 구축하는 것인 방법.
제80항에 있어서, 마이크로필라멘트 네트워크가 다층이고, 3차원 (3D)인 방법.
제80항에 있어서, 세포괴를 제거하고, 무세포 UML (AUML)을 생산하는 단계를 포함하는 방법.
제86항에 있어서, AUML이 상처 회복을 촉진시키는 것인 방법.
제86항에 있어서, AUML을 상처 부위에 적용시키는 단계를 포함하는 방법.
제88항에 있어서, AUML을 적용시키는 단계가 각질형성세포가 재상피화된 표피에서 큰 터널을 생성하도록 하는 것인 방법.
제89항에 있어서, 큰 터널이 상처 회복 부위로의 세포 및 영양소를 위한 경로를 제공하는 것인 방법.
제80항에 있어서, 마이크로필라멘트 네트워크가 상처 부위의 감염을 예방하는 것인 방법.
제80항에 있어서, 상처 피부의 재상피화를 증진 또는 촉진시키는 것을 포함하는 방법.
제80항에 있어서, 상처가 2도 열 화상 상처인 방법.
제80항에 있어서, 치료를 필요로 하는 부위에 마이크로필라멘트 네트워크를 적용시키는 단계 이전에, 그와 공동으로, 또는 그 이후에 치료 약물을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.