NO311111B1 - Metode for bestemmelse av mengden av fett og vann i en biologisk pröve - Google Patents

Description

Oppfinnelsen er en metode for bestemmelse av mengde av vann og fett i en biologisk prøve. Metoden anvender kjernemagnetisk resonans (NMR) til å bestemme mengden av fett og vann for eksempel i en fiske- eller dyrefile.

Innenfor næringsmiddelindustrien er det store behov for å kunne bestemme innholdet av vann og fett i de produktene som fremstilles. Den delen av næringsmiddelproduksjonen som driver oppdrett av marine dyr og fisk spesielt knyttet til oppdrett av edle fiskearter som laks og lignende, er det viktig å kunne bestemme disse faktorene av den biomassen som produseres. Den vektmessige sammensetning av vann og fett i fiskekjøttet, er en faktor som bestemmer kvaliteten på fiskekjøttet og som er avgjørende for et riktig produkt slik markedet vil ha det. Dette er også sentralt ved produksjon av gris.

Det finnes flere metoder som benyttes for å bestemme innhold av vann og fett i næringsmidler. Den ene betegnes som Soxhlets metode. Her tas en prøve som veies og deretter tørkes ut i tørkeskap ved 105 °C. Dette tar omkring 4 timer å gjennomføre. Deretter bestemmes innholdet av fett i prøvematerialet ved at det tilsettes et fettløselig stoff, slik at fettet kan trekkes ut og løsemidlet deretter fjernes. Fettmengden kan finnes ved veiing.

En annen måte å fremskaffe fett- og vanninnhold på, er ved homogenisering av en prøve. Man tilsetter deretter gips som trekker til seg vannet og perkloretylen som binder seg til fettet og forårsaker en tetthetforandring. Når vannet er fjernet kan denne tetthetforandringen finnes og fettinnholdet deretter bestemmes. Denne kalles Foss-let-metoden.

En tredje metode benytter seg av fotometriske teknikker og infrarødt lys. Denne krever en kostbar utrustning.

I sovjetisk patent 1.043.537 beskrives en metode som ikke direkte benytter forskjellen i mobilitet mellom fett og vann til å skille mellom disse signalene. Det postuleres at forskjellen i mobilitet fører til en forskjell i relaksasjonstider, og deretter gjør de nytte av dette i et eksperiment som måler de longitudinale relaksasjonstidene. Da fett og vann, i følgje dette patentet, har en signifikant forskjell i karakteristisk relaksasjonstid, vil man kunne sette parametrene i eksperimentet slik at man bare måler fettsignalet. Ved å kalibrere mot kjent referanseprøve har man dermed et mål for fettinnhold. Her postuleres det at forskjellen i mobilitet mellom vann og fett fører til en forskjell i karakteristisk relaksasjonstid. Dette er ikke nødvendigvis korrekt for alle biologiske system, da det er mange flere variabler som påvirker den karakteristiske relaksasjonstida. Man kan dermed måle om lag samme relaksasjonstid, på tross av stor forskjell i mobilitet.

Den benytter et Stimulert-Spinn-Ekko NMR-eksperiment i et antatt konstant magnetisk felt for å finne fettinnholdet.

Den kompenserer ikke for tap av NMR-signal som følge av relaksasjonsmekanismer. I stedet velger man ut referanseprøver med om lag samme relaksasjonsegenskaper og kalibrerer med disse. Man antar da at tap av NMR-signal fra kjent og ukjent prøve er om trent den samme.

Japansk patentene nr. 1.190.342 og 5-64635 samt amerikansk patent nr. 5134372 beskriver metoder hvor man skiller vann og fett signal ut fra det faktum at kjemiske egenskaper gir forskjellig resonansrfekvens. Signalene kan dermed skilles ved høye nok magnetfelt som man oppnår i supraledende magneter. Ved å nytte fasesensitiv detektor, så kan man separere fett- og vannsignal. Metoden fungere ikke ved svake magnetfelt som man oppnår ved å nytte elektromagneter eller permanente magneter.

Britisk patent nr. 2.261.072 omtaler en metode hvor man fjerner vannsignal ved å tilsette kalsiumkarbid. Dette kjemikaliet endrer den karakteristiske relaksasjonstida til vann slik at NMR-signalet fra vann forsvinn fort. Man står da igjen med fettsignalet som man kvantifiserer mot kjent referanse.

Dagens anvendte metoder krever enten kostbar utrustning og/ eller det tar lang tid for å gjennomføre en prøve og de vil ikke kunne være noe godt alternativ til bruk ute i næringsmiddelindustrien. For eksempel vil oppdrettere av fisk ikke se det formåltjenelig å selv utføre slike prøver på grunn av disse faktorene.

Hensikten med foreliggende oppfinnelse er å fremskaffe en metode som raskere, billigere og med større nøyaktighet enn kjente metoder, kan benyttes til bestemmelse av innholdet av fett- og vanninnhold i næringsmidler.

Dette oppnås ved at den biologiske prøven plasseres i et homogent/statisk magnetfelt og utsettes for et oscillerende magnetisk felt som sammen med en magnetisk feltgradient over prøven måler protonenes kjernemagnetiske moment, i et difmsjonseksperiment og et kombinert diffusjons/relaksasjonseksperiment idet man direkte skiller signalene fra fettet og vannet ved hjelp av deres forskjellige mobilitet.

Ytterligere detaljer ved oppfinnelsen vil fremgå av den etterfølgende beskrivelsen av metoden under henvisning til figurer.

Figur 1. En biologisk prøve plassert i NMR- basert måleapparat. Figur 2. Signalform som påtrykkes ved bruk av Pulsede magnetiske Feltgradient Spin Ekko metoden (PFGSE). Figur 3. Resultat fra PFGSE NMR- diffusjonseksperiment av homogenisert laksefile. Figur 4. PFGSE- signalsekvens med etterfølgende rekke av 180° RF-signaler, et transversalt relaksasjonseksperiment. Figur 5. Viser dempningen av fettsignalet på grunn av T2<*>.

Figur 6. Viser dempningen av vannsignalet.

Når en plasserer hydrogen i et eksternt homogent magnetfelt, så vil det kjernemagnetiske momentet rette seg inn etter dette feltet. Hamiltonfunksjonen for ikke vekselvirkende kjernemagnetiske spinn i et eksternt magnetfelt kan skrives

der Y=gyromagnetisk faktor, fi=Planck's konstant. I=spinnoperator og H(t) er det eksterne magnetisk felt. Tidsavhengigheten til H(t) er inkludert for å gjøre (LI) gyldig under påvirkning av oscillerende magnetfelt (RF-felt) og magnetiske feltgradienter (g). For hydrogenets kjernespinn kan egenverdiene, energinivåene, til Harniltonifinksjonen skrives når H(t) er konstant og homogent (=Ho) Differansen mellom de to energinivåene skrives dermed

I termisk likevekt vil en få populasjonsforskjell mellom øvre og nedre energinivå gitt ved Boltzmann-faktoren

Der T er absolutt temperatur og k= Boltzmanns konstant.

Populasjonsforskjellen fører til at et system plassert i et eksternt magnetfelt vil generere et netto kjernemagnetisk moment som vil være avhengig av proton/hydrogen innholdet. Momentet vil i termisk likevekt være rettet inn etter det eksterne magnetfeltet. Ved å påvirke et slikt system med et oscillerende magnetfelt, RF-felt, transversalt til det eksterne magnetfeltet Ho, vil en indusere overganger mellom spinn energinivåene (ref.l). Retningen på netto kjernemagnetisk moment vil da bevege seg ut av termisk likevekt med det eksterne feltet. Når RF-feltet blir slått av, vil systemet rette seg inn mot termisk likevekt igjen, retningen til Ho. Denne innrettingen vil foregå med en hastighet gitt av karakteristiske relaksasjonstider, Tl (longitudinal relaksasjon) og T2 (transversal relaksasjon).

Veien tilbake til termisk likevekt i kombinasjon med oscillasjon av netto kjernemagnetisk moment transversalt til Ho vil forårsake magnetiske fluksendringer som en kan gjøre opptak av med samme RF-spole som en eksiterte systemet med. Strømmen som blir indusert i spolen vil da være proporsjonal med antall hydrogen i systemet, og en vil ut i fra signalstyrken kunne kvantifisere hydrogeninnholdet i systemet (se figur 1).

En kan utføre opptak av mobiliteten til hydrogenene ved å gjøre nytte av en magnetisk feltgradient. Den magnetiske feltgradienten, g, fører til at frekvensen som protonenes kjernemagnetiske moment oscillerer med i planet transversalt til Ho vil være posisjonsavhengig

Når en ved hjelp av RF-pulser og magnetiske feltgradienter gjør et NMR-diffusjonseksperiment (ref.2), skjer det en utfasing av det netto magnetiske momentet gitt ved

Differansen (Z2-Z1) er avstanden protonene har flyttet seg i løpet av NMR-diflusjonseksperimentet, og 8 er tiden som de pulsede magnetiske feltgradienten er aktive. For større verdier på (Z2-Z1), større mobilitet, vil den induserte strømmen i RF-spolen, NMR-signalet, avta som følge av at protonene er kommet ut av fase.

Ved å anta en gaussisk fordeling av diffusjonskoeffesienter og monoeksponensiell attenuasjon av NMR-signalet som følge av relaksasjonsprosesser, så kan en skrive attenuasjonen av et NMR-signal som

ti = tid NMR-signalet er påvirket av transversale relaksasjonsprosesser t2 = tid NMR-signalet er påvirket av longitudinale relaksasjonsprosesser g(t") = total magnetisk feltgradient, ekstern og intern.

D = diffusjonskoeffesient

Tl = karakteristisk longitudinal relaksasjonstid

T2 = karakteristisk transversal relaksasjonstid

Io = Initiell intensitet av NMR-signalet

Der er flere måter å utføre et diffusjonseksperiment ved hjelp av NMR på. Her brukes den såkalte Pulsede magnetiske Feltgradient Spin Ekko metoden (PFGSE) (se figur 2). Korreksjon for longitudinale relaksasjonsprosesser blir da unødvendig, og en vil fa refokusert NMR-signalet med hensyn til interne magnetiske feltgradienter. Ekko-attenuasjonen for PFGSE-sekvensen skrives;

Gi er den interne magnetiske feltgradienten forårsaket av magnetiske susceptibilitetsendringer gjennom prøvematerialet, g er den eksternt påtrykte magnetiske feltgradienten, 8 er gradient pulslengde, og x er tidsintervallet mellom 90-graders RF-puls og 180-graders RF-puls.

De to leddene i første eksponent i (L8) dras sammen til et T2<*->ledd

T2<*> er definert ved følgende ligning: Uttrykket for attenuasjonen skrives da

Relaksasjonsledd og diffusjonsledd pga. intern magnetisk feltgradient, Gi, er dermed samlet i I(T2<*>).

For å skille mellom vann- og fettsignal gjør en nytte av at vann og fett har stor forskjell i mobilitet, minst 2 dekader. Et PFGSE-diffusjonseksperiment vil da kunne brukes til å separere de to signalene (se figur 3). Ved å tilpasse de to signalene til (LII) med forskjellig D, så vil en få verdier på I(T2<*>) for fett og for vann separat.

Figur 3 viser en attenuasjon av NMR-signal frå et NMR diffusjons-eksperiment. Kurven kan tilnærmet beskrives ved to komponenter:

Da fett og vann har svært forskjellig mobilitet, representert ved Dfeitt og Dvatn, så vil signalet fra andre ledd (vatnsignalet) forsvinne mye raskere enn signalet fra første ledd i ligningen (fettsignalet). I figur 3 viser den heltrukne linjen en vektet lineær regresjonstilpassing til overstående ligning (eventuelt LII) når vannsignalet er undertrykt på grunn av dets høye mobilitet. Ekstrapolasjonen inn til y-aksen gir da I(T2<*>)feitt. Verdien på I(T2<*>)vam får man så ved å trekke I(T2<*>)feitt fra det totale signalet I ved skjæringspunktet med y-aksen.

Etter at signalene er separert gjør en korreksjon for T2<*->effekter. Dette er nødvendig da PFGSE-eksperimentet med eksisterende utstyr tar 4-10 ms, og transversal relaksasjonstid for vann og fett er av samme størrelsesorden. Det betyr at noe signal både fra vann og fett kan være mistet, men ved hjelp av et relaksasjonsekperiment korrigerer man for denne effekten. Dermed kan vann- og fettsignal kvantifiseres.

NMR-signal som er tapt i løpet av PFGSE diffusjonseksperimentet, kompenserer en for ved å måle verdien på T2<*> og dermed ekstrapolere seg inn til observasjonstid lik 0 (se figurene 5 og 6). Dette gjøres ved hjelp av en kombinasjon av PFGSE-sekvensen med en etterfølgende rekke av 180-graders RF-pulser, et transversal relaksasjonseksperiment (se figur 4).

Eksperimentet utføres for to verdier på g:

a) Den magnetiske feltgradienten er g så sterk at vannsignal er undertrykt En kan da måle T2<*> for fett samt Io=Ifett, og kvantifisering av fett er fullført. b) g er liten slik at vann og fett måles samtidig, x" kan da settes mindre enn x slik at en får et målepunkt nær opptil observasjonstid lik 0. x' kan ikke settes lik 0 da det vil bety at proton

NMR-signal fra proteinet i systemet vil bidra. Proton har en transversal relaksasjonstid på 10-100 fis (ref.3 ) slik at minste t' som kan nyttes vil være 250 us. Første målepunkt vil da være ved 0.5 ms, og proton NMR-signalet fra proteinet vil da ikke gi et signifikant bidrag til NMR-signalet Da en kjenner T2<*> for fett samt Ifett fra a), finnes T2<*> for vann samt Io=Ivann. Kvantifisering av vann er fullført.

I tilfelle a) skrives attenuasjonen

En vektet lineær regresjonstilpassing for logaritmen til (LI3) til funksjonen resulterer i en verdi for c der

Med vektet tilpassing tar en hensyn til at modellen i (LI4) ikke er gyldig til alle tider. Når observasjonstiden går mot et minimum (n —*■ 0), vil gyldigheten av modellen øke. De første målepunktene er derfor tillagt mer vekt enn de siste. Figur 5 viser attenuasjonen av fettsignal på grunn av T2<*->relaksasjon.

Diffusjons- og relaksasjonseffekter i NMR-signalet fra fett er nå korrigert for, og signalet menes å være et mål for fettinnholdet i prøven.

For å utføre en lignende tilpassing for T2<*->eksperimentet der vann og fettsignal er til stede samtidig, må en først trekke fra fettsignalet. Dette gjøres ved å skalere attenuasjonen fra fettsignalet i a) med I(T2<*>). I(T2<*>) er den ekstrapolerte verdien ved 0 påtrykt magnetisk feltgradient styrke, og denne er visualisert med en linje i figur 3. Effekter fra diffusjon av fett under påvirkning av påtrykt magnetisk feltgradient g er da korrigert for, og den resulterende T2<*> attenuasjonen vil være fra vann alene.

En vektet lineær regresjon til funksjonen i (LI4) gir da

Prøven veies før NMR-eksperimentet, og når en har funnet vekt av fett (gitt av LI3) og vann (gitt av L 14), vil resterende mengde utgjøre reststoffet eller tørrstoffet i prøven.

Metoden er testet ut på homogenisert laksefilet der eksperimentelle data er vist i figurene 3,5 og 6 . Kontrollrnålinger er gjort ved hjelp av Fosslet metoden for ekstraksjon av fett og tørking for å finne vanninnhold. Resultatene fra de to ulike metodene viser at en finner tilnærmet samme vanninnhold, begge innenfor intervallet 62.5-64.5 %.

For fettinnhold gir NMR-metoden en prosentandel på 19.8 % mot 14.0 % fra Foss-let metoden.

Referanser:

Ref.l: NMR- Signal Reception: Virtual Photons and Coherent Spontaneous Emission, Concepts Magnetic Resonance 9: 277-297 (1997).

Ref.2: Pulsed- Field Gradient Nuclear Magnetic Resonance as a Tool for Studying Tramlational Difusion: Part 1. Basic Theory, Concepts Magnetic Resonance 9: 299-336

(1997).

Ref. 3: A review of H nuclear magnetic resonance relaxation in pathology: Are Tl and T2 diagnostics?, Medical Physics 14 (1), Jan/Feb 1987.

Claims (4)

1. Fremgangsmåte for å bestemme mengde av fett og vann i biologisk materiale, karakterisert ved at den biologiske prøven plasseres i et homogent/statisk magnetfelt og utsettes for et oscillerende magnetisk felt (figur 1) som sammen med en magnetisk feltgradient over prøven måler protonenes kjernemagnetiske moment, i et diffusjonseksperiment (figur 2) og et kombinert difiusjons/relaksasjonseksperiment (figur 4) idet man direkte skiller signalene fra fettet og vannet ved hjelp av deres forskjellige mobilitet.

2. Fremgangsmåte for bestemmelse av mengde av fett og vann i biologisk materiale ifølge krav 1, karakterisert ved at signalene fra fett og vann separeres ved styrt endring av den påtrykte magnetiske feltgradienten for å fremskaffe et signal for fett og vann samlet og et signal for fett alene (figur 3) hvorved vannsignalet kan finnes gjennom subtraksjon av disse signalene.

3. Fremgangsmåte for bestemmelse av mengde av fett og vann i biologisk materiale ifølge krav 2, karakterisert ved at signalene fra fett og vann korrigeres for T2<* >relaksasjonseffekter gjennom følgende trinn: i) Magnetisk feltgradientstyrke settes så høy at vannsignal undertrykkes i diffusjonssekvensen og korreksjon for T2<*->relaksasjon utføres for fettsignalet alene (figur 5, LI5) ii) Magnetisk feltgradientstyrke settes så lav at T2<*>relaksasjon for vann og fett måles samtidig. iii) En skalert versjon av T2<*->relaksasjonskurva for fett alene som er korrigert for attenuasjon av signal på grunn av diffusjon i diffusjonssekvensen subtraheres fra T2<*->relaksasjonskurva for fett og vann, og en står da igjen med T2<*-> relaksasjonskurva for vann alene (figur 6, LI6).

4. Fremgangsmåte for bestemmelse av mengde av fett og vann i biologisk materiale ifølge krav 1, 2 eller 3 karakterisert ved at det anvendes magnetiske feltgradienter til å generere romlig frekvensoppløsing (L5) av det Fourier- transformerte NMR- signalet, slik at referanseprøve kan kjøres simultant med den biologiske prøven.