JP2014221072A - 特異的切断および質量分析法の組合せによる診断的配列決定 - Google Patents
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Abstract
【課題】基準核酸配列が知られている1つ以上の標的核酸の配列分析の方法を提供する。
【解決手段】(a)標的核酸が生物学的サンプルに由来すること;(b)切断試薬を用いて、標的核酸を、相補的切断反応に付し、それにより切断産物を生成すること;(c)工程(b)で生成した切断産物に質量分光測定的分析を行って、1つ以上の質量スペクトルを得ること、及び(d)工程(c)で得られた標的核酸の切断産物の質量スペクトルを、基準核酸配列のための公知または推定された質量スペクトルと比較し、そしてそれから、体系的コンピューター処理分析により、標的核酸のヌクレオチド配列の全部または一部を推定し、そして推定核酸配列を、基準核酸と比較して、標的核酸が、核酸と同じ配列か、または異なる配列を有するかどうかを決定する工程を含む、基準核酸配列が知られている1つ以上の標的核酸の配列分析の方法。
【選択図】なし
【解決手段】(a)標的核酸が生物学的サンプルに由来すること;(b)切断試薬を用いて、標的核酸を、相補的切断反応に付し、それにより切断産物を生成すること;(c)工程(b)で生成した切断産物に質量分光測定的分析を行って、1つ以上の質量スペクトルを得ること、及び(d)工程(c)で得られた標的核酸の切断産物の質量スペクトルを、基準核酸配列のための公知または推定された質量スペクトルと比較し、そしてそれから、体系的コンピューター処理分析により、標的核酸のヌクレオチド配列の全部または一部を推定し、そして推定核酸配列を、基準核酸と比較して、標的核酸が、核酸と同じ配列か、または異なる配列を有するかどうかを決定する工程を含む、基準核酸配列が知られている1つ以上の標的核酸の配列分析の方法。
【選択図】なし
Description
(発明の分野)
本発明は、核酸に基づく診断的アッセイの分野にある。さらに詳細には、それは、プロトタイプまたは標準配列が、すでに利用可能である(「再配列決定」ともいう)か、または本明細書に記述される方法を用いて決定され得るサンプル核酸の領域の「診断的配列決定」のために有用な方法に関する。この診断技術は、迅速かつ信頼のおける方法でそのような再配列決定を必要とする領域で有用である:(i)所定の領域/遺伝子の種々の対立遺伝子の配列の同定、(ii)疾病関連突然変異の記録、(iii)体細胞変動の検出、(iv)分子進化の分野における研究、(v)原核生物および真核生物ゲノムの核酸配列の決定、(vi)1つ以上の生物学的サンプルで1つ以上の核酸を同定すること;(vii)および、生物学的サンプルおよび他の領域における遺伝子の発現プロファイルを決定すること。
本発明は、核酸に基づく診断的アッセイの分野にある。さらに詳細には、それは、プロトタイプまたは標準配列が、すでに利用可能である(「再配列決定」ともいう)か、または本明細書に記述される方法を用いて決定され得るサンプル核酸の領域の「診断的配列決定」のために有用な方法に関する。この診断技術は、迅速かつ信頼のおける方法でそのような再配列決定を必要とする領域で有用である:(i)所定の領域/遺伝子の種々の対立遺伝子の配列の同定、(ii)疾病関連突然変異の記録、(iii)体細胞変動の検出、(iv)分子進化の分野における研究、(v)原核生物および真核生物ゲノムの核酸配列の決定、(vi)1つ以上の生物学的サンプルで1つ以上の核酸を同定すること;(vii)および、生物学的サンプルおよび他の領域における遺伝子の発現プロファイルを決定すること。
(発明の背景)
ヒト及び多数のモデル生物のための完全な標準ゲノム配列は、最近、利用可能であるか、または近い将来に利用可能になると予想される。並行挑戦は、目的の配列における変動のタイプおよび範囲が、個人および集団の中の遺伝性の差の基礎をなすことから、それを特徴づけることである。ヒトでは、配列変動の大部分が、一塩基多型(SNP)と称されるヌクレオチド置換からなる。DNA配列決定は、多型を見つける最も敏感な方法である〔Eng C.およびVijg Jら、Nature Biotechnol. 15巻:422-426頁(1997年)〕。それらをモニターする強力な方法〔Landegren Uら、Genome Res. 8巻:769-776頁(1998年)〕と共に、このような配列変動の成長するパネルは、最も微妙な疾病の疑われる遺伝子座を同定する連鎖の研究で有用である〔Lander E.およびSchork N.、Science 265巻:2037-2048頁(1994年);Risch N.およびMerikangas K.、Science 273巻:1516-1517頁(1996年)〕。さらに、全ての(機能性)対立遺伝子変動の同定は、多量のサンプルで特定の領域の再配列決定を必要とする〔Nickerson D.ら、Nature Genet. 19巻:233-240頁(1998年)〕。公知SNPを監視する多数の方法が開発された〔Landegren U.ら、Genome Res. 8巻:769-776頁(1998年)〕が、再配列決定は、患者の診断を確実にするために日常的に使用されているようである。実際に、これまで調査されたかなりの数の疾患関連遺伝子において、文字どおり数百または実に数千の異なる突然変異が、同定され、そして目録に入った。その結果、配列決定は最終レベルの分離を表し、そして公知の医療上の関連性の多数の突然変異の他に、どの突然変異または突然変異の組合せが存在するのかを監視する好ましい方法であり得る。
ヒト及び多数のモデル生物のための完全な標準ゲノム配列は、最近、利用可能であるか、または近い将来に利用可能になると予想される。並行挑戦は、目的の配列における変動のタイプおよび範囲が、個人および集団の中の遺伝性の差の基礎をなすことから、それを特徴づけることである。ヒトでは、配列変動の大部分が、一塩基多型(SNP)と称されるヌクレオチド置換からなる。DNA配列決定は、多型を見つける最も敏感な方法である〔Eng C.およびVijg Jら、Nature Biotechnol. 15巻:422-426頁(1997年)〕。それらをモニターする強力な方法〔Landegren Uら、Genome Res. 8巻:769-776頁(1998年)〕と共に、このような配列変動の成長するパネルは、最も微妙な疾病の疑われる遺伝子座を同定する連鎖の研究で有用である〔Lander E.およびSchork N.、Science 265巻:2037-2048頁(1994年);Risch N.およびMerikangas K.、Science 273巻:1516-1517頁(1996年)〕。さらに、全ての(機能性)対立遺伝子変動の同定は、多量のサンプルで特定の領域の再配列決定を必要とする〔Nickerson D.ら、Nature Genet. 19巻:233-240頁(1998年)〕。公知SNPを監視する多数の方法が開発された〔Landegren U.ら、Genome Res. 8巻:769-776頁(1998年)〕が、再配列決定は、患者の診断を確実にするために日常的に使用されているようである。実際に、これまで調査されたかなりの数の疾患関連遺伝子において、文字どおり数百または実に数千の異なる突然変異が、同定され、そして目録に入った。その結果、配列決定は最終レベルの分離を表し、そして公知の医療上の関連性の多数の突然変異の他に、どの突然変異または突然変異の組合せが存在するのかを監視する好ましい方法であり得る。
生物医療の遺伝学の分野は、配列決定の技術に密に依ることは明らかなようである。したがって、時間および費用競争力のある、そして同時に正確でそして確固としている高度な配列決定法が必要である。この領域における発展としては、塩基性ジデオキシ鎖終結配列決定法〔Sangerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74巻:5463-5467頁(1977年);Lipshutz R.およびFodor S.ら、Current Opinion in Structural Biology 4巻:376-380頁(1994年)により論評〕に対する改善、並びに全く新しい理論的枠組みに基づいている新たなアプローチ法が挙げられる。2つのこのような新規アプローチ法は、ハイブリッド形成による配列決定(SBH)〔Drmanac R.ら、Science 260巻:1649-1652頁(1993年)〕およびピロ配列決定〔Ronaghi M.ら、Science 281巻:363-365頁(1998年);Ronaghi M.ら、Anal.Biochem. 242巻:84-89頁(1996年)〕である。これらのアプローチ法の概念が、実験的に確認された一方で、それらの最終的な支持および使用法は、使用の型−例えばデノボ配列決定、再配列決定、および公知SNPの遺伝子型決定に依り得る。
最近、進展は、核酸を分析する質量分析(MS)の使用でも行われた〔Crain,P.F.およびMcCloskey,J.A.、Current Opinion in Biotechnology 9巻:25-34頁(1998年)、およびそこに引用される文献〕。1つの有望な開発は、DNAおよびRNAオリゴヌクレオチドの配列決定に対するMSの使用であった〔Limbach P.、Mass Spectrom.Rev. 15巻:297-336頁(1996年);Murray K.、J.Mass Spectrom.31巻:1203-1215頁(1996年)〕。MSおよびより詳細には、マトリックス介助レーザーデソープション/イオン化MS(MALDI MS)は、高速のシグナル獲得および固形表面から離れた自動化分析によって非常に高い処理量の可能性を示す。時間を節約することに加えて、MSは、分子の固有の特性を測定し、そしてしたがって、際立ってより多くの情報を与えるシグナルを得ることが指摘された〔Koester H.ら、Nature Biotechnol.、14巻:1123-1128頁(1996年)〕。
配列情報は、気相断片化から直接誘導され得る〔例えば、Nordhoff E.ら、Mass Spectrom.、30巻:99-112頁(1995年);Little D.ら、J.A.Chem.Soc.、116巻:4893-4897頁(1994年);Wang B.ら、国際公開公報第98/03684号および国際公開公報第98/40520号;Blocker H.ら、欧州特許第0 103 677号;Foote S.ら、国際公開公報第98/54571号基準〕。対照的に、間接法は、溶液相における多様な方法、すなわち、気相イオンの発生の前によって得られる断片の質量を測定する。それの最も簡単な形態において、質量分析は、配列決定反応により生成された断片−ラダー(すなわち、1つの共通終点を共有する断片の繰り込まれた集合)のゲル電気泳動の分画に取って代わる。配列決定反応は、塩基呼び出しが、連続的な位置で終結しそして1つのヌクレオチド残基によって互いに異なる断片の正確な質量測定にも基づき得るので、必ずしも、塩基特異的である必要はない。断片−ラダーは、サンガー法〔Koester H.ら、Nature Biotechnol.、14巻:1123-1128頁(1996年);Reeve M.A.、Howe R.P.、Schwarz T.、米国特許第5,849,542号;Koester H.、米国特許第5,547,835号;Levis R.およびRomano L.、米国特許第5,210,412号および米国特許第5,580,733号;Chait B.およびBeavis R.、米国特許第5,453,247号〕による、塩基特異的部分的RNA消化〔Hahner S.ら、Nucleic Acids Res.、25巻:1957-1964頁(1997年);Koester H.、国際公開公報第98/20166号〕により、または化学的切断〔Isola N.ら、Anal.Chem.、71巻:2266-2269頁(1999年);Limbach P.、Mass Spectrom. Rev. 15巻:297-336頁(1996年)で引用された文献〕により生成され得る。代替的方法は、3′−または5′−末端のいずれかからエキソヌクレアーゼ消化によって生成されるラダーを分析することからなる〔Pieles U.ら、Nucleic Acids Res.、21巻:3191-3196頁(1993年);Koester H.、米国特許第5,851,765号;Engels J.ら、国際公開公報第98/45700号;Tarr G.およびPatterson D.、国際公開公報第96/36986号;Patterson D.、米国特許第5,869,240号〕。
最近の実施条件下での直接および間接MS方法論の両方の重大な制限は、〜30−50ヌクレオチドを超える鎖の長さへの適用性に乏しいことである。結果として、MSについての見込みは、大規模の配列決定よりむしろDNA診断アッセイの役目であることが示唆された〔Smith L.、Nature Biotechnol.、14巻:1084-1087頁(1996年)〕。MSは、短いヌクレオチド断片を分析する絶妙な手段を表すという事実を考えると、核酸に基づく診断の目的について記述された種々のMSに基づく方法は、一般に、このような比較的短い断片の誘導および分析に関与する〔例えば、Koester H.、国際公開公報第96/29431号;Koester H.ら、国際公開公報第98/20166号;Shaler T.ら、国際公開公報第98/12355号;Kamb A.、米国特許第5,869,242号;Monforte J.ら、国際公開公報第97/33000号;Foote S.ら、国際公開公報第98/54571号〕。
MSに基づくアッセイのいくつかは、定義された突然変異または多型の評価に使用された。他の方法は、複数のオリゴヌクレオチド断片を誘導し、そして突然変異および/または多型についての大型標的核酸領域を分析するために、「質量フィンガープリント」をもたらす。しかし、後者のMS分析は、それらが、配列変動の検出に基本的に制限されるという点で、相当に少ない情報を与えるものである。その方法は、用語診断的配列決定が、配列変動の存在、特性および位置の明解な決定を意味する、核酸の診断的配列決定に使用され得ない。最高で、測定は、その質量が、可能性のある組成物の異性体の数を減少させるのに十分に正確に測定される小さな断片の基本的組成物を確認する。さらに、組成物における特定の変化(質量スペクトルでの移動によって示されるとおり)のみが、多型または突然変異に明瞭に割当てられ得る。相互に関係する配列のスペクトルと、野生型配列、または付与された多型を含むことが知られる公知配列から得られる基準スペクトルとの間の調和は、相互に関係した核酸領域が、野生型であるか、または先に知られた多型を組込み、それにより特定の他の可能性のある解釈を無視することを示すように推定される。
当技術分野においてほとんどの方法は、配列関連情報を得る一方で、それらは、相補的な消化反応の後に得られる数種の異なる質量スペクトルの組合せが、核酸領域の有効な調査を可能にし、そして公知、並びに標準核酸と、公知ヌクレオチド配列に相対的な、かねて未知の配列変動の両方の明瞭な割当てを提供するということは開示されていない。
上に記述された方法の制限を考慮すると、当技術分野は、上に検討された方法の欠点を克服するであろう核酸の診断的配列決定についての新たな手段から明らかに恩恵を受けるところがある。
従来の配列決定技術、すなわち、断片ラダーのゲル電気泳動分析と比較して、本発明の方法は、多重標的配列の同時分析にいっそう適している。一般に、各特定の配列または配列変異型は、質量ピークの固有の集合に関連がある。その結果、本発明の方法による配列決定反応は、(i)多重化(すなわち、単独の生物学的サンプルから得られる2つまたはそれ以上の標的非同種の標的領域の分析)、(ii)ヘテロ接合性のサンプルの分析、並びに(iii)プーリング法(すなわち、2つまたはそれ以上の異なる生物学的サンプルから誘導される類似の領域の同時配列決定)に十分に役立つ。
多重性の許容量のため、本発明の方法は、遺伝的連鎖の研究でのマーカーとして有用な多型(例えば、SNP)のゲノム全体の発見のための道具として適し得る。多数の変異型位置の明瞭な同定/診断は、完全な配列決定より需要が低く、そしてその結果、相当の量の標的ゲノム遺伝子座が、特にそれらの長さが比較的小さく保たれている場合組合され、そして同時に分析され得る。並行して記録され得るマーカーの数は、目的の種における遺伝的多様性のレベルにより、そして標的核酸を製造および分析するために使用される正確な方法によるが、しかし、一般的に、最近のMS能力では数十から100までの桁であり得る。MSの高精度および高速特性への多重化の付加は、数千(数万)のマーカーの大規模で、そして費用上有効な評価を可能にする新たなマーカー技術となる。ゲノム全体の遺伝子型決定に対する本発明の使用のある態様は、実施例5に記述される。
本発明の方法による配列決定反応は、原則的には、各個体の配列または配列変異体についての離散セットを得るのに対して、従来の配列ラダーは、互いの上に積み重なっている。したがって、このような配列または配列変異体は、より少ない種として存在する場合でさえ、分析され得る。これは、正常なおよび病気に罹った細胞の両方またはそれ自身(例えば、癌様組織、ウイルス類似種)における存在のためしばしば遺伝的に異質性である医療用サンプルの分析のための有用な特質である。さらに、野生型対立遺伝子に対する低い割合の突然変異体での突然変異を検出する能力は、個々の生物学的サンプルをプールすること、集団中のゲノム配列変動についてのよりコスト効果の良い調査を可能にすべき方法を実現可能にする。
本発明は、本発明の相補的切断反応の適切なセットによって生じた相補的フィンガープリントのセットで得られるデータの統合が、配列決定に本質的に等しいサンプル核酸の特徴付けのレベルを表すという見識に、部分的に基づく。本発明は、MSによる分析に特に適するモノ−およびジヌクレオチドから数十のヌクレオチドの断片までの範囲に入る切断産物の生成を生じる切断プロトコールの使用にも向けられる。同時に、本発明の方法は、広範な範囲の可能性のある突然変異について標的核酸をスクリーニングすることを制限される他の断片化工程とは異なっている。本発明によって、相補的消化反応の後に得られ、体系的なコンピュータ処理分析に連結された数種の異なる質量スペクトルの組み合わせは、選択された標的核酸またはそこの領域の調査を可能にし、そして公知および予て未知である配列変動の両方の明瞭な配置に導く。本発明のある種の態様では、本明細書に開示される方法と組合せた標準配列の知識は、実験的アプローチ法のモデル化、可能性のある明瞭さの予想、および適切な解決法の設計を可能にする。
(発明の概要)
本発明は、特定の核酸配列を検出または分析する質量分析法に向けられる。本発明は、例えば、特定の領域/遺伝子の種々の対立遺伝子配列の同定、疾病に関連した突然変異の同定および評価、体細胞変動の検出、分子進化での遺伝的多様性を決定すること、およびゲノム性配列の、例えばウイルス性および細菌性単離物の決定を可能にする迅速で、そして信頼できる方法で核酸をデノボ(de novo)配列決定または再配列決定するために有用である。本発明は、発現プロファイルに関与する1つ以上の生物学的サンプルにおける全ての核酸分子の同定、すなわち、発現されるmRNAの発現を迅速に配列決定することによって、規定の時間で、規定の細胞で発現される全てのmRNAの同定にも有用である。
本発明は、特定の核酸配列を検出または分析する質量分析法に向けられる。本発明は、例えば、特定の領域/遺伝子の種々の対立遺伝子配列の同定、疾病に関連した突然変異の同定および評価、体細胞変動の検出、分子進化での遺伝的多様性を決定すること、およびゲノム性配列の、例えばウイルス性および細菌性単離物の決定を可能にする迅速で、そして信頼できる方法で核酸をデノボ(de novo)配列決定または再配列決定するために有用である。本発明は、発現プロファイルに関与する1つ以上の生物学的サンプルにおける全ての核酸分子の同定、すなわち、発現されるmRNAの発現を迅速に配列決定することによって、規定の時間で、規定の細胞で発現される全てのmRNAの同定にも有用である。
1つの態様で、本発明は、公知標準核酸配列が、利用可能である1つ以上の標的核酸の配列分析についての方法に向けられる。この方法で、1つ以上の標的核酸は、1つ以上の生物学的サンプルに由来して、基準核酸は、各々、相補的切断反応にかけ、そして切断反応の産物を、質量分析法によって分析する。その後、1つ以上の標的核酸の質量スペクトルは、基準核酸配列の質量スペクトルと比較され、そして1つ以上の標的核酸のヌクレオチド配列は、体系的コンピュータ処理分析によって推定される。
この態様の1つの局面で、cDNAクローンのような複数の標的は、同じ生物学的サンプルのmRNAから調製され、そして並行の実験で上のとおり別個に分析される。第二の態様で、複数の標的は、同じ生物学的サンプルから誘導され、そして同時に、例えばゲノム全体の遺伝子型決定で分析される。
1つ以上の標的核酸は、一本鎖DNA、二本鎖DNA、cDNA、一本鎖RNA、二本鎖RNA、DNA/RNAハイブリッド、およびDNA/RNAモザイク核酸からなる群より選択され得る。
第2の態様で、1つ以上の増幅標的核酸が、増幅核酸断片、クローン化核酸断片、およびゲノムから得られる一連の非連続的DNA断片からなる群より選択される。本発明の1つの態様で、増幅された1つ以上の増幅標的核酸は、インビボ・クローニング、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、逆転写に続くポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)、鎖置換増幅(SDA)、および転写に基づく工程からなる群より選択される1つ以上の連続増幅手段から誘導される。
好ましい態様で、増幅された核酸断片は、(a)1つ以上の標的核酸または基準核酸と相補的である領域に対応し、そして上に記述される増幅手段の内のいずれか1つを使用して発現制御配列をコードする1つ以上のプライマー使用して、1つ以上の標的核酸または基準核酸を増幅させ;そして(b)標的または基準核酸上の転写制御配列を認識する1つ以上のRNAポリメラーゼを用いて、増幅された1つ以上の標的核酸または基準核酸からRNA転写産物を生成する工程を包含する方法によって1つ以上の標的核酸または基準核酸から生成されるRNA転写産物である。その後、上の方法によって生成されるRNAは、核酸断片を生成する相補的切断反応にかけられ、そしてそれは、その後、MSによって分析される。転写制御配列は、真核生物の転写制御配列、原核生物の転写制御配列、およびウイルス性転写制御配列からなる群より選択される。原核生物の転写制御配列は、T3、T7およびSP6プロモーターからなる群より選択され得る。コグネイトRNAポリメラーゼは、水酸基以外の2′−置換基でRNA転写非規定基質に組込む能力のある野生型または突然変異体形態のいずれかであり得る。
第3の態様で、1つ以上の標的核酸は、修飾されたヌクレオシド三リン酸を用いて増幅される。質量修飾ヌクレオシド三リン酸は、質量修飾デオキシヌクレオシド三リン酸、質量修飾ジデオキシヌクレオシド三リン酸、および質量修飾リボヌクレオシド三リン酸からなる群より選択される得る。修飾ヌクレオシド三リン酸は、塩基、糖、および/またはホスフェート部分で修飾され、そして酵素的工程、化学的に、または両方の組合せを通して導入される。1つの態様で、修飾は、転写サブユニット上の水酸基以外の2′−置換基から構成され得る。別の態様では、修飾は、ホスホロチオエート・インターヌクレオシドリンカー、またはさらにアルカリ化試薬と反応したホスホロチオエート・インターヌクレオシドリンカーから構成され得る。さらに別の態様では、修飾は、ウリジン−5′−一リン酸・サブユニットのC5上のメチル基から構成され得る。このような修飾は、ある種の切断試薬による切断の特異性および/または切断産物の質量および/または切断産物の長さを改変し得る。
本発明の1つの局面では、1つ以上の標的核酸および基準核酸は、酵素的切断、化学的切断、および/または物理的切断反応を使用して、相補的切断にかけられる。好ましい態様では、1つ以上の標的核酸および基準核酸は、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼからなる群より選択される1つ以上の酵素を用いて、酵素的切断反応にかけられる。さらに好ましい態様では、標的核酸は、二本鎖RNAであり、そして使用されるエンドヌクレアーゼは、リボヌクレアーゼである。リボヌクレアーゼは、G−特異的T1リボヌクレアーゼ、A−特異的U2リボヌクレアーゼ、A/U特異的phyMリボヌクレアーゼ、U/C特異的リボヌクレアーゼA、C−特異的ニワトリ肝臓リボヌクレアーゼ(RNアーゼCL3)およびクサチビンから選択され得る。この好ましい態様の1つの態様では、標的核酸は、ホスホロチオエート修飾一本鎖DNAまたはRNAであり、そしてエンドヌクレアーゼが、ヌクレアーゼP1である。
別の局面では、核酸断片の質量分光測定法の分析は、マトリックス介助レーザーデソープション/イオン化飛行時間型(MALDI−TOF)、電気スプレーイオン化(ESI)、およびフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴(FT−ICR)からなる群より選択される質量分光計を用いて行われる。好ましい態様では、切断断片の分析に使用される質量分光測定法は、MALDI−TOFである。
第5の態様では、本発明の方法は、そのために公知基準核酸配列が利用できる、生物学的サンプルから誘導される1つ以上の標的核酸中の核酸配列変動を診断するために使用され得る。この方法で、生物学的サンプルから誘導される1つ以上の標的核酸、およびその配列が前決定された基準核酸が、相補的切断反応にかけられ、そして切断反応の産物は、質量分光測定法によって分析される。その後、1つ以上の標的核酸の質量スペクトルは、基準核酸の質量スペクトルと比較され、そして1つ以上の標的核酸におけるヌクレオチド配列変動は、1つ以上の標的核酸および基準核酸の間の配列変動の体系的コンピューター処理の分析によって推定される。標的核酸における欠失、置換、および/または挿入を含む多様な酸配列変動は、本発明の方法を用いて決定され得る。
第6の態様では、本発明の方法は、そのために公知基準核酸配列が利用できる、生物学的サンプルから誘導される1つ以上の標的核酸中の公知ヌクレオチド配列変動を評価するために使用され得る。この態様では、生物学的サンプルから誘導される1つ以上の標的核酸、および基準核酸が、相補的切断反応にかけられ、そして切断反応の産物は、質量分光測定法によって分析される。その後、1つ以上の標的核酸の質量スペクトルは、基準核酸の質量スペクトルと比較し、そして1つ以上の標的核酸におけるヌクレオチド配列変動は、1つ以上の標的核酸および基準核酸の間の核酸配列を比較することにより、体系的コンピューター処理の分析によって評価される。
第7の態様では、本発明の方法は、そのために基準核酸配列で利用できるものがない、生物学的サンプルから誘導される1つ以上の標的核酸中のヌクレオチド配列を決定する(デノボ配列決定する)ために使用され得る。この方法では、生物学的サンプルから誘導される標的核酸は、相補的切断反応にかけられ、そして切断反応の産物は、質量分光測定法によって分析される。その後、体系的コンピューター分析によって繋げられた1つ以上の標的核酸の質量スペクトルは、1つ以上の標的核酸の配列を推定するために使用される。
第8の態様では、本発明の方法は、1つ以上の公知または未知標的核酸のゲノム全体の遺伝子型決定のために使用され得る。この方法では、生物学的サンプルから誘導される1つ以上の標的核酸は、増幅され、そしてその後、相補的切断反応にかけられる。1つの態様では、複数の標的は、単独サンプルから誘導され、そして同時に分析される。切断反応の産物は、質量分光測定法によって分析される。1つ以上の公知または未知標的核酸の質量スペクトルは、基準核酸の質量スペクトルと比較される。その後、この比較は、生物学的サンプルが誘導される生物の遺伝子型を判断するため、そして1つ以上の公知または未知標的核酸の遺伝的に関連性のある核酸配列変動を、そこから決定するために使用される。
第9の態様では、本発明の方法は、1つ以上のサンプル中の1つ以上の標的核酸を同定するために使用され得る。この方法では、生物学的サンプルから誘導される1つ以上の標的核酸は、増幅され、そしてその後、相補的切断反応にかけられる。1つの態様では、複数の標的は、単独サンプルから誘導され、そして同時に分析される。切断反応の産物は、質量分析的方法によって分析される。1つ以上の標的核酸の同定は、1つ以上の公知または未知標的核酸の質量スペクトルを、互いに比較するか、または基準核酸の複数の質量スペクトルとの比較によって推定される。
1つの局面では、本発明の方法は、発現プロファイル、すなわち、1つ以上のサンプル中で発現される種々のmRNAを同定するために使用され得る。
さらに、本発明によって含まれるのは、質量スペクトルを用いた1つ以上の標的核酸の配列分析のためのキット、その核酸配列が知られている1つ以上の集合の基準核酸を有する容器、1つ以上の核酸切断剤、および1つ以上の標的核酸の質量スペクトルを、基準核酸の質量スペクトルと比較し、そしてそこから、1つ以上の標的核酸の核酸配列を推定するためのコンピューターアルゴリズム/ソフトウエアーを包含するキットである。1つの態様では、核酸切断剤は、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼから構成される酵素の群から選択される酵素である。好ましい態様では、エンドヌクレアーゼは、G−特異的T1リボヌクレアーゼ、A−特異的U2リボヌクレアーゼ、A/U特異的phyMリボヌクレアーゼ、U/C特異的リボヌクレアーゼA、C−特異的ニワトリ肝臓リボヌクレアーゼ(RNアーゼCL3)およびクサチビンからなる群より選択されるリボヌクレアーゼである。
(発明の詳細な説明)
質量分光測定法での最近の能力で、長さ〜50塩基より大きな核酸を配列決定することは実施不可能である。その結果、実施不可能で、そして面倒な数の独立の配列決定反応は、目的の遺伝子または他の遺伝的領域の数千の塩基に及ぶことが必要である。下に示される本発明の方法は、この制限を克服する。同時に、本発明の方法は、広範な範囲の可能性のある突然変異について標的核酸をスクリーニングすることが制限される他の断片化工程と異なる。実際に、本明細書に記述されたとおり相補的切断反応の適切な選択は、遺伝的変動の余剰配置および特性の決定を可能にする。さらに、コンピューター処理プロトコールが、記述された方法の絶対必要な部分であることが本明細書に示される。方法およびアルゴリズムは、基準配列(類)に基づいて、(i)規定の特性の1つ以上の切断反応と関連したスペクトルの変化、および(ii)特異的に定義された配列変動の間の関係を推定することが必要とされる。
質量分光測定法での最近の能力で、長さ〜50塩基より大きな核酸を配列決定することは実施不可能である。その結果、実施不可能で、そして面倒な数の独立の配列決定反応は、目的の遺伝子または他の遺伝的領域の数千の塩基に及ぶことが必要である。下に示される本発明の方法は、この制限を克服する。同時に、本発明の方法は、広範な範囲の可能性のある突然変異について標的核酸をスクリーニングすることが制限される他の断片化工程と異なる。実際に、本明細書に記述されたとおり相補的切断反応の適切な選択は、遺伝的変動の余剰配置および特性の決定を可能にする。さらに、コンピューター処理プロトコールが、記述された方法の絶対必要な部分であることが本明細書に示される。方法およびアルゴリズムは、基準配列(類)に基づいて、(i)規定の特性の1つ以上の切断反応と関連したスペクトルの変化、および(ii)特異的に定義された配列変動の間の関係を推定することが必要とされる。
本発明の方法による配列決定反応は、多重化、すなわち、多重の非隣接の標的領域の同時分析のために使用され得る〔前記〕。したがって、方法は、遺伝的連結の研究でのマーカーとして有用な多型(例えば、SNP)のゲノム全体の発見のための道具として適し得る。実際に、多数の異性体位置の明瞭な同定/診断は、完全な配列決定より需要が低く、そしてその結果、特にそれらの長さが比較的小さく保たれている場合相当の量の標的ゲノム遺伝子座が、組合され、並行して分析され得ることが認識される。並行に記録され得るマーカーの数は、目的の種における遺伝的多様性のレベルにより、そして標的核酸を製造および分析するために使用される正確な方法によるが、しかし、一般的に、最近のMS能力で数十から100までの桁であり得る。MSの高い正確および高速特性に多重化の付加は、数千(数万)のマーカーの大規模で、そして費用上有効な評価を可能にする新たなマーカー技術に寄与する。ゲノム全体の遺伝子型決定する本発明の使用のある様相は、実施例5に記述される。
本発明は、当技術分野において生来の欠点のいくつかを克服する質量分析法(MS)に基づいた核酸配列決定法を提供する。先に記述された方法と対照的に、本発明の方法は、ラダー、すなわち、共通末端によって特徴づけられるネスト化た核酸断片の整列された集合の生成を必要としない。むしろ、開示された方法は、相補的断片化反応と、MSの分析的分離能との組合せに応じて、質量分解および質量精度を改善する。本発明は、モノ−およびジヌクレオチドから、MSによる分析に特に適する数十のヌクレオチドの断片までの範囲に入る切断産物の生成を生じる酵素的切断プロトコールの使用に向けられる。本発明により、相補的消化反応の後に得られ、体系的コンピューター処理の分析に繋げられた数種の異なる質量スペクトルの組合せは、選択核酸またはその領域の調査を可能にし、そしてそして公知および先に未知である配列変動の両方の明瞭な割当てに導く。
本発明は、サンプル核酸の全てまたは一部の診断的配列決定(「再配列決定」とも称される)、すなわち、関連した公知基準配列に関連して起こる配列変動の存在、特性および位置の決定をする方法にも向けられる。配列変動は、先に同定されているか、またはこれまで未知であるかのいずれかであり得る。本発明による診断的配列決定は、先に知られた突然変異または多型を評価するときに、核酸配列における特定の位置に注目し得る。
ここで使用される場合、用語「マッピング」は、両方の特徴、すなわち、配列変動の特性および位置を包含すると解釈される。
ここで使用される場合、用語「標的DNA」、「標的配列」、「標的核酸」および同等物は、全体的にまたは部分的に配列決定または再配列決定されるべきである配列領域に、並びに実際に1つ以上の相補的切断反応にかけられる核酸材料に該当する。
用語「基準核酸配列」、「関連配列」、「既知配列」および同等物は、その配列が、先に決定され、そしてそれが標的に対応する核酸領域に該当する。基準および標的配列は、同一であるか、または異なっていると見なされ得る。多くの使用法で、数種の異なる配列変動は、基準として利用できる。標的配列とその基準配列との間の差は、簡単(例えば、単独ヌクレオチド置換、欠失および挿入;マイクロサテライト多型)または複雑(例えば、多ヌクレオチドの置換、挿入および欠失)であり得る。特定の状況で、だれも、もしあれば、どの基準配列に、標的核酸が対応するかを先立って知ることができない。このような条件で、相互に関係する標的配列は、一般的に、(より)大きな基準配列の部分に、および/または複数の異なる基準の内の1つに対応する。
用語「明瞭な」、「独特の」、「明白な」、および同等のものは、単独配列変動または配列変動の組合せだけが、観察された質量スペクトル変化を説明できることを示すために使用される。
ここで使用される場合、用語「相補的(切断)反応」、「相補的切断」および同等のものは、可変の特異性〔例えば、緊縮または弛緩したモノ−およびジ−ヌクレオチド特異性;試薬の組合せを用いた消化;部分的切断〕によって特徴づけられる標的核酸消化に、および/または標的配列の消化選択的形態〔例えば、相補的(+)および(−)鎖;修飾されたサブユニットの組込み;標的配列の可変部分の分析〕に該当する。
ここで使用される場合、用語「転写産物」および「転写」は、RNAポリメラーゼの手段による核酸ポリマーの合成に該当する。正規のサブユニット(2′−OH基を有する)に加えて、転写産物は、非正規の基質(2′−位置に水酸基以外の任意の他の置換基を有する)を組込み得る。正規および非正規の基質は、追加の修飾を含み得る。
ここで使用される場合、用語「遺伝子型決定」は、全てとして生物により受継がれた特定の集合の対立遺伝子であるか、または目的の特定の遺伝子座で見られる対立遺伝子の型である遺伝的構築を決定することに該当する。
ここで使用される場合、用語「発現プロファイリング」は、規定の条件の集合の下、規定の時間、規定の細胞または細胞の集団のmRNA発現プロファイルを決定するための(複数の)方法に該当する。
ヌクレオチドは、以下のとおり称される。リボヌクレオチド三リン酸は、NTPまたはrNTPと称される;Nは、特定のリボヌクレオチドを示すA、G、C、Uまたはm5Uであり得る。同様に、デオキシヌクレオシド・三リン酸は、Nが、A,G、C、T、またはUであり得るdNTPとして示される。本明細書を通して、モノマーのヌクレオチド・サブユニットは、DNAまたはRNAに対する特定の文献なしにA,G,C、またはTとして示される。必要である場合、ヌクレオシド・一リン酸の特性は、リボヌクレオチドに該当するU、m5U、CMP、およびUMPのようなより特定の略号の使用によって、そしてデオキシヌクレオチドを示すためにdC、dU、dCMP、dUMPおよびdTMP明らかにされる。Tが、m5Uのための選択的名称ではないことに注目すべきである。
非整列の集合の特異的切断断片を介した配列決定
本発明の方法は、断片−ラダーを作製することなしに、規定の標的配列で、すなわち、1つの共通終止点を共有する断片の繰込まれた集合で、位置ごとに相互関連を可能にする。その方法は、部分的に、1つ以上の標的核酸を、相補的モノヌクレオチド−および/またはジヌクレオチド−特異的切断の集合にさせることを特徴とし、その産物は、質量分析(MS)によって分析される。本発明による好ましい方法は、2つまたはそれ以上の分離反応の方法によって各ヌクレオチドでの1つ以上の標的核酸の特異的切断を包含する。本明細書に記述されたもののようなモノヌクレオチド−およびジヌクレオチド−特異的切断反応で得られる消化産物は、モノヌクレオチドから数十のヌクレオチドの断片までの範囲にあり、そして特に、MSによる分析に十分に適している。本発明のこの態様は、最近のMS作用の下で断片−ラダーを分析する時に出合った短い読取り長の技術的制限を克服する。その方法で得られた質量スペクトルは、配列の簡単な読取りを供しなかった。本明細書に提供されるコンピューター処理のアプローチ法は、関連した基準配列について知られるか、または推定されるもので得られたスペクトルの比較分析を可能にする。
本発明の方法は、断片−ラダーを作製することなしに、規定の標的配列で、すなわち、1つの共通終止点を共有する断片の繰込まれた集合で、位置ごとに相互関連を可能にする。その方法は、部分的に、1つ以上の標的核酸を、相補的モノヌクレオチド−および/またはジヌクレオチド−特異的切断の集合にさせることを特徴とし、その産物は、質量分析(MS)によって分析される。本発明による好ましい方法は、2つまたはそれ以上の分離反応の方法によって各ヌクレオチドでの1つ以上の標的核酸の特異的切断を包含する。本明細書に記述されたもののようなモノヌクレオチド−およびジヌクレオチド−特異的切断反応で得られる消化産物は、モノヌクレオチドから数十のヌクレオチドの断片までの範囲にあり、そして特に、MSによる分析に十分に適している。本発明のこの態様は、最近のMS作用の下で断片−ラダーを分析する時に出合った短い読取り長の技術的制限を克服する。その方法で得られた質量スペクトルは、配列の簡単な読取りを供しなかった。本明細書に提供されるコンピューター処理のアプローチ法は、関連した基準配列について知られるか、または推定されるもので得られたスペクトルの比較分析を可能にする。
本発明による切断断片の非指示集合に基づいた配列変動を検出およびマッピングする能力は、種々の相補的部位特異的反応の組合せで部分的にある。例えば、本発明の実施に有用な1つの切断模式図は、モノヌクレオチド−特異的リボヌクレアーゼ−T1(RNアーゼ−T1、G−特異的)およびRNアーゼ−U2(A−特異的;この酵素の限定的特異性は、認識され、そして下で詳述される)を利用する。標的核酸におけるプリン(A/G)およびピリミジン(C/T)の両方が、標的核酸の2つの相補的鎖のRNAコピーを、両方の酵素で切断することにより試験できる。ただ単独モノヌクレオチド特異的反応により生成される断片のMS分析は、ほとんどの配列変動の存在を検出するが、しかし本質的にヌクレオチドに影響を及ぼすものである突然変異の少数だけが、局在化もされる。本発明の方法は、規定の配列中の4つの塩基の各々を試験するので、12個の可能性のあるヌクレオチド置換の各々は、1つの切断部位の損失および別の切断部位の混入獲得を生じる。この概念は、仮定的な標的核酸の2つの相補的転写産物でのRNアーゼ−T1およびRNアーゼ−U2切断反応について表Iで例示される。転位は、(+)または(−)鎖のいずれかのRNアーゼ−T1およびRNアーゼ−U2切断パターンの両方に影響を及ぼす。表1に見ることができるとおり、全ての塩基転換は、転写産物の両方の鎖の切断パターンを変化する:それらは、両方の鎖でのRNアーゼ消化、または1つの鎖のT1消化および相補的鎖のU2消化のいずれか1つに影響を及ぼす。2つの切断パターンを改変することに加えて、各単独ヌクレオチド置換は、残りの2つの消化反応(表I)の各々で1つの断片の分子の質量にも影響を及ぼす。結論として、本発明の相補的切断反応は、高度の固有の重複性を生じる。各ヌクレオチド置換は、基準スペクトルに関して最大10の差(データ点)で潜在的に結合する。切断部位の損失および獲得は、3つのピークの消失および出現の両方に関連する;2つの別のピークは、質量差の結果として移行を受ける。実際には、CおよびU(T)の間の1Da質量差は、情報の明らかな量の損失を生じ得る(表I)。さらに詳細には、G−およびA−特異的切断反応で、C/U転位は、見落とされる一方で、観察される質量差は、特定の塩基転換で明瞭に割当てられないかもしれない。しかし、RNA標的配列の分析に向けられる本発明の好ましい方法では、その方法は、いっそう好ましい質量差を示すCおよび/またはU類似体を利用し、したがって特定の塩基転換に対する質量差の明瞭な割当てを可能にする。実施例1および表Iは、5−メチルウリジンが、このような有用な類似体の例であることを示す〔m5U;R.I.ケミカル、カリフォルニア州オレンジ;インビトロ転写反応間のm5UTPの組込みについて、Hacia J.ら、Nucleic Acids Res. 26巻:4975-4982頁(1998年)も基準〕。
図1Aは、実施例の方法で、p53遺伝子のエキソン5の120−ヌクレオチドセグメント、並びに各鎖のRNAコピー上のRNアーゼ−T1およびRNアーゼ−U2によって生成される消化産物の図面表現を示す。図1Bは、別の例示の配列から誘導される塩基特異的断片のサイズ分布を表し、そしてモノ−、ジ−およびトリ−ヌクレオチドが、大きな消化産物より相当多いことを例示する。この分布は、平均長の4つのヌクレオチドを伴う断片を生成するモノヌクレオチド特異的切断反応について予測される。サイズ分布と対照的に、オリゴヌクレオチドが、仮定できる異なる分子の質量の数は、断片のサイズとともに迅速に増加する。消化産物の制約された組成物(例えば、RNアーゼ−T1の場合に1つのGのみ)のため、モノ−、ジ−およびトリ−ヌクレオチドの分子の質量の数は、それぞれ、1、3および6に限定される。その結果、モノ−、ジ−およびトリ−ヌクレオチドは、それらの数が、制限された質量空間を越えるので、本発明の方法にしばしば情報を与えない。図1Aは、標的配列の特定の部分で、切断反応の内の1つが、認識ヌクレオチドの過剰表現のため、多くの小型断片を産生し、そして、その結果、実際には情報をなんら生じないことを例示する。しかし、本発明の方法を用いて、この問題は、他の消化により同じ領域から誘導される断片(表現されたヌクレオチド下で相互に関連する)が、対応して大きいことを確かめる4つの反応の相補的特性によって最小限にされる。これは、本発明の方法の基本的寄与を示す。4つの切断反応の各々は、特定の突然変異についての情報(表I基準)を得て、そして一般にこの情報における重複性は、情報の一部が、上に記述されるとおりスペクトルから失われている場合でさえ、突然変異(特性および配置)の同定を可能にする。
したがって、本発明の方法は、完全にではないが、主に配列独立性であり、そして実質的に任意の変動の再配列決定を可能にする。本方法による診断的配列決定のコンピューターシュミレーション、さらに詳細には、RNアーゼT1およびU2を用いた、各鎖のRNAコピーの消化に関与するものは、三百個の塩基対までの標的配列について、全ての可能性のある単独ヌクレオチド置換の〜90%またはそれ以上が、34データ点に関連することを示した。1%未満の置換は、スペクトル変化を生じない。全ての可能性のある単独ヌクレオチド置換の95%以上は、特徴的なスペクトル変化を生じ、そしてしたがって、明瞭に同定され得る(実施例1および図3および4基準)。
要約すると、本発明による配列の推定は、「質量フィンガープリント」の相補的組にある情報、並びに関連対照配列についての先の知識の相互の関連に基づく。この規模のデータの間の関係は、明瞭な方法で、配列変動の存在、特性および位置を判断することを可能にする。それは、配列の誘導が、決定的には、正確性によらない方法の例、すなわち、質量測定の絶対値である。それは、むしろ、質量−移行の首尾一貫した集合および配列を特徴的に定義する切断部位の出現/消失である。本明細書で記述されるコンピューターシュミレーションは、5Daまたは0.1%を仮定したが、その数字は、技術の現状の装置で達成され得るものより十分に上である。さらに、正しい塩基組成物の決定は、高精度の測定〔例えば、抑制されていない配列の場合、そして測定が、0.01%またはそれ以上の精度を示す場合に5マー;Limbach P.、Mass Spectrom.Rev. 15巻:297-336頁(1996年)〕の場合にさえ短い断片に少なくとも限定されることが指摘されるべきである。1つ以上の断片に正しい塩基組成物を割当てる精密な質量測定に関与する、当技術分野における他の方法は、一般に、ほとんどの配列変動の検出を可能にするが、しかしそれらの明白なマッピングは許さない。これらの実験で、特定の実験的観察が、1つの特定の先に知られた配列変動に関連し、それにより選択的配列変動が、同じ結果を説明できるという事実を無視することが一般に推定された。
本発明は、以降に記述される数種の追加の態様および態様を包含し、そして特定の他の態様は、当業者に十分に明らかである。
標的核酸作製および断片化
(a)標的核酸の誘導および塩基特異性を用いた切断のアプローチ
核酸分子は、当技術分野において十分に知られている多数の手段のいずれかを用いて、特定の生物学的サンプルから単離でき、そして選択される特定の単離手段は、特定の生物学的サンプルに適切である。それに本発明の方法を行う単離標的核酸の適切な量を得るために、標的核酸の増幅は、必要であり得る。本発明に使用するための適切な増幅手段の例は、それに限定されないが、クローニング〔Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989年)〕、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)〔Newton C.R.およびGraham A.、PCR、BIOS Publishers(1994年)〕およびRT−PCRのような変形〔Higuchiら、Bio/Technology 11巻:1026-1030頁(1993年)〕および対立遺伝子特異的増幅(ASA)、鎖置換増幅(SDA)〔Terrance Walker G.ら、Nucleic Acids Res. 22巻:2670-77頁(1994年)〕、および転写に基づく工程が挙げられる。
(a)標的核酸の誘導および塩基特異性を用いた切断のアプローチ
核酸分子は、当技術分野において十分に知られている多数の手段のいずれかを用いて、特定の生物学的サンプルから単離でき、そして選択される特定の単離手段は、特定の生物学的サンプルに適切である。それに本発明の方法を行う単離標的核酸の適切な量を得るために、標的核酸の増幅は、必要であり得る。本発明に使用するための適切な増幅手段の例は、それに限定されないが、クローニング〔Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989年)〕、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)〔Newton C.R.およびGraham A.、PCR、BIOS Publishers(1994年)〕およびRT−PCRのような変形〔Higuchiら、Bio/Technology 11巻:1026-1030頁(1993年)〕および対立遺伝子特異的増幅(ASA)、鎖置換増幅(SDA)〔Terrance Walker G.ら、Nucleic Acids Res. 22巻:2670-77頁(1994年)〕、および転写に基づく工程が挙げられる。
本発明の1つの態様は、RNアーゼT1およびU2を用いた標的核酸の各鎖のRNAコピーの消化を特徴とする、核酸を配列決定(再配列決定など)する方法に向けられる。方法の利点の1つは、DNAに比較された、MALDI−MSにおける高い感度およびよりよい安定性を示すRNAの使用である〔Hahner S.ら、Nucleic Acids Res. 25巻:1957-1964頁(1997年)〕。全般的に、本発明のこの局面の第一工程は、PCRまたは逆転写、続いてPCR(RT−PCR)による標的核酸の増幅に関与する。これは、非アニーリング5′伸長としてプロモーター配列を組込む推定プライマーの対で達成され得る。第二の工程で、これらのプロモーターは、標的配列を含む隣接配列の特異的転写のために使用される。好ましくは、プロモーター配列は、小さく、そしてバクテリオファージT7、T3およびSP6から誘導されるもののような単独サブユニットコグネイトRNAポリメラーゼによるインビトロ転写を可能にする。本発明のこの態様での使用のために好まれるのは、転写の間に取込まれ得て、そして好ましい質量差を示すCおよび/またはU類似体〔例えば、m5U;前記〕である。異なるプロモーター配列を担持するPCRプライマーの使用は、2つの並行鎖特異的転写反応での両方の鎖のRNAコピーの生成を可能にする。両方の鎖も、同じプロモーター配列から転写され得る:これは、1つのプロモータータグ付プライマーのみとの2つの並行の増幅反応を必要とする。選択的には、インビトロ転写も、プロメガ(ウイスコンシン州マディソン)から入手可能な、適切なプロモーターを含むpGEM型ベクターのような特別の目的のベクター中でクローン化される配列から産生され得る。第三の工程は、さらに、標的配列における各所望の位置が、相互に関連するように、1つ以上の相補的モノヌクレオチド特異的RNアーゼ(例えば、RNアーゼ−T1およびRNアーゼ−U2)を用いた結果物であるRNA転写産物の処理を包含する。その工程における最終工程は、相補的切断反応から生じるRNA断片の質量分光測定的分析、および公知基準配列のもので得られるスペクトルの比較から構成される。
生物学的サンプルから得られる標的核酸を作製し、そして標的配列を、1集合の相補的モノヌクレオチド特異的切断反応にかける代替計画は、本発明の範囲内にもある。標的核酸は、DNA、cDNA、任意の型のRNA、DNA/RNAハイブリッド、またはモザイクRNA/DNA組成物のもの〔合成反応におけるリボ−およびデオキシリボヌクレオシド・三リン酸(rNTP/dNTP)の比により;Sousa R.およびPadilla R.、EMBO J. 14巻:4609-4621頁(1995年);Conrad F.ら、Nucleic Acids Res. 23巻:1845-1853頁(1995年)〕であり得る。標的配列は、酵素的合成の間または後のいずれかで導入される修飾であり得る。
一般に、各標的配列の異なる形態は、モノ特異的切断反応の相補的組を行い得るためにそのように製造される。切断反応は、酵素的に、および/または化学的に行われ得る。消化反応のモノヌクレオチド特異性は、標的核酸の構造で、または両方の組合せで、切断剤(例えば、RNアーゼT1)にある。例えば、RNアーゼA(C−およびU−残基の両方について特異的である)は、CまたはU残基でのリボヌクレオチドリボ核分解作用を遮断する基質配列の修飾によりモノ特異的にされ得る。U残基でのRNアーゼ切断は、理論的には、化学的修飾によって防止され得る〔Simoncsits A.ら、Nature 269巻:833-836頁(1977年)〕。リボースの2′−水酸基で修飾されたほとんどの注目されるものである、ヌクレオチド類似体の酵素的組込みは、本発明の実施に特に好ましい。多様なこのような類似体は、T7RNAポリメラーゼ;例えば、2′−フルオロ、2′−アミノ〔Aurup H.ら、Biochemistry 31巻:9636-9641頁(1992年)〕、2′−O−メチル〔Conrad F.ら、Nucleic Acids Res. 23巻:1845-1853頁(1995年)〕、ならびに2′−デオキシNTP〔Sousa R.およびPadilla R.、EMBO J. 14巻:4609-4621頁(1995年);Conrad F.ら、Nucleic Acids Res. 23巻:1845-1853頁(1995年)〕についての基質であることが示された。上の攻略法は、広範囲の消化でのGpNホスホジエステルバンドを切断すると言われるRNアーゼU2のような特定のRNアーゼの特異性を改善するためにも使用され得る〔Brownlee G.、「生化学および分子生物学における実験室技術」(Work T.S.およびWork E.編)、北オランダ、アムステルダム、199-200頁(1972年)〕。だた1つの特異的rNTPを組込み、そして特定の突然変異ポリメラーゼでまったく効率的に得られるモザイクDNA/RNA標的配列〔Sousa R.およびPadilla R.、EMBO J. 14巻:4609-4621頁(1995年);Gao G.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94巻:407-411頁(1997年);Bonnin A.ら、J.Mol.Biol. 290巻:241-251頁(1999年)〕は、アルカリ性処理により、またはRNアーゼ−Iのような非特異的RNアーゼを用いた消化により、非特異的切断を可能にする〔Meador J.ら、Eur.J.Biochem. 187巻:549-553頁(1990年)〕。
標的配列の選択的切断を得る選択的攻略法は、ホスホロチオエート化学を利用する。Rp立体配置でのホスホロチオエート・インターヌクレオシド連結を有するDNAおよびRNAポリマーは、容易に合成される〔Eckstein F.、Ann.Rev.Biochem.54巻:367-402頁(1985年)およびそこに引用される文献基準〕。このようなホスホロチオエート連結は、アルカリ化に続き特異的に加水分解され得る〔Gish G.およびEskstein F.、Nucleic Acids Symp. Ser. 253-256頁(1987年); Gish G.およびEskstein F.、Science 240巻: 1520-1522頁(1988年)〕。本発明のこの態様によるモノ−ヌクレオチド特異的断片化は、1つの特定のα−チオヌクレオチド三リン酸基質を利用する標的の合成を必要とする。いくつかのヌクレアーゼ(例えば、ヌクレアーゼP1)は、Rpホスホチオエートジエステルを加水分解できない;したがって、間接選択的切断(自然のホスホジエステルで)は、3つの異なるαS−dNTP(またはαS−rNTP)を組込む標的化合物遺伝子列で得ることができる。
(b)代替的相補的反応
本発明の配列決定法の作用は、以下の相互に関係した因子:(1)配列決定されるべき領域の長さ、(2)MS分析の分離能、および(3)ある程度の範囲まで、配列それ自身に依存すべき当業者により理解される。その結果、目的の領域が長いほど、消化産物の数が多くなり、分解能は、いっそう重大になる。さらに、配列決定されるべき領域の長さは、4つの塩基特異的断片化パターンのみに基づいて、明瞭にマッピングされえない単独ヌクレオチド置換の数に直接的に比例する(実施例1;図4)。いくつかの配列モチーフは、配列決定することが本質的に困難である。このような配列の例は、C1およびC2での突然変異が、それぞれ、C5およびC4での同じ型の突然変異と区別できないCTAGC1C2C3C4C5GATC(配列番号:15)である。別のこのような配列は、G1−>Aが、G3−>A突然変異と区別できないGAG1A2A3A4GAである;同様に、A2−>GおよびA4−>Gは、際立ち得ない。最終的に、4つのモノ−ヌクレオチド特異的切断は、複雑な配列変動を分析するのに不十分である可能性もある(下の検討基準)。したがって、最も好ましくは、本発明の実施としては、意図される領域の再配列決定攻略法のコンピューター補助シュミレーションが挙げられる。このようなシュミレーションおよび分析は、その配列での可能性のある問題の位置を示し、そしてこのような配列決定困難さを克服する対抗測定として、特定の追加の相補的切断反応の有用さを評価するために使用され得る。
本発明の配列決定法の作用は、以下の相互に関係した因子:(1)配列決定されるべき領域の長さ、(2)MS分析の分離能、および(3)ある程度の範囲まで、配列それ自身に依存すべき当業者により理解される。その結果、目的の領域が長いほど、消化産物の数が多くなり、分解能は、いっそう重大になる。さらに、配列決定されるべき領域の長さは、4つの塩基特異的断片化パターンのみに基づいて、明瞭にマッピングされえない単独ヌクレオチド置換の数に直接的に比例する(実施例1;図4)。いくつかの配列モチーフは、配列決定することが本質的に困難である。このような配列の例は、C1およびC2での突然変異が、それぞれ、C5およびC4での同じ型の突然変異と区別できないCTAGC1C2C3C4C5GATC(配列番号:15)である。別のこのような配列は、G1−>Aが、G3−>A突然変異と区別できないGAG1A2A3A4GAである;同様に、A2−>GおよびA4−>Gは、際立ち得ない。最終的に、4つのモノ−ヌクレオチド特異的切断は、複雑な配列変動を分析するのに不十分である可能性もある(下の検討基準)。したがって、最も好ましくは、本発明の実施としては、意図される領域の再配列決定攻略法のコンピューター補助シュミレーションが挙げられる。このようなシュミレーションおよび分析は、その配列での可能性のある問題の位置を示し、そしてこのような配列決定困難さを克服する対抗測定として、特定の追加の相補的切断反応の有用さを評価するために使用され得る。
1つのこのような測定は、標的領域を分割すること、および全体として標的領域を配列決定することよりもむしろ、サンプル核酸から2つまたはそれ以上(部分的に重複する)のセグメント(例えば、アンプリコン)を誘導することから構成される。長さを設定することに加えて、これは、組成物を越えてある程度の制御を発揮することを可能にする。これは、目的の領域が、二重にしたセグメントを含むときに生じる問題と相互に関係する。第二の測定は、上に記述されるような異なる分子質量を示す1つ以上の修飾ヌクレオチドを組込む標的断片に関与する1つ以上の選択的または追加の反応を行うことから構成される。当業者は、その多くが、有用であり、そして本発明の方法の酵素的手段で融和され得る質量修飾ヌクレオチド類似体の価値の存在を知っている。ヌクレオチド類似体は、多くの消化産物の質量に示唆的に影響し、したがって、必要とされる情報を示し得る明らかに異なるスペクトルを生じる。類似体Uおよびm5U〔前記〕は、これを例示する。シュミレーション研究(本発明をモデル化する)は、Uの使用は、m5Uで観察される特定の配列の不明確さを解消することを示す(データは示されず)一方で、全体的に、後者のヌクレオチド類似体は、相当に少ない配列不明確さを生じる(実施例1基準)。
別の選択は、相補的鎖における1つ以上の追加の反応から構成される。例えば、1つの鎖のG−特異的切断に比べて、相補的配列のC−反応は、他の質量差によって特徴づけられる異なる集合の断片を生じる。したがって、標的配列の相補的鎖の包含反応の効果は、ヌクレオチド類似体の使用に類似する。
本発明により供され、そして上に例示される潜在的問題を取除く上で有用であるさらに別の選択としては、切断の選択的特異性を示す反応を使用することが挙げられる。例えば、部分的塩基特異的切断は、反応条件を変化させることによるか、または切断性および未切断性(例えば、2′−修飾;前記)形態の1つの特定のヌクレオチドが、任意に起こる特別に作製された標的の使用によって達成され得る。選択的に、部分的塩基特異的切断の代わりに、より大きな厳密性によって特徴づけられる1つ以上の特異的消化が行われる(例えば、ジヌクレオチド−または弛緩したジヌクレオチド特異性;下を基準)。制限酵素を用いた、二本鎖DNA形態で標的配列の消化は、本発明によって供されるさらに別の選択である。標的核酸の二重消化(すなわち、2つの塩基特異的切断の組合せ)も、単独、または本発明の他の消化法と組合せて、本発明の範囲内で情報を与える選択を表す。
本発明の範囲内の別の情報を与える選択は、切断された標的配列の分析に関与する。さらに特別に、例えば、特定の3′−デオキシヌクレオチド基質の組込みによって製造される鎖終結配列の切断は、全長の標的核酸のスペクトルと比較した場合に、別の断片を含むスペクトルを生じ、そして結果として、特定の場合に、配列変動のいっそう明瞭な補償を可能にする追加の情報を提供する。このアプローチ法は、複雑な配列変動を含む長さでの消化産物または領域の特徴づけに特に有用である。
(c)選択的な相補的反応:モノヌクレオチドより大きな特異性によって特徴づけられた切断
さらに別のそれの実施態様では、本発明の方法は、ジヌクレオチド−または緩和ジヌクレオチド−特異性により特徴づけられる核溶解工程を含む。結果物である消化産物のサイズの分布が、モノヌクレオチド特異的切断により生成される4ヌクレオチドの平均長を示す断片より、MSによる分析にさらに適しているので、このような切断の緊縮は、長い標的配列の分析を促進する。本発明のこの態様で有用であるのは、例えば、Mead D.らの国際公開公報第94/21663号(PCT/US94/03246)によって記述されるもののようなジヌクレオチド配列でDNAを切断する能力のある制限エンドヌクレアーゼ試薬である。本発明の実施に有用であるピリミジン−アデノシン(CAおよびUA)バンドを優勢に加水分解するRNアーゼも、同定された〔大腸菌RNアーゼ−M、Cannistraro V.およびKennell D.、Eur.J.Biochem. 181巻: 363-370頁(1989年);サッカロマイセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)から単離されたエンドリボヌクレアーゼでのように、Stevens A.ら、J.Bacteriol. 164巻: 57-62頁(1985年);およびエンテロバクター属(Enterobacter sp.)でのように、Marotta C.ら、Biochemistry 12巻: 2901-2904頁(1973年)により記述されるC−リボヌクレアーゼ〕。本発明に開示および例示されるとおり、これらの酵素の特異性は、必要とされる場合、本質的に、一方ではdUMP(またはdTMP)を、そして他方ではdCMPを組込む標的核酸の使用によって、CA−またはUA−結合に制限される可能性がある。
さらに別のそれの実施態様では、本発明の方法は、ジヌクレオチド−または緩和ジヌクレオチド−特異性により特徴づけられる核溶解工程を含む。結果物である消化産物のサイズの分布が、モノヌクレオチド特異的切断により生成される4ヌクレオチドの平均長を示す断片より、MSによる分析にさらに適しているので、このような切断の緊縮は、長い標的配列の分析を促進する。本発明のこの態様で有用であるのは、例えば、Mead D.らの国際公開公報第94/21663号(PCT/US94/03246)によって記述されるもののようなジヌクレオチド配列でDNAを切断する能力のある制限エンドヌクレアーゼ試薬である。本発明の実施に有用であるピリミジン−アデノシン(CAおよびUA)バンドを優勢に加水分解するRNアーゼも、同定された〔大腸菌RNアーゼ−M、Cannistraro V.およびKennell D.、Eur.J.Biochem. 181巻: 363-370頁(1989年);サッカロマイセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)から単離されたエンドリボヌクレアーゼでのように、Stevens A.ら、J.Bacteriol. 164巻: 57-62頁(1985年);およびエンテロバクター属(Enterobacter sp.)でのように、Marotta C.ら、Biochemistry 12巻: 2901-2904頁(1973年)により記述されるC−リボヌクレアーゼ〕。本発明に開示および例示されるとおり、これらの酵素の特異性は、必要とされる場合、本質的に、一方ではdUMP(またはdTMP)を、そして他方ではdCMPを組込む標的核酸の使用によって、CA−またはUA−結合に制限される可能性がある。
緊縮または緩和ジヌクレオチド特異的切断は、標的核酸の酵素的および化学的修飾を通して操作され得る。限定されない例として、目的の核酸の転写産物は、通常およびα−チオ−基質の混合物で合成され得て、そしてホスホロチオエート・インターヌクレオシド連結は、アルキルハライド(例えば、インドアセタミド、インドエタノール)または2,3−エポキシ−1−プロパノールのような試薬を用いたアルキル化によって引き続き修飾され得る。このような修飾によって形成されるホスホトリエステル結合は、RNアーゼのための基質であると予測されない。この手段を使用して、どの基質が、標的標品のためにα−チオ形態で使用されるかにより、RNアーゼ−T1のようなモノ特異的RNアーゼに、4つの可能性のあるGpN結合を除き任意の3つ、2つまたは1つを切断させ得る。本発明の実施に有用なジヌクレオチド特異的試薬の範囲は、さらに、RNアーゼ−U2およびRNアーゼ−Aのような追加のRNアーゼを使用することによってさらに伸長され得る。RNアーゼ−Aの場合には、特異性は、上に記述されるとおり2′−修飾形態の適切な基質の酵素的組込みを通して、CpNまたはUpNジヌクレオチドに限定され得る。例えば、CpGジヌクレオチドについて特異的なRNアーゼ−Aを作製するために、転写産物(標的)は、以下の基質:αS−dUTP、αS−CTP、αS−ATP、およびGTPを使用して製造される。したがって、本明細書に記述される指示方法を用いて、16個のジヌクレオチド特異性全てを操作することが可能である。しかし、本明細書に記述される全てではないジヌクレオチド特異的試薬は、標的核酸の相補的鎖が、分析に含まれる場合、必要とされる。
上に概説される攻略法は、反復ヌクレオチドについて特異的にされる(または上に記述されたとおり特異的にされる)ホモポリマー区域(A、G、CまたはTの一続き)内の切断を防止することを可能にする。実際に、特定のαS−NTPの組込み、続いてアルキル化は、そのヌクレオチドの反復内の切断を選択的に防止し、それにより反復で続くヌクレオチドの3′−側で起こる切断を可能にする。実施例1で記述されるものに類似するシュミレーション研究は、特に有用な攻略法としてこれを同定した。RNアーゼ−T1およびRNアーゼ−U2を用いた2つの相補的鎖の消化による配列分析は、αS−GMPおよびαS−AMPが、個々の転写産物に組込まれるときに、多様な突然変異の数で5から10倍の減少を生じた。これらの研究も、反復内の切断の選択的遮断が、平均長の消化産物における比較的小さな増加を付随し、それにより情報の相当に少ない損失を生じることを示唆する。
当業者も、本明細書に記述される断片化法の特定の態様で変動または代替を容易に認識する。本発明によって包含されるこのような代替または変動は、それに限定されないが、
1.類似のまたは代替の特異性を示す他のまたは別のRNアーゼ(単独または組合せで)の使用;
2.本発明の方法と比較して有用な特徴を示す突然変異体または化学的に修飾されたRNアーゼの使用〔例えば、自然のホスホジエステル基質よりホスホロチオエート類似体を好むRNアーゼT1突然変異体については、Loverix S.ら、Nature Struct. Biol. 5巻: 365-368頁(1998年)基準;さらに、化学的に修飾されたRNアーゼを用いた制限消化の生成については、Contreras R.およびFiers W.、FEBS Lett. 16巻: 281-283頁(1971年)基準〕;
3.代替イソタイプを組込むヌクレオチドを含めた、異なる質量および/または反応性を示す他のヌクレオチド類似体の使用;
4.化学的〔Maxam A.およびGilbert W.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74巻:560-564頁(1977年);Richterich P.ら、Nucleic Acids Res.23巻:4922-4923頁(1995年)〕または酵素的のいずれかでの代替特異的断片化法が挙げられる。
1.類似のまたは代替の特異性を示す他のまたは別のRNアーゼ(単独または組合せで)の使用;
2.本発明の方法と比較して有用な特徴を示す突然変異体または化学的に修飾されたRNアーゼの使用〔例えば、自然のホスホジエステル基質よりホスホロチオエート類似体を好むRNアーゼT1突然変異体については、Loverix S.ら、Nature Struct. Biol. 5巻: 365-368頁(1998年)基準;さらに、化学的に修飾されたRNアーゼを用いた制限消化の生成については、Contreras R.およびFiers W.、FEBS Lett. 16巻: 281-283頁(1971年)基準〕;
3.代替イソタイプを組込むヌクレオチドを含めた、異なる質量および/または反応性を示す他のヌクレオチド類似体の使用;
4.化学的〔Maxam A.およびGilbert W.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74巻:560-564頁(1977年);Richterich P.ら、Nucleic Acids Res.23巻:4922-4923頁(1995年)〕または酵素的のいずれかでの代替特異的断片化法が挙げられる。
多重化反応
別の態様では、本発明の方法は、サンプル核酸中の少なくとも2つの非隣接領域の同時配列決定に向けられる。断片−ラダー(すなわち、共通終点を共有するネスト化集合の断片)を生成する伝統的配列決定法と対照的に、本明細書で概説される攻略法は、多重の配列決定のために同等に有用である。本発明による多重の配列決定は、一般に、標的核酸の選択領域の増幅に関与する。これは、増幅すべき標的核酸と隣接するかまたは共末端である専用のプライマー対のセットを用いることによって達成され得る。または、多重の標的核酸の製造は、サンプル核酸から誘導される制限断片の付随増幅を包含する。ある種のアプローチ法は、実施例5で示され、そして例示される。多重の配列決定の特別の場合は、二本鎖標的核酸の2つの相補的鎖の同時分析から構成される。
別の態様では、本発明の方法は、サンプル核酸中の少なくとも2つの非隣接領域の同時配列決定に向けられる。断片−ラダー(すなわち、共通終点を共有するネスト化集合の断片)を生成する伝統的配列決定法と対照的に、本明細書で概説される攻略法は、多重の配列決定のために同等に有用である。本発明による多重の配列決定は、一般に、標的核酸の選択領域の増幅に関与する。これは、増幅すべき標的核酸と隣接するかまたは共末端である専用のプライマー対のセットを用いることによって達成され得る。または、多重の標的核酸の製造は、サンプル核酸から誘導される制限断片の付随増幅を包含する。ある種のアプローチ法は、実施例5で示され、そして例示される。多重の配列決定の特別の場合は、二本鎖標的核酸の2つの相補的鎖の同時分析から構成される。
さらに別の態様では、本発明の方法は、少なくとも2つの生物学的サンプルの対応の標的領域(類)の同時配列決定のために使用され得る。類似の標的核酸のプールの内1つでの配列変動は、ゲル電気泳動の手段により従来の配列ラダーを分析するときに見落とされ得る。本発明の方法で、配列変動は、原則として、種々の相補的質量スペクトルにおける1つ以上の固有のピークを生じる。この特性は、野生型対立遺伝子に対する突然変異体の明らかに低い比で、突然変異の検出を可能にすべきであり、したがって、大きなプールの分析を可能にする。貯蔵する能力は、本発明の方法を、規定の集団における特定の標的領域を越えて配列変動の発見のために有用にさせる。この使用法について、全般的に、5−10個のサンプルを合せ得る。突然変異が、先に同定された場合には、相当に多くのサンプル、例えば数十を合せ得る。本発明の方法を、サンプルプールの分析のために有用にさせる特徴は、その方法を、ヘテロ接合性のサンプル(すなわち、2つの対立遺伝子の当モル混合物)の分析にとって有用にさせる。
質量分光測定法
本発明の実施に有用である質量分光測定法としては、マトリックス介助レーザーデソープションイオン化(MALDI)およびエレクトロスプレー(ES)のようなイオン化技術が挙げられる。これらのイオン源は、質量分光測定計の当技術分野で知られるとおり、飛行時間型(TOF;線状またはリフレクトロン配置)、単または多重の四重極、フーリエ形質転換イオンサイクロトロン共鳴(FTICR)、イオントラップ、またはこれらの組合せのような種々の分離/検出フォーマットに適合され得る。〔Limbach P.、Mass Spectrom.Rev.15巻:297-336頁(1996年);Murray K.、J.Mass Spectrom.、31巻:1203-1215頁(1996年)〕。
本発明の実施に有用である質量分光測定法としては、マトリックス介助レーザーデソープションイオン化(MALDI)およびエレクトロスプレー(ES)のようなイオン化技術が挙げられる。これらのイオン源は、質量分光測定計の当技術分野で知られるとおり、飛行時間型(TOF;線状またはリフレクトロン配置)、単または多重の四重極、フーリエ形質転換イオンサイクロトロン共鳴(FTICR)、イオントラップ、またはこれらの組合せのような種々の分離/検出フォーマットに適合され得る。〔Limbach P.、Mass Spectrom.Rev.15巻:297-336頁(1996年);Murray K.、J.Mass Spectrom.、31巻:1203-1215頁(1996年)〕。
本発明の方法は、一般に、複合体オリゴヌクレオチド断片混合物の分析を必要とするので、主に、単独に負荷される分子を生じるMALDIアプローチ法は、明らかな多重の負荷が、さらにスペクトルのピークの数を増加するESより好ましい。デソープション/イオン化工程については、多数のマトリックス/レーザー組合せが、使用され得る。
簡便対複雑な変動の配列決定
別の態様では、本発明の方法は、関連基準核酸との比較で、単独ヌクレオチド置換以外の配列変動を組込む1つ以上の標的核酸の診断的配列決定に向けられる。このような配列変動は、1つ以上のヌクレオチドの欠失または挿入、ならびに多重ヌクレオチドの置換に関与し得る。
別の態様では、本発明の方法は、関連基準核酸との比較で、単独ヌクレオチド置換以外の配列変動を組込む1つ以上の標的核酸の診断的配列決定に向けられる。このような配列変動は、1つ以上のヌクレオチドの欠失または挿入、ならびに多重ヌクレオチドの置換に関与し得る。
単独ヌクレオチド置換に類似して、単独ヌクレオチドの挿入または欠失は、本発明の方法を用いたその分析が単純である、簡単な配列変動を表す。これらの型の配列変動の両方は、4つの相補的モノヌクレオチド特異的断片化パターンにおける(最大9つの)変化の特徴的な集合と関連する。他の配列決定法に類似する本発明の方法は、それが、同一のヌクレオチドの一続きにある1つのヌクレオチドに関するときの挿入または欠失の点を明瞭に配置できえないと解釈される。しかし、これは、観察されたスペクトルが、本発明の実施による特異的配列変動に特徴的な方法で関連するかどうかのコンピューター補助分析を行うときに、考慮に入れられ得る。
マイクロサテライトDNA〔VNTR(縦列繰返し配列数多様性)とも称される〕またはSSR(簡単な配列繰返し)の分析は、その分析が、本発明の方法を用いて容易に達成される、特別の場合を表す。多重ヌクレオチドは、VNTRまたはSSRに関与するが、公知基準配列の基準でのスペクトルの変化の解釈は、むしろ簡単であり、そして多型(反復単位の改変数)は、容易に特徴づけられ得る。
本発明の方法は、多重ヌクレオチドが、挿入、欠失、置換またはそれらの組合せのいずれかを通して影響されるもののようないっそう複雑な配列変動を分析するためにも使用され得る。多数の二重および三重突然変異対の分析は、実施例3dで下に記述される。標的核酸内の多重置換は、特徴的数のスペクトル変化によって付随されるとも予測される。この数は、置換が、隣接しているか、または分離されるかのいずれかに、ならびに突然変異が分離される場合に介在配列に依る。少なくとも1つのA、G、CおよびTを含む配列によって単離される単独ヌクレオチド置換は、各々、上に概説されるとおり10個のスペクトル差に関連する。一般に、複雑な配列変動の分析は、(巧妙な)コンピューター処理のアプローチ法を必要とする。1つの可能性のあるアルゴリズムは、配列変動が確認される短い領域で全ての可能性のある配列に基づいて生成されるものと、実験的に観察されたスペクトルの比較に関与する。このようなアルゴリズムは、配列変動または、あいまいさの場合には、様々のマッチング配列を同定する。この手段は、本発明の方法が、標的核酸の短い領域のデノボ配列決定にかけられ得ることを示す。実際に、実験的観察が、境界を設定するだけでなく、アルゴリズムが、挿入または欠失と考えない必要があるように変異体領域の長さを定義することも確認される。特定のヌクレオチドの不在のように、追加の実験的に誘導された情報は、さらに、アルゴリズムが調査すべき配列空間を制限できる。特定の使用法では、複雑な配列変動は、先に知られている可能性があり、したがって、基準配列の集合の一部であり得る。このような場合に、実験的に観察されたスペクトルは、基準配列について推定されるものに直接関連し得る。しかし、このような関連が特徴的であるかどうかをコンピューター処理する必要がなおある。先の知識の利点は、実験的アプローチ法は、流出情報が、実際に、潜在的に生じる複雑な配列変動に特徴的に関連するように、適合され得ることである。
コンピューター処理アルゴリズム
本発明は、部分的に、本明細書に示されるとおり1集合の相補的切断反応で得られるスペクトルのコンピューター分析、およびこれらのデータと、公知基準配列からコンピューターで推定されたスペクトル変化の比較が、配列変動の存在、特性および位置の明瞭な決定における重要な工程であるという洞察力に支えられる。さらに詳細には、本明細書に示される実験を模擬するコンピューターのアプローチ法は、特徴的関係が、得られたスペクトルと、特定の配列変動との間に存在するかどうかを決定することが必要である。したがって、本発明の1つの態様は、コンピューターアルゴリズムを活用する方法、または標的核酸および基準核酸の間の1つ以上のヌクレオチド差から生じるスペクトルの差をコンピューター処理する能力のある方法を意図し、方法およびアルゴリズムは、基準核酸およびそれの配列変動(すなわち、ヌクレオチド差を示す標的核酸)に様々の塩基特異的切断をかけて、オリゴヌクレオチド断片を生成することを特徴とし、それにより各オリゴヌクレオチド断片の質量をコンピューター処理し、基準核酸から得られるオリゴヌクレオチド断片の質量スペクトル、および塩基特異的切断反応の各々についてのそれらの配列変動を生じ、そしてこれらのコンピューター処理で誘導された質量スペクトルを、異なる塩基特異的切断反応で実験的に得られたスペクトルと適合させる。
本発明は、部分的に、本明細書に示されるとおり1集合の相補的切断反応で得られるスペクトルのコンピューター分析、およびこれらのデータと、公知基準配列からコンピューターで推定されたスペクトル変化の比較が、配列変動の存在、特性および位置の明瞭な決定における重要な工程であるという洞察力に支えられる。さらに詳細には、本明細書に示される実験を模擬するコンピューターのアプローチ法は、特徴的関係が、得られたスペクトルと、特定の配列変動との間に存在するかどうかを決定することが必要である。したがって、本発明の1つの態様は、コンピューターアルゴリズムを活用する方法、または標的核酸および基準核酸の間の1つ以上のヌクレオチド差から生じるスペクトルの差をコンピューター処理する能力のある方法を意図し、方法およびアルゴリズムは、基準核酸およびそれの配列変動(すなわち、ヌクレオチド差を示す標的核酸)に様々の塩基特異的切断をかけて、オリゴヌクレオチド断片を生成することを特徴とし、それにより各オリゴヌクレオチド断片の質量をコンピューター処理し、基準核酸から得られるオリゴヌクレオチド断片の質量スペクトル、および塩基特異的切断反応の各々についてのそれらの配列変動を生じ、そしてこれらのコンピューター処理で誘導された質量スペクトルを、異なる塩基特異的切断反応で実験的に得られたスペクトルと適合させる。
1つの好ましい態様では、コンピューターアルゴリズムは、基準核酸の全ての可能性のある単純なヌクレオチド変動のスペクトルを体系的にコンピューター処理するように設計され、それに限定されないが、全ての可能性のある単純なヌクレオチド置換、欠失および挿入を含む。生きた生物で見られる遺伝的多様性のほとんどは、単独ヌクレオチド変動に関与し、実験的に観察された配列変動は、本発明の方法およびアルゴリズムで同定され得て、1つ以上の適合は、観察されたスペクトルおよびコンピューターで誘導された質量スペクトルの間で見出され得る。特徴的適合が見出される場合には、標的核酸における配列変動は、特徴的である。1つ以上の適合が、スペクトルの間で見出されるとき、配列変動は、明瞭に樹立されえない。
様々のアプローチ法が、それに限定されないが、完全な基準配列でのコンピューター分析を行うこと、または例えばスライディングウインドーを用いて、基準配列のセグメントにおける一連のコンピューター分析を行うことのようなコンピューター分析を行うために使用され得ることは、当業者に明らかである。後者のアプローチ法は、基準配列の様々の部分で起こる様々の配列変動の同定を可能にする。
別の態様では、本発明の方法およびコンピューターアルゴリズムは、基準配列の限定セグメントにおける全ての可能性のあるヌクレオチド配列を調査するように設計される。このような方法およびアルゴリズムは、先行のアプローチ法が、適合を付与するのに失敗した場合に使用され得て、それにより配列変動は、基準核酸における単純なヌクレオチド変動に対応しないことが示される。これは、1つ以上の切断産物が、多重のヌクレオチド改変を含む場合であり得る。その後、これらの切断産物に対応する領域は、全ての可能性のある配列順列についてのスペクトルをコンピューター処理し、そしてマッチング配列を決定することによって、さらに調査され得る。十分なコンピューター処理力を付与して、このような方法およびアルゴリズムは、本発明により生成される質量スペクトルデータを用いてデノボ配列決定を行うために使用され得ることが予想される。
本発明の方法の適用
本発明の方法は、それに限定されないが、植物、動物、真菌、細菌およびウイルスを含めた多様な生物学的源から核酸を迅速に、そして正確に再配列決定することに特に十分に適している。再配列決定は、関連基準配列に比べて、先に知られた、ならびに未知の配列変動(例えば、突然変異および多型)の両方の検出およびマッピングを含む。断片ラダーの従来のゲル電気泳動分析に関して最も注目すべき区別は、一般に、各特定の配列(変動)が、はっきりしていて、そして特徴的な集合の(質量)ピークを生じることである。この特性は、本発明の方法を、ヘテロ接合性サンプルの信頼性のある評価、単独の生物学的サンプルから多重の標的領域の同時配列決定(すなわち、多重化)、ならびに様々のサンプルからの類似の領域の同時分析(すなわち、プール)のために有効にさせる。個々のサンプルの貯蔵分の使用は、集団における先に未知の配列変動の費用的に有効な同定を可能にするに違いない。本発明の特性のこの態様は、本発明を、医療および公衆健康の研究に価値あるものにする。非常にしばしば、このような研究は、細胞的に、そして遺伝的にヘテロ接合性であり、そしてその結果、野生型対立遺伝子に対する突然変異体低い比で突然変異を検出できるアッセイを必要とするサンプル(例えば、唾液、血液、綿棒(swabs)、パラフィン包埋組織、生検材料)に依る。
本発明の方法は、それに限定されないが、植物、動物、真菌、細菌およびウイルスを含めた多様な生物学的源から核酸を迅速に、そして正確に再配列決定することに特に十分に適している。再配列決定は、関連基準配列に比べて、先に知られた、ならびに未知の配列変動(例えば、突然変異および多型)の両方の検出およびマッピングを含む。断片ラダーの従来のゲル電気泳動分析に関して最も注目すべき区別は、一般に、各特定の配列(変動)が、はっきりしていて、そして特徴的な集合の(質量)ピークを生じることである。この特性は、本発明の方法を、ヘテロ接合性サンプルの信頼性のある評価、単独の生物学的サンプルから多重の標的領域の同時配列決定(すなわち、多重化)、ならびに様々のサンプルからの類似の領域の同時分析(すなわち、プール)のために有効にさせる。個々のサンプルの貯蔵分の使用は、集団における先に未知の配列変動の費用的に有効な同定を可能にするに違いない。本発明の特性のこの態様は、本発明を、医療および公衆健康の研究に価値あるものにする。非常にしばしば、このような研究は、細胞的に、そして遺伝的にヘテロ接合性であり、そしてその結果、野生型対立遺伝子に対する突然変異体低い比で突然変異を検出できるアッセイを必要とするサンプル(例えば、唾液、血液、綿棒(swabs)、パラフィン包埋組織、生検材料)に依る。
本発明の方法論の別の利点は、診断的配列決定が、先に同定された突然変異または多型の明瞭な評価のために有用な特性である、標的核酸における特定の位置に限定されるように(相補的切断反応の数を減少させることによって)変えられ得ることである。本明細書に記述される方法は、例えば、最近知られる3000以上の遺伝的疾病(例えば、血友病、サラセミア、デュセンヌ型筋ジストロフィー、ハンチントン病、アルツハイマー病および嚢胞性線維症)またはまだ同定されていない遺伝的欠陥のいずれかを診断するために使用され得る。さらに、特定のDNA配列は、個体の、糖尿病、硬化症、肥満、種々の自己免疫疾病および癌(例えば、結腸直腸、胸部、卵巣、肺の)のような多数の疾病または症状のいずれかの素因になり得る。生物学的サンプルによって、遺伝的疾病または遺伝的素因についての診断は、本発明の方法を用いて出生前または後のいずれかに行われ得る。本発明の方法を用いた感染性生物から誘導される核酸の再配列決定は、病原性の概念を示し得て、そして薬剤耐性を引起す変動を同定するために有用でもあり得る。例えば、ヒト免疫欠損ウイルス(HIV)のプロテアーゼ/逆転写酵素領域における突然変異は、プロテアーゼおよび逆転写酵素(RT)阻害剤の抗ウイルス活性に対する感度が減少したことに関与した。したがって、これらのウイルス性ドメインをコードする核酸の再配列決定は、疾病進行を監視することに特別の目的のあるものである(実施例1基準)。同様に、本発明による配列決定は、特定の細菌の抗生物質耐性表現型を決定するために有用であり得る〔例えば、マイコバクテリウム・ツバキュロシス(Mycobacterium tuberculosis);Head S.ら、Mol.Cell.Probes 13巻:81-87頁(1999年);Troesch A.ら、J.Clin.Microbiol. 37巻:49-55頁(1999年)〕。
他の態様では、本発明の方法は、標的核酸の同定および分類に向けられる。本発明による分析は、配列決定に基本的に等しいレベルで核酸を特徴づける。したがって、相互に関連した未知配列は、得られた質量スペクトルを、複数の基準配列について公知または推定されたものと比較することによって、明瞭に同定され得る。この実施で、適合する基準データベース配列を有しない新規配列も、見出され得る。発現プロファイング(すなわち、cDNAライブラリーの分析)についての方法の使用、ならびに全ゲノム配列決定は、それぞれ、実施例6および7で例示される。他の使用法としては、同定または遺伝(例えば、父系または母系)の決定を含む。
本発明を実施するためのキット
サンプル中の1つ以上の標的核酸の診断的配列決定のためのキットも提供される。好ましい態様では、このようなキットは、1つ以上の基準核酸、配列特異的切断プロトコールのための種々の試薬、およびコンピューターアルゴリズムを包含する。このようなキットは、選択的に核酸増幅試薬をも含み得る。さらに、キットは、それに限定されないが修飾ヌクレオチド基質を含めた、修飾核酸の製造のための試薬を含み得る。キットは、特定の酵素的または化学的反応に適する条件を供する緩衝液をも含み得る。さらに、キットは、特定の核酸を単離し、そして質量分光計分析のための核酸断片を作製する目的のために、固形支持体のような試薬を含み得る。
サンプル中の1つ以上の標的核酸の診断的配列決定のためのキットも提供される。好ましい態様では、このようなキットは、1つ以上の基準核酸、配列特異的切断プロトコールのための種々の試薬、およびコンピューターアルゴリズムを包含する。このようなキットは、選択的に核酸増幅試薬をも含み得る。さらに、キットは、それに限定されないが修飾ヌクレオチド基質を含めた、修飾核酸の製造のための試薬を含み得る。キットは、特定の酵素的または化学的反応に適する条件を供する緩衝液をも含み得る。さらに、キットは、特定の核酸を単離し、そして質量分光計分析のための核酸断片を作製する目的のために、固形支持体のような試薬を含み得る。
本発明の前述の局面は例証となるのであって、付随の請求項に規定されるとおり、本発明を制限すると解釈されるべきでない。いくつかの様相における変動、ならびに代替の手段は、当業者に容易に認識される。
実施例1には、本発明の方法を用いて、HIV−1の1200塩基対領域の診断的配列分析をモデル化することが記述される。
実施例2には、切断されるべき核酸テンプレートを修飾することによって塩基特異的切断についての方法が記述される。
実施例3には、本発明の方法によるRNアーゼ−T1コーディング領域の診断的配列分析が示される。
実施例4には、〜1000塩基対核酸の分析が示される。
実施例5には、多重遺伝子型決定を含む遺伝子型決定のための本発明の使用が示される。
実施例6には、転写プロファイリングのための本発明の使用が示される。
実施例7には、全ゲノム再配列決定をするための本発明の使用が示される。
実施例1
HIV−1の1200塩基対領域の診断的配列分析をモデル化すること
本発明の方法は、ヒト免疫欠損ウイルス1型(HIV−1;HXB2単離物;ゲンバンク(Genbank)アクセッション番号K03455;位置2161から3360まで)から誘導される1200塩基対配列を用いた。この配列は、方法の全体的能力、ならびにあいまいさの発生を試験するコンピューターシュミレーションにおけるモデルとして使用された。選択される領域は、逆転写酵素の全体のプロテアーゼ遺伝子および最初の〜270コドンを包含する〔Hertogs K.ら、Antimicrob.Agents Chemother.42巻:269-276頁(1998年)と比較して〕。HIVの医療上単離物のこのドメインの遺伝子型決定/再配列決定は、薬剤耐性関連突然変異の発生を監視するために特別な目的のものである。単独ならびに多重の変化は、プロテアーゼおよびRT阻害剤の抗ウイルス活性に対する感受性が減少したことを示した〔Hertogs K.ら、Antimicrob.Agents Chemother.42巻:269-276頁(1998年);Schinazi R.ら、Int.Antivir.News 4巻:95-107頁(1996年)およびそこに引用される文献〕。
HIV−1の1200塩基対領域の診断的配列分析をモデル化すること
本発明の方法は、ヒト免疫欠損ウイルス1型(HIV−1;HXB2単離物;ゲンバンク(Genbank)アクセッション番号K03455;位置2161から3360まで)から誘導される1200塩基対配列を用いた。この配列は、方法の全体的能力、ならびにあいまいさの発生を試験するコンピューターシュミレーションにおけるモデルとして使用された。選択される領域は、逆転写酵素の全体のプロテアーゼ遺伝子および最初の〜270コドンを包含する〔Hertogs K.ら、Antimicrob.Agents Chemother.42巻:269-276頁(1998年)と比較して〕。HIVの医療上単離物のこのドメインの遺伝子型決定/再配列決定は、薬剤耐性関連突然変異の発生を監視するために特別な目的のものである。単独ならびに多重の変化は、プロテアーゼおよびRT阻害剤の抗ウイルス活性に対する感受性が減少したことを示した〔Hertogs K.ら、Antimicrob.Agents Chemother.42巻:269-276頁(1998年);Schinazi R.ら、Int.Antivir.News 4巻:95-107頁(1996年)およびそこに引用される文献〕。
コンピューターシュミレーションの主要な目的は、SNPを検出およびマッピングするための再配列決定方法の作用を試験することであった。このために、我々は、我々が体1200塩基対配列中の1つずつ各ヌクレオチドを体系的に突然変異させたコンピューターシュミレーション分析を行った。各突然変異について、我々は、異なる4つのRNアーゼ消化反応、主に(+)および(−)鎖のRNアーゼ−T1およびRNアーゼ−U2切断で配列の規定のセグメントから生成される切断産物の分子質量を計算した。元来の配列から得た基準切断産物のものとこれらの質量の比較は、各突然変異変化に関連した診断的断片、すなわち、突然変異の結果として現れるかまたは消えるかのいずれかである断片の質量を同定する。この分析での基礎となる想定は、測定可能であるために、断片は、同じ反応で生成される他の切断産物のものと異なる分子質量を示さなければならないことにあった。さらに、我々は、質量スペクトル分析の分解能が、5Daまたは0.1%より大きな質量差に限定されると考える。言い換えると、同じ消化産物中の他の断片とのその質量差が、5Daまたは0.1%より小さい断片は、その分析で評価されなかった。質量スペクトルの定量的態様(すなわち、ピーク高)は、本発明のシュミレーション研究で考慮されなかった。各突然変異変化について、我々は、突然変異の存在についての診断用である断片の数をコンピューター処理した。突然変異の変化は、少なくとも1つの診断的断片(スペクトル変化を示す)があるときに検出可能と評価された。さらに、我々は、突然変異の変化が、明瞭にマッピングされ得るかどうかを試験した。このために、我々は、各突然変異に関連した診断的断片の集合を比較した。特徴的集合の断片を得る突然変異は、明瞭にマッピングさ得る一方で、同じ集合を付与する突然変異は、互いに区別できない。
第一のシュミレーション分析で、我々は、それぞれ、1、2および4種のRNアーゼ消化反応を用いて検出およびマッピングできたSNPのフラクションをコンピューター処理した。このために、我々は、HIV配列の200塩基対セグメントにおける体系的な単独のヌクレオチド置換シュミレーションを行った。4つの異なるRNアーゼ消化反応〔(+)および(−)鎖のRNアーゼ−T1およびRNアーゼ−U2切断〕の各々について、我々は、検出可能な診断的断片の数を計算し、そしてこれらの断片が、各突然変異に特徴的であるかどうかを分析した。図2に要約される結果は、単独RNアーゼ消化反応の各々で、突然変異の大きなフラクション(55%から85%まで)が検出されることを示す。対照的に、これらの突然変異の変動の唯一小さなフラクション(20%から30%まで)が、明瞭にマッピングされ得た。主要な理由は、多くの異なる突然変異の変化は、同じ質量差を生じることである。マッピングされ得る突然変異のフラクションは、2つのRNアーゼ消化反応のデータが合わされるときに、60%周囲から70%までの増加する。4つの異なる切断反応から得られるさらなるデータの組合せは、突然変異の変化の96%を、明瞭に位置決めし、そして本発明の方法の利点を示すことを可能にする。配列あいまいさの詳細な調査は、これらの内の約半分が、CからUへの(または逆にAからGへの)転位に関与することを示す。CおよびU残基の間の分子質量における差が、ただ1Daであるので、ピリミジン塩基を担持する鎖の切断産物における質量差は、小さすぎて検出できない。その結果として、だれでも、この突然変異の変化が、Uの代わりにm5Uを用いたときに検出可能になり得ることを予測し得る。200塩基対配列におけるm5Uを用いたコンピューターシュミレーションは、明確にマッピングされ得る突然変異のフラクションが、98%に増加することを示す。その結果として、全てのさらなるシュミレーションは、類似m5Uの使用に基づいている。これらの結果は、4つのモノヌクレオチド特異的RNアーゼ消化が、高度の正確性を示すほとんどの配列の再配列決定のために必要および十分の両方であることを示す。
本発明の方法で得られる配列の質は、試験された配列セグメントのサイズによって強力に影響されることは明らかである。実際に、セグメントのサイグが大きいほど、特定の関連の診断的断片が、同じ反応で生成される他の切断産物と同時発生し得る統計的機会も多くなる。したがって、我々は、様々サイズのセグメント、すなわち100、200、300および600塩基対のセグメントを用いて、1,200塩基対HIV配列における体系的な単独ヌクレオチド置換シュミレーション分析を行った。各シュミレーションで、総計3,600の単独突然変異置換が、分析された。4つの異なるRNアーゼ消化反応の各々について、測定可能な診断的断片の数およびパターンの両方は、上に記述される検出限界を用いてコンピューター処理された。図3には、4つの異なる分析における3,600突然変異の変化で得られる診断的断片の数の分布が示される。結果は、単独ヌクレオチド置換の大きな含有率が、DNAの大型セグメントを用いたときに、少数の診断的スペクトル変化に関連することを明らかに示す。
各シュミレーションで、我々は、検出可能なSNPの数、ならびに明瞭にマッピングされ得るSNPのフラクションの両方を決定した。図4で要約されるコンピューターシュミレーションの結果は、ほとんど全ての突然変異の変化は、4つの異なる分析で検出されることを示す。3,600のSNPの内、漏れた検出の数は、それそれ100塩基対、200塩基対、300塩基対および600塩基対セグメントを用いて、それぞれ0、1、3および9であった。対照的に、明瞭にマッピングされ得る突然変異の変動のフラクションは、長いセグメントを使用する場合、よりいっそう減少する。わずか1%のSNPが、100塩基対セグメントを分析するときにあいまいである一方で、そのフラクションは、600塩基対セグメントでほとんど10%まで増加する。あいまいさの詳細な調査は、これらの主要部は、塩基のそれが変化されることを同定することに失敗した場合、同一の塩基対のすぐ近くまで必要とすることを示す。
結論として、シュミレーションの結果は、本発明の方法が、再配列決定するのに有効であること、そして大型のセグメントであっても、限定数の位置を分析する必要があるときに使用され得ることを示す。さらに、ほとんどの場合に、コンピューター補助シュミレーション研究が、本発明の方法を用いたときに、実験的設計ならびにデータ解釈に必須であるようである。最も重要には、シュミレーションは、スペクトル変化が、特定の配列変動に明瞭に連結されるかどうかを示す。
実施例2
テンプレートの修飾による塩基特異的切断
本実施例は、核酸分解試薬による切断の特異性が、特定のホスホジエステルが、耐性切断を結合するように標的テンプレートの修飾を通してさらに制限され得ることを示す。さらに詳細には、C−およびU−残基の両方の3′側で正常に切断するRNアーゼ−Aは、標的が、これらのヌクレオチドの内の1の2″−デオキシ類似体を組込むときに、モノヌクレオチド特異的になることが示される。多クローニング部位ならびにファージT7プロモーター配列を包含するプラスミドベクターpGEM3−Zf(+)(プロメガ、ウイスコンシン州マディソン)の領域は、モデルとして使用された(図5基準)。
テンプレートの修飾による塩基特異的切断
本実施例は、核酸分解試薬による切断の特異性が、特定のホスホジエステルが、耐性切断を結合するように標的テンプレートの修飾を通してさらに制限され得ることを示す。さらに詳細には、C−およびU−残基の両方の3′側で正常に切断するRNアーゼ−Aは、標的が、これらのヌクレオチドの内の1の2″−デオキシ類似体を組込むときに、モノヌクレオチド特異的になることが示される。多クローニング部位ならびにファージT7プロモーター配列を包含するプラスミドベクターpGEM3−Zf(+)(プロメガ、ウイスコンシン州マディソン)の領域は、モデルとして使用された(図5基準)。
本発明による配列分析に対する第一の工程は、158個の塩基対試験配列の増幅を含む。反応は、順行および逆行プライマーの12.5ピコモルの各々、200Mの各dNTP、0.25LTaqDNAポリメラーゼ(5U/L;プロメガ、ウイスコンシン州マディソン)、1.5mMのMgCl2および酵素で補足された緩衝液を使用して、総量50Lで行われた。94℃で、2分間の最初のインキュベーションの後、40サイクルの以下の温度プログラムを行った:30秒間、94℃;30秒間、50℃;および15秒間、72℃。サンプルを、追加の15分間72℃に維持し、そしてその後冷却した。PCR反応産物を精製し(高純度PCR産物精製キット;ロッシュ・ダイアグノスチックス・ベルギューム、ベルギー国ブリュッセル)、そして続いて、1つの特異的鎖の転写のために使用した。dNTPおよびrNTPの両方を組込む能力を示す突然変異体T7RNAポリメラーゼ(T7RアンドDNA(商標)ポリメラーゼ;エピセンター、ウィスコンシン州マディソン)を、転写反応に使用した。正常なリボヌクレオチド基質を用いた転写に加えて、CTPが、dCTPに置換される1つの反応が、行われた一方で、2つのさらに別々の転写で、dUTPまたはdTTPのいずれかは、UTPを置換した。転写反応は、40mMトリス−Ac(pH8.0)、40mM KAc、8mMスペルミジン、5mMジチオスレイトール、15mM MgCl2、1mMの各rNTP、5mMのdNTP(これらの場合には、適切なNTPが、除外される)、〜40nM DNAテンプレート(〜2ピコモル)、および250単位T7RアンドDNA商標ポリメラーゼを含有する50L容積で行われた。インキュベーションは、37℃で、2時間行われた。転写の後、全長T7インビトロ転写産物(118ヌクレオチド)を、5′−ビオチン化形態の相補的逆PCRプライマー(図5)にアニールさせ、続いてストレプトアビジン被覆磁性ビーズ上へのビオチン化アニーリング産物の捕捉によって精製された。このために、50ピコモルビオチン化逆行プライマーを、転写反応に加えた。混合物を、最初に5分間70℃で、そして続いて、〜30分間室温でインキュベートさせた。その後、わずかに過剰のセラ−マグ(商標)ストレプトアビジン磁性微小粒子〔サレジン・インク.(Seradyn Inc.)、インディアナ州インディアナポリス;50μlの2M NaCl、20mMトリス−HCl(pH8.0)、2mM EDTAに再懸濁させた〕を、添加し、そして結果物である混合物を、振盪しながら30分間、室温でインキュベートさせた。磁性粒子収集装置(MPC;ダイナル、ノルウェー国オスロー)を用いてビーズを収集し、上清を除去し、続いて、ビーズを、100Lの100mM(NH4)3−シトレートで三回洗浄した。最終的に、ビーズを、0.5gウシ膵臓RNアーゼ−A(50U/mg;ロッシュ・ダイアグノスチックス・ベルギューム、ベルギー国ブリュッセル)を含有する3Lの25mM(NH4)3−シトレートで再浮遊させ、そして室温で、約30分間インキュベートして、転写産物を完全に消化させた。1LのRNアーゼ反応物を除去し、そして5Lのマトリックス溶液に添加した。この1:1のアセトニトリル:H2Oマトリックス溶液を、3−ヒドロキシピコリン酸(〜100mg/ml)で飽和させ、そしてさらに、25mM(NH4)3−シトレート、(場合により)内部標準として働いている2ピコモル/Lのオリゴヌクレオチド、そしてナトリウムおよびカリウムアダクトの存在を最小限にする(NH4)+形態での陽イオン交換ビーズ(ダウエックス50W−X2;シグマ、ミズーリー州セントルイス)を含有する。混合物を、室温で、15分間インキュベートした後、1Lを、サンプルプレートに載せ、そして乾燥させた。質量スペクトルを、リフレックスIII質量分光測定計(ブルッカー・ダルトニク・ジー・エム・ビー・エイチ、ドイツ国ブレーメン)を用いて収集した。
4つの転写産物の各々について推定されるRNアーゼ−A切断産物は、表IIで示される。推定断片の質量計算は、3′−リン酸基を仮定し、2′,3′−環状リン酸中間体を仮定しないことに注目すべきである。全体に、実験的に得られたスペクトル(図6)は、推定と素晴らしく一致している。最小の3マー(図6Aおよび6C)のいくつかの不在は、情報を与えないモノ−およびジ−ヌクレオチド消化産物を除去するために使用されたマス−ゲートに関連し得る。推定3′−近傍断片TGTTTC(1830.1Da)は、図6C、すなわち、dU−転写産物から誘導するスペクトルでわずかに不十分に確かめられる。この結果は、他の観察と共に、比較的高いdU−含有量を示す断片が、本発明のMS方法論を用いて、明らかに低い感度で検出されることを示唆する。図6Dにおける2817Daピークは、添加されたオリゴヌクレオチドの二重プロトン化形態に対応する。予想された断片のいくつかは、同一の組成物を有するので、分離され得ない。さらに、1Daだけ異なる(例えば、CMPおよびUMPの間の差;表II)通常の転写産物の消化産物は、図6Aではっきりしたピークとして見ることができない。合計で、データでは、RNアーゼ−Aは、dTTPまたはdUTPが、UTPに置換されときC−特異的RNアーゼとして、そしてCよりむしろdCUが、基質転写産物に組込まれるときにU−特異的試薬として働くことを納得のいくように示される。この高いレベルの核酸塩基特異性は、本発明の実施例で使用される過剰消化条件下でさえ達成される。
本実施例に記述されるプロトコールは、例証であり、そして特定の修飾および変動は、当業者の頭に浮かぶ。転写産物の固定化は、MS分析のための材料を製造する簡単な手段、例えば全ての他の生物の除去、およびNa+およびK+対抗イオンの(NH4)+(連続RNアーゼ消化は、MSに「不適合」であるあらゆる試薬を必要としないことに注目すべきである)への交換を表す。クロマトグラフィーのような他の方法が、転写産物またはMS分析のための誘導された消化産物を作成するために使用され得るとき、本発明は、自動化および高い処理量の分析を容易に受け入るという点で好ましい。反復実験で、本明細書で記述されるのと同じ結果を本質的に生じながら、転写産物は、水中で消化され、そして〜15ナノリットルのこれらの消化物は、MALDI−TOF−MSによる分析のための(商標)スペクトロチップ(Spectrochip(商標))(シークエノム・インク、カリフォルニア州サンディエゴ)に直接使用された。
実施例3
RNアーゼ−T1コーディング領域の診断的配列決定
本発明の実施例は、RNアーゼ−T1コーディング領域の部分の再配列決定への本発明の方法の使用を示す。我々は、古典的ジデオキシ鎖終結方法を用いて先に配列決定された部位特異的突然変異体〔Steyaert J.、Eur.J.Biochem.247巻:1-11頁(1997年)〕の採取の利用性のため、RNアーゼ−T1コーディング領域を選択した。本実施例で使用される野生型および突然変異体の配列は、図7に示される。
RNアーゼ−T1コーディング領域の診断的配列決定
本発明の実施例は、RNアーゼ−T1コーディング領域の部分の再配列決定への本発明の方法の使用を示す。我々は、古典的ジデオキシ鎖終結方法を用いて先に配列決定された部位特異的突然変異体〔Steyaert J.、Eur.J.Biochem.247巻:1-11頁(1997年)〕の採取の利用性のため、RNアーゼ−T1コーディング領域を選択した。本実施例で使用される野生型および突然変異体の配列は、図7に示される。
a.野生型RNアーゼ−T1配列の分析
実験は、実施例2に記述されるとおり本質的に行われた。最初に、選択された野生型RNアーゼ−T1標的核酸を、以下のプライマーを用いてPCRによって増幅させた:
5′−CCGGATATAAACTTCACGAAGACGG(順行)(配列番号:16)
5′−GATAGGCCATTCGTAGTAGGGAGAGC(逆行)(配列番号:17)
続いて、結果物であるアンプリコンは、5′非アニーリング伸長物としてT7プロモーター部位を組込む順行または逆行プライマーのいずれかを用いて再増幅された(図7A基準)。
5′−TAATACGACTCACTATAGGGCGACTTCACGAAGAGCGG(順行)(配列番号:18)
5′−TAATACGACTCACTATAGGGCGAATTCGTAGTAGGGAGAGC(逆行)(配列番号:19)
続いて、結果物であるプロモーター付随アンプリコンの各々は、2つの別々の転写反応でテンプレートとして使用された。T7RアンドDNAポリメラーゼ(エピセントレ(Epicentre)、ウィスコンシン州マディソン)を、それぞれCMPおよびUMPの代わりにdCMPまたはdUMPを組込む転写産物(dC−およびdU−転写産物と称される)を作成するために使用した。転写反応は、各rNTPが、2mMで存在し、そしてインキュベーションが、一夜37℃で行われる以外は、実施例2に記述されるとおり行われた。4つの全長T7−転写産物は、転写産物3′−末端に合致するビオチン化オリゴヌクレオチド(すなわち、最初の増殖工程で使用されるビオチン化形態の順行または逆行のいずれかのPCRプライマー)でアニーリングすること、および続いてストレプトアビジン微小粒子上への捕捉によって精製された。(NH4)3−シトレートを用いた集約的な洗浄の後、転写産物を溶出させた。ビーズを、3Lの水に再浮遊させ、そして90℃で、2分間維持し、続いてすぐに、磁石を用いたビーズの収集、および新たな試験管への上清の移動を行った。その後、得られた増幅標的核酸を、RNアーゼ−Aを含有する1Lの100mM(NH4)3−シトレートの添加によって完全に消化させた。最終的に、反応産物は、MALDI−TOF−MSによって分析された。
実験は、実施例2に記述されるとおり本質的に行われた。最初に、選択された野生型RNアーゼ−T1標的核酸を、以下のプライマーを用いてPCRによって増幅させた:
5′−CCGGATATAAACTTCACGAAGACGG(順行)(配列番号:16)
5′−GATAGGCCATTCGTAGTAGGGAGAGC(逆行)(配列番号:17)
続いて、結果物であるアンプリコンは、5′非アニーリング伸長物としてT7プロモーター部位を組込む順行または逆行プライマーのいずれかを用いて再増幅された(図7A基準)。
5′−TAATACGACTCACTATAGGGCGACTTCACGAAGAGCGG(順行)(配列番号:18)
5′−TAATACGACTCACTATAGGGCGAATTCGTAGTAGGGAGAGC(逆行)(配列番号:19)
続いて、結果物であるプロモーター付随アンプリコンの各々は、2つの別々の転写反応でテンプレートとして使用された。T7RアンドDNAポリメラーゼ(エピセントレ(Epicentre)、ウィスコンシン州マディソン)を、それぞれCMPおよびUMPの代わりにdCMPまたはdUMPを組込む転写産物(dC−およびdU−転写産物と称される)を作成するために使用した。転写反応は、各rNTPが、2mMで存在し、そしてインキュベーションが、一夜37℃で行われる以外は、実施例2に記述されるとおり行われた。4つの全長T7−転写産物は、転写産物3′−末端に合致するビオチン化オリゴヌクレオチド(すなわち、最初の増殖工程で使用されるビオチン化形態の順行または逆行のいずれかのPCRプライマー)でアニーリングすること、および続いてストレプトアビジン微小粒子上への捕捉によって精製された。(NH4)3−シトレートを用いた集約的な洗浄の後、転写産物を溶出させた。ビーズを、3Lの水に再浮遊させ、そして90℃で、2分間維持し、続いてすぐに、磁石を用いたビーズの収集、および新たな試験管への上清の移動を行った。その後、得られた増幅標的核酸を、RNアーゼ−Aを含有する1Lの100mM(NH4)3−シトレートの添加によって完全に消化させた。最終的に、反応産物は、MALDI−TOF−MSによって分析された。
スペクトルの図面表現は、図8A−Dに示される。推定された分解産物は、表IIIに列記される。pGEM3−Zf(+)転写産物を用いた場合、得られたスペクトルは、推定と素晴らしく一致している。最もおそらく二重プロトン化の結果である少数のピークも、観察された(図8B基準)。(−)鎖におけるT−反応は、3′−末端に余剰非テンプレートコード化ヌクレオチドを伴う転写産物の生成を示唆する〔Milligan J.ら、Nucleic Acids Res. 15巻:8783-8798頁(1987年)〕。実際に、予想される3′−末端断片に加えて、余剰G−残基(図8Dおよび表III)を含有する同じ断片と一致する目立ったピークが観察される。(+)鎖におけるC−反応から得られる予想3′−末端断片(1153Da:図8A)の不在は、この同じ現象によって説明され得る。この場合には、3′−伸長転写産物の切断が起こり、そして3′−リン酸化(3′−OHよりむしろ)形態の推定断片を生じ、そしてその産物は、同じ消化の別の断片(1233.7Da;表III)と同時に起こる。
b.選択されたRNアーゼ−T1単点突然変異の分析
4つの単独ヌクレオチド置換が選択された(図7Bで突然変異体番号1、番号2、番号3および番号4)。突然変異体配列の各々は、野生型RNアーゼ−T1コーディング領域(実施例3a)について記述されるとおり分析された。結果は、表IVに要約される。各突然変異について、表IVは、野生型RNアーゼ−T1基準配列の5′断片が、突然変異同じく突然変異特異的である5断片によって、影響されることを示す。その変化が、見当たらす、そしてその結果、10の理論的データ点の外にどれだけ多くの突然変異同定が、実際に基礎とされるかについても示す。スペクトルの変化は、小さすぎる(<3−マー)か、または特徴的でない断片をふくむことから、見当たらない。さらに、少数の断片、例えば1つの3−マーならびに≧9.8Kdaを示す大型断片は、実験的に観察されなかった。突然変異番号2に関する結果は特に興味深い。これらの結果は、本発明を実際的に最もよく示す。この特定の場合には、4つ全てのモノ−ヌクレオチド特異的解列反応は、突然変異の検出を生じる。すなわち、だれもが、その配列が、野生型RNアーゼ−T1コーディング領域と異なることに気づく。しかし、単独で行われた場合、これらの反応で、突然変異の明瞭なマッピングに至るものはない。(+)鎖におけるC−反応は、1947Daの新たな断片を生じる。単独ヌクレオチド突然変異番号のみが、このような6−マー〔組成=A3G(dU)C〕の作成を説明できるのでない。例えば、これは、配列CTACTACをCAAGTACに変換する二重突然変異についての場合でもある(図7基準);TACピークは、3−マーのような第三の存在のため失われない。(+)鎖におけるT−反応は、1つの断片の質量が、基準スペクトルと比較したときに56Daまで増加したスペクトルを生じる。これは、dCのGへに置換を示唆する。切断産物が、3つのdC残基を含むので、置換を位置決めすることは可能でない。(−)鎖におけるC−反応は、一見したところで最も情報を与えるものである;大きな基準断片は、切断によって影響される。しかし、断片の配列(GTAG1TT...TG2GATC)(配列番号:20)は、G1−>CおよびG2−>C突然変異の両方が、9814Daおよび1289Daの観察される産物〔組成=GA(dU)C〕を説明するようなものである。最終的に、(−)鎖におけるT−反応は、最後の情報を与えるものであり、そして944Da〔A(dC)U〕のピークの外観は、多くの異なる方法で説明され得る。A(dC)U−断片は、例えば、配列伸縮TAT1TTでCについてのT1−残基の置換によって生成される(図7基準)。結論として、突然変異番号2は、いくつかの場合には、配列変動の特性および位置が、少なくとも2つの異なる相補的切断反応の組合せによってのみ決定され得ることを例示する。
4つの単独ヌクレオチド置換が選択された(図7Bで突然変異体番号1、番号2、番号3および番号4)。突然変異体配列の各々は、野生型RNアーゼ−T1コーディング領域(実施例3a)について記述されるとおり分析された。結果は、表IVに要約される。各突然変異について、表IVは、野生型RNアーゼ−T1基準配列の5′断片が、突然変異同じく突然変異特異的である5断片によって、影響されることを示す。その変化が、見当たらす、そしてその結果、10の理論的データ点の外にどれだけ多くの突然変異同定が、実際に基礎とされるかについても示す。スペクトルの変化は、小さすぎる(<3−マー)か、または特徴的でない断片をふくむことから、見当たらない。さらに、少数の断片、例えば1つの3−マーならびに≧9.8Kdaを示す大型断片は、実験的に観察されなかった。突然変異番号2に関する結果は特に興味深い。これらの結果は、本発明を実際的に最もよく示す。この特定の場合には、4つ全てのモノ−ヌクレオチド特異的解列反応は、突然変異の検出を生じる。すなわち、だれもが、その配列が、野生型RNアーゼ−T1コーディング領域と異なることに気づく。しかし、単独で行われた場合、これらの反応で、突然変異の明瞭なマッピングに至るものはない。(+)鎖におけるC−反応は、1947Daの新たな断片を生じる。単独ヌクレオチド突然変異番号のみが、このような6−マー〔組成=A3G(dU)C〕の作成を説明できるのでない。例えば、これは、配列CTACTACをCAAGTACに変換する二重突然変異についての場合でもある(図7基準);TACピークは、3−マーのような第三の存在のため失われない。(+)鎖におけるT−反応は、1つの断片の質量が、基準スペクトルと比較したときに56Daまで増加したスペクトルを生じる。これは、dCのGへに置換を示唆する。切断産物が、3つのdC残基を含むので、置換を位置決めすることは可能でない。(−)鎖におけるC−反応は、一見したところで最も情報を与えるものである;大きな基準断片は、切断によって影響される。しかし、断片の配列(GTAG1TT...TG2GATC)(配列番号:20)は、G1−>CおよびG2−>C突然変異の両方が、9814Daおよび1289Daの観察される産物〔組成=GA(dU)C〕を説明するようなものである。最終的に、(−)鎖におけるT−反応は、最後の情報を与えるものであり、そして944Da〔A(dC)U〕のピークの外観は、多くの異なる方法で説明され得る。A(dC)U−断片は、例えば、配列伸縮TAT1TTでCについてのT1−残基の置換によって生成される(図7基準)。結論として、突然変異番号2は、いくつかの場合には、配列変動の特性および位置が、少なくとも2つの異なる相補的切断反応の組合せによってのみ決定され得ることを例示する。
c.野生型および突然変異体RNアーゼ−T1配列の混合物の分析
表IVに示される分析は、野生型RNアーゼ−T1配列および単独ヌクレオチド置換の内の1つの等モル混合物が、試験される実験を模擬するのに使用され得る。ヘテロ接合性の遺伝子型を模擬するこのような場合に、スペクトルは、(野生型)基準配列から誘導される全てのものに加えて、多数の新規断片を含む。したがって、突然変異/多型の特徴および配置は、必然的に、新規断片のみに基づく。明瞭さは、新規断片が、突然変異を特徴的に定義するのに十分であることを必要とする。当業者は、各々の対立遺伝子が目立った集合のピークに関連しているので、接合状態決定が、本発明の方法を用いて単純であることを認識する。
表IVに示される分析は、野生型RNアーゼ−T1配列および単独ヌクレオチド置換の内の1つの等モル混合物が、試験される実験を模擬するのに使用され得る。ヘテロ接合性の遺伝子型を模擬するこのような場合に、スペクトルは、(野生型)基準配列から誘導される全てのものに加えて、多数の新規断片を含む。したがって、突然変異/多型の特徴および配置は、必然的に、新規断片のみに基づく。明瞭さは、新規断片が、突然変異を特徴的に定義するのに十分であることを必要とする。当業者は、各々の対立遺伝子が目立った集合のピークに関連しているので、接合状態決定が、本発明の方法を用いて単純であることを認識する。
我々は、突然変異対立遺伝子が、以下のフラクションで存在するように特定の単独ヌクレオチド突然変異(例えば、突然変異番号3;図7B)で、野生型RNアーゼ−T1と混合された多数の実験を行った:1:2、1:5、1:10、1:20、1:50、1:100、1:200、1:500および1:1000。実験は、異なる対立遺伝子頻度によって特徴づけられたサンプルプールの分析を模倣する。最初に、等価の量の野生型および突然変異体の標的配列は、プライマーが、制限され、そして完全に消費される条件を用いて、PCR増幅によって合成された。所望の比で2つのアンプリコンを混合した後、材料を再増幅させた。その後、(−)鎖の転写産物が作成され、そして転写が、リボ型(rNTP)で4つ全てのヌクレオチド三リン酸基質を用いて行われ、そして切断が、RNアーゼ−Aの代わりにRNアーゼ−T1で行われた以外は、上に記述されるとおり消化された。RNアーゼ−T1酵素を用いた切断が、AAAUCAAAACCUUCG(配列番号:21)(下線付き残基は、突然変異番号3(図7Aおよび7Bに言及)によってAに変えられている)である多型の15−マー断片を生じる。野生型および突然変異体断片の質量は、それぞれ4807.91Daおよび4830.95Daである;突然変異は、23Daの移行を引起す。我々は、対立遺伝子頻度および関連のピーク高(R2=0,97)の間に素晴らしい線状相関関係があること、および突然変異体対立遺伝子に関連したピークが、5〜10%の材料を表すときに自信をもってなお同定され得ることを見出した。他の実験で、検出される可能性のある野生型対立遺伝子に対して突然変異の最小の比は、明らかに低いかもしれないことに注目されるべきである。実際に、本実施例で、「突然変異体ピーク」の信頼性のある検出は、野生型標的核酸について記録された対照スペクトルにより明らかなとおり余剰のピークの発生によってやや妨害された。この余剰ピークは、もしかすると、野生型断片(22Da質量シフト)の低レベルのNa+−アダクトが原因であり得る。全てで、後者データは、相同の標的核酸は、貯蔵され、そして同時に分析され得ることを示す;特定の配列変動を示すことに加えて、本発明の方法は、対立遺伝子頻度が生物学的サンプルのプールの中で概算されることを可能にし得る。本明細書に開示されるとおり診断的配列決定が、第一に、ピークの出現および消失ならにびピークシフトに依る一方で、本実施例は、特定の定量的態様のスペクトル(例えば、ピーク高およびピーク領域)は、配列分析に含まれ得て、そして相補的価値のある情報を得ることを示す。
d.RNアーゼ−T1多重突然変異体の分析
本発明の方法は、単独ヌクレオチド置換の分析に限定されない。複雑な変動も、配列決定され得る。表IVは、多数のRNアーゼT1多突然変異体、さらに詳細には二重および三重突然変異体(図7Bで突然変異番号5、番号6、番号7および番号8)と関連することが推定されるスペクトル変化を列記する。上に記述されるとおり、多突然変異体は、特有の数のスペクトル変化に関連する。多置換の場合に、関与した欠失または挿入なしに、影響された基準断片の数は、新規断片の数に常に一致する。二重突然変異体については、スペクトル変化の数は、突然変異が隣接する場合(突然変異番号5)では、12から、突然変異が、少なくとも1つのA、G、CおよびTを含む配列によって分離される場合には最大20までの範囲にある。後者の場合には、二重突然変異体は、2つの同時に起こるが、しかし独立の単独ヌクレオチド置換として処理されることである。三重突然変異体は、最小14スペクトル変化(突然変異体番号7)に関連する。単独ヌクレオチド置換を用いた場合、全てではない論理的スペクトル変化が、観察され得るか、または可能性があり、そして情報の部分は、失われる。しかし、その場合の膨大な大半では、得られたスペクトルおよび基準核酸配列(類)に基づいて、体系的コンピューター分析は、配列変動を明瞭に同定および配置できる。
本発明の方法は、単独ヌクレオチド置換の分析に限定されない。複雑な変動も、配列決定され得る。表IVは、多数のRNアーゼT1多突然変異体、さらに詳細には二重および三重突然変異体(図7Bで突然変異番号5、番号6、番号7および番号8)と関連することが推定されるスペクトル変化を列記する。上に記述されるとおり、多突然変異体は、特有の数のスペクトル変化に関連する。多置換の場合に、関与した欠失または挿入なしに、影響された基準断片の数は、新規断片の数に常に一致する。二重突然変異体については、スペクトル変化の数は、突然変異が隣接する場合(突然変異番号5)では、12から、突然変異が、少なくとも1つのA、G、CおよびTを含む配列によって分離される場合には最大20までの範囲にある。後者の場合には、二重突然変異体は、2つの同時に起こるが、しかし独立の単独ヌクレオチド置換として処理されることである。三重突然変異体は、最小14スペクトル変化(突然変異体番号7)に関連する。単独ヌクレオチド置換を用いた場合、全てではない論理的スペクトル変化が、観察され得るか、または可能性があり、そして情報の部分は、失われる。しかし、その場合の膨大な大半では、得られたスペクトルおよび基準核酸配列(類)に基づいて、体系的コンピューター分析は、配列変動を明瞭に同定および配置できる。
実施例4
〜1000の塩基対領域の質量分光測定分析
本発明の方法は、断片−ラダーの分析に関与する最近のMSに基づく配列決定方法論に遭遇した短い読取り長さの制限を克服するように設計される。適用法によって、数百またはさらに数1000の塩基対の標的領域が、分析され得ることを予測できる。本実施例は、多数のオリゴヌクレオチド断片が、本発明の方法によって同時に分析され得ること、そしてその結果として、検出プラットホームは、方法論に制限を課さないことを示す。
〜1000の塩基対領域の質量分光測定分析
本発明の方法は、断片−ラダーの分析に関与する最近のMSに基づく配列決定方法論に遭遇した短い読取り長さの制限を克服するように設計される。適用法によって、数百またはさらに数1000の塩基対の標的領域が、分析され得ることを予測できる。本実施例は、多数のオリゴヌクレオチド断片が、本発明の方法によって同時に分析され得ること、そしてその結果として、検出プラットホームは、方法論に制限を課さないことを示す。
実施例2で表される模式図に続いて、プラスミドベクターpGEM3−Zf(+)(プロメガ、ウィスコンシン州マディソン)の1012の塩基対領域が増幅され、そして結果物であるアンプリコン、続いて972のヌクレオチド長のインビトロT7転写産物の製造のために使用された(図5基準)。転写産物は、U−特異的切断が、RNアーゼ−Aによって行われ得るように、CMPの代わりにdCMPを組込んだ。この転写産物について推定された切断産物は、表Vに列記される。図9は、実験的に得られたスペクトルの最も関連のある部分を示す。実験データから得られる第一の結論は、>200切断産物から構成される複雑なモノ−ヌクレオチド特異的消化反応が、質量分光測定計によって分析され得ることである。約67の推定された際立ったピークの大部分は、容易に同定される。ただ少数の4マー断片が、検出可能でないか、またはかろうじて可能である。本発明の実験で、いくつかのピークの割当ては、ある種の消化産物(の少なくとも一部)が、3′−環状ホスフェート基の代わりに2′,3′−環状ホスフェートを含むという想定を必要とする。このようなピークは、〜18Daまで本来のピークと異なる。環状ホスフェートが、トランスエステル化切断反応から生じ、そしてこれらの中間体が、ゆっくりとした第二の反応工程で加水分解を受けることが十分に知られている。
実施例5
遺伝子型決定
本発明の方法は、サンプル核酸の多重非隣接領域の診断的配列決定を行うためにも有用である。これは、本発明を、全ゲノムの発見、ならびに多型の日常的評価(例えば、SNP)およびゲノムDNA中の多遺伝子座での突然変異のために有用にさせる。このような多重遺伝子型決定は、概念的に、再配列決定と差がない;両方とも、改変が、特徴づけられそして明白に位置決めされることを必要とする。上に記述される単独標的配列に関与する腎炎に類似して、コンピューターシュミレーションは、観察されたスペクトル変化の内の1つが、特定のゲノム改変に特徴的に関連していることを見出すために行われ得る。多重遺伝子型決定が、多数の変異体位置の同定/診断を必要とするのみであるので、当業者によって、(i)多重標的核酸の複雑さ(すなわち、合せた長さ)が、全長の再配列決定の場合より明らかに長いこと、および(ii)単独突然変異切断反応が、対立遺伝子および接合性同定の両方についてしばしば十分であり得ることが認識される。各々が、2つの選択的形態の一連の重対立遺伝子のSNPの内の1つを積極的に同定する2つの配列特異的切断の使用に関与する使用法も、本発明の方法を積極的に使用する。例えば、ヒトにおける最も共通な型の点突然変異および多型である多くのCからTへの転位は、C−およびT(U)−特異的反応の組合せにより容易に評価され得る。ゲル電気泳動の配列決定を使用して分析されたヘテロ接合性のサンプルは、意識して同定するのはしばしば困難であることを話題にする価値がある。本明細書で記述される方法で、ヘテロ接合性性の検出は、野生型および突然変異特異的な集合の質量スペクトルピークの両方の存在のために明瞭である。
遺伝子型決定
本発明の方法は、サンプル核酸の多重非隣接領域の診断的配列決定を行うためにも有用である。これは、本発明を、全ゲノムの発見、ならびに多型の日常的評価(例えば、SNP)およびゲノムDNA中の多遺伝子座での突然変異のために有用にさせる。このような多重遺伝子型決定は、概念的に、再配列決定と差がない;両方とも、改変が、特徴づけられそして明白に位置決めされることを必要とする。上に記述される単独標的配列に関与する腎炎に類似して、コンピューターシュミレーションは、観察されたスペクトル変化の内の1つが、特定のゲノム改変に特徴的に関連していることを見出すために行われ得る。多重遺伝子型決定が、多数の変異体位置の同定/診断を必要とするのみであるので、当業者によって、(i)多重標的核酸の複雑さ(すなわち、合せた長さ)が、全長の再配列決定の場合より明らかに長いこと、および(ii)単独突然変異切断反応が、対立遺伝子および接合性同定の両方についてしばしば十分であり得ることが認識される。各々が、2つの選択的形態の一連の重対立遺伝子のSNPの内の1つを積極的に同定する2つの配列特異的切断の使用に関与する使用法も、本発明の方法を積極的に使用する。例えば、ヒトにおける最も共通な型の点突然変異および多型である多くのCからTへの転位は、C−およびT(U)−特異的反応の組合せにより容易に評価され得る。ゲル電気泳動の配列決定を使用して分析されたヘテロ接合性のサンプルは、意識して同定するのはしばしば困難であることを話題にする価値がある。本明細書で記述される方法で、ヘテロ接合性性の検出は、野生型および突然変異特異的な集合の質量スペクトルピークの両方の存在のために明瞭である。
多重遺伝子型決定は、一般に、ゲノム領域の同時増幅に関与する。先に知られたSNP遺伝的マーカーの場合に、選択された遺伝子座の同時増幅は、推定プライマー対を使用することによって達成され得る〔Wangら、Science 250巻:1077-1081頁(1998年)〕。または、いっそう総括的なアプローチ法は、標的配列の作成が、サンプル核酸から誘導される多重の短制限断片の付随した増幅を包含するSNPの集合の発見および錬側の日常的評価の両方について適合され得る。この「ランダムサンプル」法は、高い多型含量(例えば、100塩基対での1SNP以上)を示す生物に特に有用であり得る。この同時増幅は、単独PCRプライマー対についての標的部位を組込む制限断片アダプター配列の末端に連結することによって達成され得る。このアプローチ法では、アンプリコンの平均サイズは、大半が≧1 SNPを組込むように小さいべきである一方で、さらに、アンプリコンの総数は、十分に小さいべきで、その結果それらの合せた長さが、本発明の方法による分析を受け入れる。これらの要件は、制限酵素の適切な選択、および制限断片の別々の小集団の選択性増幅を可能にする方法〔Vos P.ら、Nucleic Acids Res.23巻:4407-4414頁(1995年);Zabeau M.およびVos.P.、欧州特許第0534858号(1993年);Kikuya Kato、Nucleic Acids Res.23巻:3685-3690頁(1995年)〕および本明細書に記述されとおりのものの使用によって適合され得る。例えば、研究下のゲノムでまれにしか切断しない第一の制限酵素を、約100塩基対の平均サイズを示す断片を生成する第二の試薬と合せ得る(例えば、テトラ−ヌクレオチド認識部位を有する2つの酵素の組合せ)。2つの異なる制限部位によって縁取られた断片の数は、好ましくは、10,000より少ないべきである;これらの内の適切な小集団は、選択的プライマーの使用によって容易に増幅され得る〔Vos P.ら、Nucleic Acids Res.23巻:4407-4414頁(1995年)〕。さらに、非常に短くされた伸長時間により特徴づけられるPCRプロトコールは、短い断片の増幅が、強力に好まれ、それによりさらにアンプリコンの数および平均サイズを減少させるように使用され得る。ゲノム断片の選択性同時増幅の間、または連続PCR工程で、アプリコンに全長プロモーター配列(例えば、バクテリオファージT7、T3またはSP6から誘導するもの;前記)を付着する第一のプライマーが使用され得る。第二の鎖は、例えば最後から二番目の位置でリボヌクレオチド残基を含むプライマーの伸長によって合成され得る。PCR増幅に続いて、プライマー配列は、RNアーゼ消化および結果物である第一のプライマーの助けで転写された切断鎖によってこの第二の鎖から除去され得る。この手段は、標的制限断片に結合された共通配列を最小化する。
実施例6
cDNAライブラリー分析−転写プロファイリング
診断的配列決定は、一般に、定義された核酸で行われる。すなわち、どの基準配列に標的核酸が対応するかを知る。しかし、本発明による再配列決定法は、特定の配列を同定または分類するためにも使用され得る。このような実験では、相互いに関係した核酸(例えば、DNAのランダムクローン)は、典型的に、(より)大きなサンプル配列の未知部分に対応するか、または生物学的サンプルに存在する複数の核酸の内の1つ、または両方の組合せを表す。未知核酸から誘導される質量スペクトルを、関連基準配列(類)、またはその部分について知られるか、または推定されるものと比較する。この型の実験で、相互に関係した標的配列のいくつかが、必ずしも基準配列中にそれらの相手を有することを必要するとはかぎらないこと、そして逆も同じであることに注目すべきである。本発明の方法による配列同定は、同時に、可能な配列変動を示し得ることは確認され得る。したがって、相互に関係した配列は、データベースの配列の1つに同一であるとして、基準配列のようなものの変異体として、または合致する配列がなんら見出されない場合には新規として分類され得る。
cDNAライブラリー分析−転写プロファイリング
診断的配列決定は、一般に、定義された核酸で行われる。すなわち、どの基準配列に標的核酸が対応するかを知る。しかし、本発明による再配列決定法は、特定の配列を同定または分類するためにも使用され得る。このような実験では、相互いに関係した核酸(例えば、DNAのランダムクローン)は、典型的に、(より)大きなサンプル配列の未知部分に対応するか、または生物学的サンプルに存在する複数の核酸の内の1つ、または両方の組合せを表す。未知核酸から誘導される質量スペクトルを、関連基準配列(類)、またはその部分について知られるか、または推定されるものと比較する。この型の実験で、相互に関係した標的配列のいくつかが、必ずしも基準配列中にそれらの相手を有することを必要するとはかぎらないこと、そして逆も同じであることに注目すべきである。本発明の方法による配列同定は、同時に、可能な配列変動を示し得ることは確認され得る。したがって、相互に関係した配列は、データベースの配列の1つに同一であるとして、基準配列のようなものの変異体として、または合致する配列がなんら見出されない場合には新規として分類され得る。
少なくとも4つの相補的モノ−ヌクレオチド特異的切断反応を含む分析が、配列決定に本質的に等しい分離で未知配列を同定することが確認されるべきである。同時に、本明細書に記述されるMSに基づく方法は、すばやいデータ獲得を可能にし、そして高い処理量を受け入れる。したがって、本発明の方法は、先例のない規模および速度で核酸を同定および目録作成するのに有用である。1つの使用法は、(i)ユニジーン(unigene)ライブラリーのアセンブリ(すなわち、複製クローンの同定/除去)、(ii)先に同定された遺伝子の新規遺伝子または新規変異体の同定、および(iii)転写プロファイリングの目的のために、cDNAライブラリーの分析から構成される。本発明の方法の速度および処理量は、より多くのクローンのプロセシング、したがって、cDNAライブラリーの深部分析においていっそう可能にするべきである。
多様な方法は、転写プロファイリング、すなわち、質および量の語句の両方で転写の分析についての当技術分野で知られている。1つの方法、発現配列タグ(EST)アプローチ法で、mRNA集団は、ランダムに選択されたcDNAの部分的配列決定によって評価される。遺伝子発現パターンにおける全体的変化は、2つの比較されたcDNAライブラリーの中でEST比から推定される〔Lee N.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92巻:8303-8307頁(1995年)〕。本明細書に記述される方法は、類似のレベルの分離(解決策)で、しかし相当に高い速度および処理量で発現した遺伝子を目録作成するために使用され得る。最初に、一方向でクローン化されたcDNAのライブラリーは、挿入配列の転写を可能にするベクター中で構築される。好ましくは、cDNAの3′−末端は、プロモーターに隣接して配置される。転写についてのテンプレートは、1対のベクター特異的プライマーを用いたプロモーター−cDNAカセットの増幅によって作成され得る。または、ベクターDNAが作成され、そして挿入cDNA(例えば、〜25塩基対)の5′−末端に密着したベクター内の制限部位で切断される。好ましくは、テンプレートが、切断される制限部位は、研究下のcDNA内で低い発生頻度を示すに違いない。PCR産物または消化ベクターから合成されるラン−オフ転写産物は、共通3′−末端によって特徴づけられ、ベクター配列から構成され、そしてそれは、実施例2で記述されるとおり全長の転写産物の単離を可能にする。代替攻略法は、全てのテンプレートが、cDNA5′−末端で消化されるだけでなく、膨大な大半が、3′−末端からある程度の距離(例えば、数百の塩基対)で、cDNA内で切断もされるように制限試薬を用いたベクターDNAの処理に関与する。制限試薬は、単独酵素または2つまたはそれ以上の制限酵素の組合せであり得る。消化産物(類)へのアダプターの連結〔Vos P.ら、Nucleic Acids Res.23巻:4407-4414頁(1995年)〕は、実施例2に記述されるとおり、それらの単離を可能にする共通3′−末端で全長の転写産物を得るために考え得る。しかし、5′−末端でビオチン基を組込む転写産物も、作成でき〔Hahner S.ら、Nucleic Acids Res.25巻:1957-1964頁(1997年)〕、それによりそれらの固定のための代替手段を提供する。cDNA内の消化は、同じ転写産物から誘導する異なる部分的cDNAを、この手段によって調和させ、そしてそれにより同定に安易である点で魅力的な選択枝である。全長のラン−オフ転写産物は、最終的に、相補的配列特異的切断反応にかけ、そして結果物である消化産物は、本明細書に開示されるとおりMSによって分析される。
当業者は、上に概説された転写産物プロファイリングの利益を認識する。ESTアプローチ法に比較可能で、cDNAは、配列レベル、すなわち、分離の最適レベルで同定される。したがって、本方法は、相互に関係した核酸の断片化を含む一方で、フィンガープリント技術によって保持されるそのレベルの分離が、いっそう超過する〔Prashar Y.およびWeissman S.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93巻:659-663頁(1996年);Bachem C.ら、The Plant Journal 9巻:745-753頁(1996年);Ivanova N.およびBelyavsky A.、Nucleic Acids Res.23巻:2954-2958頁(1995年);Liang P.およびPardee A.、Science 257巻:967-971頁(1992年)〕。ハイブリッド形成に基づくアプローチ法〔Schena M.ら、Science 270巻:467-470頁(1995年);Wodicka L.ら、Nature Biotechnology 15巻:1359-1367頁(1997年)〕と対照的に、本方法は、公知および先に未知の両方の配列を同定できる。さらに、ゲル電気泳動の分画を要求するすばやい方法を立証すべきである。
実施例7
全−ゲノム再配列決定
過去数年で、全ゲノム、特に微生物のものを配列決定するための技術は、成熟してきた。50以上の微生物のゲノムは、2000年までに完了されると予定され、そしてこの巨大な知識から生じる利益は、迅速に明確になりつつある〔Clayton R.ら、Curr.Opinion Microbiol.1巻:562-566頁(1998年)〕。全部の微生物ゲノムが、日常的になりつつあること、および微生物の遺伝学が、「比較ゲノム」の時代に入りつつあることは明らかなようである。完全なゲノム配列の知識は、系統発生的分析における最終道具であり、遺伝子/機能性多様性研究を可能にし、そして研究が、生物で行われる手段を基礎的に変化させる。現時点で、各新たなゲノム配列の実質的部分は、データベース合致を示さない。だれでも、微生物種多様性が、よりよく表される場合に、将来、より大きな比率のオルソロガス(orthologous)遺伝子を見出すことを予想する。その時点で、生成された配列のほとんどが、すでに知られた配列に類似する場合に、全体的ゲノム分析は、デノボ配列決定法によるよりむしろ、本明細書に記述されるとおり再配列決定攻略法を使用することによって、迅速に、正確に、そして費用有効に行われ得る。同様の進化は、多くの(モデル)生物についてのゲノム計画が、進行中であるか、またはすでに終了している細菌の遺伝学分野の外側で予測され得る(例えば、ドロソフィア・メラノガステル(Drosophila melanogaster)、カエノルハブジチス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)、ヒト、マウス、アラビドプシス・タリアナ(Arabidopsis thaliana)、およびコメ)。
全−ゲノム再配列決定
過去数年で、全ゲノム、特に微生物のものを配列決定するための技術は、成熟してきた。50以上の微生物のゲノムは、2000年までに完了されると予定され、そしてこの巨大な知識から生じる利益は、迅速に明確になりつつある〔Clayton R.ら、Curr.Opinion Microbiol.1巻:562-566頁(1998年)〕。全部の微生物ゲノムが、日常的になりつつあること、および微生物の遺伝学が、「比較ゲノム」の時代に入りつつあることは明らかなようである。完全なゲノム配列の知識は、系統発生的分析における最終道具であり、遺伝子/機能性多様性研究を可能にし、そして研究が、生物で行われる手段を基礎的に変化させる。現時点で、各新たなゲノム配列の実質的部分は、データベース合致を示さない。だれでも、微生物種多様性が、よりよく表される場合に、将来、より大きな比率のオルソロガス(orthologous)遺伝子を見出すことを予想する。その時点で、生成された配列のほとんどが、すでに知られた配列に類似する場合に、全体的ゲノム分析は、デノボ配列決定法によるよりむしろ、本明細書に記述されるとおり再配列決定攻略法を使用することによって、迅速に、正確に、そして費用有効に行われ得る。同様の進化は、多くの(モデル)生物についてのゲノム計画が、進行中であるか、またはすでに終了している細菌の遺伝学分野の外側で予測され得る(例えば、ドロソフィア・メラノガステル(Drosophila melanogaster)、カエノルハブジチス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)、ヒト、マウス、アラビドプシス・タリアナ(Arabidopsis thaliana)、およびコメ)。
本発明の方法は、全体の(細菌の)ゲノムまたはメガベースの核酸領域の再配列決定に容易に適合され得る。これは、本発明の方法によってランダム断片を留める未選択サブクローンの配列分析に関与するショットガンアプローチ法の使用で成し遂げ得る。全ての独立のランダム配列のアセンブリーは、足場として役割を果す基準配列の利用性のため、デノボ配列決定計画〔Fleischmann R.ら、Science 269巻:496-512頁(1995年)〕でのものと基本的に異なる。単独の完全配列へのアセンブリーは、基準配列の一部で実験的に得られたスペクトルの各組を合致することに及ぶ。これを達成するために要求されるコンピューターのアプローチ法は、実施例6で概説されたcDNAライブラリーの分析のために必要とされるものに類似する。両方の場合に、だれもが、先立って、全てに存在する場合、規定の相互に関係した標的領域についての基準配列を知らない。しかし、本ショットガンアプローチ法が、セグメントの未定義末端のため、コンピューター処理能力の点でさらにいっそう必要とされ得ることに注目すべきである。同時に、アルゴリズムは、標的および基準配列の間に起こる変動をマッピングする能力があるべきである。その組込み重複を伴う(すなわち、ほとんどの配列が、数倍網羅される)ショットガンアプローチ法が、関連ゲノムの対の総括的比較のために有用であることを立証するべきであることが予想される。ショットガンアプローチ攻略法についての代替は、制限酵素断片の1つ以上のライブラリーから得られるクローンの分析、または遺伝子座特異的プライマー対で生成される定義されたアンプリコンの分析から構成される。
本発明は、好ましくは態様の点で記述されたときに、変動および修飾が起こることは、当業者に理解される。したがって、付随の請求項が、請求されるとおり本発明の範囲内にある全てのそのような等価の変動を網羅することが意図される。本明細書に引用される文献の全ては、基準としてはっきりと組み入れられる。
表I:本発明の方法によってDNAで起こり得る12の可能性のある点突然変異の検出。各置換は、切断部位の損失(−印)および獲得(+印)に関連する。さらに、各突然変異は、示されるとおり2つの消化産物の質量に影響を及ぼす。太字で示される質量差は、両方の転写産物におけるm5Uの組込みから生じる(詳細についてはテキスト基準)。
表II:4個の異なるpGEM3−Zf(+)由来の転写産物について推定されるRNAエース−A消化産物。≧3マー断片は、それらの分子質量によって評価される。通常の転写産物は、rNTP基質で作成された。dTMP、dUMPまたはdCMPを組込む転写産物は、dT−、またはdC−転写産物として示される。5′−三リン酸(5′ppp−)を含む断片が、示される。
表III:RNAエース−T1コーディング領域の(+)および(−)鎖のdU−およびdC−転写産物について推定されるRNAエース−A消化産物。≧3−マーのみが示される。dU−転写産物の切断は、C特異的である。同様に、T−反応は、dC−転写産物で行われる。イタリック体で示される2個の断片は、3′−伸長転写産物の生成を推定する(実施例3に引用)。
表IV:RNAエース−T1コーディング領域での単独および多重突然変異と関連したスペクトル変化。
表V:972ヌクレオチド長のT7転写産物のU−特異的切断。総計で222の推定された消化産物は、それらの組成物によりグループ分けされる。星印は、付随の環状リン酸反応中間体が、観察されるピークのもの(図9)を示す。最大の断片は、得られたスペクトルから不在である;数個の他の切断産物は、微小ピークとして現れ、そして「弱い」と標識される。
Claims (56)
- (a)1つ以上の標的核酸が1つ以上の生物学的サンプルに由来すること;
(b)1つ以上の切断試薬を用いて、1つ以上の標的核酸を、相補的切断反応に付し、それにより切断産物を生成すること;
(c)工程(b)で生成した切断産物に質量分光測定的分析を行って、1つ以上の質量スペクトルを得ること、及び
(d)工程(c)で得られた1つ以上の標的核酸の切断産物の1つ以上の質量スペクトルを、基準核酸配列のための公知または推定された質量スペクトルと比較し、そしてそれから、体系的コンピューター処理分析により、1つ以上の標的核酸のヌクレオチド配列の全部または一部を推定し、そして推定核酸配列を、基準核酸と比較して、1つ以上の標的核酸が、核酸と同じ配列か、または異なる配列を有するかどうかを決定する工程を含む、基準核酸配列が知られている1つ以上の標的核酸の配列分析の方法。 - 工程d)で決定される核酸配列差が、欠失、置換、挿入またはそれらの組合せである、請求項1記載の方法。
- 生物学的サンプルが、真核生物、原核生物、およびウイルスからなる群より選択される生物に由来する、請求項1記載の方法。
- 標的核酸が、一本鎖DNA、二本鎖DNA、cDNA、一本鎖RNA、二本鎖RNA、DNA/RNAハイブリッド、およびDNA/RNAモザイク核酸からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- 1つ以上の標的核酸が、インビボクローニング、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、逆転写に続くポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)、鎖置換増幅(SDA)、および転写に基づく方法からなる群より選択される1つ以上の連続増幅手段に由来する、請求項4記載の方法。
- 1つ以上の増幅標的核酸が、
(a)1つ以上の標的核酸に発現制御配列を作用的に連結すること、および
(b)1つ以上の標的核酸上の転写制御配列を認識する1つ以上のRNAポリメラーゼを用いて、工程a)の1つ以上の標的核酸の1つまたは両方の鎖を転写させる工程を含む方法により一本鎖または二本鎖標的核酸から生成されるRNA転写産物である、請求項5記載の方法。 - 転写制御配列が、真核生物の転写制御配列、原核生物の転写制御配列、およびウイルスの転写制御配列からなる群より選択される、請求項6記載の方法。
- 原核生物の転写制御配列が、T3、T7およびSP6プロモーターからなる群より選択される、請求項7記載の方法。
- T3、T7またはSP6プロモーターを利用するRNAポリメラーゼが、野生型または突然変異体のRNAポリメラーゼ、水酸基以外の2′置換基を有する非標準基質をRNA転写物内に組込むことができる突然変異体ポリメラーゼのいずれかである、請求項8記載の方法。
- 標的核酸が、質量修飾デオキシヌクレオシド三リン酸、質量修飾ジデオキシヌクレオシド三リン酸、および質量修飾リボヌクレオシド三リン酸からなる群より選択される1つ以上の修飾ヌクレオシド三リン酸を用いて得られる、請求項4、5、6、7、8または9記載の方法。
- 修飾ヌクレオシド三リン酸が、塩基、糖、および/またはリン酸部分で修飾され、そして酵素的工程によってか、化学的にか、または両方の組合せによって得られる、請求項10記載の方法。
- 修飾が、ヌクレオチド三リン酸上の水酸基以外の2′置換基からなる、請求項10記載の方法。
- 修飾が、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合、またはさらにアルカリ化試薬と反応したホスホロチオアートヌクレオシド間結合からなる、請求項10記載の方法。
- 修飾が、ウリジン−5′−一リン酸サブユニットのC5上のメチル基からなる、請求項10記載の方法。
- 修飾が、1つ以上の切断試薬による切断の特異性および/または切断産物の質量および/または長さを変化させる、請求項10記載の方法。
- 修飾が、1つ以上の切断試薬による切断の特異性および/または切断産物の質量および/または長さを変化させる、請求項11、12、13または14記載の方法。
- 相補的切断反応が、酵素的切断、化学的切断、および物理的切断からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- 相補的切断反応が、緩和モノヌクレオチド特異性、モノヌクレオチド特異性、緩和ジヌクレオチド特異性、またはジヌクレオチド特異性によって特徴づけられる、請求項17記載の方法。
- 化学的反応が、アルカリ処理からなり、そして1つ以上の標的核酸が、水酸基以外の2′置換基で非標準基質を組込んだRNA転写産物である、請求項17または請求項18記載の方法。
- 1つ以上の標的核酸が、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼからなる群より選択される1つ以上の酵素を用いる、酵素的切断反応に付される、請求項17または請求項18記載の方法。
- 1つ以上の標的核酸が、制限酵素、RNAエンドヌクレアーゼ、DNAエンドヌクレアーゼおよび非特異的ホスホジエステラーゼからなる群より選択される1つ以上のエンドヌクレアーゼを用いる、酵素的切断反応に付される、請求項20記載の方法。
- 1つ以上のエンドヌクレアーゼが、1つ以上の選択性または非選択性RNAエンドヌクレアーゼであり、そして1つ以上の標的核酸が、転写産物である、請求項21記載の方法。
- 1つ以上の選択性または非選択性RNAエンドヌクレアーゼが、G特異的T1リボヌクレアーゼ、A特異的U2リボヌクレアーゼ、A/U特異的phyMリボヌクレアーゼ、U/C特異的リボヌクレアーゼA、C特異的ニワトリ肝臓リボヌクレアーゼ(RNアーゼCL3)およびクサチビンからなる群より選択される、請求項22記載の方法。
- 1つ以上の標的核酸が、ホスホロチオアート修飾一本鎖DNAまたはRNAであり、そしてエンドヌクレアーゼが、ヌクレアーゼP1である、請求項15記載の方法。
- 核酸断片の質量分析的分析が、マトリックス介助レーザーデソープション/イオン化飛行時間型(MALDI−TOF)、電気スプレーイオン化(ESI)、およびフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴(FT−ICR)からなる群より選択される質量分析的方法を用いて行われる、請求項1記載の方法。
- (a)1つ以上の生物学的サンプルから、1つ以上の標的核酸を得;
(b)1つ以上の切断試薬を用いて、1つ以上の標的核酸を、相補的切断反応に付し、それにより切断産物を生成し;
(c)工程(b)で得られる切断産物上の質量分析的分析を行って、2つ以上の質量スペクトルを得;そして
(d)工程(c)で得られる1つ以上の標的核酸の切断産物の1つ以上の質量スペクトルを、基準核酸配列についての公知または推定された質量スペクトルと比較し、そしてそこから、体系的コンピューター分析により、1つ以上の標的核酸の公知ヌクレオチド配列変動の存在または不在を評価する工程を含む、公知基準核酸配列が利用可能である1つ以上の標的核酸の公知ヌクレオチド配列変異を評価する方法。 - 工程d)で評価される標的核酸の核酸配列変異が、欠失、置換、挿入またはそれらの組合せである、請求項26記載の方法。
- 1つ以上の標的核酸が、真核生物、原核生物、およびウイルスからなる群より選択される生物学的サンプルに由来する、請求項26記載の方法。
- 1つ以上の標的核酸が、一本鎖DNA、二本鎖DNA、一本鎖RNA、二本鎖RNA、およびDNA/RNAハイブリッドからなる群より選択される、請求項26または請求項27記載の方法。
- 1つ以上の標的核酸が、インビボクローニング、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、逆転写に続くポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)、鎖置換増幅(SDA)、および転写に基づく方法からなる群より選択される1つ以上の連続的増幅方法に由来する、請求項29記載の方法。
- 1つ以上の増幅標的核酸が、
(a)1つ以上の標的核酸に、転写制御配列を作用的に連結し、そして
(b)1つ以上の標的核酸上の転写制御配列を認識する1つ以上のRNAポリメラーゼを用いて、1つ以上の標的核酸の一方または両方の鎖を転写する工程を含む方法によって生成されるRNA転写産物である、請求項29記載の方法。 - 転写制御配列が、真核生物の転写制御配列、原核生物の転写制御配列、およびウイルスの転写制御配列からなる群より選択される、請求項31記載の方法。
- 原核生物の転写制御配列が、T3、T7およびSP6プロモーターからなる群より選択される、請求項32記載の方法。
- T3、T7またはSP6プロモーターを利用するRNAポリメラーゼが、野生型または水酸基以外の2′置換基を有する非標準基質を組込むことができる突然変異体の形態のいずれかである、請求項33記載の方法。
- 1つ以上の標的核酸が、質量修飾デオキシヌクレオシド三リン酸、質量ジデオキシヌクレオシド三リン酸、および質量修飾リボヌクレオシド三リン酸からなる群より選択される修飾ヌクレオシド三リン酸を用いて得られる、請求項30、31、または32記載の方法。
- 修飾ヌクレオシド三リン酸が、塩基、糖、および/またはホスフェート部分で修飾され、そして酵素的工程によってか、化学的にか、または両方の組合せによって導入される、請求項35記載の方法。
- 修飾が、ヌクレオシド三リン酸上の水酸基以外の2′置換基からなる、請求項35記載の方法。
- 修飾が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合、またはさらにアルカリ化試薬と反応したホスホロチオエートヌクレオシド間結合からなる、請求項35記載の方法。
- 修飾が、ウリジン−5′−一リン酸サブユニット上のメチル基からなる、請求項35記載の方法。
- 修飾が、1つ以上の切断試薬による切断の特異性および/または切断産物の質量および/または長さを改変する、請求項35記載の方法。
- 修飾が、1つ以上の切断試薬による切断の特異性および/または切断産物の質量および/または長さを改変する、請求項36、37、38、39または40記載の方法。
- 相補的切断反応が、酵素的切断、化学的切断、および物理的切断からなる群より選択される、請求項26記載の方法。
- 相補的切断反応が、緩和モノヌクレオチド特異性、モノヌクレオチド特異性、緩和ジヌクレオチド特異性、またはジヌクレオチド特異性によって特徴づけられる、請求項42記載の方法。
- 化学的切断が、アルカリ処理からなり、そして1つ以上の標的核酸が、水酸基以外の2′置換基で非標準基質を組込むRNA転写産物である、請求項42または請求項43記載の方法。
- 1つ以上の標的核酸が、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼからなる群より選択される1つ以上の酵素を用いて、酵素的切断反応に付される、請求項42または請求項43記載の方法。
- 1つ以上の標的核酸が、制限酵素、RNAエンドヌクレアーゼ、DNAエンドヌクレアーゼおよび非特異的ホスホジエステラーゼからなる群より選択される1つ以上のエンドヌクレアーゼを用いて、酵素的切断反応に付される、請求項45記載の方法。
- 1つ以上のエンドヌクレアーゼが、1つ以上の選択性または非選択性RNAエンドヌクレアーゼであり、そして1つ以上の標的核酸が、転写産物である、請求項46記載の方法。
- 1つ以上のRNAエンドヌクレアーゼが、G特異的T1リボヌクレアーゼ、A特異的U2リボヌクレアーゼ、A/U特異的phyMリボヌクレアーゼ、U/C特異的リボヌクレアーゼA、C特異的ニワトリ肝臓リボヌクレアーゼ(RNアーゼCL3)およびクサチビンからなる群より選択される、請求項46または請求項47記載の方法。
- 1つ以上の標的核酸が、ホスホロチオエート修飾一本鎖DNAまたはRNAであり、そしてエンドヌクレアーゼが、ヌクレアーゼP1である、請求項または請求項記載の方法。
- 核酸断片の質量分析的分析が、マトリックス介助レーザーデソープションイオン化飛行時間型(MALDI−TOF)、電気スプレーイオン化(ESI)、およびフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴(FT−ICR)からなる群より選択される質量分析的方法を用いて行われる、請求項26記載の方法。
- (a)生物学的サンプル材料から、1つ以上の標的核酸を得;
(b)1つ以上の切断試薬を用いて、1つ以上の標的核酸を、相補的切断反応に付し、それにより切断産物を生成し;
(c)工程(b)で得られる切断産物上の質量分析的分析を行って、核酸断片の質量スペクトルを得;そして
(d)工程(c)で得られる切断産物の質量スペクトルでの体系的コンピューター分析により、1つ以上の標的核酸のヌクレオチド配列を、そこから推定する工程を含む、1つ以上の標的核酸の配列を決定する方法。 - (a)1つ以上の生物学的サンプルから、1つ以上の標的核酸を得;
(b)1つ以上の切断試薬を用いて、1つ以上の標的核酸を、1つ以上の特異的切断反応に付し、それにより切断産物を生成し;
(c)工程(b)で得られる切断産物上の質量分析的分析を行って、1つ以上の質量スペクトルを得;そして
(d)工程(c)で得られる切断産物の質量スペクトルを、基準質量スペクトルと比較し、そして1つ以上の公知または未知の標的核酸の遺伝的に類似の核酸配列変動を、それから診断する工程を含む、1つ以上の公知または未知標的核酸のゲノム全体の遺伝子型決定をする方法。 - (a)1つ以上の生物学的サンプルから、1つ以上の標的核酸を得;
(b)1つ以上の切断試薬を用いて、工程(a)の1つ以上の標的核酸を、1つ以上の特異的切断反応に付し、それにより切断産物を生成し;
(c)工程(b)で得られる切断産物上の質量分析的分析を行って、1つ以上の質量スペクトルを得;そして
(d)工程(c)で得られる1つ以上の質量スペクトルを、互いに、または基準核酸の複数の質量スペクトルと比較し、そして1つ以上の標的核酸の同一性をそれから推定する工程を含む、1つ以上の生物学的サンプル中の1つ以上の標的核酸の同定を行う方法。 - 1つ以上の標的核酸が、cDNAである、請求項53記載の方法。
- 生物学的サンプル中の発現プロファイルを決定するために使用される、請求項54記載の方法。
- (a)核酸配列が公知である1つ以上のセットの基準核酸;
(b)1つ以上のヌクレオチド三リン酸;
(c)1つ以上のポリメラーゼ;
(d)1つ以上の核酸切断剤;および
(e)1つ以上の標的核酸の質量スペクトルを、基準核酸の質量スペクトルと比較し、そしてそれから、標的核酸の核酸配列を推定するためのコンピューターソフトウエアを含むことを特徴とする、質量分光法を用いる1つ以上の標的核酸の配列分析のためのキット。
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