JP5615997B2 - 特異的切断および質量分析法の組合せによる診断的配列決定 - Google Patents
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Description
本発明は、核酸に基づく診断的アッセイの分野にある。さらに詳細には、それは、プロトタイプまたは標準配列が、すでに利用可能である(「再配列決定」ともいう)か、または本明細書に記述される方法を用いて決定され得るサンプル核酸の領域の「診断的配列決定」のために有用な方法に関する。この診断技術は、迅速かつ信頼のおける方法でそのような再配列決定を必要とする領域で有用である:(i)所定の領域/遺伝子の種々の対立遺伝子の配列の同定、(ii)疾病関連突然変異の記録、(iii)体細胞変動の検出、(iv)分子進化の分野における研究、(v)原核生物および真核生物ゲノムの核酸配列の決定、(vi)1つ以上の生物学的サンプルで1つ以上の核酸を同定すること;(vii)および、生物学的サンプルおよび他の領域における遺伝子の発現プロファイルを決定すること。
ヒト及び多数のモデル生物のための完全な標準ゲノム配列は、最近、利用可能であるか、または近い将来に利用可能になると予想される。並行挑戦は、目的の配列における変動のタイプおよび範囲が、個人および集団の中の遺伝性の差の基礎をなすことから、それを特徴づけることである。ヒトでは、配列変動の大部分が、一塩基多型(SNP)と称されるヌクレオチド置換からなる。DNA配列決定は、多型を見つける最も敏感な方法である〔Eng C.およびVijg Jら、Nature Biotechnol. 15巻:422-426頁(1997年)〕。それらをモニターする強力な方法〔Landegren Uら、Genome Res. 8巻:769-776頁(1998年)〕と共に、このような配列変動の成長するパネルは、最も微妙な疾病の疑われる遺伝子座を同定する連鎖の研究で有用である〔Lander E.およびSchork N.、Science 265巻:2037-2048頁(1994年);Risch N.およびMerikangas K.、Science 273巻:1516-1517頁(1996年)〕。さらに、全ての(機能性)対立遺伝子変動の同定は、多量のサンプルで特定の領域の再配列決定を必要とする〔Nickerson D.ら、Nature Genet. 19巻:233-240頁(1998年)〕。公知SNPを監視する多数の方法が開発された〔Landegren U.ら、Genome Res. 8巻:769-776頁(1998年)〕が、再配列決定は、患者の診断を確実にするために日常的に使用されているようである。実際に、これまで調査されたかなりの数の疾患関連遺伝子において、文字どおり数百または実に数千の異なる突然変異が、同定され、そして目録に入った。その結果、配列決定は最終レベルの分離を表し、そして公知の医療上の関連性の多数の突然変異の他に、どの突然変異または突然変異の組合せが存在するのかを監視する好ましい方法であり得る。
本発明は、特定の核酸配列を検出または分析する質量分析法に向けられる。本発明は、例えば、特定の領域/遺伝子の種々の対立遺伝子配列の同定、疾病に関連した突然変異の同定および評価、体細胞変動の検出、分子進化での遺伝的多様性を決定すること、およびゲノム性配列の、例えばウイルス性および細菌性単離物の決定を可能にする迅速で、そして信頼できる方法で核酸をデノボ(de novo)配列決定または再配列決定するために有用である。本発明は、発現プロファイルに関与する1つ以上の生物学的サンプルにおける全ての核酸分子の同定、すなわち、発現されるmRNAの発現を迅速に配列決定することによって、規定の時間で、規定の細胞で発現される全てのmRNAの同定にも有用である。
質量分光測定法での最近の能力で、長さ〜50塩基より大きな核酸を配列決定することは実施不可能である。その結果、実施不可能で、そして面倒な数の独立の配列決定反応は、目的の遺伝子または他の遺伝的領域の数千の塩基に及ぶことが必要である。下に示される本発明の方法は、この制限を克服する。同時に、本発明の方法は、広範な範囲の可能性のある突然変異について標的核酸をスクリーニングすることが制限される他の断片化工程と異なる。実際に、本明細書に記述されたとおり相補的切断反応の適切な選択は、遺伝的変動の余剰配置および特性の決定を可能にする。さらに、コンピューター処理プロトコールが、記述された方法の絶対必要な部分であることが本明細書に示される。方法およびアルゴリズムは、基準配列(類)に基づいて、(i)規定の特性の1つ以上の切断反応と関連したスペクトルの変化、および(ii)特異的に定義された配列変動の間の関係を推定することが必要とされる。
本発明の方法は、断片−ラダーを作製することなしに、規定の標的配列で、すなわち、1つの共通終止点を共有する断片の繰込まれた集合で、位置ごとに相互関連を可能にする。その方法は、部分的に、1つ以上の標的核酸を、相補的モノヌクレオチド−および/またはジヌクレオチド−特異的切断の集合にさせることを特徴とし、その産物は、質量分析(MS)によって分析される。本発明による好ましい方法は、2つまたはそれ以上の分離反応の方法によって各ヌクレオチドでの1つ以上の標的核酸の特異的切断を包含する。本明細書に記述されたもののようなモノヌクレオチド−およびジヌクレオチド−特異的切断反応で得られる消化産物は、モノヌクレオチドから数十のヌクレオチドの断片までの範囲にあり、そして特に、MSによる分析に十分に適している。本発明のこの態様は、最近のMS作用の下で断片−ラダーを分析する時に出合った短い読取り長の技術的制限を克服する。その方法で得られた質量スペクトルは、配列の簡単な読取りを供しなかった。本明細書に提供されるコンピューター処理のアプローチ法は、関連した基準配列について知られるか、または推定されるもので得られたスペクトルの比較分析を可能にする。
(a)標的核酸の誘導および塩基特異性を用いた切断のアプローチ
核酸分子は、当技術分野において十分に知られている多数の手段のいずれかを用いて、特定の生物学的サンプルから単離でき、そして選択される特定の単離手段は、特定の生物学的サンプルに適切である。それに本発明の方法を行う単離標的核酸の適切な量を得るために、標的核酸の増幅は、必要であり得る。本発明に使用するための適切な増幅手段の例は、それに限定されないが、クローニング〔Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989年)〕、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)〔Newton C.R.およびGraham A.、PCR、BIOS Publishers(1994年)〕およびRT−PCRのような変形〔Higuchiら、Bio/Technology 11巻:1026-1030頁(1993年)〕および対立遺伝子特異的増幅(ASA)、鎖置換増幅(SDA)〔Terrance Walker G.ら、Nucleic Acids Res.22巻:2670-77頁(1994年)〕、および転写に基づく工程が挙げられる。
本発明の配列決定法の作用は、以下の相互に関係した因子:(1)配列決定されるべき領域の長さ、(2)MS分析の分離能、および(3)ある程度の範囲まで、配列それ自身に依存すべき当業者により理解される。その結果、目的の領域が長いほど、消化産物の数が多くなり、分解能は、いっそう重大になる。さらに、配列決定されるべき領域の長さは、4つの塩基特異的断片化パターンのみに基づいて、明瞭にマッピングされえない単独ヌクレオチド置換の数に直接的に比例する(実施例1;図4)。いくつかの配列モチーフは、配列決定することが本質的に困難である。このような配列の例は、C1およびC2での突然変異が、それぞれ、C5およびC4での同じ型の突然変異と区別できないCTAGC1C2C3C4C5GATC(配列番号:15)である。別のこのような配列は、G1−>Aが、G3−>A突然変異と区別できないGAG1A2A3A4GAである;同様に、A2−>GおよびA4−>Gは、際立ち得ない。最終的に、4つのモノ−ヌクレオチド特異的切断は、複雑な配列変動を分析するのに不十分である可能性もある(下の検討基準)。したがって、最も好ましくは、本発明の実施としては、意図される領域の再配列決定攻略法のコンピューター補助シュミレーションが挙げられる。このようなシュミレーションおよび分析は、その配列での可能性のある問題の位置を示し、そしてこのような配列決定困難さを克服する対抗測定として、特定の追加の相補的切断反応の有用さを評価するために使用され得る。
さらに別のそれの実施態様では、本発明の方法は、ジヌクレオチド−または緩和ジヌクレオチド−特異性により特徴づけられる核溶解工程を含む。結果物である消化産物のサイズの分布が、モノヌクレオチド特異的切断により生成される4ヌクレオチドの平均長を示す断片より、MSによる分析にさらに適しているので、このような切断の緊縮は、長い標的配列の分析を促進する。本発明のこの態様で有用であるのは、例えば、Mead D.らの国際公開公報第94/21663号(PCT/US94/03246)によって記述されるもののようなジヌクレオチド配列でDNAを切断する能力のある制限エンドヌクレアーゼ試薬である。本発明の実施に有用であるピリミジン−アデノシン(CAおよびUA)バンドを優勢に加水分解するRNアーゼも、同定された〔大腸菌RNアーゼ−M、Cannistraro V.およびKennell D.、Eur.J.Biochem. 181巻: 363-370頁(1989年);サッカロマイセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)から単離されたエンドリボヌクレアーゼでのように、Stevens A.ら、J.Bacteriol. 164巻: 57-62頁(1985年);およびエンテロバクター属(Enterobacter sp.)でのように、Marotta C.ら、Biochemistry 12巻: 2901-2904頁(1973年)により記述されるC−リボヌクレアーゼ〕。本発明に開示および例示されるとおり、これらの酵素の特異性は、必要とされる場合、本質的に、一方ではdUMP(またはdTMP)を、そして他方ではdCMPを組込む標的核酸の使用によって、CA−またはUA−結合に制限される可能性がある。
1.類似のまたは代替の特異性を示す他のまたは別のRNアーゼ(単独または組合せで)の使用;
2.本発明の方法と比較して有用な特徴を示す突然変異体または化学的に修飾されたRNアーゼの使用〔例えば、自然のホスホジエステル基質よりホスホロチオエート類似体を好むRNアーゼT1突然変異体については、Loverix S.ら、Nature Struct. Biol. 5巻: 365-368頁(1998年)基準;さらに、化学的に修飾されたRNアーゼを用いた制限消化の生成については、contreras R.およびFiers W.、FEBS Lett. 16巻: 281-283頁(1971年)基準〕;
3.代替イソタイプを組込むヌクレオチドを含めた、異なる質量および/または反応性を示す他のヌクレオチド類似体の使用;
4.化学的〔Maxam A.およびGilbert W.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74巻:560-564頁(1977年);Richterich P.ら、Nucleic Acids Res.23巻:4922-4923頁(1995年)〕または酵素的のいずれかでの代替特異的断片化法が挙げられる。
別の態様では、本発明の方法は、サンプル核酸中の少なくとも2つの非隣接領域の同時配列決定に向けられる。断片−ラダー(すなわち、共通終点を共有するネスト化集合の断片)を生成する伝統的配列決定法と対照的に、本明細書で概説される攻略法は、多重の配列決定のために同等に有用である。本発明による多重の配列決定は、一般に、標的核酸の選択領域の増幅に関与する。これは、増幅すべき標的核酸と隣接するかまたは共末端である専用のプライマー対のセットを用いることによって達成され得る。または、多重の標的核酸の製造は、サンプル核酸から誘導される制限断片の付随増幅を包含する。ある種のアプローチ法は、実施例5で示され、そして例示される。多重の配列決定の特別の場合は、二本鎖標的核酸の2つの相補的鎖の同時分析から構成される。
本発明の実施に有用である質量分光測定法としては、マトリックス介助レーザーデソープションイオン化(MALDI)およびエレクトロスプレー(ES)のようなイオン化技術が挙げられる。これらのイオン源は、質量分光測定計の当技術分野で知られるとおり、飛行時間型(TOF;線状またはリフレクトロン配置)、単または多重の四重極、フーリエ形質転換イオンサイクロトロン共鳴(FTICR)、イオントラップ、またはこれらの組合せのような種々の分離/検出フォーマットに適合され得る。〔Limbach P.、Mass Spectrom.Rev.15巻:297-336頁(1996年);Murray K.、J.Mass Spectrom.、31巻:1203-1215頁(1996年)〕。
別の態様では、本発明の方法は、関連基準核酸との比較で、単独ヌクレオチド置換以外の配列変動を組込む1つ以上の標的核酸の診断的配列決定に向けられる。このような配列変動は、1つ以上のヌクレオチドの欠失または挿入、ならびに多重ヌクレオチドの置換に関与し得る。
本発明は、部分的に、本明細書に示されるとおり1集合の相補的切断反応で得られるスペクトルのコンピューター分析、およびこれらのデータと、公知基準配列からコンピューターで推定されたスペクトル変化の比較が、配列変動の存在、特性および位置の明瞭な決定における重要な工程であるという洞察力に支えられる。さらに詳細には、本明細書に示される実験を模擬するコンピューターのアプローチ法は、特徴的関係が、得られたスペクトルと、特定の配列変動との間に存在するかどうかを決定することが必要である。したがって、本発明の1つの態様は、コンピューターアルゴリズムを活用する方法、または標的核酸および基準核酸の間の1つ以上のヌクレオチド差から生じるスペクトルの差をコンピューター処理する能力のある方法を意図し、方法およびアルゴリズムは、基準核酸およびそれの配列変動(すなわち、ヌクレオチド差を示す標的核酸)に様々の塩基特異的切断をかけて、オリゴヌクレオチド断片を生成することを特徴とし、それにより各オリゴヌクレオチド断片の質量をコンピューター処理し、基準核酸から得られるオリゴヌクレオチド断片の質量スペクトル、および塩基特異的切断反応の各々についてのそれらの配列変動を生じ、そしてこれらのコンピューター処理で誘導された質量スペクトルを、異なる塩基特異的切断反応で実験的に得られたスペクトルと適合させる。
本発明の方法は、それに限定されないが、植物、動物、真菌、細菌およびウイルスを含めた多様な生物学的源から核酸を迅速に、そして正確に再配列決定することに特に十分に適している。再配列決定は、関連基準配列に比べて、先に知られた、ならびに未知の配列変動(例えば、突然変異および多型)の両方の検出およびマッピングを含む。断片ラダーの従来のゲル電気泳動分析に関して最も注目すべき区別は、一般に、各特定の配列(変動)が、はっきりしていて、そして特徴的な集合の(質量)ピークを生じることである。この特性は、本発明の方法を、ヘテロ接合性サンプルの信頼性のある評価、単独の生物学的サンプルから多重の標的領域の同時配列決定(すなわち、多重化)、ならびに様々のサンプルからの類似の領域の同時分析(すなわち、プール)のために有効にさせる。個々のサンプルの貯蔵分の使用は、集団における先に未知の配列変動の費用的に有効な同定を可能にするに違いない。本発明の特性のこの態様は、本発明を、医療および公衆健康の研究に価値あるものにする。非常にしばしば、このような研究は、細胞的に、そして遺伝的にヘテロ接合性であり、そしてその結果、野生型対立遺伝子に対する突然変異体低い比で突然変異を検出できるアッセイを必要とするサンプル(例えば、唾液、血液、綿棒(swabs)、パラフィン包埋組織、生検材料)に依る。
サンプル中の1つ以上の標的核酸の診断的配列決定のためのキットも提供される。好ましい態様では、このようなキットは、1つ以上の基準核酸、配列特異的切断プロトコールのための種々の試薬、およびコンピューターアルゴリズムを包含する。このようなキットは、選択的に核酸増幅試薬をも含み得る。さらに、キットは、それに限定されないが修飾ヌクレオチド基質を含めた、修飾核酸の製造のための試薬を含み得る。キットは、特定の酵素的または化学的反応に適する条件を供する緩衝液をも含み得る。さらに、キットは、特定の核酸を単離し、そして質量分光計分析のための核酸断片を作製する目的のために、固形支持体のような試薬を含み得る。
HIV−1の1200塩基対領域の診断的配列分析をモデル化すること
本発明の方法は、ヒト免疫欠損ウイルス1型(HIV−1;HXB2単離物;ゲンバンク(Genbank)アクセッション番号K03455;位置2161から3360まで)から誘導される1200塩基対配列を用いた。この配列は、方法の全体的能力、ならびにあいまいさの発生を試験するコンピューターシュミレーションにおけるモデルとして使用された。選択される領域は、逆転写酵素の全体のプロテアーゼ遺伝子および最初の〜270コドンを包含する〔Hertogs K.ら、Antimicrob.Agents Chemother.42巻:269-276頁(1998年)と比較して〕。HIVの医療上単離物のこのドメインの遺伝子型決定/再配列決定は、薬剤耐性関連突然変異の発生を監視するために特別な目的のものである。単独ならびに多重の変化は、プロテアーゼおよびRT阻害剤の抗ウイルス活性に対する感受性が減少したことを示した〔Hertogs K.ら、Antimicrob.Agents Chemother.42巻:269-276頁(1998年);Schinazi R.ら、Int.Antivir.News 4巻:95-107頁(1996年)およびそこに引用される文献〕。
テンプレートの修飾による塩基特異的切断
本実施例は、核酸分解試薬による切断の特異性が、特定のホスホジエステルが、耐性切断を結合するように標的テンプレートの修飾を通してさらに制限され得ることを示す。さらに詳細には、C−およびU−残基の両方の3′側で正常に切断するRNアーゼ−Aは、標的が、これらのヌクレオチドの内の1の2″−デオキシ類似体を組込むときに、モノヌクレオチド特異的になることが示される。多クローニング部位ならびにファージT7プロモーター配列を包含するプラスミドベクターpGEM3−Zf(+)(プロメガ、ウイスコンシン州マディソン)の領域は、モデルとして使用された(図5基準)。
RNアーゼ−T1コーディング領域の診断的配列決定
本発明の実施例は、RNアーゼ−T1コーディング領域の部分の再配列決定への本発明の方法の使用を示す。我々は、古典的ジデオキシ鎖終結方法を用いて先に配列決定された部位特異的突然変異体〔Steyaert J.、Eur.J.Biochem.247巻:1-11頁(1997年)〕の採取の利用性のため、RNアーゼ−T1コーディング領域を選択した。本実施例で使用される野生型および突然変異体の配列は、図7に示される。
実験は、実施例2に記述されるとおり本質的に行われた。最初に、選択された野生型RNアーゼ−T1標的核酸を、以下のプライマーを用いてPCRによって増幅させた:
5′−CCGGATATAAACTTCACGAAGACGG(順行)(配列番号:16)
5′−GATAGGCCATTCGTAGTAGGGAGAGC(逆行)(配列番号:17)
続いて、結果物であるアンプリコンは、5′非アニーリング伸長物としてT7プロモーター部位を組込む順行または逆行プライマーのいずれかを用いて再増幅された(図7A基準)。
5′−TAATACGACTCACTATAGGGCGACTTCACGAAGAGCGG(順行)(配列番号:18)
5′−TAATACGACTCACTATAGGGCGAATTCGTAGTAGGGAGAGC(逆行)(配列番号:19)
続いて、結果物であるプロモーター付随アンプリコンの各々は、2つの別々の転写反応でテンプレートとして使用された。T7RアンドDNAポリメラーゼ(エピセントレ(Epicentre)、ウィスコンシン州マディソン)を、それぞれCMPおよびUMPの代わりにdCMPまたはdUMPを組込む転写産物(dC−およびdU−転写産物と称される)を作成するために使用した。転写反応は、各rNTPが、2mMで存在し、そしてインキュベーションが、一夜37℃で行われる以外は、実施例2に記述されるとおり行われた。4つの全長T7−転写産物は、転写産物3′−末端に合致するビオチン化オリゴヌクレオチド(すなわち、最初の増殖工程で使用されるビオチン化形態の順行または逆行のいずれかのPCRプライマー)でアニーリングすること、および続いてストレプトアビジン微小粒子上への捕捉によって精製された。(NH4)3−シトレートを用いた集約的な洗浄の後、転写産物を溶出させた。ビーズを、3Lの水に再浮遊させ、そして90℃で、2分間維持し、続いてすぐに、磁石を用いたビーズの収集、および新たな試験管への上清の移動を行った。その後、得られた増幅標的核酸を、RNアーゼ−Aを含有する1Lの100mM(NH4)3−シトレートの添加によって完全に消化させた。最終的に、反応産物は、MALDI−TOF−MSによって分析された。
4つの単独ヌクレオチド置換が選択された(図7Bで突然変異体番号1、番号2、番号3および番号4)。突然変異体配列の各々は、野生型RNアーゼ−T1コーディング領域(実施例3a)について記述されるとおり分析された。結果は、表IVに要約される。各突然変異について、表IVは、野生型RNアーゼ−T1基準配列の5′断片が、突然変異同じく突然変異特異的である5断片によって、影響されることを示す。その変化が、見当たらす、そしてその結果、10の理論的データ点の外にどれだけ多くの突然変異同定が、実際に基礎とされるかについても示す。スペクトルの変化は、小さすぎる(<3−マー)か、または特徴的でない断片をふくむことから、見当たらない。さらに、少数の断片、例えば1つの3−マーならびに≧9.8Kdaを示す大型断片は、実験的に観察されなかった。突然変異番号2に関する結果は特に興味深い。これらの結果は、本発明を実際的に最もよく示す。この特定の場合には、4つ全てのモノ−ヌクレオチド特異的解列反応は、突然変異の検出を生じる。すなわち、だれもが、その配列が、野生型RNアーゼ−T1コーディング領域と異なることに気づく。しかし、単独で行われた場合、これらの反応で、突然変異の明瞭なマッピングに至るものはない。(+)鎖におけるC−反応は、1947Daの新たな断片を生じる。単独ヌクレオチド突然変異番号のみが、このような6−マー〔組成=A3G(dU)C〕の作成を説明できるのでない。例えば、これは、配列CTACTACをCAAGTACに変換する二重突然変異についての場合でもある(図7基準);TACピークは、3−マーのような第三の存在のため失われない。(+)鎖におけるT−反応は、1つの断片の質量が、基準スペクトルと比較したときに56Daまで増加したスペクトルを生じる。これは、dCのGへに置換を示唆する。切断産物が、3つのdC残基を含むので、置換を位置決めすることは可能でない。(−)鎖におけるC−反応は、一見したところで最も情報を与えるものである;大きな基準断片は、切断によって影響される。しかし、断片の配列(GTAG1TT...TG2GATC)(配列番号:20)は、G1−>CおよびG2−>C突然変異の両方が、9814Daおよび1289Daの観察される産物〔組成=GA(dU)C〕を説明するようなものである。最終的に、(−)鎖におけるT−反応は、最後の情報を与えるものであり、そして944Da〔A(dC)U〕のピークの外観は、多くの異なる方法で説明され得る。A(dC)U−断片は、例えば、配列伸縮TAT1TTでCについてのT1−残基の置換によって生成される(図7基準)。結論として、突然変異番号2は、いくつかの場合には、配列変動の特性および位置が、少なくとも2つの異なる相補的切断反応の組合せによってのみ決定され得ることを例示する。
表IVに示される分析は、野生型RNアーゼ−T1配列および単独ヌクレオチド置換の内の1つの等モル混合物が、試験される実験を模擬するのに使用され得る。ヘテロ接合性の遺伝子型を模擬するこのような場合に、スペクトルは、(野生型)基準配列から誘導される全てのものに加えて、多数の新規断片を含む。したがって、突然変異/多型の特徴および配置は、必然的に、新規断片のみに基づく。明瞭さは、新規断片が、突然変異を特徴的に定義するのに十分であることを必要とする。当業者は、各々の対立遺伝子が目立った集合のピークに関連しているので、接合状態決定が、本発明の方法を用いて単純であることを認識する。
本発明の方法は、単独ヌクレオチド置換の分析に限定されない。複雑な変動も、配列決定され得る。表IVは、多数のRNアーゼT1多突然変異体、さらに詳細には二重および三重突然変異体(図7Bで突然変異番号5、番号6、番号7および番号8)と関連することが推定されるスペクトル変化を列記する。上に記述されるとおり、多突然変異体は、特有の数のスペクトル変化に関連する。多置換の場合に、関与した欠失または挿入なしに、影響された基準断片の数は、新規断片の数に常に一致する。二重突然変異体については、スペクトル変化の数は、突然変異が隣接する場合(突然変異番号5)では、12から、突然変異が、少なくとも1つのA、G、CおよびTを含む配列によって分離される場合には最大20までの範囲にある。後者の場合には、二重突然変異体は、2つの同時に起こるが、しかし独立の単独ヌクレオチド置換として処理されることである。三重突然変異体は、最小14スペクトル変化(突然変異体番号7)に関連する。単独ヌクレオチド置換を用いた場合、全てではない論理的スペクトル変化が、観察され得るか、または可能性があり、そして情報の部分は、失われる。しかし、その場合の膨大な大半では、得られたスペクトルおよび基準核酸配列(類)に基づいて、体系的コンピューター分析は、配列変動を明瞭に同定および配置できる。
〜1000の塩基対領域の質量分光測定分析
本発明の方法は、断片−ラダーの分析に関与する最近のMSに基づく配列決定方法論に遭遇した短い読取り長さの制限を克服するように設計される。適用法によって、数百またはさらに数1000の塩基対の標的領域が、分析され得ることを予測できる。本実施例は、多数のオリゴヌクレオチド断片が、本発明の方法によって同時に分析され得ること、そしてその結果として、検出プラットホームは、方法論に制限を課さないことを示す。
遺伝子型決定
本発明の方法は、サンプル核酸の多重非隣接領域の診断的配列決定を行うためにも有用である。これは、本発明を、全ゲノムの発見、ならびに多型の日常的評価(例えば、SNP)およびゲノムDNA中の多遺伝子座での突然変異のために有用にさせる。このような多重遺伝子型決定は、概念的に、再配列決定と差がない;両方とも、改変が、特徴づけられそして明白に位置決めされることを必要とする。上に記述される単独標的配列に関与する腎炎に類似して、コンピューターシュミレーションは、観察されたスペクトル変化の内の1つが、特定のゲノム改変に特徴的に関連していることを見出すために行われ得る。多重遺伝子型決定が、多数の変異体位置の同定/診断を必要とするのみであるので、当業者によって、(i)多重標的核酸の複雑さ(すなわち、合せた長さ)が、全長の再配列決定の場合より明らかに長いこと、および(ii)単独突然変異切断反応が、対立遺伝子および接合性同定の両方についてしばしば十分であり得ることが認識される。各々が、2つの選択的形態の一連の重対立遺伝子のSNPの内の1つを積極的に同定する2つの配列特異的切断の使用に関与する使用法も、本発明の方法を積極的に使用する。例えば、ヒトにおける最も共通な型の点突然変異および多型である多くのCからTへの転位は、C−およびT(U)−特異的反応の組合せにより容易に評価され得る。ゲル電気泳動の配列決定を使用して分析されたヘテロ接合性のサンプルは、意識して同定するのはしばしば困難であることを話題にする価値がある。本明細書で記述される方法で、ヘテロ接合性性の検出は、野生型および突然変異特異的な集合の質量スペクトルピークの両方の存在のために明瞭である。
cDNAライブラリー分析−転写プロファイリング
診断的配列決定は、一般に、定義された核酸で行われる。すなわち、どの基準配列に標的核酸が対応するかを知る。しかし、本発明による再配列決定法は、特定の配列を同定または分類するためにも使用され得る。このような実験では、相互いに関係した核酸(例えば、DNAのランダムクローン)は、典型的に、(より)大きなサンプル配列の未知部分に対応するか、または生物学的サンプルに存在する複数の核酸の内の1つ、または両方の組合せを表す。未知核酸から誘導される質量スペクトルを、関連基準配列(類)、またはその部分について知られるか、または推定されるものと比較する。この型の実験で、相互に関係した標的配列のいくつかが、必ずしも基準配列中にそれらの相手を有することを必要するとはかぎらないこと、そして逆も同じであることに注目すべきである。本発明の方法による配列同定は、同時に、可能な配列変動を示し得ることは確認され得る。したがって、相互に関係した配列は、データベースの配列の1つに同一であるとして、基準配列のようなものの変異体として、または合致する配列がなんら見出されない場合には新規として分類され得る。
全−ゲノム再配列決定
過去数年で、全ゲノム、特に微生物のものを配列決定するための技術は、成熟してきた。50以上の微生物のゲノムは、2000年までに完了されると予定され、そしてこの巨大な知識から生じる利益は、迅速に明確になりつつある〔Clayton R.ら、Curr.Opinion Microbiol.1巻:562-566頁(1998年)〕。全部の微生物ゲノムが、日常的になりつつあること、および微生物の遺伝学が、「比較ゲノム」の時代に入りつつあることは明らかなようである。完全なゲノム配列の知識は、系統発生的分析における最終道具であり、遺伝子/機能性多様性研究を可能にし、そして研究が、生物で行われる手段を基礎的に変化させる。現時点で、各新たなゲノム配列の実質的部分は、データベース合致を示さない。だれでも、微生物種多様性が、よりよく表される場合に、将来、より大きな比率のオルソロガス(orthologous)遺伝子を見出すことを予想する。その時点で、生成された配列のほとんどが、すでに知られた配列に類似する場合に、全体的ゲノム分析は、デノボ配列決定法によるよりむしろ、本明細書に記述されるとおり再配列決定攻略法を使用することによって、迅速に、正確に、そして費用有効に行われ得る。同様の進化は、多くの(モデル)生物についてのゲノム計画が、進行中であるか、またはすでに終了している細菌の遺伝学分野の外側で予測され得る(例えば、ドロソフィア・メラノガステル(Drosophila melanogaster)、カエノルハブジチス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)、ヒト、マウス、アラビドプシス・タリアナ(Arabidopsis thaliana)、およびコメ)。
Claims (26)
- 1つ以上の生物学的サンプルに存在する1つ以上の標的核酸の配列分析の方法であって、
(a)1つ以上の標的核酸を1つ以上の生物学的サンプルから単離する工程であって、好ましくは、標的核酸は、標的核酸の相補的(+)および(−)鎖、又は1つ以上のヌクレオシドが塩基、糖及び/又はリン酸部分において修飾された、サブユニットを組込みこまれた形態とすることができ、
(b)工程(a)から得られた1つ以上の標的核酸を、酵素的切断、化学的切断、および物理的切断からなる群より選択される別個の塩基特異的又は配列特異的相補的切断反応の4つのセットに付す工程であって、各切断反応が、非整列断片のセットを生成する工程、
(c)工程(b)から得られた非整列断片の4つのセットを質量分析法によって分析する工程、及び、
(d)工程(c)から得られた4つのセットの質量分析スペクトルを公知の基準配列についてコンピューターで予想されたスペクトルと比較することを含むか、又は工程(c)から得られた4つのセットの質量分析スペクトルを全ての可能な配列順列についてコンピューターで予想されたスペクトルと比較することを含む、工程(c)から得られた4つのセットの質量分析スペクトルについて体系的コンピューター分析を行い、上記標的核酸の配列を分析する工程、
を含む方法。
- 1つ以上の生物学的サンプルが、真核生物、原核生物及びウイルスからなる群より選択される生物に由来する、請求項1に記載の方法。
- 1つ以上の標的核酸が、一本鎖DNA、二本鎖DNA、cDNA、一本鎖RNA、二本鎖RNA、DNA/RNAハイブリッドおよびDNA/RNAモザイク核酸からなる群より選択される、請求項1又は2に記載の方法。
- 1つ以上の標的核酸が、インビボでの、クローニング、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、逆転写その後のポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)、鎖置換増幅(SDA)及び転写に基づく方法からなる群より選択される1つ以上の連続的な増幅手段によって得られる、請求項1〜3いずれか1項に記載の方法。
- 1つ以上の増幅された標的核酸が、下記工程:
(a)1つ以上の標的核酸に転写制御配列を作用的に連結する工程、及び
(b)1つ以上の標的核酸上の転写制御配列を認識する1つ以上のRNAポリメラーゼを用いて、工程a)の1つ以上の標的核酸の一方または両方の鎖を転写させる工程
を含む方法によって1本鎖又は2本鎖標的核酸から生成された転写物である、請求項4に記載の方法。
- 上記転写制御配列が、5′伸張部分のような転写制御配列を組み込むプライマーを用いるPCR増幅によって1つ以上の標的核酸に作用的に連結される、請求項5に記載の方法。
- 転写制御配列が、真核生物の転写制御配列、原核生物の転写制御配列およびウイルスの転写制御配列からなる群より選択される、請求項5又は6に記載の方法。
- 原核生物の転写制御配列が、T3、T7及びSP6プロモーターからなる群より選択される、請求項7に記載の方法。
- T3、T7又はSP6プロモーターを利用するRNAポリメラーゼが、野生型または突然変異体のRNAポリメラーゼであって、突然変異体ポリメラーゼが、2′デオキシ、2′−O−メチル、2′−フルオロ又は2′−アミノ置換基を有する非標準基質を転写物内に組込むことができる、請求項8に記載の方法。
- 突然変異体RNAポリメラーゼが、T7又はSP6突然変異体ポリメラーゼのいずれかである、請求項9に記載の方法。
- 一つ以上の標的核酸が、塩基、糖及び/又はリン酸部分において修飾された1つ以上のヌクレオシドを組み入れ、修飾が、1つ以上の切断反応による切断の特異性、及び/又は、切断産生物の質量及び/又は長さを改変する、請求項1〜10いずれか1項に記載の方法。
- 修飾が、修飾デオキシヌクレシド三リン酸、修飾リボヌクレオシド三リン酸、及び/又は修飾ジデオキシヌクレオシド三リン酸の酵素的組み込みによって導入されるか、修飾が、化学的に導入されるか、又は修飾が、両方法の組み合わせによって導入される、請求項11に記載の方法。
- 修飾が、ヌクレオチド三リン酸上の2′−デオキシ、2′−O−メチル、2′−フルオロ又は2′−アミノ置換基からなる、請求項11又は12に記載の方法。
- 修飾が、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合又はアルカリ化試薬とさらに反応したホスホロチオアートヌクレオシド間結合からなる、請求項11又は12に記載の方法。
- 修飾が、ウリジン−5′−一リン酸サブユニットのC5上のメチル基からなる、請求項11又は12に記載の方法。
- 修飾が、代替的同位元素を組み込むヌクレオチドからなる、請求項11又は12に記載の方法。
- 工程(a)の1つ以上の標的核酸が、切断の前に精製されている、請求項1〜16いずれか1項に記載の方法。
- 上記精製が、固定化によってか又はクロマトグラフィーによって行われる、請求項17に記載の方法。
- 相補的切断反応が、弛緩モノヌクレオチド特異性、モノヌクレオチド特異性、弛緩ジヌクレオチド特異性またはジヌクレオチド特異性を特徴とする、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 1つ以上の標的核酸が、アルカリ又はマクサム・ギルバート配列決定法において用いられる試薬を用いる処理からなる化学的消化反応に付される、請求項19に記載の方法。
- 1つ以上の標的核酸が、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼからなる群より選択される1つ以上の酵素を用いる酵素的切断反応に付される、請求項19に記載の方法。
- 1つ以上の標的核酸が、制限酵素、RNAエンドヌクレアーゼ、及びDNAエンドヌクレアーゼからなる群より選択される1つ以上のエンドヌクレアーゼを用いる酵素的切断反応に付される、請求項21に記載の方法。
- 1つ以上のエンドヌクレアーゼが、G特異的T1リボヌクレアーゼ、A特異的U2リボヌクレアーゼ、A/U特異的phyMリボヌクレアーゼ、U/C特異的リボヌクレアーゼA、C特異的ニワトリ肝臓リボヌクレアーゼ(RNアーゼCL3)、クサチビン、及び大腸菌(E. coli)、エンテロバクター属(Enterobacter sp.)又は酵母(Saccharomyces cerevisiae)から単離されるピリミジン−アデノシンを好むRNアーゼからなる群より選択される、1つ以上の選択的RNAエンドヌクレアーゼである、請求項22に記載の方法。
- 1つ以上の標的核酸が、ホスホロチオアート修飾一本鎖DNA又はRNAであり、そして核酸消化が、ヌクレアーゼP1を用いて行われる、請求項1〜8、11〜12及び14〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 1つ以上の標的核酸が、突然変異体ポリメラーゼを用いて調製されたモザイクのRNA/DNA核酸又は修飾されたモザイクのRNA/DNA核酸であって、切断試薬が、RNAエンドヌクレアーゼ、DNAエンドヌクレアーゼ又はアルカリである、請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 1つ以上の標的核酸が、野生型又は突然変異体RNAポリメラーゼを用いて調製された、転写物、修飾された転写物、モザイクのRNA/DNA転写物又は修飾されたモザイクのRNA/DNA転写物であり、切断試薬が、1つ以上の選択的RNAエンドヌクレアーゼ又はアルカリである、請求項1〜23及び25のいずれか1項に記載の方法。
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