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Description
【特許請求の範囲】
【請求項1】 1つ以上の生物学的サンプルに存在する1つ以上の標的核酸の配列分析の方法であって、
(a)1つ以上の標的核酸を1つ以上の生物学的サンプルから得る工程、
(b)工程(a)から得られた1つ以上の標的核酸を、別個の塩基特異的、配列特異的又は部位特異的相補的切断反応のセットに付す工程であって、各切断反応が、非整列断片のセットを生成する工程、
(c)工程(b)から得られた非整列断片のセットを質量分析法によって分析する工程、及び、
(d)工程(c)から得られた質量分析スペクトルについて体系的コンピューター分析を行い、上記標的核酸の配列を分析する工程、
ここで、上記相補的切断反応は、種々の特異性を特徴とする標的核酸消化及び/又は標的配列の別の形態の消化をいう、
を含む方法。
【請求項2】 1つ以上の生物学的サンプルが、真核生物、原核生物及びウイルスからなる群より選択される生物に由来する、請求項1に記載の方法。
【請求項3】 1つ以上の標的核酸が、一本鎖DNA、二本鎖DNA、cDNA、一本鎖RNA、二本鎖RNA、DNA/RNAハイブリッドおよびDNA/RNAモザイク核酸からなる群より選択される、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項4】 1つ以上の標的核酸が、インビボでの、クローニング、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、逆転写その後のポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)、鎖置換増幅(SDA)及び転写に基づく方法からなる群より選択される1つ以上の連続的な増幅手段によって得られる、請求項1〜3いずれか1項に記載の方法。
【請求項5】 1つ以上の増幅された標的核酸が、下記工程:
(a)1つ以上の標的核酸に転写制御配列を作用的に連結する工程、及び
(b)1つ以上の標的核酸上の転写制御配列を認識する1つ以上のRNAポリメラーゼを用いて、工程a)の1つ以上の標的核酸の一方または両方の鎖を転写させる工程
を含む方法によって1本鎖又は2本鎖標的核酸から生成された転写物である、請求項4に記載の方法。
【請求項6】 上記転写制御配列が、5′伸張部分のような転写制御配列を組み込むプライマーを用いるPCR増幅によって1つ以上の標的核酸に作用的に連結される、請求項5に記載の方法。
【請求項7】 転写制御配列が、真核生物の転写制御配列、原核生物の転写制御配列およびウイルスの転写制御配列からなる群より選択される、請求項5又は6に記載の方法。
【請求項8】 原核生物の転写制御配列が、T3、T7及びSP6プロモーターからなる群より選択される、請求項7に記載の方法。
【請求項9】 T3、T7又はSP6プロモーターを利用するRNAポリメラーゼが、野生型または突然変異体のRNAポリメラーゼであって、突然変異体ポリメラーゼが、2′デオキシ、2′−O−メチル、2′−フルオロ又は2′−アミノ置換基を有する非標準基質を転写物内に組込むことができる、請求項8に記載の方法。
【請求項10】 突然変異体RNAポリメラーゼが、T7又はSP6突然変異体ポリメラーゼのいずれかである、請求項9に記載の方法。
【請求項11】 得られた標的核酸が、塩基、糖及び/又はリン酸部分において修飾された1つ以上のヌクレオシドを組み入れる方法であって、修飾が、1つ以上の切断試薬による切断の特異性、及び/又は、切断産生物の質量及び/又は長さを改変する、請求項1〜10いずれか1項に記載の方法。
【請求項12】 修飾が、修飾デオキシヌクレシド三リン酸、修飾リボヌクレオシド三リン酸、及び/又は修飾ジデオキシヌクレオシド三リン酸の酵素的組み込みによって導入されるか、修飾が、化学的に導入されるか、又は修飾が、両方法の組み合わせによって導入される、請求項11に記載の方法。
【請求項13】 修飾が、ヌクレオチド三リン酸上の2′−デオキシ、2′−O−メチル、2′−フルオロ又は2′−アミノ置換基からなる、請求項11又は12に記載の方法。
【請求項14】 修飾が、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合又はアルカリ化試薬とさらに反応したホスホロチオアートヌクレオシド間結合からなる、請求項11又は12に記載の方法。
【請求項15】 修飾が、ウリジン−5′−一リン酸サブユニットのC5上のメチル基からなる、請求項11又は12に記載の方法。
【請求項16】 修飾が、代替的同位元素を組み込むヌクレオチドからなる、請求項11又は12に記載の方法。
【請求項17】 工程(a)の1つ以上の標的核酸が、切断の前に精製されている、請求項1〜16いずれか1項に記載の方法。
【請求項18】 上記精製が、固定化によってか又はクロマトグラフィーによって行われる、請求項17に記載の方法。
【請求項19】 相補的切断反応が、酵素的切断、化学的切断および物理的切断からなる群より選択される、請求項1〜18いずれか1項に記載の方法。
【請求項20】 相補的切断反応が、弛緩モノヌクレオチド特異性、モノヌクレオチド特異性、弛緩ジヌクレオチド特異性またはジヌクレオチド特異性を特徴とする、請求項19に記載の方法。
【請求項21】 1つ以上の標的核酸が、アルカリ又はマクサム・ギルバート配列決定法において用いられる試薬を用いる処理からなる化学的消化反応に付される、請求項19又は20に記載の方法。
【請求項22】 1つ以上の標的核酸が、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼからなる群より選択される1つ以上の酵素を用いる酵素的切断反応に付される、請求項19または請求項20に記載の方法。
【請求項23】 1つ以上の標的核酸が、制限酵素、RNAエンドヌクレアーゼ、DNAエンドヌクレアーゼ及び非特異的ホスホジエステラーゼからなる群より選択される1つ以上のエンドヌクレアーゼを用いる酵素的切断反応に付される、請求項22に記載の方法。
【請求項24】 1つ以上のエンドヌクレアーゼが、G特異的T1リボヌクレアーゼ、A特異的U2リボヌクレアーゼ、A/U特異的phyMリボヌクレアーゼ、U/C特異的リボヌクレアーゼA、C特異的ニワトリ肝臓リボヌクレアーゼ(RNアーゼCL3)、クサチビン、非特異的RNアーゼI、及び大腸菌(E. coli)、エンテロバクター属(Enterobacter sp.)又は酵母(Saccharomyces cerevisiae)から単離されるピリミジン−アデノシンを好むRNアーゼからなる群より選択される、1つ以上の選択的か又は非選択的RNAエンドヌクレアーゼである、請求項23に記載の方法。
【請求項25】 1つ以上の標的核酸が、ホスホロチオアート修飾一本鎖DNA又はRNAであり、そして核酸消化が、ヌクレアーゼP1を用いて行われる、請求項1〜8、11〜12及び14〜24のいずれか1項に記載の方法。
【請求項26】 1つ以上の標的核酸が、突然変異体ポリメラーゼを用いて調製されたモザイクのRNA/DNA核酸又は修飾されたモザイクのRNA/DNA核酸であって、切断試薬が、RNAエンドヌクレアーゼ、DNAエンドヌクレアーゼ又はアルカリである、請求項1〜24のいずれか1項に記載の方法
【請求項27】 1つ以上の標的核酸が、野生型又は突然変異体RNAポリメラーゼを用いて調製された、転写物、修飾された転写物、モザイクのRNA/DNA転写物又は修飾されたモザイクのRNA/DNA転写物であり、切断試薬が、1つ以上の選択的か若しくは非選択的RNAエンドヌクレアーゼ又はアルカリである、請求項1〜24及び26のいずれか1項に記載の方法。
【請求項28】 1つ以上の標的核酸が、突然変異体T7又はSP6ポリメラーゼを用いて調製された、dCMP、dUMP又はdTMPのいずれかを取り込むモザイクのRNA/DNA転写物であり、切断試薬が、RNアーゼAのようなピリミジン特異的RNアーゼである、請求項1〜24又は26〜27のいずれか1項に記載の方法。
【請求項29】 工程(b)の非整列断片のセットが、イオン交換ビーズを用いてさらに精製された、請求項1〜28のいずれか1項に記載の方法。
【請求項30】工程(b)の非整列断片のセットが、固体支持体上にスポットされている、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】 上記固体支持体が、固体表面、プレート及び細片(チップ)からなる群より選択される、請求項30記載の方法。
【請求項32】 核酸断片の質量分析的分析が、マトリックス介助レーザーデソープション/イオン化飛行時間型(MALDI−TOF)、エレクトロスプレーイオン化(ESI)およびフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴(FT−ICR)からなる群より選択される質量分析的方法を用いて行われる、請求項1〜31のいずれか1項に記載の方法。
【請求項33】 基準核酸配列が公知である1つ以上の標的核酸の配列分析のための請求項1〜32のいずれか1項に記載の方法であって、請求項1の工程(c)において得られた非整列断片の1つ以上の質量スペクトルを基準核酸配列の質量スペクトルの公知又は予想質量スペクトルと比較し、そしてそこから体系的コンピューター分析によって1つ以上の標的核酸の全て又は一部のヌクレオチド配列を推定し、そして推定されたアミノ酸配列を基準核酸と比較し、1つ以上の標的核酸が、基準核酸と同一の配列又は異なる配列を有するかどうかを決定する付加的工程を含む方法。
【請求項34】 決定された核酸配列差が、欠失、置換、挿入又はそれらの組み合わせである、請求項33に記載の方法。
【請求項35】 核酸配列差が、単一ヌクレオチド多形(SNP)である、請求項34に記載の方法。
【請求項36】 1つ以上の生物学的サンプルに存在する1つ以上の標的核酸の公知及び未知のヌクレオチド配列変異をスコアするための請求項33〜35のいずれか1項に記載の方法の使用。
【請求項37】 上記の公知及び未知のヌクレオチド配列変異の決定が、所定の領域/遺伝子の種々の対立遺伝子配列の同定、疾患関連突然変異のスコア、体細胞変異の検出又は分子進化の領域における研究を可能にする、請求項36に記載の使用。
【請求項38】 1つ以上の標的核酸について得られたスペクトルを、複数の参照核酸について予測された質量スペクトルと比較し、それによって、1つ以上の生物学的サンプルにおける1つ以上の標的核酸を同定する/検出する、請求項33に記載の方法の使用。
【請求項39】 1つ以上の生物学的サンプルにおける1つ以上の標的核酸の発現プロフィールを測定するための、請求項38に記載の使用。
【請求項40】 1つ以上の生物学的サンプルに存在する1つ以上の標的核酸の未知配列の配列分析のための、請求項1〜32のいずれか1項に記載の方法であって、上記方法が、下記工程:
(a)1つ以上の生物学的サンプルから1つ以上の標的核酸を一本鎖形態で引き出す工程、
(b)工程(a)から得られた1つ以上の標的核酸を、4つの別々の塩基特異的相補的切断反応のセットに付す工程であって、各切断反応が、非整列断片のセットを生成する工程、
(c)工程(b)から得られた非整列断片のセットを質量分析法によって分析する工程、
(d)工程(c)から得られた質量スペクトルについて体系的コンピューター分析を行い、上記標的核酸の配列をアセンブルする工程、及び
(e)もし配列が工程(d)の後で一義的に決められないなら、場合により、工程(a)〜(d)を反復し、それによって、上記標的核酸及び/又は上記標的核酸の異なる部分の改変された形態を生成し、結合データが一義的配列の解に収束するまで追加的モノヌクレオチド及び/又はジヌクレオチド特異的切断反応を行い、非整列断片の追加的セットを提供する工程、
ここで、上記相補的切断反応とは、さまざまな特異性を特徴とする標的核酸消化及び/又は標的配列の別の形態の消化をいう、
を含む方法。
【請求項41】 1つ以上の生物学的サンプルに存在する1つ以上の未知配列の標的核酸の配列分析のための、請求項40に記載の方法の使用。
【請求項42】 1つ以上の生物学的サンプルにおける1つ以上の未知配列の標的核酸の配列決定のための、請求項40に記載の方法の使用。
【請求項43】 1つ以上の生物学的サンプルのゲノム全体の遺伝子型分類のための、請求項33〜35及び40のいずれか1項に記載の方法の使用。
【請求項44】 1つ以上の生物学的サンプルにおける基準核酸が公知である、1つ以上の標的核酸の、請求項1〜35のいずれか1項に記載の方法による、質量分析法を用いる配列分析のためのキットであって、キットが、
(a)1つ以上のヌクレオチド三リン酸、
(b)1つ以上のポリメラーゼ、
(c)1つ以上の核酸切断剤、及び
(d)核酸配列が公知である、1つ以上の基準核酸のセット
(e)場合により、標的核酸を精製するための試薬、
(f)場合により、非整列断片のセットを精製するためのイオン交換ビーズ、
(g)場合により、その上に非整列断片のセットをスポットすることができる固体支持体、及び
(h)場合により、1つ以上の標的核酸の質量スペクトルを基準核酸の質量スペクトルと比較し、それから標的核酸の核酸配列を推定するためのコンピューターソフトウェア
を含むキット。
【請求項45】 1つ以上の生物学的サンプルに存在する、基準核酸配列が公知である1つ以上の標的核酸
の配列を分析するための、
における配列差を決定するための、
同標的核酸における公知及び未知ヌクレオチド配列変異をスコアするための、
同標的核酸を検出及び/又は同定するための、又は
同標的核酸を用いてゲノム全体の遺伝子型分類を行うための、
請求項44に記載のキットの使用。
【請求項46】 質量分析法を用いる、1つ以上の生物学的サンプルにおける1つ以上の未知の標的核酸の、請求項1〜32及び40のいずれか1項に記載の方法による配列分析のためのキットであって、キットが、下記:
(a)1つ以上のヌクレオチド三リン酸、
(b)1つ以上のポリメラーゼ、及び
(c)1つ以上の核酸切断剤、
(d)場合により、標的核酸を精製するための試薬、
(e)場合により、非整列断片のセットを精製するためのイオン交換ビーズ、
(f)場合により、その上に非整列断片のセットをスポットすることができる固体支持体、及び
(g)場合により、該標的核酸の配列を分析し、1つ以上の一義的配列をもたらすためのコンピューターソフトウェア
を含むキット。
【請求項47】 1つ以上の生物学的サンプルに存在する未知配列を有する1つ以上の標的核酸の配列を分析するための、配列を決定するための、又は、この1つ以上の標的核酸を用いるゲノム全体の遺伝子型決定を行うための、請求項46に記載のキットの使用。
【請求項1】 1つ以上の生物学的サンプルに存在する1つ以上の標的核酸の配列分析の方法であって、
(a)1つ以上の標的核酸を1つ以上の生物学的サンプルから得る工程、
(b)工程(a)から得られた1つ以上の標的核酸を、別個の塩基特異的、配列特異的又は部位特異的相補的切断反応のセットに付す工程であって、各切断反応が、非整列断片のセットを生成する工程、
(c)工程(b)から得られた非整列断片のセットを質量分析法によって分析する工程、及び、
(d)工程(c)から得られた質量分析スペクトルについて体系的コンピューター分析を行い、上記標的核酸の配列を分析する工程、
ここで、上記相補的切断反応は、種々の特異性を特徴とする標的核酸消化及び/又は標的配列の別の形態の消化をいう、
を含む方法。
【請求項2】 1つ以上の生物学的サンプルが、真核生物、原核生物及びウイルスからなる群より選択される生物に由来する、請求項1に記載の方法。
【請求項3】 1つ以上の標的核酸が、一本鎖DNA、二本鎖DNA、cDNA、一本鎖RNA、二本鎖RNA、DNA/RNAハイブリッドおよびDNA/RNAモザイク核酸からなる群より選択される、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項4】 1つ以上の標的核酸が、インビボでの、クローニング、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、逆転写その後のポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)、鎖置換増幅(SDA)及び転写に基づく方法からなる群より選択される1つ以上の連続的な増幅手段によって得られる、請求項1〜3いずれか1項に記載の方法。
【請求項5】 1つ以上の増幅された標的核酸が、下記工程:
(a)1つ以上の標的核酸に転写制御配列を作用的に連結する工程、及び
(b)1つ以上の標的核酸上の転写制御配列を認識する1つ以上のRNAポリメラーゼを用いて、工程a)の1つ以上の標的核酸の一方または両方の鎖を転写させる工程
を含む方法によって1本鎖又は2本鎖標的核酸から生成された転写物である、請求項4に記載の方法。
【請求項6】 上記転写制御配列が、5′伸張部分のような転写制御配列を組み込むプライマーを用いるPCR増幅によって1つ以上の標的核酸に作用的に連結される、請求項5に記載の方法。
【請求項7】 転写制御配列が、真核生物の転写制御配列、原核生物の転写制御配列およびウイルスの転写制御配列からなる群より選択される、請求項5又は6に記載の方法。
【請求項8】 原核生物の転写制御配列が、T3、T7及びSP6プロモーターからなる群より選択される、請求項7に記載の方法。
【請求項9】 T3、T7又はSP6プロモーターを利用するRNAポリメラーゼが、野生型または突然変異体のRNAポリメラーゼであって、突然変異体ポリメラーゼが、2′デオキシ、2′−O−メチル、2′−フルオロ又は2′−アミノ置換基を有する非標準基質を転写物内に組込むことができる、請求項8に記載の方法。
【請求項10】 突然変異体RNAポリメラーゼが、T7又はSP6突然変異体ポリメラーゼのいずれかである、請求項9に記載の方法。
【請求項11】 得られた標的核酸が、塩基、糖及び/又はリン酸部分において修飾された1つ以上のヌクレオシドを組み入れる方法であって、修飾が、1つ以上の切断試薬による切断の特異性、及び/又は、切断産生物の質量及び/又は長さを改変する、請求項1〜10いずれか1項に記載の方法。
【請求項12】 修飾が、修飾デオキシヌクレシド三リン酸、修飾リボヌクレオシド三リン酸、及び/又は修飾ジデオキシヌクレオシド三リン酸の酵素的組み込みによって導入されるか、修飾が、化学的に導入されるか、又は修飾が、両方法の組み合わせによって導入される、請求項11に記載の方法。
【請求項13】 修飾が、ヌクレオチド三リン酸上の2′−デオキシ、2′−O−メチル、2′−フルオロ又は2′−アミノ置換基からなる、請求項11又は12に記載の方法。
【請求項14】 修飾が、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合又はアルカリ化試薬とさらに反応したホスホロチオアートヌクレオシド間結合からなる、請求項11又は12に記載の方法。
【請求項15】 修飾が、ウリジン−5′−一リン酸サブユニットのC5上のメチル基からなる、請求項11又は12に記載の方法。
【請求項16】 修飾が、代替的同位元素を組み込むヌクレオチドからなる、請求項11又は12に記載の方法。
【請求項17】 工程(a)の1つ以上の標的核酸が、切断の前に精製されている、請求項1〜16いずれか1項に記載の方法。
【請求項18】 上記精製が、固定化によってか又はクロマトグラフィーによって行われる、請求項17に記載の方法。
【請求項19】 相補的切断反応が、酵素的切断、化学的切断および物理的切断からなる群より選択される、請求項1〜18いずれか1項に記載の方法。
【請求項20】 相補的切断反応が、弛緩モノヌクレオチド特異性、モノヌクレオチド特異性、弛緩ジヌクレオチド特異性またはジヌクレオチド特異性を特徴とする、請求項19に記載の方法。
【請求項21】 1つ以上の標的核酸が、アルカリ又はマクサム・ギルバート配列決定法において用いられる試薬を用いる処理からなる化学的消化反応に付される、請求項19又は20に記載の方法。
【請求項22】 1つ以上の標的核酸が、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼからなる群より選択される1つ以上の酵素を用いる酵素的切断反応に付される、請求項19または請求項20に記載の方法。
【請求項23】 1つ以上の標的核酸が、制限酵素、RNAエンドヌクレアーゼ、DNAエンドヌクレアーゼ及び非特異的ホスホジエステラーゼからなる群より選択される1つ以上のエンドヌクレアーゼを用いる酵素的切断反応に付される、請求項22に記載の方法。
【請求項24】 1つ以上のエンドヌクレアーゼが、G特異的T1リボヌクレアーゼ、A特異的U2リボヌクレアーゼ、A/U特異的phyMリボヌクレアーゼ、U/C特異的リボヌクレアーゼA、C特異的ニワトリ肝臓リボヌクレアーゼ(RNアーゼCL3)、クサチビン、非特異的RNアーゼI、及び大腸菌(E. coli)、エンテロバクター属(Enterobacter sp.)又は酵母(Saccharomyces cerevisiae)から単離されるピリミジン−アデノシンを好むRNアーゼからなる群より選択される、1つ以上の選択的か又は非選択的RNAエンドヌクレアーゼである、請求項23に記載の方法。
【請求項25】 1つ以上の標的核酸が、ホスホロチオアート修飾一本鎖DNA又はRNAであり、そして核酸消化が、ヌクレアーゼP1を用いて行われる、請求項1〜8、11〜12及び14〜24のいずれか1項に記載の方法。
【請求項26】 1つ以上の標的核酸が、突然変異体ポリメラーゼを用いて調製されたモザイクのRNA/DNA核酸又は修飾されたモザイクのRNA/DNA核酸であって、切断試薬が、RNAエンドヌクレアーゼ、DNAエンドヌクレアーゼ又はアルカリである、請求項1〜24のいずれか1項に記載の方法
【請求項27】 1つ以上の標的核酸が、野生型又は突然変異体RNAポリメラーゼを用いて調製された、転写物、修飾された転写物、モザイクのRNA/DNA転写物又は修飾されたモザイクのRNA/DNA転写物であり、切断試薬が、1つ以上の選択的か若しくは非選択的RNAエンドヌクレアーゼ又はアルカリである、請求項1〜24及び26のいずれか1項に記載の方法。
【請求項28】 1つ以上の標的核酸が、突然変異体T7又はSP6ポリメラーゼを用いて調製された、dCMP、dUMP又はdTMPのいずれかを取り込むモザイクのRNA/DNA転写物であり、切断試薬が、RNアーゼAのようなピリミジン特異的RNアーゼである、請求項1〜24又は26〜27のいずれか1項に記載の方法。
【請求項29】 工程(b)の非整列断片のセットが、イオン交換ビーズを用いてさらに精製された、請求項1〜28のいずれか1項に記載の方法。
【請求項30】工程(b)の非整列断片のセットが、固体支持体上にスポットされている、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】 上記固体支持体が、固体表面、プレート及び細片(チップ)からなる群より選択される、請求項30記載の方法。
【請求項32】 核酸断片の質量分析的分析が、マトリックス介助レーザーデソープション/イオン化飛行時間型(MALDI−TOF)、エレクトロスプレーイオン化(ESI)およびフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴(FT−ICR)からなる群より選択される質量分析的方法を用いて行われる、請求項1〜31のいずれか1項に記載の方法。
【請求項33】 基準核酸配列が公知である1つ以上の標的核酸の配列分析のための請求項1〜32のいずれか1項に記載の方法であって、請求項1の工程(c)において得られた非整列断片の1つ以上の質量スペクトルを基準核酸配列の質量スペクトルの公知又は予想質量スペクトルと比較し、そしてそこから体系的コンピューター分析によって1つ以上の標的核酸の全て又は一部のヌクレオチド配列を推定し、そして推定されたアミノ酸配列を基準核酸と比較し、1つ以上の標的核酸が、基準核酸と同一の配列又は異なる配列を有するかどうかを決定する付加的工程を含む方法。
【請求項34】 決定された核酸配列差が、欠失、置換、挿入又はそれらの組み合わせである、請求項33に記載の方法。
【請求項35】 核酸配列差が、単一ヌクレオチド多形(SNP)である、請求項34に記載の方法。
【請求項36】 1つ以上の生物学的サンプルに存在する1つ以上の標的核酸の公知及び未知のヌクレオチド配列変異をスコアするための請求項33〜35のいずれか1項に記載の方法の使用。
【請求項37】 上記の公知及び未知のヌクレオチド配列変異の決定が、所定の領域/遺伝子の種々の対立遺伝子配列の同定、疾患関連突然変異のスコア、体細胞変異の検出又は分子進化の領域における研究を可能にする、請求項36に記載の使用。
【請求項38】 1つ以上の標的核酸について得られたスペクトルを、複数の参照核酸について予測された質量スペクトルと比較し、それによって、1つ以上の生物学的サンプルにおける1つ以上の標的核酸を同定する/検出する、請求項33に記載の方法の使用。
【請求項39】 1つ以上の生物学的サンプルにおける1つ以上の標的核酸の発現プロフィールを測定するための、請求項38に記載の使用。
【請求項40】 1つ以上の生物学的サンプルに存在する1つ以上の標的核酸の未知配列の配列分析のための、請求項1〜32のいずれか1項に記載の方法であって、上記方法が、下記工程:
(a)1つ以上の生物学的サンプルから1つ以上の標的核酸を一本鎖形態で引き出す工程、
(b)工程(a)から得られた1つ以上の標的核酸を、4つの別々の塩基特異的相補的切断反応のセットに付す工程であって、各切断反応が、非整列断片のセットを生成する工程、
(c)工程(b)から得られた非整列断片のセットを質量分析法によって分析する工程、
(d)工程(c)から得られた質量スペクトルについて体系的コンピューター分析を行い、上記標的核酸の配列をアセンブルする工程、及び
(e)もし配列が工程(d)の後で一義的に決められないなら、場合により、工程(a)〜(d)を反復し、それによって、上記標的核酸及び/又は上記標的核酸の異なる部分の改変された形態を生成し、結合データが一義的配列の解に収束するまで追加的モノヌクレオチド及び/又はジヌクレオチド特異的切断反応を行い、非整列断片の追加的セットを提供する工程、
ここで、上記相補的切断反応とは、さまざまな特異性を特徴とする標的核酸消化及び/又は標的配列の別の形態の消化をいう、
を含む方法。
【請求項41】 1つ以上の生物学的サンプルに存在する1つ以上の未知配列の標的核酸の配列分析のための、請求項40に記載の方法の使用。
【請求項42】 1つ以上の生物学的サンプルにおける1つ以上の未知配列の標的核酸の配列決定のための、請求項40に記載の方法の使用。
【請求項43】 1つ以上の生物学的サンプルのゲノム全体の遺伝子型分類のための、請求項33〜35及び40のいずれか1項に記載の方法の使用。
【請求項44】 1つ以上の生物学的サンプルにおける基準核酸が公知である、1つ以上の標的核酸の、請求項1〜35のいずれか1項に記載の方法による、質量分析法を用いる配列分析のためのキットであって、キットが、
(a)1つ以上のヌクレオチド三リン酸、
(b)1つ以上のポリメラーゼ、
(c)1つ以上の核酸切断剤、及び
(d)核酸配列が公知である、1つ以上の基準核酸のセット
(e)場合により、標的核酸を精製するための試薬、
(f)場合により、非整列断片のセットを精製するためのイオン交換ビーズ、
(g)場合により、その上に非整列断片のセットをスポットすることができる固体支持体、及び
(h)場合により、1つ以上の標的核酸の質量スペクトルを基準核酸の質量スペクトルと比較し、それから標的核酸の核酸配列を推定するためのコンピューターソフトウェア
を含むキット。
【請求項45】 1つ以上の生物学的サンプルに存在する、基準核酸配列が公知である1つ以上の標的核酸
の配列を分析するための、
における配列差を決定するための、
同標的核酸における公知及び未知ヌクレオチド配列変異をスコアするための、
同標的核酸を検出及び/又は同定するための、又は
同標的核酸を用いてゲノム全体の遺伝子型分類を行うための、
請求項44に記載のキットの使用。
【請求項46】 質量分析法を用いる、1つ以上の生物学的サンプルにおける1つ以上の未知の標的核酸の、請求項1〜32及び40のいずれか1項に記載の方法による配列分析のためのキットであって、キットが、下記:
(a)1つ以上のヌクレオチド三リン酸、
(b)1つ以上のポリメラーゼ、及び
(c)1つ以上の核酸切断剤、
(d)場合により、標的核酸を精製するための試薬、
(e)場合により、非整列断片のセットを精製するためのイオン交換ビーズ、
(f)場合により、その上に非整列断片のセットをスポットすることができる固体支持体、及び
(g)場合により、該標的核酸の配列を分析し、1つ以上の一義的配列をもたらすためのコンピューターソフトウェア
を含むキット。
【請求項47】 1つ以上の生物学的サンプルに存在する未知配列を有する1つ以上の標的核酸の配列を分析するための、配列を決定するための、又は、この1つ以上の標的核酸を用いるゲノム全体の遺伝子型決定を行うための、請求項46に記載のキットの使用。
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